Técnicas de Eletroforese Rodrigo Rocha Latado. Eletroforese Diversos métodos para análise de:...

Técnicas de Eletroforese

Rodrigo Rocha LatadoRodrigo Rocha LatadoRodrigo Rocha LatadoRodrigo Rocha Latado

Eletroforese

Diversos métodos para análise de:

Ácidos nucléicos (DNA e RNA)

Proteínas

Enzimas

ETAPAS

Preparar a amostra (DNA total, Produtos de PCR, Proteínas, etc...)

Preparar o gel

Aplicar as amostras no gel

Eletroforese

Coloração do gel, Fixação, Documentação

CLASSIFICAÇÃO

• Tipos: - agarose

- poliacrilamida desnaturante

não desnaturante- amido (para isoenzimas)

• Princípios:- carga elétrica e tamanho da molécula (partícula)

- pH (focalização isoelétrica)

• Detecção:– brometo de etídeo, SYBR, nitrato de prata,

fluorescência– substratos específicos (isoenzimas)

• Visualização:

– UV, direta, câmera

Eletroforese

Sharp, Sambrook and Sugden

Eletroforese

Syber green

Singer VL, Lawlor TE, Yue S. 1999. Comparison of SYBR Green Inucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat. Res. 439(1):37-47.

http://www.probes.com/servlets/product?region=0&item=7563

Àcidos Nucléicos• Ácido nucléico exposto a campo elétrico

migra para eletrodo na velocidade ou mobilidade proporcional a força do campo e a carga líquida da molécula– mobilidade: inversamente proporcional ao

coeficiente friccional– coeficiente friccional: função do tamanho e

forma da molécula e viscosidade do meio

Eletroforese• Moléculas separadas por:

– tamanho– forma ou conformação– magnitude de cargas

• Sob pH fisiológico -> fosfatos ionizados– poliânions correm em direção ao eletrodo

positivo– Eletroforese pólo negativo -> pólo positivo

Eletroforese

Eletroforese• Tamanho da Molécula de DNA

– DNA linear migra inversa/ proporcional ao log10 do seu peso molecular

Eletroforese• AGAROSE: • polissacarídeo linear de galactose com

unidades de -D-galactopiranose com ligações 1,3 e 3,6-anidro-a-L-galactopiranose

• PM médio: 120.000 Da

Agarose

Eletroforese em gel de agarose

- Tampão (TAE ou TBE) e agarose

- Concentração agarose varia entre 1 e 3%

- Fundir a agarose no tampão e aplicar na fôrma

- Esperar esfriar, retirar o pente

- Aplicar as amostras no gel

- Iniciar a eletroforese

Eletroforese• Tampões: água eletrolisada gerando H+• no anodo e OH- no catodo

– terminal catódico (+) -> básica– terminal anódico (-) -> ácida

• requer tampão para evitar gradientes de pH

EletroforeseTampão Aplicação e comentários

TAE Usar quando o DNA vai ser recuperadoUsar para eletroforese de DNA de grande tamanho (> 12 Kb)Baixa f orça iônicaPropriedades:Baixa capacidade tamponante - recirculação pode ser necessária paracorridas eletroforéticas longas (> 6 horas).

TBE Usar para eletroforese de DNA pequeno (< 1 Kb)Melhor resolução de DNA pequeno (< 1 Kb)Mobilidade do DNA mais restritaAlta f orça iônicaPropriedades:Diminui a mobilidade do DNA.Alta capacidade tamponante - não requer recirculação para corridaslongas.

Eletroforese• TAE

– para recuperação de fragmentos– preferido moléculas maiores– menor campo de força– maior porosidade

• TBE– preferido para moléculas menores < 1Kb– interage com agarose - poros menores

Eletroforese

• Voltagem– expressar sempre em V cm-1

– gradiente de voltagem - distância entre eletrodos

– voltagem excessiva - rastro de banda– voltagem baixa - difusão de bandas pequenas <1

Kb

– TBE - bandas pequenas mais finas– TAE - bandas maiores

Eletroforese

TampãoTamanho Voltagem

Recuperação Análise

< 1 kb 5 V/ cm TAE TBE

1 to 12 kb 4-10 V/ cm TAE TAE/ TBE

> 12 kb 1-2 V/ cm TAE TAE

Eletroforese

• Tempo de corrida

– correr gel até banda de interesse ter migrado de 40 a 60% do comprimento do gel

– parte inferior do gel - difusão e dispersão

Eletroforese

• Tampão de Carregamento:• Concentração 6 a 10x

– aumentar densidade da amostra - depositar amostra no fundo do poço

– adicionar cor a amostra– adicionar corantes de mobilidade ou migração

• azul de bromofenol• xileno cianol• verde de bromocresol

Eletroforese- Poliacrilamida

GEL DE POLIACRILAMIDA

- Géis de Poliacrilamida são obtidos a partir da formação de ligações entre o polímero acrilamida e o co-monômero bis-acrilamida.

- Essa reação covalente é geralmente catalizada por persulfato de amônio e iniciada por TEMED, uma amina terciária.

- Uma ampla faixa de tamanho de poros pode ser obtida através de variações de: Concentração de acrilamida e bis-acrilamida Grau de polimerização

GEL DE POLIACRILAMIDA

- A matriz de poliacrilamida por possuir poros menores do que a matriz de agarose, géis de acrilamida são usados para separar fragmentos de DNA menores que 2 kpb, enquanto que moléculas de até 200 kpb podem ser separaradas em géis de agarose.

- De forma geral, um gel de 12 cm, a 1% de agarose separa fragmentos na faixa de 30 a 0,2 Kbp, enquanto que a 7,5% de poliacrilamida separa entre 1 a 0,05 Kpb.

Eletroforese

Acrilamida* (%)

Tamanho de Fragmentos Separados (pares de

base)

Migração de Corante

Xileno Cianol Azul de Bromofenol pb pb

3,5 100 – 1000 460 100 5,0 80 – 500 260 65 8,0 60 – 400 160 45 12,0 40 – 200 70 20 15,0 25 – 150 60 15 20,0 6 – 100 45 12

O corante Azul de Bromofenol (Bromphenol Blue) migra aaproximadamente a 300 pares de base e Xileno Cianol (XyleneCyanol) a 4 Kpb, independente da concentração de agaroseentre 0,5 e 1,4% em 0,5 x de TBE.

ACRILAMIDA DESNTAURANTE

- Acréscimo de Uréia no gel para a manutenção do DNA naforma de fita simples

- Amostras de DNA são desnaturadas a 94 -96o C, na presença de Formamida, antes da eletroforese