Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Biologia Molecular em Microbiologia Clínica TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Prof.Doutor José Cabeda

Técnicas de Biologia Molecular em Microbiologia Clínica

TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOSDE ÁCIDOS NUCLEICOS

Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos

PCRPCR Real Time PCRReal Time PCR NASBA/TMANASBA/TMA

PCR

OPTIMIZAÇÃO DO PCR

[MgCl[MgCl22]]

ThTh [dNTP][dNTP] [primers][primers] [DNA][DNA] [inibidores][inibidores]

Variantes do PCR RT-PCR

RNA cDNA

RT

prod. ampl.

PCR

Nested PCR

1º PCR

2º PCR

Nested - PCR

PCR Multiplex

Variantes do PCR

RT-PCRRT-PCR Multiplex PCRMultiplex PCR Nested PCRNested PCR Assymetric PCRAssymetric PCR Degenerate PCRDegenerate PCR Hot Start PCRHot Start PCR In Situ PCRIn Situ PCR Long-PCRLong-PCR

PCR-ELISAPCR-ELISA PCR-RFLPPCR-RFLP PCR-SSCPPCR-SSCP RAPD-PCRRAPD-PCR REP-PCRREP-PCR Touchdown PCRTouchdown PCR




Principio de funcionamento do Real-Time PCR

Detecção dos produtos de PCR

Montar uma reacção


Químicas Utilizáveis

SYBR-Green I

5’3’

5’ 3’

SGExcitation

SG

SG

SG

SG

SYBR-Green I

5’3’

5’ 3’

SG

SG

SG

SG

SG

Excitation Emission

Detcção com SybGreen

Sybr-Green Detection

Intercalates to dsDNAIntercalates to dsDNA Inhibits DNA amplification Inhibits DNA amplification

so concentration is criticalso concentration is critical Detects specific and non-Detects specific and non-

specific targetsspecific targets Low starting background Low starting background

with large increase in with large increase in signalsignal

Can run a melt curve to Can run a melt curve to look at product specificitylook at product specificity

Detecção com sondas

Quimicas utilizáveis:sondas taqman

R Q

Sequence specific probes: Dual labeled probes

5’3’5’ 3’

5’3’

5’ 3’

Excitation RQQR QR

Excitation

Quimicas utilizáveis:molecular beacons

Molecular Beacons I

10mer

25mer

FAM DabCyl

Molecular Beacons II

R QExcitation

R

Q

QR Emission

Can be used to quantitation and Can be used to quantitation and mutation detectionmutation detection

Need beacons for the normal and Need beacons for the normal and mutation sequencemutation sequence

Design is difficult due to nature of Design is difficult due to nature of folding structurefolding structure

Expensive when compared to FRETExpensive when compared to FRET

Molecular Beacons III

Quimicas utilizáveis:sondas FRET


Hyb-ProbesTM

Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: Quencher

Excitation Emission

Transfer

Quenched FRET analysis

Two labeled probes, FAM at the 5’ and Two labeled probes, FAM at the 5’ and BH1 on the 3’BH1 on the 3’

When the probes hybridize the FAM When the probes hybridize the FAM energy is quenched by the BH1energy is quenched by the BH1

After the product is amplified run a melt After the product is amplified run a melt curve to determine genotypecurve to determine genotype

Different melt points are seen for normal Different melt points are seen for normal and mutationand mutation

5’ 3’

Quimicas utilizáveis:sondas Eclipse

F

Q

F F

MGB

Q

F

MGB

Q Q

F


Aplicações

QuantificaçãoQuantificação

End Point versus Real-Time

Quantificação


Aplicações

Detecção de Mutações / SNPDetecção de Mutações / SNP

Detecção de mutações


Aplicações

Multiplex DetectionMultiplex Detection

Detecção simultânea de vários produtos


Os equipamentos

LightCycler

SmartCycler

Rotorgene

The samples spin continually during The samples spin continually during a run at 500 rpma run at 500 rpm

The samples are heated and cooled The samples are heated and cooled in a low mass air ovenin a low mass air oven

Tubes are illuminated as they pass Tubes are illuminated as they pass the detectorthe detector

On data acquisition energy is On data acquisition energy is averaged over 20 revolutions to give averaged over 20 revolutions to give the fluorescence of each samplethe fluorescence of each sample

Four ChannelsFour Channels• Ch1: ex 470nm, det 510nm• Ch2: ex 530nm, det 550nm• Ch3: ex 585nm, det 610nm• Ch4: ex 625nm, det 660nm

Near Patient TestingLaboratório de Urgência



NASBA/NUCLISENS

Amplification: schematic diagram

Primer 1

Reverse Transcriptase

RNase HPrimer 2

Reverse Transcriptase

T7 RNA polymerasePrimer 2

Reverse Transcriptase Reverse Transcriptase

RNase HPrimer 1

• sense RNA• antisense RNA• sense DNA• antisense DNA

Legend:

Técnicas de amplificação de Sinal

bDNA (Quantiplex)bDNA (Quantiplex)

bDNA (I)

bDNA (II)

bDNA (III)

bDNA (IV)

bDNA (V)

SDADNA Plymerase

Restriction enzyme


Aplicações de técnicas de amplificação de AN ao diagnóstico

microbiológico

MÉTODOS CONVENCIONAIS

NO DIAGNÓSTICO

MICROBIOLÓGICO

Caracterização microscópicaCaracterização microscópica

Crescimento “in vitro” em meios sintéticosCrescimento “in vitro” em meios sintéticos

Caracterização bioquímicaCaracterização bioquímica

Demonstração imunológica da presença dos/ contacto Demonstração imunológica da presença dos/ contacto

com microorganismoscom microorganismos

LIMITAÇÕES DOS MÉTODOS CONVENCIONAIS

MÉTODOMÉTODO LIMITAÇÃOLIMITAÇÃO EXEMPLOSEXEMPLOS

CulturalCultural Meios e condições de Meios e condições de

cultura especiaiscultura especiais

Mycoplasma spp.,Mycoplasma spp., Legionella Legionella

spp......spp......

Culturas celulares Culturas celulares Vírus, bactérias intracelulares Vírus, bactérias intracelulares

obrigatóriasobrigatórias

Incapacidade de crescer Incapacidade de crescer

““in vitro”in vitro”

M. lepraeM. leprae, , T. pallidumT. pallidum, HPV, , HPV,

HCV....HCV....

Microrganismos de Microrganismos de

crescimento lento crescimento lento Mycobacterium sppMycobacterium spp., fungos., fungos

LIMITAÇÕES DOS

MÉTODOS CONVENCIONAIS

MÉTODOMÉTODO LIMITAÇÃOLIMITAÇÃO

SerológicoSerológico Sem utilidade na fase aguda Sem utilidade na fase aguda

diagnóstico retrospectivodiagnóstico retrospectivo

Problemático no hospedeiro Problemático no hospedeiro

imunocomprometidoimunocomprometido

Reactividade cruzadaReactividade cruzada

Interpretação complexaInterpretação complexa

DIAGNÓSTICO MOLECULAR

Sensibilidade

Especificidade

Rapidez

• Diagnóstico etiológico em tempo clinicamente útil

• Evitar terapias empíricas

• Administração precoce de terapia específica

• Diminuição do tempo e custos da hospitalização

PCR Tempo Real

ÁREAS DE APLICAÇÃO

Detecção de Resistência aos Detecção de Resistência aos

AntimicrobianosAntimicrobianos

Diagnóstico das Doenças Infecciosas

UBM - HGSA

O que fazemos (Microbiologia)

MicrobiologiaMicrobiologia Detecção/quantificação de agentes patogénicosDetecção/quantificação de agentes patogénicos

VírusVírusBactériasBactérias

Genotipagem viralGenotipagem viral Detecção de resistências a drogasDetecção de resistências a drogas

Detecção de genótipos associados a resistênciaDetecção de genótipos associados a resistência EpidemiologiaEpidemiologia

Infecção nosocomialInfecção nosocomial

Áreas de Intervenção (II)UrgentesUrgentes

VirologiaVirologia Detecção de agentesDetecção de agentes Identificação de agentesIdentificação de agentes Resistências a drogasResistências a drogas

MicrobiologiaMicrobiologia Detecção de agentesDetecção de agentes Identificação de agentesIdentificação de agentes Resistências a drogas Resistências a drogas

HematologiaHematologia Doenças oncológicasDoenças oncológicas

Estudo de genes quimeraEstudo de genes quimera Estudo de Doença Res.Mín.Estudo de Doença Res.Mín. Estudo de monoclonalidadeEstudo de monoclonalidade Estudo de QuimerismoEstudo de Quimerismo

Não UrgentesNão Urgentes Hematologia/ImunologiaHematologia/Imunologia

Doenças GenéticasDoenças Genéticas MonogénicasMonogénicas

• Estudo de MutaçõesEstudo de Mutações• Estudo de haplótiposEstudo de haplótipos

MultifactoriaisMultifactoriais• Estudo de polimorfismos Estudo de polimorfismos

(factores genéticos de risco)(factores genéticos de risco) Anatomia PatológicaAnatomia Patológica

BiópsiasBiópsias Detecção de patogénios Detecção de patogénios Detecção de monoclonalidade Detecção de monoclonalidade

ThinPrepThinPrep Detecção de HPVDetecção de HPV

Virologia

Sistema Nervoso CentralSistema Nervoso Central

HSV1/2HSV1/2 EBVEBV CMVCMV VZVVZV HHV-6HHV-6 EnterovirusEnterovirus

Transmissíveis p/ sangueTransmissíveis p/ sangue HIVHIV HBVHBV HCVHCV

OutrosOutros HTLV-1HTLV-1 HPVHPV Poliomavirus (JCV e BKV)Poliomavirus (JCV e BKV)

Microbiologia

Detecção de bacteriasDetecção de bacterias Micobacterium tuberculosisMicobacterium tuberculosis Leptospira sppLeptospira spp Pneumonias atípicasPneumonias atípicas

Legionella spp.Legionella spp. Legionella pneumophilaLegionella pneumophila Legionella genusLegionella genus Micoplasma pneumoniaeMicoplasma pneumoniae Chlamydia pneumoniaeChlamydia pneumoniae

Staphylococcus spp.Staphylococcus spp. Enterococcus spp.Enterococcus spp. Helicobacter pyloriHelicobacter pylori Clostridium difficile (tcdA,tcdB)Clostridium difficile (tcdA,tcdB) Bordetella pertussisBordetella pertussis Borrelia burgdorferiBorrelia burgdorferi 16S rDNA16S rDNA

Identificação de bactériasIdentificação de bactérias Micobacterium tuberculosis complexMicobacterium tuberculosis complex Micobacterium aviumMicobacterium avium Micobacterium avium complexMicobacterium avium complex Micobacterium kanzasiiMicobacterium kanzasii Micobacterium intracelulareMicobacterium intracelulare Micobacterium GordonaeMicobacterium Gordonae

Resistencias a drogasResistencias a drogas MeticilinaMeticilina GlicopeptídeosGlicopeptídeos Rifampicina Rifampicina IsoniazidaIsoniazida

AntiretroviraisAntiretrovirais

Escolha da tecnologia (I)Real-Time-PCRReal-Time-PCR

Mais rápido (até 1 hora)Mais rápido (até 1 hora) Mais sensívelMais sensível Menor risco de contaminaçãoMenor risco de contaminação Uma só tecnologia fazUma só tecnologia faz

AmplificaçãoAmplificação DetecçãoDetecção CaracterizaçãoCaracterização

PCR convencionalPCR convencional

Mais baratoMais barato Muitos protocolos disponíveisMuitos protocolos disponíveis Mais fácil de montar para:Mais fácil de montar para:

MultiplexMultiplex NestedNested

Chromo 4 (MJ Research)

Rotorgene(pyrosequencing)

MyiQ(BioRad)

R.A.P.I.D(Yahoo)

LightCycler SmartCycler(cepheid)

7000 / 7300 / 7500 / 7900HT(Applied Biosystems)

SmartCycler-TD (cepheid)

Opticon(MJ Research)

MX3000P(Stratagene)

MX4000(Stratagene)

Escolha da tecnologia (II)

http://www.biocompare.com/matrix/2838/Real-Time-Thermal-Cyclers-(Thermocyclers).html

Escolha da tecnologia (III)

LightCyclerLightCycler

O mais rápido (cerca de 20’)O mais rápido (cerca de 20’) Muitos protocolos disponíveisMuitos protocolos disponíveis 32 amostras/corrida32 amostras/corrida Fluorocromos limitados na versão Fluorocromos limitados na versão

originaloriginal

SmartCyclerSmartCycler

Bastante rápido (cerca de 30’)Bastante rápido (cerca de 30’) Disponível em 25Disponível em 25l e 100l e 100l:l:

PCR preparatívosPCR preparatívos Aumento do input amostraAumento do input amostra Conversão de PCR Conversão de PCR

convencional facilitadaconvencional facilitada 16 estações independentes16 estações independentes

16 programas simultânos16 programas simultânos Apenas 16 amostrasApenas 16 amostras

Infecções víricas do SNCHERPESVIRUSHERPESVIRUS

SensitivitySensitivity HSV-1 HSV-1 200 copies/mL 200 copies/mL HSV-2 HSV-2 100 copies/mL 100 copies/mL VZV VZV 500 copies/mL 500 copies/mL CMV CMV 315 copies/mL315 copies/mL HHV-6 HHV-6 1/50 1/50 EBV EBV 1/10 1/10

Response time: Response time: 4 hours4 hours++

ENTEROVIRUSENTEROVIRUS Sensitivity*Sensitivity*

CoxA16 CoxA16 0.25 TCID 0.25 TCID5050 CoxA9 CoxA9 0.036 TCID 0.036 TCID5050 CoxB5 CoxB5 320 TCID 320 TCID5050 Echo11 Echo11 25 TCID 25 TCID5050 Echo6 Echo6 2000 TCID 2000 TCID5050 ENT71 ENT71 56 TCID 56 TCID5050

Response time: Response time: 4 hours4 hours

10-2

10-4 10-5 10-6 10-7 10-8

++----

+++++ +

Single Nested

Cox A9Cox A16Cox B5

ENT71RHINONeg.Neg.

3,90,253203203232563,200

TCID50/ml

--++--+---

Single

+++++++---

Nested

++++++++--

Lab1

++

+/-+/---+---

Lab2

++++-- ++--

Lab3

A vantagem do Nested (Enterovírus)

A vantagem do Nested (Enterovírus)

Positivas13%

Negativas87%

Single RT-PCR

Negativas56%

Positivas44%

Nested RT-PCR

Amostras clínicas (162 LCR)

Detecção de bactérias

BacteriologiaBacteriologia Leptospiras Leptospiras B.burgdorferiB.burgdorferi H.pyloriH.pylori M.pneumoniaeM.pneumoniae C.pneumoniaeC.pneumoniae

L.pneumophila L.pneumophila M.tuberculosisM.tuberculosis Bordetella PertussisBordetella Pertussis Clostridium difficileClostridium difficile

B.burgdorferi

M.tuberculosis

M.pneumoniae

Leptospiras

H.pylori

Biópsias Gástricas Frescas

Biópsias Gástricas Fixadas

Extracção de DNA:

Homogeneização dos Tecidos

Lise Celular

Desnaturação Proteica

Tampão de Lise de Tecidos

Fast Prep

Temperatura de 95 ºC

Proteinase K

Magna Pure LC

DNA Isolation Kit - Tissue

Helicobacter pylori

60 m

Detecção de H. pylori – Multiplex PCR em Tempo Real

Smart Cycler Urease

-Globina (Controlo Interno)

Ensaio “in house”

2 Pares de Primers

(Urease / -Globina)

Sondas TaqMan

Helicobacter pylori

Detecção de Resistência à Claritromicina – PCR em Tempo Real

Light Cycler Amplificação do Gene 23S rRNA

Sondas FRET

Análise de Melting

Tempo de Resposta: ~ 5 H

EstirpeEstirpe Tmelting Tmelting (ºC)(ºC)

Wild - typeWild - type 61.561.5

Mut (A2142C)Mut (A2142C) 58.058.0

Mut (A2142G)Mut (A2142G) 53.053.0

Mut (A2143G)Mut (A2143G) 53.653.6

Helicobacter pylori

PNEUMONIAS ATÍPICASM. pneumoniae, C. pneumoniae e L. pneumophila

TÉCNICA:TÉCNICA: PCR em Tempo Real – SMART CYCLER PCR em Tempo Real – SMART CYCLER

3 ENSAIOS3 ENSAIOS DE PCR Efectuados individualmente para a detecção de DE PCR Efectuados individualmente para a detecção de cada cada um dos microrganismos um dos microrganismos

PNEUMONIAS ATÍPICASM. pneumoniae, C. pneumoniae e L. pneumophila

TEMPO DE RESPOSTA:TEMPO DE RESPOSTA: 3 H 3 H VSVS 48 H PCR Convencional48 H PCR Convencional

ESPECIFICIDADEESPECIFICIDADE

SENSIBILIDADESENSIBILIDADE

LIMITE DE DETECÇÃO:LIMITE DE DETECÇÃO:

L. pneumophilaL. pneumophila - 18 UFC/ml - 18 UFC/ml

AMOSTRAS:AMOSTRAS:

LBALBA

LCRLCR

Expectorações...Expectorações...

M. pneumoniae

C. pneumoniae

L. pneumophila

LEPTOSPIROSE (UBM-HGSA)

Amplificação do 23SrDNA (género Leptospira) e detecção específica de Amplificação do 23SrDNA (género Leptospira) e detecção específica de 6 espécies patogénicas6 espécies patogénicas

Amostras de urina, sangue, LCRAmostras de urina, sangue, LCR PCR em Tempo Real (Light Cycler)PCR em Tempo Real (Light Cycler) Limite de detecção: cultura = 10Limite de detecção: cultura = 10-12-12; Urina inoculada = 10; Urina inoculada = 10-7-7

LEPTOSPIRA TÉCNICA :TÉCNICA : PCR em Tempo Real – LIGHT CYCLER PCR em Tempo Real – LIGHT CYCLER

Amplificação do gene 23S rDNA que permite num só ensaio a Amplificação do gene 23S rDNA que permite num só ensaio a detecção de 6 espécies patogénicas detecção de 6 espécies patogénicas

TEMPO DE RESPOSTA:TEMPO DE RESPOSTA: 3 H (Considerando o tempo dispendido no 3 H (Considerando o tempo dispendido no pré-pré- -tratamento das amostras de -tratamento das amostras de urina)urina)

AMOSTRAS:AMOSTRAS: Urina Urina Sangue Sangue LCRLCRBiópsias...Biópsias...

Bordetella pertussis

Detecção molecular de Detecção molecular de IS 481IS 481

Amostras:Amostras: Secreções nasofaríngeSecreções nasofarínge Zaragatoa nasofaríngeZaragatoa nasofarínge

Armazenar a 4ºCArmazenar a 4ºC

Volume mínimo amostra Volume mínimo amostra 400 400ll

Extracção de ácidos nucleicosExtracção de ácidos nucleicos

EZ 1 BioRobot – QiagenEZ 1 BioRobot – Qiagen

Bordetella pertussis

Limite de detecçãoLimite de detecção ATCC 9797DATCC 9797D

DNA genómico DNA genómico B. pertussisB. pertussis Diluições seriadas Diluições seriadas 10 10-1-1 a 10 a 10-10-10

14x1014x10-7-7ng/mL ng/mL 1,5 genomas/PCR 1,5 genomas/PCR

Bordetella pertussisBordetella pertussis ATCC ATCC 9797D9797D

DiluiçãDiluiçãoo

ConcentraçConcentraçãoão Resultado Resultado

1010-1-1 14ng/14ng/LL POSPOS

1010-2-2 1,4ng/1,4ng/LL POSPOS

1010-3-3 1,4x101,4x10-1-1ng/ng/LL POSPOS

1010-4-4 1,4x101,4x10-2-2ng/ng/LL POSPOS

1010-5-5 1,4x101,4x10-3-3ng/ng/LL POSPOS

1010-6-6 1,4x101,4x10-4-4ng/ng/LL POSPOS

1010-7-7 1,4x101,4x10-5-5ng/ng/LL POSPOS

1010-8-8 1,4x101,4x10-6-6ng/ng/LL POSPOS

1010-9-9 1,4x101,4x10-7-7ng/ng/LL +/-+/-

1010-10-10 1,4x101,4x10-8-8ng/ng/LL NEGNEG

Detecção de C. difficile de fezes - Multiplex PCR em Tempo Real Smart Cycler

Gene tcdA: Toxina A

Gene tcdB: Toxina B

2 Pares de Primers

Sondas

FAM: Toxina A

TET: Toxina B

Tempo de Resposta: ~ 3 H

Controlo de Inibição

Sensibilidade Analítica: 10 cópias genoma por reacção de PCR

Clostridium difficile

DETECÇÃO DE RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS (UBM-HGSA)

BACTÉRIABACTÉRIA RESISTÊNCIARESISTÊNCIA MUTAÇÕESMUTAÇÕES

Mycobacterium Mycobacterium tuberculosistuberculosis

RifampicinaRifampicinarpoB rpoB 526(CAC526(CACGAC)GAC)

531 (TCG531 (TCGTTG)TTG)

533 (CTG533 (CTGCCG)CCG)

IsoniazidaIsoniazidakatG katG 315 (AGC315 (AGCACC)ACC)

315 (AGC315 (AGCAAC)AAC)

Helicobacter Helicobacter pyloripylori

ClaritromicinaClaritromicina 23S rDNA23S rDNA

TUBERCULOSEIdentificação de isolados de culturaIdentificação directa de produtos biológicos(em desenvolvimento)

Espécie Tm

M. tuberculosis 63ºC

M. kansasii 59ºC

M.avium 58ºC

M.intracellulare 54ºC

M.gordonae 49ºC

16S rDNA

Gene 16S rDNAGene 16S rDNA – natureza conservada no reino procariota– natureza conservada no reino procariota

PCR UniversalPCR Universal uma reacção uma reacção amplifica vários agentes amplifica vários agentes

Detecção da presença de bactérias em amostras clínicas estéreisDetecção da presença de bactérias em amostras clínicas estéreis

16S rDNA Aplicações:Aplicações:

LCR, Sangue, produtos biológicos “estéreis”LCR, Sangue, produtos biológicos “estéreis”

Problemas:Problemas: Detecção de bactérias inviáveisDetecção de bactérias inviáveis Risco de contaminação laboratorialRisco de contaminação laboratorial Risco de contaminação na colheitaRisco de contaminação na colheita

Correlacionar resultados Correlacionar resultados

positivos com a clínicapositivos com a clínica

Inactivação do DNA exógeno (irradiação UV reagentes/material) Inactivação do DNA exógeno (irradiação UV reagentes/material)

Extracção de ácidos nucleicosExtracção de ácidos nucleicos Bactérias Gram - Bactérias Gram - Bactérias Gram + Bactérias Gram + MicobactériasMicobactérias

Lise enzimática / mecânicaLise enzimática / mecânica Magna Pure LC, RocheMagna Pure LC, Roche

Total Nucleic Acid Isolation KitTotal Nucleic Acid Isolation Kit

AmplificaçãoAmplificação

Smart Cycler, Cepheid - PCR em Tempo RealSmart Cycler, Cepheid - PCR em Tempo Real

Múltiplos controlos negativos (extracção, amplificação)Múltiplos controlos negativos (extracção, amplificação)

16S rDNA

16S rDNA

Sensibilidade analítica do métodoSensibilidade analítica do método

S. aureusS. aureus 160 UFC/mL 160 UFC/mL

E. coliE. coli 200 UFC/mL 200 UFC/mL

Aplicação a 76 amostras de LCR (Meningite Bacteriana Aguda)Aplicação a 76 amostras de LCR (Meningite Bacteriana Aguda)

Sensibilidade: 80%; Especificidade: 94.5%Sensibilidade: 80%; Especificidade: 94.5%

VPP: 84%; VPN: 92.7%VPP: 84%; VPN: 92.7%

Resultado – POSITIVO/NEGATIVOResultado – POSITIVO/NEGATIVO

EspécieEspécie OrigemOrigem PCR em tempo PCR em tempo realreal

E. coliE. coli ATCC 25922ATCC 25922 PosPos

S. aureusS. aureus ATCC 25923ATCC 25923 PosPos

E. faecalisE. faecalis ATCC 25212ATCC 25212 PosPos

S. pneumoniaeS. pneumoniae ATCC 6305ATCC 6305 PosPos

P. mirabilisP. mirabilis ATCC 12453ATCC 12453 PosPos

E. cloacaeE. cloacae ATCC 13047ATCC 13047 PosPos

K. pneumoniaeK. pneumoniae ATCC 13883ATCC 13883 PosPos

P. aeruginosaP. aeruginosa ATCC 27853ATCC 27853 PosPos

H. influenzaeH. influenzae ATCC 49766ATCC 49766 PosPos

N. meningitidisN. meningitidis Isolado clínicoIsolado clínico PosPos

L. monocytogenesL. monocytogenes Isolado clínicoIsolado clínico PosPos

S. epidermidisS. epidermidis Isolado clínicoIsolado clínico PosPos

S.agalactiaeS.agalactiae Isolado clínicoIsolado clínico PosPos

M. tuberculosisM. tuberculosis Isolado clínicoIsolado clínico PosPos

Leptospira spLeptospira sp Isolado clínicoIsolado clínico PosPos

16S rDNA

16S rDNA

Estirpes detectadas por outros autores com os mesmos primersEstirpes detectadas por outros autores com os mesmos primers

Acinetobacter calcoaceticusAcinetobacter calcoaceticus Clostridium perfringensClostridium perfringens

Aeromonas hydrophilaAeromonas hydrophila Corynebacterium genitaliumCorynebacterium genitalium

Alcaligenes faecalisAlcaligenes faecalis Erysipelothrix rhusiophathiaeErysipelothrix rhusiophathiae

Bacteroides fragilisBacteroides fragilis Gardnerella vaginalisGardnerella vaginalis

Campylobacter fetusCampylobacter fetus Lactobacillus acidophilusLactobacillus acidophilus

Campylobacter jejuniCampylobacter jejuni Leuconostoc paramesenteroidesLeuconostoc paramesenteroides

Eikenella corrodensEikenella corrodens Micrococcus luteusMicrococcus luteus

Mycoplasma genitalium Mycoplasma genitalium Flavobacterium meningosepticumFlavobacterium meningosepticum

Legionella pneumophilaLegionella pneumophila Mycoplasma hominisMycoplasma hominis

Moraxella catarrhalisMoraxella catarrhalis Mycoplasma pneumoniaeMycoplasma pneumoniae

Neisseria gonorrhoeaeNeisseria gonorrhoeae Peptostreptococcus anaerobiusPeptostreptococcus anaerobius

Providencia stuartiiProvidencia stuartii Peptostreptococcus magnusPeptostreptococcus magnus

Salmonella typhimuriumSalmonella typhimurium Propionibacterium acnesPropionibacterium acnes

Serratia marcescensSerratia marcescens Streptococcus mitisStreptococcus mitis

Yersinia enterocoliticaYersinia enterocolitica Streptococcus sanguisStreptococcus sanguis

Desafio:Desafio:

sensibilidade sem comprometer a especificidadesensibilidade sem comprometer a especificidade

Kits de Extracção MKits de Extracção MGradeGrade

Enzimas LowDNAEnzimas LowDNA

Essencial:Essencial:

Resultados positivos Resultados positivos Identificação do produto amplificado Identificação do produto amplificado

Distinguir contaminações de verdadeiros positivos Distinguir contaminações de verdadeiros positivos

Correlação com clínicaCorrelação com clínica

Valor Preditivo PositivoValor Preditivo Positivo

SensibilidadeSensibilidade

16S rDNA

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Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Biologia Molecular em Microbiologia Clínica TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS