FABOLA XOCHILT VALDEZ DOMINGOS

BIOMARCADORES DE CONTAMINAO AMBIENTAL

EM PEIXES E OSTRAS DE TRS ESTURIOS BRASILEIROS

E CINTICA DE DERIVADOS SOLVEIS DO PETRLEO

EM PEIXES Tese apresentada ao programa de Ps-Graduao em Biologia Celular e Molecular, Setor de Cincias Biolgicas da Universidade Federal do Paran, como requisito parcial para obteno do grau de Doutor em Cincias Biolgicas com rea de Concentrao em Biologia Celular e Molecular. Orientador: Prof. Dr. Ciro A. Oliveira Ribeiro Co-orientora: Profa. Dra. Helena C. Silva de Assis Colaborao: Dr. milien Pelletier Dr. Claude Rouleau

CURITIBA 2006

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Esta tese dedicada meus pais Ailton (in memoriam) e Maria Luisa e minha

filha Bianca por todo seu auxlio, incentivo e

dedicao incondicionais.

ii

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador Prof. Dr. Ciro Alberto de Oliveira Ribeiro a quem considero meu Pai

Cientfico, pelos 9 anos de orientao, confiana e apoio nos momentos difceis.

A minha Co-Orientadora Prof. Dr. Helena Cristina da Silva de Assis por sua orientao,

pacincia e confiana.

Aos meus Orientadores na Universit do Quebc a Rimouski Prof. Dr. Emilien Pelletier

(Institut des Sciences de la Mer de Rimouski - ISMER, Universit du Qubec Rimouski) e Dr.

Claude Rouleau (IML Institut Maurice Lamontagne), pela acolhida pessoal e profissional e por

sua contribuio significativa na minha formao durante os 7 meses em que estive no

Canad.

A meus pais Ailton (in memoriam) e Maria Luisa, sem seus ensinamentos, incentivo e

auxlio eu no estaria concludo esta tese.

A minha filha Bianca, por ter me privado de sua companhia em diversos momentos de

minha formao, por pacincia, motivao e esperana.

A minha famlia pelo incentivo, entusiasmo, e confiana.

A meus amigos, pessoas maravilhosas, com quem compartilho vitrias e tropeos.

A Manuela da Silva Dreyer, Nara Bobko, Patcia de Souza Diogo, Michele da Cunha

Torres, pelo auxlio na preparao das amostras.

Aos colegas do Laboratrio de Toxicologia Celular em especial a Francisco Filipak Neto

pelo auxlio imediato nas mais diversas tarefas, especialmente quelas relacionadas a

informtica.

A Gislaine Canuel, Stephane, Coraline, Isabelle Desbiens pelo auxlio na preparao dos

experimentos, coleta de amostras e manuseio de equipamentos.

A Irene Sloss, Gustavo, Antnio Curtosi, Emilie Doussantouse e Stephane pela calorosa

acolhida no Canad e auxlio nos mais diversos momentos.

Ao Centro de Estudos do Mar CEM, professores Henry Louis Spach, Paulo Lana e suas

equipes pela disponibilidade e auxlio logstico nas coletas realizadas em Paranagu.

A todos os pesquisadores e suas respectivas equipes pelo auxlio nas coletas e no

processamento inicial das amostras nas universidades: UFPE, UFRPE e UFES.

Ao Programa de Ps-Graduao em Biologia Celular e Molecular da UFPR.

A Marlene Camargo, por sua ateno e eficincia.

Aos professores desta academia especialmente Cloris Faraco, Clia Franco, Marco

Randi, Lus Fernando Favaro, Slvio Sanches Veiga, Stnio que tanto contriburam para a minha

formao.

A finalmente a UFPR, instituio na qual passei grande parte dos ltimos 11 anos de

minha vida.

iii

Ao PROJETO RECOS INSTITUTO DO MILNIO Ministrio da Cincia e Tecnolgia pelo

financiamneto do projeto (www.mileniodomar.org.br).

Ao Centro de Microscopia Eletrnica (CME) UFPR, especialmente a Regina, Rosngela,

Srgio e Matilde.

A CAPES pela bolsa de doutorado no pas e pela bolsa sanduche no exterior.

iv

O que seria da cincia sem a curiosidade?

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SUMRIO LISTA DE FIGURAS..................................................................................................................................vii LISTA DE TABELAS..................................................................................................................................viii RESUMO..................................................................................................................................................ix ABSTRACT................................................................................................................................................x INTRODUO GERAL ............................................................................................................................ 1 1. CONTAMINAO EM AMBIENTES AQUTICOS .............................................................................. 1 1.1. METAIS PESADOS ..................................................................................................................................2 1.2. HIDROCARBONETOS POLICCLICOS AROMTICOS ........................................................................3 1.3. PESTICIDAS ORGANOCLORADOS ......................................................................................................5 1.4. PESTICIDAS ORGANOFOSFORADOS E CARBAMATOS.....................................................................7 1.5. ORGANOESTANHOS: TRIBUTIL-ESTANHO (TBT) E DIBUTIL-ESTANHO (DBT) .....................................7 2. PEIXES E MOLUSCOS COMO BIOINDICADORES DE QUALIDADE AMBIENTAL.............................. 10 3. BIOMONITORAMENTO..................................................................................................................... 12 4. BIOMARCADORES ........................................................................................................................... 14 5. CINTICA DE CONTAMINANTES EM ORGANISMOS AQUTICOS COMO FERRAMENTA PRVIA A ESTUDOS DE BIOMONITORAMENTO.................................................................................................... 16 CAPTULO I: BIOMARCADORES DE CONTAMINAO AMBIENTAL EM PEIXES NOS ESTURIOS BRASILEIROS DE PARANAGU (PR), PIRAQU-A (ES) E ITAMARAC (PE)....................................18 I. 1. INTRODUO................................................................................................................................ 19 I.2. MATERIAIS E MTODOS ................................................................................................................. 21 I.2.1. ESPCIES BIOINDICADORAS ...........................................................................................................21 I.2.2. REAS DE ESTUDO E ESTRATGIA AMOSTRAL................................................................................21 I.2.2.1. Itamarac - Complexo Estuarino Canal de Santa Cruz - PE.................................................23 I.2.2.2. Piraqu - Sistema Estuarino dos rios PiraquAu e Piraqu-Mirim - ES .............................24 I.2.2.3. Paran - Complexo Estuarino Baa de Paranagu.................................................................25 I.2.3. PROCEDIMENTOS INICIAIS ..............................................................................................................26 I.2.4. BIOMARCADORES SOMTICOS .....................................................................................................26 I.2.5. BIOMARCADORES MORFOLGICOS.............................................................................................27 I.2.5.1. Avaliao Histopatolgica .........................................................................................................27 I.2.5.2. Microscopia Eletrnica de Transmisso ...................................................................................28 I.2.5.3. Microscopia Eletrnica de Varredura.......................................................................................28 I.2.6. BIOMARCADOR BIOQUMICO - AVALIAO DA COLINESTERASE ...........................................28 I.2.7. TRATAMENTO ESTATSTICO DOS DADOS........................................................................................29 I.3. RESULTADOS .........................................................................................................................................30 I.3.1. INDICES SOMTICOS........................................................................................................................30 I.3.2. HISTOPATOLOGIA DE BRNQUIAS .................................................................................................32 I.3.3. HISTOPATOLOGIA DE FGADO .......................................................................................................32 I.3.4. ATIVIDADE DA COLINESTERASE ......................................................................................................37 I.4. DISCUSSO .................................................................................................................................... 38 CAPTULO II: BIOMARCADORES DE CONTAMINAO AMBIENTAL EM OSTRAS NOS ESTURIOS BRASILEIROS DE PARANAGU (PR), PIRAQU-A (ES) E ITAMARAC (PE)........................ ........... 45 II. 1. INTRODUO............................................................................................................................... 46 II.2. MATERIAIS E MTODOS ................................................................................................................ 48 II.2.1. ESPCIE BIOINDICADORA...............................................................................................................48 II.2.2. REAS DE ESTUDO E ESTRATGIA AMOSTRAL..............................................................................48 II.2.2.1. Itamarac - Complexo Estuarino Canal de Santa Cruz - PE................................................50 II.2.2.2. Piraqu - Sistema Estuarino dos rios PiraquAu e Piraqu-Mirim - ES ............................51 II.2.2.3. Paran - Complexo Estuarino Baa de Paranagu................................................................52 II.2.3. PROCEDIMENTOS INICIAIS..............................................................................................................53 II.2.4. BIOMARCADOR SOMTICO..........................................................................................................54II.2.5. BIOMARCADORES MORFOLGICOS ...........................................................................................54

vi

II.2.5.1.Avaliao Histopatolgica .........................................................................................................54 II.2.5.2. Microscopia Eletrnica de Transmisso .................................................................................55 II.2.5.3. Microscopia Eletrnica de Varredura.....................................................................................55 II.2.6. BIOMARCADOR BIOQUMICO - AVALIAO DA COLINESTERASE..........................................55 II.2.7. TRATAMENTO ESTATSTICO DOS DADOS ......................................................................................56 II. 3. RESULTADOS................................................................................................................................. 57 II.3.1. PARMETROS FSICO-QUMICOS DA GUA................................................................................57 II.3.2. NDICE SOMTICO ..........................................................................................................................57 II.3.3. HISTOPATOLOGIA.........................................................................................................................59 II.3.3.1. Leses Detectadas ......................................................................................................................59 II.3.3.2. Ocorrncia de Leses ................................................................................................................63 II.3.4. ATIVIDADE DA COLINESTERASE .....................................................................................................65 II. 4. DISCUSSO .................................................................................................................................. 66

CAPTULO III: CINTICA DE DERIVADOS DE PETRLEO EM Fundulus heteroclitus E Salvelinus alpinus APS EXPOSIO HDRICA........................................................................................ ........... 73 III.1. INTRODUO............................................................................................................................... 74 III.2. MATERIAIS E MTODOS ............................................................................................................... 75 III.2.1. ESPCIES BIOINDICADORAS........................................................................................................75 III.2.1. EXPERIMENTO COM RADIOISTOPOS.......................................................................................76 III.2.1.2. Autoradiografia (WBARG Whole-body Autoradiography)............................................77 III.2.2. SIMULAO DE DERRAMAMENTO DE PETRLEO....................................................................77 III.2.2.1.Anlise de HPAs na gua ........................................................................................................ 79 III.2.2.2.Anlise de HPAs na bile ........................................................................................................... 80 III.3. RESULTADOS................................................................................................................................. 81 III.3.1. Experimento com radioistopos................................................................................................81 III.3.1.1. Anlise Qualitativa................................................................................................................... 81 III.3.1.2. Anlise Quantitativa................................................................................................................ 83 III.3.2. SIMULAO DE DERRAMAMENTO DE PETRLEO....................................................................84 III.3.2.1.Anlise de HPAs na gua ........................................................................................................ 85 III.3.2.2. Anlise de HPAs na bile .......................................................................................................... 86 III.4. DISCUSSO .................................................................................................................................. 87 CONSIDERAES FINAIS .................................................................................................................... 91 CONCLUSES ...................................................................................................................................... 93 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .......................................................................................................... 94

vii

LISTA DE FIGURAS

CAPTULO I Figura 1. Localizao geogrfica dos pontos referncia (R) e contaminado (C) nas trs regies

estuarinas avaliadas na costa brasileira...................................................................................23 Figura 2. ndice hepatossomtico (IHS), e fator de condio (FC) de peixes coletados em trs

esturios brasileiros.......................................................................................................................31 Figura 3. Histopatologia de brnquias de peixes das reas

estuarinas avaliadas....................................................................................................................34 Figura 4. ndice histopatolgico de leses branquiais de indivduos coletados nas reas estuarinas

estudadas.....................................................................................................................................34 Figura 5. Histopatologia de fgado em indivduos coletados nas reas estuarinas

avaliadas...................................................................................................................................35 Figura 6. ndice histopatolgico de leses hepticas de indivduos coletados nas reas

estuarinas estudadas...................................................................................................................37 Figura 7. Ocorrncia de centros de melanomacrfagos (CMM) e melanomacrfagos livres (MM)

no fgado de indivduos coletados nas reas estuarinas estudadas....................................37 Figura 8. Atividade da colinesterase no msculo de indivduos coletados nas reas

estuarinas estudadas...................................................................................................................36 CAPTULO II Figura 1. Localizao geogrfica dos pontos referncia (R) e contaminados (C1 e C2) nas trs

regies estuarinas avaliadas na costa brasileira.....................................................................48 Figura 2. ndice de condio (IC) de Crassostrea rhizophora coletada no inverno e vero em trs

esturios brasileiros......................................................................................................................57 Figura 3. Leses histopatolgicas observadas nas brnquias de

Crassostrea rhizophorae.............................................................................................................57 Figura 4. Organizao ultraestrutural e leses detectadas nos filamentos branquiais de

Crassostrea rhizophorae..........................................................................................................59 Figura 5. Microscopia eletrnica de varredura das brnquias de

Crassostrea rhizophorae.............................................................................................................60 Figura 6. Ocorrncia comparativa de leses histopatolgicas nas brnquias de Crassostrea

rhizophorae entre trs regies estuarinas da costa brasileira.............................................62 CAPTULO III Figura 1. Recipiente de conteno de petrleo.....................................................................................48 Figura 2. Autoradiogramas de Fundulus heteroclitus aps exposio de 24h. ..................................79 Figura 3. ndice de concentrao (IC) de Naftaleno, Naftol e Fenantreno em Fundulus heteroclitus

durante 21 dias de experimento...............................................................................................81 Figura 4. Eliminao de Naftaleno, Naftol e Fenantreno durante o perodo de depurao em

Fundulus heteroclitus durante 21 dias de experimento..........................................................81 Figura 5. Presena de HPAs na gua durante o experimento de simulao de derramamento de

petrleo em Salvelinus alpinus...................................................................................................82 Figura 6. Cromatogramas de bile obtidos por HPLC-FL. ........................................................................83

viii

LISTA DE TABELAS

CAPTULO I Tabela 1. Exemplos de fatores de importncia utilizados no clculo do ndice de leses segundo

Bernet et al. (1999)....................................................................................................................27 Tabela 2. Parmetros fsico-qumicos da gua nos trs esturios avaliados.......................................30 Tabela 3. Parmetros fsico-qumicos da gua nos trs esturios avaliados. .....................................30 CAPTULO II Tabela 1. Parmetros fsico-qumicos da gua nos trs esturios avaliados. .....................................56 Tabela 2. Alteraes histopatolgicas relacionadas a exposio contaminantes observadas por

alguns autores nas brnquias de bivalves................................................................................66 CAPTULO III Tabela 1. Caractersticas dos contaminantes testados..........................................................................74 Tabela 2. Estimativa da concentrao de HPAs metilados em amostras provenientes da

simulao de derramamento de petrleo...........................................................................83

Tabela 3. Caractersticas dos metablitos naftol, fenantrol e pirenol..................................................83

ix

RESUMO

Ambientes aquticos, particularmente regies estuarinas, constituem o destino final de diversos tipos de contaminantes. Este estudo apresenta duas abordagens diferentes: a avaliao comparativa de biomarcadores em trs regies estuarinas brasileiras e avaliao da cintica de derivados do petrleo atravs de bioensaios. Para o biomonitoramento dos esturios de Paranagu (PR), Piraqu (ES) e Itamarac (PE) foram utilizados trs organismos bioindicadores: peixes (Cathorops spixii e Lutjanus synagris) e ostras (Crassostrea rizophorae). Biomarcadores somticos, histopatolgicos (brnquias e fgado) e bioqumico (atividade da acetilcolinesterase) foram avaliados em ambas as espcies. Diferenas nos ndices somticos e atividade da colinesterase, bem como a ocorrncia de leses histopatolgicas foram detectadas nos peixes. As ostras apresentaram ndices de condio e atividade da colinesterase similar entre as reas avaliadas, alm disso, leses histopatolgicas foram observadas nestes organismos. Em todas as reas amostradas os peixes apresentaram diferenas no fator de condio, nas leses histopatolgicas hepticas e branquiais, bem como na atividade da colinesterase nos diferentes pontos de coleta. A avaliao cintica e toxicolgica de derivados de petrleo foi realizada atravs de dois experimentos (1) exposio a derivados de petrleo (naftaleno, naftol e fenantreno) marcados com 14C e (2) simulao de derramamento de petrleo. Atravs do experimento (1) foi possvel observar a cintica dos compostos avaliados na espcie de peixe Fundulus heteroclitus. Os principais rgos alvo destes compostos foram vescula biliar, intestino e fgado. Atravs da simulao de derramamento de petrleo foi possvel detectar a presena de derivados de HPAs na gua atravs de espectofotometria e de HPLC-FL, porm estes compostos no foram detectados na bile de Salvelinus alpinus atravs da anlise ao HPLC-FL. Os resultados obtidos nos esturios brasileiros revelam que todas as reas avaliadas esto impactadas, bem como a importncia da abordagem de mltiplos biomarcadores em estudos de biomonitoramento. Os estudos relativos cintica contribuem para uma melhor compreenso dos mecanismos de disperso, biocumulao e distribuio de HPAs leves em peixes.

Palavras-chave: atividade da acetilcolinesterase, biomarcadores, biomonitoramento, cintica de derivados de petrleo, fenantreno, hidrocarbonetos policclicos aromticos, histopatologia, naftaleno, naftol.

x

ABSTRACT

Aquatic environments, particularly estuarine regions, receive a expressive load of contaminants. This study presents two different approaches: a comparative biomarker evaluation in three Brazilian estuarine areas and a kinetic evaluation of petroleum derivatives through bioassays. The biomonitoring of Paranagu (PR), Piraqu (ES) and Itamarac (PE) estuaries were carried out on three bioindicator species: fishes (Cathorops spxii and Lutjanus synagris) and oysters (Crassostrea rizophorae). Somatic, histopathologic (gills and liver) and biochemical biomarkers (cholinesterase activity) were evaluated on these species. Differences on somatic indexes and cholinesterase activity as well as the occurrence of histopathologic lesions were detected on fishes. Oysters presented somatic indexes and cholinesterase activity values similar between evaluated areas, besides that, histopathologic lesions were observed on these organisms. Fishes presented differences on condition factor, histopathologic lesions on liver and gills, as well on cholinesterase activity. In order to evaluate the kinetic parameters of petroleum derivatives two experiments were done: (1) a waterborne exposition to selected petroleum derivatives (naphthalene, naphtol and phenantrene) radiollabeled with 14C and (2) a simulation of an oil spill. The results of the first experiment showed that the main target organs for naphthalene, naphtol and phenantrene in Fundulus heteroclitus, were gall blader, intestine and liver. The presence of petroleum derivatives was detected on the aquaria water trhough spectophotometry and HPLC-FL after the oil spill simulation. However these compounds were not detected on the bile of evaluated animals anlysed through HPLC-FL. The results obtained on the Brazilian estuaries suggest that all evaluated areas are impacted, as well the relevance of a multibiomarker approach on biomonitoring studies. The kinetic results contribute to a better understanding of dispersion, bioaccumulation and distribution of light PAHs on fishes.

Key-words: acetilcholinesterase activity, biomarkers, biomonitoring, histopathology, kinetic of petroleum derivatives, naphtalene, naphtol, phenentrene, polycyclic aromatic hidrocarbons.

INTRODUO GERAL

1. CONTAMINAO EM AMBIENTES AQUTICOS

Os ecossistemas aquticos so considerados receptores finais de

contaminantes liberados no ambiente, estando susceptveis a ao de

contaminantes areos, que chegam aos corpos dgua por deposio

atmosfrica e contaminantes terrestres que atingem os ambientes aquticos

atravs do escoamento destes pelas chuvas.

Os esturios so ambientes aquticos de transio entre ecossistemas

dulccolas e marinhos. So regies parcialmente fechadas nas quais a gua do

mar bastante diluda pelo aporte de gua doce do continente (Thurman e

Trujillo, 1999). As regies estuarinas so extremamente importantes do ponto de

vista biolgico, pois apresentam alta riqueza de espcies e podem ser

consideradas como berrio para diversas espcies marinhas, tanto pela

proteo quanto pela grande disponibilidade de nutrientes (Thurman e Trujillo,

1999).

Situados em regies costeiras, os esturios freqentemente encontram-se

localizados em reas de grande atividade antropognica, sendo, portanto

susceptveis aos impactos decorrentes destas atividades. As principais fontes de

impacto ambiental em esturios seriam o escoamento de esgoto proveniente de

reas urbanas, a liberao de diversos produtos qumicos (orgnicos e

inorgnicos) pela atividade industrial, a agricultura e o fluxo de embarcaes,

atividade a partir da qual podem ocorrer vazamentos acidentais de petrleo e

derivados, combustveis e outros produtos transportados por via martima (Kennish,

1991).

Atravs das diversas fontes acima citadas, os poluentes mais comumente

encontrados em esturios so: metais pesados (em especial os compostos

2

organoestanhos); hidrocarbonetos policclicos aromticos (HPAs); pesticidas como

bifenilas policloradas(PCBs), organoclorados (OC) e organofosforados; dioxinas e

furanos; detergentes e outros componentes do esgoto urbano e da ocupao

humana.

1.1. METAIS PESADOS

Os metais pesados correspondem a um grupo de elementos qumicos que

apresenta massa atmica variando entre 63,54 a 200,59 (Viarengo, 1989). A

maioria dos metais pesados apresenta potencial txico comprovado, ou seja,

so capazes de induzir efeitos deletrios aos organismos vivos expostos (Dallinger

e Raimbow, 1993). Alguns metais pesados como ferro, cobre, zinco e cobalto, so

considerados elementos essenciais aos processos biolgicos, mas podem ser

txicos quando em concentraes mais elevadas (Kennish, 1991; Heath, 1995).

A atividade industrial de minerao, processamento de metais e gerao

de despejos industriais e domsticos vem contribuindo para o aumento da

concentrao de diversos metais pesados nos ambientes naturais (Abel, 1989).

Os organismos vivos podem bioacumular metais pesados, incorporando-os na

cadeia trfica e atingindo grande parte dos diferentes estratos que constituem os

ecossistemas aquticos (Viarengo, 1989).

Experimentos agudos com peixes atravs de estudos de laboratrio

mostraram que o mercrio capaz de induzir alteraes branquiais como a

fuso de lamelas secundrias nas espcies Trichomycterus zonatus e Salvelinus

alpinus (Oliveira Ribeiro et al., 1996; Oliveira Ribeiro et al., 2000). No entanto

3

existem relatos de que outros metais pesados, como o chumbo, tambm podem

afetar a estrutura das brnquias em peixes (Alves Costa, 2001).

Alteraes hepticas em peixes expostos a metais tambm foram

relatadas em nosso grupo de pesquisa. reas de necrose, danos nucleares e

morte celular foram relatados por Rabitto et al (2005) em Hoplias malabaricus

aps exposio crnica a chumbo inorgnico. Oliveira Ribeiro et al. (2002)

observaram desorganizao citoplasmtica e reas de necrose aps exposio

trfica ao metil-mercrio.

1.2. HIDROCARBONETOS POLICCLICOS AROMTICOS

Os hidrocarbonetos policclicos aromticos (HPAs), so compostos

orgnicos que apresentam dois ou mais anis carbnicos fundidos. Alguns HPAs

como o benzo[a]pireno, so formados atravs da combusto incompleta de

compostos orgnicos e subseqente recombinao com outras partculas

orgnicas, constituindo portanto uma fonte importante destes compostos

(Harvey,1991).

HPAs podem ser introduzidos naturalmente no ambiente atravs de

queimadas de florestas, pastagens e atividades vulcnicas. Como fontes

antropognicas de HPAs possvel destacar: descargas e derramamentos de

petrleo, gerao de energia eltrica, esgotos urbanos e industriais, incinerao

de lixo e madeira, aquecimento de casas alm da produo de carvo e asfalto

(Albers, 1995).

A presena de HPAs em ambientes aquticos contaminados pode ser

detectada tanto nos componentes biticos quanto nos componentes abiticos

4

do ecossistema. Mamferos, aves, peixes e vrios macroinvertebrados so

capazes de metabolizar os hidrocarbonetos ingeridos, porm, organismos que

vivem muito prximos fonte de contaminao ou que no possuem sistemas

de detoxificao bem desenvolvidos, como os bivalves, tendem a bioacumular

estes compostos mais intensamente (Albers, 1995).

Em invertebrados tem-se registrado que os HPAs so capazes de causar a

induo de danos celulares, presena de tumores, prejuzos na reproduo,

reduo das taxas de crescimento e desenvolvimento, e em casos de

contaminao muito severa, a morte dos organismos (Hsu e Deng, 1996 e Ueno

et al, 1995). Alm dos efeitos descritos, em peixes os HPAs freqentemente esto

associados a mutaes, malformaes, tumores e cncer (Collier et al. 1998), e

ainda a alteraes fisiolgicas e morfolgicas nos rins e fgado, hiperplasia nas

brnquias e eroso em nadadeiras observadas por Hsu e Deng (1996).

Dados mostram que os hidrocarbonetos derivados do petrleo provocam

danos estruturais nas lamelas respiratrias das brnquias (DiMichele e Taylor, 1978;

Engelhardt et al., 1981; Poirier et al.,1989; Correa e Garcia, 1990; Prasad, 1991,

Nero et al., 2006), comprometendo as trocas gasosas do organismo com o meio

e resultando em hipxia, sendo esta a principal causa de morte em massa de

peixes. Alm disso, Spiers et al. (1996) identificaram leses hiperplsicas em

clulas mucosas e de cloreto nas brnquias de peixes expostos a HPAs.

Hidrocarbonetos podem se acumular em ovos de peixes e so

transferidos para as larvas aps a ecloso dos ovos (Goksoyr et al., 1991). Spiers et

al. (1996) observaram necroses mltiplas e um varivel nmero de macrfagos e

linfcitos no fgado de organismos expostos em um derramamento de petrleo

5

no canal de Santa Brbara. Segundo estudos de diversos autores os

hidrocarbonetos provenientes do petrleo elevam as concentraes de cortisol

no plasma (Di Michele eTaylor, 1978; Levitan e Taylor, 1979; Engelhardt et al., 1981;

Leloup-Hatey e Hardy, 1985). O aumento na concentrao deste hormnio

deprime a funo da tireide (Redding et al., 1986; Brown et al., 1991), podendo

apresentar como conseqncia alteraes no comportamento reprodutivo e

alimentar dos organismos expostos.

Estudos recentes realizados em nosso laboratrio mostraram que a frao

solvel do petrleo capaz de causar inibio na atividade da

acetilcolinesterase (AChE) em Astyanax sp aps exposio aguda, bem como

vrias das leses mencionadas acima (Akaishi et al., 2004).

1.3. PESTICIDAS ORGANOCLORADOS

Aps a Segunda Guerra Mundial, ocorreu um sbito aumento no uso dos

inseticidas. Logo aps o seu uso comeou-se a observar que tais compostos eram

encontrados com freqncia no ambiente natural, principalmente em

organismos que no constituam seu alvo inicial. Sua toxicidade, persistncia e

caractersticas lipoflicas, causavam o acmulo de resduos em tecidos,

mortalidade, efeitos na reproduo e declnio de populaes selvagens. Estudos

sobre os efeitos de pesticidas em peixes tiveram incio logo aps a introduo do

DDT (dimetil-difenil-tricloroetano) em 1943 (Blus,1995).

Alm da vasta utilizao na agricultura, como pesticidas, outros

organoclorados (PCBs - bifenilas policloradas, DDT, dioxinas e furanos),

principalmente os PCBs tm sido extensivamente utilizados nas indstrias

6

eletrnicas, manufatura de adesivos, aditivos de leo hidrulico, tintas, extintores,

plsticos e em copiadoras de papel (Tam e Yao, 2002).

Assim como os HPAs, vrios dos compostos organoclorados pertencem a

classe dos poluentes orgnicos persistentes (POPs), os quais so compostos que

apresentam resistncia degradao e, portanto, encontram-se por perodos

de tempo prolongados no ambiente (Ali e Sreekrishnan, 2001; Fillman et al., 2002).

Os POPs podem ser transportados por longas distncias, pois tem sido detectados

em amostras biolgicas coletadas em locais distantes das fontes de

contaminao (Simonich e Hites, 1995 apud Vives e Grimalt, 2002) e podem

participar de diversos ciclos biogeoqumicos sem sofrerem degradao (Vives e

Grimalt, 2002).

Por sua toxicidade e persistncia no ambiente, os POPs tem sido o alvo

principal de atuao dos rgos de proteo ambiental no Canad (Canadian

Environmental Protection) e Estados Unidos (United States Protection Agency -

EPA) (Ali e Sreekrishnan, 2001). Os POPs, por serem de difcil degradao, tendem

a se concentrar no ambiente e serem bioacumulados pelos organismos vivos

afetando a sade dos ecossistemas e da mesma forma colocando em risco a

sade humana (Fillman et al., 2002). Os compostos organoclorados persistem por

longos perodos no ambiente, com isso atuam cronicamente sobre os organismos

vivos sendo capazes de induzir alteraes genticas nos organismos expostos,

podendo levar a alteraes congnitas e neoplasias diversas (Ali e Sreekrishnan,

2001). Sendo assim, estes compostos esto associados a graves efeitos

ambientais, atuando sobre uma ampla variedade de espcies e atingindo todos

os nveis trficos (Blus,1995). A exposio a organoclorados tem sido associada ao

7

declnio de populaes de animais marinhos (Tanabe et al,. 1994 apud Fillman et

al., 2002).

1.4. PESTICIDAS ORGANOFOSFORADOS E CARBAMATOS

Os organofosforados e carbamatos so pesticidas que tem sido utilizados

no controle de insetos e outros invertebrados (Hill, 1995). Esta classe de pesticidas

rapidamente metabolizada ou excretada pela maioria dos organismos vivos,

no havendo bioconcentrao nas cadeias trficas. Portanto, os

organofosforados e carbamatos apresentam um tempo relativamente curto de

permanncia no ambiente. Esses fatores, associados sua eficincia tem

favorecido a substituio dos organoclorados pelos organofosforados e

carbamatos.

Os organismos podem ser afetados pelos organofosforados e carbamatos

atravs do contato direto, que pode ocorrer na aplicao do pesticida, na

ingesto de gua, solo, presas ou alimentos contaminados. Vrios estudos

mostram que organismos aquticos expostos organofosforados e carbamatos

afetam a atividade das colinesterases (De la Torre et al., 2002; Rofriguez-Fuentes e

Gold-Bouchot, 2000; Tortelli et al., 2006).

1.5. ORGANOESTANHOS: TRIBUTIL-ESTANHO (TBT) E DIBUTIL-ESTANHO (DBT)

O TBT (tributil-estanho) um composto organometlico que tem sido

amplamente utilizado como biocida em tintas de embarcaes desde a

dcada de 70, e talvez seja o agente qumico mais txico que tem sido

introduzido deliberadamente nos ecossistemas aquticos (Pelletier, 1995). Alm

8

disso, este composto utilizado tambm na indstria de PVC como estabilizador,

na proteo de madeira contra fungos e bactrias, como agente desinfetante e

como pesticida na agricultura. Apesar de regulamentado o uso do TBT em vrios

pases, a contaminao ainda persiste em nveis txicos crnicos, havendo

registros da presena deste composto nos organismos aquticos e sedimento

(Fent e Hunn, 1995).

Em vrios animais (como mamferos, peixes e invertebrados) foi

demonstrado que o TBT metabolizado em produtos intermedirios hidroxilados

como o dibutil-estanho (DBT) e monobutil-estanho (MBT) (Fent, 1996).

Experimentos in vivo e in vitro tm demonstrado que xenobiontes como o TBT

podem inibir o sistema enzimtico citocromo P450 em peixes, atravs da

inativao de algumas enzimas deste complexo, alterando-as e inibindo o seu

funcionamento (Fent e Stegman, 1993; Fent e BucheliI, 1994). Desta forma, o TBT

pode alterar tanto o seu prprio metabolismo quanto o de outros poluentes que

so biotransformados pelo sistema P450. Alm disso pode interferir em outras vias

metablicas do organismo como a biosntese de hormnios, processo do qual

este complexo multienzimtico participa (Pdros et al., 2000).

Segundo Fent e Meier (1992), a presena de TBT na gua leva a um alto

ndice de mortalidade de larvas de Phoxinus phoxinus, alm de deformao no

eixo do corpo, paralisia e presena de olhos opacos. Tambm foi observado

nesta mesma espcie degenerao na pele, msculo esqueltico, rim e epitlio

da crnea, com algumas clulas apresentando vacuolizao do citoplasma e

picnose. Dados recentes e ainda no publicados pelo nosso grupo, mostram que

o TBT quando dissolvido na gua, leva mortalidade de 100% da populao de

9

alevinos de Phaloceros caudimaculatus, em concentraes consideradas

subletais para outros organismos de clima nrdico. Estes resultados mostram que

alevinos de Phaloceros caudimaculatus so mais sensveis do que peixes de clima

temperado. A sensibilidade e suscetibilidade mais acentuada em organismos

tropicais do que nrdicos foi demonstrada no estudo realizado por Oliveira

Ribeiro et al. 2000, neste trabalho a espcie brasileira Trichomycterus zonatus foi

capaz de acumular maiores concentraes de Hg do que espcie nrdica

Salvelinus alpinus em condies experimentais similares. Estes resultados reforam

ainda mais o argumento de que a legislao referente a nveis mximos

permissveis da presena de contaminantes na gua deveria ser estabelecida a

partir de resultados obtidos com espcies nativas, dados esses que ainda so

escassos na literatura.

Trabalhos desenvolvidos no nosso laboratrio demonstraram ainda que

exemplares de Salvelinus alpinus submetidos a injees intraperitoneais de 0,3 mg

TBT/kg apresentaram necroses hepticas e alteraes na organizao da

cromatina em hepatcitos (Valdez Domingos, 1999). A presena de necroses

associada exposio ao TBT tambm foi relatada por outros autores (Holm et

al., 1991; Schwaiger et al., 1992; Ueno et al., 1994 e Ueno et al., 1995 e Oliveira

Ribeiro et al, 2002), evidenciando este tipo de alterao como um importante

elemento na identificao do potencial txico do TBT em fgado de peixes. O

fgado um importante rgo-alvo para o TBT e seus derivados, onde a ao

deletria deste composto pode comprometer as condies de vida do

organismo tanto pela importncia do rgo, quanto pela gravidade das

alteraes diagnosticadas.

10

Dada sua toxicidade faz-se necessria a quantificao e discusso dos

nveis de TBT e DBT na costa brasileira, bem como estudos para diagnosticar de

forma mais ampla seus reais efeitos sobre os organismos aquticos tropicais

brasileiros. A utilizao de espcies nativas nestes estudos, mesmo quando

realizados em condies de laboratrio, constituem dados importantes

auxiliando na escolha de espcies bioindicadoras em estudos de

biomonitoramento e diagnstico de reas impactadas por estes contaminantes.

Diante das mltiplas fontes de impacto antropognico sobre as regies

costeiras, principalmente nas reas estuarinas, faz-se necessrio o

desenvolvimento e a padronizao de metodologias e de biomarcadores que

possam contribuir para a avaliao e diagnstico dos impactos a que esto

sujeitas estas regies no Brasil.

2. PEIXES E MOLUSCOS COMO BIOINDICADORES DE QUALIDADE AMBIENTAL

Bioindicadores so espcies de organismos vivos cujas caractersticas

favorecem sua utilizao na avaliao da sade de um determinado

ecossistema. Alguns fatores devem ser considerados na escolha de espcies

bioindicadoras em estudos de biomonitoramento: (1) a espcie deve ser

representativa da rea de estudo; (2) deve possuir hbito preferencialmente

sedentrio ou de baixa mobilidade, constituindo assim populaes fixas a fim de

que sua exposio aos contaminantes possa refletir as condies da regio em

estudo (Radtke, 1979); (3) os organismos bioindicadores devem ser de fcil

identificao e coleta em todas as estaes do ano; (4) o tamanho do animal

um fator importante, pois deve possibilitar a obteno de material biolgico

11

suficiente para garantir a realizao das anlises propostas no estudo (Stewart e

Malley, 1997); e (5) o nvel trfico da espcie a ser utilizada tambm deve ser

avaliado, pois espcies que ocupam nveis trficos superiores geralmente so

mais representativas, uma vez que podem fornecer informaes relacionadas

aos fenmenos de bioacumulao e biomagnificao (Oliveira Ribeiro et al.,

1999; Vives e Grimalt ,2002).

A utilizao de espcies de vertebrados e de invertebrados em um mesmo

estudo de biomonitoramento ambiental gera resultados que possibilitam uma

anlise mais ampla das condies de impacto do ambiente, visto que existem

diferenas na fisiologia e complexidade de respostas que estes organismos

podem apresentar. Desta forma o uso de um nmero variado de biomarcadores

como avaliaes somticas, moleculares, bioqumicas, genticas, imunolgicas

e morfolgicas torna o estudo mais representativo. No entanto, dependendo do

biomarcador selecionado, os protocolos para estes parmetros diferem,

podendo ser especficos para grandes grupos taxonmicos ou mesmo para

famlias, gneros e espcies, fazendo-se necessria uma padronizao prvia

dos protocolos antes do incio das amostragens definitivas.

Peixes e moluscos apresentam vrias das caractersticas acima citadas e

tm sido considerados excelentes bioindicadores. Estes organismos vm sendo

amplamente utilizados em estudos de toxicologia e monitoramento ambiental, na

avaliao da sade dos ecossistemas aquticos tanto com relao presena

quanto aos efeitos de poluentes (Carajaville et al., 2000; Silva et al., 2001; Nasci et

al., 2002; Svrdh, 2003; Amado et al., 2003 e 2006; Joyeux et al., 2004; Medeiros et

12

al., 2005; Oliveira Ribeiro et al., 2005; Binelli et al., 2006; Rabitto et al., 2005; Nigro et

al., 2006; Teles et al., 2006; Zanette et al., 2006).

3. BIOMONITORAMENTO

Atravs de programas de monitoramento possvel identificar e

acompanhar impactos antropognicos em determinadas reas ao longo do

tempo (Lange, 1996). Inicialmente os estudos de monitoramento enfocavam a

deteco de contaminantes no compartimento abitico de ambientes

aquticos (coluna dgua e sedimento) (Van der Oost et al., 1996; Rainbow et al.,

1995; Silva et al., 2001), posteriormente comeou-se a avaliar a presena de

xenobiontes nos componentes biticos desses contaminantes (Kehrig et al., 1998;

Schmitt et al., 1999; Watanabe et al., 1999). Alguns autores como Meyer et al.

(1998), Silva et al. (2001), Joyeux et al. (2004), Pereira e Kuch (2005) e Silva et al.

(2006) relatam a presena de contaminantes em guas costeiras brasileiras.

Estudos de biomonitoramento direcionados a deteco e avaliao de

efeitos em organismos vivos so bem mais recentes (Doran et al., 2001; Barreiro et

al., 2002; Nasci et al., 2002; Monteiro et al., 2005; Munteanu e Munteanu, 2006) e

vm sendo bastante utilizados em ambientes estuarinos e marinhos na Europa e

Amrica do Norte (Nasci et al., 2002; Petrovic et al., 2004; Munteanu and

Munteanu, 2006; Nigro et al., 2006). Na costa brasileira ainda so escassos os

dados relativos biomonitoramento, estes estudos foram recentemente inciados

e vm sendo realizados mais intensamente nos ltimos anos (Ventura et al., 2002;

Lemos et al., 2005; Martins et al., 2005; Amado et al., 2006; Camargo and

Martinez, 2006; Zanette et al., 2006), como o projeto RECOS financiado pelo

13

Ministrio da Cincia e Tecnologia atravs do Instituto do Milnio, do qual faz

parte o presente trabalho.

O Projeto Instituto do Milnio - RECOS - Uso e Apropriao dos Recursos

Costeiros, um projeto amplo, aprovado pelo Ministrio da Cincia e Tecnologia

(Dez/2001), e financiado pelo Banco Mundial, no qual esto envolvidas diversas

instituies brasileiras: FURG, CECO (UFRGS); UNISUL, CLIMERH/EPAGRI (SC), UFSC,

UFPR, IAG (USP), UFFL, UFES, UFRPE, UFPE, UFMA, UFPA e Museu Goeldi.

Quatro grandes reas temticas constituram o Projeto Instituto do Milnio:

(1) Modelo Gerencial da Pesca, (2) Maricultura Sustentvel, (3) Monitoramento,

Modelagem, Eroso e Ocupao Costeira e (4) Qualidade Ambiental e

Biodiversidade. Na rea temtica Qualidade Ambiental e Biodiversidade do

Projeto Instituto do Milnio est inserido o programa Qualidade Ambiental

Biomarcadores, que realizou estudos em 5 regies da costa brasileira nos estados

do Par (PA), Pernambuco (PE), Esprito Santo (ES), Paran (PR) e Rio Grande do

Sul (RS).

O presente trabalho est inserido no programa acima citado, que objetivou

avaliar e comparar cinco diferentes regies da costa brasileira impactadas por

atividades antropognicas, atravs da utilizao de diferentes classes de

biomarcadores, bem como estabelecer e padronizar metodologias que possam

ser efetivamente aplicadas em estudos de biomonitoramento em regies

costeiras do Brasil.

14

4. BIOMARCADORES

Biomarcadores so respostas bioqumicas, fisiolgicas ou parmetros

morfolgicos alterados, causados pela exposio de um organismo a um

determinado xenobionte (Melancon, 1995). Os biomarcadores tambm podem ser

definidos como alteraes biolgicas em nvel molecular, celular e fisiolgico, as

quais expressam a exposio e os efeitos txicos causados pelos poluentes (Walker

et al., 1996).

Alguns critrios devem ser avaliados na definio de biomarcadores a

serem utilizados em um estudo: especificidade, o biomarcador deve demonstrar

o efeito especfico de um determinado contaminante no funcionamento de um

determinado rgo alvo e/ou de estrutura vital; fcil reprodutibilidade

(metodologia e logstica acessvel) e ainda, clareza na interpretao dos

resultados, de forma que seja possvel diferenciar resultados devidos exposio

aos contaminantes de oscilaes fisiolgicas normais (Stegeman et al., 1992;

Bainy, 1993).

A utilizao de biomarcadores em estudos de toxicologia apresenta

vrias vantagens, pois permite: (1) detectar precocemente a existncia de

contaminao por substncias txicas biologicamente significativas, (2)

identificar espcies ou populaes em risco de contaminao, (3) avaliar a

magnitude da contaminao, e (4) determinar o grau de severidade dos efeitos

causados pelos contaminantes (Stegeman et al., 1992).

Segundo Oost et al. (2003), biomarcadores podem ser classificados como:

(1) Biomarcadores de efeito, constituem parmetros mensurveis em

compartimentos celulares que permitem inferir efeitos prejudiciais ou adversos

15

aos organismos; como a induo das enzimas CYP1A1 e CYP1A2 do citocromo

P450 na presena de hidrocarbonetos policclicos aromticos. (2) Biomarcadores

de exposio, atravs dos quais possvel detectar e/ou quantificar a presena

do xenobionte, seus metablitos ou sua associao a componentes celulares ou

moleculares do organismo; como a deteco de metblitos na bile em animais

expostos a HPAs. H ainda biomarcadores inespecficos, que respondem a vrios

contaminantes e podem ser utilizados como indicadores gerais de exposio. Os

biomarcadores inespecficos, como avaliao de leses histopatolgicas e

ndices somticos, auxiliam na deteco da presena e efeito de xenobiontes

em ambientes aquticos, sendo altamente recomendada sua utilizao em

estudos de biomonitoramento ambiental e diagnstico de reas impactadas.

Neste estudo os biomarcadores sero classificados, segundo Adams et al (1989),

de acordo com nvel de organizao biolgica em biomarcadores somticos,

bioqumicos e morfolgicos.

A avaliao de contaminao de ambientes aquticos atravs de

biomarcadores tem sido bastante utilizada em estudos de biomonioramento,

porm a maioria dos estudos tem avaliado apenas um nico nvel de

organizao biolgica (Sturm et al., 1999; Coughlan et al., 2002; Lionetto et al,

2003; Galloway et al., 2004; Binelli et al., 2006; Zanette et al., 2006). A utilizao de

biomarcadores pertencentes a dois ou mais nveis de organizao biolgica

como realizado por Noaksson et al., 2005; Amado et al. 2006, Camargo e

Martinez (2006) e no presente estudo, possibilita a obteno de diferentes tipos

de respostas que podem ser comparadas e confrontadas. Este tipo de

abordagem proporciona um diagnstico mais preciso e confivel da situao da

16

rea estudada e representa a tendncia atual em estudos de

biomonitoramento.

5. CINTICA DE CONTAMINANTES EM ORGANISMOS AQUTICOS COMO

FERRAMENTA PRVIA A ESTUDOS DE BIOMONITORAMENTO

Organismos aquticos so capazes de absorver, e bioacumular

contaminantes presentes na gua ou alimento (Akaishi et al. 2004).

Atravs da cintica de contaminantes possvel compreender as vias de

absoro e distribuio de contaminantes em organismos aquticos (Arukwe et

al., 1999; Rouleau et al., 1999; Inza et al., 2001; Fowler et al., 2004; Bianchini et al.,

2005; Edginton and Rouleau, 2005; Wood et al., 2002). Este tipo de estudo fornece

subsdios aos estudos de biomonitoramento, pois identifica de forma mais precisa

tecidos e rgos alvos.

A autoradiografia (WBARG - whole-body autoradiography) uma

metodologia que vem sendo muito utilizada em estudos de cintica, pois permite

quantificar e qualificar a presena e distribuio de contaminantes atravs de

organismos expostos a xenobiontes radioativamente marcados. A cintica de

alguns contaminantes como zinco, cdmio (Inza et al., 2001; Rouleau et al., 1998

e 2001; Fowler et al., 2004), mercrio (Rouleau et al., 1998 e 1999), mercrio

inorgnico e metilmercrio (Oliveira Ribeiro et al., 1999), prata (Wood et al., 2002;

Fowler et al., 2004; Bianchini et al., 2005), nonilfenol (Arukwe et al., 1999), tributil-

estanho (Rouleau et al., 1999 e 2003) e bifenilas policloradas (PCBs) (Fowler et al.,

2004) em peixes j foram avaliadas atravs de WBARG. No entanto h uma

17

grande quantidade de contaminantes que ainda no tiveram seus potenciais de

absoro, bioacumulao e eliminao elucidados.

Esta tese foi estruturada em 3 captulos, os captulos I e II trazem os resultados

obtidos em um estudo de biomonitoramento em trs regies da costa brasileira

utlizando trs organismos biondicadores e um abordagem de mltiplos

biomarcadores, o captulo III traz uma abordagem cintica de alguns derivados

de baixa massa molecular de petrleo e tambm apresenta uma simulao de

derramamento de petrleo em laboratrio como uma nova abordagem para

estudo dos efeitos da frao solvel do petrleo na gua.

18

CAPTULO I

BIOMARCADORES DE CONTAMINAO AMBIENTAL EM

PEIXES NOS ESTURIOS BRASILEIROS DE PARANAGU

(PR), PIRAQU-A (ES) E ITAMARAC (PE)

COLABORAO:

Patrcia de Souza Diogo

Michelle da Cunha Torres

Manuela Dreyer da Silva

Prof. Dra. Helena Cristina da Silva de Assis

Publicao relacionada:

Valdez Domingos, F.X.; Silva de Assis, H.C.; Silva, M.D.; Damian, R.C.; Almeida, A.I. M.; Cestari, M.M.; Randi, M.A.F.; Oliveira Ribeiro, C.A. Biomonitoring of Estuarine Areas in the Brazilian Coast: a Multi-Biomarker Approach. Manuscrito submetido a revista Ecotoxicology and Environmental Safety.

19

I. 1. INTRODUO

Despejos urbanos, agrcolas e industriais representam as principais fontes de

contaminao em rios, esturios e oceanos (De la Torre et al. 2005; Nigro et al.

2006). Poluentes como hidrocarbonetos policclicos aromticos (HPAs), bifenilas

policloradas (PCBs), compostos organoclorados (OCs) e metais pesados esto

entre as principais classes de contaminantes que so frequentemente

encontrados nestes ecossistemas (Oliveira Ribeiro et al., 2005; Munteanu e

Munteanu, 2006; Nigro et al. 2006).

Para medir efeitos agudos e crnicos de contaminantes no ambiente

alguns parmetros como crescimento, fator de condio, ndice

gonadossomtico e hepatossomtico podem ser avaliados (Deviller et al., 2005;

Teles e Santos, 2006).

Leses histopatolgicas e alteraes em atividades enzimticas so alguns

dos efeitos relatados em estudos prvios em organismos aquticos em reas

impactadas (Akaishi et al., 2004; Mouchet et al. 2006). A ocorrncia de danos

celulares e teciduais em fgado e brnquias de peixes ambientalmente expostos

a HPAs, PCBs, metais pesados, esgoto, efluentes porturios e industriais tem sido

descrita por vrios autores (Stentiford et al., 2003; Norena-Barroso et al., 2004;

Oliveira Ribeiro et al., 2005). Alm desses efeitos, a avaliao da atividade da

colinesterase (Dellali et al., 2001; Tortelli et al., 2006; Quintaneiro et al. 2006)

representa um parmetro bastante utilizado em programas de monitoramento

ambiental.

20

Estudos que avaliam o impacto das atividades humanas em reas costeiras

brasileiras tem aumentado recentemente principalmente nas regies sul e

sudeste (Joyeux et al., 2004; Medeiros et al., 2005; Pereira e Kuch, 2005; Lemos et

al., 2005; Martins et al., 2005; Amado et al., 2006; Camargo e Martinez, 2006; Silva

et al., 2006; Umbuzeiro et al., 2006; Zanette et al., 2006), mas no h registros de

estudos comparativos entre reas costeiras brasileiras nem investigaes que

utilizem diferentes classes de biomarcadores. Aqui no Brasil, assim como em outros

pases, os impactos ambientais em reas costeiras representam causa de

preocupao no que se refere aos efeitos de poluentes na sade dos organismos

aquticos e na qualidade dos alimentos de origem marinha e estuarina.

O Projeto Instituto do Milnio - RECOS - Uso e Apropriao dos Recursos

Costeiros (vide introduo geral) objetivou avaliar e comparar cinco diferentes

regies da costa brasileira impactadas por atividades antropognicas, atravs da

utilizao de diferentes classes de biomarcadores, bem como estabelecer e

padronizar metodologias que possam ser efetivamente aplicadas em estudos de

biomonitoramento em regies costeiras do Brasil.

O objetivo deste captulo foi avaliar comparativamente trs regies

estuarinas impactadas por ocupao humana devido liberao de efluentes

industriais e urbanos e tambm por atividades porturias que ocorrem ao longo

da costa brasileira, empregando-se diferentes classes de biomarcadores como

ndices somticos, histopatologia e neurotoxicidade em duas espcies de peixes.

21

I.2. MATERIAIS E MTODOS

I.2.1. ESPCIES BIOINDICADORAS

O bagre amarelo, Cathorops spixii (Siluriformes, Ariidae) habita reas

costeiras marinhas, esturios, lagoas e desembocaduras de rios, podendo ser

encontrado at em guas hipersalinas. Esta espcie distribui-se desde Belize

(Amrica Central) at o sul do Brasil, podendo ser encontrado em profundidades

de at 50 m (Figueiredo e Menezes, 1978). Os adultos podem apresentar

comprimento total mximo de 30 centmetros (Fishbase, 2006). Esta espcie de

bagre abundante na Baa de Paranagu (Fvaro et al. 2005), e

economicamente importante na pesca artesanal da regio sul do Brasil. C. spixii

apresenta hbito carnvoro e utiliza invertebrados e pequenos peixes como itens

principais de sua dieta (Fishbase, 2006).

O vermelho arioco, Lutjanus synagris (Perciformes, Lutjanidae) apresenta

registros de ocorrncia desde o atlntico oeste (Carolina do Norte, USA) at o

sudeste do Brasil, incluindo o golfo do Mxico e o Caribe. Esta espcie pode

encontrar-se associada a diferentes tipos de substrato, desde reas de recifes de

coral at reas lodosas; alimenta-se em geral a noite de invertebrados

bentnicos e pequenos peixes e pode atingir at 60 cm de comprimento total na

fase adulta (Fishbase, 2005).

I.2.2. REAS DE ESTUDO E ESTRATGIA AMOSTRAL

O projeto foi desenvolvido em trs regies da costa brasileira: nos estados

de PE, ES e PR (Figura 1). As coletas foram realizadas atravs de rede de arrasto

pelos integrantes da rea temtica de Biodiversidade, pertencentes ao Projeto

22

Instituto do Milnio RECOS, nas universidades envolvidas em cada regio (UFPR-

CEM em Paranagu, UFES em Piraqu-Au, UFPE e UFRPE em Itamarac).

Para as amostragens foram escolhidas duas reas em cada esturio (Figura

1). A rea contaminanda (C) representa a rea mais prxima as fontes de

impacto antrpico e rea referncia (R) constitui uma rea afastada da

influncia de atividades humanas. Em cada uma dessas reas foram coletados

dez indivduos de cada espcie nas duas estaes amostrais: inverno (agosto de

2003) e vero (fevereiro de 2004). Alguns parmetros fisico-qumicos (salinidade,

temperatura e pH) foram coletados durante as amostragens.

23

Figura 1. Localizao geogrfica dos pontos referncia (R) e contaminado (C) nas trs regies estuarinas avaliadas na costa brasileira. Adaptado de Zanette et al. 2006.

I.2.2.1. Itamarac - Complexo Estuarino Canal de Santa Cruz - PE

A Baa de Itamarac onde est localizado o Complexo Estuarino Canal de

Santa Cruz (Figura 1) est situada no nordeste do Brasil, 40 km ao norte de Recife,

Pernambuco (734-755S; 3449-3452W, Meyer et al., 1998). Existem duas

estaes bem definidas na regio: a estao seca, compreendida entre

setembro a janeiro, e a estao chuvosa, que ocorre entre fevereiro e agosto. O

rio Botafogo o principal rio que desemboca no Canal de Santa Cruz, e segundo

Meyer et al. (1998), at 1991 recebeu grande aporte de mercrio proveniente de

uma fbrica de soda custica na regio (Cavalcanti, 2003).

Atualmente ainda existem fbricas de soda custica operando na regio

do canal de Santa Cruz, tambm h fbricas de cloro e papel bem como de

plantaes de cana-de-acar (Manuel de Jesus Flores Montes, membro da

UFPE e participante do Projeto do Milnio-RECOS, comunicao pessoal). Alm

do aporte de efluentes industriais e agrcolas muito provvel que esgotos

urbanos estejam chegando ao Canal de Santa Cruz.

O ponto C no Complexo Estuarino Canal de Santa Cruz localiza-se no rio

Botafogo (740047S; 3451486W). No rio Carrapicho, considerado isento de

impacto antropognico, foi determinanda a rea R (743042S; 3453383W). A

precipitao mdia mensal de chuvas em agosto permaneceu na faixa de 100 a

150mm enquanto que em fevereiro atingiu a faixa de 150 a 200mm (CPTEC,

2005).

24

I.2.2.2. Piraqu - Sistema Estuarino dos rios PiraquAu e Piraqu-Mirim - ES

Situado no distrito de Santa Cruz em Aracruz, Esprito Santo encontra-se o

Sistema Estuarino dos rios PiraquAu e Piraqu-Mirim (Figura 1). Este esturio

apresenta 65 km de extenso e rea de 73,38 km2, estando apenas 2,25% de sua

rea protegida pela Reserva Biolgica de Manguezais dos rios Piraqua e

Piraqu-mirim (Luiz Fernando Loureiro Fernandes, membro da UFES e participante

do Projeto do Milnio-RECOS, comunicao pessoal). Segundo Luiz Fernando

Loureiro Fernandes (comunicao pessoal), o manguezal do rio Piraqu-mirim

avana aproximadamente 9 km em direo ao continente, enquanto o rio

Piraqua avana cerca de 13 km, representando o maior avano de mar

do Esprito Santo. As pocas de maior ocorrncia de precipitao esto

compreendidas entre outubro e maio nesta regio, no havendo estao seca

pronunciada na regio (Cuzzuol e Lima, 2003).

No municpio de Aracruz h uma indstria de fabricao de celulose de

fibra curta e branqueada de eucalipto (que utilizada como matria prima para

produo de papel) que reconhecida como a maior do mundo no gnero, e

que est em plena atividade desde 1978. Associado a esta indstria existe um

terminal porturio privativo especializado no transporte da celulose exportada,

que embarca 2 milhes de toneladas que vo para os Estados Unidos, Europa e

sia e 900 mil toneladas produzidas por outra indstria localizada em Minas

Gerais, que concentra suas vendas para o Japo e sia. Ainda nesta regio

existem indstrias de produo de perxido de hidrognio, metal-mecnicas e

eletrnicas (Prefeitura de Aracruz, 2005). Alm das atividades industriais existe

ainda atividade agrcola expressiva (IBGE, 2005) e aporte de esgoto da cidade

25

de Aracruz. De acordo com as atividades acima descritas espera-se que os

principais contaminantes presentes no Sistema Estuarino dos rios Piraqua,

onde est localizada a rea C (1955'20,22"S; 4011'31,24"W), sejam metais,

organoclorados, pesticidas e esgoto domstico. O ponto R est situado no rio

Piraqu-mirim (1956'14,67"S; 4012'42,33"W).

I.2.2.3. Paran - Complexo Estuarino Baa de Paranagu

O Complexo Estuarino Baa de Paranagu (251634S; 481742W, Figura

1) constitui o maior esturio do Paran, estendendo-se aproximadamente 50 km

para o interior do continente (Kolm et al., 2002). s margens deste esturio

localiza-se a cidade de Paranagu, cuja populao estimada em mais de

140.000 pessoas (IBGE, 2005). Kolm et al. (2002), citam que a regio ainda no

possui tratamento de esgotos adequado, sendo a maior parte do esgoto urbano

lanado em dois rios da regio: Itiber e Embogua. Alm do esgoto urbano,

existe ainda o aporte de fertilizantes, pesticidas e efluentes industriais gerados

pelas atividades agropecurias e industriais da regio, respectivamente.

O Porto de Paranagu considerado o maior porto do Sul do Brasil e possui

expressiva participao na exportao de granis slidos, principalmente de

soja, na Amrica Latina. Em 2002 e 2003, os principais produtos exportados foram

gros e as principais importaes foram fertilizantes (Portos do Paran, 2005).

Alm de resduos dos produtos importados e exportados, a regio do porto est

diretamente exposta presena de combustveis devido ao fluxo de

embarcaes. As influncias antrpicas regionais sugerem a presena de metais,

26

hidrocarbonetos, pesticidas e grande aporte orgnico no Complexo Estuarino

Baa de Paranagu.

No complexo Estuarino Baa de Paranagu o ponto C (2519430 S;

4829690 W) situa-se na regio prxima ao terminal de carga/descarga

porturia de fertilizantes de Paranagu (Fospar), onde h o aporte de efluentes

industriais, resduos de combustveis (devido ao intenso trfego de navios) e

resduos de mercadorias carregadas/descarregadas no Porto de Paranagu. O

ponto R est situado na Baa de Laranjeiras (2531271 S; 4829690 W; Figura1).

I.2.3. PROCEDIMENTOS INICIAIS

Imediatamente aps a coleta os peixes foram acondicionados em caixas

isotrmicas (contendo gua do local de captura) providas de aerao

constante e transportados ao laboratrio.

Os peixes foram anestesiados com cido-etil ster-3-aminobenzico (MS

222) 0,02% e as medidas de peso total (g), comprimento total (cm) e peso do

fgado foram tomadas, previamente disseco.

I.2.4. BIOMARCADORES SOMTICOS

Os fgados coletados foram pesados (P) e os ndices somticos calculados

segundo as seguintes frmulas: IHS = ndice hepatossomtico [(Pfgado/Ppeixe)] x 100

e o fator de condio, FC = Ppeixe /Cb, onde b o coeficiente angular da relao

peso-comprimento (C = comprimento total).

27

I.2.5. BIOMARCADORES MORFOLGICOS

I.2.5.1. Avaliao Histopatolgica

Fgado e brnquias dos animais coletados foram fixados em Alfac (Etanol,

formol e cido actico), desidratados e includos em Paraplast (Sigma). O ndice de leses utilizado na avaliao do material foi descrito por Bernet et al.

(1999), para a aplicao deste ndice necessrio atribuir um valor nmerico a

cada leso observada (0, 2, 4 ou 6), esse valor deve ser multiplicado por um valor

de fator de importncia apresentado por Bernet et al. (1999) e exemplificado na

tabela 1 (1, 2 ou 3), dessa forma obtido um ndice para cada tipo de leso em

cada rgo avaliado, todos os ndices de cada rgo so somados obtendo-se

assim um ndice por rgo. A ocorrncia de melanomacrfagos foi avaliada de

acordo com Rabitto et al. (2005), de acordo com esta metodologia centros de

melanomacrfagos e melanomacrfagos livres so contados em 15 campos de

cada lmina.

Tabela 1. Exemplos de fatores de importncia utilizados no clculo do ndice de leses segundo Bernet et al. (1999).

rgo

Leso Fator de Importncia Brnquias descolamento de epitlio 1

fuso de lamelas 2

hiperplasia 2

desorganizao de lamelas secundrias 1

neoplasias 2

Fgado Necrose 3

infiltraes de leuccitos 2

vacuolizao de hepatcitos 1

28

I.2.5.2. Microscopia Eletrnica de Transmisso

As brnquias dos peixes e os fragmentos de fgado foram fixados em

Glutaraldedo 2,5%, Paraformaldedo 2%, CaCl2 2,5 mM, NaCl em tampo

cacodilato 0,1 M pH 7,2-7,4 por duas horas, emblocados em resina PoliEMBED 812

(Electron Microscopy Sciences) e analisados no microscpio eletrnico de transmisso (MET) JEOL 1200.

I.2.5.3. Microscopia Eletrnica de Varredura

As brnquias foram fixadas em 3% glutaraldedo, 0,1 M cacodilato de sdio,

pH 7,2 - 7,4 desidratadas com etanol (Merck) submetidas ao ponto crtico (CO2),

e observadas no microscpio eletrnico de varredura JEOL JSM-6360LV.

I.2.6. BIOMARCADOR BIOQUMICO - AVALIAO DA COLINESTERASE

Fragmentos de msculo branco sem pele e sem sangue foram coletados

da regio dorsal dos peixes e congelados. No laboratrio as amostras de msculo

foram homogenizadas (5% p/v) em tampo fosfato (0,05 M 4 C ) com 20% de glicerol pH 7,0 e centrifugados a 850 x g (4 C) por 15 min. O sobrenadante foi centrifugado novamente a 12.800 x g (4 C) por 15 min e utlizado como fonte de enzima. 9mM de iodeto de acetiltiocolina (AcSCh) foram utilizados na realizao

dos ensaios. A atividade colinestersica foi analisada de acordo com Ellman et al.

(1961), com adaptaes para microplaca, e a concentrao de protenas foi

determinada segundo o mtodo de Bradford (1976).

29

I.2.7. TRATAMENTO ESTATSTICO DOS DADOS

Dois tipos de comparao foram realizadas. A avaliao de

contaminao foi feita atravs da comparao da rea contaminada e

referncia em cada esturio, exceto para Itamarac que foi comparada com a

rea de referncia de Paranagu. Comparaes sazonais tambm foram

realizadas em cada um dos esturios avaliados. Os dados de histopatologia

foram comparados atravs do teste Mann-Whitney. Os parmetros cinticos

enzimticos (Vmax e Km) foram estimados pela equao de Michaelis-Menten; e

a atividade enzimtica foi avaliada atravs de teste T de student. ndices

somticos e ocorrncia de melanomacrfagos foram avaliados atravs de teste

T. A correlao entre peso, comprimento dos peixes e atividade da colinesterase

foi analisado atravs da correlao de Pearson. O teste Kruskal-Wallis foi utilizado

nas comparaes sazonais (Zar, 1984). O nvel de significncia considerado foi de

0,05.

30

I.3. RESULTADOS

Nos esturios de Paranagu e Itamarac foi coletada a espcie Cathorops

spixii, como esta espcie no ocorre no complexo estuarino Piraqu-A, foi

necessrio definir outro bioindicador para esta rea. Por apresentar hbito

alimentar carnvoro e ser abundante na rea de interesse, Lutjanus synagris foi a

espcie selecionada como bioindicadora para amostragem no complexo

estuarino Piraqu-A.

Os parmetros fsico-qumicos obtidos durante as amostragens so

apresentados na Tabela 2. Diferenas expressivas de temperatura entre vero e

inverno foram detectadas apenas em Paranagu. Itamarac apresenta uma

estao seca e uma estao chuvosa bem definida em fevereiro e agosto,

respectivamente.

Tabela 2. Parmetros fsico-qumicos da gua nos trs esturios avaliados.

reas Estudadas Pontos Inverno Vero

T (C) S (ppm) pH T (C) S (ppm) pH Itamarac Contaminado 28 21,7 7,8 29.9 13,7 8,1

Piraqu Referncia 23,9 35 6,1 29,7 20,8 10,1

Contaminado 24,1 33,5 7,1 28,7 17,6 11,3

Paranagu Referncia 20 25 8,0 28 20 8,2

Contaminado 22 23 7,9 28 17 8,4

T = Temperatura; S = Salinidade

I.3.1. INDICES SOMTICOS

Os ndices IHS e FC so apresentados na Tabela 3. Comparando-se as reas

referncia e contaminada de cada esturio durante o inverno ou vero

observou-se fator de condio similar nos indivduos entre as reas referncia (R)

31

e contaminada (C) em Paranagu no inverno, enquanto o IHS apresentou

valores mais altos na rea contaminada no vero. Em Piraqu valores mais altos

no FC foram encontrados na rea contaminada durante o inverno. Tanto o IHS

quanto o CF foram similares em Piraqu durante o vero. Quando comparado

com a rea referncia de Paranagu os valores de IHS de Itamarac

apresentaram-se menores no inverno e maiores no vero.

Atravs de comparaes sazonais em cada esturio, foi observado que no

ponto R de Paranagu o IHS apresentou valores maiores no inverno e o FC foi

similar. Na rea referncia de Piraqu o FC foi maior no vero e o IHS no variou

sazonalmente. Todos os ndices apresentaram valores similares nas reas

Paranagu C e Piraqu C entre as estaes. Em Itamarac C o IHS foi mais alto

no vero enquanto o FC foi similar entre as estaes.

Figura 2. ndice hepatossomtico (IHS), e fator de condio (FC) de peixes coletados em trs esturios brasileiros, n=10. * Indica diferena entre referncia e contaminado, **indica dferena na mesma rea amostral entre inverno e vero (p

32

I.3.2. HISTOPATOLOGIA DE BRNQUIAS

Descolamento de epitlio, fuso de lamelas, hiperplasia, desorganizao

de lamelas secundrias e neoplasias foram as leses mais relevantes observadas

nas brnquias (Figura 3). O descolamento de epitlio caracterizado pelo

descolamento de clulas epiteliais na lamela secundria (Figura 3C). reas de

fuso de lamelas esto frequentemente associadas com hipertrofia e

proliferao de clulas mucosas (Figura 3D). A fuso integral e parcial base das

lamelas secundrias identificada atravs de microscopia de luz foi confirmada

pela anlise ao MEV (Figura 3F e G).

As leses histopatolgicas nas brnquias apresentaram ocorrncia similar

entre os pontos R e C de Paranagu, Piraqu e Itamarac no inverno e em

Piraqu no vero (Figura 4). Os peixes coletados nas reas contaminadas de

Paranagu e Itamarac no vero que apresentaram ndices de leso menores

do que na rea referncia de Paranagu (Figura 4).

I.3.3. HISTOPATOLOGIA DE FGADO

Necroses, infiltraes de leuccitos e vacuolizao de hepatcitos foram

as leses mais expressivas identificadas no fgado das espcies estudadas (Figura

5). Proliferao do retculo endoplasmtico (Figura 5B) e a presena de

numerosos grnulos eltron densos nos hepatcitos (Figura 5C e E) foram

observados atravs de MET. As necroses observadas atravs de microscopia de

luz tambm foram visualizadas atravs de MET como focos de necrose (Figura 5D,

E, F). Na coleta de inverno os animais amostrados no ponto R de Paranagu

apresentaram ndice de leses hepticas maior que as reas C de Paranagu e

33

Itamarac, enquanto a ocorrncia de leses hepticas foi similar entre os pontos

R e C em Piraqu (Figura 6). No vero os indivduos coletados em Paranagu

apresentaram ndices de leses similares entre os pontos R e C, enquanto em

Piraqu foi detectado maior ndice de leses no ponto R. As leses hepticas

detectadas nos animais coletados em Itamarac foram similares as do ponto R

de Paranagu no vero (Figura 6).

Melanomacrfagos (MM) podem ser visualizados como clulas

pigmentadas ou grupos de clulas pigmentadas que so denominados centros

de melanomacrfagos (CMM) em rgos como fgado, rim anterior e intestino de

peixes. Seu material granular apresenta colorao que oscila entre amarelo e

preto quando corado com hematoxilina e eosina. Os indivduos coletados no

esturio de Piraqu no apresentaram CMM nem MM hepticos em ambas as

reas amostradas (R e C). A ocorrncia de CMM foi similar entre os pontos R e C

nos indivduos amostrados em Paranagu tanto no inverno quanto no vero,

enquanto a ocorrncia de MM foi maior em Paranagu R apenas no inverno

(Figura 7). Itamarac apresentou valores menores de MMC e MM quando

comparadas com Paranagu R no inverno e ocorrncia de MM similar

Paranagu no vero (Figura 7).

34

Figura 3. Histopatologia de brnquias de peixes das reas estuarinas avaliadas. (A) Estrutura normal das brnquias. (B) Dilatao de vasos nas extremidades das lamelas secundrias e inchao das clulas de cloreto. (C) Descolamento de epitlio nas lamelas secundrias. (D) Fuso de lamelas secundrias, hipertrofia e proliferao de clulas de muco (mc). (E) Estrutura normal das brnquias em MEV. Barra = 100m. (F) Fuso na base das lamelas secundrias. Barra = 100m. (G) Fuso completa de lamelas secundrias. Barra = 200m. pl= lamela primria, sl= lamela secundria, cc=clula de cloreto, el=descolamento de epitlio, f=fuso de lamelas secundrias. Barra A, B, C, D = 50m. Cathorops spixii: B, C, D, F; Lutijanus synagris: A, E, G.

Figura 4. ndice histopatolgico de leses branquiais de indivduos coletados nas reas estuarinas estudadas (medianas). Diferenas entre as reas estudadas so indicadas por letras (p

35

Figura 5. Histopatologia de fgado em indivduos coletados nas reas estuarinas avaliadas. (A) Estrutura caracterstica do fgado. (B) Vacuolizao do citosol dos hepatcitos; (C) Presena de diversos grnulos eltron densos (g) e vacolos (seta) no citosol dos hepatcitos; (D) Desorganizao citoslica indicativa de necrose; (E) rea de necrose focal e presena de grnulos eltron densos; (F) Detalhe da desorganizao do citosol (setas); (G) Espao de Disse (d). Barra = 50m. Cathorops spixii: A, B, C, E, F; Lutijanus synagris: D, G.

36

37

I.3.4. ATIVIDADE DA COLINESTERASE

As espcies estudadas no apresentaram correlao entre os parmetros:

peso, comprimento e a atividade colinestersica nas reas avaliadas. A

atividade enzimtica foi mais alta nas reas C de Paranagu, Piraqu e

Itamarac quando comparadas com as respectivas reas R no inverno (Figura

8A). Durante o vero Piraqu e Paranagu apresentaram atividade da

colinesterase similar, enquanto Itamarac C apresentou maior atividade se

comparado com Paranagu R (Figura 8B). A atividade da colinesterase

apresentou-se mais elevada nos indivduos coletados no inverno se comparados

aos coletados no vero em todas as reas estudadas (Figura 8A e B).

38

I.4. DISCUSSO

Estudos de biomonitoramento so geralmente focados em uma nica ou

em poucas reas de rios, esturios ou lagoas, a utilizao de biomarcadores

nestes estudos frequentemente restrita a uma ou poucas classes de

biomarcadores (Shailaja e Silva, 2003; Petrovic et al., 2004; de la Torre et al., 2005;

Oliveira Ribeiro et al., 2005; Munteanu e Munteanu, 2006; Nigro et al., 2006). Este

trabalho apresenta respostas de trs classes de biomarcadores (somticos,

histopatolgicos e bioqumicos) de trs diferentes reas estuarinas impactadas

por atividades humanas ao longo da costa brasileira.

Um dos parmetros de avaliao dos organismos neste estudo foi a

aplicao de ndices somticos, como utlizado por outros autores (Khan et al.

1994, Karels et al., 1998; Couillard et al., 1999; Oliveira Ribeiro et al., 2005). Segundo

Huuskonen e Lindstrom Seppa (1995) e Teles et al. (2006) IHS pode indicar estado

metablico alterado em peixes. Alguns estudos reportam que animais coletados

em reas contaminadas frequentemente apresentam aumento no IHS e

decrscimo no FC (Adams e Ryon, 1994; Karels et al., 1998; van der Oost et al.,

1996), um aumento no IHS foi observado na rea C de Paranagu durante o

vero, porm o FC permaneceu similar ao da rea referncia. Como Cathorops

spixii apresenta hbito alimentar carnvoro possvel que esteja ocorrendo

biomagnificao e bioacumulao de poluentes nesta espcie, estes fenmenos

poderiam estar associados aos altos valores IHS observados em Paranagu e

Itamarac durante o vero. Segundo Soimasuo et al. (1995), Felder et al. (1998) e

de la Torre et al. (2005), indivduos expostos a contaminantes podem apresentar

baixos valores de FC como tambm ndices similares entre os grupos avaliados,

39

como foi observado neste trabalho em Paranagu em ambas estaes sazonais

e em Piraqu no vero. Incrementos no FC nos indivduos de Piraqu no inverno

podem ser atribudos a uma maior disponibilidade de alimento que ocorre nesta

estao, especialmente em ecossistemas tropicais (Townsend et al., 2006).

Leses histopatolgicas tem sido frequentemente descritas como

importantes ferramentas em estudos de biomonitoramento devido facilidade

de interpretao tanto em situaes de exposio aguda quanto crnica

(Wester et al., 1991; Couillard et al., 1999; Wester et al., 2002; Gl et al., 2004;

Oliveira Ribeiro et al., 2005). Assim como relatado neste trabalho, a ocorrncia de

leses branquiais e hepticas em animais expostos ambientalmente a

contaminantes tem sido reportada em organismos aquticos por outros autores

como Gl et al. (2004), Lyons et al. (2004), Norea-Barroso et al. (2004) e Oliveira

Ribeiro et al. (2005).

A presena de leses nas brnquias de peixes pode ser interpretada como

resultado de efeitos agudos de xenobiontes (Zodrow et al. 2004). Neste estudo a

ocorrncia de fuso de lamelas foi detectada em todas as reas avaliadas. A

ocorrncia de fuso lamelar j foi relacionada por alguns autores fontes de

contaminao especfica como: efluente de indstria de papel clorado

(Pacheco e Santos, 2002; Valdez Domingos, 2001), cobre (Arellano et al., 1999) e

efluente de esgoto com tratamento secundrio (Coutinho and Gokhale, 2000,

Valdez Domingos, 2001). O descolamento de epitlio observado neste estudo

tambm foi relatado por Arellano et al. (1999) e Fanta et al. (2003) em peixes

expostos a cobre e organofosforados, respectivamente. Tanto o descolamento

de epitlio quanto a fuso de lamelas aumenta a distncia entre as clulas

40

epiteliais e os capilares sanguneos causando prejuzo nas trocas gasosas e

tambm pode levar distrbios na osmorregulao, mecanismos essenciais

sobrevivncia de peixes. A ocorrncia de proliferao nas clulas de muco

observada em indivduos de diferentes reas est relacionada a um mecanismo

de proteo em situaes de injria causada por contaminantes aquticos ou

respostas de estresse devido a exposies agudas e/ou crnicas, ocorre uma

maior secreo de muco nestas situaes a fim de minimizar o contato do tecido

afetado com a gua. Hipertrofia celular e tecidual podem ser indicativas de

disfuno celular e podem levar ao desenvolvimento de neoplasias em situao

de exposies crnicas a certos poluentes como HPAs, pesticidas clorados ou

PCBs (Ali e Sreekrishnan, 2001; Shailaja e Silva, 2003).

Devido aos processos de absoro e metabolizao as leses observadas

no fgado esto relacionadas exposio crnica a poluentes. A ocorrncia de

reas de necroses foi a leso heptica mais evidente neste estudo, este tipo de

leso tem sido registrada em peixes de reas impactadas por mltiplos

contaminantes (Simpson et al., 2000; Pacheco e Santos, 2002; Schmalz et al., 2002;

Marty et al., 2003; Stehr et al., 2003; Stentiford et al., 2003; Oliveira Ribeiro et al.,

2005). No presente trabalho a presena de necroses em indivduos das reas

referncia e contaminadas representa um indicativo de que os esturios esto

impactados, o que poderia ser confirmado atravs de anlises qumicas de biota,

gua e sedimento nestas reas. Este tipo de leso causa prejuzos funcionais e

estruturais no fgado de peixes (Stentiford et al., 2003), diminui a funcionalidade,

podendo causar a falncia do rgo e consequentemente afetar maiores nveis

de organizao biolgica (Rabitto et al., 2005). Embora a ocorrncia de reas

41

necrticas no tenha correlao especfica com um determinado

contaminante, a ocorrncia de necrose tem sido frequentemente observada em

reas estuarinas associadas presena de contaminantes como HPAs (Stentiford

et al., 2003), pesticidas clorados (Oliveira Ribeiro et al. 2005), metais pesados

(Schmalz et al., 2002), organofosforados (Fanta et al., 2003), efluente de indstria

de papel clorado e cido dehidroabitico (Pacheco e Santos, 2002). A presena

de vesculas lipdicas observada no fgado de indivduos das reas estudadas

sugere um mecanismo de imobilizao de compostos lipoflicos como descrito

por Oliveira Ribeiro et al. (2005) em Anguilla anguilla ambientalmente exposta a

pesticidas clorados, HPAs e PCBs.

A incidncia de melanomacrfagos (CMM ou MM) no fgado e outros

tecidos est relacionada a um aumento na atividade fagoctica como resposta

imune a leses em indivduos expostos a contaminantes (Couillard et al., 1999;

Mondon et al., 2001; Oliveira Ribeiro et al., 2005; Rabitto et al., 2005). No presente

trabalho a ocorrncia de CMM ou MM no apresentou resultados expressivos

para o diagnstico das reas estudadas.

Embora as leses histopatolgicas no apresentem relao especfica com

os contaminantes este tipo de abordagem tem sido uma ferramenta bastante

utilizada em biomonitoramento na avaliao da qualidade da gua de reas

supostamente impactadas (Wester et al., 2002). As reas R e C de Paranagu,

Piraqu e Itamarac apresentaram ndices de leso branquial e heptico

similares durante o inverno e o vero, indicando que ambas as reas esto sendo

afetadas pela liberao de compostos qumicos nestes esturios em

conseqncia de atividades humanas.

42

A atividade da colinesterase em peixes e outros organismos aquticos tem

sido utilizada globalmente como biomarcador de contaminao em peixes em

programas de monitoramento por diferentes grupos (Sturm et al., 1999; Monserrat

e Bianchini, 2001; Rodriguez-Fuentes e Gold-Bouchot, 2000; Monserrat et al., 2002;

Ventura et al., 2002; Corsi et al., 2003; Monteiro et al., 2005; Binelli et al. 2006; Tortelli

et al., 2006). A atividade da colinesterase representa um eficiente biomarcador

para detectar efeitos subletais de xenobiontes, principalmente organofosforados,

carbamatos e alguns metais pesados (Sturm et al., 1999; Monserrat e Bianchini,

2001; Silva de Assis et al. 2005; Rabitto et al, 2005), compostos que so reportados

na literatura como inibidores da colinesterase. Alm dos contaminantes acima

citados, hidrocarbonetos tambm podem alterar a atividade da colinesterase

em peixes, inibindo-a em diluies da frao solvel na gua de 15 e 33% na

espcie Astyanax sp. (Akaishi et al., 2004), porm os mecanismos de ao dos

hidrocarbonetos sobre a atividade da colinesterase ainda no foram

esclarecidos. No presente estudo uma maior atividade da colinesterase foi

observada na maioria das reas C estudadas durante o inverno. A induo da

atividade desta enzima foi tambm descrita em Puntius conchonius aps

exposio a endosulfano em msculo e fgado (Gill et al. 1990). O trabalho

realizado por Tortelli et al. (2006) nas mesmas reas de estudo mostrou que as

constantes de MichaelisMenten, Km e Vmax apresentaram diferentes padres

no crebro de C. spixii coletado nas reas R e C de Paranagu, neste trabalho os

autores sugerem que o complexo reversvel enzima-inibidor mais facilmente

formado em peixes coletados na rea C, enquanto a formao do complexo

irreversvel enzima-inibidor ocorre com maior facilidade nos animais das reas R.

43

Embora no tenham sido realizados em amostras de msculo, estes resultados

poderiam ser atribudos como uma possvel hiptese para justificar os menores

valores de atividade da colinesterase observados nestas reas.

Dados que relacionam a atividade da acetilcolinesterase com variaes

de temperatura esto disponveis apenas para peixes, nestes estudos os autores

atribuem a temperatura como fator responsvel pelas diferenas sazonais

observadas na atividade enzimtica, apresentando de forma geral maiores

valores de atividade enzimtica nas estaes mais quentes e vice-versa

(Bocquen e Galgani, 1991; Kirby et al. 2000).

Os resultados apresentados sugerem que os maiores valores na atividade

da colinesterase observada nos espcimens das reas estudadas no inverno

possam estar relacionados a presena de compostos anticolinestersicos nas

reas R, ou de compostos indutores da colinesterase nas reas C. Acredita-se que

todos os resultados apresentados neste estudo estejam sendo influenciados por

contaminantes como metais pesados, hidrocarbonetos, pesticidas, os quais

infere-se que estejam presentes nas reas estudadas atravs da avaliao das

influncias antrpicas de cada esturio (item I.2.2.).

De acordo com os dados apresentados, as trs regies estuarinas esto

seriamente impactadas por atividades antropognicas. Entre os biomarcadores

utilizados a medida da atividade d