Quantificação de RNA PCR quantitativo (RT-PCR Tempo Real)

Quantificação de RNA

PCR quantitativo

(RT-PCR Tempo Real)

Métodos de Detecção de RNA

• Northern Blots

• Hibridização in situ

• Teste de Proteção de RNAse

• RT-PCR (qPCR)

• Microarranjo

qPCR

• Rapidez

• Sensibilidade

• Especificidade

PCR

Eletroforese

Confirmação do produto específico

PCR

Caixa Preta

PCR em tempo Real

PCR Tempo Real

Amplificação Visualização da

amplificação em tempo Real

Curva de Melting

Etapas

RNA RT PCR Quantificação

Iniciadores Iniciadores

e/ou

sondas

Modelos matemáticos

Desnaturação inicial (95oC – 5’)

Desnaturação (95oC – 15’’ a 1’)

Anelamento (50 a 65oC – 1’)

Extensão (72oC – 1’)

Extensão final (72oC – 10’)

Resfriamento (4-10oC - ∞)

30-40 x

Fases da PCR

Equipamentos

RotorGene 3000 (Corbett)LightCycler (Roche)

iCycler iQ (BioRad)ABI Prism 7700

Detecção do sinal

• Fluoróforos

– Associados a sondas

– Intercalados ao produto amplificado

Beacons

TaqMan

Scorpion

Syber Green I

Desenho do Fragmento

• Menor que 100 pb– Amplificam com maior eficiência– Denaturam com maior facilidade– Eficiência da Taq ( 30 -70 pb/sec)

• Menor fragmento 67 pb

Desenho dos Iniciadores

• Separando Exons

• Programas

• Tamanho – 15- 20 pb– 5 GC entre 20-70%– Tm 58-60oC

Quantificação

• Absoluta– Número de cópias por amostras– Curva padrão

• Relativa– Amostra A tem mais copias que B– Normalização (Gene Referência)

Quantificação - Conceitos

Visualização da amplificação em

tempo RealThreshold

Ct

Quantificação - Absoluta

Curva Padrão

Quantificação - Relativa

Controle. Tratamento

Gene Alvo

Gene Ref

Gene Alvo

Gene Ref

Modelos Matemáticos

DELTA DELTA

Gene Referência Gene Alvo

Controle

Tratamento

Controle

tratamento

Quantificação - Relativa

Pfaffl (2001)

Armadilhas

• Qualidade do RNA

• Especificidade x Inespecificidade da sonda

• Linearidade da RT

• Analise do dados

• O threshold

Conclusões

• Rapidez

• Sensibilidade

• Especificidade

• Limitado pelo alto

custo dos reagentes e

equipamentos