Vitelogenina Em Peixes

MÉTODOS PARA ESTUDOS COM A MÉTODOS PARA ESTUDOS COM A EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS: ENFOQUE EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS: ENFOQUE

PARA A PARA A VITELOGENINAVITELOGENINA DE PEIXES DE PEIXES

AÇÃO DE METAIS EAÇÃO DE METAIS EXENOESTRÓGENOSXENOESTRÓGENOS

LAB. DE TOXICOLOGIA CELULARLAB. DE TOXICOLOGIA CELULARDEP. BIOLOGIA CELULAR, UFPRDEP. BIOLOGIA CELULAR, UFPR

DETECÇÃO E DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DA QUANTIFICAÇÃO DA

EXPRESSÃO PROTÉICAEXPRESSÃO PROTÉICA

SISTEMA REPRODUTORSISTEMA REPRODUTORNEUROENDÓCRINONEUROENDÓCRINO

CÉREBROCÉREBRO

HIPOTÁLAMOHIPOTÁLAMOGtRH (+) / DPM (–)

HIPÓFISEHIPÓFISE GtH I & GtH II (+)

e outros (+/–)

TESTÍCULO/OVÁRIOTESTÍCULO/OVÁRIO ESxH e outros fatores dimorfismo sexual gametogênese (Zn) incorpora VTG (GtH I)

POSSÍVEIS ETAPASPOSSÍVEIS ETAPASpara o estudo dapara o estudo da

EXPRESSÃO de PROTEÍNASEXPRESSÃO de PROTEÍNAS

seqüência da proteína seqüência de ácidos nucléico

MÉTODOS:

QUALITATIVOS: imuno-detecção (avaliação subjetiva);QUANTITATIVOS:

quantificação relativa:métodos semi-quantitativos (ELISA direto);métodos indiretos (p.ex.: análise de imagens);

quantificação absoluta:p.ex.: cromatografia ou ELISA sandwich

POSSÍVEIS ETAPAS para o estudo da EXPRESSÃOPOSSÍVEIS ETAPAS para o estudo da EXPRESSÃO

de de VITELOGENINAVITELOGENINA ( (VTGVTG) em fígado (HEPATÓCITOS) e) em fígado (HEPATÓCITOS) e

DETECÇÃO-QUANTIFICAÇÃODETECÇÃO-QUANTIFICAÇÃO em TECIDOS de TRAÍRAem TECIDOS de TRAÍRA

: uma OU outra ENTRADA

: uma E outra ENTRADA+

: relação INTRA-ESPECÍFICA (Hm)

: relação INTERESPECÍFICA (outras espécies - spp )

proteínas (PTs) ou

aminoácidos (aa’s) ou

seqüência de aa’s

DNA ou seqüência de DNA

RNA ou seqüência de RNA

DNA, RNA, PT, aa’s ou

SEQÜÊNCIAS spp Hm

ISOLAMENTO ou PURIFICAÇÃO deVTG de Hm (PLASMA ou CÉLULAS)

>> cromatografia de troca iônica (purificação)>> fracionamento por precipitação (isolamento)

ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay>> INCUBAÇÃO com anti-VTG

>> INCUBAÇÃO com ANTI-2ário-CONJUGADO

>> COLORIMETRIA (padrões : VTG purificada)

>> VALIDAÇÃO (bioensaios)

IMMUNOBLOTS : WESTERN ou DOT BLOTS

>> VTG em SDS-PAGE ou direto no NYLON

>> INCUBAÇÃO com anti-VTG ou anti-VTG

>> INCUBAÇÃO com ANTI-2ário-CONJUGADO

>> DENSITOMETRIA (padrões : VTG purificada)

RECORTAR, do SDS-PAGE, a BANDA com VTG

PRODUÇÃO DE anti-VTGIMUNIZAÇÃO em spp +

INDUÇÃO de VTG de Hmno FÍGADO por IIP de17-ESTRADIOL (E2)

anti-VTG de spp REAÇÃO CRUZADA

RT ( transcriptase reversa )TRANSCRIÇÃO REVERSA

mRNA’s >>> cDNA’s

EXTRAÇÃO de RNA-total do FÍGADO

NORTHERN BLOT

HIBRIDIZAÇÃO: cDNA-VTG ou SHt

>> RNA em GEL de AGAROSE

>> DENSITOMETRIA (padrões de RNA)

+

EXPRESSÃO in vitro do DNA-VTG de Hm>> VETORES de EXPRESSÃO (“gene” de VTG)>> produção de VTG (ou VTG-aa’s) em host cell

PCR ( DNA polimerase )

>> amplificação e isolamento

de cDNA ou OUTRO

>> com PRIMERS para VTG

construir SONDA MARCADA :

DNA-VTG

+

CONSTRUÇÃO/OBTENÇÃO de PRIMERS

oligonucleotídeos sintéticos degenerados

>> para sequências conservadas de aa’s

do domínio carboxi-terminal (3’) da VTG

(17 sequências conhecidas de 15 spp )

>> ALEATÓRIOS

SONDA HETERÓLOGA MARCADA (SHt )HIBRIDIZAÇÃO com ESTRINGÊNCIA

>> RNA ou DNA ou cDNA ou

>> oligonucleotídeos sintéticos degenerados

relacionados à seqüência(s) de DNA do GENE

que codifica a VTG em spp de peixes

EXTRAÇÃO de DNA-total do FÍGADO>> clivagem aleatória (endonuclease de restrição)>> coleção heterogênea de fragmentos de DNA

“ISOLAMENTO” do DNA-VTG

HIBRIDIZAÇÃO: DNA-VTG ou SHt

>> SOUTHERN BLOT de GEL de AGAROSE

>> seleção de colônia com clones de DNA-VTG

+

+

CLONAGEM do DNA de Hm( DNA-total ou cDNA-VTG )

DNA de Hm (EXÓGENO à bactéria ou levedura)+

VETOR DE CLONAGEM (plasmídio ou fago)=

CLONES de DNA recombinante (COLÔNIAS)

VTG plasmática

de Sparus aurata

cDNA-VTG de Sparus aurata

mRNA-VTG

de Sparus aurata

Northern Blot:

autoradiografia (32P)

5 dias após IIP :

5 mg E2 . kg-1

SDS-PAGE (7%)Comassie Blue

3 10 30 M

VTG

3 3 10 10 30 30 M

VTG

ELISA

VTG de Sparus aurata

VTGWestern Blot: anti(2)-enzima

RESPOSTA

ESTROGÊNICA

INDUZIDA EM

Salvelinus alpinus

mRNA-VTGNorthern Blot: sonda fluorescente (cDNA-DIG)

Salvelinus alpinus

IIP : 10 mg E2 . kg-1

VTG: Western Blot(policlonal de truta em coelho / anti-IgG de coelho conjugado à peroxidase)

mRNA-RE2

Northern Blot: sonda fluorescente (cDNA-DIG)

Salvelinus alpinus

IIP : 10 mg E2 . kg-1

mRNA-VEPsNorthern Blot:

sonda fluorescente(cDNA-DIG)

Salvelinus alpinus

IIP : 10 mg E2 . kg-1

CULTIVO PRIMÁRIODE HEPATÓCITOS

DE TRUTA

IOD

TRUTA

mRNA-VTG

Northern Blot:

autoradiografia (32P)

[VTG]% (IOD)VTG SDS-PAGE (5-20 %)

TRUTA

[VTG]% (IOD)

EXPRESSÃODE VTG

vs.EXPOSIÇÃO AO Pb++

EMHoplias malabaricus

VITELOGENINA (VTG) em plasma de Hoplias malabaricusevidenciada por SDS-PAGE descontínuo (Coomassie Brilliant Blue)

empilhamento em ACRILAMIDA a 4 % \\ separação em ACRILAMIDA a 9 %INDUÇÃO in vivo com hexaidrobenzoato de estradiol (E2)

dose via intraperitoneal: 20 g E2 . g-1 biomassa — iip E2(+)

linha 1: 200 nl dos animais 3 e 6 (pool de plasma), MACHOS jovens E2 (-)linha 2: 200 nl do animal 4, FÊMEA jovem E2 (-)linha 3: 50 nl do animal 11, sexo indefinido, iip E2(+)linha 4: 200 nl do animal 11, sexo indefinido, iip E2(+)linhas 5 a 8: 50 nl de VTG redissolvida em NaCl 1 M, após PRECIPITAÇÃO (2x),

com EDTA/MgCl2 e H2O

linha 5: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 2,5linha 6: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 2,0linha 7: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 1,5linha 8: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 1,0

animal 11, iip E2(+) :

1 2 3 4 5 6 7 8 MWM

205 kDa

116 kDa97,4 kDa

66 kDa45 kDa

29 kDa

VITELOGENINA (VTG) em plasma de Hoplias malabaricusevidenciada por SDS-PAGE descontínuo (Coomassie Brilliant Blue)

empilhamento em ACRILAMIDA a 4 % \\ separação em ACRILAMIDA a 9 %INDUÇÃO in vivo com hexaidrobenzoato de estradiol (E2)

dose via intraperitoneal: 20 g E2 . g-1 biomassa — iip E2(+)

linha 1: 400 nl dos animais 3 e 6 (pool de plasma), MACHOS jovens E2 (-)linha 2: 400 nl do animal 4, FÊMEA jovem E2 (-)linha 3: 100 nl do animal 11, sexo indefinido, iip E2(+)linha 4: 400 nl do animal 1, FÊMEA jovem E2 (-)linhas 5 a 8: 150 nl de VTG redissolvida em NaCl 1 M, após PRECIPITAÇÃO (2x),

com EDTA/MgCl2 e H2O

linha 5: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 2,5linha 6: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 2,0linha 7: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 1,5linha 8: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 1,0

animal 11, iip E2(+) :

1 2 3 4 5 6 7 8MWM

116 kDa97,4 kDa

45 kDa

29 kDa