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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE TECNOLOGIA E GEOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE ENERGIA NUCLEAR
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIAS
ENERGÉTICAS E NUCLEARES
Detecção de Micronúcleo em Hemócitos de Biomphalaria
glabrata exposto a Radiação Gama de 60Co
LUANNA RIBEIRO SANTOS SILVA
RECIFE – PERNAMBUCO – BRASIL
AGOSTO – 2010
3
Detecção de Micronúcleo em Hemócitos de Biomphalaria glabrata exposto a
Radiação Gama de 60Co
LUANNA RIBEIRO SANTOS SILVA
4
5
Detecção de Micronúcleo em Hemócitos de Biomphalaria glabrata exposto a
Radiação Gama de 60Co
Dissertação de Mestrado submetido
ao Programa de Pós-graduação em
Tecnologias Energéticas e Nucleares,
do Departamento de Energia Nuclear,
da Universidade Federal de
Pernambuco, para obtenção do título
de Mestre em Ciências. Área de
Concentração: Dosimetria e
Instrumentação Nuclear.
Orientador: Profª. Drª Edvane Borges da Silva (CAV/DEN-UFPE) Co-orientadora: Profª. Drª. Ana Maria M. De Albuquerque Melo (DBR-UFPE)
RECIFE-PERNAMBUCO-BRASIL
AGOSTO-2010
6
7
Dedico à minha família e meus amigos
que sempre me acompanharam
em todos os momentos.
8
AGRADECIMENTOS
A todas as forças celestiais que me ajudaram na minha jornada da vida.
À Nossa Senhora da Conceição, por nunca ter me faltado quando precisei.
Aos meus pais, Antonio Ribeiro Silva Filho e Severina Cecília dos Santos, por toda dedicação, amor e educação a mim dada.
À minha Orientadora, Ana Maria Mendonça de A. Melo, pela paciência, amor e companheirismo e por TODOS esses anos juntos no laboratório. Porque sem ela não sei o que eu seria.
À minha Orientadora, Edvane Borges da Silva, pelo carinho e toda paciência durante todo o mestrado.
Ao professor Amâncio, pelos ensinamentos e por ser meu pai cientifico.
À minha amada avó Alice Anunciação (in memorian) por ter simplesmente ter sido tudo na minha vida e ter me ensinado que o amor é o maior troféu que um homem pode carregar.
Aos meus avós que mesmo sem perceber me ajudam muito.
A meu irmão Luann Ribeiro, por ter me apoiado em todos as momentos que precisei.
Aos meus amigos que sempre estavam ao meu lado em todos os momentos da minha vida.
A todos do laboratório de Radiobiologia da UFPE, Cris, Mona, Fabrício, Gustavo, Pedro, Edvaldo, Will, Samia, Karine e todos que me ajudaram direta e indiretamente.
A minha amiga Rebeca Cantinha, pelo carinho e pela parceria.
Ao departamento de Biofísica e Radiobiologia do CCB/UFPE, pelo suporte e ajuda na minha jornada cientifica.
À seu Fredson pelo apoio e pelos incentivos que me foi dado durante todo o estagio.
Ao Laboratório de Metrologia das Radiações Ionizantes (DEN/ UFPE), na pessoa da Profª Helen Koury, por ter cedido gentilmente a fonte radioativa para realização de meus trabalhos.
Ao LAMBDA, na pessoa do Profº Ademir Amaral, pelo suporte de equipamentos e insumos para realização dos experimentos.
9
À Ronaldo e Clarissa, pelo o amor, pois é isso que nos une.
Ao meu grande amigo Luiz Reinuax (in memorian), por ter vibrado a cada conquista e por todo carinho que me foi dado. Te amo, jamais esquecerei a sua alegria.
À todas amizades cultivadas na graduação, que nunca esquecerei.
À Carlos Eduardo (Dola), pelo companheirismo, PACIÊNCIA e amor cultivado.
A todos os membros das bancas examinadoras Prof. Dr. Francisco Fernandes Amancio, Profa. Dra. Vlaudia Costa, Prof. Dr. Ademi r Amaral, Prof. Dr. Thiago de Salazar e Fernandes e Prof. Dr. Cristiano Aparecido Chagas por suas valiosas contribuições para o enriquecimento deste trabalho. Ao Departamento de Energia Nuclear na pessoa do Prof. Dr. André Maciel Netto.
Aos professores do DEN, pelo suporte científico que me concederam neste mestrado
A todos os funcionários do DEN, em especial a Magali e Nilvânia, pela amizade e por tornarem minha jornada muito mais agradável.
Aos colegas do GERAR , pela companhia e pelos momentos agradáveis que passamos juntos.
Aos colegas do DEN pela amizade e companhia neste caminho.
À minha pequenina cunhada Natalia Mirrely, por ter aquentado meus estresses.
Às minhas filhas, Sasha, Lecca e Raquely por terem alegrado todos os meus dias.
À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pelo suporte financeiro para a execução deste trabalho.
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Esquema da ação da radiação na molécula de DNA. www.cnen.gov.br 5
Figura 2 Classificação taxonômica de Biomphalaria glabrata, segundo Rey (2001) 10
Figura 3 (A) Biomphalaria glabrata (SAY, 1818) melânico. (B) Concha do molusco B. glabrata1. Fonte: http://www.elrincondelmalacologo.com 11
Figura 4 Hemócito de B. glabrata, corados com DAPI e observados no microscópio de fluorescência. (aumento 1000X) 13
Figura 5 (A) Hialinócitos corados com Giemsa.(1000 X); (B) Granulócitos corado com Giemsa.(1000 X) 14
Figura 6 Aquários de criação de moluscos B. glabrata do moluscário do Departamento de Biofisica e Radiobiologia-UFPE 18
Figura 7 (A) Recipientes individuais de B. glabrata; (B) Molusco, demonstrando o diâmetro da concha 19
Figura 8 (A) Fonte Gammacell® 220 Excel-MDS Nordion. (B) Tubos Falcon com os B. glabrata que serão irradiados 21
Figura 9 Microscópio óptico Medilux do laboratório de Radiobiologia (DBR-UFPE) 23
Figura 10 Microscópio de Fluorescência Leica CW4000 do Lambda (DEN-UFPE) 24
Figura 11 Esquema com os critérios de identificação de MN; (A) Diâmetro menor que 1/3 do tamanho do núcleo; (B) Cor e textura semelhante ao núcleo; (C) Não estar em contato direto com o núcleo. 25
Figura 12 Alterações encontrados na hemolinfa de B. glabrata irradiados nas doses de 35, 45 e 55 Gy. (A) Núcleo bilobulado; (B) núcleos interligados 28
Figura 13 Apoptose em hemócitos de Biomphalaria glabrata submetidos a 55Gy de radiação gama de 60Co 29
Figura 14 (A) Hemócito corado com Giemsa; (B) Hemócito corado com Hoechst 33258. A seta vermelha indica MN 34
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Hemócitos originários dos moluscos irradiados e não
irradiados
26
Tabela 2 – Dados da Frequência de Micronúcleo de B. glabrata
submetidos a radiação gama de 60Co
30
Tabela 3- Vantagens e limitações das técnicas de coloração Giemsa e
Hoechst 33258
35
12
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
B. glabrata Biomphalaria glabrata 60Co Cobalto-60
CNEN Comissão Nacional de Energia Nuclear
DBR Departamento de Biofísica e Radiobiologia
DNA Ácido Desoxirribonucleico
DEN Departamento de Energia Nuclear
Gy Gray
kGy KiloGray
MN Micronúcleo
13
Detecção de Micronúcleo em Hemócitos de Biomphalaria glabrata exposto a
Radiação Gama de 60Co
Autor: Luanna Ribeiro Santos Silva Orientador: Profª. Drª Edvane Borges da Silva Co-orientadora: Profª. Drª. Ana Maria M. De Albuquerque Melo
RESUMO
As radiações ionizantes podem induzir mutações gênicas, aberrações cromossômicas e morte celular. Recentemente, começou a haver grande empenho no desenvolvimento de técnicas que auxiliem na compreensão desses possíveis danos biológicos surgidos após exposições dos organismos a certas doses de radiação ionizante. Dentre estas técnicas, o teste do micronúcleo tem se mostrado um ótimo biomarcador de efeitos de genotoxicidade do dano ao DNA. Esta técnica também pode ser utilizada para detecção de genotoxicidade ambiental, na biomonitoração. O molusco Biomphalaria glabrata, devido às suas características biológicas e ambientais, tem se apresentado como um ótimo modelo experimental, possibilitando a avaliação de efeitos produzidos por agentes físicos e químicos. Diante disso, o presente trabalho visou detectar os efeitos genotóxicos da radiação gama de 60Co em hemócitos de Biomphalaria glabrata, por meio do teste do micronúcleo, bem como estabelecer este ensaio como um novo biomarcador ambiental. Os moluscos foram divididos em grupos e submetidos a dose de 0 (controle), 25, 35, 45 e 55 Gy de radiação gama. Após 48 horas da irradiação, a hemolinfa dos moluscos foi coletada e analisada em microscópios óptico e de fluorescência. As lâminas foram coradas com Giemsa e hoechst 33258, posteriormente foram analisadas quanto ao número de hemócitos, alterações nucleares e frequência de micronúcleos. A análise estatística foi realizada por meio do Teste do χ2, ANOVA e teste de Tukey, com p<0,05. Os resultados obtidos demonstram que moluscos adultos de B. glabrata se mostraram sensíveis aos efeitos da radiação gama de 60Co. Na dose 35 Gy apresentaram um número menor de hemócitos, enquanto que os expostos a 55 Gy uma maior quantidade de hemócitos. Os hemócitos dos moluscos irradiados apresentaram alterações morfológicas e aterações celulares nas doses de 35, 45 e 55 Gy, sendo a dose de 55 Gy a mais radiotóxica. A freqüência de micronúcleos não foi dose-dependente, porém apresentou diferença significativa entre o grupo controle e os grupos irradiados. Pode-se concluir que a análise morfológica e a frequência de micronúcleo de hemócitos de Biomphalaria glabrata são parâmetros confiáveis na avaliação da ação de agentes genotóxicos em ambientes aquáticos.
Palavras-chave: genotoxicidade ambiental, micronúcleo, hemócitos,
biomonitoramento, Biomphalaria glabrata, Radiação, 60Co
14
Detection of Micronuclei in Haemocytes from Biomphalaria glabrata exposed to 60Co Gamma Radiation
Author: Luanna Ribeiro Santos Silva Adviser: Profª. Drª Edvane Borges da Silva Co-adviser: Profª. Drª. Ana Maria M. De Albuquerque Melo
ABSTRACT
Ionizing radiation can induce genetic mutations, chromosomal aberrations and cellular death. Recently, a large effort has been done for the development of several techniques that help with the comprehension of possible biological damages that occur after some organisms’ exposure to certain doses of ionizing radiation. Among these techniques, the micronucleus test has proved an excellent biomarker of genotoxic effects from DNA damage. This technique can also be used for the detection of environmental genotoxicity in biomonitoring. The mollusk Biomphalaria glabrata, due to their biological characteristics and environmental factors, has emerged as an excellent experimental model, enabling the evaluation of effects produced by physical and chemical agents. Therefore, this study aims to detect the genotoxic effects of gamma radiation from 60Co in haemocytes from Biomphalaria glabrata through micronucleus tests, and set this as a new biomarker test environment. The snails were divided into groups and subjected to doses of 0 (control), 25, 35, 45 and 55 Gy of gamma radiation. After 48 hours of irradiation, the mollusks haemolymph were collected and examined in optical and fluorescence microscopes. The slides were stained with Giemsa and Hoechst 33258, and analyzed according to the haemocytes number, nuclear changes and micronuclei frequency. The statistical analysis was performed using the χ2Test, ANOVA and Tukey test with p<0.05. The results showed that adult snails B. glabrata were sensitive to effects of 60Co gamma radiation. The 35 Gy dose showed a lower number of haemocytes, whereas the exposed to 55 Gy showed greater amounts of haemocytes. The haemocytes of irradiated mollusks showed morphological and cellular abnormalities at doses of 35, 45 and 55 Gy and the dose of 55 Gy was more radiotoxic. The micronuclei frequency was not dose-dependent, but there is significant difference between control and irradiated-groups. It can be concluded that morphology analysis and the micronuclei frequency in haemocytes of Biomphalaria glabrata are reliable parameters to evaluate the effects of genotoxic agents in aquatic environments. Keywords: micronucleus, haemocytes, biomonitoring, Biomphalaria glabrata, radiation, 60Co
15
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 1
2. REVISÃO DE LITERATURA 4
2.1. Radioecologia 4
2.2. Biomonitoramento 7
2.2.1. Teste do micronúcleo 9
2.3. Biomphalaria e sua utilização como bioindicador 10
3. METODOLOGIA 18
3.1. Criação e Manutenção dos Moluscos 18
3.2..Seleção dos moluscos 19
3.3. Irradiação de Moluscos Adultos 20
3.4. teste de Micronúcleo dos moluscos B. glabrata 21
3.4.1. Coloração Giemsa (convencional) 22
3.4.2. Coloração para fluorescência 23
3.5. Análise das lâminas 24
3.6. Análise estatística 25
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 26
4.1. Análise da radiosensibilidade celular dos hemócitos de
B. glabrata.
26
4.2. Análise da freqüência de micronúcleo 30
4.3. Comparação entre Metodologias de Coloração 33
5. CONCLUSÕES 36
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 37
16
1. INTRODUÇÃO
Os organismos vivos estão expostos naturalmente à ação das
radiações, sejam elas provenientes de fontes naturais ou artificiais (MELO, 1994
& MELO, 1998). Sabe-se que as radiações ionizantes também podem induzir a
mutações gênicas, aberrações cromossômicas e morte celular (SEGRETO, 2005;
HALL, 1994).
As células irradiadas apresentam ainda uma tendência ao aumento
ou diminuição do número de cromossomos e muitos dos efeitos celulares são
decorrentes de mudanças durante a duplicação ou reparo de danos do DNA.
Estas alterações podem causar instabilidades cromossômicas transmissíveis,
resultando em efeitos variados, mesmo depois de vários ciclos mitóticos
(GREENSTOCK, 1986; COSTA; MENK, 2000).
Recentemente tem havido grande empenho no desenvolvimento de
técnicas que auxiliem na compreensão desses possíveis danos biológicos que
surgem após exposições dos organismos a certas doses de radiação ionizante.
São elas: o teste do letal dominante (NAKANO, 2003; BATEMAN, 1971;
TALLARICO, 2004), ensaio do cometa (GRAZEFFE, 2008; VILELLA, 2006a);
teste do micronúcleo (FERNANDES, 2005; BRAGA, 2006, PAVLICA, 2000;
GODOY, 2008, CARVALHO, 2005) e aberrações cromossômicas (BAUCHINGER,
1995; RAMALHO, et al, 1988; LLOYD, 1997; FERNANDES, 2008a;
FERNANDES, 2008b).
Os micronúcleos (MN) são estruturalmente pequenos núcleos
representando o material genético que foi perdido pelo núcleo principal, como
consequência de um dano genético que pode ser causado por agentes físicos,
químicos ou biológicos, capazes de interferir no processo de ligação do
cromossomo às fibras do fuso ou que possam induzir a perda de material
genético, como cromossomos inteiros ou fragmentos de cromossomos
(SCHMIDT, 1975; VILLELA, 2006).
17
O ensaio do micronúcleo tem se mostrado um ótimo biomarcador da
ação de agentes genotóxicos ou mutagênicos. Por esta razão é utilizado no
estudo da genotoxicidade ambiental, com o propósito de biomonitoramento
(VILLELA, 2006).
O estudo da monitoração dos ambientes é importante, devido aos
diversos agentes físicos e químicos que são lançados no ambiente, provenientes
de diversas atividades humanas (ARAUJO et al., 2001). Organismos vivos, como
os moluscos Biomphalaria glabrata, que estão nesses ambientes podem sofrer
danos em suas biomoléculas. Por esta razão, o desenvolvimento de técnicas
sensíveis e de baixo custo para detecção destes efeitos é de grande importância.
O molusco, Biomphalaria glabrata, devido às suas características
biológicas e ambientais, tem-se apresentado como ótimo modelo experimental,
possibilitando a avaliação de efeitos produzidos por agentes físicos e químicos
(ESTEVAM, 2006; CANTINHA, 2010; SILVA, 2008, TALLARICO, 2004). Por sua
ampla distribuição geográfica e interferência sobre a saúde humana, como vetor
intermediário da esquistossomose mansônica, ganha interesse não apenas como
modelo de alterações fisiológicas induzidas por estímulos externos, mas também
por viabilizar a padronização de metodologias de controle populacional, ou como
bioindicadores e biomarcadores de interferentes ambientais.
Com isso, o objetivo geral deste trabalho é fornecer subsídios para a
padronização do ensaio do micronúcleo em hemócitos de Biomphalaria glabrata
como nova ferramenta na biomonitoração da ação de agentes físicos e químicos
lançados em ambientes aquáticos.
Neste contexto, esta pesquisa busca especificamente:
• Estudar a radiossensibilidade dos moluscos adultos da espécie
Biomphalaria glabrata;
• Avaliar alterações celulares nos hemócitos destes moluscos
submetidos a diferentes doses de radiação gama de 60Co;
• Analisar a frequência de micronúcleos em moluscos B. glabrata
submetidos a radiação gama de 60Co.
18
• Comparar qual a melhor metodologia de coloração, entre o Giemsa
e Hoechst, a ser utilizada no ensaio do micronúcleo em hemócitos
de B. glabrata.
19
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Radioecologia
Didaticamente, radioecologia ou “ecologia da radiação” pode ser
considerada uma ciência multidisciplinar, que visa a compreensão das inter-
relações entre a radiação ionizante ou de substâncias radioativas com o meio
ambiente. Portanto, podemos dizer que esta ciência desempenha um papel cada
vez mais importante no controle das diferentes fontes de poluição ambiental
(ANJOS, et al., 2004; ANJOS, 2006).
Sabe-se que a radiação é energia que se propaga através da matéria
ou do espaço em forma de onda (radiação eletromagnética) ou partícula (radiação
corpuscular) (CNEN, 2005).
A radiação eletromagnética, dependendo de sua energia e interação
com a matéria, pode ser classificada em ionizante (radiação gama e os raios-X),
quando possuir energia suficiente para arrancar elétrons de um átomo,
produzindo pares de íons, e não ionizante que interage com o meio podendo
interferir nas biomoléculas excitando, os elétrons promovendo de sua camada de
origem para uma camada mais externa. São exemplos de radiação não ionizante
os raios ultravioletas, infravermelhos, as ondas de radiofrequência, o laser, as
microondas e a luz visível (CNEN, 2005; BITELLI, 2006).
A radiação corpuscular é representada por partículas carregadas,
como alfa, beta, prótons e elétrons, que podem interagir com o meio causando
grande ionização das moléculas (CNEN, 2005; BITELLI, 2006).
Os efeitos da radiação em nível celular são decorrentes de mudanças
ocorridas durante a duplicação ou no reparo de danos do DNA, causando
instabilidade cromossômica transmissível. Os efeitos podem ocorrer quando o
DNA sofre ação direta das radiações (ionização) ou indireta, por meio do ataque
de radicais livres que são produzidos pela radiólise da molécula da água (Figura
20
1). O DNA expõe-se basicamente a dois tipos de danos: mutações gênicas e
quebras, acarretando falhas na divisão celular podendo levar a morte celular ou a
efeitos variados mesmo depois de vários ciclos mitóticos (SABATIER et al., 1995).
Figura 1 Esquema da ação da radiação na molécula de DNA. www.cnen.gov.br
Ao interagir com o sistema biológico, a radiação ionizante pode
provocar nas células diversas respostas que acabam ou não as levando à morte.
Os efeitos dependem do tipo de estrutura atingida e da eficiência do mecanismo
de reparo celular (BARACAT, 2000; MOORE, 2002). Outros aspectos inerentes
às radiações ionizantes e interferentes sobre seus efeitos biológicos devem ser
observados, tais como: o tipo de radiação empregada, a quantidade de energia
liberada no percurso desta, a atividade da fonte radioativa, a taxa de dose da
fonte, a presença de oxigênio e a dose absorvida (POUGET; MATHER, 2001).
Pode-se observar ainda que o dano biológico produzido pela radiação
ionizante aumenta com o incremento da dose ou com a quantidade de energia
absorvida da radiação. Podemos conceituar dose absorvida como a energia
21
média depositada pela radiação em um volume elementar de matéria (CNEN,
2005).
Segundo Okuno (1988) e Segreto (2000), os efeitos biológicos da
radiação são comumente classificados em somáticos e genéticos. Os efeitos
somáticos afetam apenas a pessoa irradiada e podem ser divididos em imediatos
e tardios. Os efeitos imediatos aparecem nos indivíduos que foram expostos à
radiação ionizante e apresentarão sinais e sintomas em até 60 dias (eritemas,
síndrome aguda da radiação etc). Os efeitos tardios caracterizam-se por surgirem
após este período ou até anos depois da exposição, podendo induzir
cancerização. Os efeitos genéticos (hereditários) podem ocorrer quando células
germinativas são irradiadas, dessa forma os efeitos resultantes podem provocar
modificações.
O homem, não possui sensores biológicos capazes de detectar este
tipo de energia ionizante; logo, diferentes equipamentos foram desenvolvidos para
esta finalidade, tais como: Geiger-Müller, caneta dosimétrica, contador
proporcional, dosímetro termoluminescente e emulsão fotográfica. No entanto, os
detectores físicos são capazes de aferir quantitativamente a dose recebida pelo
sistema material ou biológico, porém são imprecisos na determinação dos danos
que podem surgir no meio ambiente e consequentemente no homem. Isto tem
sido motivo para o desenvolvimento de diferentes estudos nas diversas áreas
relacionadas à energia nuclear, inclusive na radioecologia (ICRP, 2003).
Estudos anteriores utilizaram bactérias (MORAES et. al, 1998),
culturas de células (COSTA et al, 2002), peixes (CHATY et al, 2004), conchas de
moluscos (FRANTSEVICH et al, 1995), ghost de hemácias (AMANCIO, 1998) e
cultura de linfócitos (FERNANDES, 2005) como modelos para mensurar os danos
provocados pela radiação nos sistemas biológicos.
Os modelos animais ideais para o estudo dos efeitos biológicos das
radiações ionizantes devem possuir como características um curto ciclo vida, fácil
manutenção em laboratório, baixo custo de manutenção, resposta rápida e
precisa e boa reprodutibilidade. O molusco Biomphalaria glabrata (B. glabrata) por
22
reunir todas estas características vem se tornando alvo de estudo para uma futura
utilização como bioindicador, não apenas da ação de agentes químicos, mas
também de agentes físicos presentes no meio ambiente (MÜNZINGER, 1987;
MOTTA et al., 1997; CANTINHA, 2008).
2.2. Biomonitoramento
Com o crescimento da industrialização e da urbanização ocorrido nas
últimas décadas, os ecossistemas aquáticos passaram a sofrer grandes impactos
decorrentes destes processos. Atividades industriais, agrícolas e domésticas são
responsáveis pelo uso de mais de um terço da água doce acessível, além disso,
estas atividades são grandes responsáveis pela contaminação destas águas por
numerosos compostos químicos. Estas águas atingem os rios, lagos e oceanos
contendo uma infinidade de contaminantes em diversas concentrações (FENT,
2004).
Para o estabelecimento da condição homeostática destes ambientes
naturais, é necessário que seja realizado monitoramento destas áreas o que
possibilitaria tomada de ações corretivas (MONSERRAT et al., 2007). Entretanto,
o monitoramento e a avaliação do risco dos ambientes impactados não podem ser
baseados exclusivamente em análises químicas de amostras ambientais, pois
não são apropriadas na indicação e predição dos efeitos deletérios causados por
contaminantes na biota (BARSIENE et al., 2006, CAJARAVILLE et al., 2000).
Desta forma, para avaliar os impactos dos poluentes na qualidade ambiental é
pertinente que sejam mensurados os efeitos que estas substâncias causam nos
organismos vivos destes ecossistemas (WELLS et al., 2001).
Logo, biomonitoramento pode ser definido como o uso sistemático
das respostas de organismos vivos para avaliar mudanças ocorridas no ambiente,
geralmente causadas por ações antropogênicas (BUSS, et al., 2003).
23
Dentre as diversas metodologias utilizadas para biomonitoração
ambiental, têm-se utilizado ensaios in vitro como o teste de AMES e in vivo, por
exemplo, o teste do MN e aberrações cromossômicas (VILLELA, 2006).
O teste do MN utiliza organismos vivos expostos a um agente
mutagênico em um determinado ambiente, os dados coletados podem nos
fornecer uma resposta complexa entre a atividade genotóxica e a eficiência dos
mecanismos de defesa do organismo. Por esta razão, representa uma ferramenta
de grande relevância ecotoxicológica (VILLELA, 2006).
A dosimetria citogenética foi utilizada na biomonitoração ambiental no
acidente nuclear de Chernobyl. Cristaldi et al. (1991) investigaram o impacto
ambiental do acidente de Chernobyl sobre roedores (Clethrionomys glareolus
Schreb) de diferentes idades que habitavam quatro regiões do sudeste sueco. O
experimento empregou testes para determinação dos radionuclídeos
(principalmente 137Cs) e testes de mutagenicidade (teste do micronúcleo de
medula óssea e ensaio da anormalidade do esperma). Os resultados obtidos
mostraram uma correlação positiva entre o aumento de micronúcleos em
eritrócitos policromáticos e a dose absorvida. Ao final dos experimentos
observaram que o teste do micronúcleo se mostrou eficaz na análise dos efeitos
biológicos da contaminação por radionuclídeo.
No Brasil, a aplicação prática da dosimetria citogenética foi realizada
nas vítimas do acidente de Goiânia (1987), quando uma parcela da população foi
contaminada por Césio (137Cs). Nesse caso, detectou-se a freqüência de seis
aberrações cromossômicas instáveis (cromossomos dicêntricos, em anel e
fragmentos acêntricos) permitindo o cálculo da dose de radiação absorvida por
cada indivíduo estudado (RAMALHO; NASCIMENTO, 1991).
Pode-se afirmar que a dosimetria citogenética, tão utilizada para
mensurar dose absorvida de radiação em humanos expostos, pode ser utilizada
para medir os efeitos da radiação ou de substâncias químicas sobre outros
indivíduos ou espécies, mostrando ser uma excelente ferramenta nos estudos da
radioecologia.
24
2.2.1. Teste do Micronúcleo (MN)
Micronúcleos são corpúsculos similares em estrutura ao núcleo,
constituído de uma pequena massa nuclear delimitada por membrana e separada
do núcleo principal. Podem ser formados a partir de perdas de fragmentos
acêntricos; por uma variedade de consequências mecânicas de quebra e troca
cromossômica e por perda de cromossomos inteiros (HEDDLE et al., 1991).
Assim sendo, o micronúcleo representa perda da integridade da cromatina em
consequência de dano cromossômico estrutural (fragmento) ou dano no aparelho
mitótico, sendo agentes genotóxicos um dos prováveis causadores destes danos.
(VILLELA, 2006b)
O teste do MN é um ensaio tecnicamente simples que permite a
detecção da ação de agentes clastogênicos (que quebram cromossomos) e
aneugênicos (que induzem aneuploidia ou segregação cromossômica anormal),
sendo considerado um excelente biomarcador. Amplamente utilizado há vários
anos, sendo, portanto, bem validado para um grande número de substâncias
testadas. É uma técnica de triagem rápida e de baixo custo, adequada para
avaliar a exposição de peixes marinhos e de água doce a contaminantes (CÓLUS
et al., 2002).
O aspecto mais importante do teste do micronúcleo é que ele permite
identificar eventual aumento na frequência de danos genéticos em células que
são expostas variados agentes genotóxicos, sendo capaz de expressar os danos
nos cromossomos na forma de MNs. Assim, esse teste é originalmente, entre os
testes citogêneticos, o que fornece uma medida de confiança da perda do
cromossomo e da ruptura do fuso mitótico (FENECH, 1998).
25
O teste do micronúcleo, ao lado da análise de aberrações
cromossômicas e o ensaio do Cometa, é considerado o padrão-ouro dentre os
métodos citogenéticos. Tem sido amplamente utilizado em programas de
biomonitoramento, e é considerado uma valiosa ferramenta para avaliar
exposições de organismos aquáticos a substâncias genotóxicas. O teste do
micronúcleo é um importante sinalizador precoce de danos com consequências
irreversíveis (FREIRE, 2008).
Diante do que foi mostrado e da escassez de trabalhos utilizando
animais dulcícolas, vê-se necessário a padronização de uma técnica sensível,
como o teste do MN, para detectar a ação de agentes mutagênicos químicos e
físicos.
2.3 Biomphalaria e sua utilização como bioindicador
O caramujo Biomphalaria tem sua classificação taxonômica descrita
segundo Rey (2001) como demonstrado no fluxograma a seguir:
Figura 2 Classificação taxonômica de Biomphalaria glabrata, segundo Rey
(2001).
26
Os moluscos Biomphalaria glabrata são de água doce, possuem
conchas grandes em geral discóides, enroladas em espiral plana, sem opérculo,
na qual se forma de cada lado uma depressão que lembra um umbigo (Figura 3-
A). Nos criadouros naturais são encontrados exemplares com tamanho entre 1 a
2,5 cm, apresentando conchas com 4 a 6 giros (Figura 3 -B) (REY, 2001)
Figura 3 (A) Biomphalaria glabrata (SAY, 1818) melânico. (B) Concha do molusco
B. glabrata1. Fonte: http://www.elrincondelmalacologo.com.
Dentre os invertebrados, o filo Mollusca mostra evoluções nos
sistemas que não aparecem nos outros filos. Fazendo uma breve descrição dos
sistemas desses animais, podemos citar o sistema excretor que é composto de
uma estrutura alongada denominada rim que tem um curto ureter. Ao longo de
todo o rim observa-se uma prega mucosa, saliente e pigmentada, denominada
crista renal (REY, 1991; NEVES, 2004). A respiração é feita por dois órgãos: o
saco pulmonar e as pseudobrânquias, embora o órgão respiratório principal seja o
saco pulmonar (PESSÔA; MARTINS, 1988; REY, 1991; CIMERMAM;
CIMERMAM, 2001; NEVES, 2004).
A principal evolução do filo mollusca é o desenvolvimento de um
sistema nervoso primitivo, ausente nos demais filos de invertebrados (BARNES,
1996). Nos gastrópodes, o sistema nervoso é formado por gânglios que ficam
dispostos em torno do esôfago, atrás do saco bucal. Os órgãos dos sentidos são:
um par de olhos, um receptor olfativo (osfrádia), um par de órgãos do equilíbrio e
A B
27
orientação locomotora (otocistos), receptores de contato sob a forma de
elementos sensitivos (ex.: tentáculos); além de quimioreceptores
morfologicamente diferenciados ou não, denominados rinóforos (REY, 1991;
CIMERMAM; CIMERMAM, 2001).
O aparelho digestivo desses animais começa com a abertura bucal,
localizada, por vezes, na extremidade da tromba; espessamentos cuticulares
denominados mandíbulas, e um par de glândulas salivares que se abrem na
cavidade bucal (REY, 1991).
No interior do saco bucal encontra-se a rádula, fita alongada e
revestida de numerosos dentes quitinosos, cujos dentículos, em forma de
ganchos, têm as pontas dirigidas para trás (PESSÔA; MARTINS, 1988). A rádula
faz com que os alimentos sejam ralados e ao mesmo tempo dragados em direção
ao esôfago (REY, 1991). Alguns autores consideram a rádula como estrutura
responsável pela eclosão dos ovos embrionados, sendo assim classificada como
um órgão radiossensível (MELO, 1998).
Os resíduos da digestão são evacuados pelo intestino, onde ocorre
também a reabsorção de água (REY, 1991). Essa evacuação ocorre ao nível da
pseudobrânquia (PESSÔA; MARTINS, 1988).
Esses moluscos são seres hermafroditas, com gônada única em
forma de cacho, providas de numerosos ácinos, denominadas ovoteste, onde
óvulos e espermatozóides formam-se lado a lado (PESSÔA; MARTINS, 1988;
REY, 1991; MONTEIRO; KAWANO, 1998; CIMERMAM; CIMERMAM, 2001).
Experimentos realizados por Paraense (1970) e Rozemberg (1989)
demonstraram que quando estes moluscos estão em colônia a forma de
reprodução preferencial é a fecundação cruzada, porém podem mudar sua forma
de reprodução para autofecundação, principalmente quando as circunstâncias
ambientais são severas.
Poucos relatos são encontrados na literatura sobre a presença de um
órgão hematopoiético especializado nos moluscos gastrópodes e bivalves,
28
existindo uma indicação de que nestes animais as células da hemolinfa são
formadas por todo o corpo. A presença de amebócitos (hemócitos) está dividida
entre a circulação sanguínea e o tecido conectivo, o que favorece o grande
sucesso adaptativo destas espécies, que ocupam posição de destaque no filo
Mollusca (SOUZA, 2006; GEORGE; FERGUSON, 1950; BROWN; BROWN,
1965).
O sistema circulatório desses animais é composto por coração com
duas cavidades: aurícula e ventrículo. O sangue ou hemolinfa compõe-se de
elementos amebóides (hemócitos), plasma rico em água, cloreto de sódio,
bicarbonatos e hemoglobina dissolvida, contendo ferro que permite a utilização do
oxigênio dissolvido à baixa tensão (PESSÔA; MARTINS, 1988; REY, 1991;
VERRENGIA GUERRERO et al., 1997). Os hemócitos (Figura 4) são as principais
células efetoras do sistema de defesa do caramujo, fagocitando, encapsulando e
destruindo agentes infecciosos (JEONG et al., 1983). Como o sistema circulatório
é aberto, os hemócitos podem se mover livremente para dentro e fora dos tecidos
(VAN DER KNAAP; LOKER, 1990).
Figura 4 Hemócito de B. glabrata, corados com DAPI e observados no
microscópio de fluorescência (aumento 1000X).
29
Os hemócitos são células morfológica e bioquimicamente
heterogêneas e podem ser dividas em hialinócitos que têm núcleo proprocional ao
tamanho do citoplasma, possuem poucas estruturas lisossomais e mostram baixa
tendência de formar pseudópodes ou fagocitar partículas (Figura 5 A). Outro tipo
são os chamados de granulócitos que tem mais citoplasma e lisossomos, formam
pseudópodes e fagocitam ativamente (Figura 5 B) (KNAAP & LOKER, 1990).
Figura 5 (A) Hialinócitos corados com Giemsa (1000 X); (B) Granulócitos corados
com Giemsa (1000 X).
Podemos citar ainda outra característica destes moluscos, que é o
poder de adaptação a variações ambientais, ou seja, vivem em regiões de
florestas tropicais e em zonas áridas, sobrevivem em baixas e altas altitudes,
porém, geralmente habitam cursos d’água de pouca velocidade, lagos e coleções
de água parada; suportando variação de pH entre 5,8 e 9,0 (JUBERG et al., 1987)
O gênero Biomphalaria é encontrado em vários países do mundo e no
Brasil já foram estudadas e identificadas 10 espécies, são elas: B. glabrata, B.
tenagophila, B. straminea, B. amazônica, B. peregrina, B. occidentale, B.
intermedia, B. schrammi, B. oligoza e B. kuhniana. (CARVALHO, 1992; REY,
A B
30
2001). Dentre estas destacamos as três primeiras como principais hospedeiras
intermediárias do S. mansoni, agente causador da esquistossomose mansônica,
doença endêmica no Brasil e em 70 países do mundo (PARAENSE, 1972).
Vários estudos mostraram que uma opção para eliminar ou diminuir a
população de moluscos é utilizar a radiação ionizante com o objetivo de esterilizar
estes animais, diminuindo consequentemente o número de espécimes no meio,
reduzindo assim a proliferação da esquistossomose (PERLOWAGORA-
SZUMLEWICZ, 1966; FARVAR; CEMBER, 1969; CANTINHA, 2008).
Após estes estudos, vários achados sobre a biologia de B. glabrata
foram desvendados, dando origem a novas linhas de pesquisas. Dentre elas vem
recebendo destaque a utilização destes moluscos como indicadores de poluição
ambiental química ou causada por agentes físicos, como a radiação ionizante
(ESTEVAM et al., 2006, SILVA et al., 2008; NAKANO et al., 2003)
Podemos citar primeiramente o trabalho de Okazaki et al. (1996), que
utilizando embriões destes moluscos, verificou que, após a exposição a radiação
gama de 60Co, foi possível verificar malformações específicas da presença de tal
agente. Melo (1998), também irradiando embriões de B. glabrata demonstrou que
os mesmos respondem de forma diferente a crescentes doses de radiação
ionizante.
Portanto, o desenvolvimento de técnicas mais sensíveis tornou-se um
objetivo entre os pesquisadores da área. Nakano et al. (2003) adaptou o teste do
letal dominante, utilizado primeiramente em mamíferos, para moluscos adultos de
B. glabrata. Neste experimento foram utilizados agentes químicos, mitomicina c e
ciclofosfamida, sendo utilizadas as linhagens albina e pigmentada do B. glabrata,
para detecção de mutações ligadas ao alelo dominante nos cruzamentos. Com
este experimento, foi comprovado que os espécimes adultos também apresentam
sensibilidade a substâncias mutagênicas.
O teste do letal dominante passou a ter diversificadas aplicações,
como a detecção da ação da radiação 60Co (TALLARICO et al, 2003), e ação de
31
herbicidas utilizados na agricultura e testados em laboratório (ESTEVAM et al.
2006, SILVA et al, 2008; SÁ, 2008) demonstrando a possibilidade do uso do
molusco adulto da espécie B. glabrata como biondicador de poluição ambiental
por agentes mutagênicos. Porém esta técnica possui como limitação a demora
para a obtenção dos resultados, o que torna necessário procurar técnicas mais
eficazes, de baixo custo e de resposta mais rápida.
Outro teste de mutagenicidade padronizado foi o ensaio cometa em
caramujos de água doce Biomphalaria glabrata (GRAZEFFE, 2008). O
experimento foi realizado objetivando detectar danos nos DNA de hemócitos
circulantes. Para isto, caramujos adultos foram irradiados com doses únicas de
2,5; 5; 10 e 20 Gy de radiação gama de 60Co. Os resultados demonstraram que
os efeitos genotóxicos da radiação ionizante foram detectados em todas as doses
utilizadas. O ensaio cometa em B. glabrata demonstrou ser mais uma ferramenta
na avaliação desses efeitos genotóxicos no ambiente (GRAZEFFE, 2008). No
entanto, essa técnica possui como principal limitação só ser possível realizar a
análise pontual do dano no DNA da célula, não mensurando danos de uma
geração celular para outra.
O teste do MN foi realizado in vivo e in vitro com a ostra Crassostrea
gigas para avaliar a efeitos genotóxicos do meio ambiente aquático. Os testes in
vitro foram realizados em adultos e jovens expostos ao benzo [a] pireno (BaP) e a
água de um efluente do rio Sena nas concentrações de 5, 50, 75 e 100%, um dos
locais mais contaminados da França. A freqüência de MN foi observada após 48
horas de exposição, para os dois poluentes. Observou-se que a frequência de
micronúcleos não foi muito sensível a diferentes graus de poluição, mas mostrou
alta variabilidade interindividual (BURGEOT, 1995).
Godoy (2008) utilizou os mexilhões Perna perna na região da ilha de
Cabo Frio, Arraial do Cabo, cerca de 100 km a nordeste da cidade do Rio de
Janeiro, como indicador de poluição por metais pesados 210Po/210Pb. Os
resultados demonstraram que a hemolinfa apresentou uma concentração média
de 210Po de 155 Bq.kg-1 na área contaminada. A dose de radiação não teve
qualquer efeito observável sobre a frequência de MN e quebra do DNA no
32
mexilhão, provavelmente devido à baixa taxa de dose utilizada, já que o limite de
dose sugerido foi de 10 mGy e o utilizado foi de 0,02 mGy.
Pavlica (2000) analisou a freqüência de MN, induzida por
pentaclorofenol em hemócitos do mexilhão zebra, Dreissena polymorpha e nos
gastropodas Planorbarius corneus. Os resultados obtidos sugeriram que
hemolinfa das duas espécies proporcionam um bom teste tecidual para avaliação
ambiental de genotoxicidade.
Villela (2006a) analisou a sensibilidade do mexilhão dourado,
Limnoperna fortunei, expondo as células à radiação ultravioleta, sulfato de cobre e
pentaclofenol. Todos os compostos utilizados induziram danos, gerando uma
curva dose-resposta.
Os testes de genotoxicidade, como o estudo das aberrações
cromossômicas e o teste do micronúcleo, já são utilizados como biomarcadores
da ação da radiação em células de mamíferos (AGER et al., 1990; FORAY;
MALAISE, 1995; ZHOU et al.,1997) e vêm se mostrando como boa alternativa
para análise da ação dos agentes físicos e químicos sobre moluscos marinhos
(MAJONE et al., 1990; BOLOGNESI et al., 1999), porém nenhum dado foi
encontrado na literatura especializada sobre estes testes em moluscos dulcícolas
expostos a radiação ionizante ou a agentes químicos.
Esta lacuna nos motivou a investigar a possibilidade de se utilizar B.
glabrata como um bioindicador de poluentes químicos e físicos ambientais. Isto é
de suma importância para a monitoração de meios ambientais que sejam
circunvizinhos de áreas onde haja risco ambiental, como indústrias químicas,
indústria petrolífera e usinas nucleares.
33
3. METODOLOGIA
3.1. Criação e Manutenção dos Moluscos
Os moluscos utilizados nos experimentos foram Biomphalaria
glabrata (melânicos) oriundos de São Lourenço da Mata – PE e mantidos no
moluscário do Departamento de Biofísica e Radiobiologia da Universidade
Federal de Pernambuco (UFPE), em aquários plásticos, com volume de
aproximadamente 20 litros de água filtrada, declorada (filtro Bellaforte), pH em
torno de 7,0 e temperatura de 25oC ± 2oC. A limpeza dos recipientes ocorreu 3
vezes por semana e a alimentação foi realizada diariamente com alface fresca
orgânica, cultivada livre de agrotóxicos (Figura 6).
Figura 6 Aquários de criação de moluscos B. glabrata do moluscário do
Departamento de Biofisica e Radiobiologia-UFPE.
34
3.2. Seleção dos moluscos
Para realização dos experimentos foram selecionados moluscos B.
glabrata pigmentados e adultos jovens. Os animais primeiramente foram
acondicionados em aquários individuais, com capacidade de 180 mL (Figura 7-
A), e observados por cinco dias consecutivos, para comprovação de
maturidade sexual por meio da oviposição. Durante este período foram
selecionados os moluscos que apresentaram as seguintes características:
a) Adulto jovens, sexualmente maduros, constatado pela
produção de desovas com embriões saudáveis sem malformações;
b) Diâmetro da concha superior a 10 mm, medidos com
paquímetro (Figura 7 B);
c) Idade mínima de 2 meses.
Ao término destas etapas, foram selecionados 50 animais.
Figura 7 (A) Recipientes individuais de B. glabrata; (B) Molusco, com diâmetro
da concha superior a 10 cm.
A B
35
3.3. Irradiação de Moluscos Adultos
Os moluscos selecionados foram separados em grupos com 10
animais para cada dose de radiação. A exposição foi realizada na fonte
Gammacell 60Co (modelo 220 Excel- MDS Nordion) do Departamento de
Energia Nuclear da UFPE, com a taxa de dose de 6,912 kGy/h (Janeiro de
2010) (Figura 8-A). As doses utilizadas no experimento foram, 25, 35, 45 e 55
Gy e o controle não irradiado. As doses aplicadas foram estabelecidas levando-
se em consideração trabalhos anteriores realizados no Laboratório de
Radiobiologia do Departamento de Biofísica e Radiobiologia da UFPE (SILVA,
2008; CANTINHA, 2008; CANTINHA, 2010), onde os efeitos observados não
foram letais nem possíveis de serem analisados morfologicamente.
Para proceder às irradiações os moluscos foram acondicionados
em tubos de ensaio plástico de 50 mL (tipo: FALCON) (Figura 8 B), separados
por finas camadas de gazes úmidas, para evitar a dessecação dos animais, e
em seguida levados à fonte Gammacell. Todos os grupos experimentais
inclusive o grupo controle foram mantidos nas mesmas condições de
temperatura, umidade e estresse. Após a irradiação, os grupos de moluscos
foram acondicionados em recipientes contendo 250 ml de água.
36
Figura 8 (A) Fonte Gammacell® 220 Excel-MDS Nordion. (B) Tubos Falcon
contendo B. glabrata para exposição às doses de radiação.
3.4 Teste do Micronúcleo em moluscos B. glabrata
O procedimento de preparação das lâminas para análise de
micronúcleo foi realizado de acordo com o padronizado por Pavlica (2000) com
algumas modificações. Decorrido 48 horas após a irradiação dos animais,
procedeu-se a coleta da hemolinfa do molusco B. glabrata. Para a coleta da
hemolinfa, foram feitos sucessivos toques com uma micropipeta na região podal
do animal. A manipulação desta região causa uma reação de retração do corpo
do animal para a região interna da concha. Com essa retração o animal libera a
hemolinfa que é prontamente coletada com o auxílio de uma micropipeta
(PAVLICA, 2000).
A B
37
A hemolinfa coletada foi gotejada sobre a lâmina de microscopia
(marca Bioslide) e em seguida foi adicionado o mesmo volume de solução de
EDTA a 10 mM com Ringer e incubadas por 30 minutos em câmara úmida.
Decorrido o tempo de espera, as células foram fixadas com uma solução de
glutaraldeido a 1% com Ringer, ficando nessa solução por 5 minutos. Em seguida
as células foram enxaguadas com Ringer. Para proceder a observação das
células foi utilizado os métodos de coloração Giemsa e por fluorescência.
3.4.1. Coloração Giemsa (convencional)
Utilizou-se uma solução de corante Giemsa (Merck) em tampão
fosfato de pH 6.8, com concentração final de 5%. As lâminas foram submersas
nesta solução por 5 minutos, posteriormente lavadas com água destilada e
colocadas para secagem em temperatura ambiente. A observação das lâminas já
coradas foi realizada no microscópio óptico (Medilux) (Figura 9) com aumento de
1000 vezes.
38
Figura 9 Microscópio óptico Medilux do laboratório de Radiobiologia
(DBR-UFPE)
3.4.2. Coloração por fluorescência
Para realizar a análise dos hemócitos por fluorescência as lâminas
observadas na microscopia óptica foram descoradas com solução de etanol e
ácido acético (3:1). Em seguida as lâminas descoradas foram coradas por corante
Hoechst 33258 na concentração de 1µg/ml.
Primeiramente foram gotejadas 20 µL da solução do Hoechst sobre a
lâmina e, em seguida, a lâmina foi coberta com uma lamínula que proporcionou
39
um espalhamento uniforme do corante sobre a lâmina. Após estes procedimentos,
as lâminas foram colocadas em câmara escura por 30 minutos. Terminado este
período a lamínula foi retirada e a lâmina lavada com água destilada. As lâminas
foram montadas com meio de montagem Glycerol-Mcilavaine (1:1), sendo
colocadas novamente em câmara escura a 4°C por três dias. Decorridos os três
dias as lâminas foram analisadas no microscópio de fluorescência (Leica
CW4000) (Figura 10) utilizando os comprimentos de onda de 358 nm (excitação)
e 461 nm (emissão).
Figura 10 Microscópio de Fluorescência Leica CW4000 do Lambda (DEN-UFPE).
3.5. Análise das lâminas
A avaliação da Freqüência de MN foi realizada de acordo com o
descrito por PAVLICA et al. (2000), com algumas adaptações. A freqüência de
40
MN foi obtida visualmente, por meio de microscópio com auxílio de um contador
de células. Foram analisadas em média 780 células por lâmina, sendo realizadas
cinco réplicas de cinco animais. Os micronúcleos foram identificados segundo
critérios demonstrados na Figura 11.
Figura 11 Esquema com os critérios de identificação de MN; (A) Diâmetro menor que 1/3 do tamanho do núcleo; (B) Cor e textura semelhante ao núcleo; (C) Não estar em contato direto com o núcleo.
3.6. Análise estatística
A análise estatística da frequência de MN entre os grupos foi
realizada por meio do teste do qui-quadrado, nível de significância de 5% e
p<0,05, utilizando o programa BioEstat, versão 5.0 (AYRES et al., 2007). As
análises entre as médias dos números de hemócitos por dose foram realizadas
utilizando a ANOVA e o teste de Tukey com nível de significância de 5% e p<0,05.
41
4 Resultados e Discussão
A hemolinfa de Biomphalaria glabrata expostos a alta dose de
radiação gama 60Co foi analisada quanto a radiossensibilidade e a frequência de
micronúcleos.
4.1 Análise da radiossensibilidade celular dos hemó citos de B. glabrata
Pode-se observar na Tabela 1, o número total de hemócitos
originários dos moluscos B. glabrata expostos as doses de 25, 35, 45 e 55 Gy de
radiação gama de 60Co e não expostos (controle).
Tabela 1 - Hemócitos originários dos moluscos irradiados e
não irradiados.
Conforme demonstrado na Tabela 1, a hemolinfa dos animais
irradiados com as doses de 25, 35 e 45 Gy apresentaram número de hemócitos
inferior ao grupo controle (0 Gy), sendo a dose de 35 Gy a que apresentou o
menor número de células por lâminas analisadas (≥ 1000 por lâminas). A
hemolinfa dos animais expostos a dose de 55 Gy apresentou aumento do número
Dose (Gy) Número total de Hemócitos
0 5042
25 4442
35 3334
45 4799
55 5678
42
de hemócitos em relação aos demais grupos experimentais e controle. Utilizando
o teste estatístico ANOVA percebemos que as médias do número de células para
Dose de 35 e 55 Gy são significativamente diferentes a nível de 5%.
Os resultados sugerem a existência de um comportamento de defesa
diferenciado entre os grupos de moluscos irradiados com altas doses de radiação
gama de 60Co. Cantinha et al. (2010), analisando os efeitos de altas doses de
radiação gama sobre a fecundidade B. glabrata observou que o número de
embriões produzidos por moluscos irradiados variavam de forma independente da
dose. Outro aspecto observado por Cantinha (2010) foi que a exposição a dose
de 40 Gy apresentou o menor número de embriões em relação ao controle,
enquanto que na exposição à dose de 60 Gy aconteceu o inverso, ou seja, essa
dose apresentou o maior número de células do grupo experimental em relação ao
controle. Estes dados se assemelham aos encontrados no presente trabalho que
apresentou aumento no número de hemócitos na dose de 55 Gy e uma
diminuição na dose de 35 Gy.
Pode-se observar nos presentes experimentos que apesar do
aumento do número de hemócitos após a exposição dos moluscos a dose de 55
Gy, a viabilidade destas células pode ser questionada, pois foram encontradas
diversas alterações morfológicas que a inviabilizam. Cantinha (2010) em seus
experimentos também demonstrou que a dose de 60 Gy, próxima a utilizada em
nosso experimento, também apresentou maior número de embriões e maior
inviabilidade celular.
Segundo Segreto (2000) os diferentes tipos de tecidos possuem
respostas distintas à radiação ionizante. A comparação da radiossensibilidade de
diferentes linhagens celulares indica que as células que se dividem rapidamente
são mais radiosensíveis que as de reprodução lenta (lei de Bergonié e
Tribondeau), embora esta regra tenha exceções (linfócitos e alguns melanomas).
Quando analisamos a radiossensibilidade dos hemócitos de B. glabrata irradiados
podemos verificar que todos os grupos experimentais mostraram alterações no
número de células e alterações estruturais das células. Estas modificações
seguem o princípio da lei mencionada anteriormente.
43
Durante a análise dos resultados foram observadas diferentes
alterações morfológicas nos hemócitos dos moluscos submetidos às doses de 35,
45 e 55Gy de radiação gama. Estas modificações consistem na formação de
núcleo bilobulado e pontes nucleoplasmáticas, como vistos na Figura 12
Figura 12 Alterações encontrados na hemolinfa de B. glabrata irradiados nas doses de 35, 45 e 55 Gy. (A) Núcleo bilobulado; (B) pontes nucleoplasmáticas (evidenciada pela seta vermelha).
Experimentos realizados por Zafalon-Silva (2008), com peixes
dulcícolas da especie Astyanax spp., Teleostei: Characidae expostos a poluentes
presentes no Arroio Padre Doutor (RJ) demonstraram que as células eritrocitárias,
presentes no sangue periférico apresentaram núcleo bilobulado, semelhantes as
células encontradas no nosso trabalho.
Martins (2003) encontrou anormalidades nucleares e aumento da
frequência de micronúcleo em células da mucosa bucal de indivíduos fumantes e
não- fumantes e observou que 96% dos fumantes apresentaram deformidades
nucleares, como células binucleadas, brotos nucleares e pontes
nucleoplasmáticas, resultados esses também encontrados no presente trabalho.
Fenech (2000) descreveu a formação de pontes nucleoplásmaticas
em linfócitos, originadas provavelmente quando os centrômeros de cromossomos
dicêntricos são puxados para pólos opostos durante a anáfase e o DNA resultante
A B
44
da ponte é recoberto pelo envoltório nuclear. Essa alteração celular descrita pelo
autor pode ter sido o mesmo fator que acarretou a formação de pontes
nucleoplásmaticas nos hémocitos de B. glabrata.
Sugere-se que estas alterações nucleares sejam decorrentes da ação
de agentes físicos e químicos sobre as células causando mutagenicidade.
Outra alteração celular foi exclusivamente observada durante a
análise microscópica dos hemócitos originários dos caramujos expostos a dose
de 55 Gy. Os hemócitos apresentaram núcleo disforme e inúmeros vacúolos no
citoplasma celular além de marginalização da cromatina formando densos
agregados (Figura 13).
Figura 13 Apoptose em hemócitos de Biomphalaria glabrata submetidos a 55 Gy
de radiação gama de 60Co.
Estas características são sugestivas de indução de apoptose celular.
Estudos realizados por Pavlica et al. (2000) com bivalve (D. polymorha) e o
gastropoda (P. corneus) expostos ao pentaclorofenol (PCP) nas concentrações de
450 e 600 µg/l, também detectou células com as mesmas características,
sugerindo, também, que se tratava de apoptose celular. Pavlica (2000) sugeriu
que a apoptose dos hemócitos ocorreu devido a ação do PCP inibindo as bomba
45
de Ca2+. Sabe-se que uma das causas da apoptose está ligada aos níveis de
cálcio dentro da célula (FAWTHROP, 1991; TRUMP, 1996).
O estímulo para apoptose radioinduzida parece estar relacionado ao
número de quebras produzidas no DNA, a taxa com que elas ocorrem e a rapidez
e eficiência do sistema de reparo (CARSON et al., 1986). Presumindo que o DNA
seja o alvo inicial para apoptose radioinduzida, a resposta celular ao dano na
forma de reparo do DNA pode levar à morte celular (STORY et al., 1992; KANE et
al., 1995). Desta forma, sugere-se que a apoptose surgida nos hemócitos
irradiados ocorreu devido a ação da radiação sobre o DNA da célula.
As diversas alterações nucleares citadas, não foram os únicos
achados experimentais neste trabalho. Observamos também que a radiação
ionizante induziu outras alterações no DNA, demonstrada a seguir, pela análise
da frequência de MN.
4.2. Análise da frequência de micronúcleo
Na tabela 2 observa-se a frequência de MNs detectada nos hemócitos
dos moluscos irradiados e não-irradiados.
Tabela 2 – Dados da Frequência de Micronúcleos de B. glabrata submetidos a radiação gama de 60Co
Dose (Gy) Frequência de Micronúcleo
0 0,007019
25 0,024802
35 0,024583
45 0,036279
55 0,023070
46
Foi observado um aumento da frequência de micronúcleo em todos os
moluscos expostos a radiação gama em relação ao controle. O teste do qui-
quadrado (χ2) demonstrou diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre
a freqüência de micronúcleos dos hemócitos controle e os irradiados. A dose de
45 Gy apresentou a maior freqüência de micronúcleo quando comparada às
outras doses de radiação, mostrando maior significância em relação ao controle
(p = 0,0002). Apesar de ficar demonstrado que após a irradiação observou-se um
aumento da freqüência de MN em relação ao grupo controle, este aumento não
ocorreu de maneira dose-dependente.
Estudos realizados por Wojcik (2000), irradiando cultura de linfócitos
humanos com doses de 0; 0,1; 0,25; 0,5; 1 Gy em fonte Co60, com taxa de dose
de 0,25 Gy/min, observou que houve aumento da frequência de micronúcleo de
maneira dose-dependente, comportamento diferente do encontrado no presente
trabalho. Este fato pode ter ocorrido devido a utilização de fontes com diferentes
taxas de dose. No presente trabalho foi usada uma fonte de 60Co com taxa de
dose de 6,912 kGy/h, enquanto que no experimento de Wojcik (2000) a taxa de
dose foi de 0,25 Gy/min (0,015 kGy/h). Existem princípios que regem a
radiobiologia que esclarecem os fatos acontecidos, ou seja, existe uma relação
dose-efeito, onde o surgimento de uma radiolesão depende da
radiossensibilidade da estrutura biológica e o tempo de exposição à radiação, ou
seja, quanto menor o tempo de exposição, menores serão os efeitos causados
pela radiação. A cultura de linfócito apresentou maior sensibilidade a radiação
quando comparada aos hemócitos, porém os hemócitos foram coletados de
indivíduos expostos e não de cultura de células. Podemos concluir que os
hemócitos apresentaram radiossensibilidade a exposição a radiação ionizante,
porém mostraram-se incapazes de detectar diferença entre as doses de radiação
utilizada.
Sabe-se que o sistema hematopoiético é um dos mais
radiossensíveis, por isso a exposição de indivíduos a irradiação de corpo inteiro
pode apresentar diferentes efeitos biológicos. Estudos de dosimetria biológica
utilizam linfócitos para verificar os efeitos biológicos sofridos por indivíduos
47
expostos acidentalmente ou ocupacionalmente à radiação (FERNANDES, 2005;
BRAGA, 2006; FERNANDES, 2008b). Observou-se no presente trabalho que os
moluscos apresentaram um comportamento semelhante, pois as células de
defesa (SOUZA, 2006), os hemócitos, também sofrem mudanças morfológicas e
presença de MNs quando expostas a radiação ionizante, sugerindo assim
viabilidade da sua utilização no biomonitoramento ambiental.
Nenhum dado sobre freqüência de MN em B. glabrata irradiado foi
encontrado na literatura. Porém estudos realizados com outras espécies de
moluscos expostos a diferentes agentes químicos avaliaram que a freqüência de
MN pode ser utilizada na monitoração de ambientes aquáticos (SCARPATO et al.,
1990; BATEL et al., 1994 ; AL-SABTI, 1995).
O trabalho realizado por Pavlica (2000) expôs moluscos bivalves D.
polymorpha e o gastropoda P. corneus ao agente mutagênico pentaclorofenol, na
concentração de 150 µg/L. Os resultados demonstraram que após 4 dias de
exposição, a frequência de MN em D. polymorpha e P. corneus aumentou
significativamente; concluindo que a hemolinfa de ambas as espécies representou
um teste eficaz na avaliação de genotoxicidade ambiental.
Villela (2006 b ), utilizando Limnoperna fortunei (mexilhão dourado)
para detecção da poluição (genotoxicidade) ambiental de diferentes substância
químicas na bacia do lago Guaíba no Rio Grande do Sul, percebeu em suas
análises que a frequência de micronúcleo variou entre 0,003 a 0,006
micronúcleos, concluindo que Mexilhão Dourado tem potencial para ser utilizado
como bioindicador de contaminação ambiental.
David (2007) utilizou moluscos bivalves da espécie Mytella falcata
como bioindicador de poluição, já que esse molusco é encontrado em três pontos
do estuário de Santos com diferentes níveis de substâncias potencialmente
poluidoras. Os moluscos foram analisados com a finalidade de caracterizar os
danos causados pela poluição nesses pontos. Foram utilizados diversos testes,
entre eles o teste do micronúcleo, que detectou nos três pontos altos níveis de
48
poluição. O trabalho demonstrou como a ação antrópica é bastante prejudicial ao
meio ambiente. Por isso existe a necessidade de dispormos de organismos
bioindicadores de genotoxicidade em diversos habitats para a avaliação dos
danos causados para o homem e o meio ambiente.
Outros trabalhos foram realizados utilizando o B. glabrata como
bioindicador de radiação ionizante em ambientes aquáticos, no entanto esses
trabalhos avaliaram os aspectos macroscópicos como alterações na fecundidade,
fertilidade e mortalidade dos moluscos (MELO, 1998; SILVA, 2008; CANTINHA,
2010), porém alterações celulares não foram percebidas por estes testes.
Portanto, os resultados encontrados em nossos experimentos utilizando
hemócitos de B. glabrata sugerem uma nova ferramenta que análise efeitos
biológicos sofridos pela molécula do DNA após a exposição a radiação e
provavelmente a outros agentes genotóxicos presentes em ambientes aquáticos.
4.3. Comparação entre Metodologias de Coloração
As metodologias de coloração com o corante convencional Giemsa e o
corante de fluorescência Hoechst 33258, tiveram a finalidade de identificar e
confirmar a presença de MN na hemolinfa do B. glabrata. (Figura 14).
Observamos que ambas as metodologias de coloração apresentaram
imagens que nos permitiram analisar micronúcleo e anormalidades celulares de
forma precisa. Porém, os resultados obtidos pela coloração com Giemsa foi mais
eficaz, pois além de identificar as células de forma clara, a técnica é de fácil
manuseio, baixo custo e rapidez na preparação e análise das células.
Para a confirmação de que as células observadas com a coloração
Giemsa eram de fato micronúcleos, as lâminas foram novamente coradas com o
corante Hoechst 33258. A coloração com Hoechst 33258 confirmou que os
49
corpúsculos encontrados se tratavam de micronúcleos, como mostrado na Figura
14 B.
Figura 14 (A) Hemócito corado com Giemsa; (B) Hemócito corado com
Hoechst 33258. A seta vermelha indica MN.
Um dos principais motivos de utilizar a metodologia de fluorescência é
que estes corantes se ligam a moléculas específicas dos tecidos (Dietz, 2000). O
corante Hoechst 33258 cora, especificamente, as ligações de adenina-timina do
DNA, fazendo com que essa coloração sirva de comprovação do teste, já que o
DNA está presente no núcleo das células e os MN são originários do núcleo
(www.sigmaaldrich.com).
Na tabela 3 são apresentadas as vantagens e limitações dos corantes
utilizados no teste.
A B
50
Tabela 3 - Vantagens e limitações das técnicas de coloração Giemsa e Hoechst
33258;
Técnica Vantagens Limitações
Giemsa
• Baixo custo
• Fácil manuseio
• Eficiência nas análises de
MN
• Não é DNA específico
• Forma grânulos
Hoechst
33258
• DNA específico
• Teste confirmativo
• Técnica dispendiosa
• Manuseio laborioso
• As análises causam fadiga
ocular
Pavlica (2000) utilizou também o corante Hoechst 33258, para
detecção de MN em bivalves e gastrópodes, obtendo resultados semelhantes ao
do presente trabalho.
Dietz (2000), em sua pesquisa para detecção de MN na mucosa
esofágica humana e sua relação com fatores de risco ao câncer de esôfago,
utilizou o corante fluorescente acridine orange, que cora especificamente DNA e
RNA. Em seu experimento o corante de fluorescência foi bastante eficaz, corando
as estruturas requeridas pelo autor e apresentando imagens satisfatórias,
demonstrando que a utilização de corantes fluorescência foi uma boa técnica para
testes de confirmação de MN.
Fernandes (2008a), em estudo comparativo de colorações utilizadas
na dosimetria biológica, utilizando os métodos de coloração de Giemsa,
bandeamento C, DAPI e FISH, concluiu que os métodos mais eficazes para ser
utilizado na rotina laboratorial são o método de coloração de Giemsa e o DAPI.
51
Portanto podemos observar que as colorações utilizadas neste
trabalho se mostraram eficazes na identificação dos MN’s sendo a coloração com
Giemsa a mais simples de ser realizada e menos dispendiosa.
5 CONCLUSÃO
Os dados obtidos com a irradiação dos moluscos Biomphalaria
glabrata adultos com doses de 25, 35, 45 e 55 Gy de radiação gama de 60Co,
permitiu concluir que
� Moluscos adultos de B. glabrata se mostraram
sensíveis aos efeitos da radiação gama de 60Co;
� Moluscos irradiados com 35 Gy apresentaram menor
número de hemócitos, enquanto que os expostos a 55 Gy uma maior
quantidade destas células;
� Os hemócitos dos moluscos irradiados apresentaram
alterações morfológicas e celulares nas doses de 35, 45 e 55 Gy.
� A dose de 55 Gy foi a mais radiotóxica, já que
apresentou alterações nucleares e a presença de apoptose;
� A freqüência de micronúcleo foi maior para todos
animais irradiados quando comparado ao controle, podendo ser
utilizada como indicador de radiação ambiental.
� Ambas as colorações utilizadas no presente trabalho se
mostraram eficazes na identificação dos MNs, porém a coloração com
Giemsa é mais simples de ser aplicada e de menor custo.
Os resultados obtidos no presente trabalho permitiram o início da
padronização da técnica do micronúcleo em Biomphalaria glabrata como um
bioindicador ambiental da ação de agentes físicos e químicos.
52
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