View
225
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
1/81
Testes utilizados em
Diagnóstico: Técnicas Imunológicas
e Métodos de BiologiaMolecular
Profa Alessandra XavierPardini
Disciplina: Imunologia Clnica
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
2/81
Introdu!"o:
#esposta Imunológica $spec%ca
& é mais ela'orada
recon(ecimento clonagem )multiplica!"o decélulas defesa* ativa!"o celular & processocomple+o
& células: l, T e B
atacam especi%camente o antgeno& respostaimunológica de memória
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
3/81
-istema imune:
& para a prote!"o e defesa
& pro'lemas podem ocorrer
Pro'lemas.Disfun!/es
& A0T1IM02IDAD$
& IM021D$3ICI42CIA-& 5IP$#-$2-IBI6IDAD$
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
4/81
5ipersensi'ilidade:
& #ea!"o e+agerada7 alergia 8 envolve as Ig$7 (istamina7 mastócitos
& Diferentes tipos de alergenos
& Cuidados com o paciente7 acompan(amento7 afastar o alergeno )n"o
contato*& Testes: #A-T )radioimuno* $6I-A )enzim9tico.dosagem de Ig$*7
testes cutneos
Autoimunidade:
& A rea!"o ocorre contra o próprio organismo7 é uma auto agress"o7& Diferentes fatores envolvidos )pré&disposi!"o genética7 rea!"o cruzada
contra o ;self< )próprio*7 modi%ca!"o do antgeno= fal(a na dele!"o deantgenos
& Testes: imuno>uoresc?ncia indireta )>uorocromos*7 $6I-A )enzim9tico*
& Tratamento: imunossupressor7 diferentes drogas7 e+ames periódicos
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
5/81
Imunode%ci?ncias:
& 3al(a da resposta imune7 l, T e B )s"o as mais graves*7 respostainata )menos fre@uente*
& Diagnóstico la'oratorial com aplica!"o de diferentes técnicas imuno>uoresc?ncia )>uorocromos*7 $6I-A )enzim9ticos*
& Tratamento: deve&se fazer o acompan(amento do paciente pore+ames periódicos7 transplante de medula 8 acompan(amento7reei!"o
& Avalia!"o constante do paciente para determina!"o do tratamento$+emplos: 5I7 resposta B7 resposta T7 resposta B e T )com'inada*
Tolerncia Imunológica:
& -istema imune torna&se tolerante7 independente do estmulo
& Tolerante a um determinado antgeno
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
6/81
Antgenos& De%ni!"o& Imunogenicidade
& Antigenicidade& $ptopo
Considerar: rea!"o cruzada7 rea!"o inespec%ca 8 apósativa!"o Ac de 'ai+a e de alta avidez
Antgenos 2aturais& (erdados: eritrocit9rios e de Transplante& #ealizar a investiga!"o a %m de se evitar pro'lemas
transfusionais e diminuir a c(ance de reei!"o
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
7/81
Antgenos 2aturais
& $#IT#1CIT#I1-: tipagem de AB1(7 pela técnica de
aglutina!"o direta
& T#A2-P6A2T$: pela técnica de $6I-A pes@uisa doanticorpo7 pela técnica de PC# pes@uisa do D2A)através de 'andas* )deve&se o'servar a
compati'ilidade*
& Cuidados: controle da de rea!"o7 preparo da amostra7da técnica 8 @ualidade na manipula!"o e coleta
& Compati'ilidade )c(ega a EFG* em rela!"o aotransplante considerar o órg"o
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
8/81
A2TIC1#P1-
Molécula de Ac Sítio de ligação do Agsímbolo
Sítio de ligação do AgSítio de
ligação
do Ag
antígeno Determinante
antigênico
(epítopo)
C
a d e i a l e v e
C a d e i a p e s a d a
Fab
Fc egião dedobradiça
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
9/81
Anticorpos:
Classe7 isótipo:
6infócito B ativado plasmócitos Ig
IgA pes@uisada nas secre!/es )IgA secretora*
Ig$ aumento em alergias7 infec!/es parasit9rias
IgM aumento em fase aguda
IgH memória imunológica7 passa pela placenta
IgD indica a matura!"o dos l, B
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
10/81
ANTICORPOS MONOCLONAIS
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
11/81
ANTICORPOS MONOCLONAIS -oro possui um grande nmero de anticorpos capazes de
se ligarem a um antgeno espec%co 8 soro imune
-"o mensur9veis )diferentes dilui!/es7 de acordo com atécnica*
Tentativa de se produzir um anticorpo específcopara um determinado epítopo = tecnoo!ia dosanticorpos monoconais
Anticorpos monoclonais: os anticorpos do preparadocont?m apenas anticorpos vindos de um mesmo clone delinófcito B7 isto é7 vindos de linfócitos com a mesmaespeci%cidade
Aumento da especi%cidadeHrande aplica!"o pr9tica
$+emplos: pes@uisa de antgenos (epatite B )Ag5Bs7Ag5Be7 Ag5Bc* )5I* )antgenos em tecidos 5C*7antgenos tumorais7 antgenos de 56A )transplantes*7lin(agem linfocit9ria )CDJK7 CDLK 8 acompan(amentopaciente 5IK técnica de Citometria de 3lu+o ou 3AC-*
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
12/81
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
13/81
APLICA"#O %A IM'NOLO)IA CL(NICA
Considera!/es:& Con(ecer o Ag e o Ac 8 caracteriza!"o& Aplica!"o do teste sorológico limiar de reatividade
)cut-of *&
Parmetro sorológico 'anco de sangue7 la'oratóriode an9lises clnicas& -ensi'ilidade& $speci%cidade&
3also&positivo . rea!"o cruzada& 3also&negativo .anela sorológica
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
14/81
A 6imiar de m9+ima sensi'ilidade & triagemB 6imiar com m9+imas sensi'ilidade e especi%cidade estudos epidemiológicos
C 6imiar de m9+ima especi%cidade diagnóstico
R&ATI*I%A%&
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
15/81
Introdu!"o
& 1s testes sorológicos ou imunoensaios s"o técnicaspara a detec!"o de antgenos7 anticorpos ou
su'stncias @ue desempen(em papel de antgenos& drogas7 (ormOnios7 9cidos nucléicos
& 0tilizam reagentes n"o marcados )precipita!"o7aglutina!"o7 >ocula!"o e complemento* ou
reagentes marcados )>uoresc?ncia7radioimunoensaio7 imunoenzim9ticos*
& Cada técnica apresenta vantagens7 desvantagens7aplica!"o espec%ca
& Podem ser manuais ou semi ou totalmenteautomatizadas
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
16/81
& Anticorpos monoclonais& Antgenos recom'inantes 8 maior desenvolvimento
Métodos:
& aperfei!oamento7 consolida!"o do @ue 9 e+iste7tecnologias emergentes7 mel(ora da sensi'ilidade7con%a'ilidade no resultado7 e+ecu!"o mais simples eadapt9veis a automa!"o
& métodos multiparamétricos: desa%o de detec!"o desu'stncias diferentes simunltneamente
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
17/81
& 1s testes sorológicos t?m se tornado cada vez maisre%nados e de e+ecu!"o simples7 porém7 para segarantir a @ualidade dos resultados é necess9rio
controle rigoroso& Técnicas cuidadosamente padronizadas )estudo de
popula!"o7 limiar de reatividade* 8 temperatura7p57 tempo de incu'a!"o7 ttulos7 conugados
& As metas para o la'oratório clnico devemmel(orar a disponi'ilidade7 e+atid"o e precis"odos testes clnicos7 garantir a interpreta!"o correta
dos resultados& Controe de +uaidade , testes de m-.ima
sensi/iidade0 m-.ima especifcidade
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
18/81
T1CNICAS COM
R&A)&NT&S MARCA%OS
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
19/81
Técnicas de #eagentes Marcados
Alta sensi'ilidade
Boa especi%cidade
Direta detec!"o de Ag
Indireta detec!"o de Ac
Competi!"o amostra compete com reagente marcado
Custo mais alto produ!"o dos reagentes
Permitem automa!"o completa ou n"o
Permite detectar Ac de uma classe espec%ca @ue seam
espec%cos para um determinado Ag#eagente marcado & Ag ou Ac
-istema (eterog?neo lavagem retira reagente n"oligado
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
20/81
#eagente Marcado
Marca!"o n"o modi%ca intera!"o Ag&Ac
Alto custoPermite detec!"o de classes espec%cas de Ac para um
determinado Ag
Tipo de marcador determina nome do teste
MA#CAD1#
#adioisótopo & #ADI1IM021$2-AI1
3luorocromo & IM0213601#$-C42CIA$nzima & $6I-A7 IM021&D1T7 $-T$#2 B61T
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
21/81
#adioimunoensaio
&& Primeira técnica com reagente marcado& desenvolvido em QRS detec!"o de Ac anti&insulina em pacientes tratados com o (ormOnio
- radioisótopos & IQUS
ou IQEQ
liga!"o a resduos detirosina em protenas
- vantagens: @uantitativo7 rapidez7 precis"o7 limiarde detec!"o em nano ou picogramas
- desvantagens: alto custo do teste7 vida médiados reagentes e risco operacional radiosótopos
& 0so: Ag e Ac7 marcadores tumorais7 (ormOnios
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
22/81
Princpio
@uantidade de reagente marcado )radioativo* @uanti%ca oAg ou Ac n"o marcado presente na amostra através deliga!"o espec%ca
medida da resposta & contagem radioativa & tipo deradia!"o emitida
& radia!/es α e β - contador de cintila!"o
& radia!"o γ - contador gama de cristal sólido
#ealizado em E est9gios
$st9gio Q constru!"o da curva de cali'ra!"o dilui!"o seriadado padr"o
$st9gio U interpola!"o dos resultados
$st9gio E controle de @ualidade )amostras com V W con(ecida*
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
23/81
interferente: fra!"o n"o ligada
Deve&se realizar a remo!"o da fra!"o n"o ligada ouadotar sistema com fase sólida
& 3ase sólida matrizes particuladas )celulose eagarose* ou superfcie contnua )tu'os7 discos eplacas*
Ac +traçador +
Ag da
amostra
carbono
PEG
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
24/81
Tipos de #adioimunoensaio
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
25/81
Contador de radia!"o gama
cintiladores
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
26/81
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
27/81
#$AH$2T$- 2$C$--#I1-
• Ac marcados – alta especificidade – poli ou monoclonais• Ag ou amostras fixas em lâmina de vidro
• Glicerina alcalina – pH 8,5 – montagem da com lamínulas
– meloram a intensidade da emiss!o de fluoresc"ncia
• A#ul de $vans ou vermelo %ongo – corantes de fundo –
meloram a visuali#a&!o da fluoresc"ncia
• 'âmina de sílica n!o fluorescente e de espessura mínima
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
28/81
Microscópio de imuno>uoresc?ncia
com epilumina!"o
(iltro de excita&!o
lâmina
(luoresc"nciaemitida
(iltro de
emiss!o
(onte de lu#
)ranca
câmera
(i)ra óptica(i)ra
óptica
4
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
29/81
IM0213601#$-C42CIADI#$TA
•
%on*ugado - Ac marcado com fluorocromo• +antagens alta sensi)ilidade e especificidade, possi)ilidade
de locali#ar componentes intracelulares com fluorocromos
contrastantes
• esvantagens um con*ugado para cada Ag
• .so imunoisto/uímica – doen&as renais e de pele
célula
Conjugado
fluorescente
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
30/81
IM0213601#$-C42CIA I2DI#$TAConugado Ac antiimunoglo'ulina espec%co classes
Dilui!/es seriadas ttulo de Ac m9+ima dilui!"oonde (9 >uoresc?ncia
antagens: sensvel7 espec%ca7 reprodutvel 7 f9cil7padronizada7 mesmo conugado determina Ac
produzidos em diferentes doen!asDesvantagens: custo do microscópio7 su'etividade na
leitura e di%culdade de automa!"o
0so: detec!"o de Ac para Treponema pallidum )3TA&AB-*, Toxoplasma gondii, vrus da ru'éola7citomegalovrus7 vrus (erpes simples7 Trypanosomacruzi, Plasmodium alciparum7 auto&AcZ
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
31/81
Anticorp
oAntígen
o
eação
prim!ria
eação
secund!ria
Con"ugado Anticorpo
F#$C
lavage
m
lavage
m
Microsc%pio de
&luorescência
I3I P$-[0I-A D$ A2TIC1#P1
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
32/81
CITOM&TRIA %& 4L'5OP#I2C\PI1: an9lise individual e simultnea de componentes
celulares através da medi!"o do desvio de luz incidente so'reuma célula e de sinais >uorescentes emitidos pela mesma
antagens: permite detec!"o do taman(o relativo da célula7 suagranula!"o e de U a Y emiss/es >uorescentes diferentes emmil(ares de células por segundo
Desvantagens: alto custo7 necessidade de treinamento
9rios >uorocromos
0so: imunofenotipagem de linfócitos do sangue periférico de
pacientes infectados pelo 5I7 diagnóstico e prognóstico deleucemias7 taman(o celular7 granulosidade
Tam'ém c(amada de 3AC- )>uoresecent&activated cell sorter*
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
33/81
Suspensão
de mistura
de células
Con"ugado
&luorescente
(eixe de laser etector
De&letor
Células não'
&luorescentes
Células
&luorescentes
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
34/81
CITOM&TRIA 64ACS7 PARA 8I*
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
35/81
T9cnicas imunoenzim-ticas
&& Ac ou Ag marcados com enzimas conugado &&N:IMA
& elevada especi%cidade
& f9cil de ser o'tida na forma puri%cada
& conuga!"o a Ag e Ac sem interfer?ncias
& produto de rea!"o com su'strato f9cil de ser@uanti%cado7 mesmo com pe@uenas @uantidades deenzima
& est9vel
& custo acessvel
& v9rios tipos fosfatase alcalina7 pero+idase
& determina o tipo de su'strato
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
36/81
S';STRATO CROMO)
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
37/81
P&RO5I%AS&
& su'strato 5U1U ligado a um cromógeno
& cromógeno com produto solvel & 1PD ou TMB
& cromógeno com produto insolvel & DAB ou J&cloro&Q&naftol
4OS4ATAS& ALCALINA
& cromógeno com produto solvel & 2PP
& cromógeno com produto insolvel BCIP ou 2BT
051amarelo
lil2s
3-4((
5--0-%-6-7(
(osfatase
alcalina
09laran*a, a#ul
marrom, violeta
:3, ;
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
38/81
$nsaio (eterog?neo
- etapa de lavagem retira reagente marcado n"oligado a fase sólida
3A-$ -]6IDA
& con(ecido como suporte& tu'os7 microplacas7 micropartculas ou tiras
& partculas de agarose7 poliacrilamida7 de+tran7poliestireno
& micropartculas lavagem decanta!"o7centrifuga!"o7 adsor!"o em %'ra de vidro ou captura
& tipos: $6I-A7 dot $6I-A7 IM0221B61T
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
39/81
&LISA
& capaz de detectar pe@uenas concentra!/es deAg e Ac
- reagente ligado a uma enzima
- imo'iliza!"o em fase sólida & placa deploiestireno
- antagens: maior sensi'ilidade eespeci%cidade7 rapidez7 'ai+o custo e adapta!"o
a diferentes graus de automa!"o- tipos: direta7 indireta7 de captura e decompeti!"o
- 0so: detec!"o de Ac para diversas doen!as eA como artculas virais (ormOnios rotenas
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
40/81
Resutado
visual )@ualitativo*densidade óptica )D1*
)@uanti%ca!"o . espectrofotOmetro*
6imiar de reatividade );cut&o^
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
41/81
$6I-A indireto
antagens: nico conugado para v9rios sistemas
0so: detec!"o de Ac de classes determinadas de acordocom Ag @ue sensi'ilizou a placa
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
42/81
Lavadora de
microplacas
Leitora de
microplacasacoplada a
computador
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
43/81
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
44/81
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
45/81
estern Blotting
identi%ca!"o de protenas recon(ecidas por Ac
separa!"o das protenas & PM & eletroforese em gelde poliacrilamida
transfer?ncia eletroforética & nitroceluloseincu'a!"o com amostras & presen!a de Ac
espec%cos & comple+o formado conugado
isualiza!"o & cromógeno & precipitado colorido& teste con%rmatório
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
46/81
prepara!"o do gel )concentra!"o poliacrilamida.gradiente*-D- )detergente aniOnico.confere carga negativa*
migra!"o: pólo & pólo K
preparo da amostra )solu'iliza!"o das protenas*
tamp"o corrida
voltagem.amperagem
transfer?ncia )semi&seco= ;over&nig(t
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
47/81
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
48/81
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
49/81
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
50/81
M9todos de ;ioo!ia Moecuar
Considerar:
Avan!os na 9rea de Biologia Molecular
Identi%ca!"o de uma se@_encia espec%ca de D2A ou#2A para diagnóstico
Método r9pido e e%ciente para ampli%ca!"o dese@_encias espec%cas a partir de uma misturacomple+a de se@_encias genOmicas ou cD2A
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
51/81
&strutura do %NA
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
52/81
&strutura do %NA
& 1 material genético de toda a vida neste planeta é formado por apenas
seis componentesZ
Acido %eso.irri/onuceico 6A%N0 %NA7:& Contém as instru!/es genéticas& Constru!"o de protenas e #2A& Componentes s"o: uma molécula de a!car )deso+irri'ose*7 um grupamento no
fosfato e @uatro 'ases nitrogenadas diferentes: adenina )A*7 guanina )H*7citosina )C* e timina )T*Z
& Adenina e Huanina s"o purinas . Citosina e Timina s"o pirimidinas& Adenina liga&se com Timina )A com T* e Huanina liga&se com Citosina )H com C*& A unidade essencial @ue forma a molécula do D2A é c(amada nucleotdeo @ue
mais precisamente7 deso+inucleotdeoZ& Transmiss"o de caractersticas (eredit9rias
No RNA - uma su/stitui>?o de Timina por 'racia 6'7
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
53/81
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
54/81
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
55/81
Importante@
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
56/81
& As instru!/es codi%cadas nas se@u?ncias de 'ases nitrogenadas do D2A constituinte dos geness"o transcritas para moléculas de #2A7 e destas7 traduzidas em se@u?ncias de amino9cidos dasprotenasZ
& RNA ri/ossmico7 @ue constitue7 untamente com certas protenas7 minsculos grnuloscitoplasmaticos denominados ri'ossomos7 capazes de unir os amino9cidos entre si e formar as
cadeias poipeptídicas Bue constituem as proteínas& RNA transportador0 t3m por Dun>?o capturar amino-cidos ivres nas c9ua0 levando&osaté os ri'ossomos7 onde eles se unem para formar a molécula polipeptdicaZ Cada #2Atapresenta7 em uma determinada regi"o de sua molécula7 uma trinca de 'ases denominadaanticódonZ 1 amino9cido transportado por um #2At depende do seu anticódonZ Por e+emplo7moléculas de #2At com anticódon AAA ou AAH transportam sempre o amino9cido fenilalanina=os #2At com anticódons CCA7 CCH7 CC0 ou CCC transportam somente glicinaZ
& RNA mensa!eiro0 s?o cEpias dos !enes codifcadores de proteínas e cont?m7 em suase@u?ncia de 'ases nitrogenadas7 as instru!/es so're a ordem em @ue os amino9cidos devemser unidos para produzir determinado polipeptdeoZ
&
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
57/81
CONCL'S#O0O +'& 1 O %NAF
1 D2A carrega todas as informa!/es de suas caractersticasfsicas @ue7 essencialmente7 s"o determinadas pelas protenasZ
Dessa forma7 o D2A contém as instru!/es para fazer umaprotenaZ
2o D2A7 cada protena é codi%cada por um gene )uma se@_?nciaespec%ca de nucleotdeos do D2A @ue especi%cam como umanica protena ser9 feita*Z
$speci%camente7 a ordem dos nucleotdeos dentro de um genedetermina a ordem e os tipos dos amino9cidos @ue devem sercolocados untos para formar uma protenaZ
A se@_?ncia espec%ca dos amino9cidos na cadeia é o @uediferencia uma protena de outraZ $ssa se@_?ncia é codi%cada
no D2A7 onde um gene se codi%ca para uma protenaZ
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
58/81
5i tó i
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
59/81
5istórico& QRLE& `ar, Mullis& Pr?mio 2o'el de [umica em QRREZ& D2A polimerase & ocorre naturalmente em
organismosvivos7 onde tem a fun!"o de duplicar o D2A durante adivis"o celularZ A polimerase se liga a um D2A %ta
simplesriando uma %ta de D2A complementarZ& 2a época ainda n"o (avia sido desco'erta uma D2Apolimerase termoest9velZ Processo inicial de Mullis eraine%ciente7 necessitava de muito tempo7 aten!"oconstante e grandes @uantidades de D2A polimeraseZ
& 1 processo foi mel(orado
PCR 6Rea>?o em
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
60/81
PCR 6Rea>?o emCadeia daPoimerase7 é uma técnica @ueampli%ca umase@u?ncia espec%cade D2A7 comoo'etivo de torn9&laa'undante edisponvel paradiversas técnicas de'iologia molecularZtécnica ;in vitro<
replica!"o do D2A
& [ual@uer se@_?ncia alvo de D2A
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
61/81
[ @ @pode ser ampli%cada por PC#
& A localiza!"o da se@_?ncia alvo éfeita pelos primers
& 1ligonucleotdeos com UF&UJ 'asess"o usualmente seletivos o su%cientepara localizar um stio nico em umgenoma de alta comple+idade
& 1 pareamento dos primers com aseqüncia al!o se az peloestabelecimento de pontes de(idrog?nio7 o'edecendo opareamento convencional descritopor atson e Cric
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
62/81
AternGncia de temperatura
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
63/81
AternGncia de temperatura
T9cnica
H %esnatura>?o@
JKC , KC
-epara a dupla %ta do template
em duas %tas simples
Pareamento@
KC , KC
Primers ligam&se em locais
espec%cos do D2A molde
&.tens?o@
KC
D2A polimerase usa os d2TPs
adicionando&os a nova %ta de
acordo com a regra de
pareamento polimeriza!"oZ
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
64/81
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
65/81
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
66/81
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
67/81
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
68/81
L&IT'RA &M )&L %& A)AROS& ,
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
69/81
L&IT'RA &M )&L %& A)AROS& ,AN$LIS& %& ;AN%AS , AN$LIS&%OS PRO%'TOS %& PCR
L&IT'RA &M )&L %& A)AROS& ,
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
70/81
L&IT'RA &M )&L %& A)AROS& ,AN$LIS& %& ;AN%AS , AN$LIS&%OS PRO%'TOS %& PCR
Aplica!/es da Biologia Molecular:
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
71/81
Aplica!/es da Biologia Molecular:
Diagnóstico de doen!as cong?nitas
Detec!"o de infec!/esMonitoriza!"o de terapia contra o cncer
-e@uencia de D2A
3orense
Transplante resposta de 56A )antgenos naturais* triagem de doadores7 veri%car padr"o de 'andas
Atualmente7
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
72/81
2AT Técnica de cido 2ucléico
& Bio&Manguin(os: para a rede p'lica de sade como tam'émo próprio Ministério da -ade )M-*&QIT NAT 8I*8C*
&2ome Comercial : `it 2AT 5I.5C Bio&Manguin(os&Apresenta!"o : Material fornecido para rea>es
&Descri!"o da %nalidade ou uso do produto: Teste paradetec!"o de cido 2ucléico de 5I )rus da Imunode%ci?nciaAd@uirida* e 5C )rus da (epatite C* em servi!os de(emoterapia7 visando diminuir o risco transfusional causadopor esses agentesZ
)fonte: relatório U M-* )material 9 copiado aulas 5I.AID- e 5epatites*
C612AH$M
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
73/81
A clonagem é a imita!"o perfeita de um mecanismo dereprodu!"o asse+uada ato multiplicador realizado pororganismos unicelulares ou portadores de poucas
células7 sensveis a @ual@uer mudan!a no meioam'ienteZ
$ste método reprodutor gera seres geneticamenteid?nticos b matriz utilizadaZ
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
74/81
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
75/81
0m clone é umacópia e+ata de umaplanta ou animal7com todas ascaractersticas dooriginal7 inclusive os
defeitosZ
CLONAGEM
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
76/81
QZ D2A molde para ampli%ca!"o
taman(o da molécula
UZ $scol(a da vetor replica!"o
transcri!"o
e+press"o
Plasmdeo7 fago
EZ $scol(a da célula (ospedeira
Bactéria= 6evedura= Inseto= Plantas= Animal
Teste de Paternidade %NA
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
77/81
Apica>?o: Investigar vnculo genético envolvendo %l(o7suposto pai e.ou suposta m"e de um indivduoZ 1 D2A)9cido deso+irri'onucléico* é uma su'stncia @uetransmite as caractersticas (eredit9rias dos pais paraos %l(osZ A maioria das informa!/es genéticas éid?ntica em todos os indivduos da mesma espécieZ$+istem7 entretanto7 regi/es repetitivas polimór%cas7 as
-T#s );s(ort tandem repeat
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
78/81
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
79/81
PROT&(NAS & P&PT(%&OSR&COM;INANT&S
1 processo de o'ten!"o destas su'stncias é t"o rgido
@uanto @ual@uer outra molécula medicamentosaZ Alémdos 'ioensaios para veri%car sua atividade 'iológica7 s"otam'ém veri%cados seus padr/es de @ualidade fsico&
@umicos e micro'iológicos garantindo seguran!a7e%c9cia e esta'ilidadeZ
$m rela!"o aos efeitos tó+icos7 (9 uma grandepreocupa!"o em averiguar se estas 'iomoléculaspossuem a!/es imunotó+icas7 9 @ue podem ser
recon(ecidas pelo sistema imunológico como invasoresZ
Terapia )3nica
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
80/81
Terapia )3nica
Porém a maior limita!"o desta técnica ainda est9 vinculadaao vetor @ue entrega o gene terap?uticoZ
1 atual o'etivo das indstrias farmac?uticas é a procurapor novos vetores7 principalmente n"o viraisZ
Alguns aspectos do ponto de vista farmac?utico como:'iodisponi'ilidade7 formas e formula!/es farmac?uticas
ideais7 classi%ca!"o terap?utica7 farmacocinética efarmacodinmica7 ainda s"o @uest/es @ue nem se@uer
foram mencionadas de forma concretaZ
A possi'ilidade de su'stituir genes ausentes
ou defeituosos7 por outra cópia normal dentrode uma célula som9tica do organismo7demonstra uma mano'ra fant9stica no
sentido de eliminar as doen!as (umanasZ
8/15/2019 Testes Utilizados Em Diagnóstico Tecnicas Imunologicos e Métodos de Biologia Molecular
81/81
Agradecimentos
Profa Adelaide az pelo material gentilmente cedido
Bi'liogra%a
Pes@uisa na internet )maio UFQQ*
ABBA- AZ ` et allZ7 Imunoo!ia ;-sica 4un>es e%istUr/ios do Sistema Imune0 ed revinter7 UFFEZ
CA6IC5 A CZ7 Imunoo!ia0 ed #evinter7 UFFQZ
Pes@uisa na internet em novem'ro UFQU
Pes@uisa na internet em novem'ro UFQE
Recommended