PCR Assimétrico RT- PCR - ufpel.edu.br fileRT - PCR PCR assimétrico ... Formação do cDNA ....

RT - PCR

PCR assimétrico

Daniel Bertoldi

Martin Larangeira

Rodrigo Ariza

Vinícius Lenz

Pelotas, 20 de fevereiro

Universidade Federal de Pelotas Centro de Desenvolvimento Tecnológico

Graduação em Biotecnologia Biologia Molecular

RT - PCR Reverse transcription polymerase chain reaction

• Introdução

• Princípio de ação

• One-Step RT – PCR

• Two-Step RT – PCR

• Artigos

• Utilizações

• Conclusão

Introdução

• RT-PCR é o uso da trascriptase reversa somada de um PCR para análise de um RNAm

• 1970 – Ano que foi descoberta a Transcriptase Reversa

• 1990 – Ano em que foi feito pela primeira vez um RT – PCR

Transcrição Reversa

Princípio de ação

• A transcriptase reversa sintetiza uma cadeia de DNA a partir de um RNA

• Com a síntese do DNA, se faz o PCR, até que sejam formadas bilhões de cópias

One-Step RT – PCR

• Transcrição Reversa e PCR feitas em uma etapa

• Feitos em um mesmo recipiente

• Utilização de primers gene-específicos apenas

Ilustração

Formação do cDNA

Vantagens

• Chances menores de contaminação

• Alta sensibilidade

• Mais rápido

• Menos trabalhoso

• Usa menos reagentes

Desvantagens

• Depende da quantidade e qualidade do RNA

• É necessário armazenar a amostra original de RNA

• Mais chance de ocorrer dímeros de prímers

Two-Step RT – PCR

• Duas etapas

• 1º - Transcrição reversa do RNA

• Após a síntese o cDNA é transferido para um outro recipiente

• 2º - PCR convencional

• Várias opções de primers

Primers

• Oligo (dT) primer

• Random Hexamers

• Primers Gene-específicos

Primers

Vantagens

• Escolha dos primers

• Escolha do sistema de amplificação

• Quantidade mais flexível de Transcriptase Reversa

• Várias PCRs da mesma amostra de cDNA

• Mais controle sobre as reações

• Não é necessário grande conhecimento do RNA a ser amplificado

Quando usar?

One-Step Two-Step

• Quando se trabalha com muitas amostras

• Amplificação do mesmo gene repetitivamente

• Amplificar várias mensagens de uma única fonte de RNA

• Quando se for usar o cDNA para mais amplificações

Utilização

• Análise da sequência de aminoácidos de uma proteína codificada por um mRNA

• Análise de um gene sem a presença de íntrons

• Análise do genoma de Vírus RNA

Conclusão

• O RT – PCR não tem muitas vantagens em relação a outros PCRs

• É comumente usado em conjunto com outros PCRs

• Bastante importante no estudo do genoma, tanto viral, quanto humano

Referências

• H. M. Temin, S. Mizutani: RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus

• Baltimore D: RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses

• http://biotech.about.com/od/proteintechnology/g/Reverse-Transcriptase-Pcr.htm

• http://www.bio.davidson.edu/courses/immunology/flash/rt_pcr.html

• http://www.protocol-online.org/prot/Molecular_Biology/PCR/RT-PCR/Competitive____Quantitative_RT-PCR/index.html

• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23410000

• http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/PCR/reverse-transcription/rt-pcr/one-two-step-rt-pcr.html

• http://www.virologyj.com/content/5/1/77

PCR assimétrico

Introdução

• 1983 Kary Mullis

• 1993 Nobel da Química

• Desenho dos primers

• Taq Polimerase

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PCR Assimétrico

• Amplifica mais uma fita do que a outra

• Amplifica a fita de interesse

• Excesso do primer da fita alvo

DNA de fita única*

*ssDNA ( single-strand DNA)

Como ocorre?

Utilização

• Amplificar sequências de fita simples do gene

• Métodos de Sequenciamento Genético - Sanger

• Sondagem de hibridização – grande amplitude térmica

• Usado como anti-corpo sintético (uso em diagnósticos)

Vantagens

O uso da amplificação da fita simples de DNA gera um número de outras vantagens:

• Anelamento separado e detecção - Rápida termociclagem. • • Fácil montagem de sondas de baixa temperatura de fusão (Tm) - Maior multiplicidade e rápida termociclagem. • Aumento substancial na discriminação de alelos - Melhor integridade de amplificação. • Diminuição substancial do fundo de fluorescência - Melhor sensibilidade. • Saturação Sonda/Alvo; Sinal alto, sem inibição da amplificação - Rápida termociclagem e melhor sensibilidade. • Cinética linear com pouca repetição entre as réplicas proporcionando uma análise da “região terminal”.

Introdução Aptâmeros são oligonucletídeos de fita simples que formam

uma variedade de estruturas tridimesionais que ligam com grande afinidade e especificidade a moléculas alvo. (Mazars and Theillet, 1996).

A produção de aptâmeros de DNA requer a conversão de dsDNA à ssDNA. (Hultman et al., 1989)

PCR Assimétrico

As condições foram as mesmas usadas no PCR simétrico,

mudando apenas as proporções dos primers.

Após realizado esse procedimento os produtos foram submetidos a eletroforese em gel de agarose a 3% contendo 0.5 μg mL-1 de brometo de etídio e analisados em um transiluminador UV.

Resultados

Conclusões

A produção eficiente de ssDNA necessária para produção aptâmero requere um método eficiente, levando em consideração o custo e o tempo do procedimento. PCR assimétrico fornece um desses caminhos para gerar ssDNA. Os principais critérios para o PCR assimétrico são as concentrações dos primers e o número de ciclos.

Contudo, essa técnica se mostrou bastante eficaz na produção de aptâmeros para outras moléculas alvo.

BRAZILIAN ARCHIVES OF

BIOLOGY AND TECHNOLOGY

AN INTERNATIONAL JOURNAL

Isolation and Characterization by Asymmetric PCR of the

ENDO1 Gene for glucan endo-1,3-β-D-glucosidase in

Phytophthora cinnamomi associated with the Ink Disease

of Castanea sativa Mill.

Sofia Meirinho¹, Marisa Carvalho¹, Ángel Dominguez² and Altino Choupina¹*

¹Departamento de Biologia e Microbiologia; Escola Superior Agrária de Bragança; Centro de Investigação de Montanha; Apartado 1172; 5301-854;Bragança - Portugal.

²Departamento de Microbiología y Genética; CIETUS, IMB/CSIC, Universidad de Salamanca, Plaza de los Dres. de la Reina, s/n; 37007; Salamanca - Spain

Introdução

• O Gênero Phytophthora compreende uma linha de mais de 65 espécies de oomicetos, dos quais todos são patogênicos; P. cinnamomi é umas das mais destrutivas.

• “Doença da tinta é uma das mais destrutivas em Castanea sativa.

• No Presente trabalho, um fragmento com 1231pb referente ao gene da β-1,3-glucanase foi amplificado, flanqueando esta sequência conhecida pela técnica de PCR assimétrico e usando primers conservados.

Procedimento

• Fragmento completo do gene com 2586pb obtido por técnica de PCR convencional.

• Amplificação da sequência de simples fita de 1231pb por PCR assimétrico.

• β-1,3-glucosidase gene of P. cinnamomi possui homologia com β-1,3-glucosidase da P. infestans

Resultados

Referências • Mazars, G.R. and Theillet, C. 1996. Direct sequencing by thermal asymmetric

PCR. Methods In Molecular Biology. 65, 35-40.

• Sanchez, J.A., Pierce, K.E., Rice, J.E., and Wangh, L.J. (2004) Linear-After-The-Exponential (LATE)-PCR: An advanced method of asymmetric PCR and its uses in quantitative real-time analysis, Proc Natl Acad Sci USA, 101(7):1933-1938.

• Hultman, T., Stahl, S., Hornes, E. and Uhlen, M. 1989. Direct solid phase sequencing of genomic and plasmid DNA using magnetic beads as solid support. Nucleic Acids Research. 17, 4937–4946.

• http://www.pcrstation.com/assymetric-pcr/

• http://www.koko.gov.my/CocoaBioTech/PCRxn3.html#procedure

• http://www.scielo.br/pdf/babt/v53n3/a03v53n3.pdf