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Prof.Doutor José Cabeda
Técnicas de Biologia Molecular em Microbiologia Clínica
TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOSDE ÁCIDOS NUCLEICOS
Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos
PCRPCR Real Time PCRReal Time PCR NASBA/TMANASBA/TMA
PCR
OPTIMIZAÇÃO DO PCR
[MgCl[MgCl22]]
ThTh [dNTP][dNTP] [primers][primers] [DNA][DNA] [inibidores][inibidores]
Variantes do PCR RT-PCR
RNA cDNA
RT
prod. ampl.
PCR
Nested PCR
1º PCR
2º PCR
Nested - PCR
PCR Multiplex
Variantes do PCR
RT-PCRRT-PCR Multiplex PCRMultiplex PCR Nested PCRNested PCR Assymetric PCRAssymetric PCR Degenerate PCRDegenerate PCR Hot Start PCRHot Start PCR In Situ PCRIn Situ PCR Long-PCRLong-PCR
PCR-ELISAPCR-ELISA PCR-RFLPPCR-RFLP PCR-SSCPPCR-SSCP RAPD-PCRRAPD-PCR REP-PCRREP-PCR Touchdown PCRTouchdown PCR
Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos
PCRPCR Real Time PCRReal Time PCR NASBA/TMANASBA/TMA
Prof.Doutor José Cabeda
Principio de funcionamento do Real-Time PCR
Detecção dos produtos de PCR
Montar uma reacção
Prof.Doutor José Cabeda
Químicas Utilizáveis
SYBR-Green I
5’3’
5’ 3’
SGExcitation
SG
SG
SG
SG
SYBR-Green I
5’3’
5’ 3’
SG
SG
SG
SG
SG
Excitation Emission
Detcção com SybGreen
Sybr-Green Detection
Intercalates to dsDNAIntercalates to dsDNA Inhibits DNA amplification Inhibits DNA amplification
so concentration is criticalso concentration is critical Detects specific and non-Detects specific and non-
specific targetsspecific targets Low starting background Low starting background
with large increase in with large increase in signalsignal
Can run a melt curve to Can run a melt curve to look at product specificitylook at product specificity
Detecção com sondas
Quimicas utilizáveis:sondas taqman
R Q
Sequence specific probes: Dual labeled probes
5’3’5’ 3’
5’3’
5’ 3’
Excitation RQQR QR
Excitation
Quimicas utilizáveis:molecular beacons
Molecular Beacons I
10mer
25mer
FAM DabCyl
Molecular Beacons II
R QExcitation
R
Q
QR Emission
Can be used to quantitation and Can be used to quantitation and mutation detectionmutation detection
Need beacons for the normal and Need beacons for the normal and mutation sequencemutation sequence
Design is difficult due to nature of Design is difficult due to nature of folding structurefolding structure
Expensive when compared to FRETExpensive when compared to FRET
Molecular Beacons III
Quimicas utilizáveis:sondas FRET
Prof.Doutor José Cabeda
Hyb-ProbesTM
Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: Quencher
Excitation Emission
Transfer
Quenched FRET analysis
Two labeled probes, FAM at the 5’ and Two labeled probes, FAM at the 5’ and BH1 on the 3’BH1 on the 3’
When the probes hybridize the FAM When the probes hybridize the FAM energy is quenched by the BH1energy is quenched by the BH1
After the product is amplified run a melt After the product is amplified run a melt curve to determine genotypecurve to determine genotype
Different melt points are seen for normal Different melt points are seen for normal and mutationand mutation
5’ 3’
Quimicas utilizáveis:sondas Eclipse
F
Q
F F
MGB
Q
F
MGB
Q Q
F
Prof.Doutor José Cabeda
Aplicações
QuantificaçãoQuantificação
End Point versus Real-Time
Quantificação
Prof.Doutor José Cabeda
Aplicações
Detecção de Mutações / SNPDetecção de Mutações / SNP
Detecção de mutações
Prof.Doutor José Cabeda
Aplicações
Multiplex DetectionMultiplex Detection
Detecção simultânea de vários produtos
Prof.Doutor José Cabeda
Os equipamentos
LightCycler
SmartCycler
Rotorgene
The samples spin continually during The samples spin continually during a run at 500 rpma run at 500 rpm
The samples are heated and cooled The samples are heated and cooled in a low mass air ovenin a low mass air oven
Tubes are illuminated as they pass Tubes are illuminated as they pass the detectorthe detector
On data acquisition energy is On data acquisition energy is averaged over 20 revolutions to give averaged over 20 revolutions to give the fluorescence of each samplethe fluorescence of each sample
Four ChannelsFour Channels• Ch1: ex 470nm, det 510nm• Ch2: ex 530nm, det 550nm• Ch3: ex 585nm, det 610nm• Ch4: ex 625nm, det 660nm
Near Patient TestingLaboratório de Urgência
Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos
PCRPCR Real Time PCRReal Time PCR NASBA/TMANASBA/TMA
NASBA/NUCLISENS
Amplification: schematic diagram
Primer 1
Reverse Transcriptase
RNase HPrimer 2
Reverse Transcriptase
T7 RNA polymerasePrimer 2
Reverse Transcriptase Reverse Transcriptase
RNase HPrimer 1
• sense RNA• antisense RNA• sense DNA• antisense DNA
Legend:
Técnicas de amplificação de Sinal
bDNA (Quantiplex)bDNA (Quantiplex)
bDNA (I)
bDNA (II)
bDNA (III)
bDNA (IV)
bDNA (V)
SDADNA Plymerase
Restriction enzyme
Prof.Doutor José Cabeda
Aplicações de técnicas de amplificação de AN ao diagnóstico
microbiológico
MÉTODOS CONVENCIONAIS
NO DIAGNÓSTICO
MICROBIOLÓGICO
Caracterização microscópicaCaracterização microscópica
Crescimento “in vitro” em meios sintéticosCrescimento “in vitro” em meios sintéticos
Caracterização bioquímicaCaracterização bioquímica
Demonstração imunológica da presença dos/ contacto Demonstração imunológica da presença dos/ contacto
com microorganismoscom microorganismos
LIMITAÇÕES DOS MÉTODOS CONVENCIONAIS
MÉTODOMÉTODO LIMITAÇÃOLIMITAÇÃO EXEMPLOSEXEMPLOS
CulturalCultural Meios e condições de Meios e condições de
cultura especiaiscultura especiais
Mycoplasma spp.,Mycoplasma spp., Legionella Legionella
spp......spp......
Culturas celulares Culturas celulares Vírus, bactérias intracelulares Vírus, bactérias intracelulares
obrigatóriasobrigatórias
Incapacidade de crescer Incapacidade de crescer
““in vitro”in vitro”
M. lepraeM. leprae, , T. pallidumT. pallidum, HPV, , HPV,
HCV....HCV....
Microrganismos de Microrganismos de
crescimento lento crescimento lento Mycobacterium sppMycobacterium spp., fungos., fungos
LIMITAÇÕES DOS
MÉTODOS CONVENCIONAIS
MÉTODOMÉTODO LIMITAÇÃOLIMITAÇÃO
SerológicoSerológico Sem utilidade na fase aguda Sem utilidade na fase aguda
diagnóstico retrospectivodiagnóstico retrospectivo
Problemático no hospedeiro Problemático no hospedeiro
imunocomprometidoimunocomprometido
Reactividade cruzadaReactividade cruzada
Interpretação complexaInterpretação complexa
DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Sensibilidade
Especificidade
Rapidez
• Diagnóstico etiológico em tempo clinicamente útil
• Evitar terapias empíricas
• Administração precoce de terapia específica
• Diminuição do tempo e custos da hospitalização
PCR Tempo Real
ÁREAS DE APLICAÇÃO
Detecção de Resistência aos Detecção de Resistência aos
AntimicrobianosAntimicrobianos
Diagnóstico das Doenças Infecciosas
UBM - HGSA
O que fazemos (Microbiologia)
MicrobiologiaMicrobiologia Detecção/quantificação de agentes patogénicosDetecção/quantificação de agentes patogénicos
VírusVírusBactériasBactérias
Genotipagem viralGenotipagem viral Detecção de resistências a drogasDetecção de resistências a drogas
Detecção de genótipos associados a resistênciaDetecção de genótipos associados a resistência EpidemiologiaEpidemiologia
Infecção nosocomialInfecção nosocomial
Áreas de Intervenção (II)UrgentesUrgentes
VirologiaVirologia Detecção de agentesDetecção de agentes Identificação de agentesIdentificação de agentes Resistências a drogasResistências a drogas
MicrobiologiaMicrobiologia Detecção de agentesDetecção de agentes Identificação de agentesIdentificação de agentes Resistências a drogas Resistências a drogas
HematologiaHematologia Doenças oncológicasDoenças oncológicas
Estudo de genes quimeraEstudo de genes quimera Estudo de Doença Res.Mín.Estudo de Doença Res.Mín. Estudo de monoclonalidadeEstudo de monoclonalidade Estudo de QuimerismoEstudo de Quimerismo
Não UrgentesNão Urgentes Hematologia/ImunologiaHematologia/Imunologia
Doenças GenéticasDoenças Genéticas MonogénicasMonogénicas
• Estudo de MutaçõesEstudo de Mutações• Estudo de haplótiposEstudo de haplótipos
MultifactoriaisMultifactoriais• Estudo de polimorfismos Estudo de polimorfismos
(factores genéticos de risco)(factores genéticos de risco) Anatomia PatológicaAnatomia Patológica
BiópsiasBiópsias Detecção de patogénios Detecção de patogénios Detecção de monoclonalidade Detecção de monoclonalidade
ThinPrepThinPrep Detecção de HPVDetecção de HPV
Virologia
Sistema Nervoso CentralSistema Nervoso Central
HSV1/2HSV1/2 EBVEBV CMVCMV VZVVZV HHV-6HHV-6 EnterovirusEnterovirus
Transmissíveis p/ sangueTransmissíveis p/ sangue HIVHIV HBVHBV HCVHCV
OutrosOutros HTLV-1HTLV-1 HPVHPV Poliomavirus (JCV e BKV)Poliomavirus (JCV e BKV)
Microbiologia
Detecção de bacteriasDetecção de bacterias Micobacterium tuberculosisMicobacterium tuberculosis Leptospira sppLeptospira spp Pneumonias atípicasPneumonias atípicas
Legionella spp.Legionella spp. Legionella pneumophilaLegionella pneumophila Legionella genusLegionella genus Micoplasma pneumoniaeMicoplasma pneumoniae Chlamydia pneumoniaeChlamydia pneumoniae
Staphylococcus spp.Staphylococcus spp. Enterococcus spp.Enterococcus spp. Helicobacter pyloriHelicobacter pylori Clostridium difficile (tcdA,tcdB)Clostridium difficile (tcdA,tcdB) Bordetella pertussisBordetella pertussis Borrelia burgdorferiBorrelia burgdorferi 16S rDNA16S rDNA
Identificação de bactériasIdentificação de bactérias Micobacterium tuberculosis complexMicobacterium tuberculosis complex Micobacterium aviumMicobacterium avium Micobacterium avium complexMicobacterium avium complex Micobacterium kanzasiiMicobacterium kanzasii Micobacterium intracelulareMicobacterium intracelulare Micobacterium GordonaeMicobacterium Gordonae
Resistencias a drogasResistencias a drogas MeticilinaMeticilina GlicopeptídeosGlicopeptídeos Rifampicina Rifampicina IsoniazidaIsoniazida
AntiretroviraisAntiretrovirais
Escolha da tecnologia (I)Real-Time-PCRReal-Time-PCR
Mais rápido (até 1 hora)Mais rápido (até 1 hora) Mais sensívelMais sensível Menor risco de contaminaçãoMenor risco de contaminação Uma só tecnologia fazUma só tecnologia faz
AmplificaçãoAmplificação DetecçãoDetecção CaracterizaçãoCaracterização
PCR convencionalPCR convencional
Mais baratoMais barato Muitos protocolos disponíveisMuitos protocolos disponíveis Mais fácil de montar para:Mais fácil de montar para:
MultiplexMultiplex NestedNested
Chromo 4 (MJ Research)
Rotorgene(pyrosequencing)
MyiQ(BioRad)
R.A.P.I.D(Yahoo)
LightCycler SmartCycler(cepheid)
7000 / 7300 / 7500 / 7900HT(Applied Biosystems)
SmartCycler-TD (cepheid)
Opticon(MJ Research)
MX3000P(Stratagene)
MX4000(Stratagene)
Escolha da tecnologia (II)
http://www.biocompare.com/matrix/2838/Real-Time-Thermal-Cyclers-(Thermocyclers).html
Escolha da tecnologia (III)
LightCyclerLightCycler
O mais rápido (cerca de 20’)O mais rápido (cerca de 20’) Muitos protocolos disponíveisMuitos protocolos disponíveis 32 amostras/corrida32 amostras/corrida Fluorocromos limitados na versão Fluorocromos limitados na versão
originaloriginal
SmartCyclerSmartCycler
Bastante rápido (cerca de 30’)Bastante rápido (cerca de 30’) Disponível em 25Disponível em 25l e 100l e 100l:l:
PCR preparatívosPCR preparatívos Aumento do input amostraAumento do input amostra Conversão de PCR Conversão de PCR
convencional facilitadaconvencional facilitada 16 estações independentes16 estações independentes
16 programas simultânos16 programas simultânos Apenas 16 amostrasApenas 16 amostras
Infecções víricas do SNCHERPESVIRUSHERPESVIRUS
SensitivitySensitivity HSV-1 HSV-1 200 copies/mL 200 copies/mL HSV-2 HSV-2 100 copies/mL 100 copies/mL VZV VZV 500 copies/mL 500 copies/mL CMV CMV 315 copies/mL315 copies/mL HHV-6 HHV-6 1/50 1/50 EBV EBV 1/10 1/10
Response time: Response time: 4 hours4 hours++
ENTEROVIRUSENTEROVIRUS Sensitivity*Sensitivity*
CoxA16 CoxA16 0.25 TCID 0.25 TCID5050 CoxA9 CoxA9 0.036 TCID 0.036 TCID5050 CoxB5 CoxB5 320 TCID 320 TCID5050 Echo11 Echo11 25 TCID 25 TCID5050 Echo6 Echo6 2000 TCID 2000 TCID5050 ENT71 ENT71 56 TCID 56 TCID5050
Response time: Response time: 4 hours4 hours
10-2
10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
++----
+++++ +
Single Nested
Cox A9Cox A16Cox B5
ENT71RHINONeg.Neg.
3,90,253203203232563,200
TCID50/ml
--++--+---
Single
+++++++---
Nested
++++++++--
Lab1
++
+/-+/---+---
Lab2
++++-- ++--
Lab3
A vantagem do Nested (Enterovírus)
A vantagem do Nested (Enterovírus)
Positivas13%
Negativas87%
Single RT-PCR
Negativas56%
Positivas44%
Nested RT-PCR
Amostras clínicas (162 LCR)
Detecção de bactérias
BacteriologiaBacteriologia Leptospiras Leptospiras B.burgdorferiB.burgdorferi H.pyloriH.pylori M.pneumoniaeM.pneumoniae C.pneumoniaeC.pneumoniae
L.pneumophila L.pneumophila M.tuberculosisM.tuberculosis Bordetella PertussisBordetella Pertussis Clostridium difficileClostridium difficile
B.burgdorferi
M.tuberculosis
M.pneumoniae
Leptospiras
H.pylori
Biópsias Gástricas Frescas
Biópsias Gástricas Fixadas
Extracção de DNA:
Homogeneização dos Tecidos
Lise Celular
Desnaturação Proteica
Tampão de Lise de Tecidos
Fast Prep
Temperatura de 95 ºC
Proteinase K
Magna Pure LC
DNA Isolation Kit - Tissue
Helicobacter pylori
60 m
Detecção de H. pylori – Multiplex PCR em Tempo Real
Smart Cycler Urease
-Globina (Controlo Interno)
Ensaio “in house”
2 Pares de Primers
(Urease / -Globina)
Sondas TaqMan
Helicobacter pylori
Detecção de Resistência à Claritromicina – PCR em Tempo Real
Light Cycler Amplificação do Gene 23S rRNA
Sondas FRET
Análise de Melting
Tempo de Resposta: ~ 5 H
EstirpeEstirpe Tmelting Tmelting (ºC)(ºC)
Wild - typeWild - type 61.561.5
Mut (A2142C)Mut (A2142C) 58.058.0
Mut (A2142G)Mut (A2142G) 53.053.0
Mut (A2143G)Mut (A2143G) 53.653.6
Helicobacter pylori
PNEUMONIAS ATÍPICASM. pneumoniae, C. pneumoniae e L. pneumophila
TÉCNICA:TÉCNICA: PCR em Tempo Real – SMART CYCLER PCR em Tempo Real – SMART CYCLER
3 ENSAIOS3 ENSAIOS DE PCR Efectuados individualmente para a detecção de DE PCR Efectuados individualmente para a detecção de cada cada um dos microrganismos um dos microrganismos
PNEUMONIAS ATÍPICASM. pneumoniae, C. pneumoniae e L. pneumophila
TEMPO DE RESPOSTA:TEMPO DE RESPOSTA: 3 H 3 H VSVS 48 H PCR Convencional48 H PCR Convencional
ESPECIFICIDADEESPECIFICIDADE
SENSIBILIDADESENSIBILIDADE
LIMITE DE DETECÇÃO:LIMITE DE DETECÇÃO:
L. pneumophilaL. pneumophila - 18 UFC/ml - 18 UFC/ml
AMOSTRAS:AMOSTRAS:
LBALBA
LCRLCR
Expectorações...Expectorações...
M. pneumoniae
C. pneumoniae
L. pneumophila
LEPTOSPIROSE (UBM-HGSA)
Amplificação do 23SrDNA (género Leptospira) e detecção específica de Amplificação do 23SrDNA (género Leptospira) e detecção específica de 6 espécies patogénicas6 espécies patogénicas
Amostras de urina, sangue, LCRAmostras de urina, sangue, LCR PCR em Tempo Real (Light Cycler)PCR em Tempo Real (Light Cycler) Limite de detecção: cultura = 10Limite de detecção: cultura = 10-12-12; Urina inoculada = 10; Urina inoculada = 10-7-7
LEPTOSPIRA TÉCNICA :TÉCNICA : PCR em Tempo Real – LIGHT CYCLER PCR em Tempo Real – LIGHT CYCLER
Amplificação do gene 23S rDNA que permite num só ensaio a Amplificação do gene 23S rDNA que permite num só ensaio a detecção de 6 espécies patogénicas detecção de 6 espécies patogénicas
TEMPO DE RESPOSTA:TEMPO DE RESPOSTA: 3 H (Considerando o tempo dispendido no 3 H (Considerando o tempo dispendido no pré-pré- -tratamento das amostras de -tratamento das amostras de urina)urina)
AMOSTRAS:AMOSTRAS: Urina Urina Sangue Sangue LCRLCRBiópsias...Biópsias...
Bordetella pertussis
Detecção molecular de Detecção molecular de IS 481IS 481
Amostras:Amostras: Secreções nasofaríngeSecreções nasofarínge Zaragatoa nasofaríngeZaragatoa nasofarínge
Armazenar a 4ºCArmazenar a 4ºC
Volume mínimo amostra Volume mínimo amostra 400 400ll
Extracção de ácidos nucleicosExtracção de ácidos nucleicos
EZ 1 BioRobot – QiagenEZ 1 BioRobot – Qiagen
Bordetella pertussis
Limite de detecçãoLimite de detecção ATCC 9797DATCC 9797D
DNA genómico DNA genómico B. pertussisB. pertussis Diluições seriadas Diluições seriadas 10 10-1-1 a 10 a 10-10-10
14x1014x10-7-7ng/mL ng/mL 1,5 genomas/PCR 1,5 genomas/PCR
Bordetella pertussisBordetella pertussis ATCC ATCC 9797D9797D
DiluiçãDiluiçãoo
ConcentraçConcentraçãoão Resultado Resultado
1010-1-1 14ng/14ng/LL POSPOS
1010-2-2 1,4ng/1,4ng/LL POSPOS
1010-3-3 1,4x101,4x10-1-1ng/ng/LL POSPOS
1010-4-4 1,4x101,4x10-2-2ng/ng/LL POSPOS
1010-5-5 1,4x101,4x10-3-3ng/ng/LL POSPOS
1010-6-6 1,4x101,4x10-4-4ng/ng/LL POSPOS
1010-7-7 1,4x101,4x10-5-5ng/ng/LL POSPOS
1010-8-8 1,4x101,4x10-6-6ng/ng/LL POSPOS
1010-9-9 1,4x101,4x10-7-7ng/ng/LL +/-+/-
1010-10-10 1,4x101,4x10-8-8ng/ng/LL NEGNEG
Detecção de C. difficile de fezes - Multiplex PCR em Tempo Real Smart Cycler
Gene tcdA: Toxina A
Gene tcdB: Toxina B
2 Pares de Primers
Sondas
FAM: Toxina A
TET: Toxina B
Tempo de Resposta: ~ 3 H
Controlo de Inibição
Sensibilidade Analítica: 10 cópias genoma por reacção de PCR
Clostridium difficile
DETECÇÃO DE RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS (UBM-HGSA)
BACTÉRIABACTÉRIA RESISTÊNCIARESISTÊNCIA MUTAÇÕESMUTAÇÕES
Mycobacterium Mycobacterium tuberculosistuberculosis
RifampicinaRifampicinarpoB rpoB 526(CAC526(CACGAC)GAC)
531 (TCG531 (TCGTTG)TTG)
533 (CTG533 (CTGCCG)CCG)
IsoniazidaIsoniazidakatG katG 315 (AGC315 (AGCACC)ACC)
315 (AGC315 (AGCAAC)AAC)
Helicobacter Helicobacter pyloripylori
ClaritromicinaClaritromicina 23S rDNA23S rDNA
TUBERCULOSEIdentificação de isolados de culturaIdentificação directa de produtos biológicos(em desenvolvimento)
Espécie Tm
M. tuberculosis 63ºC
M. kansasii 59ºC
M.avium 58ºC
M.intracellulare 54ºC
M.gordonae 49ºC
16S rDNA
Gene 16S rDNAGene 16S rDNA – natureza conservada no reino procariota– natureza conservada no reino procariota
PCR UniversalPCR Universal uma reacção uma reacção amplifica vários agentes amplifica vários agentes
Detecção da presença de bactérias em amostras clínicas estéreisDetecção da presença de bactérias em amostras clínicas estéreis
16S rDNA Aplicações:Aplicações:
LCR, Sangue, produtos biológicos “estéreis”LCR, Sangue, produtos biológicos “estéreis”
Problemas:Problemas: Detecção de bactérias inviáveisDetecção de bactérias inviáveis Risco de contaminação laboratorialRisco de contaminação laboratorial Risco de contaminação na colheitaRisco de contaminação na colheita
Correlacionar resultados Correlacionar resultados
positivos com a clínicapositivos com a clínica
Inactivação do DNA exógeno (irradiação UV reagentes/material) Inactivação do DNA exógeno (irradiação UV reagentes/material)
Extracção de ácidos nucleicosExtracção de ácidos nucleicos Bactérias Gram - Bactérias Gram - Bactérias Gram + Bactérias Gram + MicobactériasMicobactérias
Lise enzimática / mecânicaLise enzimática / mecânica Magna Pure LC, RocheMagna Pure LC, Roche
Total Nucleic Acid Isolation KitTotal Nucleic Acid Isolation Kit
AmplificaçãoAmplificação
Smart Cycler, Cepheid - PCR em Tempo RealSmart Cycler, Cepheid - PCR em Tempo Real
Múltiplos controlos negativos (extracção, amplificação)Múltiplos controlos negativos (extracção, amplificação)
16S rDNA
16S rDNA
Sensibilidade analítica do métodoSensibilidade analítica do método
S. aureusS. aureus 160 UFC/mL 160 UFC/mL
E. coliE. coli 200 UFC/mL 200 UFC/mL
Aplicação a 76 amostras de LCR (Meningite Bacteriana Aguda)Aplicação a 76 amostras de LCR (Meningite Bacteriana Aguda)
Sensibilidade: 80%; Especificidade: 94.5%Sensibilidade: 80%; Especificidade: 94.5%
VPP: 84%; VPN: 92.7%VPP: 84%; VPN: 92.7%
Resultado – POSITIVO/NEGATIVOResultado – POSITIVO/NEGATIVO
EspécieEspécie OrigemOrigem PCR em tempo PCR em tempo realreal
E. coliE. coli ATCC 25922ATCC 25922 PosPos
S. aureusS. aureus ATCC 25923ATCC 25923 PosPos
E. faecalisE. faecalis ATCC 25212ATCC 25212 PosPos
S. pneumoniaeS. pneumoniae ATCC 6305ATCC 6305 PosPos
P. mirabilisP. mirabilis ATCC 12453ATCC 12453 PosPos
E. cloacaeE. cloacae ATCC 13047ATCC 13047 PosPos
K. pneumoniaeK. pneumoniae ATCC 13883ATCC 13883 PosPos
P. aeruginosaP. aeruginosa ATCC 27853ATCC 27853 PosPos
H. influenzaeH. influenzae ATCC 49766ATCC 49766 PosPos
N. meningitidisN. meningitidis Isolado clínicoIsolado clínico PosPos
L. monocytogenesL. monocytogenes Isolado clínicoIsolado clínico PosPos
S. epidermidisS. epidermidis Isolado clínicoIsolado clínico PosPos
S.agalactiaeS.agalactiae Isolado clínicoIsolado clínico PosPos
M. tuberculosisM. tuberculosis Isolado clínicoIsolado clínico PosPos
Leptospira spLeptospira sp Isolado clínicoIsolado clínico PosPos
16S rDNA
16S rDNA
Estirpes detectadas por outros autores com os mesmos primersEstirpes detectadas por outros autores com os mesmos primers
Acinetobacter calcoaceticusAcinetobacter calcoaceticus Clostridium perfringensClostridium perfringens
Aeromonas hydrophilaAeromonas hydrophila Corynebacterium genitaliumCorynebacterium genitalium
Alcaligenes faecalisAlcaligenes faecalis Erysipelothrix rhusiophathiaeErysipelothrix rhusiophathiae
Bacteroides fragilisBacteroides fragilis Gardnerella vaginalisGardnerella vaginalis
Campylobacter fetusCampylobacter fetus Lactobacillus acidophilusLactobacillus acidophilus
Campylobacter jejuniCampylobacter jejuni Leuconostoc paramesenteroidesLeuconostoc paramesenteroides
Eikenella corrodensEikenella corrodens Micrococcus luteusMicrococcus luteus
Mycoplasma genitalium Mycoplasma genitalium Flavobacterium meningosepticumFlavobacterium meningosepticum
Legionella pneumophilaLegionella pneumophila Mycoplasma hominisMycoplasma hominis
Moraxella catarrhalisMoraxella catarrhalis Mycoplasma pneumoniaeMycoplasma pneumoniae
Neisseria gonorrhoeaeNeisseria gonorrhoeae Peptostreptococcus anaerobiusPeptostreptococcus anaerobius
Providencia stuartiiProvidencia stuartii Peptostreptococcus magnusPeptostreptococcus magnus
Salmonella typhimuriumSalmonella typhimurium Propionibacterium acnesPropionibacterium acnes
Serratia marcescensSerratia marcescens Streptococcus mitisStreptococcus mitis
Yersinia enterocoliticaYersinia enterocolitica Streptococcus sanguisStreptococcus sanguis
Desafio:Desafio:
sensibilidade sem comprometer a especificidadesensibilidade sem comprometer a especificidade
Kits de Extracção MKits de Extracção MGradeGrade
Enzimas LowDNAEnzimas LowDNA
Essencial:Essencial:
Resultados positivos Resultados positivos Identificação do produto amplificado Identificação do produto amplificado
Distinguir contaminações de verdadeiros positivos Distinguir contaminações de verdadeiros positivos
Correlação com clínicaCorrelação com clínica
Valor Preditivo PositivoValor Preditivo Positivo
SensibilidadeSensibilidade
16S rDNA
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