Universidade do Estado do Rio de Janeiro

Centro Biomédico

Faculdade de Odontologia

Bruno Rescala Conde de Medeiros

Perfil imunológico e microbiológico de pacientes com periodontites crônica

e agressiva

Rio de Janeiro

2010

Bruno Rescala Conde de Medeiros

Perfil imunológico e microbiológico de pacientes com periodontites crônica e agressiva

Tese apresentada, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor, ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia, da Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Área de concentração: Periodontia.

Orientador: Prof. Carlos Marcelo da Silva Figueredo

Rio de Janeiro

2010

Bruno Rescala Conde de Medeiros

Perfil imunológico e microbiológico de pacientes com periodontites crônica e agressiva

Tese apresentada, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor, ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia, da Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Área de concentração: Periodontia.

Aprovada em 29 de março de 2010.Orientador:

_____________________________________________Prof. Carlos Marcelo da Silva FigueredoFaculdade de Odontologia da UERJ

Banca Examinadora:

_____________________________________________Prof. Jonas Capelli JúniorFaculdade de Odontologia da UERJ

_____________________________________________Prof. Milton UzedaDepartamento de Microbiologia Médica da UFRJ

_____________________________________________Prof. Raphael Hirata JúniorFaculdade de Ciências Médicas da UERJ

_____________________________________________Prof. Ricardo Guimarães FischerFaculdade de Odontologia da UERJ

_____________________________________________Prof. Ricardo Palmier TelesForsyth Institute

Rio de Janeiro

2010

DEDICATÓRIA

Para Cris, pelo amor e incentivo constante.

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais Marilena e Livieto, pelo apoio incondicional que sempre me deram em

tudo na minha vida. Ao meu avô João (in memorium), minha avó Helena, minhas irmãs Luana

e Mariana, minha madrinha Marilena e minha tia Eliana, pelo carinho e incentivo.

À minha esposa Cris, pelo amor, incentivo, compreensão e ajuda constante durante

todo esse tempo.

Ao Professor Ricardo Palmier Teles, não só por todos os ensinamentos e a ajuda

durante a elaboração deste trabalho, mas especialmente pelo incentivo, confiança e a amizade,

desde o início da minha formação em Periodontia, no curso de Especialização.

Ao meu orientador, Professor Carlos Marcelo da Silva Figueredo, pelos ensinamentos,

incentivo e a confiança depositada desde o início do curso de Mestrado.

Ao professor Ricardo Guimarães Fischer, por todos os ensinamentos e a ajuda desde o

início do curso de Mestrado.

Ao grande amigo Wilson Rosalem, companheiro constante em todas as fases de

elaboração e confecção deste trabalho, incentivo permanente neste longo caminho.

Aos colegas da disciplina de Periodontia da UNESA, Fábio, Wilson, Vívian, Rodrigo e

Antonieta, pela ajuda e companherismo nos últimos anos.

Aos meus amigos Fabiano, Fred, João Luís, Ida e Mazinho, pelo incentivo e

companheirismo em todos os momentos da minha vida.

A todos os amigos da UERJ pela amizade compartilhada durante estes últimos anos.

RESUMO

RESCALA, Bruno. Perfil imunológico e microbiológico de pacientes com periodontites crônica e agressiva. 2010. 47f. Tese (Doutorado em Odontologia) - Faculdade de Odontologia, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2010.

O objetivo deste estudo foi determinar os níveis de interleucina-1β (IL-1 ), IL-2, IL-4, IL-8, interferon-γ (IFN-) e a atividade de elastase no fluido gengival (FG) de pacientes com periodontite crônica generalizada (PCG) e periodontite agressiva generalizada (PAgG), e correlacionar com indivíduos de um grupo controle com gengivite apenas. Um objetivo secundário foi analisar o perfil microbiológico subgengival destes indivíduos. Dados clínicos transversais foram obtidos de 20 pacientes com PCG, 17 pacientes com PAgG e 10 indivíduos com gengivite. Amostras de FG foram coletadas com tiras de papel e os níveis de: IL-1, IL-2, IL-4, IL-8 e IFN- foram medidos, utilizando um imunoensaio do tipo multiplex (Luminex). Atividade da elastase foi avaliada por um ensaio enzimático. Amostras de placa subgengival foram analisadas através do checkerboard DNA-DNA hybridization. As diferenças de significância entre os grupos para dados imunológicos e microbiológicos foram realizadas utilizando o teste Kruskal-Wallis, ajustando para múltiplas comparações. As médias dos parâmetros clínicos e os volumes de FG foram maiores nos pacientes com PCG e PAgG comparados ao grupo gengivite. Níveis mais elevados de IL-1β e atividade de elastase foram encontrados em sítios profundos quando comparado a sítios rasos em ambos os grupos com periodontite (p <0,05). Os dados microbiológicos apresentaram níveis significativamente mais elevados das espécies do complexo vermelho em pacientes com PCG e PAgG, quando comparados aos indivíduos com gengivite (p <0,05). Não houve diferença estatisticamente significante nos níveis de biomarcadores no FG e nos níveis de espécies bacterianas subgengivais entre pacientes com PCG e pacientes com PAgG. Sendo assim, concluímos que os dados do presente estudo não mostraram diferença estatisticamente significante nos parâmetros imunológicos e microbiológicos medidos entre indivíduos com PCG e PAgG.

Palavras-chave: Periodontite. Fluido do sulco gengival. Citocinas. Microbiologia

ABSTRACT

The goal of this study was to determine the gingival crevicular fluid (GCF) levels of interleukin-1β (IL-1), IL-2, IL-4, IL-8 and interferon-γ (IFN-) and elastase activity from patients with generalized chronic (GCP) and generalized aggressive periodontitis (GAgP) and to compare with a control group with gingivitis subjects. A secondary aim was to analyze the microbiological profile of these subjects. Cross-sectional clinical data were obtained from 20 GCP, 17 GAgP and 10 gingivitis subjects. GCF samples were collected with paper strips and the levels of: IL-1, IL-2, IL-4, IL-8, and IFN- measured using a multiplexed bead immunoassay (Luminex). Elastase activity was assessed by an enzymatic assay. Subgingival plaque samples were analyzed using checkerboard DNA-DNA hybridization. Significance of differences among groups for immunological and microbiological data was examined using Kruskal-Wallis adjusting for multiple comparisons. Mean clinical parameters and GCF volumes were higher in GCP and GAgP patients compared to controls. Higher levels of IL-1β and higher elastase activity were found in deep sites compared to shallow sites in both periodontitis groups (p<0.05). The microbiological data showed significantly higher levels of the Red complex species in GCP and GAgP patients compared to controls (p<0.05). There were no statistically significant differences in levels of GCF biomarkers and in levels of subgingival bacterial species between GCP and GAgP subjects. In conclusion, there were no statistically significant differences in the measured immunological and microbiological parameters between GCP and GAgP subjects.

Keywords: Periodontitis. Gingival crevicular fluid. Cytokines. Microbiology.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Contagens médias (x 105) das 40 espécies testadas de até 14 amostras de biofilme subgengival em 10 pacientes com gengivite, 20 com periodontite crônica generalizada (PCG) e 14 com periodontite agressiva generalizada (PAgG). Contagens médias de cada espécie foram calculados pela média dos dados de cada indivíduo e, em seguida, foi realizado uma média entre indivíduos em cada grupo clínico separadamente. A significância das diferenças de cada espécie entre os grupos clínicos foi realizada pelo teste de Kruskal-Wallis e ajustado para 40 comparações (SOCRANSKY et al., 1991): * p <0,05, ** p <0,01 e *** p <0,001. As espécies foram ordenadas e agrupadas de acordo com os complexos descritos por Socransky et al. 1998 (SOCRANSKY et al., 1998) ................................................................ 34

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 –

Tabela 2 –

Tabela 3 –

Tabela 4 –

Tabela 5 –

Tabela 6 –

Valores médios (± DP) para parâmetros clínicos e demográficos nos indivíduos dos grupos gengivite (G), periodontite crônica generalizada (PCG) e periodontite agressiva generalizada (PAgG)...................................

Pares de comparação post-hoc usando o procedimento da menor diferença significante de Fischer (LSD)........................................................................

Valores médios (± DP) para: profundidade de bolsa à sondagem (PBS), nível de inserção clínico (NIC), porcentagem de sítios com sangramento à sondagem (SS) e volume de fluido gengival (FG) para os sítios coletados, nas diferentes categorias de sítios. Os dados foram comparados usando ANOVA e ANCOVA, ajustando para diferenças de idade e para o tabagismo entre os grupos..............................................................................

Pares de comparação post-hoc usando o procedimento da menor diferença significante de Fischer (LSD).........................................................................

Valores de mediana (intervalo interquartil) de atividade de elastase (Abs) e os níveis dos 5 biomarcadores (pg/sítio) para amostras agrupadas das diferentes categorias de sítio. Os dados foram comparados usando teste Kuskal-Wallis e o teste não-paramétrico ANCOVA, ajustando para diferenças de idade e para o tabagismo entre os grupos.................................

Pares de comparação post-hoc usando o procedimento da menor diferença significante de Fischer (LSD).........................................................................

30

30

31

31

33

33

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AAP – Academia Americana de Periodontia

Abs - Absorbância

et al – e outros

FG – Fluido gengival

G – Gengivite

g – Sítio raso com gengivite

IG – Índice Gengival

INF-γ - Interferonγ

IL-1β – Interleucina-1 beta

IL-2 – Interleucina 2

IL-4 – Interleucina 4

IL-8 – Interleucina-8

LSD – Diferença mínima significativa de Fisher

ml - Mililitro

mm – Milímetros

mM – Milimolar

ng – Nanograma

NIC – Nível de inserção clínico

PAgG – Periodontite agressiva generalizada

PBS – Profundidade de bolsa à sondagem

PCG – Periodontite crônica generalizada

pg – Picograma

PIC – Perda de inserção clínica

sp – Sítio profundo

sr – Sítio raso

SS – Sangramento à sondagem

Th1 – Célula “T” auxiliar 1

Th2 – Célula “T” auxiliar 2

µl - Microlitro

SUMÁRIO

1

1.1

1.2

1.3

1.4

2

3

3.1

3.2

3.2.1

3.2.2

3.3

3.3.1

3.4

4

4.1

4.2

4.3

5

6

INTRODUÇÃO .....................................................................................................

REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................

Periodontite crônica e agressiva segundo a classificação da AAP de 1999.......

Fluido gengival como ferramenta de diagnóstico ...............................................

Achados imunológicos nas periodontites crônica e agressiva ..........................

Achados microbiológicos nas periodontites crônica e agressiva ......................

PROPOSIÇÃO ......................................................................................................

MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................

Seleção de pacientes e exame clínico ....................................................................

Coleta de fluido gengival .......................................................................................

Quantificação dos mediadores pelo método Luminex ............................................

Atividade de elastase ...............................................................................................

Coleta Microbiológica ...........................................................................................

Técnica de hibridização Checkerboard DNA-DNA ................................................

Análise estatística ..................................................................................................

RESULTADOS.......................................................................................................

Parâmetros clínicos................................................................................................

Resultados Imunológicos.......................................................................................

Resultados Microbiológicos...................................................................................

DISCUSSÃO...........................................................................................................

CONCLUSÕES......................................................................................................

REFERÊNCIAS.....................................................................................................

ANEXO - Comitê de ética em pesquisa...................................................................

APÊNDICE A – Artigo submetido para o Journal of Periodontology -

Immunological and microbiological profiles of chronic and aggressive

periodontitis subjects................................................................................................

13

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15

16

17

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24

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25

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27

29

30

30

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33

35

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40

47

48

13

INTRODUÇÃO

Atualmente, a periodontite crônica generalizada (PCG) e a periodontite agressiva

generalizada (PAgG) são reconhecidas como duas formas distintas de doença periodontal que

resultam de uma resposta inflamatória a bactérias localizadas no biofilme dental subgengival.

A forma mais comum, periodontite crônica, é caracterizada por uma perda de inserção

periodontal que parece ocorrer durante um longo período de tempo. Em contraste, rápida

destruição de inserção periodontal é evidente na periodontite agressiva (ARMITAGE, 1999).

Em resposta à microbiota subgengival, o hospedeiro libera citocinas inflamatórias e

enzimas, que são responsáveis pela maior parte da degradação dos tecidos periodontais,

levando aos sinais clínicos da doença (SEYMOUR; GEMMELL, 2001; PRESHAW, 2008).

Vários destes biomarcadores podem ser detectados no fluido gengival (FG), que é um meio

conveniente para o diagnóstico e avaliação dos níveis de mediadores inflamatórios liberados

durante a progressão da doença periodontal. Os níveis aumentados de diversas citocinas pró-

inflamatórias no FG têm sido associados com periodontite crônica e/ou agressiva, como a IL-

1 (FIGUEREDO, RIBEIRO et al., 1999; GIANNOPOULOU; KAMMA; MOMBELLI,

2003), IL-2 (LEE et al., 1995; SALVI et al., 1998), INF-γ (DUTZAN et al., 2009) e IL-8 (JIN

et al., 2002; KAMMA et al., 2004; TELES et al., 2009). Inversamente, a citocina anti-

inflamatória IL-4 tem sido associada com a remissão ou melhoria de ambas as formas de

periodontites crônica e agressiva (GIANNOPOULOU; KAMMA; MOMBELLI, 2003;

BASTOS et al., 2009).

A presença de neutrófilos hiper-reativos em pacientes com periodontite agressiva,

quando comparados em indivíduos com periodontite crônica foi sugerida (BUCHMANN et

al., 2002). Giannopoulou et al. (2003) concluiram que pacientes com periodontite agressiva

apresentaram maiores níveis de IL-1 e IL-8 no FG, quando comparados aos níveis dos

pacientes com periodontite crônica. No entanto, vários estudos também têm demonstrado a

presença de neutrófilos hiper-reativos em pacientes com periodontite crônica associada a uma

liberação local excessiva de enzimas proteolíticas como a elastase (GUSTAFSSON;

ASMAN; BERGSTROM, 1994; FIGUEREDO, RIBEIRO et al., 1999). Além disso, Suzuki et

al. (2008) não encontraram diferenças nos níveis de IL-1β no FG entre indivíduos com

periodontite crônica e agressiva. Portanto, a existência de diferenças na resposta do

hospedeiro e, consequentemente, dos níveis de biomarcadores inflamatórios no FG entre as

formas de doença periodontal crônica e agressivas necessitam de esclarecimentos adicionais.

14

Enquanto em alguns estudos foram encontradas diferenças na microbiota periodontal

entre pacientes com periodontite crônica e agressiva (DOGAN et al., 2003; SCHACHER et

al., 2007), estudos mais recentes mostram apenas pequenas diferenças no perfil

microbiológico entre indivíduos com periodontite crônica e agressiva (LEE, E. et al., 2003;

XIMENEZ-FYVIE et al., 2006). Estes resultados microbiológicos sugerem que o hospedeiro

e fatores ambientais podem explicar as diferenças na taxa de destruição tecidual observada

nestas duas condições clínicas (CHAMPAGNE et al., 2003; MENG et al., 2007).

Um número limitado de estudos tem avaliado simultaneamente mediadores

inflamatórios no FG e a microbiota associada aos indivíduos e sítios estudados (PALYS et al.,

1998; SODER et al., 2006). Até o nosso conhecimento, não há estudos que examinaram

biomarcadores no FG e a composição microbiana subgengival concomitantemente, a fim de

esclarecer diferenças na resposta do hospedeiro ao desafio microbiano entre pacientes com

periodontite crônica e agressiva. A fim de determinar se indivíduos com periodontite

agressiva apresentam um fenótipo hiper-inflamatório, quando comparados aos indivíduos com

periodontite crônica, a quantificação do desafio microbiano é necessária.

Os dados de estudos recentes (LEE, J. W. et al., 2003; XIMENEZ-FYVIE et al., 2006)

mostram que os perfis microbianos subgengivais nos indivíduos com periodontite agressiva e

crônica parecem ser semelhantes. Sendo assim, podemos testar a hipótese de que as formas

crônica e agressiva de periodontites apresentam diferentes perfis de biomarcadores no FG

quando expostas a microbiotas subgengivais semelhantes.

Portanto, o objetivo do presente estudo foi comparar os níveis de IL-1 , IL-2, IL-4,

IL-8, IFN- e a atividade elastase no FG entre indivíduos com PCG e PAgG, e relacionar seus

níveis com indivíduos de um grupo controle com gengivite apenas. Um objetivo secundário

foi analisar o perfil microbiológico subgengival destes indivíduos.

15

1 REVISÃO DA LITERATURA

1.1 Periodontite crônica e agressiva segundo a classificação da AAP de 1999

Em 1999 no Workshop Internacional de Classificação das Condições e Doenças

Periodontais, os termos “periodontite de início precoce” e “periodontite do adulto” foram

substituídos por “periodontite agressiva” e “periodontite crônica” respectivamente. Essas

mudanças foram devidas principalmente a uma considerável incerteza sobre a definição de

limites de idades e o fato de considerar a idade como um critério preliminar para a

classificação. Atualmente as periodontites agressiva e crônica são reconhecidas como duas

formas distintas de doença periodontal.

A periodontite crônica é uma doença infecciosa que causa uma inflamação dos tecidos

de suporte dentários, levando a perda progressiva destes tecidos. É reconhecida como a forma

mais comum de periodontite, sendo mais prevalente em adultos, podendo, no entanto, surgir

em qualquer idade. A quantidade de destruição é compatível com a presença de fatores locais.

Sua prevalência e severidade aumentam com a idade, podendo afetar um número variável de

dentes e apresentar diferentes taxas de progressão. A periodontite crônica pode ser

adicionalmente caracterizada pela extensão e severidade. A extensão é caracterizada pelo

número de sítios envolvidos sendo: Localizada se ≤ 30% dos sítios forem afetados e

generalizada se > de 30% dos sítios forem afetados. A severidade foi categorizada com base

na perda de inserção (PIC), sendo: leve (1 a 2 mm PIC), moderada (3 a 4 mm PIC) e avançada

( ≥5 mm PIC) (ARMITAGE, 1999).

Em contrapartida, a periodontite agressiva é menos prevalente na população,

normalmente afetando indivíduos mais jovens (abaixo de 30 anos), mas podendo ocorrer em

indivíduos mais velhos, com rápida perda de inserção e destruição óssea e normalmente

havendo agregação familiar. Como fator secundário para o diagnóstico, é visto que a

quantidade de depósitos microbianos é inconsistente com a severidade da destruição

periodontal. Na forma localizada, a perda de inserção está localizada em molares/incisivos e

não pode envolver mais de dois dentes permanentes fora estes. Nos indivíduos com a forma

generalizada, deve ocorrer perda de inserção interproximal generalizada afetando pelo menos

três dentes permanentes que não sejam primeiros molares e incisivos (ARMITAGE, 1999).

16

A variação individual na progressão à periodontite tem sido documentada em estudos

longitudinais tanto em populações tratadas como não tratadas (LINDHE; NYMAN, 1984;

LOE et al., 1986). Em um estudo longitudinal em plantadores de chá no Sri Lanka, sem

nenhum acesso a cuidados odontológicos e com baixa higiene oral, uma grande variação

individual no risco de progressão foi observada. Enquanto 81% desta população apresentava

progressão moderada e 11% nenhuma progressão de doença, uma pequena porcentagem, 8%,

foi descrita como tendo rápida progressão de doença durante um período de 15 anos de

acompanhamento (LOE et al., 1986). Provavelmente, este grupo de risco era composto por

indivíduos com as formas de periodontite crônica avançada e periodontite agressiva.

1.2 Fluido gengival como ferramenta de diagnóstico

O fluido gengival (FG) emerge entre a superfície dentária e a camada externa do

epitélio juncional. Em saúde, representa um fluido intersticial que aparece no sulco como um

resultado de um gradiente osmótico e é considerado um transudato. Com o acúmulo de placa

ocorre uma resposta inflamatória no tecido gengival, resultando em um aumento de

permeabilidade nos capilares e uma elevação do fluxo do FG. Neste estágio, o FG torna-se um

verdadeiro exsudato, com uma concentração de proteínas similar à do soro (GRIFFITHS,

2003). Durante a passagem do tecido gengival para o sulco, este exsudato carrega vários

componentes celulares e moleculares da resposta imunológica presentes no soro, assim como

mediadores e produtos da destruição tecidual gerados nos tecidos. Logo, a coleta de FG é um

método minimamente invasivo que pode ser usada para quantificar e caracterizar a resposta

do hospedeiro frente ao desafio bacteriano local pela medição de marcadores bioquímicos e

componentes celulares (CHAMPAGNE et al., 2003).

Vários estudos têm procurado uma associação entre a quantidade total ou a

concentração de diferentes constituintes do FG e o status de saúde periodontal. Visto que a

resposta do hospedeiro é um determinante crítico na patogênese da periodontite, a mensuração

dos níveis dos mediadores inflamatórios tem sido usada para avaliação de risco. Este risco

pode estar relacionado diretamente à chance de um sítio perder inserção clínica ou à

possibilidade de o indivíduo vir a desenvolver doença periodontal (CHAMPAGNE et al.,

2003).

17

A resposta imuno-inflamatória do hospedeiro pode variar de indivíduo para indivíduo

dependendo não apenas do grau de virulência bacteriana, mas também de fatores ambientais

(BARBOUR et al., 1997), genéticos e associações com doenças sistêmicas (CUTLER et al.,

1999).

Os sinais clínicos de doença periodontal não são capazes de revelar o verdadeiro grau

de atividade da doença. Mensurações de sangramento à sondagem e supuração são indicativos

da presença de inflamação. Entretanto, elas representam baixos valores preditivos positivos

para a progressão da doença, tanto para os níveis relacionados ao indivíduo como para os

sítios (CLAFFEY et al., 1990; CLAFFEY; EGELBERG, 1994). Estas limitações podem

resultar em sobretratamento de sítios baseados na presença de inflamação clínica e uma falta

de tratamento em sítios com risco de progressão.

O FG é composto por diversos componentes da resposta imunológica presentes no

soro, assim como mediadores inflamatórios e produtos gerados pela destruição tecidual local

(FIGUEREDO; GUSTAFSSON, 1998; BOSTROM; LINDER; BERGSTROM, 2000;

ALPAGOT et al., 2001). Portanto, o FG é uma ferramenta importante para quantificar e

caracterizar a resposta do hospedeiro frente ao desafio bacteriano (CHAMPAGNE et al.,

2003).

1.3 Achados imunológicos nas periodontites crônica e agressiva

A resposta imuno-inflamatória do hospedeiro ao biofilme localizado no sulco gengival

é caracterizada pela produção excessiva de citocinas inflamatórias e enzimas, que são

responsáveis pela maioria de destruição periodontal, levando aos sinais clínicos de doença

(SEYMOUR; GEMMELL, 2001; PRESHAW, 2008). Níveis aumentados de citocinas pró-

inflamatórias no fluido gengival como IL-1β (FIGUEREDO, RIBEIRO et al., 1999;

GIANNOPOULOU; KAMMA; MOMBELLI, 2003; GOUTOUDI; DIZA; ARVANITIDOU,

2004; TOKER; POYRAZ; EREN, 2008) e IL-8 (GAMONAL et al., 2000; JIN et al., 2002;

KAMMA et al., 2004; TELES et al., 2009) têm sido associados com periodontites crônica e

agressiva. Entretanto, ainda não está claro se a quantidade total em vez de mera presença da

citocina seria importante para a progressão da doença.

A IL-1β é um dos mediadores mais investigados no FCG (MATHUR et al., 1996;

YOSHIMURA et al., 1997; FIGUEREDO, RIBEIRO et al., 1999; BOSTROM; LINDER;

18

BERGSTROM, 2000; GAMONAL et al., 2000; GIANNOPOULOU; KAMMA;

MOMBELLI, 2003; GOUTOUDI; DIZA; ARVANITIDOU, 2004; TOKER; POYRAZ;

EREN, 2008). Em modelos de gengivite experimental os níveis desta citocina apresentam

elevação com o passar do tempo (GONZALES et al., 2001; ZHANG; KASHKET;

LINGSTROM, 2002); apresentam-se elevados em pacientes com periodontite quando

comparados com controles saudáveis e com gengivite (HOU; LIU; ROSSOMANDO, 1995;

GIANNOPOULOU; KAMMA; MOMBELLI, 2003); estão em níveis mais elevados em sítios

ativos versus inativos (GAMONAL et al., 2000) e apresentam declínio após tratamento

(REINHARDT et al., 1993; ALEXANDER et al., 1996; LAMSTER et al., 1996;

HOLMLUND; HANSTROM; LERNER, 2004). Além disso, foi observado em um modelo

em primatas que quando esta citocina é bloqueada in vivo, ocorre uma redução da perda óssea

alveolar detectada por radiografia (OATES; GRAVES; COCHRAN, 2002).

Giannopoulou et al (2003) constataram que pacientes com periodontite agressiva

apresentaram maiores níveis de IL-1 em seu FG, em comparação com periodontite crônica.

Foi achado neste estudo que quando os níveis de IL-1β foram comparados aos sítios do grupo

saudável, houve um aumento 6 vezes maior para os pacientes com periodontite crônica e 9

vezes maior para o grupo agressiva. Isso pode indicar que as diferenças na quantidade de IL-

1β estão envolvidos na progressão rápida da periodontite agressiva quando comparada com a

forma crônica. No entanto, Suzuki et al (2008) não encontraram diferença significante entre as

concentrações de IL-1β em sítios profundos em pacientes com periodontite agressiva e

crônica.

A elastase é a enzima neutrofílica encontrada em maior quantidade no FG durante o

processo de inflamação periodontal (COX; ELEY, 1989). Foi sugerido que a elastase pode ser

um indicador potencial para periodontite e para progressão da doença (PALCANIS et al.,

1992; ARMITAGE et al., 1994). Em um estudo longitudinal, Jin et al (1995) encontraram

níveis de elastase significativamente elevados em indivíduos com periodontite refratária

quando comparados àqueles com grau similar de periodontite no início do estudo; no entanto,

ocorreu redução favorável após o tratamento.

A presença de hiper-atividade neutrofílica pode estar associada a uma maior

destruição periodontal. Foi observado que neutrófilos periféricos de pacientes com

periodontite crônica e agressiva encontraravam-se hiper-responsivos após estimulação in vitro

quando comparados a controles saudáveis (FREDRIKSSON et al., 2003). Altas concentrações

de citocinas pró-inflamatórias são responsáveis pela ativação de neutrófilos que podem levar a

uma excessiva liberação local de enzimas proteolíticas como a elastase, resultando em

19

destruição dos tecidos periodontais(GUSTAFSSON; ASMAN; BERGSTROM, 1994;

FIGUEREDO, GUSTAFSSON et al., 1999).

A patogênese da doença periodontal é caracterizada pelo constante influxo de

leucócitos em direção ao sulco gengival (KORNMAN; PAGE; TONETTI, 1997). Um grupo

especial de citocinas, chamadas de quimiocinas é responsável por esse caminho migratório

(MUKAIDA et al., 1992). Em particular, a IL-8 garante o recrutamento seletivo de neutrófilos

(BICKEL, 1993). Ela pode ser secretada por diferentes células do hospedeiro como

macrófagos, linfócitos, fibroblastos, células epiteliais e endoteliais (BAGGIOLINI; WALZ;

KUNKEL, 1989).

Alguns estudos sugerem uma relação entre os níveis de IL-8 e atividade de doença

periodontal. Foi demonstrado que a quantidade total de IL-8 estava significativamente

aumentada no FG de sítios doentes de pacientes com periodontite crônica, quando

comparadas com sítios saudáveis ou com gengivite de pacientes controles (TSAI; HO; CHEN,

1995; MATHUR et al., 1996; GAMONAL et al., 2000; GIANNOPOULOU; KAMMA;

MOMBELLI, 2003). Gamonal et al. (2000) encontraram níveis mais elevados deste mediador

em pacientes com periodontite (316,7 ng/ml), comparado a indivíduos saudáveis (188,9

ng/ml). Cabe ressaltar que no mesmo grupo de pacientes, sítios ativos apresentavam maiores

concentrações de IL-8 (247,1 ng/ml) se comparados a sítios estáveis (163,6 ng/ml). A redução

dos níveis de IL-8 após terapia periodontal também foi relatada (TSAI; HO; CHEN, 1995;

GAMONAL et al., 2000; JIN et al., 2002). Entretanto, outros trabalhos mostraram uma

relação inversa entre IL-8 e atividade de doença (CHUNG; GRBIC; LAMSTER, 1997; JIN;

SODER; CORBET, 2000).

Diferenças nas citocinas secretadas pelas células Th1 e Th2 determinam as diferentes

funções biológicas dos subgrupos: linfócitos Th1 produzem primariamente IL-2; IFN-; TNF-

β, enquanto linfócitos Th2 secretam IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13. Altos níveis de atividade

Th1 promovem inflamação excessiva e injúria tecidual, funções mediadas por célula como a

reação de hipersensibilidade tardia. Células Th2 estão mais associadas com forte resposta

mediada por anticorpos, e reações alérgicas (GOLDSBY et al., 2000).

Células Th1 e Th2 podem individualmente ou combinadas regular a defesa do

hospedeiro contra a infecção periodontal. Inversamente, a expressão de citocinas Th1/Th2

pode ser originada de características específicas de patógenos periodontais durante a infecção

(GEMMELL et al., 2002). Tem sido sugerido que citocinas inflamatórias produzidas por

células Th1 estariam mais associadas a um processo de destruição tecidual ativo, enquanto

citocinas com características antiinflamatórias produzidas por células Th2 estariam envolvidas

20

na homeostasia tecidual e no subsequente processo de reparo tecidual (KINANE; LAPPIN,

2001). Provavelmente, considerando a dinâmica da resposta imune, um perfil de citocinas nos

tecidos periodontais seria alternado entre Th1 e Th2 dependendo do estágio da doença

(TENG, 2002).

A IL-2 é uma citocina pró-inflamatória que tem ação na regulação de células B e atua

na reabsorção óssea na doença periodontal (SEYMOUR et al., 1985). Lee et al (1995)

concluiram que os níveis de IL-2 estavam significativamentes elevados em sítios ativos de

pacientes com periodontite refratária quando comparados a sítios inativos após

acompanhamento por 3 meses; além disso, eles encontram correlação positiva entre niveis

elevados desta citocina com perda de inserção e reabsorção óssa.

Salvi et al (1998) mostram que a análise do FG de pacientes com periodontite crônica

e agressiva na “dentição terminal” apresentava elevados níveis dos mediadores inflamatórios

Th1 (IL-2 e INFγ) quando comparados aos mediadores da resposta Th2 (IL-4 e IL-6).

A presença da citocina anti-inflamatória IL-4 tem sido associada com a remissão ou a

melhoria de ambas as formas de periodontite crônica e agressiva (GIANNOPOULOU;

KAMMA; MOMBELLI, 2003; PRADEEP; ROOPA; SWATI, 2008; BASTOS et al., 2009).

Trabalhos anteriores demonstraram que baixos níveis de IL-4 em tecidos periodontais doentes

estão associados à atividade e à progressão de doença (SHAPIRA; VAN DYKE; HART,

1992; GIANNOPOULOU; KAMMA; MOMBELLI, 2003; TSAI et al., 2007). A diminuição

da produção da IL-4 por células T CD4+ gengivais pode levar ao acúmulo de macrófagos

ativados nos tecidos periodontais inflamados. A IL-4 inibe a produção IL-1β e IFN-γ pelos

monócitos; sendo assim, com baixos níveis de IL-4 os monócitos secretam altos níveis de

mediadores pró-inflamatórios (TE VELDE et al., 1990; LEE; RHOADES; ECONOMOU,

1995)

1.4 Achados microbiológicos nas periodontites crônica e agressiva

Um grande número de espécies bacterianas distintas pode ser encontrado no biofilme

dental subgengival. No entanto, apenas um pequeno subgrupo de micro-organismos orais

parece estar associado com infecções periodontais. Diversos estudos demonstraram que

determinadas espécies subgengivais e/ou complexos de micro-organismos orais estão

relacionados com diferentes tipos de doenças periodontais, assim como com um risco maior à

21

progressão dessas infecções (HAFFAJEE et al., 1997; SOCRANSKY; HAFFAJEE, 1997;

TANNER et al., 1998). Estudos iniciais já mostravam que sítios doentes em um mesmo

indivíduo exibiam formas microbianas distintas daquelas observadas em locais saudáveis,

conferindo um caráter de especificidade à doença (LISTGARTEN; SOCRANSKY, 1965;

TANNER et al., 1979). O conceito de especificidade microbiana na etiologia da doença

periodontal fortaleceu-se com as pesquisas relacionando o A. actinomycetemcomitans com a

periodontite juvenil localizada (NEWMAN et al., 1976; SLOTS, 1976; NEWMAN;

SOCRANSKY, 1977). Posteriormente, estabeleceu-se o Porphyromonas gingivalis como um

importante patógeno na periodontite crônica (SOCRANSKY et al., 1998). Outras espécies,

tais como, Tannerella forsythia, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens, Fusobacterium

nucleatum e espécies de Treponema têm sido sugeridas como possíveis patógenos

periodontais, porém seu verdadeiro papel na etiologia destas doenças não está totalmente

definido (HAFFAJEE; SOCRANSKY, 1994; SOCRANSKY; HAFFAJEE, 1994).

Estudos voltados para a caracterização da microbiota subgengival e identificação dos

agentes etiológicos das diversas formas de periodontites encontram uma série de limitações,

tais como: dificuldades técnicas, complexidade da microbiota endógena, dificuldades no

diagnóstico clínico de tipos distintos de doença, bem como o grau de atividade em diferentes

sítios e/ou indivíduos e dificuldades na interpretação e análise dos dados (HAFFAJEE;

SOCRANSKY, 1994). Devido a essas limitações, alguns critérios foram propostos para

definir um verdadeiro patógeno periodontal, incluindo: associação entre níveis e frequência

elevados do microrganismo com casos de infecção; eliminação ou redução das espécies

suspeitas associadas à remissão da doença; presença de uma resposta específica do

hospedeiro; capacidade da espécie em induzir a mesma doença em modelo animal, e o

aumento do risco à doença associada à presença e a níveis elevados do patógeno

(HAFFAJEE; SOCRANSKY, 1994).

Assim, como em outras infecções bacterianas, na doença periodontal a mera presença

da espécie potencialmente patogênica não garante que a doença ocorrerá. Na verdade, os

níveis desse microrganismo e sua virulência, sim, determinarão o risco à doença. Até

recentemente, a caracterização da microbiota subgengival associada à periodontite era

proveniente de trabalhos utilizando métodos tradicionais de cultura de microrganismos orais

para sua identificação. O cultivo de espécies em anaerobiose é um método relativamente

eficaz no isolamento dos principais microrganismos associados às doenças periodontais. Por

outro lado, esses métodos consomem tempo, requerem pessoal treinado, são de alto custo e

22

esbarram em uma série de limitações, como dificuldades no isolamento e crescimento de

espécies fastidiosas ou mesmo não-cultiváveis do biofilme subgengival (SANZ et al., 2004).

Na busca por alternativas para otimização do processo de caracterização e

quantificação da microbiota subgengival Socransky et al. (1994), descreveram a técnica do

“checkerboard DNA-DNA hybridization” para identificação de microrganismos orais no

biofilme subgengival de indivíduos com diferentes formas de periodontites ou saúde

periodontal. Essa técnica emprega o uso de sondas de DNA e permite a identificação e

quantificação de até 45 espécies de microrganismos em até 28 amostras de biofilme de uma

única vez. O grande número de amostras que pode ser processado em um curto espaço de

tempo e o relativo baixo custo deste método tem possibilitado aos pesquisadores expandir e

aperfeiçoar estudos envolvidos com a etiologia microbiana das doenças orais.

Socransky et al. (1998) investigaram a presença de 40 espécies bacterianas no biofilme

subgengival, de indivíduos com doença periodontal utilizando o checkerboard DNA-DNA

hybridization. O propósito do trabalho era verificar como essas comunidades microbianas se

organizavam dentro deste biofilme. Observou-se a formação de cinco grandes complexos

microbianos, compostos por determinadas espécies bacterianas que estavam em maior

freqüência presentes ao mesmo tempo. Foi verificado que espécies dos complexos

denominados de “vermelho” (T. forsythia, P. gingivalis e Treponema denticola) e “laranja”

(Fusobacterium spp., Capnocytophaga spp., Prevotella spp.) estavam associadas a sinais

clínicos de doença periodontal crônica, caracterizando-as como espécies patogênicas. Por

outro lado, espécies de estreptococos, actinomicetos e Veillonella parvula foram associadas a

sítios com saúde periodontal.

Na atual classificação das doenças periodontais, os critérios microbiológicos não

foram mencionados como características primárias que diferenciem a periodontite crônica da

periodontite agressiva. No entanto, uma elevada proporção de A. actinomycetemcomitans, e

em algumas populações, de P. gingivalis foi reconhecido como uma das características

secundárias que são em geral, mas não universalmente presente em paciente com periodontite

agressiva (ARMITAGE, 1999).

Enquanto alguns estudos encontraram diferenças na microbiota periodontal entre

pacientes com periodontite crônica e agressiva (DOGAN et al., 2003; SCHACHER et al.,

2007), estudos mais recentes mostram apenas pequenas diferenças no perfil microbiológico

entre indivíduos com periodontite crônica e agressiva (MOMBELLI; CASAGNI;

MADIANOS, 2002; XIMENEZ-FYVIE et al., 2006). Estes resultados microbiológicos

sugerem que o hospedeiro e fatores ambientais podem explicar as diferenças na taxa de

23

destruição tecidual observada nestas duas condições clínicas (CHAMPAGNE et al., 2003;

MENG et al., 2007).

2 PROPOSIÇÃO

O objetivo do presente estudo foi comparar os níveis de IL-1 , IL-2, IL-4, IL-8, IFN-

e a atividade elastase no FG entre indivíduos com PCG e PAgG, e relacionar seus níveis

com indivíduos de um grupo controle com gengivite apenas. Um objetivo secundário, foi

analisar o perfil microbiológico subgengival destes indivíduos.

24

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Seleção de pacientes e exame clínico

Foram selecionados para o grupo teste 20 pacientes portadores de periodontite crônica

generalizada (PCG) avançada (48.6 ± 7.5 anos, 50% homens e 25% de fumantes), 17

pacientes com periodontite agressiva generalizada (PAgG) (29.2 ± 6.6 anos, 30% homens e

nenhum fumante) classificados de acordo com a Academia Americana de Periodontia (AAP)

de 1999 (ARMITAGE, 1999). Os pacientes deveriam possuir no mínimo 20 dentes e ter pelo

menos 6 sítios com profundidade de bolsa maior ou igual a 5 mm. Nenhum dos participantes

havia recebido tratamento periodontal prévio. Foram selecionados para o grupo gengivite 10

pacientes controles com gengivite apenas (34.6 ± 6.4 anos, 80% homens e nenhum fumante).

Os pacientes foram selecionados na Faculdade de Odontologia da UERJ. Os critérios

de exclusão foram: presença de patologia sistêmica que pudesse interferir com a progressão

da doença periodontal como diabetes e AIDS; doenças auto-imunes; gravidez; lactação;

utilização de medicamentos de uso prolongado nos seis meses anteriores ao início do estudo

(antibióticos, anti-histamínicos, cortisona, hormônios, nifedipina) e outros que pudessem

interferir com o processo inflamatório ou ter efeitos adversos direto no periodonto.

As medidas clínicas foram realizadas em 6 sítios por dente (mesio-vestibular, médio-

vestibular, disto-vestibular, mesio-lingual, médio-lingual e disto-lingual) de cada dente

presente, exceto terceiros molares, com uma sonda periodontal North Caroline (UNC15 - Hu-

Friedy Co., Chicago, EUA) por dois examinadores calibrados. Os parâmetros clínicos

avaliados foram porcentagem de sangramento à sondagem (SS), profundidade de bolsa à

sondagem (PBS) e nível de inserção clínico (NIC). Houve uma concordância de 94,5% dentro

de ± 1 milímetro para medições de PBS e de NI entre os examinadores. Todos os pacientes

foram submetidos à avaliação radiográfica. Foram solicitadas radiografias periapicais

completas e panorâmica. A análise radiográfica criteriosa serviu como um dos parâmetros

para ajudar no diagnóstico periodontal, para inclusão dos pacientes nos 3 grupos clínicos.

O objetivo do estudo foi explicado por escrito e um termo de consentimento foi

assinado pelos pacientes selecionados. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de

Ética e Pesquisa da UERJ.

25

3.2 Coleta de fluido gengival

Nos grupos PCG e PAgG foram coletados 5 sítios profundos inflamados com PBS ≥ 5

mm e 5 sítios rasos inflamados com PBS ≤ 3 mm. No grupo gengivite, foram coletados 5

sítios rasos inflamados (gengivite) sendo PBS ≤ 3 mm. Sítios inflamados foram definidos

como sítios apresentando sinais clínicos de vermelhidão, inchaço e/ou sangramento à

sondagem.

As amostras foram agrupadas juntas (pool) por cada categoria de sítio em cada

paciente. Assim, o número final de amostras foi: 20 amostras para sítios rasos e 20 amostras

para sítios profundos no grupo PCG, 17 amostras para sítios rasos e 17 amostras para sítios

profundos no grupo PAgG e 10 amostra para sítios com gengivite no grupo gengivite.

Os sítios coletados foram isolados com rolos de algodão, secos com ar e a placa

supragengival foi cuidadosamente removida. Uma tira de papel absorvente padrão

(Periopaper, IDE Interstate, Amityville, NY) foi introduzida no sulco ou bolsa periodontal, até

certa resistência ser sentida e foi deixada em posição por 30 segundos. O volume do FG foi

imediatamente determinado através da utilização do medidor de FG previamente calibrado

(Periotron 8000, IDE Interstate, Amityville, NY). Para cada indivíduo, as tiras de cada

categoria de sítio foram agrupados em tubos Eppendorf contendo 0,5 ml de solução salina

tampão fosfato (PBS). Após eluição por 30 minutos em temperatura ambiente, as tiras foram

removidas e as amostras foram centrifugadas a 3000 g por 5 minutos. O sobrenadante foi

coletado e congelado a -20 ° C até análise.

3.2.1 Quantificação dos mediadores pelo método Luminex

Os níveis das citocinas foram determinados utilizando um imunoensaio com

microesferas do tipo multiplex. Cinquenta microlitros das amostras de fluido gengival foram

analisadas para IL-1 , IL-2, IL-4, IL-8 e INFγ usando um kit disponível comercialmente

(Lincoplex, Millipore, Missouri, USA) em um analisador Luminex (Luminex®, MiraiBio,

Alameda, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

Resumidamente, 96-poços com filtro foram pré-umedecidos com tampão de lavagem e

a solução foi aspirada dos poços usando uma sucção à vácuo (Millipore Corporation,

26

Billerica, MA). Micro-esferas revestidas com anticorpos monoclonais contra os 5 alvos

diferentes analisados foram adicionadas aos poços. Amostras e padrões (variando de 0,13 a

2.000 pg / ml para cada análise) foram pipetados nos poços e incubados durante a noite a 4 oC.

Os poços foram lavados e aspirados e uma mistura de anticorpos biotinilados secundários foi

adicionada. Após a incubação por 1 hora, estreptavidina conjugada com a proteína

fluorescente, R-ficoeritrina (estreptavidina-RPE) foi adicionada às microesferas e incubadas

por 30 minutos. Após a lavagem para remoção dos reagentes não aderidos, foi adicionada aos

poços com as microesferas (mínimo de 100 por análise) uma solução tampão sheath fluid

(Luminex®, MiraiBio, Alameda, CA) para serem analisadas no analisador de microesferas

(Luminex 100™, Luminex®, MiraiBio, Alameda, CA). As concentrações das amostras

desconhecidas (antígenos nas amostras de FG) foram estimadas a partir da curva padrão,

utilizando o Bio-Plex Manager Software (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Os níveis das

citocinas foram expressos como quantidade total por sítio (pg / sítio).

3.2.2 Atividade de elastase

A atividade de elastase total foi medida com um substrato específico, l-pyroglutamyl-

L-propil-L-valina-p-nitroanilina (S-2484, Haemochrom Diagnostica, Mo¨lndal, Sweden).

Cem microlitros de amostra não diluída foi misturada com 65 μl de substrato em uma placa

de microtitulação com 96 poços (Nunc Maxisorp, Numc Roskild, Denmark). A mistura foi

agitada por 5 minutos e, a absorbância a 405 nm foi lida em um espectrofotômetro (Millenia

Kinetic Analyzer, Diagnostic Product, Los Angeles, CA.). Após 2 horas de incubação a 37 °

C, a absorbância foi lida por uma segunda vez. A diferença entre as 2 horas de

acompanhamento e os dados iniciais foi considerada a atividade total de elastase e foi

expressa em absorbância (Abs).

3.3 Coleta Microbiológica

27

O perfil microbiológico subgengival para cada indivíduo foi defenido como uma

amostra representativa da boca coletada da face mesial de cada dente de dois quadrantes

selecionados aleatoriamente. As amostras foram removidas de todos os indivíduos em todos

os três grupos clínicos. Depósitos de biofilme supragengival foram removidos previamente

com gaze estéril e as amostras de biofilme subgengival coletadas com curetas Gracey estéreis.

Para cada amostra, era utilizada uma extremidade estéril da cureta.

3.3.1 Técnica de hibridização Checkerboard DNA-DNA

Cada amostra de placa subgengival foi colocada separadamente em tubos de

Eppendorf contendo 0,15 ml de TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 7,6), 0,15 ml de uma

solução 0,5 M de NaOH foi adicionado a cada tubo e congelado a -20 oC até análise. As

amostras foram então descongeladas e fervidas nos tubos em banho-maria por 5 minutos.

Após fervura, as suspensões foram neutralizadas com a adição de 0,8 ml de 5M de acetato de

amônia. Com isso, as células bacterianas foram lisadas e o DNA suspenso na solução. Na

primeira fase de montagem do “checkerboard”, o “Minislot 30” (Immunetics, Cambridge,

MA, USA) foi colocado sobre uma membrana de nylon (15 x 15 cm) com carga positiva

(Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN, USA) e o conjunto aparafusado sobre uma base de

acrílico. Cada suspensão de biofilme contendo DNA livre foi depositada nas fendas do

“Minislot” e o DNA concentrado na membrana de nylon. A membrana era removida do

aparato e o DNA fixado nela através da exposição à luz ultravioleta (Stratalinker, USA). Cada

“Minislot” permite a deposição de até 30 amostras. Em cada membrana foram depositadas 24

amostras e as duas últimas canaletas do “Minislot” foram reservadas para colocação dos

padrões, contendo uma mistura de DNA das espécies bacterianas investigadas,

correspondendo a duas concentrações: 105 e 106 células.

Após fixação do DNA nas membranas, essas foram pré-hibridizadas a 42oC por 1 hora

em uma solução de 50% formamida, 5 X SSC, 1% caseína, 5 X reagente de Denhardt, 25mM

de fosfato de sódio (pH 6,5) e 0,5 mg/ml de RNA de levedura. Em seguida, cada membrana

era colocada sob a placa acrílica do “Miniblotter 45” (Immunetics, Cambridge, MA, USA),

com a linha contendo o DNA fixado perpendicular às canaletas do “Miniblotter”.

As sondas de DNA foram confeccionadas usando o kit “random primer digoxigenin

labelling” [Boehringer Mannheim, USA]). Anteriormente ao seu uso, as sondas foram

28

testadas com uma mistura controle contendo as espécies investigadas, em uma concentração

de 104 células bacterianas e tiveram sua concentração ajustada de tal modo que as

intensidades dos sinais de todas as sondas fossem semelhantes. Cada canaleta do “Miniblotter

45” foi preenchida com 130 l de uma determinada sonda, contida em uma solução de

hibridização (45% formamida, 5 X SSC, 1 X reagente de Denhardt, 20 mM de fosfato de

sódio (pH 6.5), 0,2 mg/ml de RNA de levedura, 10% de sulfato de dextrano, 1% caseína e 20

ng/ml de DNA). As sondas foram hibridizadas perpendicularmente às linhas contendo o DNA

bacteriano, propiciando um formato de xadrez com as linhas de DNA horizontais e as sondas

verticais. O aparato contendo as membranas foi colocado dentro de um saco plástico para

evitar sua desidratação. A hibridização das membranas com as sondas ocorreram a 42oC,

durante 20 horas. As 40 cepas utilizadas para a confecção de sondas e padrões foram obtidas

da American Type Culture Collection (ATCC) e do Forsyth Institute (Boston, MA, USA).

Após hibridização com as sondas, as membranas foram removidas do “Miniblotter” e

lavadas por 5 minutos em temperatura ambiente, seguido de duas lavagens de 20 minutos

cada a 65oC em uma solução adstringente (0,1 X SSC, 0,1% SDS), a fim de remover sondas

que não hibridizaram completamente. Em seguida, as membranas foram imersas por 1 hora

em uma solução contendo 0,1M de ácido maleico, 3 M NaCl, 0,2 M NaOH, 0,3% Tween 20,

0,5% caseína, pH 8,0 e 30 minutos na mesma solução contendo o anticorpo anti-digoxigenina

conjugado à fosfatase alcalina (Boehringer Mannheim), em uma diluição de 1/25000. As

membranas foram, então, lavadas com uma solução de 0,1 M ácido maleico, 3 M NaCl, 0,2

M NaOH, 0,3% Tween 20, pH 8,0; 4 vezes por 10 minutos e uma vez por 5 minutos em 0,1

M Tris HCl, 0,1 NaCl, 50 mM MgCl2, pH 9,5. Após as lavagens, as membranas foram

incubadas em uma solução contendo uma substância fluorescente (Atto – Phos) para futura

leitura e quantificação da reação em um scanner (Imagequant/Storm 840, USA). Os sinais

fluorescentes cpturados pelo “Storm” foram convertidos a contagens (níveis x 105) por

comparação com os valores dos padrões, usando regressão linear.

29

3.4 Análise estatística

Os dados clínicos foram obtidos a partir de 6 sítios por dente para PBS, NIC e SS. Os

parâmetros clínicos médios foram determinados pela média de todos os sítios, de todos os

dentes, em cada indivíduo e depois comparados entre os indivíduos de cada grupo clínico

separadamente.

Os parâmetros clínicos médios para cada categoria de sítio foram calculados pela

média dos valores dos sítios coletados de cada indivíduo e, depois, comparados entre

indivíduos em cada categoria de sítio para cada grupo clínico separadamente.

Os níveis de cada mediador inflamatório foram medidos em amostras coletadas em

cada categoria de sítio a partir de cada indivíduo. O nível médio de cada biomarcador no FG

foi calculado pela média entre os indivíduos em cada categoria de sítio em cada grupo clínico

separadamente.

Os dados microbiológicos disponíveis foram as contagens de cada uma das 40

espécies testadas para até 14 amostras de placa subgengival por indivíduo. Os dados de cada

espécie foram expressos em contagens x 105 em cada sítio. Os dados microbiológicos foram

analisados como uma média, dentro de cada indivíduo e, depois, esta média comparada entre

indivíduos em cada grupo clínico separadamente.

A significância das diferenças entre os grupos foi calculada através do teste ANOVA

para os dados clínicos e o teste Kruskal-Wallis para dados imunológicos e microbiológicos.

Para os dados de FG e microbiológicos, o nível α foi ajustado para múltiplas comparações

usando a correção de Bonferroni para obter uma taxa final de erro tipo 1 de 5%

(SOCRANSKY et al., 1991). A diferença significativa entre os grupos para a porcentagem de

homens e percentual de fumantes foi testada pelo teste exato de Fisher. Para todos os tipos de

dados, diferenças de significância post-hoc entre pares de comparações foram determinadas

usando o procedimento da menor diferença significativa de Fisher (LSD – least significant

difference). Devido às diferenças de idade e no percentual de fumantes entre os grupos,

parâmetros clínicos médios, níveis dos biomarcadores no FG e a média dos dados

microbiológicos foram posteriormente analisados usando o teste não-paramétrico ANCOVA

ajustando para a idade e para o fumo. O procedimento LSD de Fisher foi repetido para os

valores ajustados por ANCOVA.

O nível de significância deste estudo foi considerado como 5% (p < 0,05).

30

4 RESULTADOS

4.1 – Parâmetros clínicos

As médias dos parâmetros clínicos e demográficos para os 3 grupos clínicos são

apresentados na Tabela 1. A Tabela 2 apresenta os pares de comparações post-hoc usando o

procedimento LSD de Fisher. Os valores médios para todos os parâmetros clínicos, PBS,

NIC, SS e volume de FG foram significativamente mais elevados em ambos os grupos de

periodontite em comparação ao grupo de gengivite. Houve diferença, também

estatisticamente significativa nas médias das idades e no percentual de fumantes entre os 3

grupos clínicos. Após o ajuste para a idade e para o fumo usando ANCOVA, todas as

diferenças permaneceram estatisticamente significativas (dados não mostrados).

Tabela1 – Valores médios (± DP) para parâmetros clínicos e demográficos nos indivíduos dos grupos gengivite (G), periodontite crônica generalizada (PCG) e periodontite agressiva generalizada (PAgG).

Tabela 2 – Pares de comparação post-hoc usando o procedimento da menor diferença significante de Fischer (LSD)

31

A Tabela 3 apresenta os valores médios (± DP) para PBS (mm), NIC (mm), SS

(porcentagem) e volume FG (μl) para cada categoria de sítio, enquanto a Tabela 4 mostra a

análise post-hoc correspondente. Os sítios profundos dos indivíduos com periodontite

apresentaram valores estatisticamente superiores para todos os parâmetros clínicos, quando

comparados aos sítios com gengivite dos indivíduos com gengivite. Os sítios rasos do grupo

com periodontite tiveram uma maior porcentagem de SS e volume de FG comparado aos

sítios com gengivite. Para o grupo PAgG, sítios rasos também apresentaram maiores valores

de PBS comparados aos sítios com gengivite. Quando os grupos PCG e PAgG foram

comparados, a única diferença estatística significante encontrada foi no volume de FG dos

sítios profundos. Esta diferença tornou-se sem significância depois do ajuste para a idade e

para o fumo.

Tabela 4 - Pares de comparação post-hoc usando o procedimento da menor diferença significante de Fischer (LSD)

Tabela 3 – Valores médios (± DP) para: profundidade de bolsa à sondagem (PBS), nível de inserção clínico (NIC), porcentagem de sítios com sangramento à sondagem (SS) e volume de fluido gengival (FG) para os sítios coletados, nas diferentes categorias de sítios. Os dados foram comparados usando ANOVA e ANCOVA, ajustando para diferenças na idade e para o fumo entre os grupos.

32

4.2 Achados imunológicos

Os biomarcadores IL-1, IL-8 e a atividade da elastase foram ser detectados em todas

as amostras testadas, a IL-4 foi detectada em 88% das amostras de FG, enquanto a IL-2 e

IFN-γ foram encontrados em apenas 57% das amostras. Os valores de mediana (intervalo

interquartil) para a quantidade total de IL-1β, IL-2, IL-4, IL-8 e INF-γ (pg / sítio), atividade

da elastase (Abs) e as comparações entre as categorias de sítio para os níveis dos

biomarcadores no FG são apresentados na Tabela 5.

A Tabela 6 apresenta os pares de comparação post-hoc correspondentes usando o

procedimento LSD de Fisher. Sítios rasos no grupo PAgG tinham atividade de elastase

estatisticamente superiores no FG em comparação aos sítios com gengivite do grupo

gengivite. Inversamente, os níveis de IL-4 no FG foram significativamente maiores em sítios

rasos dos indivíduos com gengivite em relação aos sítios rasos dos grupos PCG e PAgG

depois dos ajustes para ANCOVA. Sítios profundos de ambos os grupos com periodontite

tinham níveis significativamente maiores de atividade de elastase, IL-1β e IL-2 comparados

aos sítios com gengivite do grupo gengivite.

Quando sítios rasos e profundos foram comparados dentro de cada grupo com

periodontite, os sítios profundos apresentaram níveis estatisticamente superiores no FG de IL-

1, IL-2 e atividade de elastase, em comparação aos sítios rasos do grupo PAgG e para

elastase e IL-1β no grupo PCG. Quando os valores para os sítios rasos e profundos foram

comparados entre os indivíduos dos grupos PCG e PAgG, o grupo PAgG tinha níveis

significativamente maiores de IL- 1 nos sítios profundos. No entanto, quando os dois grupos

foram comparados usando ANCOVA ajustado para idade e fumo, as médias ajustadas não

apresentaram diferença estatisticamente significante.

33

4.3 Achados Microbiológicos

Os dados microbiológicos apresentados na Figura 1 mostram níveis significativamente

elevados das espécies do complexo vermelho (Tannerella forsythia, Porphyromonas

gingivalis e Treponema denticola), nos grupos PCG e PAgG quando comparados ao grupo

com gengivite. Os níveis de Eubacterium nodatum e Eubacterium saburreum também foram

estatisticamente superiores em indivíduos com periodontite em relação a este grupo. Com

exceção de E. nodatum, essas diferenças continuaram estatisticamente significantes após o

ajuste para idade e fumo usando ANCOVA (dados não mostrados). Quando o grupo PCG foi

Tabela 5 – Valores de mediana (intervalo interquartil) de atividade de elastase (Abs) e os níveis dos 5 biomarcadores (pg/sítio) para amostras agrupadas das diferentes categorias de sítio. Os dados foram comparados usando teste Kuskal-Wallis e o teste não-paramétrico ANCOVA, ajustando para diferenças de idade e para o tabagismo entre os grupos.

Tabela 6 - Pares de comparação post-hoc usando o procedimento da menor diferença significante de Fischer (LSD)

34

comparado com o grupo PAgG, não houve diferença estatisticamente significativa para os

níveis de qualquer espécie. Três amostras de indivíduos com PAgG não puderam ser

analisadas por terem sido comprometidas durante o envio para o Instituto Forsyth em Boston.

5 DISCUSSÃO

Figura 1 - Contagens médias (x 105) das 40 espécies testadas de até 14 amostras de biofilme subgengival de 10 pacientes com gengivite, 20 com periodontite crônica generalizada (PCG) e 14 com periodontite agressiva generalizada (PAgG). Contagens médias de cada espécie foram calculados pela média dos dados de cada indivíduo, e em seguida, foi realizado uma média entre indivíduos em cada grupo clínico separadamente. Significância das diferenças de cada espécie entre os grupos clínicos foram realizados pelo teste de Kruskal-Wallis e ajustado para 40 comparações (SOCRANSKY et al., 1991): * p <0,05, ** p <0,01 e *** p <0,001. As espécies foram ordenados e agrupados de acordo com os complexos descritos por Socransky et al. 1998 (SOCRANSKY et al., 1998)

35

Neste estudo transversal, não foi possível demonstrar diferenças estatisticamente

significativas entre indivíduos com PAgG e indivíduos com PCG nos níveis no FG de cinco

biomarcadores: IL-1β, IL-2, IL-4, IL-8, IFN-γ e na atividade de elastase. Quando os perfis

microbiológicos dos grupos PAgG e PCG foram comparados, não houve diferença estatística

para nenhuma das espécies testadas, sugerindo que ambas as infecções estavam associadas

com uma microbiota subgengival semelhante. Os dados indicam que estas doenças

periodontais clinicamente distintas podem apresentar mecanismos patogênicos semelhantes

em sua progressão.

Vários estudos relataram níveis mais elevados de IL-1β no FG em sítios com

periodontite em relação a sítios saudáveis com gengivite (LEE et al., 1995; TSAI; HO;

CHEN, 1995; FIGUEREDO, RIBEIRO et al., 1999; TELES et al., 2009). Nossos resultados

comparando os níveis de IL-1β no FG em sítios rasos e profundos em ambos os grupos com

periodontite confirmam a associação bem estabelecida entre a IL-1β e os parâmetros clínicos

de doença periodontal. Clinicamente, pacientes com periodontite agressiva parecem ter uma

rápida destruição periodontal com uma elevada taxa de perda óssea comparado a indivíduos

com periodontite crônica. Uma possível explicação para esta taxa mais rápida de progressão

da doença pode ser a produção excessiva de mediadores pró-inflamatórios como a IL-1β por

esses pacientes. No entanto, poucos relatos compararam os níveis deste biomarcador no FG de

indivíduos com diferentes formas de periodontites (GIANNOPOULOU; KAMMA;

MOMBELLI, 2003; SUZUKI et al., 2008). Giannopoulou et al. (2003) relataram maiores

níveis de IL-1β no FG em indivíduos com periodontite agressiva, quando comparado com

indivíduos com periodontite crônica. Inversamente, Suzuki et al. (2008) não encontraram

diferenças estatisticamente significativas nos níveis de IL-1β no FG entre indivíduos com

periodontite crônica e agressiva. Embora a análise inicial deste trabalho sugira que os

indivíduos com PAgG tivessem níveis mais elevados de IL-1β no FG em ambos os sítios

rasos e profundos em comparação com indivíduos do grupo PCG, análises adicionais levando

em consideração as diferenças de idade e fumo entre os dois grupos revelaram que a diferença

nas médias ajustadas para a idade e para o fumo não foram estatisticamente significantes.

Alguns trabalhos demonstram que a quantidade total de IL-8 estava significativamente

aumentada no FG de sítios doentes de pacientes com periodontite crônica, quando

comparadas com sítios saudáveis ou com gengivite de pacientes controles (TSAI; HO; CHEN,

1995; MATHUR et al., 1996; GAMONAL et al., 2000; GIANNOPOULOU; KAMMA;

36

MOMBELLI, 2003). No entanto, os nossos achados não demonstraram esta relação, os níveis

de IL-8 apresentaram pouca variação entre os grupos e as categorias de sítios. No trabalho de

Jin et al (2000) os níveis totais de IL-8 também não apresentaram diferença significativas

entre as categorias de sítio no grupo periodontite.

Atividade da elastase foi maior em sítios rasos de pacientes com PAgG, quando

comparados aos sítios rasos dos indivíduos com gengivite. Houve também diferenças

estatisticamente significativas entre os sítios rasos e profundos em ambos os grupos de

periodontite, sugerindo um aumento na atividade de elastase associados com a severidade da

doença. Estudos anteriores do nosso grupo também mostraram níveis mais elevados de

elastase livre em pacientes com periodontite sem tratamento, quando comparados a indivíduos

controles com gengivite (FIGUEREDO; FISCHER; GUSTAFSSON, 2005). Foi visto que

neutrófilos periféricos de pacientes com periodontite crônica e agressiva encontraravam-se

hiper-responsivos após estimulação in vitro quando comparados a controles saudáveis

(FREDRIKSSON et al., 2003). Estes níveis aumentados de atividade elastase poderiam ser

explicados pelas diferenças na ativação local de neutrófilos por outros mediadores

inflamatórios, diferenças na quantidade e qualidade do biofilme adjacente ou a uma hiper-

reatividade dos neutrófilos, por si só.

Também encontramos níveis significativamente maiores de IL-2 em sítios profundos

quando comparados a sítios rasos dos indivíduos do grupo PAgG. Estes resultados estão de

acordo com estudos anteriores que mostraram níveis elevados deste mediador no FG em sítios

periodontais ativos e na "dentição terminal” de pacientes com periodontite (LEE et al., 1995;

SALVI et al., 1998). No entanto, uma limitação do presente estudo foi a baixa freqüência de

detecção deste mediador pró-inflamatório nas amostras de FG (57%), especialmente em sítios

rasos. Quantidades significativamentes maiores de IL-4 em sítios rasos de indivíduos do

grupo gengivite em comparação com os sítios rasos de ambos os grupos com periodontite

estão de acordo com dados relatados por outros autores em estudos anteriores (TSAI et al.,

2007; BASTOS et al., 2009). Giannopoulou et al.(2003) relataram uma relação inversa entre

níveis de IL-4 no FG e a condição periodontal; níveis de IL-4 estavam mais elevados no

grupo periodontalmente saudável, quando comparado ao grupo com periodontite. Salvi et al.

(1998) mostraram que baixos níveis de IL-4 no FG estavam associados com uma maior

deterioração periodontal em indivíduos com periodontite agressiva avançada. Estes dados

estão de acordo com o papel bem estabelecido de IL-4 como um potente regulador da função

dos macrófagos e inibidor da secreção de algumas citocinas pró-inflamatórias (TE VELDE et

al., 1990). Além disso, a IL-4 tem mostrado induzir a produção e secreção de colágeno

37

(AOUDJEHANE et al., 2008). Portanto, elevados níveis de IL-4 no FG em indivíduos com

gengivite podem indicar um papel protetor desta citocinas anti- inflamatória, enquanto os

baixos níveis de IL-4 em tecidos periodontais doentes podem favorecer a progressão da

doença e comprometer o processo de cicatrização.

Ainda é controverso se indivíduos com PCG e indivíduos com PAgG apresentam

diferentes perfis microbianos subgengivais. Alguns estudos sugerem diferenças significativas

entre estes groups (DOGAN et al., 2003; DARBY et al., 2005), enquanto outros têm relatado

diferenças apenas discretas no perfil microbiano (LEE, J. W. et al., 2003; XIMENEZ-FYVIE

et al., 2006). Em um estudo recente analisando a composição do biofilme subgengival de

amostras coletadas da placa de indivíduos brasileiros com PAgG e periodontite crônica,

também usando a técnica de hibridização do checkerboard DNA-DNA, Faveri et al. (2009)

encontraram apenas pequenas diferenças entre as microbiotas das duas condições clínicas.

Nossos resultados indicaram que a microbiota subgengival de ambos os indivíduos com PCG

e PAgG foi caracterizada por níveis elevados de todas as espécies do complexo vermelho, em

comparação aos indivíduos do grupo gengivite. Indivíduos com PAgG também apresentaram

níveis significativamente maiores de F. nucleatum sp. nucleatum, enquanto os indivíduos com

PCG apresentaram níveis significativamente maiores de E. nodatum e E. saburreum, quando

comparados com indivíduos controles com gengivite. Entretanto, nenhuma diferença

microbiológica significativa foi encontrada entre os grupos PCG e PAgG para qualquer uma

das espécies analisadas. Portanto, nossos resultados suportam a noção de que a microbiota das

duas formas de periodontite são bastante semelhantes.

A grande força deste estudo está no fato de que, até onde sabemos , esta é a primeira

vez que os dados microbiológicos e imunológicos de pacientes com PCG e PAgG são

examinados concomitantemente. Isto é bastante relevante, pois em um estudo anterior, foi

demonstrado uma maior expressão de mediadores pró-inflamatórios no FG de indivíduos com

periodontite agressiva em comparação a indivíduos com periodontite crônica, sugerindo que

estes resultados seriam indicativos de um fenótipo "hiper-inflamatório” pelos indivíduos com

periodontite agressiva (BUCHMANN et al., 2002). No entanto, este estudo não levou em

conta eventuais diferenças na composição da microbiota entre os grupos clínicos que

poderiam explicar essa elevação local nos biomarcadores inflamatórios. Neste trabalho, não

foram encontradas diferenças significativas nos níveis dos biomarcadores no FG e na

microbiota associada entre os grupos PCG e PAgG. Estes dados sugerem que quando

expostos a um desafio microbiano semelhante, indivíduos com PCG e PAgG expressam

níveis semelhantes de mediadores inflamatórios locais.

38

Os dados do presente estudo devem ser interpretados com cautela, uma vez que

envolveu uma amostra relativamente pequena e houve diferença estatisticamente significante

na idade e no fumo entre os 3 grupos clínicos, que tentamos compensar usando o teste

ANCOVA. A distinção clínica entre o PCG e PAgG também foi difícil em algumas situações.

Nós usamos as diretrizes estabelecidas pelo AAP (ARMITAGE, 1999), no entanto, já que não

há meios práticos de definir a taxa de perda de inserção, a idade foi utilizada como parâmetro

para ajudar no diagnóstico da periodontite agressiva. O desenho transversal do estudo também

dificulta a interpretação dos dados, visto que as diferenças imunológicas e microbiológicas

entre estas duas infecções periodontais podem ser de natureza temporal. Além disso, também

é possível que as diferenças nos mecanismos patológicos entre as duas condições periodontais

envolvendo mediadores imunológicos e espécies subgengivais não tenham sido medidas no

presente estudo.

6 CONCLUSÕES

39

Os resultados deste estudo confirmam a associação previamente estabelecida entre

níveis de biomarcadores pró-inflamatórios no FG como IL-1β, elastase e IL-2, com sinais

clínicos de doença periodontal. Além disso, nossos achados de baixos níveis de IL-4 em sítios

periodontalmente doentes sugerem que um desequilíbrio entre citocinas pró e anti-

inflamatórias pode estar associado com a progressão da doença periodontal. Nossos dados

também sugerem que os indivíduos dos grupos PAgG e PCG estudados foram expostos a um

desafio microbiano subgengival semelhante e expressaram um perfil semelhante de citocinas

e atividade elastase no FG. Estes resultados indicam que as duas formas clinicamente distintas

de periodontite podem ser originadas através de mecanismos patogênicos comuns.

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46

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ANEXO A

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APÊNDICE A

Immunological and microbiological profiles of chronic and aggressive periodontitis subjects

B Rescala* , W Rosalem*, R P Teles‡, RG Fischer*, AD Haffajee‡, SS

Socransky‡ A Gustafsson† and CM Figueredo*†

*Department of Periodontology, Rio de Janeiro State University - UERJ, Rio de Janeiro,

Brazil

†Division of Periodontology, Institute of Odontology, Karolinska Institute, Sweden

‡Department of Periodontology, The Forsyth Institute, Boston, MA, USA

Word count: 3624

Number of figures: 1

Number of tables: 6

Key findings: Generalized aggressive periodontitis and generalized chronic periodontitis

present similar profiles of GCF inflammatory biomarkers and a similar subgingival

microbiota.

Running title: Micro and imuno profiles of chronic and aggressive periodontitis.

Correspondance to:

Carlos Marcelo da Silva Figueredo, PhD

Faculdade de Odontologia – Secretaria de Pós-graduação e Pesquisa

Av. 28 de setembro, 157, Vila Isabel, Rio de Janeiro, RJ, Brasil, ZIP code: 20551-030

Telephone number: 55 21 2587 6457

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E-mail: cmfigueredo@hotmail.com