ISSN 1678-0493

Diálogos & Ciência

w ww. f t c . b r /d i a logos

Biologia de Sistemas de Pectinases do Fungo

Moniliophthora perniciosa

Edson Mario de Andrade Silvaa, Heliana Argôlo Santos Carvalhoa, Fabienne Michelia,b

aCentro de Biotecnologia e Genetica - DCB, Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), Ilhéus, BA, BrazilbCentre de Coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement (CIRAD), UMR AGAP, Montpellier, France

doi: 10.7447/dc.2013.006

1. Introdução

As pectinas são moléculas complexas de ácido poligalacturônico que contém regiões smooth (não ramificadas) e hairy (ramificadas), e que constituem em média 35% da parede primária dos vegetais superiores (CAFFALL & MOHNEN, 2009; RIDLEY et al, 2001). A molécula de pectina é composta de varias regiões (de acordo com o tipo de ramificação e composição): homogalacturonano (HG), ramnogalacturonano I (RGI), ramnogalacturonano II (RGII) e xylogalacturonano (XGA) (VISSER, 1996). O HG é um

polímero linear que consiste em uma cadeia principal formada por ácidos D-galacturônicos, os quais podem encontrar-se acetilados e/ou metil-esterificados; ii) o RGI consiste em uma cadeia que alterna resíduos de ácido galacturônico com resíduos de ramnose, nos quais podem ser encontradas ligadas covalentemente cadeias laterais de resíduos de açúcares neutros como galactose e arabinose; iii) o RGII possui cadeia linear de homogalacturonano com cadeias laterais complexas ligadas aos resíduos de galacturonato; e iv) o XGA que consiste em uma cadeia composta de ácido galacturônico e resíduos de xilose (HARHOLT et al, 2010). Segundo a

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I N F O R M A Ç Õ E S R E S U M O

Histórico:Recebido em25/02/2013

Revisado em:15/03/2013

Aceito em:19/03/2013

As pectinases (pectina-metilesterases [PMEs], poligalacturonases [PGs] e protopectinases) são enzimas que degradam substâncias pécticas, principais constituintes da lamela média dos vegetais. Fitopatógenos produzem tais enzimas, que são de fundamental importância para a sua virulência. A vassoura de bruxa, doença causada pelo basidiomiceto hemibiotrófico, Moniliophthora perniciosa, tem comprometido a cacauicultura no sul da Bahia. Dados do sequenciamento do genoma desse patógeno revelaram a presença de genes homólogos a pectinases. O objetivo desse trabalho foi analisar uma rede de interação proteína-proteína obtida por biologia de sistemas, gerada a partir de uma poligalacturonase de M. perniciosa (MpPG2). Para tal, foi feita um busca do ortólogo em Neurospora crassa utilizando o Blast reverso (reciprocal Blast). A rede foi montada no http://string-db.org/ com o ortólogo NCU02369, e apresentou 683 nós. Para o estudo da rede, foi utilizado o programa Cytoscape, no qual foram realizadas análises i) de centralidade, que revelou 30 gargalos dentre os quais a MpPG2 se encontrou, 149 hubs e 142 hubs-gargalos; e ii) de modularidade, onde foi possível identificar seis clusters; e iii) de ontologia gênica. A NCU10045 é uma pectinesterase que apareceu na rede interagindo com a NCU02369-MpPG2, ela relaciona-se com outras proteínas como a NCU05063 que é uma glicosil hidrolase da parede celular, além de interagir com a NCU06326.1, que é uma pectato liase-1. Assim, foi possível inferir que pectinases e algumas hidrolases encontradas na rede, interagem direta ou indiretamente com a NCU02369-MpPG2, reunindo assim um conjunto de atividades enzimáticas que podem ser determinantes para a invasão do hospedeiro.

Palavras-chave:Vassoura-de-bruxa, Pectinases, Interação planta-patógeno

A U T O R E S A B S T R A C T

EMAS* mariodeandradee@gmail.comTécnico em Tecnologia de Alimentos

HASCMestre em Genética e Biologia Molecular

FMDoutor em Fisiologia Celular e Molecular de Plantas

TITLE: Systems biology of Moniliophthora perniciosa pectinasesPectinases (pectin methylesterases [PMEs], polygalacturonases [PGs] and protopectinases) are enzymes involved in the degradation of the pectic molecule, which is the main component of the plant middle lamella. Phytopathogens produce such enzymes, which are very important for their virulence. The witches’ broom disease, caused by the hemibiotrophic basidiomycete Moniliophthora perniciosa, has committed the cacao production in South Bahia, Brazil. Moniliophthora perniciosa genome sequencing revealed the presence of homologous of pectinase genes. The objective of this work was to obtain a physical protein-protein interaction network by systems biology, generated from a M. perniciosa polygalacturonase (MpPG2). The search for Neurospora crassa MpPG2 ortholog was performed using the reciprocal Blast. The network was obtained in http://string-db.org/ with the NCU02369 ortholog and presented 683 nodes. For the network study, we used the Cytoscape software in which the following analyses were made: i) centrality which revealed 30 bottlenecks including the MpPG2, 149 hubs and 142 hubs-bottleneck; ii) modularity which allowed the identification of 6 clusters; and iii) gene ontology. The NCU10045 is a pectinesterase which interacts in the network with NCU02369-MpPG2; it was also related to other proteins such as the NCU05063 glycosyl hydrolase or with the NCU06326.1 pectate lyase-1. Thus, it was possible to suggest that pectinases and hydrolases were found in the network and interacted directly or indirectly with NCU02369-MpPG2 forming a set of enzymatic activity that may be crucial for host invasion.Keywords: witches’ broom disease, pectinases, plant-pathogen interaction

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Sociedade Americana de Química (American Chemical Society) é possível classificar os carboidratos pécticos em: i) protopectina; ii) pectina; iii) ácido péctico; e iv) ácido pectínico. Essa classificação está baseada em sua solubilidade em água e grau de metilação, onde as pectinas são as mais solúveis e possuem sua cadeia poligalacturônica com diferentes graus de metoxilação.

Embora complexos, os carboidratos pécticos são facilmente degradados por enzimas pécticas (pectinases) que podem ser classificadas em protopectinases, pectinesterase e enzimas despolimerizante (JAYANI et al, 2005) de acordo com o substrato e a região do esqueleto poligalacturônico no qual atua (ALKORTA 1998). As protopectinases agem sobre a protopectina tornando-a solúvel. As pectina metilesterases (PMEs) atuam convertendo pectina altamente esterificada a uma forma de baixa metoxilação. Nas enzimas despolimerizantes, encontram-se as poligalacturonases (PGs) que rompem as ligações α-(1-4) entre os resíduos de ácido galacturônico não esterificados. As PGs se destacam dentre as pectinases por serem de grande importância para os patógenos na colonização do hospedeiro (LANG e DÖRNENBURG, 2000). Elas são classificadas em i) endo-PGs que hidrolisam o esqueleto poligalacturônico aleatoriamente; e ii) exo-PGs que rompem as ligações glicosídicas α-(1-4) terminais. Algumas destas enzimas tem ações sequenciais como o caso das PMEs que geram pectina de baixa metoxilação levando a uma atuação sinérgica com as PGs, uma vez que estas atuam sobre a pectina de baixa metoxilação. De uma forma geral, as pectinases são produzidas por uma gama de microrganismos como fungos filamentosos, leveduras e bactérias (JAYANI et al, 2005). Com esse conjunto de atividades enzimáticas, os patógenos de plantas passam a ter grande eficiência na invasão de seu hospedeiro. No caso de Moniliophthora perniciosa, basidiomiceto hemibiotrófico causador da doença vassoura-de-bruxa em cacau, foram identificados três genes de PGs. A proteina MpPG2 é o centro do presente estudo.

Devido a sua complexidade, a compreensão de um sistema biológico exige recursos seguros e adequados para o seu estudo, e a biologia de sistemas computacional se candidata como uma das melhores ferramentas para essa finalidade (KITANO, 2002). As redes de interação (networks) física proteína-proteína são ferramentas de grande importância no estudo dos processos biológicos em um determinado organismo, a fim de se criar modelos em diferentes escalas de organização biológica que explique o seu funcionamento (BELTRAO CAGNEY e KROGAN, 2010). Baseando-se nessas interações, é possível estudar complexos proteicos e associá-los a suas respectivas funções, fato que coloca a biologia de sistemas em destaque, por dar um grande suporte na análise de dados gerados por análises de larga escala, como proteômica ou transcriptômica, dentre outras (IDEKER & KROGAN, 2012).

Para a construção e análise de redes biológicas, a bioinformática apresenta um fundamental papel, desde o suporte na busca de ortólogos com o uso de algorítimos como o BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), até a disponibilidade de bancos de dados on-line como o STRING® (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes; SZKLARCZYK et al., 2011), o qual prediz e modela redes tridimensionais, baseando-se em informações de suas interações física e funcionais contidas em outros bancos de dados, como por exemplo, o UniProt® (MAGRANE & CONSORTIUM, 2011), SMART® (LETUNIC et al, 2009), GeneCards® (SAFRAN et al., 2010) e SWISS-MODEL (KIEFER et al, 2009). As análises computacionais da biologia de sistemas contam também com ferramentas off-line como o Cytoscape® (SHANNON, 2003). O Molecular Complex Detection (MCODE®) é um software que é encontrado como plugin para o Cytoscape, e que gera sub-grafos (cluster) a

A MpPG2 38 GNGPEYWDGLGGNGGVTKPAPMMKYVVESSELSQNIDRIKISGVYQDVVVVNSPARTYSV 97 G+G +YWDGLG G + KP + +E S V + V ++N+P + S+XP_959790.2 104 GSGEKYWDGLGQKGPIKKPKFFQVHNLEDS-------------VIEGVTILNAPVQVMSI 150

MpPG2 98 SNPGPLLITSLTIDNSLGDEPNDQSNGEPAGHNTDGFDC-STHDLVISNSVIHNQDDCLA 156 + L +TS T+DN GD D G+ G NTD FD S+ ++VI + ++NQDDC+AXP_959790.2 151 NGCKNLTVTSFTLDNKAGD--GDWKAGK-GGRNTDAFDIGSSSNIVIDGAKVYNQDDCVA 207

MpPG2 157 INKGSNITFSGNTCTGGHGISVGSI--SSDAVVTDIHITNNMIIDKLVQLAKPYDQALRI 214 IN G++ITF C+GGHG+S+GS+ SD V ++ N++I + + RIXP_959790.2 208 INSGTDITFRNGLCSGGHGLSIGSVGGRSDNTVKNVLFENSVIANS--------ENGARI 259

MpPG2 215 KTKADATSASVSGVTYSGNTATGCKRFGVIIDQ 247 KT T+ VS +TY ++G+++DQXP_959790.2 260 KTNY-GTTGLVSNITYRNVKLQNITKYGIMVDQ 291

BXP_959790.2 79 FAGPL--LSISSSSKLTIRGLSSSVLYGSGEKYWDGLGQKGPIKKPKFFQVHNLEDS--- 133 + GPL L I + +T+ G + G+G +YWDGLG G + KP + +E S RecMpseq 12 WEGPLFTLKIPRLTAITVNG-NGRKFDGNGPEYWDGLGGNGGVTKPAPMMKYVVESSELS 70

XP_959790.2 134 ----------VIEGVTILNAPVQVMSINGCKNLTVTSFTLDNKAGD--GDWKAGK-GGRN 180 V + V ++N+P + S++ L +TS T+DN GD D G+ G NRecMpseq 71 QNIDRIKISGVYQDVVVVNSPARTYSVSNPGPLLITSLTIDNSLGDEPNDQSNGEPAGHN 130

XP_959790.2 181 TDAFDIGSSSNIVIDGAKVYNQDDCVAINSGTDITFRNGLCSGGHGLSIGSVGGRSDNTV 240 TD FD S+ ++VI + ++NQDDC+AIN G++ITF C+GGHG+S+GS+ SD VRecMpseq 131 TDGFDC-STHDLVISNSVIHNQDDCLAINKGSNITFSGNTCTGGHGISVGSI--SSDAVV 187

XP_959790.2 241 KNVLFENSVIANS--------ENGARIKTNY-GTTGLVSNITYRNVKLQNITKYGIMVDQ 291 ++ N++I + + RIKT T+ VS +TY ++G+++DQRecMpseq 188 TDIHITNNMIIDKLVQLAKPYDQALRIKTKADATSASVSGVTYSGNTATGCKRFGVIIDQ 247

C

RecMpseq 1 MNGDITFGVANWEGPLFTLKIPRLTAITVNGNGRKFDGNGPEYWDGLGGNGGVTKPAPMM 60 MNGDITFGVANWEGPLFTLKIPRLTAITVNGNGRKFDGNGPEYWDGLGGNGGVTKPAPMMMpPG2 1 MNGDITFGVANWEGPLFTLKIPRLTAITVNGNGRKFDGNGPEYWDGLGGNGGVTKPAPMM 60

RecMpseq 61 KYVVESSELSQNIDRIKISGVYQDVVVVNSPARTYSVSNPGPLLITSLTIDNSLGDEPND 120 KYVVESSELSQNIDRIKISGVYQDVVVVNSPARTYSVSNPGPLLITSLTIDNSLGDEPNDMpPG2 61 KYVVESSELSQNIDRIKISGVYQDVVVVNSPARTYSVSNPGPLLITSLTIDNSLGDEPND 120

RecMpseq 121 QSNGEPAGHNTDGFDCSTHDLVISNSVIHNQDDCLAINKGSNITFSGNTCTGGHGISVGS 180 QSNGEPAGHNTDGFDCSTHDLVISNSVIHNQDDCLAINKGSNITFSGNTCTGGHGISVGSMpPG2 121 QSNGEPAGHNTDGFDCSTHDLVISNSVIHNQDDCLAINKGSNITFSGNTCTGGHGISVGS 180

RecMpseq 181 ISSDAVVTDIHITNNMIIDKLVQLAKPYDQALRIKTKADATSASVSGVTYSGNTATGCKR 240 ISSDAVVTDIHITNNMIIDKLVQLAKPYDQALRIKTKADATSASVSGVTYSGNTATGCKRMpPG2 181 ISSDAVVTDIHITNNMIIDKLVQLAKPYDQALRIKTKADATSASVSGVTYSGNTATGCKR 240

RecMpseq 241 FGVIIDQVNPEAE 253 FGVIIDQVNPEAEMpPG2 241 FGVIIDQVNPEAE 253

Figura 1: Obtenção do ortólogo de MpPG2 em Neurospora crassa. A. Alinhamento de MpPG2 com o Best hit (precursor de poligalacturonase XP_959790.2) do Blastp de MpPG2 contra o banco de sequências de N. crassa. B. Alinhamento de XP_959790.2 com o Best hit (RecMpseq) do Blastp de XP_959790.2 contra o banco de sequências de M. perniciosa (reciprocal blast). C. Alinhamento das duas sequências (MpPG2 e resultado do reciprocal blast) de M. perniciosa.

partir de uma rede biológica baseando-se em processos biológicos, o que permite um melhor estudo dos complexos proteicos (BADER, 2003). O estudo dos processos celulares, biológicos ou moleculares pode ser feito com o auxílio da Biological Networks Gene Ontology tool (BiNGO®), (MAERE et al, 2005). Outro importante algoritmo é o CentiScaPe®, ele determina a centralidade (ou relevância no que diz respeito a interação de cada nó na rede). Dentre as centralidades temos, por exemplo: i) o Degree, que corresponde ao grau de conectividade de um nó a nós adjacentes; o seu valor é de grande importância para a determinação do número de interações que faz um determinado nó em uma rede; e ii) o Betweenness (SCARDONI et al, 2009) que, segundo YU et al (2007), é uma das propriedades mais importantes na topologia da rede e é utilizada para discriminar nós gargalos (bottlenecks).

2. Material e Métodos

A busca da sequência ortóloga a proteína MpPG2 em Neurospora crassa, foi realizada no NCBI (National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov), usando o algoritmo Blastp (proteína contra proteína). O resultado de maior e-value foi usado como possível candidato à proteína ortóloga da MpPG2. Em seguida, foi feito um Blastp reverso (reciprocal blast), com a sequência de N. crassa, contra M. perniciosa. A reciprocidade foi verificada quando o Best hit (maior e-value) alinhava 100% a sequência original de MpPG2.

A sequência de N. crassa ortóloga da MpPG2 (NCBI:

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Figura 2: Resultado das análises feitas para a rede montada com a MpPG2 (NCU02369); A, rede obtida no STRING moldada no Cytoscape; B, cluster 1; C, cluster 2; D, cluster 3; E, cluster 4; F, cluster 5; G, cluster 6.

XP_959790.2) foi usada para modelar uma rede de interação proteína-proteína no STRING database (http://string-db.org), onde, a princípio, não foi selecionado nenhum organismo como referência. Foi detectada uma proteína hipotética de N. crassa com 379 resíduos de aminoácidos denominada NCU02369. Os parâmetros utilizados para a adição de nós a rede foram: não mais que 50 interações, baixa confiança (0,150) e foi requerido a adição de 800 nós. Foi possível obter uma rede saturada com 683 nós.

Para a mineração dos dados, a matriz disponibilizada pelo STRING no formato texto foi utilizada no Cytoscape, onde a rede de interação proteica foi remodelada e analisada com o MCODE®, no qual foram selecionados os módulos que apresentaram um score a partir de 2,5. Para o estudo dos processos biológicos nos quais as proteínas da rede e os complexos proteicos obtidos pelo MCODE estavam envolvidos, foi utilizado o BiNGO, com teste estatístico hipergeométrico e testes múltiplos de correção (Benjamini & Hochberg’s FDR com nível de significância de 0,05). O plugin CentiScaPe foi aplicado selecionando a rede principal e a direcionando para a analise das centralidades Degree e Betweenness, a fim de detectar os nós hubs, gargalos e hubs-gargalos. Para melhor compreensão de rede modelada, foi realizada uma busca da função de cada proteína no banco de dados de N. crassa (http://www.broadinstitute.org /annotation/genome/neurospora/MultiHome.html).

3. Resultados e Discussão

Blastp reversoO Blastp da MpPG2 contra Neurospora crassa teve como

best hit um precursor de poligalacturonase (XP_959790.2). O alinhamento teve uma cobertura de 83%, e-value de 1e-29 e identidade máxima de 35% (Figura 1A). O precursor de poligalacturonase XP_959790.2 foi, em seguida, comparado (reciprocal Blast) com o banco de dados de M. perniciosa, o que resultou no alinhamento apresentado na Figura 1B, este tendo uma cobertura de 58%, e-value de 7e-31 e identidade máxima de 34%. O alinhamento das duas sequencias de M. perniciosa (antes e depois do reciprocal Blast) apresentou identidade e cobertura de 100%, além de e-value de 0,0 (Figura 2C), assim podemos considerar que o ortólogo de MpPG2 em N. crassa é verdadeiro.

Rede de interação proteína-proteínaFoi obtida uma rede geral de interações físicas e

funcionais contendo 683 nós e 20597 conectores, além dos 6 clusters gerados pelo MCODE® (Figura 2). Foram detectados Figura 3: Complexo proteico envolvido na desramificação e degradação da pectina.

30 gargalos; dentre eles, sete interagem com a ortóloga da MpPG2, NCU02369. Há uma pectinesterase (NCU10045), que atua reduzindo o grau de metoxilação de pectinas, favorecendo a ação da poligacturonase. Na Figura 3 podemos observar um complexo proteico que envolve a NCU02369 e NCU10045. É também possível notar uma variedade de enzimas relacionadas à desramificação e degradação da pectina, fato que torna o substrato poligalacturônico mais acessível às pectinases.

Modelos criados para N. crassa revelaram que metabólitos gerados pela degradação da parede celular, como xilose, glicose, celobiose, por exemplo podem estar modulando a expressão gênica de enzimas como celulase e hemicelulases (CHAOGUANG TIAN et al., 2009). O fungo M. perniciosa

invade o cacaueiro através de seus tecidos meristemáticos (PURDY e SCHMIDT, 1996), que são ricos em substâncias pécticas, o que nos leva a inferir que o complexo exposto na Figura 2, embora seja um modelo para N. crassa pode muito bem estar presente em M. perniciosa, visto que a rede foi montada com uma proteína ortóloga a MpPG2. Trabalhos de comparação das sequências dessa rede com o genoma do M. perniciosa pode vir a revelar melhores informações sobre a homologia do complexo proteico como um todo e estar confirmando a existência de processos bastante similares.

4. Agradecimentos

O trabalho de HASC foi fomentado pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). O trabalho de EMAS foi fomentado pelo Centre de Coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement (CIRAD) e em seguida pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Esta pesquisa foi financiada pelo Banco do Nordeste (BNB) e pela Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC).

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