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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS

KARINE MARIA MARTINS BEZERRA CARVALHO

A RESINA DE Protium heptaphyllum E SEU PRINCIPAL CONSTITUINTE, A

MISTURA DE TRITERPENOS ALFA E BETA-AMIRINA, PREVINE M A

OBESIDADE INDUZIDA POR DIETA EM CAMUNDONGOS:

EVIDÊNCIAS E POTENCIAIS MECANISMOS

FORTALEZA

2015

KARINE MARIA MARTINS BEZERRA CARVALHO

A RESINA DE Protium heptaphyllum E SEU PRINCIPAL CONSTITUINTE, A

MISTURA DE TRITERPENOS ALFA E BETA-AMIRINA, PREVINEM A OBESIDADE

INDUZIDA POR DIETA EM CAMUNDONGOS:

EVIDÊNCIAS E POTENCIAIS MECANISMOS

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Medicida da UFC, como requisito para a obtenção do título de Doutor em Ciências Médicas.

Orientadora: Profa. Dra. Flávia Almeida Santos

FORTALEZA

2015

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará Biblioteca de Ciências da Saúde

C321r Carvalho, Karine Maria Martins Bezerra.

A resina de protium heptaphyllum e seu principal constituinte, a mistura de triterpenos alfa e beta-amirina, previnem a obesidade induzida por dieta em camundongos : evidências e potenciais mecanismos / Karine Maria Martins Bezerra Carvalho. – 2015.

120 f. : il. color. Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,

Departamento de Medicina Clínica, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, Doutorado em Ciências Médicas, Fortaleza, 2015.

Área de Concentração: Ciências Biomédicas. Orientação: Profa. Dra. Flávia Almeida Santos. 1. Triterpenos. 2. Obesidade. 3. Dieta. I. Título.

CDD 615.32

KARINE MARIA MARTINS BEZERRA CARVALHO

A RESINA DE Protium heptaphyllum E SEU PRINCIPAL CONSTITUINTE, A

MISTURA DE TRITERPENOS ALFA E BETA-AMIRINA, PREVINEM A OBESIDADE

INDUZIDA POR DIETA EM CAMUNDONGOS:

EVIDÊNCIAS E POTENCIAIS MECANISMOS

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Medicida da UFC, como requisito para a obtenção do título de Doutor em Ciências Médicas.

Orientadora: Profa. Dra. Flávia Almeida Santos

BANCA EXAMINADORA

___________________________________________________ Profa. Dra. Flávia Almeida Santos (Orientadora)

Universidade Federal do Ceará

___________________________________________________ Prof. Dra. Nylane Maria Nunes de Alencar

Universidade Federal do Ceará

___________________________________________________ Profa. Dra. Soraia Pinheiro Machado

Universidade Estadual do Ceará

___________________________________________________ Profa. Dra. Cinthya Iamille Frithz Brandao de Oliveira

Universidade Federal do Amazonas

___________________________________________________ Prof. Dr. Francisco Artur Silva Filho

Universidade Estadual do Pauí

À minha mãe, Lúcia Maria Martins Bezerra Carvalho, minha maior incentivadora e companheira em todos os momentos.

Ao meu pai, Antônio Gomes Carvalho, meu maior exemplo de

caráter e humildade.

AGRADECIMENTOS

À Profa. Dra. Flávia Almeida Santos, pela oportunidade, orientação, amizade e confiança.

Ao Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao, pela importante contribuição neste trabalho.

À Profa. Geanne Matos pela amizade, paciência e enorme disposição em ajudar nas

inúmeras vezes em que precisei.

Aos professores que gentilmente aceitaram participar da banca examinadora, contribuindo

com seu valioso tempo e conhecimento.

Aos meus familiares e amigos pelo incentivo e força para atingir essa conquista.

À querida amiga Talita Morais, pela paciência, amizade, companheirismo e indispensável

ajuda no desenvolvimento desta pesquisa.

Aos estimados amigos Tiago Melo e Patrícia Rodrigues pelo apoio, incentivo e colaboração

nos experimentos de obesidade.

Às secretárias do PPGCM, Ivone Mary Fontenele e Rita de Cássia Almeida, pela simpatia,

amizade, disponibilidade e contribuição indispensável.

Aos bolsistas de iniciação científica do LPN, Paulo Iury, Ana Virgínia, Bruno e Ítalo, pelo

apoio e contribuição nos experimentos.

À técnica de laboratório do LPN, Aguinéa, pela organização do laboratório, contribuição nos

experimentos, além da amizade, carinho e disposição em me ajudar durante todos esses

anos.

Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, pelo apoio indispensável.

Aos colegas do Hospital de Messejana, pelo companheirismo e paciência nas inúmeras

vezes que tive que conciliar trabalho e estudo.

Aos meus alunos da FCRS, que semanalmente, me fazem sentir capaz.

Ao CAPES, pelo apoio financeiro, de extrema importância para realização deste trabalho.

Enfim, agradeço a todos que de forma direta ou indireta colaboraram no desenvolvimento

desta pesquisa e para esta realização pessoal.

RESUMO

A obesidade, que se caracterizada pelo acúmulo excessivo de gordura corporal decorrente

principalmente do aumento do consumo de alimentos calóricos e do sedentarismo, está

associada a várias condições patológicas como doenças cardiovasculares, diabetes,

desordens musculoesqueléticas e câncer. As opções farmacológicas para o tratamento da

obesidade são limitadas e apresentam diversos efeitos colaterais. No Brasil apenas dois

fármacos estão disponíveis, sibutramina e orlistate. Na busca de novas opções terapêuticas

para o tratamento da obesidade, as plantas medicinais têm sido uma importante fonte de

pesquisa, em especial os compostos terpênicos, conhecidos reguladores da glicemia e do

metabolismo lipídico. O presente estudo investigou o efeito antiobesidade da resina do

Protium heptaphyllum (RPH) e de seu principal constituinte, a mistura de triterpenos alfa e

beta-amirina (AMI), na obesidade induzida por dieta hipercalórica em camundongos e seus

possíveis mecanismos de ação. Foram utilizados camundongos Swiss, albinos, machos,

pesando entre 20-25g, que após uma semana de livre acesso a ração padrão (Purina®,

Brasil) foram divididos em 7 grupos de 10 animais e tratados com dieta padrão (DP), dieta

hipercalórica (DH), DH+RPH 10mg/kg, DH+RPH 20mg/kg, DH+AMI 10mg/kg, DH+AMI 20

mg/kg ou DH+sibutramina 10mg/kg (SIB) por 15 semanas. RPH e AMI foram inicialmente

diluídas em 2% Tween 80 em água. O grupo DH recebeu o mesmo veículo. SIB foi diluída

em água. Veículo, RPH, AMI e SIB foram trocados duas vezes na semana. A avaliação dos

parâmetros de obesidade foi constituída das medidas do peso corporal, do tecido adiposo

abdominal e do fígado, bem como da determinação de glicose, amilase, lipase, ALT, AST,

colesterol total, triglicérides, insulina, grelina, leptina, TNF-α, MCP-1, IL-6 e resistina

plasmáticos, colesterol e triglicerídeos hepáticos e avaliação histológica da gordura

abdominal e do fígado. Foi ainda avaliado a expressão gênica de PPARy e de lipoproteína

lipase (LPL) no tecido adiposo abdominal e o efeito de RPH na adipogênese in vitro. Os

animais que receberam apenas a dieta hipercalórica (DH), ao final da 15ª. semana,

apresentaram aumento significativo do peso corporal, da gordura abdominal e do fígado e

dos níveis plasmáticos de glicose, amilase, lipase, ALT, AST, colesterol total e triglicerídeos

em relação ao grupo que recebeu apenas a dieta padrão (DP). Os animais tratados com

RPH 10 e 20mg/kg, AMI 10 e 20mg/kg e SIB 10mg/kg demonstraram redução significativa

do peso corporal, da gordura abdominal e do fígado e dos níveis plasmáticos de glicose,

amilase, lipase, ALT, AST, colesterol total e triglicerídeos em relação ao grupo DH. Apenas

RPH 10mg/kg não alterou significativamente os níveis plasmáticos de lipase comparado ao

grupo DH. A DH aumentou significativamente o colesterol total e os triglicerídeos hepáticos

em relação a DH e esta elevação foi significativamente reduzida pela RPH, AMI e SIB. O

consumo de ração foi significativamente maior nos animais que receberam a DH em

comparação aos animais da DP, e este consumo foi significativamente reduzido pela RPH,

AMI e SIB. Não houve diferença significativa entre os grupos quanto ao consumo de água.

Além disso, o tratamento com RPH 10 e 20mg/kg, AB 10 e 20mg/kg e SIB 10mg/kg reduziu

os níveis plasmáticos de insulina e leptina em relação aos animais que receberam apenas a

DH. Os níveis plasmáticos de grelina apresentaram-se reduzidos significativamente na DH

quando comparados a DP, enquanto a RPH elevou significativamente os níveis de grelina

em relação a DH, estes foram reduzidos por AMI e SIB. Apenas RPH 20mg/kg e AMI 20

mg/kg reduziram significativamente os níveis plasmáticos de resistina em relação a DH. A

DH elevou significativamente os níveis plasmáticos de TNF-α, IL-6 e MCP-1 em relação a

DP. RPH, AMI e SIB reduziram significativamente os níveis de IL-6 e MCP-1, enquanto para

o TNF-α esta redução foi observada em RPH 20mg/kg e AMI 10 e 20 mg/kg. Houve

elevação significativa da expressão de mRNA de PPAR� e LPL no tecido adiposo do grupo

DH em relação a DP. RPH e AMI promoveram significativa redução da expressão de PPAR�

e LPL, o mesmo não sendo observado com a SIB. A área dos adipócitos foi

significativamente maior nos animais da DH comparado aos animais da DP e esta foi

reduzida por RPH, AMI e SIB. Enquanto a DH promoveu um processo inflamatório hepático

com sinais de necrose e esteatose, este foi prevenido pela RPH 20mg/kg, AMI 20mg/kg e

SIB. RPH 12,5; 25 e 50 µg/mL reduziu significativamente a adipogênese in vitro, observada

pela redução do acúmulo de lipídeos nas células 3T3-L1 e pela regulação negativa da

expressão proteica de PPARγ, C/EBPα e C/EBP-β. Estes achados sugerem RPH e AMI

possuem um potencial antiobesidade preventivo pelos seus efeitos moduladores sobre o

metabolismo de carboidratos e lipídeos, sobre a regulação de hormônios reguladores da

fome e da saciedade, sobre adipocinas e citocinas, além da regulação da adipogênese.

Palavras-chaves: Protium heptaphyllum, amirinas, triterpenos, obesidade, dieta hipercalórica.

ABSTRACT

Obesity which is characterized by excessive accumulation of body fat mainly due to the increased consumption of high-calorie foods and sedentary lifestyle is associated with various pathological conditions such as cardiovascular disease, diabetes, musculoskeletal disorders and cancer. Pharmacologic options for the treatment of obesity are limited and have many side effects. In Brazil only two drugs are available, sibutramine and orlistat. In the search for new therapeutic options for the treatment of obesity, medicinal plants have been an important source of research, particularly the terpene compounds, known regulators of blood glucose and lipid metabolism. This study investigated the antiobesity effect of Protium heptaphyllum resin (RPH) and its main constituent, the mixture of triterpenes alpha and beta-amyrin (AMY), in obesity induced by high calorie diet in mice and its possible mechanisms of action. Swiss albino male mice were used, weighing between 20-25g, which after a week of free access to standard chow (Purina®, Brazil) were divided into 7 groups of 10 animals each and treated with standard diet (SD), high-fat diet (HFD), HFD+RPH 10mg/kg, HFD+RPH 20mg/kg, HFD+AMY 10mg/kg, HFD+AMY 20 mg/kg or HFD+sibutramine 10mg/kg (SIB) for 15 weeks. RPH and AMY were initially diluted in 2% Tween 80 in water. The HFD group received the same vehicle. SIB was diluted with water. Vehicle, RPH, AMY and SIB were replaced twice a week. The evaluation of obesity parameters consisted of measurements of body weight, abdominal adipose tissue and liver, as well as determination of glucose, amylase, lipase, ALT, AST, total cholesterol, triglycerides, insulin, ghrelin, leptin, TNF-α, MCP-1, IL-6 and plasma resistin, triglycerides and cholesterol, and histological evaluation of liver and abdominal fat. It was also evaluated the gene expression of PPARy and lipoprotein lipase (LPL) in abdominal adipose tissue and the effect of PHR on adipogenesis in vitro. The animals that received only the high-fat diet (HFD), at the end of the 15th week, showed significant increase in body weight, liver and abdominal fat and plasma levels of glucose, amylase, lipase, ALT, AST, total cholesterol and triglycerides when compared to group that received the standard diet (SD). The animals treated with RPH 10 and 20mg/kg, AMY 10 and 20mg/kg and SIB 10 mg/kg showed a significant reduction of body weight, liver and visceral fat and plasma levels of glucose, amylase, lipase, ALT, AST, total cholesterol and triglycerides in relation to the HFD group. Only RPH 10 mg/kg did not significantly alter plasma levels of lipase compared to the HFD group. HFD increased significantly total cholesterol and hepatic triglycerides in comparison to HFD and this increase was significantly reduced by RPH, AMY and SIB. Feed intake was significantly higher in animals that received HFD compared to animals of SD, and this consumption was significantly reduced by RPH, AMY and SIB. There was no significant difference between the groups regarding water consumption. In addition, treatment with RPH 10 and 20 mg/kg, AMY 10 and 20 mg/kg and SIB 10 mg/kg reduced plasma leptin and insulin levels compared to animals that received only HFD. Plasma levels of ghrelin appeared in the HFD significantly reduced when compared to SD, while RPH increased significantly ghrelin levels in relation to HFD, these were reduced by AMY and SIB. Only RPH 20 mg/kg and AMY 20 mg/kg reduced significantly plasma resistin levels in relation to HFD. HFD significantly elevated plasma levels of TNF-α, IL-6 and MCP-1 compared to the SD. RPH, AMY and SIB significantly reduced IL-6 and MCP-1 levels, while for TNF-α it was observed a reduction with RPH 20mg/kg and AMY 10 and 20mg/kg. There was a significant increase of PPAR� mRNA and LPL expression in adipose tissue of the HFD group compared to SD. RPH and AMY caused significant reduction of PPAR� and LPL expression, but the same was not observed with SIB. The adipocytes area was significantly bigger in HFD animals compared to SD animals and it was reduced by RPH, AMY and SIB. While HFD promoted a liver inflammation with necrosis and steatosis signs, this was prevented by RPH 20 mg/kg, AMY 20 mg/kg and SIB. RPH 12.5; 25 and 50 µg/mL significantly reduced adipogenesis in vitro, observed by the reduction of the accumulation of lipids in 3T3-L1 cells and by down-regulation of protein expression of PPAR�, C/EBPα and C/EBP-β. These findings suggest RPH and AMY have a preventive anti-obesity potential for their modulatory effects on carbohydrates and lipids metabolism, on

the regulation of hormones regulating hunger and satiety on adipokines and cytokines in addition to the regulation of adipogenesis. Keywords: Protium heptaphyllum, amyrin, triterpenes, obesity, high-fat diet.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Fotografia da espécie Protium heptaphyllum March, folhas,

frutos e sementes.

51

Figura 2 Estrutura química dos constituintes triterpênicos da resina

de P. heptaphyllum.

52

Figura 3 Efeito da resina de P. heptaphyllum (RPH) e de alfa e beta-

amirina (AMI) sobres os níveis plasmáticos de grelina (A),

leptina (B) e resistina (C) na obesidade induzida por dieta

hipercalórica em camundongos. DN (dieta padrão), DH

(dieta hipercalórica), SIB (sibutramina).

69

Figura 4 Efeito da resina de P. heptaphyllum (RPH) e de alfa e beta-

amirina (AMI) sobres os níveis plasmáticos de TNF-α (A),

IL-6 (B) e MCP-1 (C) na obesidade induzida por dieta

hipercalórica em camundongos. DN (dieta padrão), DH

(dieta hipercalórica), SIB (sibutramina).

71

Figura 5 Efeito da RPH e AMI sobre a expressão relativa de PPARγ

(A) e LPL (B) em tecido adiposo.

72

Figura 6 Microfotografia representativa do fígado de animais

submetidos a dieta padrão (A), dieta hipercalórica (B), RPH

20mg/kg (C), AMI 20mg/kg (D) e SIB 10mg/kg (E).

74

Figura 7 Microfotografia representativa do tedido adiposo de animais

submetidos a dieta padrão (A), dieta hipercalórica (B), RPH

20mg/kg (C), AMI 20mg/kg (D) e SIB 10mg/kg. Efeito da

RPH, AMI e SIB sobre a área dos adipócitos.

75

Figura 8 Efeito da RPH sobre o acúmulo de lipídeos em células 3T3-

L1.

77

Figura 9 Efeito da RPH sobre a expressão proteica de PPARγ,

C/EBPα e C/EBPβ em células 3T3-L1

79

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Classificação de peso pelo IMC. 14

Tabela 2 Combinação das medidas de circunferência abdominal e IMC para

avaliar obesidade e risco para diabetes 2 e doença cardiovascular.

14

Tabela 3

Sequência oligonucleotídica dos iniciadores utilizados nos ensaios

de qRT-PCR.

51

Tabela 4 Efeito da resina do Protium heptaphyllum (RPH) e da mistura de

alfa e beta amirina (AMI) no peso corporal, peso da gordura

abdominal, consumo de ração, consumo de água e peso do fígado

na obesidade induzida por dieta hipercalórica em camundongos.

57

Tabela 5 Efeito da resina do Protium heptaphyllum (RPH) e da mistura de

alfa e beta amirina (AMI) sobre parâmetros plasmáticos e

hepáticos na obesidade induzida por dieta hipercalórica em

camundongos.

59

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AgRP Peptídeo relacionado ao gene agouti

AMI Mistura de alfa e beta-amirina

AMPK Proteína quinase ativada por AMP

AP Área postrema

Apo Apolipoproteína

ARC Núcleo arqueado

ATLG Lipase de triacilglicerol do adipócito

BDNF Fator neurotrófico derivado do cérebro

CART Transcrito regulado pela cocaína e anfetamina

CB1 Receptores canabinóides 1

CB2 Receptores canabinóides 2

CCK Colecistocinina

C/EBPα Proteinas estimuladoras de ligação a CCAATα

C/EBPβ Proteinas estimuladoras de ligação a CCAATβ

C/EBPδ Proteinas estimuladoras de ligação a CCAATδ

CPT Carnitina Palmitoiltransferase

DEXA Densitometria com emissão de raio- x de dupla energia

DM Diabetes Mellitus

DMN Núcleo dorsomedial

DPP-IV Dipeptidil dipeptidase IV

ENPP1 Ectonucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterase 1

FATP Proteína transportadora de ácidos graxos

FIAF Fator adipocitário induzido pelo jejum

FFA Ácidos graxos livres

GABA Ácido y-aminobutírico

GAD2 Glutamato descarboxilase 2

GHSR Receptor do secretagogo do hormônio do crescimento

GIP Peptídeo Inibitório Gástrico

GLP-1 Peptídeo semelhante ao glucagon 1

GLP-1R Receptor de GLP-1

HDL-C HDL-Colesterol

IL Interleucina

IMC Índice de massa corporal

IkBα Inibidor kappa B α

IRS Substrato do receptor da insulina

LDL Lipoproteína de Baixa Densidade

LEP Leptina

LEPR Receptor de leptina

LH Hipotálamo lateral

LPL Lipoproteína lipase

MCP Proteína quimiotática de monócitos

MC4R Receptor 4 da melanocortina

NCEP ATP III National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III guidelines

NTS Núcleo do trato solitário

NF-�B Fator nuclear kappa B

NPV Núcleo Paraventricular

NPY Neuropeptídeo Y

NVM Núcleo ventromedial

NHANES National Health and Nutrition Examination Survey

OMS Organização Mundial da Saúde

OXM Oxintomodulina

RDC Resolução da Diretoria Colegiada

RLEP Receptor da leptina

PAI Inibidor do ativador do plasminogênio

PDG Saponinas triterpênicas panaxadiol

PTG Saponinas triterpênicas panaxatriol

PVN Núcleo paraventricular

PI3K Fosfoinositidio 3-quinase

POMC Proopiomelanocortina

PPAR Receptor ativado por proliferador de peroxissoma

PCSK1 Pró-convertase 1

PP Polipeptídio Pancreático

PTP Proteína tirosina fosfatase

PYY Peptideo YY

RPH Resina do Protium heptaphyllum

SCOUT Sibutramine Cardiovascular Outcomes

SIB Sibutramina

SM Síndrome metabólica

SNP Polimorfismos de nucleotídeos simples

SOCS Supressor de sinalização de citocinas

TAB Tecido adiposo branco

TG Triglicerídeos

TAM Tecido adiposo marrom

TNF Fator de necrose tumoral

VCAM Molécula de adesão intercelular

VIGITEL Vigilância de Fatores de Risco e Proteção para Doenças Crônicas por

Inquérito Telefônico

VLDL Lipoproteína de muito baixa densidade

VMN Núcleo ventromedial

WC Circunferência abdominal

α-MSH α-estimulante-melanócito

SUMÁRIO

1.0. Introdução 18

1.1. Obesidade............................................................................................... 18

1.1.1 Epidemiologia.......................................................................................... 18

1.1.2. Diagnóstico............................................................................................. 20

1.1.3. Fisiopatologia.......................................................................................... 22

1.1.4. Tratamento da obesidade....................................................................... 40

1.2. Plantas Medicinais e seu potencial Antiobesidade ................................ 45

1.2.1. Terpenos e seu potencial Antiobesidade................................................ 47

1.2.2. Resina do Protium heptaphyllum e a mistura de triterpenos alfa e beta-

amirina....................................................................................................

48

2.0. Justificativa........................................................................................... 53

3.0. Objetivos................................................................................................ 54

3.1. Objetivo Geral........................................................................................ 54

3.2. Objetivos Específicos........................................................................... 54

4.0. Metodologia .......................................................................................... 55

4.1. Material Botânico e obtenção dos compostos ....................................... 55

4.2. Animais .................................................................................................. 55

4.3. Dietas...................................................................................................... 55

4.4. Protocolo Experimental .......................................................................... 56

4.4.1 Peso corporal, do tecido adiposo e fígado.............................................. 56

4.4.2. Análises plasmáticas e hepáticas........................................................... 57

4.4.3. Análise por RT-qPCR (Reação em cadeia da polimerase

da transcrição reversa em tempo real)....................................................

57

4.4.4. Análise histológica hepática e do tecido adiposo................................... 60

4.4.5. Área dos adipócitos................................................................................. 60

4.4.6. Cultura e citotoxicidade em células 3T3-L1............................................ 60

4.4.7. Indução da adipogênese e Coloração com Oil Red O........................... 61

4.4.8. Análise por Western blotting.................................................................... 62

4.5. Análise estatística .................................................................................. 63

5.0. Resultados. ............................................................................................. 64

5.1. Efeito da resina do Protium heptaphyllum (RPH) e de alfa e beta

amirina (AMI) no peso corporal, consumo de ração e água e peso

relativo do tecido adiposo abdominal e fígado........................................

64

5.2. Efeito da RPH e AMI nos parâmetros plasmáticos e hepáticos............. 66

5.2.1. Dosagens bioquímicas plasmáticas e hepáticas..................................... 66

5.2.2. Dosagens plasmáticas de Grelina, Leptina, Resistina, TNF-α, IL-6 e

MCP-1......................................................................................................

68

5.3. Expressão gênica de PPARy e LPL no tecido adiposo .......................... 72

5.4. Análise histológica do fígado e tecido adiposo........................................ 73

5.5. Efeito da RPH na cultura de células 3T3-L1............................................ 76

5.5.1. Avaliação da citotoxicidade da RPH em cultura de células 3T3-L1........ 76

5.5.2. Efeito da RPH sobre o acúmulo de lipídeos em adipócitos 3T3-L1........ 76

5.5.3. Efeito da RPH sobre a expressão proteica de PPARγ, C/EBPα e

C/EBPβ em células 3T3-L1.....................................................................

76

6.0. Discussão. .............................................................................................. 79

7.0. Conclusões ............................................................................................ 93

8.0. Referências ............................................................................................ 94

18

1.0. Introdução

1.1. Obesidade

1.1.1 Epidemiologia

Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS) a obesidade é definida

como um acúmulo anormal ou excessivo de gordura que pode prejudicar a saúde

(WHO, 2015). A causa fundamental para a obesidade e o sobrepeso é o desequilíbrio

energético entre as colorias consumidas e as calorias gastas. Globalmente, a

obesidade deve-se a um aumento do consumo de alimentos calóricos ricos em

gordura, da inatividade física, da natureza sedentária de várias formas de trabalho,

mudanças nos meios de transporte e aumento da urbanização (WHO, 2015).

Em 2014 no mundo, mais de 1,9 bilhões de adultos acima de 18 anos

estavam com sobrepeso. Destes, mais de 600 milhões eram obesos.

Aproximadamente 13% da população adulta mundial (11% de homens e 15% de

mulheres) era de obesos em 2014 (WHO, 2015).

Nos países desenvolvidos, a prevalência de sobrepeso (IMC≥25 kg/m2) e

de obesidade (IMC≥30 kg/m2) entre os homens aumentou de 28,8% em 1980 para

36,9% em 2013. Entre as mulheres, a prevalência aumentou de 29,8% para 38,0% no

mesmo período. Entre as crianças do sexo masculino, a prevalência aumentou de

16,2% para 23,8% e entre as meninas de 16,2% para 22,6%. Um aumento, embora

mais lento e em um nível inferior, também foi observado em adultos, adolescentes e

crianças nos países em desenvolvimento (8,1% para 12,9%). Esses dados associados

ao entendimento das inúmeras comorbidades associadas ao ganho de peso

confirmam a alegação feita pela OMS, de que o sobrepeso e a obesidade constituem

uma das ameaças mais importantes para a saúde mundial atualmente (MORGENE;

SØRENSEN, 2014).

No Brasil estudos mostram o aumento da prevalência da obesidade,

principalmente em crianças e adolescentes, assim como na população indígena

(AZAMBUJA et al., 2013; COIMBRA et al., 2013; FLORES et al., 2013; PITANGUEIRA

et al., 2015). De acordo com a pesquisa Vigitel 2014 (Vigilância de Fatores de Risco e

Proteção para Doenças Crônicas por Inquérito Telefônico), realizada pelo Ministério da

Saúde, apesar de suas limitações, mostra um crescimento no número de pessoas com

19

excesso de peso no país, 52,5% dos brasileiros com idade acima de 18 anos estão

acima do peso, e 17,9% da população está obesa. Quanto menor a escolaridade,

maiores os índices de excesso de peso e obesidade. Em relação ao percentual de

obesos nas capitais, Campo Grande é a que apresenta os maiores percentuais (22%)

e Florianópolis os menores (14%). Fortaleza é a 3ª. capital com o maior percentual de

adultos com excesso de peso (56%) e a 9ª. capital com maior percentual de obesos

(19%) (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015).

A Vigitel 2014 mostrou um aumento significativo na frequência de

realização de atividade física e no consumo de frutas e hortaliças no Brasil. Apesar

desses avanços, o estudo também mostrou a existência de hábitos alimentares

inapropriados da população, com o consumo médio de sal (12g/dia) sendo o dobro do

recomendado pela OMS, 16,2% costumam trocar o almoço ou jantar por um lanche de

baixo valor nutritivo, enquanto 29,4% consomem carne gordurosa e mais da metade

(52,9%) consome leite integral regularmente, enquanto 20,8% ingerem refrigerantes,

no mínimo, cinco dias por semana (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015).

Os gastos com obesidade no Brasil são de US$ 269.6 milhões (1,86% de

todos os gastos com assistência médica de média e alta complexidade). O custo com

a obesidade mórbida representa 23,8% do total (US$ 64.2 milhões), apesar desta ser

18 vezes menos prevalente. A cirurgia bariátrica custou ao Brasil um total de US$ 17.4

milhões em 2011 (DE OLIVEIRA et al., 2015).

O Ministério da Saúde através da Portaria No. 424, de 19 de março de

2013, redefiniu as diretrizes para a organização da prevenção e do tratamento do

sobrepeso e da obesidade como linha de cuidado prioritária da Rede de Atenção à

Saúde das Pessoas com Doenças Crônicas (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2013). O

Ministério da Saúde tem uma campanha de promoção à Saúde que inclui o incentivo à

alimentação saudável e incentivo à atividade física, que podem ser acessada no site

www.saude.gov.br/promocaodasaude (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015).

20

1.1.2. Diagnóstico

O índice de massa corporal (IMC), calculado pelo peso corporal em

quilogramas dividido pela altura ao quadrado (kg/m2), é o método mais utilizado para o

diagnóstico da obesidade, e se correlaciona diretamente com o risco de comorbidades

e mortalidade. A OMS definiu como obesidade um IMC ≥ 30kg/m2, e como sobrepeso

um IMC ≥ 25kg/m2. A definição também descreve os graus de obesidade como grau 1,

2 e 3. Sendo o grau 3 a obesidade mórbida (ABESO, 2009) (TABELA 1).

O IMC tem limitações importantes como não diferenciar a gordura de

massa magra e não refletir a distribuição da gordura corporal (YOON et al., 2014).

Portanto, os atletas com corpo reforçado de massa muscular, podem ser

erroneamente classificados como obesos quando se utiliza apenas o IMC, ao passo

que pessoas com baixa massa magra, mas com alto teor de gordura corporal, podem

ter um IMC normal (ROMERO-CORRAL et al., 2010).

A circunferência abdominal tem sido comumente utilizada como um

marcador simples e clinicamente útil para a adiposidade central. A determinação de

valores de corte para a circunferência abdominal têm se mostrado importante na

prevenção e no tratamento da obesidade, diabetes mellitus tipo 2 (DM2) e doenças

cardiovasculares relacionadas (YOON et al., 2014). A OMS estabelece como ponto de

corte para risco cardiovascular aumentado a medida de circunferência abdominal igual

ou superior a 94 cm em homens e 80 cm em mulheres caucasianos (TABELA 2).

A associação da medida da circunferência abdominal com o IMC pode

oferecer uma forma combinada de avaliação de risco, e ajudar a diminuir as limitações

de cada uma das avaliações isoladas (ABESO, 2010).

Enquanto a medição de pregas cutâneas é de baixo custo mas de uso

limitado (MATHIEU et al., 2009), medidas diretas do tecido adiposo através de

pletismografia por deslocamento de água ou ressonância magnética são

demasiadamente caras para utilização em larga escala ou na prática clínica. Novos

métodos para medir o teor de gordura, como a pletismografia por deslocamento de ar,

a densitometria com emissão de raio X de dupla energia (DEXA) ou a bioimpedância

têm se mostrado válidos e menos dispendiosos (OLIVEROS et al., 2014).

21

Tabela 1 – Classificação de peso pelo IMC

Classificação IMC (kg/m 2)

Risco de Comorbidades

Baixo peso < 18,5 Baixo

Peso Normal 18,5 a 24,9 Médio

Sobrepeso ≥ 25,0 -

Pré-obeso 25,0 a 29,9 Aumentado

Obeso I 30,0 a 34,9 Moderado

Obeso II 35,0 a 39,9 Grave

Obeso III ≥ 40,0 Muito Grave

Fonte: Adaptado de ABESO, 2009.

Tabela 2 - Combinação das medidas de circunferência abdominal e IMC para avaliar

obesidade e risco para diabetes 2 e doença cardiovascular.

Circunferência abdominal (cm)

Risco de complicações

metabólicas IMC (kg/m 2)

homem: 94-102 102+

mulher: 80-88 88+

Baixo peso < 18,5 - -

Peso saudável 18,5 a 24,9 - Aumentado

Sobrepeso 25,0 a 29,9 Aumentado Alto

Obesidade ≥ 30 Alto Muito alto

Fonte: Adaptado de ABESO, 2009.

22

1.1.3. Fisiopatologia

A obesidade é causada por uma complexa interação entre o ambiente,

predisposição genética e comportamento humano, sendo os fatores ambientais os

principais contribuintes para a epidemia da obesidade (NGUYEN; HASHEM, 2010).

A partir de 2006 com a criação da hipótese obesogênica, a epidemia de

obesidade pode, pelo menos em parte, ser consequência do ambiente (e

especialmente dentro da cadeia alimentar), onde xenobióticos (ex. pesticidas, metais

pesados, solventes) agem como desreguladores endócrinos, principalmente durante o

desenvolvimento fetal, promovendo hiperplasia dos adipócitos, facilitando vias

adipogênicas, alterando a homeostase lipídica e interferindo em mecanismos de

controle do apetite e da saciedade (GRÜN; BLUMBERG, 2006; KELISHADI et al.,

2013).

A relação inversa entre obesidade e classe socioeconômica e o aumento

da obesidade em países em desenvolvimento mostra uma clara evidência da

influência ambiental no ganho de peso (VAN DER KLAAUW; FAROOQI, 2015). A

adoção de um estilo de vida relativamente sedentário pela redução da atividade física

no trabalho e no lazer, associado a uma abundância e facilidade no consumo de

alimentos calóricos, com alta palatibilidade, representa uma transição nutricional (VAN

DER KLAAUW; FAROOQI, 2015).

Uma dieta rica em gorduras e em acúcares refinados é composta de

alimentos com alta densidade calórica, alta palatibilidade, de baixo poder sacietógeno

e de fácil absorção e digestão. Estas características favorecem o aumento da ingestão

alimentar e, portanto, contribuem para o desequilíbrio energético. Além disso, as

diferenças em relação aos macronutrientes da dieta (excesso de carboidratos ou

excesso de gordura) influenciam no tipo de substrato que o organismo oxida

preferencialmente. Dessa forma, indivíduos que ingerem muito carboidratos, oxidam

(“queimam”) de forma menos eficientes as gorduras e podem ter mais dificuldades em

perder peso (GELONEZE et al., 2010).

Há um crescente reconhecimento de que as redes sociais podem ter um

papel importante na obesidade. CHRISTAKIS et al (2007), exploraram a hipótese de

que a obesidade poderia se espalhar através das redes sociais, avaliando uma rede

interligada de mais de 12000 pessoas do Framingham Heart Study, onde foi

investigado o efeito do ganho de peso entre amigos, irmãos e cônjuges. Eles

descobriram que o risco de uma pessoa se tornar obesa aumentava 57% se um amigo

23

se tornasse obeso. O risco de se tornar obeso aumentava em 40% se uma pessoa

tinha um irmão que se tornou obeso e 37% se tinha um cônjuge. Esse estudo

enfatizou o fato da obesidade ser afetada pela complexa interação entre meio

ambiente, genética e comportamento humano.

Acredita-se que a obesidade, na maioria dos casos, seja consequência de

um ambiente obesogênico em indivíduos geneticamente predispostos (GELONEZE et

al., 2010).

O perfil genético pode ser uma explicação para as diferenças individuais

na predisposição para o ganho de peso. A maioria dos genes envolvidos na

susceptibilidade da obesidade são também relacionados com o consumo de alimentos

e com a regulação do balanço energético. São conhecidos 3 tipos de formas genéticas

de obesidade, a obesidade monogênica sindrômica, a obesidade monogênica não

sindrômica e a obesidade poligênica (ALBUQUERQUE et al., 2015).

As formas monogênicas da obesidade resultam da alteração de um único

gene, são formas raras e severas que afetam aproximadamente 5% da população

(FAROOQI; O’RAHILLY, 2005; ALBUQUERQUE et al., 2015). Existem mais de 200

tipos de obesidade humana associados com formas monogênicas ou mendelianas

(BELL et al., 2005; RANKINEN et al., 2006; MUCH; CLÉMENT, 2006). Estas formas

são constituídas por mutações em genes envolvidos na diferenciação neuronal do

núcleo paraventricular e na rede leptina/melanocortina, como o gene da leptina (LEP)

e seu receptor (LEPR), a proópiomelanocortina (POMC) e seu receptor (MC4R), a pró-

proteína convertase/kexina tipo 1 (PSCK1), o homólogo 1 do gene mind de Drosófila

(SIM1), o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e o seu receptor (NTRK2)

(FAROOQI; O’RAHILLY, 2007; ALBUQUERQUE et al., 2015. A forma monogênica

sindrômica refere-se a à obesidade associada a um distindo fenótipo clínico, como

retardo mental, características dismórficas e anormalidades de desenvolvimento de

órgãos específicos. São exemplos, a síndrome de WAGR, Prader-Wulli, Bardet-Bield,

Altrom e síndrome de Cohen (ICHIHARA; YAMADA, 2008; ALBUQUERQUE et al.,

2015).

A teoria mais aceita é a da obesidade poligênica, onde ocorre a interação

de múltiplos alelos comuns. Podemos citar o gene para a glutamato descarboxilase 2

(GAD2) na origem do ácido gama-butírico que regula positivamente o ingresso de

alimento, o gene para ectonucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterase 1 (ENPP1), que

tem um papel no sensoriamento cerebral da insulina, e o gene SLC6A14, um

24

transportador de triptofano implicado na regulação do apetite, além dos genes para

leptina (LEP) e seu receptor (LEPR), a pró-opiomelanocortina (POMC) e seu receptor

(MC4R), a pró-convertase 1 (PCSK1), o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)

e seu receptor (NTRK2), receptor canabinoide (CNR1), receptor da dopamina (DRD2)

e da serotonina (2C HTR2C) (HINNEY E HEBEBRAND, 2008).

O desequilíbrio entre a ingestão e o gasto energético resulta na obesidade.

O cérebro é o regulador do consumo e do gasto energético e assim da homeostase

energética do organismo. Os hormônios intestinais comunicam a informação do trato

gastrintestinal para centros reguladores do apetite no sistema nervoso central (SNC)

pela via denominada eixo-intestino-céebro. Tais informações são transferidas para o

SNC via sinalização nervosa aferente vagal ou não-vagal, ou via corrente circulatória

(hormônios intestinais). Redes neurais complexas distribuídas pelo cérebro e tronco

cerebral estão no controle da alimentação e da homeostase energética. No

hipotálamo, o núcleo arqueado (ARC), o núcleo paraventricular (PVN), o núcleo

ventromedial (VMN), o núcleo dorsomedial (DMN) e a área hipotalâmica lateral (LH)

são responsáveis pela maior parte do controle da homeostase energética (BUHMANN

et al., 2014).

O ARC recebe sinais periféricos de apetite e responde a estes com a

liberação modulada de neuropeptideos em duas populações distintas de neurônios. Os

neurônios que co-expressam neuropeptideo Y (NPY) e peptídeo relacionado ao agouti

(AgRP) aumentam a fome e o apetite estimulando a alimentação (neurônios

orexígenos). Em contraste, os neurônios que co-expressam pró-opiomelanocortina

(POMC) e transcrito regulado pela cocaína e anfetamina (CART) reduzem a fome e

diminuem o apetite levando a redução na alimentação (neurônios anorexígenos). O

balanço entre as atividades dessas duas classes de circuitos neuronais é crítico para a

manutenção do peso corporal (BUHMANN et al., 2014; KÄLIN et al., 2015). Esses

neurônios expressam receptores para hormônios reguladores do metabolismo como

insulina, leptina, grelina, glicocorticóides, estrógenos, hormônios tireoidianos e GLP-1

(peptídeo semelhante ao glucagon 1) (YI et al., 2012; KÄLIN et al., 2015).

Sinais do ARC são enviados para outras regiões hipotalâmicas, incluindo o

Núcleo Paraventricular (NPV), que hospeda neurônios neuroendócrinos que controlam

a resposta ao estresse, assim como neurônios que regulam a produção e o gasto de

energia periférica, pelo controle do metabolismo da glicose e de lipídeos (OBICI et al.,

2002; BRUINSTROOP et al., 2013; KÄLIN et al., 2015).

25

A informação sobre os estoques de energia e o consumo recente de

alimentos é comunicada em ambas as direções entre o hipotálamo e o tronco cerebral

influenciando a percepção de fome e saciedade. Essas interações neuronais através

de vias centrais da melanocortina revelam que esse sistema exerce um importante

papel na regulação da fome, da saciedade e do gasto energético. De fato, o sistema

homeostático da melanocortina assegura, de forma confiável, a estabilidade do peso,

e protege mais robustamente contra a perda de peso do que contra o ganho de peso.

No caso de alterações da adiposidade corporal, o cérebro aciona mecanismo de

homeostase fisiológicos que resistem ao ganho de peso, através de mecanismos

compensatórios de alteração do apetite, modulando neurotransmissores e a taxa

metabólica (KÄLIN et al., 2015).

Os seres humanos não se alimentam apenas em resposta ao sistema

homeostático do balanço energético. Existe influência de um sistema não

homeostático, de prazer e de recompensa (hedônico). Na obesidade, respostas

hedônicas geradas nas estruturas dopaminérgicas mesolímbicas se sobressaem à

regulação homeostática fisiológica, para aliviar o déficit na sinalização de recompensa,

resultando em crescente excesso de ingestão alimentar. Consequentemente, a

despeito de um estoque normal ou excessivo de energia, continua-se a consumir

alimentos palatáveis em excesso, por seus efeitos prazerosos. Outros sistemas

envolvidos nos processos de recompensa são o sistema endocanabinoide e o sistema

opióide (ZHANG et al., 2014).

Os hormônios do trato gastrintestinal envolvidos no controle da

homeostase de energia, são grelina, colescitocinina, glucagon, peptídeo semelhante

ao glucagon 1 (GLP-1), oxintomodulina, peptídeo YY, polipeptídio pancreático, amilina

e polipeptídio inibitório gástrico.

A grelina é o único hormônio intestinal, orexígeno, ativo perifericamente,

sendo derivada predominantemente das células epiteliais gástricas, mas também da

glândula pituitária. A grelina age no receptor secretagogo do hormônio do crescimento

(GSH-R) aumentando o consumo de alimento em roedores e em humanos

(MURAKAMI et al., 2002; WREN et al., 2001a; 2001b). Os níveis circulantes de grelina

são influenciados pelo estado prandial, onde seus níveis aumentam no estado pré-

prandial e diminuem no estado pós-prandial, sugerindo um papel da grelina no início

da refeição (ARIYASU et al., 2001; CUMMINGS et al., 2001). Em contraste, os obesos

têm níveis circulantes menores de grelina do que individuos magros, o que em parte

pode ser explicado pelo aumento da insulina e leptina nestes indivíduos, exercendo

26

uma ação inibitória. (HAMED et al., 2011; PRADHAN et al., 2013). A grelina também

tem um papel como neurotransmissor. Ela é expressa nas áreas ARC e PVN

hipotalâmicas. A regulação do apetite é mediada via neurônios NPY/AgRP. A

administração periférica de grelina leva a secreção do hormônio do crescimento e

estimulação da alimentação via eixo-cérebro-intestino, enquanto sua administração

central causa ação orexígena direta no hipotálamo (NAKAZATO et al., 2001; WREN et

al., 2001). O uso de antagonistas da grelina em humanos para o tratamento da

obesidade não tem sido bem sucedida (ZHANG et al., 2014).

A colecistocinina (CCK) foi o primeiro hormônio intestinal conhecido por

estar envolvido com o controle do apetite. É secretada pelas células L no duodeno e

jejuno após a ingestão alimentar e exerce seus efeitos sobre a motilidade e secreção

da vesícula biliar e gastrintestinal via receptor CCK1 e em menor extensão via CCK2

(REHFELD, 2004). Gorduras e proteínas são os principais estimulantes da secreção

de CCK. Seus níveis plasmáticos estão elevados 15min após a refeição e possui uma

meia-vida de poucos minutos (GEARY, 2004). Quando administrada perifericamente

em roedores, ocorre inibição dose-dependente da ingestão de alimentos, mas

desenvolve-se tolerância com administração continua. Além disso, a infusão

intermitente prandial de CCK reduz o tamanho da alimentação em roedores mas um

mecanismo compensatório de aumento da frequência de alimentação é observado

(KOPIN et al., 1999; WEST et al., 1984). Em humanos, o agonista seletivo de CCKA,

GI 181771X, falhou em induzir perda de peso em ensaios clínicos de Fase II.

Enquanto sua administração crônica em animais induz pancreatite, sugerindo

viabilidade limitada de seu uso terapêutico em humanos (FONG, 2005; KIM et al.,

2011).

O glucagon liberado pelas células alfa das ilhotas pancreáticas aumenta a

glicemia em resposta a hipoglicemia e ao aumento do gasto energético pelo estresse

fisiológico (HEPPNER et al., 2010; JONES et al., 2012). A sua administração leva a

diminuição do consumo de alimentos, que acredita-se ser modulada via alteração do

tônus vagal e da taxa de esvaziamento gástrico (GEARY et al., 1992). Em roedores, a

intolerância à glicose e a obesidade induzida por dieta podem ser tratadas com

agonistas duais dos receptores de glucagon e de GLP-1 (POCAI et al., 2009).

Quanto aos peptídeos semelhantes ao glucagon, a expressão do gene pré-

pró-glucagon é limitada as células alfa pancreáticas, células L intestinais e neurônios

hipotalâmicos e do núcleo do trato solitário (NTS). Pelo processamento pós-

traducional tecido-específico do pró-glucagon, mediante a ação de enzimas pró-

27

hormônio convertases, no pâncreas ocorre a formação de glucagon, enquanto nas

células L intestinais e no NTS há formação dos peptídeos glicentina, oxintomodulina

(OXM) e peptídeos semelhantes ao glucagon 1 e 2 (GLP-1 e -2) (BAGGIO;

DRUCKER, 2007).

O peptídeo semelhante ao glucagon 1 (GLP-1) é um fator insulinotrópico

secretado pelas células L do trato gastrointestinal e expresso em várias regiões do

cérebro. O receptor de GLP-1 (GLP1-R) é expresso no hipotálamo, trato gastrintestinal

e pâncreas. Quando administrado perifericamente, como por via central, o GLP-1 ativa

neurônios hipotalâmicos no ARC, PVN, assim como no núcleo do trato solitário (NTS)

e área postrema (AP), aumentando a saciedade e diminuindo a fome, exercendo

assim efeito anorético. A liberação de GLP-1 é proporcional a quantidade de calorias

ingeridas, mas as respostas ao GLP-1 podem diferir entre indivíduos com peso normal

e obesos. O GLP-1 é rapidamente inativado pela enzima dipeptidil dipeptidase IV

(DPP-IV) (HOLST, 2007; TANG-CHRISTENSEN et al., 2001). GLP-1 é uma incretina

potente, estimula a liberação de insulina pancreática, inibe a secreção gástrica ácida,

reduz a velocidade de esvaziamento gástrico e promove a neogênese de células beta

pancreáticas (NAUCK et al., 1997; SCHJOLDAGER et al., 1989; WETTERGREN et

al., 1993). O efeito do GLP-1 pode ser bloqueado pela vagotomia, sugerindo um papel

central da inervação vagal na mediação do efeito anorético do GLP-1. O antagonista

de GLP-1R, exedin (9-39), aumenta a ingestão de alimentos em ratos saciados,

indicando que a sinalização pelo GLP1R é um importante regulador fisiológico da

ingestão de alimentos e homeostase energética (ABBOTT et al., 2005; CHELIKANI et

al., 2005; NEARY et al., 2005). Análogos do GLP-1 (Liraglutida e Exanatida) estão em

estudo clinico Fase III para o tratamento da obesidade (KAKKAR; DAHIYA, 2015).

A oxintomodulina (OXM) é co-secretada com GLP-1 e PYY pelas células L,

em correlação com o consumo de calorias. A OXM reduz a secreção ácida gástrica e o

consumo de alimentos, sem comprometer a palatabilidade do alimento (POCAI, 2013;

COHEN et al., 2003). OXM causa uma redução da atividade neuronal no ARC, PVN e

núcleo supra-óptico hipotalâmicos (LEQUELLEC et al., 1992). Sua administração

central inibe o consumo de alimentos em ratos via receptores GLP-1, assim como

suas ações são bloqueadas pelo antagonista de receptor GLP-1, exendina 9-39

(DAKIN et al., 2004). Além disso, a sua administração em humanos reduz o apetite e o

consumo de alimentos ao mesmo tempo que aumenta o gasto energético, com perda

de peso corporal (WYNNE et al., 2005; COHEN et al., 2003). Assim como o GLP-1, a

28

OXM é inativada pela DPP-IV e análogos da OXM resistentes a DDP-IV estão sendo

investigados para o tratamento da obesidade (POCAI, 2013).

O Peptideo YY (PYY) é liberado pelas células endócrinas L do trato

gastrintestinal após a refeição, onde é co-estocado com o GLP-1 (ADRIAN et al.,

1985). Sua secreção é proporcional às colorias ingeridas, mas não é influenciado pela

distensão gástrica. Pode ser encontrado em todo o trato gastrintestinal, suas maiores

concentrações estão no cólon e reto (ADRIAN et al., 1985). A principal forma do PYY é

o PYY3-36 que possui alta afinidade pelo receptor Y2 e menor afinidade por Y1 e Y5

(LE ROUX et al., 2006). A administração periférica de PPY3-36 em doses fisiológicas

reduz o consumo de alimentos em roedores, primatas e humanos (CHELIKANI et al.,

2005; KOEGLER et al., 2005; DEGEN et al., 2005). PPY3-36 ativa neurônios POMC

no ARC, assim como inibe neurônios NPY, e seus efeitos anoréxicos centrais são

mediados pela inervação vagal (CUNA-GOYCOLEA et al., 2005; ABBOTT et al.,

2005). Os níveis de PYY circulantes pós-prandial estão diminuídos no obeso, contudo

existe uma controvérsia onde estudos demonstram grandes diferenças nos níveis de

jejum de PYY entre não obesos e obesos (BATTERHAM et al., 2003; KORNER et al.,

2005; STOCK et al., 2005). Porém, obesos são sensíveis a administração periférica de

PYY, reduzindo a ingestão alimentar similar aos indivíduos com peso normal

(BATTERHAM et al., 2003).

O Polipeptídio Pancreático (PP) pertence à família de peptídeos que

incluem o NPY e PYY. O PP é liberado pelas células pancreáticas PP, após a

alimentação, e sob controle vagal (SCHWARTZ et al., 1978). PP é comparável a

outros peptídeos intestinais anoréticos como o PYY, sendo secretado em proporção

com a quantidade de calorias ingeridas. O PP liga-se a todos os receptores da família

de receptores Y, mas tem maior afinidade pelo subtipo Y4 (MICHEL et al., 1998). Seus

efeitos são mediados pelo hipotálamo ventromedial (VHM), paraventricular (PVN) e

tronco cerebral (ASAKAWA et al., 2003a). PP induz o relaxamento da vesícula biliar,

inibição da secreção pancreática assim como reduz o esvaziamento gástrico

(ASAKAWA et al., 2003b). Também regula o apetite, suas concentrações plasmáticas

estão reduzidas quando aumenta a ingestão alimentar e elevadas na anorexia nervosa

(BATTERHAM et al., 2003). A sua administração intravenosa diminui a ingestão

alimentar e o esvaziamento gástrico e aumenta o gasto energético, enquanto sua

administração central leva ao aumento do consumo alimentar (CLARK et al., 1984).

PP reduz a leptina no tecido adiposo e a expressão do gene do fator de liberação de

29

ACTH (ASAKAWA et al., 2003b). Agonistas de receptores Y4 estão sendo

investigados para o tratamento da obesidade (KAKKAR; DAHIYA, 2015).

A insulina produzida pelas células beta pancreáticas age nos neurônios do

ARC hipotalâmicos reduzindo o consumo de alimentos. A insulina é transportada para

o cérebro por um processo mediado por receptor saturável, dependente dos

receptores de insulina. Este transporte é dependente de vários fatores incluindo dieta,

glicemia, diabetes e obesidade. A obesidade leva a uma importante redução do

transporte de insulina da periferia para o SNC (BEGG, 2015). A ação anorética da

insulina deve-se a diminuição da expressão de NPY, e estimulo da expressão de

POMC (PORTE et al., 2005). A insulina liga-se a seus receptores expressos nos

neurônios POMC/CART e NPY/AgRP. A insulina e a leptina ativam neurônios POMC,

mas regulam diferentemente AgRP, com leptina inibindo e insulina estimulando sua

síntese (XU et al., 2005). A deficiência de insulina é associada com NPY aumentado,

enquanto a administração de insulina inibe a expressão de NPY (XU et al., 2005).

A insulina age sobre os tecidos hepático, muscular e adiposo, promovendo

o estado anabólico por conduzir o metabolismo em direção ao armazenamento de

carboidratos, lipídeos e à síntese proteica. Em paralelo, suprime as vias catabólicas.

No fígado, a insulina estimula a glicólise, a síntese de glicogênio, suprime a lipólise e a

gliconeogênese e promove a síntese de triacilgliceróis. No tecido adiposo, estimula a

síntese de triacilglicerol. No músculo, estimula a o transporte e o metabolismo da

glicose e a síntese de glicogênio. Também aumenta a captação celular de

aminoácidos e estimula a síntese de proteínas (DOMINICZAK; BAYNES, 2005).

A amilina é co-sintetizada e co-liberada com a insulina em resposta ao

consumo de alimentos (MITSUKAWA et al., 1990). A ação anorética da amilina

depende da ativação direta de centros cerebrais, como a área postrema e área

tegmental ventral. Sua ação envolve redução da secreção e do esvaziamento gástrico,

redução da elevação de glicose pós-prandial e redução do consumo alimentar (LUTZ,

2006; GEDULIN et al., 1997; YOUNG et al., 1995; MORLEY E FLOOD, 1991). Em

humanos, essa sinalização é mediada via receptores de amilina, que são

heterodímeros de receptores da calcitonina e de proteínas modificadores da atividade

do receptor (RAMPs) (CHRISTOPOULOS et al., 1999; MUFF et al., 1999). Os efeitos

da amilina sobre a saciedade e saciação são traduzidos via ativação do sistema

serotonina-histamina-dopaminérgico (WOODS et al., 2006). O análogo de amilina,

pramlintide, foi introduzido na clínica como adjuvante na terapia para pacientes com

diabetes, e seu efeito sobre a perda de peso nesses pacientes tornou-se foco para o

30

estudo do seu uso no tratamento da obesidade (ARONNE et al., 2010; SINGH-

FRANCO et al., 2011).

O Peptídeo Inibitório Gástrico (GIP) é uma incretina secretada pelas

células K duodenais e jejunais após a ingestão de carboidratos e gordura (BAGGIO et

al., 2007; SALERA et al., 1982). O GIP está aumentado em obesos e exerce ações

anabólicas nos adipócitos, assim como efeitos lipolíticos (SALERA et al., 1982;

CREUTZFELDT et al., 1978). Camundongos nocautes para o receptor de GIP

apresentam reduzida massa de adipócitos e resistência para a obesidade induzida por

dieta (MIYAWAKI et al., 2002). O GIP potencializa o controle do consumo alimentar

em combinação com o GLP-1, não demonstrando efeito agudo per si sobre o consumo

alimentar (BAGGIO et al., 2007). Porém, animais nocautes para GIP mostram

aumento do gasto energético e ambos os hormônios têm ações comuns sobre as

células beta pancreáticas, atuando através de receptores relacionados, mas

estruturalmente distintos (BAGGIO et al., 2007, MIYAWAKI et al., 2002).

Ao lado dos hormônios intestinais, membros do sistema endocanabinóide

são também encontrados no trato gastrintestinal. Os principais endocanabinoides são

anandamida e 2-araquidonilglicerol (2-AG), que agem como agonistas endógenos de

receptores canabinóides 1 e 2 (CB1 e CB2) (SHARMA et al., 2014). O sistema

endocanabinóide (ECS) e especialmente os receptores CB1 possuem papel na

homeostase energética, modulando o consumo de alimentos e o metabolismo lipídico

no tecido adiposo, fígado, músculo esquelético e pâncreas (NOGUEIRAS et al., 2008;

DI MARZO; DESPRES, 2009). Elevados níveis de endocanabinóides são observados

em obesos (ENGELI et al., 2005; OSEI-HYIAMAN et al., 2005) e correlacionam-se

com a adiposidade intrabdominal (COTE et al., 2007). A ativação de receptores CB1

periféricos aumenta a lipogênese, o estoque de lipídeos, a secreção de insulina e

glucagon e a modulação da adiponectina (BERMUDEZ-SILVA et al., 2010; Vettor e

Pagano, 2009). No trato gastrintestinal os endocanabinóides reduzem os sinais de

saciedade gerados pela CCK (BURDYGA et al., 2004), aumentam a liberação de

grelina (TUCCI et al., 2004), além de reduzirem o peristaltismo intestinal (NESTO;

MACKIE, 2008). No fígado estimulam fatores lipogênicos (OSEI-HYIAMAN et al.,

2005), assim como alteram o metabolismo da glicose e a sensibilidade a insulina

(QUARTA et al., 2011).

A sinalização endógena do ECS envolve centros periféricos e centrais,

através da inervação vagal conectando o trato gastrintestinal a estruturas cerebrais

(eixo-intestino-cérebro). A nível central o consumo de alimentos é regulado pelo ECS

31

no hipotálamo e sistema límbico, modulando a alimentação pela redução de sinais de

saciedade e aumentando sinais anorexígenos (BERMUDEZ-SILVA et al., 2010). Após

jejum, o ECS hipotalâmico é ativado, estimulando o apetite, possivelmente reforçando

o valor hedônico da alimentação pelo aumento da liberação de dopamina na via

mesolimbica (BERMUDEZ-SILVA et al., 2010; NESTO; MACKIE, 2008; PIERCEA;

KUMARESAN, 2006) e influenciando a regulação da leptina sobre a reestruturação de

sinapses glutamatérgicas e gabaérgicas (CRISTINO et al., 2013).

O bloqueio crônico dos receptores CB1 leva a manutenção da perda de

peso em longo prazo, e redução da dislipidemia, na obesidade experimental e em

humanos, cujo mecanismo envolve o aumento do gasto energético e a ativação do

tecido adiposo marrom (BOON et al., 2014). Rimonabanto foi o primeiro antagonista

CB1 utilizado na clínica para o tratamento da obesidade em 2006 mas foi retirado do

mercado em 2008 devido a graves efeitos colaterais psiquiátricos (ansiedade,

depressão e idealização suicida) (RUMSFELD; NALLAMOTHU, 2014). Contudo

pesquisadores de todo o mundo estão interessados no desenvolvimento de

antagonistas seletivos CB1 para o tratamento da obesidade (SHARMA et al., 2014).

Estudos têm mostrado o papel da microbiota intestinal na homeostase do

organismo, e a identificação do seu efeito sobre o metabolismo fisiológico, como

também em doenças metabólicas, como o DM2 e a obesidade (HASTSTRA et al.,

2015; MORAN; SHANAHAN, 2014). A maior quantidade de microbiota intestinal é

encontra no intestino grosso, principalmente no colón, e de dois filos principais de

bactérias, o Firmicutes (incluindo Clostridium, Enterococcus, Lactobacillus e

Ruminococcus) e o Bacteroidestes (incluindo Prevotella e Bacteroides). Na obesidade

tem-se uma maior proporção de Firmicutes que Bacteroidestes comparado aos

indivíduos com peso normal (TURNBAUGH et al., 2009; LEY et al., 2006). FINUCANE

et al. (2014) mostraram a associação entre a razão Firmicutes/Bacteroidestes (F/B) e

obesidade ou IMC. Os mecanismos pelos quais a microbiota intestinal contribue para a

obesidade incluem, i) extração de calorias adicionais dos alimentos, onde a microbiota

é capaz de hidrolisar celulose e outros carboidratos complexos, e os monossacarídeos

absorvidos são metabolizados a ácidos graxos de cadeia curta (SCFA), que são

convertidos a triacilgliceróis no fígado, e depositados nos adipócitos pela ativação da

lipoproteína lipase (LPL) (resultante da inibição do fator adipocitário induzido pelo

jejum – FIAP). Em adição a indução da lipogênese hepática, a microbiota também

exerce um papel no gasto energético, favorecendo a inibição da oxidação de ácidos

graxos (que em retorno, favorece a deposição e estoque de lipídeos no tecido adiposo,

32

fígado e/ou músculo); ii) os SCFA agem como moléculas sinalizadoras em receptores

GRP41 e 43 reduzindo o gasto energético; iii) translocação de bactérias do intestino

para a corrente circulatória levando a uma inflamação sistêmica, pela ação do LPS e

de seus metabólitos rompendo a barreira intestinal; iv) modulando GLP-1/2 e o

sistema endocanabinóide (VILLANUEVA-MILLÁN et al., 2015).

A obesidade está associada a um maior risco de DM2, doenças

cardiovasculares, dislipidemia, esteatose hepática não alcoólica, doenças articulares,

apnéia do sono, asma, bem como alguns tipos de câncer, como o de endométrio,

mama, próstata e cólon (KIM et al., 2014). As alterações na estrutura e funcionamento

e a distribuição alterada da gordura, em particular a gordura visceral é

reconhecidamente um fator de risco para as alterações metabólicas encontradas na

obesidade (LANTHIER et al., 2014)

Existem dois tipos de tecido adiposo, o tecido adiposo branco (TAB) e o

tecido adiposo marrom (TAM).O TAB está distribuído pelo corpo e é representado por

dois tipos, TAB visceral (TABv) e TAB subcutâneo (TABs). OTABv, ou gordura

abdominal, está localizado dentro do peritôneo, sendo distribuído ao redor dos órgãos

internos (ex. estômago, fígado, intestino e rins). OTABs está localizado dentro da

cavidade abdominal e pode ser encontrado por baixo da pele, assim como na gordura

muscular (ex. TAB inguinal, quadris, coxas e nádegas) (PARK et al., 2014.)

A principal função do TAB é estocar energia na forma de triacilgliceróis

(TAGs), enquanto o TAM é especializado em dissipar energia na forma de calor.

Recentemente outro de tipo de adipócitos denominados “tipo-marrom” ou “bege” foram

identificados no TAB, com expressão gênica distinta do TAB e do TAM. A ativação dos

adipócitos beges aumenta o gasto energético e correlaciona-se com a magreza em

humanos (QIAN et al., 2015). Um achado também recente foi a dos adipócitos rosa

(pink adipocytes) que surgem durante a gravidez e a lactação, no processo de

alveologênese, com papel de produzir e secretar leite, sendo capazes de estocar

gordura. Estas células são encontradas exclusivamente em mulheres e sua

denominação provém da cor rosa, ao nível de microscopia, da glândula mamária da

grávida (GIORDANO et al., 2014).

O tecido adiposo é um órgão endócrino ativo que pode afetar a função de

outros órgãos, sendo uma importante fonte de várias adipocinas, citocinas,

quimiocinas e fatores de crescimento. Estas substâncias são responsáveis pela

interação entre o tecido adiposo, tecido muscular, córtex adrenal e sistemas nervoso

33

central e simpático, mantendo o equilíbrio energético do organismo, a determinação da

sensibilidade a insulina, bem como a regulação da pressão arterial, a resposta imune,

da angiogênese, metabolismo lipídico e homeostasia (GNACIŃSKA et al., 2009).

O excesso de tecido adiposo visceral e o aumento da produção de

citocinas são os principais responsáveis pelas complicações metabólicas. Os

principais componentes da síndrome metabólica são obesidade abdominal com

resistência à insulina, hiperinsulinemia, hipertensão arterial, dislipidemia, hiperglicemia

e DM2. Os outros elementos dessa síndrome são hiperuricemia e estado pró-

inflamatório. A presença de síndrome metabólica está associada ao aumento no risco

de complicações cardiovasculares, cardiopatias isquêmicas e acidente vascular

cerebral (RANA et al., 2007).

O tecido adiposo é um órgão endócrino e de estocagem que participa na

homeostase energética. Este tecido é primariamente composto de adipócitos, mas

também contém outras células, como p.ex. fibroblastos, pré-adipócitos, monócitos,

células endoteliais (LEAL; MAFRA, 2013). Os adipócitos secretam hormônios,

adipocinas e citocinas que agem de forma endócrina, parácrina e autócrina regulando

a homeostase energética. As adipocinas têm diferentes funções, como: regulação de

apetite e balanço energético, imunidade, sensibilidade à insulina, angiogênese,

inflamação e resposta de fase aguda, pressão sanguínea e metabolismo de lipídeos.

O número de adipocinas tem expandido rapidamente e incluem leptina, adiponectina,

resistina, visfatina, apelina, proteína de ligação do retinol-4, soro amiloide A, inibidor 1

do ativador de plasminogênio, angiotensinogênio, vaspina, omentina, chemerin e zinco

alfa 2 glicoproteina (LEAL; MAFRA, 2013).

Dentre as adipocinas mais conhecidas e estudadas estão a leptina, a

adiponectina e a resistina.

A leptina é codificada pelo gene ob, expresso por adipócitos diferenciados

do TAB. A gordura subcutânea é a principal fonte de leptina (FREDERICH et al.1995;

MAFFEI et al. 1995). Seu principal efeito biológico é o controle do crescimento do

tecido adiposo via ação no SNC. A leptina age nos neurônios gabaérgicos, reduzindo

o apetite e aumentando o gasto energético. Os neurônios sensíveis a leptina

encontram-se no hipatálamo e em diferentes órgãos como fígado, rins, pulmões,

pâncreas e tecido adiposo. A leptina inibe os neurônios NPY e GABA, enquanto

simultaneamente estimula os neurônios POMC. Como NPY e GABA são neurônios

orexígenos, enquanto POMC são neurônios anorexígenos, a leptina promove a

34

sensação de saciedade e aumenta o gasto energético (MUHAMMAD; FRANK, 2014;

FRIEDMAN; HALAAS 1998, BATES; MYERS 2003, MYERS et al. 2009, RING;

ZELTSER, 2010; LEAL; MAFRA, 2013).

No obeso a presença de hiperfagia e aumento do tecido adiposo na

presença de hiperleptinemia indica resistência à leptina (LEAL; MAFRA, 2013). Os

mecanismos precisos da resistência à leptina ainda não foram esclarecidos, mas o

que sabe-se até agora é que essa resistência possa advir de i) uma falha na

passagem da leptina da circulação para o cérebro pela barreira hematoencefálica; ii)

uma inibição da cascata de sinalização da leptina em regiões específicas do cérebro;

iii) uma redução na expressão de receptores de leptina e iv) uma desensibilização da

sinalização celular eferente central para a periferia (CARO et al., 1996; MARTIN et al.,

2000; MUNZBERG et al., 2005; MUNZBERG; MYERS, 2005; SÁINZ et al., 2015). Em

adição, múltiplos fatores incluindo a inflamação e estresse oxidativo, assim como o

tipo de dieta podem também contribuir para a resistência à leptina (SÁINZ et al.,

2015). A leptina está associada com ativação de macrófagos, produção de TNF-α e

espécies reativas de oxigênio, síntese de iNOS, expressão de MCP-1 e migração e

proliferação de células endoteliais (LOFFREDA et al., 1998; KONSTANTIDINES et al.,

2001; COOKE; OKA, 2002; LEAL; MAFRA, 2013).

Adiponectina é liberada exclusivamente por adipócitos do TAB. Sua

expressão é maior no TAB subcutâneo, em relação ao visceral. Suas ações estão

relacionadas com a melhoria da sensibilidade a insulina através da ativação de

proteína quinase ativada por AMP (AMPK) no fígado e no músculo esquelético, e

redução da expressão de enzimas hepáticas responsáveis pela gliconeogênese. Além

disso, a adiponectina é inversamente associada à expressão de moléculas de adesão

e a transformação de macrófagos em células espumosas, ou seja, um fator de

proteção vascular. Estudos in vitro mostraram que a adiponectina pode reduzir a

resposta inflamatória de células endoteliais por meio da inibição de TNF-α induzida

pela ativação do fator nuclear kappa B (NF-�B) (LIHN, et al., 2004; LEAL; MAFRA,

2013).

A concentração de adiponectina, ao contrário de outras adipocinas, é

reduzida na obesidade e na resistência à insulina. Hipoadiponectinemia está

associada a ocorrência de síndrome metabólica, DM2, hipertensão arterial,

dislipidemia, esteatose hepática e cardiopatias isquêmicas. A concentração de

adiponectina é inversamente proporcional a gravidade da estenose coronariana.

Níveis elevados de leptina e diminuídos de adiponectina são características de

35

síndrome metabólica e correlacionados com alto risco de doenças cardiovasculares

(HARA et al., 2007; LEAL; MAFRA, 2013).

A resistina tem estrutura semelhante à da adiponectina, sendo secretada

não apenas por adipócitos, mas por um grande número de células, em particular,

células imunocompetentes (COELHO et al, 2013). Foi nomeada pela sua capacidade

em induzir a resistência à insulina, através do aumento da expressão de enzimas

gluconeogênicas no fígado e diminuição da ativação de AMPK e expressão do

substrato 2 do receptor de insulina (STEPPAN et al., 2001; BANERJEE et al., 2004;

SHENG et al., 2008).

A resistina também pode lesionar diretamente o endotélio através da

indução da molécula de adesão celular-vascular-1 (VCAM-1) e síntese e expressão de

MCP-1 e secreção de endotelina 1 pelas células endoteliais (SHENG, et al., 2008). Os

alvos da resistina são fígado, tecido adiposo e músculo esquelético. Resistina

aumenta a produção de glicose hepática e diminui a absorção e o metabolismo dos

ácidos graxos no músculos esquelético. Presume-se que esta adipocina pode ser um

fator importante na patogênese de distúrbios metabólicos (MCTERNAN et al.,2006).

Alguns estudos mostram a associação entre resistina e obesidade ou

resistência insulínica (JAIN et al., 2009; OWECKI et al., 2011; CHEN et al., 2009).

Seus níveis foram reduzidos após uma dieta hipocalórica e na perda de peso induzida

por exercício (AZUMA et al., 2003) e sua expressão reduzida após cirurgia bariátrica

(EDWARDS et al., 2011), estando associada em alterações da adiposidade

(SCHWARTZ; LAZAR, 2011).

As adipocinas visfatina, vaspina e omentina estão envolvidas com melhora

da homeostase da glicose, a proteína de ligação do retinol-4 é prejudicial a esta

homeostase e os efeitos de apelina e chemerin são controversos. A soro amiloide A

está envolvida com efeito aterogênico e o inibidor 1 do ativador de plasminogênio

promove redução da fibrinólise. A zinco alfa 2 glicoproteina aumenta o gasto

energético e a lipólise (LEAL; MAFRA, 2013).

Na obesidade observa-se uma hiperplasia e hipertrofia dos adipócitos e

este aumento no número e tamanho dos adipócitos leva a um estresse celular,

hipóxia, aumento de espécies reativas de oxigênio e necrose adipocitária (VAN HAM

et al., 2014; LUMENG et al., 2007; MANTEIGA et al., 2013). A necrose dos adipócitos

é um evento crucial na liberação de quimiocinas, que atraem monócitos circulantes

para o sítio de inflamação, e a infiltração do tecido adiposo pelos macrófagos com

36

liberação de citocinas inflamatórias, faz com que a obesidade seja considerada um

estado de inflamação crônica (DEY et al., 2015; BAI; SUN, 2015)

Os macrófagos são divididos em duas classes, M1 (classicamente

ativados) e M2 (alternativamente ativados), que apresentam diferentes ativadores,

marcadores e funções. O macrófago M1 é ativado por meio de INF-γ e LPS, e

apresenta como marcador do fenótipo alta produção de IL-12 e IL-23, e baixa

produção de IL-10, com alta produção de óxido nítrico e espécies reativas de oxigênio,

enquanto o macrófago M2 é ativado por IL-4, IL-10, IL-13 e IL-33, e apresenta como

marcador do fenótipo alta produção de IL-10 e baixa de IL-12 e IL-23. M1 participa na

resistência a parasitas intracelulares e tumores, enquanto M2 contribui para o

remodelamento tecidual, promovendo angiogênese e progressão tumoral (BAI E SUN,

2015). Segundo LUMENG et al. (2007), na obesidade o fenótipo do macrófago do

tecido adiposo muda de um estado anti-inflamatório M2 para um estado pro-

inflamatório M1, contribuindo para o estado de inflamação crônica.

Citocinas produzidas por macrófagos que infiltram o TAB também são

consideradas adipocinas. As adipocinas pró-inflamatórias como proteína quimiotática

de monócitos (MCP-1) e TNF-α, e ácidos graxos saturados, liberados dos adipócitos

induzem NF-κB nos macrófagos e estes quando ativados passam também a liberar

MCP-1, recrutando monócitos da circulação para o tecido adiposo. Os macrófagos

infiltrados no tecido adiposo interagem de maneira parácrina com os adipócitos

através da produção de TNF-α, aumentando a produção de adipocinas pró-

inflamatórias e reduzindo a produção de adiponectina, que é anti-inflamatória (BAI;

SUN, 2015; SUGANAMI et al., 2005; KAMEI et al., 2006).

O TNF-α é considerado uma peça central no recrutamento e ativação de

células inflamatórias (CLARK; HOW, 2007), estando relacionado com a resistência à

insulina no músculo esquelético e tecido adiposo, pela fosforilação anormal de IRS-1

(substrato do receptor de insulina-1) e redução da translocação de GLUT-4

(LORENZO et al., 2008). Além disso, TNF-α induz a ativação de NF-κB, que regula

genes associados à inflamação (ANTUNES; DAN, 2009). O TNF-α está presente no

tecido adiposo inflamado em conjunto com outras citocinas pró-inflamatórias como IL-

6, IL-1β e IL-8 (AGUILAR-VALLES et al., 2015; FANTUZZI, 2005; TRAYHURN;

WOOD, 2004). O TNF-α também tem sido associado ao aumento da taxa de

aterosclerose (uma característica comumente aumentada na obesidade), devido a sua

capacidade de induzir a expressão de moléculas de adesão em células endoteliais e

de músculo liso da parede vascular (CHOY et al., 2001). Enquanto nos modelos

37

animais de obesidade o papel do TNF-α na inflamação crônica e na resistência

insulínica está claramente demonstrado (LI et al., 2003; LIANG et al., 2008), os dados

em humanos sugerem que outros fatores estão envolvidos (CAO, 2014). Nesse

sentido, estudos clínicos usando terapias anti-TNF-α não mostraram efeitos de

melhora da sensibilidade à insulina e da homeostase da glicose na obesidade

(AGUILAR-VALLES et al., 2015; WASCHER et al., 2011; YE; MCGUINNESS, 2013).

IL-6 é uma citocina pró-inflamatória produzida por monócitos, fibroblastos e

fração vascular estromal do TAB visceral (FAIN et al., 2004). Na ausência de

inflamação, o tecido adiposo parece contribuir com 15-30% da IL-6 circulante, o

músculo esquelético também pode liberar IL-6 (MOHAMED-ALI et al., 1997;

PEDERSEN et al., 2003) A IL-6 está envolvida com resistência insulínica, produção de

proteína C reativa no fígado e estimulação da secreção hepática de VLDL (LEAL;

MAFRA, 2013). As concentrações séricas de IL-6 estão elevadas na obesidade e são

reduzidas com a perda de peso (KOPP et al., 2003; MOSCHEN et al., 2011). Apesar

destas evidências o papel da IL-6 no desenvolvimento da obesidade e de doenças

relacionadas é controverso, estudos em camundongos deficientes de IL-6 apresentam

resultados inconsistentes no desenvolvimento de obesidade espontânea (DI

GREGORIO et al., 2004; WALLENIUS et al., 2002) e o uso de uma terapia com

anticorpos anti-IL-6 (tocilizumab) para o tratamento da artrite reumatoide induziu

ganho de peso (YOUNIS et al., 2013).

IL-10 e IL-1ra (antagonista do receptor de IL-1) são citocinas anti-

inflamatórias que também são secretadas pelo tecido adiposo (FAIN et al., 2004;

JUGE-AUBRY et al., 2003; POHL et al., 2009) e estão elevadas na obesidade

(ESPOSITO et al., 2003; MEIER et al., 2002). Enquanto IL-1ra antagoniza

competitivamente as ações da IL-1β em seu receptor, a IL-10 inibe a sinalização via

NF-κB e promove a indução do supressor da sinalização de citocinas-3 (SOCS-3)

(DINARELLO et al., 2012; SCHOTTELIUS et al., 1999; BERLATO et al., 2002).

Contudo, estão envolvidas na indução da resistência à leptina (MEIER et al., 2002). IL-

1ra inibe a anorexia induzida por leptina (LUHESHI et al., 1999).

As quimiocinas também estão envolvidas com a inflamação crônica da

obesidade, assim como com a resistência insulínica e DM2. A interação de MCP-1

com os receptores CCR2 é considerada chave para o desenvolvimento da resistência

insulínica associada à obesidade (OTA et al., 2013). O aumento da expressão de

MCP-1 no tecido adiposo aumenta a recrutamento de macrófagos, contudo, os dados

ainda são conflitantes em relação se a deficiência de MCP-1 pode reduzir o

38

recrutamento de macrófagos e melhorar a sensibilidade à insulina. A complexa

sinalização das quimiocinas pode ser a responsável pelos achados conflitantes. CCR2

é um receptor funcional que pode ser ativado por várias outras quimiocinas, como

MCP-2, MCP-3, CCL7 e CCL8, que também estão expressas no tecido adiposo do

obeso e que podem afetar o recrutamento de macrófagos (CHAVEY et al., 2009). As

quimiocinas CXCL1 e CXCL5 também estão envolvidas com o desenvolvimento da

obesidade e da hiperglicemia (CRAIG et al., 2014; CHAVEY et al., 2009).

O conhecimento dos eventos moleculares que regulam a diferenciação dos

pré-adipócitos e de células-tronco mesenquimais em adipócitos (adipogênese) é

importante para o entendimento da gênese da obesidade. A elevação da massa

adiposa ocorrida na obesidade é determinada pela hipertrofia e/ou hiperplasia dos

adipócitos (QUEIROZ et al., 2009). A hipertrofia dos adipócitos é considerada um

evento chave associado com a perda da sensibilidade a insulina (KLOTING; BLUHER,

2014). Indivíduos com hipertrofia adipocitária possuem elevados fatores pró-

inflamatórios, icluindo leptina, IL-6, IL-8 e MCP-1, reduzidos níveis de adiponectina e

IL-10, assim como aumento da lipólise (SKURT et al., 2007; KLOTING; BLUHER,

2014).

A hipertrofia de adipócitos maduros ocorre em resposta a ativação da

lipogênese e da lipólise, que pode variar de acordo com a incorporação ou liberação

de lipídeos, que depende, entre outros fatores, do estado nutricional do indivíduo,

gasto energético, influência de hormônios catabólicos ou anabólicos, atividade de

enzimas envolvidas nestes processos e da heterogeneidade existente entre os

diversos grupamentos adiposos do organismo. A hiperplasia, por outro lado, depende

da diferenciação dos pré-adipócitos em adipócitos, denominada adipogênese

(JENSEN et al., 1997). Durante muito tempo acreditou-se que adultos apresentavam

um número fixo de adipócitos e que as alterações na massa adiposa ocorriam

secundariamente a alterações no volume de gordura dessas células. No entanto,

adipócitos adultos exibem renovação intensa e constante, sabendo-se atualmente, que

o potencial de gerar novas células persiste durante toda a vida (SPALDING et al.,

2008).

Células tronco mesenquimais multipotentes, residentes no estroma do

tecido adiposo, tornam-se adipócitos quando perdem a capacidade de se diferenciar

em outras linhagens mesenquimais, tornando-se “comprometidas” com a linhagem

adipocitária. Esta é a fase conhecida como determinação ou comprometimento da

diferenciação do adipócito. Segue a diferenciação terminal, onde os pré-adipócitos

39

adquirem as características de adipócitos maduros, acumulado gotas de lipídeos e

respondendo a hormônios como a insulina (AILHAUD et al., 2004).

Apesar de vários aspectos moleculares da adipogênese ainda não serem

conhecidos, vários fatores envolvidos nesse processo já foram identificados. Como

estimuladores da adipogênese temos o receptor ativado por proliferadores de

peroxissoma γ (PPAR-γ), proteinas estimuladoras de ligação a CCAAT α, β e γ

(C/EBPα, C/EBPβ, C/EBPδ), membros da familia STAT (transdutores e ativadores de

transcrição), proteina 1 ligadora do elemento regulatório de esterol (SREBP1), fator de

crescimento semelhante a insulina 1 (IGF-1), fator estimulante de colonia de

macrófagos, ácidos graxos, prostaglandinas, glicorticóides, proteinas Bmal1 e Rev-

erbα e fator de células B precose 1 (EBf1), e como inibidores da adipogênese temos

proteinas Wingless e INT-1 (Wnts), proteínas de ligação a GATA 2 e 3, fatores

semelhantes a Kruppel (KLFs) e fatores reguladores de interferon (IRF3 e IRF4) (ALI

et al., 2013; LEFTEROVA; LAZAR, 2009; SARJEANT; STEPHENS, 2012; MAX et al.,

2015).

No centro desta rede estão os principais fatores adipogênicos, as proteínas

C/EBPs e o receptor PPARγ. C/EBPβ e δ induzem a expressão de C/EBPα e de

PPARγ. Uma vez ativados, C/EBPα e PPARγ se autorregulam positivamente para

permanecerem expressos, ou seja, retroalimentam a indução da sua própria

expressão, apesar da redução da expressão de C/EBPβ e -δ. PPARγ e C/EBPα

ativam a transcrição de genes marcadores da diferenciação terminal dos adipócitos,

como a proteína de ligação de ácidos graxos (FABP) 4, leptina, adiponectina,

transportador de glicose dependente de insulina (GLUT-4), entre outros. O PPARy é

considerado o regulador mestre da adipogênese, sem ele, as células precursoras são

incapazes de expressar qualquer aspecto conhecido do fenótipo dos adipócitos. Por

outro lado, as células deficientes em C/EBPα apesar de terem a capacidade de

diferenciação de adipócitos, são resistentes a insulina (MA et al., 2015; ALI et al.,

2013; FARMER, 2006; ROSEN et al., 2002).

Os receptores PPAR pertencem a um subgrupo da superfamília de

receptores nucleares, do qual três diferentes tipos foram descritos até o momento,

PPARα, PPARδ e PPARγ. Embora compartilhem propriedade estruturais comuns,

apresentam funções e distribuição diferentes entre os tecidos. Nos adipócitos, o

PPARγ regula a expressão de numerosos genes envolvidos no metabolismo de

lipídeos, incluindo aP2, acil-CoA sintetase e lipoproteína lipase (LPL). Também

controla a expressão da proteína transportadora de ácidos graxos 1 (FATP-1) e

40

translocase de ácido graxo/CD36 (FAT/CD36), ambos envolvidos na captação de

lipídeos pelos adipócitos (GRYGIEL-GÓRNIAK, 2014; TAVARES et al., 2007).

1.1.4. Tratamento da obesidade

O sucesso no tratamento da obesidade depende da magnitude da redução

do peso e diminuição dos fatores de risco presentes no início do tratamento. A eficácia

da intervenção terapêutica é atingida quando há redução maior ou igual a 1% do peso

corporal por mês, obtendo pelo menos 5% em 3 a 6 meses. Estudos mostram que a

diminuição de 5 a 10% do peso, reduz significativamente os fatores de risco para

diabetes e doenças cardiovasculares. Inicialmente o tratamento da obesidade

fundamenta-se em modificações do estilo de vida, orientações dietoterápicas, aumento

da atividade física e mudanças comportamentais (ABESO, 2010).

As intervenções no estilo de vida e na dieta objetivam uma redução no

consumo de energia e um aumento do gasto energético através de uma dieta

balanceada e de um programa de atividade física. As dietas são baseadas na redução

da ingestão de calorias para criar um balanço energético negativo. Estas podem

produzir uma perda de peso em curto tempo, mas a manutenção desta perda de peso

é frequentemente difícil. A prática de exercícios associada a uma dieta balanceada

devem ser parte permanente de um estilo de vida (ZHANG et al., 2014).

No entanto, algumas pessoas não têm resultados satisfatórios com o

tratamento conservador, sendo então, considerado o uso de medicamentos (ABESO,

2010).

O uso de medicamentos no tratamento da obesidade e sobrepeso está

indicado quando houver falha do tratamento não farmacológico, em pacientes com

IMC ≥ a 30 kg/m²; com IMC ≥ a 25 kg/m² associado a outros fatores de risco, como a

hipertensão arterial, DM2, hiperlipidemia, apneia do sono, osteoartrose, gota, entre

outras; ou com circunferência abdominal maior ou igual a 102cm (homens) e 88cm

(mulheres) (ABESO, 2010).

Atualmente no Brasil somente dois medicamentos estão registrados para o

tratamento da obesidade, sibutramina e orlistate.

A Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) No. 52, de 6 de outubro de

2011, da Anvisa que proibia o uso das substâncias anfepramona, femproporex e

41

mazindol, seus sais e isômeros, bem como intermediários, foi invalidada pelo Decreto

Legislativo 273/2014, aprovado pelo Congresso Nacional em setembro de 2014. Assim

sendo, a Diretoria Colegiada da Anvisa aprovou o novo regulamento técnico referente

a anorexígenos no País, a RDC No. 50/2014, publicada no Diário Oficial da União de

26 de setembro de 2014. A RDC No. 50/2014 prevê que as empresas interessadas em

comercializar medicamentos contendo mazindol, femproporex e anfepramona deverão

requerer novo registro à agência. A análise técnica dos pedidos levará em

consideração a comprovação de eficácia e segurança dos produtos. Segundo a

norma, as farmácias só poderão manipular esses medicamentos quando houver algum

produto registrado na Anvisa. Quando as substâncias tiverem registro, tanto o produto

manipulado quanto o produto registrado passarão a ter o mesmo controle da

sibutramina.

A sibutramina é um inibidor da recaptação da serotonina e da

noradrenalina no SNC, com efeitos anorexígenos e sacietógenos. O tratamento com

sibutramina durante um ano pode reduzir o peso em média 4,5 kg (ARTERBURN

et al., 2004). Além disso, pode melhorar os efeitos adversos do perfil bioquímico

associado a obesidade, tais como glicemia, insulina, triglicerídeos, colesterol total,

lipoproteína de baixa densidade (LDL) e de alta densidade (HDL) (Nisoli e Carruba,

2000). Também está associada com a redução da circunferência abdominal, um

preditor de doenças cardiovasculares (CHEUNG et al., 2013).

Os efeitos colaterais mais comuns da sibutramina incluem dor de cabeça,

boca seca, insônia e constipação (NISOLI; CARRUBA, 2003). Aumenta a frequência

cardíaca e a pressão arterial em cerca de 2 mmHg em alguns pacientes (NISOLI;

CARRUBA, 2000). O efeito da sibutramina sobre a pressão sanguínea depende do

balanço entre a estimulação periférica e central do sistema nervoso simpático

(HEUSSER et al., 2006). Devido à preocupação com a pressão arterial, a sibutramina

não deve ser utilizada em pacientes com risco de doenças cardíacas e acidente

vascular cerebral (CHEUNG et al., 2013).

O FDA (Food and Drug Administration) aprovou o uso da sibutramina em

1997, enquanto a ANVISA aprovou seu uso no Brasil em 2008. A partir de suspeitas

relativas ao risco cardiovascular, a Agência Europeia de Medicamentos (EMA)

solicitou ao fabricante Abbott um estudo em que fosse avaliado o risco da sibutramina

entre os usuários obesos que apresentavam um risco prévio cardiovascular. O estudo,

denominado SCOUT (Sibutramine Cardiovascular Outcomes Trial), durou 6 anos, e

seu relatório final foi publicado em setembro de 2010, no New England Journal of

42

Medicine, e mostrou 16% de aumento do risco CV (como Infarto Agudo do Miocárdio e

Acidente Vascular Cerebral) entre usuários de sibutramina. Em janeiro de 2010, a

EMA determinou o cancelamento do registro da sibutramina na Europa devido aos

riscos cardiovasculares demonstrados pelo estudo SCOUT (JAMES et al., 2010). O

FDA em outubro de 2010, anunciou que a empresa retiraria voluntariamente a

sibutramina dos Estados Unidos. A mesma medida foi tomada no Canadá e Austrália.

Contudo no Brasil está permito o seu uso até hoje (ANVISA, 2010).

A comercialização da sibutramina é regulada pela RDC No. 52, de 6 de

outubro de 2011, a qual deve ser realizado com retenção de receita, assinatura de

termo de responsabilidade do prescritor e do termo de consentimento pós-informação

por parte do usuário.

O Orlistate é um inibidor potente das lipases pancreática e gástrica, que

são necessárias para a hidrólise da gordura da dieta em ácidos graxos livres e

monoacilgliceróis, repercutindo deste modo na redução de aproximadamente 30% da

absorção da gordura ingerida na dieta (KAKKAR; DAHIYA, 2015). Uma meta analise

de 16 ensaios clínicos controlados, randomizados, duplo-cegos, placebo controlados

envolvendo 10.631 pacientes, mostrou que a terapia com orlistate associada a uma

dieta de perda de peso por um período de 1 a 4 anos, mostrou 2,9% maior perda de

peso comparado ao placebo (KAKKAR; DAHIYA, 2015).

Os efeitos adversos do orlistate advém de seu próprio mecanismo de ação

e incluem incontinência fecal, flatulência com perda fecal, urgência fecal, evacuação

oleosa e diarréia (YEN; EWALD, 2012). Aproximadamente 5% dos pacientes

descontinuam seu uso pelos seus efeitos adversos. Além de reduzir os níveis de

vitaminas A, D e E, sendo necessário suplementação destas vitaminas (CHEUNG et

al., 2013).

Em 2010 o FDA aprovou uma revisão na bula do orlistate incluindo novas

informações sobre casos de severa injuria hepática com necrose de hepatócitos e

insuficiência hepática aguda. Esta revisão foi baseada na observação de 13 casos

severos de injúria hepática envolvendo o uso do orlistate (KAKKAR E DAHIYA, 2015).

O FDA tem aprovado quatro drogas para o tratamento da obesidade,

orlistate, lorcaserina, fentermina/topiramato e naltrexone/bupropriona.

Lorcaserina (Belviq®) é um agonista altamente seletivo para os receptores

da serotonina 5-HT2C. Seus principais efeitos adversos são cefaleia, infecções do trato

43

respiratório superior, nasofaringite, tontura, náuseas, fadiga, diarreia, infecção do trato

urinário, constipação e boca seca (KAKKAR; DAHIYA, 2015). Seu uso não está

aprovado na Europa e no Brasil. A EMA a retirou do mercado por mostrar sua

associação com carcinogenicidade, desordens psiquiátricas (como depressão) e

problemas com as válvulas cardíacas (EMA, 2013).

A combinação de Fentermina/Topiramato (Qsymia®) foi aprovada pelo FDA

em 2012. Fentermina é uma amina simpatomimética que aumenta a transmissão

adrenérgica reduzindo o apetite e aumentando o gasto energético. O topiramato é um

anticonvulsivante cujo mecanismo de perda de peso não está claro, mas reduz o

apetite e aumenta a saciedade por uma ação modulatória sobre o GABA, canais de

cálcio voltagem dependentes e canais de sódio e receptores do glutamato (KAKKAR;

DAHIYA, 2015). Os principais efeitos adversos da associação são parestesias, boca

seca, constipação, disgeusia e insônia. Além de risco aumentado de defeitos

congênitos devendo seu uso ser descontinuado na gravidez (ALLISON et al., 2012). A

EMA rejeitou o início da sua comercialização pela sua associação com eventos

cardiovasculares, psiquiátricos (depressão e ansiedade), cognitivos (problemas com

memória e atenção) e risco de teratogenicidade (EMA, 2012). A associação

Fentermina/Topiramato não está aprovada para uso no Brasil.

Na associação Bupropiona/Natrexone (Contrave®), a bupropiona, um

antidepressivo, aumenta a neurotransmissão noradrenérgica e dopaminérgica via

inibição da sua recaptação, enquanto a naltrexona é um antagonista dos receptores

opióides. Seu mecanismo como agente antiobesidade é pouco conhecido mas estudos

indicam que agem a nivel hipotalâmico agindo sobre neurônios pró-opiomelanocortina

(POMC). Os principais efeitos adversos da associação são nausea, constipação,

cefaléia, vômito, tontura, insônia, boca seca e diarréia (KAKKAR; DAHIYA, 2015). A

empresa farmacêutica Takeda inicialmente submeteu a associação para aprovação

em 2010, a qual foi rejeitada pelo FDA em 2011 com base nos riscos

cardiovasculares. A Takeda reaplicou a solicitação ao FDA adicionando dados

relacionados a segurança cardiovascular e assim aprovando seu uso em setembro de

2014. Contudo a aprovação de seu uso está dependente da realização de vários

estudos pós-comercialização incluindo o de avaliação do risco cardiovascular, de

segurança e eficácia em crianças, de dosagem em pacientes com insifuciência renal e

hepática e de interações medicamentosas (FDA, 2014). Em dezembro de 2014 a EMA

aprovou o uso da associação na Europa com o nome comercial de Mysimba® (EMA,

2014). Seu uso não está aprovado no Brasil.

44

Dentre as drogas que se encontram em ensaios clínicos para futuro uso no

tratamento da obesidade temos a Liraglutida (análogo GLP-1), Exenatida (análogo

GLP-1), Cetilistate (inibidor de lipase gástrintestinal e pancreática), Velneperite

(inibidor do receptor do neuropeptideo Y5), Tesofensina (inibidor da recaptação de

serotonina, dopamina e noradrenalina), Metreleptina (agonista do receptor de leptina),

Bupropriona SR + Zonisamida SR (inibidor da recaptação de dopamina e

noradrenalina + antieplético que aumenta a neurotransmissão dopaminérgica e

serotoninérgica) e Obinepitida (agonista dos receptores neuropeptideo Y2/Y4)

(KAKKAR; DAHIYA, 2015).

O controle da obesidade mórbida (IMC ≥40kg/m2) pode ser feito através da

cirurgia bariátrica (gastroplastia vertical com bandagem, banda gástrica inflável e

gastroplastia com derivação gastro-jejunal) que altera os hormônios do trato

gastrintestinal e a atividade no SNC e representa a única forma de tratamento da

obesidade com efetividade a longo prazo (SAMUEL et al., 2006). Contudo, as

consequências pós-operatórias da cirurgia bariátrica incluem deficiência nutricional

(vitamina B12, folato, tiamina, vitamina D e vitamina E) que pode levar a complicações

neurológicas, refluxo gastroesofágico, problemas renais e psicológicos (como

depressão) e problemas de saúde bucal (como cárie dentária, xerostomia, erosão e

reabsorção óssea) (MOURA-GREC et al., 2012; LANDAIS, 2014; MATINI et al., 2014).

A manipulação da microbiota intestinal é uma nova abordagem para o

tratamento da obesidade e de outras desordens metabólicas incluindo o DM2

(DIBAISE et al., 2012; SANMIGUEL et al., 2015). Porém em relação ao tratamento da

obesidade, até o momento existe apenas um estudo clínico publicado do seu uso para

o tratamento da síndrome metabólica. Um estudo clínico controlado, duplo cego,

randomizado, com 18 homens com síndrome metabólica submetidos ao transplante de

microbiota fecal a partir de suas próprias fezes ou de fezes de doadores magros,

mostrou que após 6 semanas da infusão da microbiota, os homens que receberam

fezes de doadores magros desenvolveram significativo aumento da sensibilidade à

insulina periférica e hepática. Este efeito foi possivelmente explicado pelo aumento da

produção de ácidos graxos de cadeia curta, como o butirato, produzidos pelas

bactérias do doador magro, e assim reestabelecendo a fisiologia fecal normal (VRIEZE

et al., 2012; AGUIRRE; VENEMA, 2015).

45

1.2. Plantas Medicinais e seu potencial Antiobesida de

Muitas plantas medicinais possuem uma longa história de uso na medicina

tradicional para redução do sobrepeso e da obesidade. HASANI-RANHJBAR e

colaboradores, em 2009, publicaram uma revisão sobre a eficácia e a segurança de

produtos naturais medicinais utilizados no tratamento da obesidade em animais e

humanos. Todos os estudos em humanos e animais tomaram como parâmetros a

mudança nas medidas antropométricas (como peso corporal e circunferência da

cintura-quadril), a gordura corporal, a quantidade de alimentos consumidos e o apetite.

Foram incluídos 77 estudos (19 humanos e 58 animais). Os estudos realizados com

Cissus quadrangularis, Sambucus nigra, Asparagus officinalis, Garcinia atroviridis,

efedrina, cafeína e Slimax (extrato de várias plantas, incluindo Zingiber officinale e

Bofutsushosan) mostraram uma diminuição significativa no peso corporal. Em 41

estudos com animais foram encontrados perda de peso significativa ou inibição de

ganho de peso. Não foram observados efeitos adversos significativos ou mortalidade,

exceto em estudos com suplementos contendo efedrina, cafeína e Bofutsushosan.

O mesmo grupo publicou uma nova revisão em 2013 (HASANI-

RANHJBAR et al., 2013) sobre o mesmo tema, contudo agora abordando pesquisas

apenas em humanos, utilizando como fonte de dados o PubMed, Scopus, Google

Scholar, Web of Science e IranMedex, para estudos publicados entre 2008 e 2012.

Estudos com Nigella sativa, Camellia sinensis, Crocus sativus L, Laminaria Digitata,

Xantigen® (ácido punicico e fucoxantina), azeite de oliva virgem, chá verde

enriquecido com catequina, Monoselect Camellia® (extrato padronizado de Camellia

sinensis), chá de Oolong (chá verde azulado), Yacon syrup® (Smallanthus

sonchifolius), Irvingia gabonensi, Weighlevel® (Alchemilla vulgaris, Olea

europaea, Mentha longifolia e Cuminum cyminum), RCM-104® (Camellia sinensis,

Cassia obtusifolia e Sophora japonica), pistache, fibras do Psyllium (Plantago

psyllium), chá preto chinês, Hippophae rhamnoides, bilberries (Vaccinium myrtillus)

mostraram significativa redução do peso corporal. Somente o alginato de alga marron

e Laminaria digitata causaram inchaço abdominal e infecção do trato respiratório

superior como efeitos colaterais, nenhum outro efeito adverso significativo foi descrito

nos estudos. Segundo os autores, Nigella sativa, Camellia synensis, chá verde e o chá

preto chinês foram os que mostraram melhores efeitos antiobesidade.

VERMAAK et al (2011) publicaram uma revisão descrevendo 50 plantas

comercialmente importantes e que foram investigadas em estudos pré-clínicos e

clínicos. Dentre estas, os autores chamam atenção para Cassia mimoisoides,

46

Dioscorea nipponica, Glycyrrhiza glabra e Panax ginseng que mostraram uma

promissora atividade antiobesidade.

HIRAI et al. (2010) descrevem um número de componentes alimentares,

que por mecanismos dependentes e independentes do receptor PPAR-γ, previnem as

respostas inflamatórias induzidas pela obesidade. Dentre aqueles cujas ações

dependem do receptor PPAR-γ são citados a capsaicina, o ácido abiético (terpeno), o

ácido dihidroabiético (terpeno) e o aurapteno (cumarina). Dentre aqueles cujas ações

são independentes do receptor PPAR-γ temos os flavonóides, como a luteolina,

naringenina e cianidina 3-glicosideo e saponinas como a diosgenina. Vários

constituintes fitoquímicos de plantas medicinais tem sido estudados quanto a

capacidade de inibir lipases, e deste modo, serem úteis para o tratamento da

obesidade. Dentre esses constituintes podemos citar saponinas, polifenóis e terpenos

(BIRARI; BHUTANI, 2007).

Os produtos naturais que possuem efeitos antiobesidade podem ser

divididos em cinco categorias de acordo com seu mecanismo de ação, os que

produzem (1) redução da absorção de lipídeos, (2) diminuição da ingesta calórica, (3)

aumento do gasto energético, (4) diminuição da diferenciação e proliferação de pré-

adipócitos e (5) diminuição da lipogênese e aumento da lipólise (YUN, 2010).

Uma grande variedade de plantas possui efeito inibitório sobre a lipase

pancreática, como Aronia melanocarpa L., Nelumbo nucifera, Cudrania tricuspidata,

(WORSZTYNOWICZ et al., 2014, JEONG et al.,2014; LIU et al., 2013) e como

constituintes químicos inibidores de lipase temos saponinas, polifenóis, flavonóides e

cafeína (KIM; KANG, 2005; HAN et al., 2006; MORENO et al., 2006; SHIMODA et al.,

2006, LA GARZA et al., 2011).

Como exemplos de plantas que reduzem o apetite temos Kaempferia

parviflora (SHIMADA et al., 2011), Hoodia gordonii (VAN HEERDEN, 2008), Camellia

sinensis (HAMANO et al., 2011; MOON et al., 2007; NAGAO et al., 2005; WOLFRAM

et al., 2006), Caralluma fimbriata (KURIYAN et al., 2007), Citrus aurantium (KLONTZ

et al., 2006), Phaseolus vulgaris (BAINTNER et al., 2003; CELLENO et al., 2007) e

Robinia pseudoaccacia (BAINTNER et al., 2003), cujos constituintes são

principalmente glicosídeos, saponinas e flavonoides.

Numerosos produtos naturais têm sido propostos como tratamento para

perda de peso através do aumento do gasto energético, incluindo cafeína e capsaicina

(XU et al., 2015; OHYAMA et al., 2015). Camellia sinensis (chá verde), Capcisum

47

annuum (KIM et al., 2014), Pinellia ternata (KIM et al., 2006), Panax ginseng (CHO et

al., 2014) são exemplos de plantas com este mecanismo de ação.

A diminuição da diferenciação e proliferação de pré-adipócitos foi

observada em diversos estudos envolvendo plantas. Dentre estes podemos citar:

Morus alba L (YANG et al., 2014), Coccinia grandis L. Voigt (BUNKRONGCHEAP et

al., 2014), Aspergilllus awamori (HUANG et al.,2014), Daphne genkwa Siebold (KIM et

al.,2014), Momordica charantia, Centella asiática e Morinda citrifolia (SAHIB et al.,

2011).

Nelumbo nucifera (VELUSAMI et al., 2013), Cinnamoni cassiae (SHENG et

al. 2008), Cordyceps militaris (KIM et al., 2014) e Scutellaria baicalensis (LU et al.,

2013) são exemplos de plantas com efeito regulador sobre o metabolismo lipídico.

1.2.1. Terpenos e seu potencial Antiobesidade

Os terpenos são uma família de compostos quimicamente diversos

achados na natureza. Muitos terpenos produzidos por plantas possuem importantes

atividades farmacológicas, por exemplo, anti-tumoral, coleréticas, sedativas,

analgésicas, antiinflamatórias, antihelmínticas, cardioprotetoras, antioxidantes

antialérgicas, gastroprotetora, hipoglicêmica, antihipertensivas e antimicrobiana (VAN

UUM et al., 2002; DE LAS HERAS; HORTELANO, 2009; ARRUDA et al., 2009;

PAPPAS E SCHAICH, 2009; DOUGLAS et al., 2010; TÜRK et al., 2010; PERTINO et

al., 2010; XI et al., 2010).

Uma diversidade de vegetais, normalmente utilizados como alimentos ou

com aplicação medicinal, apresentam triterpenos em sua constituição química,

usualmente variando entre os esqueletos ursano, oleonano e lupano, contendo

normalmente um ou dois grupos hidroxilas (FRIGHETOO, 2005).

Dentre os estudos com triterpenos como agentes antiobesidade

chamamos atenção para os triterpenos pentacíclicos, classe a qual pertence a mistura

de alfa e beta-amirina. Podemos citar o ácido 18β-glicirretínico (MOON et al., 2012;

CLASSEN-HOUBEN et al., 2009), ácido betulínico (KIM et al., 2012; DE MELO et al.,

2009; CHUNG, 2006; LEE, 2006), ácido ursólico (RAO et al., 2011; LI et al., 2010;

LEE, 2006; NA, 2006; ZHANG et al., 2006), ácido oleanólico (KIM et al., 2013; DE

48

MELO et al., 2010; SUNG et al., 2010; ZHANG et al., 2008), ácido glicirrizico (EU et

al., 2010) e ácido 3-acetil-11-ceto-boswellico (LIU et al., 2013).

Triterpenos de plantas são potenciais inibidores de PTP1B (NA et al.,

2006; THUONG et al., 2008), como triterpenos do grupo do oleonano (UDDIN et al.,

2014). A proteína tirosina fosfatase 1B (PTP1B) tem um papel no diabetes e na

obesidade como uma reguladora negativa, desfosforilando o receptor de insulina

ativado pela ligação com a insulina, assim como o seu substrato (substrato do receptor

de insulina-IRS) promovendo resistência insulinica, e desfosforilando a Janus cinase 2

(JAK2) na sinalização da leptina e desse modo envolvida na resistência à leptina

(CHENG et al., 2002; ELCHEBLY et al., 1999).

Nosso laboratório demonstrou a atividade dos triterpenos pentacíclicos,

ácido oleanólico, ácido betulínico e ácido ursólico, em modelo de obesidade induzida

por dieta hipercalórica em camundongos. Os animais que receberam o ácido

oleanólico (10mg/kg, v.o.) durante 15 semanas, demonstraram melhora do teste oral

de tolerância a glicose, diminuição do peso corporal, da adiposidade visceral, da

glicose e lipídeos sanguíneos, assim como elevaram os níveis sanguíneos de leptina e

reduziram os de grelina, quando comparados aos animais que receberam apenas a

dieta hipercalórica (DE MELO et al., 2010). Enquanto animais que receberam ácido

betulínico (50mg/L na água de beber), durante 15 semanas, demonstraram redução do

peso corporal, da gordura visceral e dos níveis séricos de glicose, triglicérides e

colesterol total e significativo aumento dos níveis séricos de insulina e leptina, quando

comparados aos animais que receberam apenas dieta hipercalórica (DE MELO et al.,

2009). Nos animais que receberam o ácido ursólico (50mg/L na água de beber)

durante 15 semanas, houve redução do ganho de peso corporal e na acumulação de

gordura visceral abdominal, além de redução nos níveis de grelina, colesterol e

triglicerídeos plasmáticos (RAO et al., 2011).

1.2.2. Resina do Protium heptaphyllum e a mistura de triterpenos alfa e beta-

amirina

A espécie Protium heptaphyllum March (Burseraceae) (Figura 1),

conhecida popularmente como almecegueira, é encontrada em todo o Brasil, e em

países como Suriname, Colômbia, Venezuela e Paraguai. Esta espécie exsuda uma

resina oleosa e amorfa, cujas aplicações gerais vão desde a fabricação de vernizes e

tintas, na calafetagem de embarcações, em cosméticos e como repelente de insetos.

49

Apresenta alguns usos populares como cicatrizante, expectorante, antiulcerogênico e

antiinflamatório (VIEIRA-JÚNIOR et al., 2005; LORENZI, 2008).

VIEIRA-JÚNIOR et al. (2005) identificaram na resina sete constituintes

triterpênicos, distribuídos em três misturas, alfa e beta-amirina (45,25%), breina e

maniladiol (9,5%), alfa e beta-amirinona e lupenona (1,25%), sendo a mistura de alfa e

beta-amirina o principal constituinte. A proporção entre alfa e beta-amirina é de 63:37

(Figura 2).

Os primeiros artigos científicos sobre a atividade biológica de P.

heptaphyllum foram publicados por FRISCHKORN et al. (1978) e SIANI et al. (1999)

com a identificação das atividades cercaricida e anti-inflamatória do óleo essencial.

Enquanto o primeiro trabalho com a identificação de efeito farmacológico da resina da

almecegueira pelo nosso grupo de pesquisa foi publicado em 2004, com a

identificação de sua atividade gastroprotetora e anti-inflamatória (OLIVEIRA et al.,

2004). Para o seu óleo essencial ainda foram identificadas as atividades acaricida

(WENDEL et al., 2007), gastroprotetora (ARAUJO et al., 2011) e antidermatofitica

(HOUËL et al., 2015), enquanto para o seu extrato foram identificadas as atividades

antimicrobiana (VIOLANTE et al., 2012) e citostática contra células tumorais (TAYLOR

et al., 2013).

Nosso laboratório mostrou que a mistura de alfa e beta-amirina possui

propriedades gastroprotetora (OLIVEIRA et al., 2004a), antipruriginosa (OLIVEIRA et

al., 2004b), antinociceptiva visceral (LIMA-JÚNIOR, 2006), hepatoprotetora (OLIVEIRA

et al., 2005), inibidora da expressão de receptor NK-1 em modelo de cistite

hemorrágica (LIMA-JÚNIOR et al., 2007), antinociceptiva em dor orofacial (HOLANDA

PINTO et al., 2008a), antiinflamatória em modelo de periodontite (HOLANDA PINTO et

al., 2008b) e em modelo de pancreatite aguda (MELO, 2009). Esses efeitos

farmacológicos envolvem mecanismos como ação antioxidante, bloqueio da liberação

e/ou do receptor de substância P, abertura de canais iônicos (K+ATP), ativação de

receptores opióides, ativação de receptores vanilóides (TRPV1), ação estabilizante de

membrana de mastócitos, inibição de citocinas inflamatórias (TNF-α, IL-6, IL-1β),

inibição de enzimas amilase e lipase pancreáticas.

VITOR et al. (2009) demonstraram a atividade anti-inflamatória de alfa- e

beta-amirina, isolada do Protium kleinii, em modelo de colite ulcerativa induzida por

TNBS, pela supressão de IL-1β e de COX-2 e aumento de IL-10, possivelmente por

inibição da sinalização pelo NF-κB e CREB. Otuki et al. (2005a,b) demonstraram a

50

atividade antinociceptiva da mistura de alfa e beta-amirina, isolada do P. kleinii,

envolvendo a participação de PKC e PKA, e a atividade anti-inflamatória tópica de alfa-

amirina, cujo mecanismo envolve a supressão de PGE2 por supressão da expressão

de COX-2 e da ativação de NF-κB (MEDEIROS et al., 2007).

ARAGÃO et al. (2006) demonstraram a atividade ansiolítica e

antidepressiva da mistura de alfa e beta-amirina, assim como sua atividade analgésica

e anti-inflamatória (ARAGÃO et al., 2007) e anticonvulsivante (ARAGÃO et al., 2015).

Beta amirina melhorou o comportamento geral do sono no modelo de sono induzido

por pentobarbital em camundongos pela ativação da via gabaérgica (JEON et al.,

2015).

KWEIFIO-OKAI et al. (1992; 1994 a,b) demonstraram a sua atividade

anlipoxigenase de beta-amirina e a atividade antiartrítica de alfa-amirina.

As propriedades anti-inflamatória e antinociceptiva de alfa e beta-amirina

estão envolvidas com sua habilidade de interagir com o sistema canabinóide, onde

sua administração, por via oral, de forma preventiva ou curativa, exibiu importante

atividade anti-inflamatória no modelo de colite por DSS, e este efeito ocorreu pela sua

interação com o sistema canabinoide modulando a ativação do receptor CB1 e

infrarregulando as hidrolases endocanabinóides (CHICCA et al., 2012; DA SILVA et

al., 2011; MATOS et al., 2013).

Nosso grupo demonstrou o potencial hipoglicêmico e hipolipidêmico de

alfa- e beta-amirina, ao reduzir a glicemia (de jejum e no teste oral de tolerância à

glicose) e a insulina, reduzir os lipídeos séricos (triglicerídeos, colesterol total, VLDL e

LDL), além de preservar a integridade das células beta-pancreáticas em modelo de

hiperglicemia e hiperlipidemia por estreptozotocina (SANTOS et al., 2012).

A beta-amirina reduziu de maneira concentração dependente a produção

de mediadores inflamatórios (PGE2 e IL-6) e a ativação de NF-�B in vitro (KRISHNAN

et al., 2014), além de exercer atividade analgésica e anti-inflamatória indiretamente via

mecanismo canabinomimético, pela inibição da degradação do endocanabinoide 2-AG

sem interagir diretamente com receptores canabinóides (CHICCA et al., 2012).

Enquanto alfa-amirina possui um potencial modulatório contra o estresse oxidativo

hepático induzido pelo CCl4 pelo bloqueio do citocromo P450 (SINGH et al., 2014).

51

Figura 1. Fotografia da espécie Protium heptaphyllum March, folhas, frutos e

sementes (Fonte: Lorenzi, 2008).

52

alfa-amirina

beta-amirina

Breina

maniladiol

alfa-amirenona

beta-amirenona

Lupenona

Figura 2. Estrutura química dos constituintes triterpênicos da resina de P.

heptaphyllum

53

2.0. Justificativa

A obesidade e suas desordens metabólicas associadas tornaram-se um

dos grandes obstáculos para o aumento da expectativa média de vida. Os

medicamentos tradicionais para o tratamento da obesidade com orlistat, rimonabanto e

sibutramina, assim como as medicações mais atuais, fentermina/topiramato e

naltrexone/bupropiona, embora estejam associados com uma redução de peso e a

uma melhora nas alterações metabólicas, nenhum desses fármacos demonstrou

reduzir a mortalidade associada à obesidade (LING et al., 2013; SHIN; GADDE, 2013).

Deste modo, a pesquisa com produtos naturais, na tentativa de identificar uma nova

opção terapêutica para o tratamento da obesidade, tem recebido bastante atenção.

Triterpenos pentacíclicos pertencentes aos grupos ursano, oleanano e

lupano, tais como ácido aleanólico, ácido betulínico e ácido ursólico, mostraram

inibição de diferentes sistemas enzimáticos intimamente relacionados ao

metabolismo/absorção de carboidratos e lipídios, assim como atividade sensibilizante

e insulinomimética. Assim, a mistura de triterpenos alfa- e beta-amirina (63:37),

representada por 63% ao grupo ursano e 37% ao grupo oleanano, poderia também

modular a adipogenicidade, representando novas moléculas dotadas de relevante

atividade contra a obesidade ou atuando como coadjuvantes no tratamento da

deposição excessiva de gordura corporal.

54

3.0. Objetivos

3.1. Objetivo Geral

� Investigar o possível efeito antiobesidade da resina do Protium heptaphyllum e de

seu constituinte majoritário, a mistura de triterpenos pentacíclicos alfa e beta-

amirina in vivo e sobre a adipogênese in vitro.

3.2. Objetivos Específicos

� Avaliar o efeito antiobesidade preventivo da resina de P. heptaphyllum (RPH) e da

mistura de alfa e beta-amirina (AMI) na obesidade induzida por dieta hipercalórica

em camundongos, por 15 semanas, através da mensuração do consumo de água e

ração, do peso corporal, da gordura abdominal e do peso do fígado e da avaliação

bioquímica de glicemia, perfil lipídico e função hepática.

� Investigar se o efeito antiobesidade preventivo de RPH e de AMI na obesidade

induzida por dieta hipercalórica em camundongos, por 15 semanas, correlaciona-se

com:

o A redução da absorção de carboidratos e gorduras pela determinação

de seu efeito sobre as enzimas amilase e lipase.

o A ação sobre o hormônio gastrintestinal (grelina) e adipocitário (leptina)

que regulam o comportamento de alimentar.

o O efeito anti-inflamatório, através da avaliação plasmática de TNF-α, IL-

6 e MCP-1.

o A melhora da resistência insulínica, através da determinação dos níveis

plasmáticos de insulina e resisitina.

o Um efeito sobre a hipertrofia dos adipócitos e sobre o PPARγ e

Lipoproteina Lipase (LPL) do tecido adiposo visceral, através da

mensuração da área dos adipócitos e sobre a expressão gênica de

PPARγ e LPL.

o Efeitos sobre o tecido hepático e gordura abdominal avaliados por

análise histológica.

� Estudar se o efeito antiobesidade preventivo de RPH e de AMI se dá pela

redução da adipogênese e sobre fatores de transcrição da adipogênese

(PPARγ, C/EBPα, C/EBPβ) em cultura de pré-adipócitos 3T3-L1.

55

4.0. Metodologia 4.1. Material Botânico e obtenção dos compostos

A resina exsudada do caule do Protium heptaphyllum foi coletada no

município de Timon, no estado do Maranhão. O material foi identificado pela botanista

Roseli Farias de Melo Barros, registrado e depositado com o Nº. TEPB 18247 no

Herbário Graziela Barroso, da Universidade Federal do Piauí.

A resina bruta de P. heptaphyllum (410 g) foi dissolvida em

metanol/diclorometano (4:1), filtrado e o solvente evaporado, obtendo-se 408g (99,5%)

de resina branca amorfa. A análise fitoquímica da resina revelou a presença de

triterpenos pentacíclicos (56%), identificados por Ressonância Magnética Nuclear

(RMN 1H e 13C) e Espectrometria de Massa, como sendo as misturas de alfa e beta-

amirina (45,25%), breina e maniladol (9,5%) e uma pequena quantidade de uma

mistura de lupeona, alfa e beta-amirinona (1,25%) (VIEIRA-JUNIOR et al., 2005).

A obtenção da resina do P. heptaphyllum e da mistura de alfa e beta

amirina foi realizada pela Profa. Mariana Helena Chaves da Universidade Federal do

Piauí.

4.2. Animais

Foram utilizados camundongos, albinos, Swiss, machos, com peso entre

20-25g, oriundos do Biotério Central da Universidade Federal do Ceará,

acondicionados em gaiolas apropriadas e mantidos sob temperatura média de 24±1ºC,

em ciclo claro/escuro de 12/12 horas, recebendo ração padrão e água à vontade.

O projeto foi aprovado pelo Comissão de Ética em Pesquisa Animal

(CEPA) da UFC, com No. 70/10.

4.3. Dietas

A dieta padrão consistiu da ração padrão (Nuvilab®, Colombo, PR, Brasil)

composta de 19% de proteína, 56% de carboidratos, 3,5% de lipídios, 4.5% de

celulose, 5% de vitaminas e minerais e 12% de umidade, com um valor energético de

17,03 kJ/g.

56

A dieta hipercalórica foi preparada de acordo com o descrito por Estadella

(2014) a partir de ração padrão, amendoim torrado, chocolate ao leite e biscoito tipo

maisena e representou 20% de proteína, 48% de carboidrato, 20% de lipídeos, 4% de

celulose, 5% de vitaminas e minerais, com um valor energético de 21,4 kJ/g.

A dieta hipercalórica foi preparada no Laboratório de Farmacotécnica, do

Curso de Farmácia da UFC, sob a supervisão do Prof. Said Gonçalves da Cruz

Fonseca.

4.4. Protocolo experimental

Os animais foram inicialmente ambientados por uma semana, tendo livre

acesso a ração padrão e água ad libitum. Após esse período os animais foram

divididos aleatoriamente em 7 grupos de 8 animais cada: dieta normal (ração padrão),

dieta hipercalórica (DH), DH + resina de P. heptaphyllum (RPH, 0,05% na água de

beber equivalente a 10mg/kg), DH + RPH (0,1% na água de beber equivalente a

20mg/kg), DH + alfa e beta-amirina (AMI, 0,05% na água de beber equivalente a

10mg/kg), DH + AMI (0,1% na água de beber equivalente a 20mg/kg) e DH +

Sibutramina (SIB, 0,05% na água de beber equivalente a 10mg/kg).

A RPH e AMI foram inicialmente diluídas em 2% de Tween 80 em água

filtrada. O grupo controle DH recebeu o mesmo veículo. A SIB foi diluída em água

filtrada. Todas as soluções foram trocadas duas vezes na semana.

Semanalmente foi registrado o volume de água (ml/semana) e de ração

(g/semana) consumidos por cada um dos grupos.

O experimento teve duração de 15 semanas. Ao final deste período os

animais foram colocados em jejum de 6h, para coleta de amostras de sangue, e

posteriormente foram eutanasiados para coleta do tecido adiposo visceral e fígado.

4.4.1. Peso corporal, do tecido adiposo e fígado

Os animais foram pesados semanalmente e ao final da 15ª. semana

expresso como peso corporal final (g). Após a eutanásia foi coletado o tecido adiposo

abdominal e o fígado que foram pesados e expressos em peso relativo como mg/10g

de peso animal.

57

4.4.2. Análises plasmáticas e hepáticas

A coleta do sangue foi realizada pelo plexo retro-orbital, nos animais

levemente anestesiados com éter.

O sangue foi coletado em tubos contendo heparina sódica (5000 UI/mL,

20 µL). Decorrido meia hora da coleta, as amostras foram centrifugadas a 3500 rpm

durante 15 min. Em seguida, o plasma foi coletado e estocado a -70 oC até o uso.

Amilase, lipase, AST (aspartato aminotransferase), ALT

(alanina aminotransferase), glicose, colesterol total e triglicerídeos foram quantificados

por kits específicos (Labtest®, MG, Brasil) de acordo com as instruções do fabricante.

Insulina, leptina, grelina, resistina (Millipore®, Billerica, MA, USA), TNF-α,

IL-6 e MCP-1 (R&D Systems®, Minneapolis, MN, USA) plasmáticos foram

quantificados por Elisa, utilizando kits específicos, em duplicata, de acordo com as

instruções do fabricante.

Os lipídeos hepáticos foram extraídos utilizando o método desenvolvido

por Li et al. (1989) e os resíduos lipídicos secos foram dissolvidos em 1mL de etanol e

determinada as concentrações de triglicérides e colesterol total, com kits específicos

(Labtest®, MG, Brasil) de acordo com as instruções do fabricante.

4.4.3. Análise por RT-qPCR (Reação em cadeia da pol imerase da transcrição

reversa em tempo real)

Fragmentos do tecido adiposo visceral foram imediatamente levados ao

congelamento em nitrogênio líquido. As amostras foram então mantidas em freezer

(- 70 oC) até o momento da extração de RNA. RNA total foi isolado de cada amostra

utilizando o Mini Kit RNeasy (Qiagen, USA), de acordo com as instruções do

fabricante.

Resumidamente, as amostras foram homogeneizadas com Trizol (reagente

de lise Qiazol, Qiagen), utilizando um disruptor de células composto por uma

ferramenta de velocidade própria (Dremel 300-N/10, Mexico) e uma haste metálica

rotativa. Após o rompimento do tecido e a liberação do ácido ribonucleico (RNA) para

o meio, a solução foi centrifugada a 20.000g durante 5 min. e então, 200µL de 1-

bromo, 3- cloro-propano (BCP - Fluka, Estados Unidos) foi adicionado ao

sobrenadante.

58

Após a homogeneização e centrifugação (15,000 g, 15min, 4o C), o

conteúdo do tubo de 2mL é separado em 3 fases e o RNA impuro é localizado na fase

límpida superior. O passo seguinte foi a transferência do RNA impuro para uma coluna

de rotação, que objetivou a remoção de impurezas por lavagens consecutivas com

álcool 70% (v/v) e soluções tampão RW1 e RPE. A eluição do ácido nucléico de alta

pureza ocorreu em água livre de RNase. O RNA obtido foi quantificado com Nanodrop

(Thermo Fisher Scientific, Estados Unidos) para fins da verificação da qualidade do

RNA extraído e para a determinação da quantidade de RNA necessária para a

construção do DNA complementar (cDNA) (1μg).

Para avaliar a expressão gênica de PPARy e LPL, o cDNA foi construído a

partir do RNA isolado por uma reação com enzima transcriptase reversa

(SuperScript™ III Reverse Transcriptase System,Invitrogen, Estados Unidos). As

amostras de RNA (1 µg) foram incubadas em 4µL de 5X iScript™ Reaction Mix e 1µL

de iScript™ Reverse Transcriptase (Bio-Rad, USA) com água Milli-Q completando

para volume total final de 20µL por reação. As condições para construção do cDNA

foram: 25o C por 5 min; .42o C por 30 min., seguidos de um ciclo final de 85 o C por 5

min. O cDNA sintetizado foi mantido em um freezer a -20o C até sua amplificação por

uma reação em cadeia de polimerase em tempo real (Real Time-PCR).

A expressão gênica de PPARy e LPL foi determinada por meio do sistema

de detecção em tempo real (iQ5 Real-Time PCR Detection System, Bio-Rad, Estados

Unidos). O gene que codifica a peptidilprolil isomerase A [EC 5.2.1.8] foi utilizado

como gene de referência (Ppia). Os iniciadores de DNA (primers) de todos os genes

foram desenhados nas bases de sequência de DNA obtida do Centro Norte-Americano

de Informação Biotecnológica (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov; acesso em

02/Março/2011) (Tabela 1). Os ensaios de PCR em tempo real foram realizados em

um volume final de 25µl de um meio contendo 12.5µL SYBR Green Supermix (solução

padrão para amplificação com reagentes, contendo SYBR Green, DNA polimerase,

dNTPs e solução salina em concentrações ótimas para PCR em tempo real) 200nm de

primers e 1µL de cada amostra de cDNA. Amostras negativas também foram testadas,

com o cDNA sendo substituído por água Mili-Q autoclavada.

As condições do PCR foram as seguintes: um período de desnaturação

inicial de 3 min. a 95o C, seguida por 40 ciclos de amplificação dos genes. Cada ciclo

consistiu de uma fase de desnaturação inicial de 30 seg a 95o C, seguida por uma fase

de anelamento de 30 seg. a 57oC (Ppia) ou 58oC (LPL, PPARgamma); e uma fase de

59

extensão de 45 seg. a 72o C. A captação de fluorescência ocorreu a cada ciclo na fase

de extensão. Os dados obtidos foram armazenados e analisados pelo software iQ5

Optical System (version 2.0; Bio-Rad, USA) a fim de avaliar o ciclo limiar (threshold

cycle, CT) em que a fluorescência observada é 10 vezes maior que a fluorescência

basal para cada ensaio de RT-qPCR. A expressão do gene foi obtida pela aplicação

do método matemático de Pfaffl (Pfaffl, 2001), proporcionando a comparação entre a

amplificação dos genes de estudo e a amplificação do gene de referência em cada

amostra. As amostras foram submetidas a uma etapa de extensão final por 3 min. a

72o C.

Para a confirmação da especificidade dos produtos amplificados obtidos

(amplicons), foi construída uma curva de fusão para cada reação: a temperatura

crescente (aumento de 1o C a cada 20 seg. com início na temperatura de anelamento

do iniciador em questão) alcança 95o C, gerando a desnaturação gradual dos

amplicons.

As alterações de fluorescência foram medidas a fim de se obter a

temperatura de fusão (melting temperature, TM) de cada reação, determinando assim

a especificidade da amplificação pela obtenção de um pico único em cada reação. Os

amplicons foram também avaliados por corrida de eletroforese em gel de agarose a

3%, corados com brometo de etídio a 1% (v/v). A fotodocumentação dos géis revelou

a presença de um produto único por reação, de tamanho esperado.

Tabela 03. Sequência oligonucleotídica dos iniciadores utilizados nos ensaios de qRT-PCR. Gene Alvo Sequência do Primer (5’ -3’) Tam

anho (pb)

Banco de genes

(GenBank, NCBI)

Ppia Mus musculus peptidylprolyl

isomerase A (Ppia), mRNA

F- AATGCTGGACCAAACACAAA R- TTCCACAATGTTCATGCCTT

117 NM_008907.1

LPL Mus musculus lipoprotein lipase

(Lpl), mRNA

F- CCAATGGAGGCACTTTCCA R-

CACGTCTCCGAGTCCTCTCTCT

80 NM_008509.2

PPAR Mus musculus peroxisome proliferator

activated receptor gamma (Ppary),

mRNA

F- GATGGAAGACCACTCGCATT R- AACCATTGGGTCAGCTCTTG

115 NM_001127330.1

NM_011146.3

F: iniciador senso (forward); R: iniciador anti-senso (reverse).

60

4.4.4. Análise histológica hepática e do tecido adi poso

Amostras de tecido hepático e adiposo foram fixadas em formol 10%

tamponado por 24h e transferidos para uma preparação de álcool a 70% até o

momento do corte e colocação novamente em formol 10% tamponado. Posteriormente

as amostras foram fixadas em parafina, cortadas em micrótomo (5µm) e montados em

lâminas que foram coradas com hematoxilina-eosina.

As lâminas foram analisadas, quanto a possíveis alterações histológicas,

por microscopia ótica (Nikon YS2, Tóquio, Japão) e as fotografias foram feitas com o

uso de câmera fotográfica digital (Nikon Coolpix L14 7.1MP, Tóquio, Japão).

As análises foram realizadas pela Profa. Gerly Anne de Castro Brito do

Departamento de Morfologia da UFC que não tinha conhecimento prévio dos

tratamentos.

4.4.5. Área dos adipócitos

As amostras do tecido adiposo obtidas na coloração de hematoxilina-

eosina (item 4.4.4) e fotografadas, foram observadas em computador, e a área dos

adipócitos foi quantificada em 100 células por lâmina, com o uso do programa Image

J® (NIH, Bethesda, MD, USA). A área dos adipócitos foi expressa como µm2.

4.4.6. Cultura e citotoxicidade em células 3T3-L1

Inicialmente, os pré-adipócitos murinos 3T3-L1 foram mantidos em meio

DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) suplementado com 10% de soro de

bezerro recém-nascido e 1% de antibióticos (100U/L de penicilina e 100U/L de

estreptomicina) em estufa com controle de umidade (95%), temperatura (37°C) e CO 2

(5%). As células foram subcultivadas após atingir uma confluência de 80% (SUNG et

al., 2010).

Para avaliar a citotoxicidade da RPH, foi utilizado o ensaio do MTT, o 3-

(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazólio, que se baseia no fato deste

sal ser reduzido a um produto de coloração púrpura, o sal de formazan, pela atividade

da enzima succinil-desidrogenase presente na mitocôndria da célula viável, o que

permite quantificar a porcentagem de células vivas (MOSMANN, 1983). As células

indiferenciadas foram distribuídas em placas de 96 poços em densidade de 0,1 x 106

células/mL. As células foram incubadas com a RPH em concentrações seriadas

61

(1,5625; 3,125; 6,25; 12,5; 25 e 50 µg/mL) por um período de 69 h. Após o período de

incubação, as placas foram centrifugadas (1500 rpm/15 min) e o sobrenadante foi

descartado. Cada poço recebeu 150 µL da solução de MTT (na concentração de 0,5

mg/mL em meio DMEM high glucose) e as células foram novamente incubadas por

mais 3 h em temperatura de 37 °C e 5% de CO 2. Após esse período, as placas foram

novamente centrifugadas (3000 rpm/10 min), o sobrenadante foi desprezado e o

precipitado foi ressuspendido em 150µL de DMSO para a quantificação do sal

reduzido (formazan) pelas células viáveis. As absorbâncias foram medidas a 595 nm

em um leitor de microplacas (Beckman Coulter DTX-880®, Passadena, EUA).

O teste do MTT também foi realizado nas células diferenciadas

(adipócitos). Para isso, os pré-adipócitos foram submetidos ao processo de

diferenciação e no 8º dia a RPH foi adicionada nas concentrações de 6,25; 12,5; 25 e

50 µg/mL. A incubação das células ocorreu até o 11º dia de diferenciação, quando o

MTT foi adicionado e a viabilidade celular foi avaliada pela absorbância do sal de

formazan formado. As absorbâncias foram medidas a 595 nm em um leitor de

microplacas (Beckman Coulter DTX-880®, Passadena, EUA).

4.4.7. Indução da adipogênese e Coloração com Oil Red O.

Para avaliar o efeito da RPH sobre a diferenciação das células 3T3-L1, a

resina (6,25; 12,5; 25 e 50 µg/mL) foi incubada com as células desde o dia 1 do

processo de diferenciação até o 11º. dia.

Para isso, as células 3T3-L1 foram estimuladas com meio DMEM

suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos adicionado com

0,5mM de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), 0,25 µM de dexametasona e 1 µg/mL de

insulina por 48h. Após a indução, as células foram cultivadas em meio DMEM

suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos adicionado com 1

µg/mL de insulina por 48h e em DMEM suplementado apenas com 10% de soro fetal

bovino e 1% de antibióticos por outros 6 dias, onde o meio de cultura foi trocado a

cada 48h.

Para mensurar o acúmulo de lipídeos intracelulares no 11º dia de

diferenciação e tratamento com a RPH, foi utilizada a coloração de Oil Red O.

Primeiramente, as células foram lavadas com PBS (pH 7) e fixadas com formaldeído

4% em PBS por 1 h a temperatura ambiente. As gotículas de lipídeo foram coradas

com Oil Red O por 120 min (RAMÍREZ-ZACARÍAS et al., 1992). Por fim, o corante foi

62

extraído com álcool isopropílico e a absorbância medida a 510 nm. O percentual de

corante foi calculado relativo ao controle (KASTURI E JOSHI, 1982; SUNG et al.,

2010).

4.4.8. Análise por Western blotting

A expressão de proteínas alvo relacionadas às vias chaves para indução

do processo de adipogênese foi avaliada por western blotting (WB). Para isso, a

expressão de PPARγ, C/EBPα e C/EBPβ foram determinadas após o 11° dia do início

da indução da diferenciação celular, período no qual as células já apresentam

características morfológicas, bioquímicas e moleculares de um adipócito maduro.

Células 3T3-L1 diferenciadas foram lavadas com PBS e realizada a

extração de proteínas totais com RIPA Lysis Buffer 1x, ao qual foram adicionados

coquetel inibidor de protease, ortovanadato de sódio (200 mM) e PMSF (200mM). A

quantificação de proteínas totais foi feita por meio do método colorimétrico com o uso

do kit Bio-Rad Protein Assay® (BioRad Laboratories, California, EUA) segundo a

metodologia do fabricante.

Foram aplicados 5µg de proteína no gel de eletroforese de poliacrilamida

(SDS) e transferida para uma membrana de PVDF. Após a transferência, as

membranas foram bloqueadas por 1h em leite desnatado 3%. As membranas foram,

então, incubadas com anticorpo primário anti-PPARγ (Santa Cruz Biotechnology,

Texas, EUA), anti-C/EBP-α (Santa Cruz Biotechnology, Texas, EUA), C/EBP-β (Santa

Cruz Biotechnology, Texas, EUA) e anti β-actina (CellSignaling Technology®, Boston,

EUA) na proporção de 1:1000. Posteriormente, cada membrana foi incubada com

anticorpo secundário acoplado a fosfatase alcalina (1:2000) e detectados por

NBT/BCIP (Santa Cruz Biotechnology, Texas, EUA). A marcação com β-actina foi

usada como referência experimental.

A documentação das membranas reveladas foi realizada em captador de

imagens ImageQuant 300® (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) utilizando o programa

ImageQuant 300® (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) para aquisição e edição. Os

níveis das proteínas detectadas foram mensurados pelo programa Image J®. Cada

experimento foi realizado em duplicata.

63

4.5. Análise estatística

Os dados foram expressos como média ± erro padrão médio (EPM) e

analisados pela Análise de Variância (ANOVA) seguida do teste de Student Newman

Keul, através do programa GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Sotware, Inc., San Diego,

CA, USA).

Os valores de CI50 e seus intervalos de confiança (95%) foram obtidos por

regressão não linear.

Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significantes.

64

5.0. Resultados

5.1 . Efeito da resina do Protium heptaphyllum (RPH) e de alfa e beta amirina

(AMI) no peso corporal, consumo de ração e água e p eso relativo do tecido

adiposo abdominal e fígado

No início do experimento não foram encontradas diferenças significativas

entre os pesos dos animais de todos os grupos.

Ao final da 15ª. semana houve um aumento significativo de peso corporal

(55,13±2,35g; 36,53%) e da deposição de gordura abdominal (695,4±96,60 mg/10g) no

grupo DH em relação ao grupo DP (40,38±0,94g e 195,4±24,59 mg/10g,

respectivamente). A RPH (10 e 20 mg/kg) e AMI (10 e 20 mg/kg) reduziram

significativamente o peso corporal (11,8%; 17,69%; 13,60%; 11,57%, respectivamente)

e a deposição de gordura visceral (34,2%; 39,39%; 49,71%; 36,91%, respectivamente)

quando comparado ao grupo DH. Sibutramina (10mg/kg) reduziu significativamente o

peso corporal (26,43%) e a deposição de gordura visceral (48,36%) (Tabela 4).

Observamos um aumento significativo do consumo de ração no grupo DH

(38,24±3,03 g/semana) em relação ao grupo DP (31,65±1,32 g/semana). Os

tratamentos com RPH (10 e 20 mg/kg), AMI (10 e 20 mg/kg) e SIB (10 mg/kg)

reduziram significativamente o consumo de ração dos animais em relação aos animais

do grupo DH. Não houve diferença significativa na quantidade de água ingerida entre

os grupos (Tabela 4).

65

Tabela 4. Efeito da resina do Protium heptaphyllum (RPH) e da mistura de alfa e beta amirina (AMI) no peso corporal, peso da gordura

abdominal, consumo de ração, consumo de água e peso do fígado na obesidade induzida por dieta hipercalórica em camundongos.

DP DH DH + RPH 10 mg/kg

DH + RPH 20 mg/kg

DH + AMI 10 mg/kg

DH + AMI 20 mg/kg

DH +

SIB 10mg/kg

Peso corporal inicial

(g)

25,10±0.79

25,20±0,55

25,20±0,71

25,20±0,64

25,20±0,51

25,20±0,55

25,10±0,67

Peso corporal final

(g)

40,38±0.94 55,13±2,35a 45,38±1,29b 48.63±1.47b 47,63±2,67b 48,75±1,27b 40,56±1,35b

Consumo de ração

(g/semana)

31,65±1.32 38,24±3,03a 27,17±1,17b 33,34±1,40b 26,79±1,10b 28,43±1,20b 27,21±1,16b

Consumo de água

(mL/semana)

48,13±0.73 47,63±1,66 44,44±1,20 41,91±1,38 46,71±1 ,37 46,82±2,52 42,54±0,72

Gordura abdominal

(mg/10g)

195,4±24.59 695,4±96,60a 421,5±79,22b 457,6±28,38b 349,7±54,17b 438,7±42,07b 359,1±62,21b

Figado (mg/10g) 337,9±13.60 413,1±7,32a 378,5±16,69b 341,5±9,56b 352,2±9,10b 319,3±17,34b 368,4±11,54b

Os resultados estão expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M). DP (dieta padrão), DH (dieta hipercalórica), RPH (Resina de P. heptaphyllum),

AMI (alfa e beta-amirina), SIB (sibutramina). ap<0,05 vs DP; bp<0,05 vs DH (ANOVA e teste de Student Newman Keul).

66

5.2. Efeito da RPH e AMI nos parâmetros plasmáticos e hepáticos

5.2.1. Dosagens bioquímicas plasmáticas e hepáticas

Os níveis de amilase (164,30±11,46 U/L) e lipase (295,70±25,62 U/L)

foram significativamente elevados no grupo de animais tratados com a DH quando

comparado aos animais que receberam a DP (99,73±4,14 U/L e 223,30±10,27 U/L,

respectivamente) (Tabela 5).

A RPH (20 mg/kg), AMI (10 e 20 mg/kg) e SIB significativamente reduziram

o aumento dos níveis de amilase e lipase associados a DH. Contudo RPH 10mg/kg

falhou em reduzir os níveis de lipase (Tabela 5).

A DH aumentou significativamente os níveis plasmáticos de ALT, AST,

colesterol total e triglicerídeos e os níveis hepáticos de colesterol total e triglicerídeos,

os quais foram reduzidos significativamente pelo tratamento com RPH, AMI e SIB

(Tabela 5).

Os níveis de glicose e de insulina apresentaram-se significativamente no

grupo DH (219,10±15,68 mg/dL; 4,524±0,58 ng/ml, respectivamente) em ralação ao

grupo DP (125,30±8,34 mg/dL; 1,059±0,14, respectivamente). O tratamento com RPH

(10 e 20 mg/kg) e AMI (10 e 20 mg/kg) e SIB reduziu significativamente os níveis de

glicose e insulina em relação ao grupo DH (Tabela 5).

67

Tabela 5. Efeito da resina do Protium heptaphyllum (RPH) e da mistura de alfa e beta amirina (AMI) sobre parâmetros plasmáticos e hepáticos

na obesidade induzida por dieta hipercalórica em camundongos.

DP DH DH + RPH 10 mg/kg

DH + RPH 20 mg/kg

DH + AMI 10 mg/kg

DH + AMI 20 mg/kg

DH +

SIB 10mg/kg

Amilase (U/L) 99,73 ±4,14 164,30±11,46a 123,20±12,73b 109,90±9,59b 114,20±8,84 b 106,50±8,06 b 101,00±8,74b

Lipase (U/L) 223,30±10,27 295,70±25,62a 294,30±12,51a 221,10±9,78b 227,5±8,39 b 238,8±8,54 b 251,30±9,53b

ALT (U/L) 41,75±3,06 75,75±10,99a 35,13±2,63b 40,63±8,92b 45,25±3,31 b 53,25±5,39 b 48,38±5,48b

AST (U/L) 72,71±10,55 189,0±10,24a 69,63±5,21b 64,63±3,22b 73,75±4,86 b 67,63±2,41 b 71,50±8,18b

Glicose (mg/dL) 125,30±8,34 219,10±15,68a 142,30±11,12b 146,40±7,16b 157,3±22,08 b 137,1±9,36 b 177,30±11,67b

Insulina (ng/mL) 1,059±0,14 4,524±0,58a 1,408±0,11b 1,489±0,27b 2,17±1,34 b 1,52±0,31 b 0,8588±0,08b

Colesterol total (mg/dL) 121,80±3,82 206,60±13,31a 171,00±6,49b 151,20±10,37b 147,6±8,38 b 160,2±8,37 b 171,40±6,28b

Triglicerideos (mg/dL ) 110,20±11,11 183,40±13,78a 84,20±6,19b 94,20±6,61b 128,8±12,49 b 124,6±10,88 b 106,00±6,88b

Colesterol total hepático

(mg/g)

6,29±0,92 13,50±1,07a 7,57±1,36b 7,43±0,97b 10,00±0,37 b 5,50±0,42 b 5,43±0,29b

Triglicerideos hepáticos (mg/g) 53,38±8,29 129,30±18,23a 74,29±14,45b 70,63±10,22b 68,25±9,67 b 47,13±6,41 b 47,75±6,25b

Os resultados estão expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M). DP (dieta padrão), DH (dieta hipercalórica), RPH (Resina de P. heptaphyllum),

AMI (alfa e beta-amirina), SIB (sibutramina). ap<0,05 vs DP; bp<0,05 vs DH (ANOVA e teste de Student Newman Keul).

68

5.2.2. Dosagens plasmáticas de Grelina, Leptina, Re sistina, TNF- α, IL-6 e MCP-1

Observamos uma redução significativa nos níveis de grelina nos animais

do grupo DH (325,6±51,76pg/mL) em relação ao grupo DP (637,5±79,79 pg/mL). O

tratamento com RPH 10mg/kg (724,3±124,8 pg/mL) e 20mg/kg (807,5±59,68 pg/mL)

aumentou significativamente os níveis de grelina em relação ao grupo DH. O

tratamento com AMI 10mg/kg (271,7±23,11 pg/mL) e 20mg/kg (370,8±59,19 pg/mL),

assim como SIB (390,2±83,82 pg/mL) mantiveram os níveis de grelina

significativamente menores em relação a DP (Figura 3A).

Os níveis de leptina apresentaram-se significativamente elevados no grupo

DH (370,00±79,82 pg/mL) em relação ao grupo DP (43,57±5,70 pg/mL). O tratamento

com RPH 10mg/kg e 20mg/kg, AMI 10mg/kg e 20mg/kg e SIB (109,20±22,79;

134,70±53,90; 223,20±86,66; 56,35±14,56 e 54,96±14, 84 pg/mL, respectivamente)

reduziu significativamente os níveis de leptina em relação ao grupo DH (Figura 3B).

Os níveis de resistina apresentaram-se significativamente aumentados no

grupo DH (850,70±57,89 pg/mL) quando comparado a DP (503,40±38,59 pg/mL).

Apenas os tratamentos com RPH 20mg/kg (382,80±49,61 pg/mL) e AMI 20mg/kg

(427,40±70,05 pg/mL) diminuíram significativamente os níveis de resistina quando

comparados a DH (Figura 3C).

69

0

200

400

600

800

1000

a

b b

a

a a

A

Gre

lina

(pg/

mL)

0

100

200

300

400

500 a

b

b

b b

b

B

Lept

ina

(pg/

mL)

DP DH

RPH 10mg/kg

RPH 20mg/k

g

AMI 1

0mg/

kg

AMI 2

0mg/

kg

SIB 1

0mg/

kg0

200

400

600

800

1000 a

bb

C

Res

istin

a (p

g/m

L)

Figura 3 . Efeito da resina de P. heptaphyllum (RPH) e de alfa e beta-amirina (AMI)

sobres os níveis plasmáticos de grelina (A), leptina (B) e resistina (C) na obesidade

induzida por dieta hipercalórica em camundongos. DP (dieta padrão), DH (dieta

hipercalórica), SIB (sibutramina). Os valores representam a média ± E.P.M. (n=8

animais/grupo). a p < 0,05 vs DP; b p<0,05 vs DH (ANOVA e Teste de Student

Newman Keul).

70

Os níveis de TNF-α apresentaram-se aumentados significativamente no

grupo DH (335,60±33,97 pg/mL) quando comparado a DP (56,77±12,29 pg/mL). Os

tratamentos com RPH 20mg/Kg e AMI 10 e 20 mg/kg (107,30±25,80; 95,44±22,24; 188,0±40,26 pg/mL, respectivamente), diminuíram significativamente os níveis de

TNF-α quando comparados a DH (Figura 4A).

Os níveis de IL-6 apresentaram-se aumentados significativamente no

grupo DH (182,70±15,87 pg/mL) quando comparado a DP (58,38±13,19 pg/mL). RPH

10mg/kg e 20mg/kg, AMI 10mg/kg e 20mg/kg e SIB (82,56±13,00; 91,18±27,33; 71,93±30,35; 50,55±16,86 e 66,79±23,50 pg/mL, respectivamente) reduziram significativamente os níveis de IL-6 quando comparados a DH (Figura 4B).

Os níveis de MCP-1 mostraram-se aumentados significativamente no

grupo DH (70,78±8,81 pg/mL) quando comparado a DP (45,70±6.,44 pg/mL). RPH

10mg/kg e 20mg/kg, AMI 10mg/kg e 20mg/kg e SIB (47,25±6,51; 49,59±5,01; 39,82±2,93; 42,95±6,40 e 43,08±3,50 pg/mL, respectivamente) reduziram significativamente os níveis de MCP-1 quando comparados a DH (Figura 4C).

71

0

100

200

300

400

500

a

b b

A

a

TN

F- α

(pg

/ml)

b

0

50

100

150

200

250

a

bb

b

bb

IL-6

(pg

/ml)

B

DP DH

RPH 10m

g/kg

RPH 20m

g/kg

AMI 10m

g/kg

AMI 20m

g/kg

SIB 10

mg/

kg

0

20

40

60

80

100

a

b bb

b b

C

MC

P-1

(pg/

ml)

Figura 4 . Efeito da resina de P. heptaphyllum (RPH) e de alfa e beta-amirina (AMI)

sobres os níveis plasmáticos de TNF-α (A), IL-6 (B) e MCP-1 (C) na obesidade

induzida por dieta hipercalórica em camundongos. DP (dieta padrão), DH (dieta

hipercalórica), SIB (sibutramina). Os valores representam a média ± E.P.M. (n=8

animais/grupo). a p < 0,05 vs DP; b p<0,05 vs DH (ANOVA e Teste de Student

Newman Keul).

72

5.3. Expressão gênica de PPARy e LPL no tecido adip oso

A expressão dos genes adipogênicos PPARy e LPL no tecido adiposo foi

demonstrada na Figuras 5. A DH causou elevação significativa da expressão de

RNAm de PPARy e LPL. RPH 10 e 20 mg/kg e AMI 10 e 20 mg/kg reduziram

significativamente a expressão de RNAm de PPARy e LPL. Sibutramina não foi capaz

de alterar a expressão de PPARy e LPL em relação a DH.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

a

bb

b

b

PP

ARγ

(exp

ress

ão r

elat

iva)

A

DP DH

RPH 10m

g/kg

RPH 20mg/k

g

AMI 10m

g/kg

AMI 20m

g/kg

SIB 10

mg/kg

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5 a

bb

b

b

LPL(

expr

essã

o re

lativ

a)

B

Figura 5. Efeito da RPH e AMI sobre a expressão relativa de PPARγ (A) e LPL (B) em

tecido adiposo. Os resultados estão expressos como média ± E.P.M. DP (dieta

padrão), DH (dieta hipercalórica), RPH (resina do P. heptaphyllum), AMI (alfa e beta-

amirina) e SIB (sibutramina). a p < 0,05 vs DP; b p<0,05 vs DH (ANOVA e Teste de

Student Newman Keul).

73

5.4. Análise histológica do fígado e tecido adiposo

O fígado dos animais alimentados com a ração padrão (DP) apresentou

hepatócitos nucleados bem formados, matriz sinusoidal bem formada, ausência de

infiltrado inflamatório, tecido fibroso ou acúmulo de lipídeos, arquitetura intacta

compatível com fígado normal (Figura 6A).

A dieta hipercalórica (DH) promoveu infiltrado inflamatório focal, leve e

parenquimatoso, necrose isolada de hepatócitos, esteatose leve microgoticular, sem

disposição peculiar e presença de gotículas de lipídios (Figura 6B).

O tratamento com RPH (20 mg/kg), AMI (20mg/kg) e SIB resultou em

hepatócitos nucleados bem formados, discreta dilatação de sinusóides, discreto

infiltrado inflamatório de linfócitos, ausência de tecido fibroso e nenhum acúmulo de

gotículas de lipídeos (Figura 6C, 6D,6 E).

A dieta hipercalórica (DH) foi capaz de aumentar o volume dos adipócitos

quando comparada ao grupo que recebeu dieta padrão (DP) (Figura 7A e 7B). O

tratamento com RPH, AMI e SIB reduziram a área dos adipócitos (Figura 7C, 7D e

7E).

Esse resultado foi confirmado com a mensuração da área dos adipócitos.

Observamos que o grupo DH apresentou área (101,62±5,08 µm2 x 102)

significativamente maior em relação a DP (39,95±8,85 µm2 x 102). Todos os grupos

tratados demonstraram redução significativa da área dos adipócitos (RPH10:

53,07±3,77; RPH20: 44,15±2,49; AB10: 37,69±3,40; AB20: 48,17±218.5; SIB:

43,55±2,77 µm2 x 102) (Figura 8).

74

(A)

(B)

(C)

(D)

(E)

Figura 6. Microfotografia representativa do fígado de animais submetidos a dieta padrão (A), dieta hipercalórica (B), RPH 20mg/kg (C), AMI 20mg/kg (D) e SIB 10mg/kg (E) (H&E, × 100).

75

(A)

(B)

(C)

(D)

(E)

DP DH

RPH10

RPH20

AMI10

AMI20

SIB

0

50

100

150

a

bb b

b b

Áre

a do

s ad

ipóc

itos

(µ m

2 x 1

02 )

(F)

Figura 7. Microfotografia representativa do tedido adiposo de animais submetidos a

dieta padrão (A), dieta hipercalórica (B), RPH 20mg/kg (C), AMI 20mg/kg (D) e SIB

10mg/kg (E) (H&E, × 100). Efeito da RPH, AMI e SIB sobre a área dos adipócitos. Os

valores representam a média ± E.P.M. (n=6). a p < 0,05 vs DP, b p < 0,05 vs DH

(ANOVA e Teste de Student Newman Keuls) (F).

76

5.5. Efeito da RPH na cultura de células 3T3-L1

5.5.1. Avaliação da citotoxicidade da RPH em cultur a de células 3T3-L1

A RPH não apresentou efeito citotóxico nas células 3T3-L1 não

diferenciadas e diferenciadas com valores de CI50 maiores do que 50 µg/ml.

5.5.2. Efeito da RPH sobre o acúmulo de lipídeos em adipócitos 3T3-L1

No processo de diferenciação das células 3T3-L1 o depósito de lipídeos

inicia-se no 5º. dia. Imagens representativas das células nos dias 7, 9, 11 e 13 estão

apresentadas na Figura 8A e a quantificação do corante oil red O na Figura 8B. A

coloração com Oil Red O revelou significativa redução no acúmulo de lipídeos com

RPH (12,5; 25 e 50 µg/mL) em adipócitos 3T3-L1 (Figura 8B e 8D).

5.5.3. Efeito da RPH sobre a expressão proteica de PPARγ, C/EBPα e C/EBPβ

em células 3T3-L1

A expressão de PPARγ, C/EBPα e C/EBPβ foi inibida pela RPH (Figura 9A

e 9B). Enquanto RPH atenuou significativamente a expressão de C/EBPβ em todas as

concentrações, o efeito significativo sobre a expressão de PPARγ foi observado

apenas nas concentrações de 25 e 50 µg/mL, enquanto para C/EBPα somente na

dose de 50 µg/mL (Figura 9C e 9D).

77

(a)

Dia 7 Dia 9 Dia 11 Dia 13

0 1 3 5 7 9 11 130.0

0.2

0.4

0.6

0.8

(Dias)

*

*

** *

(c)

Abs

orbâ

ncia

510n

m

Controle 6.25 12.5 25 500.0

0.5

1.0

1.5

(µg/ml)RPH

***

(d)

Abs

orbâ

ncia

510n

m

Figura 8. Efeito da RPH sobre o acúmulo de lipídeos em células 3T3-L1.

Representativo do efeito da indução da diferenciação pela coloração com Oil Red O

(a) e efeito da RPH (6,25; 12,5; 25 e 50 µg/mL) (b) no acúmulo de lipídeos em células

3T3-L1 (× 400). A intensidade do corante foi quantificada a 510nm (c, d). Valores

representam a média ± E.P.M. * p < 0,05 comparado com o controle de células não

tratadas (dia 0).

Controle RPH 6,25µg/mL RPH 12,5µg/mL RPH 25µg/mL RPH 50µg/mL

(b)

78

(a)

CN CD 12.5 25 500.0

0.1

0.2

0.3

0.4

RPH

* *

Controle

PPARγ

(µg/mL)

Nív

el d

e pr

oteí

na (

unid

ade

arbi

trár

ia)

(b)

CN CD 12.5 25 500.0

0.1

0.2

0.3

0.4

(µg/mL)RPH

**

*

Controle

C/EBPβ

Nív

el d

e pr

oteí

na(u

nida

de a

rbitr

ária

)

(c)

CN CD 12.5 25 500.0

0.1

0.2

0.3

(µg/mL)RPH

*

Controle

C/EBPα

Nív

el d

e pr

oteí

na (

Uni

dade

arb

itrár

ia)

(d)

Figura 9. Efeito da RPH sobre a expressão proteica de PPARγ, C/EBPα e C/EBPβ em

células 3T3-L1. Células 3T3-L1 foram diferenciadas na presença e na ausência de

RPH (12,5; 25 e 50 µg/mL) por 11 dias. A expressão proteica foi avaliada por Western

bloting (A). O gráfico de barras representa o resultado densitométrico das bandas de

PPARγ (B), C/EPBβ (C) e C/EBPγ (D). CN indica controle com células não

diferenciadas e CD indica controle de células diferenciadas. Β-actina foi usada como

controle. Valores representam a média ± E.P.M. * p < 0,05 comparado com controle de

células não tratadas (dia 0).

CN CD 12.5 25 50

Controle _____________

PPARγ 55kDa

C/EBP-β 48kDa

48kDa C/EBP-α

43kDa β-actin

RPH (µg/mL) ___________________

79

6.0. Discussão

Agentes que podem reduzir o peso corporal por exercerem controle em

diferentes níveis como absorção e metabolismo de lipídeos e carboidratos, saciedade

e acúmulo de lipídeos nos adipócitos são uma opção interessante para a prevenção e

tratamento da obesidade. Esse estudo avaliou pela primeira vez os efeitos da resina

do Protium heptaphyllum e da mistura de alfa e beta amirina em um modelo de

obesidade induzida por dieta hipercalórica em camundongos.

A obesidade, em particular, o excesso de adiposidade visceral, está

associada a resistência à insulina, hiperglicemia, dislipidemia e hipertensão, que juntos

são chamados de ''síndrome metabólica''. Estes distúrbios metabólicos aumentam o

risco de desenvolvimento de diabetes mellitus tipo 2 (DM2), doenças cardiovasculares

e contribuem para elevadas taxas de mortalidade e morbidade. O DM2 é a doença

metabólica mais prevalente no mundo e é caracterizada por defeitos na secreção de

insulina e uma resistência periférica à insulina no músculo esquelético, tecido adiposo

e fígado. A progressão da obesidade para DM2 permanece pouco compreendida, mas

implica numa falha das células beta do pâncreas, para compensar a resistência à

insulina levando a uma hiperglicemia crônica (ESSER et al., 2014).

A síndrome metabólica pode ser induzida por uma dieta hipercalórica em

camundongos que leva a alterações no grau de resistência à insulina e no

metabolismo de lipídeos (CHOI et al., 2007). Os resultados do presente estudo

revelaram que a dieta hipercalórica utilizada durante quinze semanas por

camundongos, pode levar ao desenvolvimento de anormalidades metabólicas,

incluindo excesso de peso, hiperglicemia, dislipidemia, hiperinsulinemia, resistência à

insulina e hiperleptinemia.

Os animais submetidos a dieta hipercalórica apresentaram ao final das

quinze semanas, peso, gordura abdominal e os parâmetros séricos de glicose,

insulina, colesterol e triglicerídeos significativamente aumentados em relação ao grupo

submetido a dieta padrão. Os compostos em estudo foram capazes de diminuir

significativamente esses parâmetros, nas doses utilizadas.

Estes resultados são consistentes com trabalhos anteriores do nosso

laboratório que mostram semelhantes efeitos com outros triterpenos pentacíclicos

como ácido betulínico, ácido ursólico e oleanólico em camundongos submetidos ao

modelo de obesidade induzida por dieta hipercalórica (DE MELO et al., 2001; DE

80

MELO et al., 2009; RAO et al., 2011). Também demonstramos o efeito hipoglicemiante

e hipolipemiante da mistura de triterpenos pentacíclicos alfa e beta amirina em

camundongos diabéticos induzidos por estreptozotocina e com hiperlipidemia induzida

por dieta hiperlipidêmica (SANTOS et al., 2012).

Uma importante estratégia no tratamento da obesidade é a inibição da

digestão e absorção de nutrientes, no intuito de reduzir o consumo de energia por

mecanismos gastrintestinais sem alterar quaisquer mecanismos centrais. A lipase,

secretada pelo pâncreas e glândulas salivares, é uma enzima chave para a absorção

dos triglicerídeos no intestino delgado. Enquanto a amilase é responsável pela

absorção da glicose, através da hidrólise dos carboidratos no trato digestivo. A inibição

das enzimas digestivas é um mecanismo dos mais amplamente utilizados para a

determinação do potencial de um produto natural como um agente antiobesidade

(MARRELLI et al, 2013).

Assim, o presente estudo abordou o efeito da resina do Protium

heptaphyllum (RPH) e da mistura de alfa e beta amirina (AB) sobre as enzimas

amilase e lipase. Observamos que todos os grupos tratados (RPH 10 e 20 mg/mg, AB

10 e 20 mg/kg e SIB) reduziram a atividade catalítica da amilase. Com exceção da

RPH10, os demais compostos, reduziram a ação da lipase.

A atividade inibidora da α-amilase por triterpenos pentacíclico, tais como

ácido oleanólico, ácido ursólico e lupeol foi anteriormente descrita (ALI et al., 2006).

Os triterpenos pentacíclicos ácido betulínico, ácido ursólico e oleanólico demonstraram

efeito semelhante de inibição de amilase e lipase no modelo de obesidade induzida

por dieta hipercalórica em camundongos (DE MELO et al., 2001; DE MELO et al.,

2009; RAO et al., 2011).

Extratos de Phaseolus vulgaris, foram eficazes na diminuição do peso

corporal e da hiperglicemia através da inibição de α-amilase interferindo na digestão

do amido e sacarose, diminuindo a absorção de açúcar e reduzindo potencialmente as

calorias derivadas dos carboidratos (LAYER et al.,1985; LAYER et al., 1986;

BARRETT E UDANI, 2011, GUPTA et al., 2014). Seu principal princípio ativo

triterpenóide denominado faseolamina é conhecido como um forte inibidor da α-

amilase (CELLENO et al., 2007; MOSCA et al., 2008; CARAI et al., 2009). Compostos

naturais inibidores da α-amilase demonstraram ser úteis na redução da hiperglicemia

pós-prandial por diminuir a absorção de carboidratos e consequentemente a absorção

de glicose. Portanto, ao reduzir a hiperglicemia pós-prandial, não haverá a captação

81

de glicose pelos adipócitos impedindo também a síntese e acúmulo dos triacilgliceróis

(MAURY et al., 1993).

Tem sido reportado na literatura que triterpenos dos grupos lupano e

oleano apresentam ações inibitórias da lipase, com isso prevenindo o aumento de

peso corporal causado pela ingesta de dieta hipercalórica (LIU et al., 2008; GUO et al.,

2009).

LIU et al. (2010) investigaram os efeitos das frações saponinas

triterpênicas panaxadiol (PDG) e panaxatriol (PTG) isoladas de Panax ginseng sobre a

atividade da lipase pancreática in vitro e atividade antiobesidade em camundongos

submetidos a dieta hipercalórica. As principais conclusões foram que PDG

desempenhou um papel mais importante na inibição da atividade da lipase in vitro em

relação a PTG. PDG exibiu uma significativa redução do tecido adiposo e dos níveis

de triglicerídeos hepáticos nos camundongos alimentados com dieta hipercalórica

contendo 0.02% e 0,05% de PDG quando comparados ao grupo alimentado apenas

com dieta hipercalórica.

A raiz de Platycodon grandiflorum quimicamente composta por saponinas

triterpênicas, produziu efeitos sobre o controle da obesidade e metabolismo lipídico,

resultando em redução do colesterol, redução na ingestão de calorias e consequente

perda de peso. Vários estudos apontam a inibição da lipase como um dos

mecanismos de ação deste composto (XU et al., 2005; KIM et al., 2009; LEE et al.,

2012).

YAN et al. (2014), concluíram que o ácido asiático (AA), um triterpeno

pentacíclico que ocorre naturalmente em muitas frutas e legumes como manjericão,

mostarda marrom e centelha asiática, melhora o acúmulo de lipídeos hepáticos e

resistência à insulina em camundongos alimentados com dieta hipercalórica. A

ingestão de AA reduziu significativamente o acúmulo de lipídeos no sangue, esteatose

hepática e tecido adiposo através da supressão da expressão das proteínas ACC1,

FAS, SCD-1 e SREBP-1c. Além disso, este triterpeno atenuou o estresse oxidativo e

inflamação hepáticas.

O tratamento durante 15 semanas com RPH, AB e SIB causaram

mudanças significativas nos níveis séricos de parâmetros lipídicos, ou seja, uma

diminuição nos níveis de colesterol total e triglicerídeos em comparação com o grupo

DH. O motivo para essa diminuição pode ser em parte atribuída a atividade inibitória

da enzima lipase pancreática demonstrada pelas drogas utilizadas.

82

A obesidade e os transtornos associados, especialmente DM2, tornaram-

se um desafio médico na sociedade moderna. Descoberta em 1994, a leptina

inicialmente caracterizou-se por reduzir a ingestão de alimentos e aumentar o gasto

energético. Na obesidade, os níveis de leptina aumentam, embora seu efeito de

redução da ingestão de alimentos e aumento do gasto de energia, diminuam. Assim, o

estabelecimento da resistência a leptina é considerada uma das causas mais

importantes no desenvolvimento da obesidade (CAMPFIELD et al., 1996; KOCH et al.,

2014).

Apesar das propriedades anorexígenas e catabólicas bem caracterizadas,

a leptina atua centralmente, sendo também essencial para a manutenção da

homeostasia da glicose e um potente agente sensibilizador da insulina. A obesidade

dá origem a resistência à insulina e a resistência a leptina tem sido proposta como um

importante mecanismo que liga estas duas condições. O mecanismo molecular das

propriedades hipoglicemiantes subjacentes e o efeito de sensibilização a insulina da

leptina ainda não são bem caracterizados. (HEDBACKER et al., 2010). Os níveis

séricos de leptina estão fortemente associados com a massa gorda, IMC e a

resistência à leptina na obesidade, além disso, tendem a aumentar em pacientes com

diabetes, hiperlipidemia e doenças isquêmicas do coração (JOBU et al., 2013; XIAU et

al., 2013; KUATE et al., 2015).

Grelina, a primeira proteína orexígena a ser identificada, é derivada do

estômago e estimula o apetite. A diminuição dos níveis plasmáticos de grelina pode ter

um papel protetor contra o desenvolvimento da obesidade e do DM2. Porém faltam

evidências científicas que provem esta hipótese. HAMED et al. (2011), realizaram um

estudo caso-controle com objetivo de investigar a relação entre os hormônios do

apetite (grelina/leptina), IMC, insulina, estresse oxidativo em pacientes apenas obesos

e paciente obesos com DM2. Neste estudo, os níveis séricos de grelina em jejum

estava significativamente reduzidos, enquanto a insulina, resistência à insulina

(medido através do índice HOMA-IR) e os níveis de leptina estavam significativamente

aumentados nos pacientes obesos e nos obesos com DM2 em comparação com os

controles saudáveis.

Uma possível explicação para os níveis baixos de grelina em pacientes

obesos é a elevação da insulina (FLANAGAN et al., 2003; WADDEN et al., 2012;

PRADHAN et al., 2013). Estudos demonstram uma relação inversa entre os níveis

circulantes de grelina e insulina em seres humanos saudáveis, sugerindo uma relação

inibitória entre grelina e insulina. Um efeito direto da concentração fisiológica de

83

insulina sobre a secreção de grelina também foi mostrado no estômago isolado e

perfundido de ratos. (CUMMINGS et al., 2001; KAMEGAI et al., 2004; VERHULST;

DEPOORTERE, 2012).

Outra possibilidade seria um efeito direto de produtos secretados pelas

células de gordura sobre a secreção de grelina. O maior candidato neste contexto é a

leptina, que está elevada no soro de indivíduos obesos. Uma relação inversa entre

leptina e grelina tem sido relatada, sugerindo uma contribuição da leptina para os

níveis baixos de grelina relacionados com a obesidade (WEIGLE et al., 2003; HAMED

et al., 2011). A injeção intraperitoneal de leptina em camundongos, inibe a liberação de

grelina (UENO et al., 2004). Além disso, leptina é um potente inibidor da secreção de

insulina no estômago isolado de ratos (LIPPL et al., 2005). A redução dos níveis

basais de grelina não está associado apenas com insulina e leptina elevadas, mas

também com níveis mais elevados de IMC (CHAN et al., 2004; HAMED et al., 2011).

Grelina e leptina, secretadas pelo estômago e adipócitos respectivamente,

são hormônios de regulação da dieta que possuem grande influência no balanço

energético por sua interação com receptores específicos no eixo cérebro-intestino que

afetam a sensação de fome e saciedade. Portanto, a medida de seus níveis

plasmáticos podem indicar a sensibilidade de um animal para ganho de peso quando

expostos a dieta hipercalórica. No presente estudo, os camundongos alimentados com

DH durante quinze semanas apresentaram significativo ganho de peso corporal, bem

como aumento da massa adiposa, diminuição do nível circulante do hormônio

orexígeno grelina e aumento do hormônio anorexígeno, leptina. A secreção de grelina

e leptina possivelmente, são desregulados com a DH, prejudicando a homeostase e

consequentemente promovendo obesidade (HANDJIEVA-DARLENSKA;

BOYADJIEVA, 2009; KOCH et al., 2014).

Os grupos tratados com RPH 10 e 20 mg/kg, demonstraram aumento

significativo dos níveis de grelina, quando comparados ao grupo DH. Não houve

nenhuma mudança nos níveis de grelina do grupo tratados com AB 10 e 20 mg/kg.

Todos os grupos tratados reduziram eficazmente os níveis séricos de leptina com a

diminuição do consumo de energia. Assim a diminuição do ganho de peso nos

camundongos alimentados com DH e tratados com RPH, AB e SIB pode ser além da

diminuição da absorção de gordura e carboidratos, a diminuição do consumo de

energia.

84

Sibutramina, droga utilizada para o controle de peso foi incluída nesse

estudo como controle positivo. Houve redução significativa do acúmulo de gordura

abdominal, diminuição do peso corporal, redução de triglicerídeos e colesterol total

séricos em camundongos alimentados com DH e tratados com SIB. SIB é um inibidor

da recaptação da serotonina e da noradrenalina nas terminações nervosas do SNC,

com efeitos anorexígenos e sacietógenos. Porém já foi banida de vários países devido

a efeitos adversos cardiovasculares, não sendo recomendada para pacientes

hipertensos ou com história de cardiomegalia ou doença cardiovascular

(GASTALDELLI; BASTA, 2010).

KUATE et al. (2015) avaliaram o efeito de Tetrapleura tetráptera (HET)

composta por polifenóis, saponinas e triterpenos entre outros, em modelos

experimentais de DM2 e obesidade em ratos. Seus resultados indicaram diminuição

da ingestão alimentar e dos níveis de glicose, triglicerídeos, colesterol total. Também

houve redução nos níveis de insulina, leptina e dos marcadores inflamatórios TNF-α,

IL-6 e PCR (proteína C reativa) tratados com HET quando comparados aos grupos

não tratados.

Celastrol, um triterpeno pentacíclico extraído a partir das raízes de

Tripterygium Wilfordi suprime a ingestão de alimentos, bloqueia a redução do gasto

energético e leva até 45% de perda de peso em camundongos submetidos a dieta

hiperleptinemica, aumentando a sensibilidade a leptina. Porém foi ineficaz em

camundongos ob/ob (deficientes de leptina) e db/db (deficiência no receptor de

leptina), indicando que a atividade antiobesidade da droga em estudo deve-se a sua

ação sensibilizadora de leptina (LIU et al., 2015).

O excesso de tecido adiposo visceral pode contribuir para um aumento na

inflamação local/sistêmica e aumentar a resistência à insulina, contribuindo para o

aumento da morbidade e mortalidade cardiovascular global (HAMDY et al., 2006).

Resistina é uma adipocina secretada pelo tecido adiposo ligada a obesidade e a

resistência à insulina. Níveis normais de resistina expressam tanto um estado

nutricional adequado quanto um estado inflamatório controlado (PARK; AHIMA, 2013).

O grupo DH mostrou aumento no nível de resistina que foi reduzido significativamente

pelo tratamento com RPH20 e AB20, possivelmente como resultado de uma

diminuição da adiposidade visceral. A resistência à insulina é um fator chave para

distúrbios metabólicos como hiperglicemia e hiperinsulinemia, que são promovidos

pela obesidade (KAHN; FLIER, 2000).

85

Neste estudo, os camundongos submetidos a DH demonstraram um

aumento no acúmulo de gordura abdominal, hiperglicemia e hiperinsulinemia que

foram significativamente reduzidos nos grupos tratados com RPH 10 e 20, AB10 e 20

e SIB, sugerindo que essas drogas melhoram a obesidade associada a resistência à

insulina. O grupo DH revelou hiperleptinemia quando comparado ao grupo DP.

Embora a leptina seja conhecida como um potente sensibilizador de insulina, podendo

melhorar a tolerância a glicose, a resistência a leptina pode ocorrer como resposta a

dieta hipercalórica e ambos, hiperleptinemia e inflamação são propostos como

mecanismos causais (MORAES et al., 2013).

Anterirmente, nosso laboratório demonstrou que os triterpenos

pentacíclicos alfa e beta amirina melhoram a hiperglicemia e a dislipidemia, reduz o

risco aterogênico e melhora a tolerância a glicose em camundongos diabéticos

induzidos por estreptozotocina e em ratos alimentados com dieta hipercalórica,

possivelmente por sua ação anti-inflamatória e seus efeitos antioxidantes (SANTOS et

al., 2012).

O TNF-α age diretamente no adipócito regulando acúmulo de gordura e

interferindo diretamente em diversos processos dependentes de insulina, como a

homeostase glicêmica e o metabolismo de lipídios (WARNE, 2003). A inibição da

lipogênese (via inibição da expressão da lipoproteína lipase - LPL, GLUT-4 e da acetil

Coa sintetase) e aumento da lipólise é seu efeito mais intenso. Seu efeito na regulação

da massa de tecido adiposo, que parece estar associada com mudanças no número

ou volume de adipócitos também tem recebido interesse (FONSECA-ALANIZ et

al.,2006).

TNF-α contribui para manter o microambiente pró-inflamatório dos

adipócitos, principalmente através da ativação do fator nuclear NFkB. Este mecanismo

causa significativas mudanças na expressão gênica, suprimindo genes específicos dos

adipócitos e afetando sua funcionalidade. Além disso, também inibe diretamente a

diferenciação dos adipócitos a partir das células precursoras, diminuindo a expressão

de fatores de transcrição essenciais para a adipogênese, tais como receptor ativado

por proliferadores de peroxissoma γ (PPAR-γ) e proteinas estimuladoras de ligação a

CCAAT α e δ (C/EBPα e C/EBPδ), entre outros (PALACIOS-ORTEGA et al., 2015).

A avaliação do tamanho do adipócito é um importante parâmetro a ser

avaliado em protocolos pré-clínicos de obesidade, já que o grau de adiposidade é

considerado como fator predisponente para um quadro de baixo grau de inflamação

86

crônica associada com mediadores inflamatórios derivados de adipócitos, que podem

ter um efeito primário sobre o metabolismo através de vários mecanismos que afetam

a expressão de genes específicos do tecido adiposo, a liberação de triglicérides,

regulação da lipase e sensibilidade à insulina (EDER et al., 2009).

A IL-6 é uma citocina com efeito pró-inflamatório e ação no metabolismo

de carboidratos e lipídios. A sua infusão em doses próximas a fisiológica em humanos

saudáveis promove a lipólise, independentemente da modulação de catecolaminas,

glucagon e insulina. Esse efeito se dá a partir da inibição da LPL e aumento na

liberação de ácidos graxos livres e glicerol. A IL-6 é secretada por macrófagos e

adipócitos e sua expressão pode ser estimulada pelas catecolaminas via receptores

adrenérgicos β2 e β3 do tecido adiposo branco, quando em concentrações elevadas

(FONSECA-ALANIZ et al.,2006).

Em resumo, a obesidade e resistência à insulina são caracterizadas por

hipertrofia dos adipócitos e um baixo grau de inflamação crônica na gordura visceral.

Esta inflamação é resultado de um aumento na liberação de fatores pró-inflamatórios,

incluindo IL-6, MCP-1 e TNF-α dos adipócitos e infiltração de macrófagos (WELLEN;

HOTAMISLIGIL, 2003). Neste estudo observamos hipertrofia dos adipócitos no grupo

DH quando comparado ao grupo DP, demonstrado através da análise histológica e

determinação da área e perímetro dos adipócitos. Além disso, estes animais

apresentaram alteração no metabolismo do tecido adiposo, mostrando aumento da

liberação de adipocinas IL-6, TNF-α, resistina e da quimiocina MCP-1. Acredita-se que

a maioria dessas adipocinas pró-inflamatórias que aumentam dramaticamente na

obesidade, estão também envolvidas na patogênese da resistência à insulina. O

tratamento com RPH e AB teve efeitos benéficos, atenuando as citocinas pró-

inflamatórias e melhorando a sensibilidade à insulina, significativamente. SIB embora

tenha mostrado melhora nos níveis de insulina, não foi eficiente na redução de

resistina e TNF-α.

O triterpeno pentacíclico ginsenosídeo Rh1, maior componente bioativo

extraído de Panax ginseng, inibiu TNF-α, IL-6 e IL-1β em camundongos submetidos a

dieta hipercalórica durante 8 semanas (GU et al.,2013). Em outro estudo, Wu et al.

(2014) demonstraram que o tratamento com ginsenosídeo Rb1 inibe a inflamação no

tecido adiposo, fígado e hipotálamo na obesidade induzida por dieta hipercalórica em

camundongos. O tratamento com Rh1 melhorou a tolerância a glicose, a sensibilidade

central a leptina e a sinalização de leptina no hipotálamo (p-STAT3). Além disso,

87

observaram aumento da expressão (mRNA) de POMC (anorexígeno) e redução da

expressão de AgRP (orexígeno), não demonstrando efeito sobre NPY (orexígeno).

DINH et al. (2015) investigaram o efeito de Metil bardoxolona (BARD), um

composto sintético derivado do triterpeno ácido oleanólico na obesidade induzida por

dieta hipercalórica em camundongos. A administração oral de BARD na dose de

10mg/kg durante 15 semanas, preveniu o acúmulo de gordura, inflamação e estresse

oxidativo e melhorou a inervação simpática do tecido adiposo visceral. Houve redução

significativa da área dos adipócitos, da expressão de TNF-α, dos níveis de proteínas

relacionadas ao estresse oxidativo (STAT3, Akt, ERK e JNK) e aumento nos níveis de

proteínas (β3-AR, pTH/TH ratio e UCP2) relacionadas a atividade do sistema nervoso

simpático do tecido adiposo visceral do grupo tratado com BARD em relação ao grupo

não tratado.

O acúmulo de gordura está associado a ativação de moléculas específicas,

tais como PPARy, um marcador adipogênico bem conhecido expresso principalmente

no tecido adiposo onde desempenha um crítico papel da diferenciação de adipócitos e

lipogênese. PPARy também é expresso em células monocíticas e sua modulação

através de ligantes sintéticos pode influenciar o processo inflamatório (CORZO;

GRIFFIN, 2013). Antagonistas de PPARy são capazes de inibir a diferenciação de

adipócitos e melhorar as desordens metabólicas, tais como obesidade, resistência à

insulina e dislipidemia (WANG, 2010).

Este estudo analisou a expressão dos níveis de genes relacionados ao

metabolismo lipídico por qRT-PCR. Os níveis de mRNA de PPARy, que promove a

proliferação celular e é um fator de transcrição de muitos genes relacionados ao

metabolismo de carboidratos e lipídeos, estiveram também significativamente

aumentados no grupo DH, enquanto os grupos tratados com RPH (10 e 20 mg/kg) e

AB 20 mg/kg, demonstraram significativa redução. PPARy está relacionado a vários

distúrbios metabólicos, incluindo obesidade, resistência à insulina e dislipidemia, além

de regular o armazenamento de ácidos graxos e o metabolismo da glicose. Os genes

ativados por PPARy estimulam a absorção de lipídeos e a adipogênese pelas células

de gordura. A inativação de PPARy em camundongos os torna incapazes de acumular

tecido adiposo quando alimentados com uma dieta rica em gordura (JONES et

al.,2005). Além disso, as drogas que têm como alvo PPARy, têm demonstrado possuir

efeitos antiinflamatórios em modelos animais de obesidade (CORZO; GRIFFIN, 2013).

88

A LPL é uma enzima hidrolítica com a função de remover triglicerídeos do

plasma e regular o acúmulo de gordura no tecido adiposo e sua oxidação no tecido

muscular esquelético, sendo portanto, um alvo potencial em estratégias antiobesidade

(WANG; ECKEL, 2009). A diminuição da atividade da LPL leva a diminuição da

absorção celular de ácidos graxos e acúmulo de triglicerídeos nos adipócitos (QIAO et

al., 2014). Os níveis de mRNA de LPL apresentaram-se significativamente

aumentados nos grupo DH e SIB, ao passo que, nos grupos tratados com RPH10 e 20

e AB20, houve significativa redução. Estes dados indicam que RPH e AB são potentes

o suficiente para evitar o acúmulo de lipídeos nos adipócitos, além de reverter o

estado inflamatório do tecido adiposo, tendo como alvo LPL e PPARy.

SANO et al. (2012), concluíram que a carbenoxolona (CBX), um derivado

triterpênico, regula negativamente os genes envolvidos na adipogênese, transporte de

glicose e o metabolismo lipídico em camundongos alimentados com dieta

hipercalórica. O tratamento com CBX diminuiu peso corporal, massa de gordura

visceral e melhorou a sensibilidade a insulina destes animais. A expressão de genes

relacionados a adipogênese (PPAR e C/EBPα) e ao metabolismo lipídico (LPL, ATGL,

HSL) também foi suprimida nos animais tratados.

HU et al. (2012), relataram que a combinação de fucoxatina e ácido

linoleico conjugado atenua o ganho de peso corporal e melhora o metabolismo lipídico

em ratos obesos induzidos por dieta hipercalórica. Concluíram que o mecanismo

subjacente ao efeito antiobesidade da combinação de fucoxatina e ácido linoleico

conjugado pode ser elucidado através do aumento da expressão de adiponectina,

ATGL, CPT1A e diminuição da expressão de PPARy no tecido adiposo.

As aminotransferases, AST e ALT, são consideradas indicadoras sensíveis

de lesão hepatocelular, fornecendo uma avaliação quantitativa de agravos causados

ao fígado (MÜLLER et al., 2013). Como a ALT é uma enzima predominantemente

citosólica, qualquer perturbação na membrana plasmática das células hepáticas irá,

conseqüentemente, elevar os níveis dessa enzima no soro. Em relação à AST, cerca

de 60% dela encontram-se na mitocôndria. Diferentemente da ALT, a AST está

presente em outros órgãos (músculo cardíaco e esquelético) além do fígado, sendo o

seu aumento sugestivo tanto de danos hepáticos como musculares (KANAAN et al.,

2008). O aumento da adiposidade por ingestão de alimento hipercalórico promove a

síntese de diversas citocinas pró-inflamatórias contribuindo para que alterações

hepáticas possam ser observadas. LI et al. (2008), mostraram que uma dieta indutora

89

de obesidade aumenta os níveis plasmáticos dessas enzimas que refletem atividade

hepatotóxica.

Resinas de plantas, incluindo RPH ricas em triterpenos pentacíclicos, são

geralmente consideradas agentes terapêuticos com múltiplos alvos para a prevenção

e tratamento de perturbações do metabolismo e doenças vasculares, com nenhuma

toxicidade proeminente (SHENG; SUN, 2011). RPH, AB e SIB nas doses utilizadas

neste estudo não mostraram influência adversa sobre enzimas hepáticas, sugerindo

que são desprovidas de hepatotoxicidade.

A obesidade está associada ao acúmulo de lipídeos não só no tecido

adiposo, mas também em outros tecidos. O fígado desempenha um papel importante

na manutenção da homeostase do glicogênio, síntese de proteínas plasmáticas e

desintoxicação de drogas. É o centro do tráfico de lipídeos, síntese de colesterol,

triglicerídeos e produção de lipoproteínas. A insulina estimula a síntese de ácidos

graxos e triglicerídeos no fígado, e em seguida estes produtos são liberados pela

corrente sanguínea. Os hepatócitos são capazes de armazenar lipídeos como

pequenas gotas de triglicerídeos. Normalmente, o conteúdo lipídico hepático está

abaixo de 5% do peso do fígado. A longo prazo, DH conduzirá a esteatose hepática

devido ao acúmulo excessivo de lipídeos no fígado que está associada a um grupo de

anormalidades metabólicas caracterizadas por aumento dos níveis intra-hepáticos de

triglicerídeos e resistência à insulina. Como biomarcador de lesão hepática, a elevação

de ALT está relacionada a alterações na sensibilidade a insulina, tolerância a glicose e

inflamação. A hiperlipidemia é uma das principais características da obesidade

induzida por HFD (ZHANG et al., 2014).

A avaliação histológica do tecido hepático dos animais submetidos a DH

mostrou infiltrado inflamatório focal, leve e parenquimatoso, necrose isolada de

hepatócitos, esteatose leve microgoticular. A esse resultado soma-se a quantificação

de colesterol total, triglicerídios séricos e hepáticos, bem como o aumento do peso do

fígado demonstrando que o modelo foi efetivo em mimetizar a dislipidemia associada à

obesidade. Esses resultados são condizentes com outros estudos pré-clínicos já

publicados (MELO et al., 2009; MELO et al., 2010; RAO et al., 2011; TZENG et al.,

2013). Os grupos tratados com RPH, AB e SIB reduziram a lipemia plasmática e

hepática, sendo essa ação fundamental para a redução da deposição de gordura nos

hepatócitos (TZENG et al., 2013).

90

A fim de avaliar o efeito da RPH sobre a adipogênese utilizamos o modelo

de cultura de adipócitos 3T3-L1. Inicialmente foi observado que a RPH não provocou

alteração da viabilidade celular em células 3T3-L1 indiferenciadas ou após a

diferenciação, mostrando que a RPH não exerce citotoxicidade. Os resultados foram

obtidos nos adipócitos no período de 72h de incubação com RPH.

De modo semelhante, o triterpeno lupenona (também presente na RPH)

isolado de Adenophora triphylla, com potencial atividade antiadipogênica, não causa

efeito significativo de redução da viabilidade celular de 3T3-L1 (AHN et al., 2012;

JÚNIOR et al., 2005). Outro triterpeno pentacíclico com potencial atividade

antiadipogênica, o ácido oleanólico, não causa redução da viabilidade celular dos

adipócitos 3T3-L1 (KIM et al, 2013, SUNG et al, 2010). Em ensaio com MTT, o ácido

ursólico só causou alteração de viabilidade celular nos adipócitos maduros a partir de

48h de incubação e em concentrações acima de 20 µM, não alterando a proliferação

de pré-adipócitos ou seu ciclo celular, nem mesmo induzindo a apoptose nas

concentrações de 2,5 – 10 µM. (HE et al., 2013).

No presente estudo, a resina de Protium heptaphyllum reduziu o acúmulo

de lipídeos nas células 3T3-L1, demonstrado através da coloração com Oil Red O,

inibindo, portanto, a sua diferenciação nas concentrações de 12,5 a 50µg/mL. A

expressão de PPARγ, C/EBPα e C/EBPβ também foi inibida. Enquanto RPH atenuou

significativamente a expressão de C/EBPβ em todas as concentrações, o efeito

significativo sobre a expressão de PPARγ foi observado apenas nas concentrações de

25 e 50 µg/mL, enquanto para C/EBPα somente na dose de 50 µg/mL

PPARγ e C/EBPα são considerados os dois principais fatores adipogênicos

e regulam todo o processo de diferenciação terminal; sem o PPARγ as células não são

capazes de expressar o seu fenótipo de adipócitos e, portanto, é considerado o

regulador mestre da adipogênese (ROSEN et al., 2002). Após a exposição das células

3T3-L1 aos indutores da adipogênese, o C/EBP-β e –δ são os primeiros fatores de

transcrição induzidos e, então, ativam a expressão de PPARγ e CEBPα, reguladores

centrais da adipogênese (QUEIROZ et al., 2009).

HE et al. (2013), demonstraram que o triterpeno ácido ursólico reduziu o

acúmulo intracelular de lipídeos em células 3T3-L1, evidenciado pela coloração com

Oil Red O. A droga estudada também atenuou a adipogênese, acompanhado pela

redução da expressão da proteína C/EBPα, C/EBPβ, PPARy e SREBP-1c. Uma vez

que os fatores de transcrição adipogênicos foram regulados negativamente, os autores

91

também determinaram a expressão de suas proteínas alvo, envolvidas na biossíntese

de ácidos graxos e triacilgliceróis. Observaram que o ácido ursólico inativou ACC

(acetil-coA carboxilase) e reduziu a expressão de FAS (ácido graxo sintase) e FABP4

(proteína de ligação de ácidos graxo 4).

O Ácido oleanólico inibiu a expressão de PPARy e C/EBPα, bloqueando a

diferenciação de pré-adipócitos e atenuou o acúmulo de lipídeos celulares. Os autores

deste trabalho, também observaram que o ácido oleanólico suprimiu a produção de

visfatina, uma adipocina altamente expressa durante a adipogênese de adipócitos

3T3-L1, resultado atribuído provavelmente a sua inibição de PPAR (SUNG et al.,

2010).

O triterpeno lupenona suprime a diferenciação de adipócitos mediada

pelos fatores adipogênicos PPARy e C/EBPα. O mesmo estudo observou que as

células 3T3-L1 tratadas com lupenona reduziram a expressão de mRNA da proteína

aP2 e de resistina de forma dose-dependente (AHN; JOA, 2013). Outro estudo

demonstrou sua capacidade de inibir a diferenciação das células 3T3-L1, causando

redução do acúmulo de lipídeos nas células tratadas com concentrações de 100 –

200µM, verificado pela coloração com Oil Red O (AHN et al., 2012).

Semelhante a este resultado, tem-se que dois triterpenos hidrocarbonados,

cucurbitacina I e cucurbitacina B, inibem o acúmulo de lipídeo em células 3T3-L1

através da supressão da expressão de RNAm de PPARγ e C/EBPα, dentre outros

marcadores, após cinco dias de tratamento (Seo et al., 2014). O lupeol, um triterpeno

lupano, inibiu a adipogênese de células 3T3-L1 alterando a expressão gênica de

PPARγ e C/EBPα (HATA et al., 2008).

Ulmus pumilarico (UP) composto por pelo menos quatro triterpenóides

(ácido aleanólico, friedelina, ácido maslínico e ácido arjunólico) inibiu a adipogênese

de células 3T3-L1, atenuou o acúmulo de lipídeos celulares (Oil Red O), diminuiu a

atividade de GPDH, enzima chave na biossíntese de lipídeos, suprimiu a expressão

dos marcadores adipogêncos PPARγ, C/EBPα e SREBP-1c e do gene lipogênico FAS.

O extrato de UP também suprimiu a expressão de TNF-α, adipocina que promove

resistência a insulina e outras desordens metabólicas (GHOSH et al., 2012).

Finalmente, os resultados obtidos neste estudo mostram claramente que o

tratamento com a resina do Protium heptaphyllum e seu principal constituinte, a

mistura de alfa e beta amirina preveniram o desenvolvimento da obesidade em

92

animais submetidos a dieta hipercalórica durante 15 semanas, tendo resultados

semelhantes aos do agente anorético sibutramina. Sua ação antiobesidade afeta

principalmente o metabolismo de carboidratos e lipídeos por mecanismos que incluem

a inibição de enzimas digestivas, regulação de hormônios relacionados a fome e

saciedade e a modulação de adipocinas inflamatórias. Além disso, a resina do Protium

heptaphyllum inibe o processo de adipogênese através dos reguladores centrais da

cascata de diferenciação. No entanto, uma investigação mais aprofundada é

necessária no que diz respeito ao mecanismo molecular da ação antiobesidade destes

compostos, já que podem ter um potencial promissor no tratamento da obesidade

humana.

93

7.0. Conclusões

� A resina do Protium hepthaphyllum e a mistura de triterpenos pentacíclicos alfa

e beta-amirina, no protocolo de indução por dieta hipercalórica foram capazes

de reduzir o peso, a deposição de gordura abdominal, além de melhora

significativamente os parâmetros laboratoriais de glicemia, perfil lipídico e

funções hepáticas.

� As substâncias em estudo agem sobre a digestão e absorção de carboidratos e

das gorduras através da inibição da α-amilase e lipase plasmáticas,

respectivamente, sendo esse um possível mecanismo de ação dessas drogas.

� O mecanismo da ação antiobesidade da resina do P. heptaphyllum e da

mistura de alfa e beta amirina possivelmente envolve a regulação de

hormônios relacionados a fome e saciedade como grelina, leptina e insulina no

modelo de obesidade induzida por dieta hipercalórica em camundongos.

� A atividade anti-inflamatória da resina do P. heptaphyllum e da mistura de

triterpenos pentacíclicos alfa e beta-amirina influenciou na modulação das

adipocinas inflamatórias TNF-α, IL-6, MCP-1 e resistina, promovendo uma

redução significativa das suas concentrações plasmáticas em camundongos

submetidos ao modelo de obesidade induzida por dieta hipercalórica.

� Os dados indicam que a resina bruta do Protium hepthaphyllum e a mistura de

alfa e beta-amirina são potentes o suficiente para evitar o acúmulo de lipídeos

nos adipócitos, além de reverter o estado inflamatório do tecido adiposo, tendo

como alvo LPL e PPARy.

� O tratamento com a resina do P. heptaphyllum e a mistura de alfa e beta-

amirina não demonstrou toxicidade evidente através da avaliação da atividade

enzimática da ALT e AST e preveniu alterações provocadas pela dieta

hipercalórica no fígado e gordura abdominal evidenciadas pelas análises

histológicas.

� A a resina do P. heptaphyllum inibe o processo de adipogênese através dos

reguladores centrais da cascata de diferenciação, PPARγ e C/EBPα.

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