1

CONTAMINANTES MICROBIOLÓGICOS EM ALIMENTOS

ÁSPÉCTOS RELATIVOS A METODOLOGIAS

26/10/09

2

Tese de Doutorado

Dr. Mario Killner

Profa. Dra. Bernadette D.G. M. Franco

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Ciência dos Alimentos - Área de Bromatologia

Paralelos entre Métodos Fenotípicos, Imunológicos e

Genotípicos para Detecção Rápida de Salmonella spp em

Matizes Alimentares sem Contaminação Experimental:

Avaliação em Condições Reais e Simultâneas de Uso

3

INTRODUÇÃO

Respostas rápidas: monitoração de processos de

produção e/ou produtos terminados;

Por quê métodos rápidos?

Redução de custos: performance (estocagem,

otimização de processos, segurança alimentar);

Facilidade de treinamento dos analistas.

4

INTRODUÇÃO

Avaliações nem sempre foram realizadas com matrizes alimentares sem contaminação experimental;

Limitações dos trabalhos encontrados

Foram desenvolvidas em condições laboratoriais artificiais, não reproduzindo condições de trabalho de rotina.

Ausência de informações quanto a eventuais diferenças de desempenho dos kits, face à contaminação experimental ou artificial.

5

OBJETIVO

1. Avaliar criticamente diferentes métodos de detecção de Salmonella spp em alimentos, nas seguintes condições de uso:

Matrizes naturais, sem contaminação experimental;

Emprego simultâneo dos sistemas em avaliação para análise de uma mesma amostra de alimento, tendo a ISO 6579:2002, como método de referência;

2. Contribuir com informações adicionais, que possam subsidiar os laboratórios na seleção de novos métodos para detecção de Salmonella spp em alimentos.

6

MATERIAIS E MÉTODOS

Métodos e número de amostras de alimentos utilizados no estudo

Métodos Número de Amostras

ISO 6579:2002 244

BAX Salmonella 244

TECRA UNIQUE SALMONELLA 145

VIP Salmonella 85

Transia Plate Salmonella Gold 85

VIDAS Salmonella (SLM) 88

Singlepath Salmonella 87

1-2 Test 87

Total de análises realizadas 1.065

7

Amostras sem contaminação experimental

MATERIAIS E MÉTODOS

Distribuição dos grupos de amostras analisadas

Grupos Número de

Amostras

Frango, ovos e produtos avícolas 143 58,6 %

Farelo de soja 44 18,0 %

Carnes e produtos cárneos 37 15,2 %

Outros produtos 20 8,2 %

Total 244 100,0 %

8

Pré –enriquecimento

Não seletivo para todos

Seletivo quando esta-belecido na metodologia

Amostra

ISO 6579:2002

BAX Salmonella

TECRA UNIQUE Salmonella

VIP Salmonella

Transia Plate Salmonella Gold

VIDAS Salmonella (SLM)

Singlepath Salmonella

1-2 Test

MATERIAIS E MÉTODOS

9

MATERIAIS E MÉTODOS

Determinação do limite de detecção

carne,

leite e

gelatina

Matrizes utilizadas:

10

MATERIAIS E MÉTODOS

Determinação do limite de detecção

Sorovares utilizados: (pool)

Salmonella Infantis,

Salmonella Typhimurium,

Salmonella Heidelberg e

Salmonella Enteritidis

11

MATERIAIS E MÉTODOS

Determinação do limite de detecção

Níveis de inóculo por matriz:

1,0 (UFC/25 g)

4,0 (UFC/25 g)

9,3 (UFC/25 g)

12,7 (UFC/25 g) e

33,3 (UFC/25 g)

Determinações realizadas em triplicata.

12

MATERIAIS E MÉTODOS

Determinação do limite de detecção

Análises envolvidas:

3 x 5 x 8 x 3 = 360 análises

Matrizes utilizadas 3Níveis de inóculo por matriz 5Métodos avaliados 8Determinações realizadas 3

(triplicata)

13

RESULTADOS

RESULTADOS

Positividade encontrada para Salmonella spp nos diferentes grupos de amostrasanalisadas pela metodologia ISO 6579:2002

Grupos de amostrasNúmero de amostras

analisadas

Positividade para Salmonella spp Distribuição das amostras positivas

para Salmonella spp por grupo de matriz

analisada

Número de amostras positivas

Percentual de amostras positivas no

grupo

Frango, ovos e produtos

avícolas 143 15 10,5% 30,0%

Farelo de soja 44 9 20,5% 18,0%

Carnes e produtos cárneos 37 21 56,8% 42,0%

Outros produtos 20 5 25,0% 10,0%

Total 244 50 20,5% 100,0%

14

RESULTADOS

Porcentagem de concordância dos resultados presuntivos positivos para Salmonella spp nos métodos rápidos avaliados em relação aos resultados positivos pela metodologia ISO 6579:2002, nos diferentes grupos de amostras analisadas

Métodos

Grupos BAX Unique VIP Transia VIDAS Singlepath 1-2 Test

Frango, ovos e produtos avícolas

93,3% 64,3% 64,3% 90,9% 92,9% 57,2% 42,3%

Farelo de soja 100% 77,8% 88,9% 88,9% 100% 44,5% 55,6%

Carnes e produtos cárneos

90,5% 50,0% 85,0% 90,0% 90,0% 85,0% 90,0%

Outros produtos 80,0% 100% 100% 100% 100% 75,0% 80,0%

15

RESULTADOS

Métodos

Grupos BAX Unique VIP Transia VIDAS Singlepath 1-2 Test

Frango, ovos e produtos avícolas

6,6% 35,7% 35,7% 9,1% 7,2% 42,9% 53,8%

Farelo de soja 0% 22,2% 11,1% 11,1% 0% 55,6% 44,4%

Carnes e produtos cárneos

9,5% 50,0% 15,0% 5,0% 10,0% 15,8% 5,3%

Outros produtos 20,0% 0% 0% 0% 0% 25,0% 0%

Total 8,0% 35,4% 18,8% 6,7% 6,2% 31,9% 26,7%

Resultados falso-negativos para Salmonella spp nos métodos rápidos avaliados em relação aos resultados positivos pela metodologia ISO 6579:2002, nos diferentes grupos de amostras analisadas (a)

(a) Valores calculados considerando as amostras analisadas pelo método avaliado em relação ao método ISO 6579:2002, descontando-se os resultados duvidosos

16

RESULTADOS

Resultados analíticos consolidados dos diferentes métodos avaliados na pesquisa de Salmonella spp em amostras de carne, leite em pó integral e gelatina granulada artificialmente contaminadas com um “pool” de cepas de Salmonella Enterica em 5 níveis de inóculo.

ISO 6579:2002

BAX VIDASTran-

siaVip

Single-path

1-2 Test

Unique

Porcentagem de concordância (a) 100% 97,7% 100% 100% 93,2% 81,8% 95,5% 75,0%

Resultados presuntivos positivos (b) 44(d) 43 44 44 41 36 42 33

Resultados negativos (c) 0 1 0 0 3 8 2 11

Resultados duvidosos Não aplicável 0 0 0 0 0 0 0

Total de amostras analisadas 44 44 44 44 44 44 44 44

(a) Porcentagem de concordância com a positividade encontrada pela metodologia ISO 6579:2002, nos 5 níveis de inóculo, em relação às amostras analisadas pelo método avaliado.

(b) Resultados presuntivos positivos coincidentes com os resultados positivos pela metodologia ISO 6579:2002

(c) Resultados negativos encontrados nas metodologias analisadas, nos 5 níveis de inoculo, nas diferentes amostras

(d) Para o método ISO 6579:2002, estes resultados são positivos confirmados

17

RESULTADOS

Porcentagem de concordância dos resultados presuntivos positivos para Salmonella spp nos

métodos rápidos avaliados em relação aos resultados positivos pela metodologia ISO 6579:2002

em amostras de alimentos sem contaminação experimental e amostras de alimentos

artificialmente contaminadas

ISO

6579:2002 BAX VIDAS Transia VIP Single-

path 1-2

Test Unique

Amostras sem contaminação experimental

100% 92,0% 93,8% 91,1% 81,3% 68,1% 68,8% 63,8%

Amostras artificialmente contaminadas

100% 97,7% 100% 100% 93,2% 81,8% 95,5% 75,0%

18

CONCLUSÕES

Nas condições em que este presente trabalho foi desenvolvido pode-se concluir que:

o desempenho dos métodos rápidos avaliados na detecção de

Salmonella spp em alimentos sem contaminação experimental pode

diferir substancialmente daquele apresentado em alimentos

artificialmente contaminados;

os métodos rápidos avaliados devem ser utilizados unicamente para

fins de triagem, sendo que uns têm maior capacidade do que outros

para indicar em curto espaço de tempo quais amostras de alimento

poderiam estar contaminadas com Salmonella spp;

19

CONCLUSÕES

os métodos rápidos avaliados podem dar resultados falso-positivos,

em porcentagens que variam de acordo com a matriz alimentar

analisada, ou seja, podem indicar falsamente a presença de Salmonella

spp, implicando na necessidade de confirmação do resultado antes da

liberação do resultado final. O laboratório deverá estar capacitado para

o atendimento destas situações;

os métodos rápidos avaliados podem dar resultados falso-negativos,

portanto apresentam o perigo de não detectar Salmonella spp,

eventualmente presente, nas amostras analisadas, levando à liberação

de resultados equivocados;

20

CONCLUSÕES

o desempenho dos métodos rápidos avaliados pode variar com a matriz

alimentar analisada. Assim, a seleção do método rápido a ser utilizado

para a pesquisa de Salmonella spp, em um dado tipo de alimento

depende de uma avaliação prévia de seu desempenho nesse tipo de

alimento;

a adoção de um método rápido para detectar Salmonella spp em

determinada matriz alimentar tem um risco intrínseco. A seleção de um

dado método rápido só deve ser feita após a determinação do grau de

risco que se queira assumir.

21

Obrigado!

Laercio Goularte

SFDK Laboratório de Análise de Produtos Ltda.

www.sfdk.com.br