Aula 02 Microscopio de Luz e Técnicas de Observação e Coloração

Microscópio, Técnicas de Observação e de Coloração de Células

Prof. Hamilton Felix Nobrega

Quais as teorias sobre a origem da vida?

Qual a teoria mais aceita sobre o surgimento da vida?

Como surgiu a Biologia?

Quais as duas hipóteses sobre a origem das

primeiras células?

A quem se dá o crédito pela criação do primeiro

microscópio?

Quem utilizou o microscópio para observar micro-organismos pela primeira vez?

Qual o cientista famosos pela criação do método de esterilização?

O que é célula e porque recebeu esse nome?

O que diz a teoria celular?

Como surgiu os laboratórios de análises clínicas?

Para uma adequada observação das células ao microscópio, é fundamental a

aplicação de algumas técnicas biológicas específicas. Que técnicas são essas?

Quais os tipos

de

microscópio?

Principal instrumento da Biologia Celular e Histologia

• De luz (ML) / óptico (campo claro)

Modificado (variações) com propósitos especiais

Contraste de fase Invertido

Polarização Fluorescência

• Eletrônico (ME) - imagens mais aumentadas / feixe de elétrons

Microscópio eletrônico de transmissão (MET)

Microscópio eletrônico de varredura (MEV)

2)

Formado por:

Fonte luminosa → luz branca

(lâmpada com filamento de

tungstênio)

Óptica → lentes

ampliação

condensação

Mecânica

Sistema de iluminação

Fonte de luz → Lentes

O posicionamento estratégico das lentes no microscópio

proporcionam a formação de uma imagem Invertida

Fonte luminosa: Trajeto da luz

Fonte luminosa:

Trajeto da luz

Também chamados de

microscópios fotônicos, os

microscópios ópticos possuem

três conjuntos principais de

lentes ópticas, fabricadas em

vidro ou cristal.

Óptica

Um dos conjuntos é o condensador, cujas lentes tem a função

de concentrar os raios luminosos que atravessam o objeto em

observação.

Outro conjunto são as lentes objetivas, as mais importantes aomicroscópio, responsáveis pela formação a imagem.

Outro conjunto são as lentes objetivas, as mais importantes aomicroscópio, responsáveis pela formação a imagem.

4x = Vermelha10x = Amarela

40x = Azul claro100x = Preta/ branca

O terceiro conjunto é composto pelas lentes oculares, queficam próximas ao olho do observador e na qual se projetam asimagens.

A luz, após ser concentrada no

condensador, atravessa o objeto em

observação, passa pelas lentes da

objetiva e da ocular e chega ao olho

do observador como uma imagem

ampliada.

Multiplicando o aumento fornecido pela objetiva, calculamos o valor

final de observação.

Por exemplo: Se empregarmos uma ocular de 10x e uma objetiva

de 40x, o valor final da ampliação será de 400x.

Os microscópios modernos fornecem aumentos médios entre 100x

e 1.500x. Se um objeto que mede 0,01mm de diâmetro (invisível ao

olho nu) for ampliado 1.000x, sua imagem ampliada terá 10mm

(1cm) e poderá ser visualizada.

Poder de Resolução (PR): “Capacidade de uma lente (oudo próprio microscópio) em formar imagens comdetalhes mínimos”

Limite de Resolução (LR): “Menor distância entre 2 pontosdistintos do objeto, que poderão ser individualizados naimagem final”

Mecânica Função

Base Serve de apoio

Parafuso

micrométrico

Permite movimentos verticais lentos de pequena amplitude da platina

para focagem

Parafuso

macrométrico

Permite movimentos verticais de grande amplitude da platina para

focagem

Revólver Suporte das lentes objetivas, permite trocar a lente objetiva rodando

sobre um eixo

Braço fixo à base, serve de suporte às lentes e à platina

Canhão Suporta a ocular na extremidade superior

Platina Base de suporte e fixação da preparação, tem uma abertura central

(sobre a qual é colocada a preparação) que deixa passar a luz.

Pinça Ajudam a fixar a preparação

Charriot Peça que permite movimentar a lâmina sobre a platina.

Lâmpada Emite o feixe luminoso

Estudo de capilares

Médicos rejeitaram a microscopia;

Descrições sobre capilares eram

falsas;

Marcello Malpighi

(1628-1694)

“ Nossa opinião é que a anatomia de uma estrutura sumamente

pequena, interna de uma víscera, que foi exaltada nestes tempos, é

de uso a nenhum médico”

Os primeiros que estudaram as células,

notaram que elas eram preenchidas por

um líquido viscoso que foi denominado

citoplasma.

Nas células vegetais sempre se

observava um envoltório bem definido, a

parede celular.

Deduziram então, que as células animais

também tivessem algum tipo de

envoltório, o qual chamaram de

membrana plasmática.

O microscópio confirmou que havia essa finíssima camada envolvendo o

citoplasma.

Os primeiros que estudaram as células,

notaram que elas eram preenchidas por

um líquido viscoso que foi denominado

citoplasma.

Nas células vegetais sempre se

observava um envoltório bem definido, a

parede celular.

Deduziram então, que as células animais

também tivessem algum tipo de

envoltório, o qual chamaram de

membrana plasmática.

O microscópio confirmou que havia essa finíssima camada envolvendo o

citoplasma.

Tempos depois, Robert Brown, em suas

observações ao microscópio, lançou a

hipótese de que a estrutura ovóide que

havia no interior das células, era um

componente importante e fundamental,

o qual ele chamou de núcleo.

Desde então, os biólogos passaram a

admitir que todas as células tem três

partes fundamentais: membrana,

citoplasma e núcleo.

Com o desenvolvimento de

novas tecnologias microscópicas,

descobriu-se que o citoplasma

contém diversas estruturas, além

do núcleo.

Descobriu-se também que as

bactérias e arqueas

(procariontes) não possuem um

núcleo e são estruturalmente

mais simples que as demais

células.

Como podemos observar, acriação do microscópio foi ummarco nos estudos sobre ascélulas.

Para ser observado ao microscópio, o material biológico precisaser a uma série de procedimentos, denominados de técnicascitológicas.

Há diversas técnicas de preparação de amostras de acordo como material a ser estudado e do tipo de análise que se desejaobter.

Geralmente são colocadossobre uma placa de vidroretangular - a lâmina - ecobertos por uma placa devidro bem fina - a lamínula.

Observação in vivo (exame a fresco)

Técnica relativamente simples. O material biológico é colocado

sobre a lâmina e observado.

Utilizada frequentemente para se observar células vegetais vivas.

Fixação das células

Técnica utilizada para evidenciar detalhes internos das células.

Nesse caso, o material tem que passar por diferentes tratamentos

antes de ser observado.

Geralmente o primeiro tratamento é a fixação, que consiste em

matar rapidamente as células, preservando o máximo de sua

estrutura interna.

Para obter esse efeito, costuma-se mergulhar as células em

líquidos fixadores (formol, ácido acético, etc)

Coloração das células

As estruturas celulares mesmo fixadas, apresentam baixo

contraste.

Técnicas de realce das estruturas foram desenvolvidas, através da

coloração de certas estruturas celulares.

Após fixadas, as células são mergulhadas em corantes

citológicos. Os corantes tem afinidade por certas estruturas da

célula.

Após a coloração, a amostra é lavada e observada ao microscópio.

As estruturas coradas destacam-se das demais, permitindo a sua

visualização.

Fixação e coloração das células

Coloração das células

Uma técnica bem comum é a coloração com hematoxilina (azul-

arroxeado) e eosina (alaranjado).

Hematoxilina tema afinidade com o núcleo

celular e pouca afinidade com o

citoplasma.

A eosina tem grande afinidade pelo

citoplasma celular.

• Também é possível observar células a fresco comcoloração.

Corantes especiaiscomo o azul de

metileno penetram nacélula e evidenciamsuas estruturas semmatá-la.

Esfregaço

Técnica utilizada para material biológico com células isoladas ou

pouco unidas entre si.

Evita que células

fiquem empilhadas e

permite observá-las

isoladamente.

Esmagamento

Técnica utilizada para células frouxamente associadas, como as

partes moles de tecidos vegetais e animais.

O material geralmente já fixado e corado é colocado entre uma

lâmina e uma lamínula de vidro e esmagado pela pressão suave do

dedo polegar.

Em alguns casos, pode-se

aquecer previamente o material

para que as células se separem

com mais facilidade.

Corte manual

Quando o material biológico

tem células firmemente

unidas entre si, é

necessário cortá-lo em

fatias bem finas,

denominadas:

Cortes histológicos

Inclusão e corte com micrótomo

O estudo microscópico detalhado das células requer que elas

sejam cortadas em fatias muito finas. Por isso, são submetidas a

tratamentos e procedimentos que facilitam o corte.

O mais comum é chamado de inclusão. Neste, o material é

mergulhado é uma substância líquida que depois endurece,

preenchendo-o e envolvendo-o completamente.

A substância mais comumente utilizada é a parafina. Quando o

material fica solidificado dentro do molde, pode ser cortado em

fatias bem finas, com uso do micrótomo.

Inclusão e corte com micrótomo

Inclusão e corte com micrótomo

Inclusão e corte com micrótomo

Fracionamento celular por centrifugação

Essa técnica envolve a maceração das células e sua

homogeneização. Em seguida, o homogeneizado celular é

submetido a centrifugação.

De acordo com a velocidade de aceleração da centrifugação,

determinadas partes da célula são separadas. Por exemplo, os

núcleos celulares são separados a uma força de 600 g.

O líquido sobrenadante é colocado novamente para centrifugar

para separação de outras organelas, a outra velocidade. As

mitocôndrias, por exemplo, são separadas a 20.000 g

Fracionamento celular por centrifugação