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Cromatografia de Lquidose Interface LC-MS*ALEXANDRE J.C.D.
BRITO**,PAULO J. SALVADOR***E RAFAEL B. CHUST****
1. INTRODUONos ltimos anos, tem-se veri-
ficado um constante desenvolvimentoda instrumentalizao e
aplicaes paraCromatografia de Lquidos (HPLC),procurandotiraro
maiorpartido possveldesta potente tcnica analtica.
O objectivo deste artigo centra--se na apresentao e discusso
dosdesenvolvimentoslevados a cabo a nvelde instrumentao (sistemas
de injec-o de amostras, bombeamento desolventes, deteco e
tratamento dedados) pelo Departamento de Investi-gao e
Desenvolvimento de KONIKINSTRUMENTS, relatando a sua evo-luo em
paralelo com as necessidadesactuais do cromatografista.
Complementarmente, serodiscutidos os ltimos avanos a nveldas
interfaces LC-MS (Cromatografiade LquidosEspectrometria de
Massa),assinalando a sua evoluo at aoestgio actual e as tendncias
futurasneste campo analtico.
2.0 CROMATOGRAFO DE LQUIDOSVrios passos se verificaram
com o decorrer dos anos relativamentetcnica e instrumentao
para
cromatografia de lquidos, onde h asalientar:
a primeira experincia emcromatografia de lquidos, utilizandocomo
meio impulsionador a gravidade,por M. S. Tswett(1872-1919)tido
comoo "pai da cromatografia" em 1906, naqual se levou a cabo a
separao depigmentos vegetais, conseguindo puri-ficar a clorofila
por cromatografia deadsoro;
o primeiro Prmio Nobel (Qu-mica) para a Cromatografia, obtido
porA. J. P. Martin e R. L. M. Synge (ReinoUnido), em 1952;
a construo do primeirocromatgrafo de lquidos, em 1964, porCsaba
Horvath (1930), o qual permitiapresses de trabalho da ordem de
4000psi (270 atm).
e passando pela primeira sepa-rao por gradiente de solventes
(1967 Csaba Horvath EUA) at aos instru-
mentos, acessrios e consumveisactualmente em
comercializao,muitas barreiras tecnolgicas foramultrapassadas e
muitos problemasanalticos resolvidos.
2.1 Configurao de umCromatgrafo de Lquidos Moderno
A configurao de um croma-tgrafo de lquidos engloba pelo
menosquatro componentes fundamentais:
Sistema de Injeco ou Injec-tor
Sistema de Bombagem ouBomba de Solventes
Sistema de Deteco ou De-tector
Sistema de Tratamento deDados
De seguida, procuraremos sa-lientar os passos mais importantes
nasua evoluo at ao estgio actual.
2.2 Sistemas de Injeco
Relativamente aos sistemas deinjeco, a evoluo foi na
realidaderelativamente pequena, dado que osengenheiros industriais
obviaram muitodos passos necessrios para ir deencontro aos
requisitos exigidos peloscientistas e investigadores em
cro-matografia de lquidos, os quaisafortunadamente apenas tiveram
deadaptarvlvulasvulgarmente utilizadasna indstria para a injeco
croma-togrfica.
As primeirasvlvulas utilizadaspor Csaba Horvath foram as
vlvulas"deslizantes" de 4 entradas, onde sedispunha de dois canais
alternativos:um de injeco ou carga de amostra(load) e outro de
injeco no croma-tgrafo (inject). Com o aumento depresso, estas
vlvulas demonstraram--se limitadas por se revelarem
poucoestanques.
Actualmente, so universal-mente utilizadas as vlvulas de
injecode 6 vias, cuja concepo e/ou fa-bricante permitem que sejam
vlvulasde injeco de volume fixo ou de volu-me varivel dependendo a
sua fun-cionalidade da sua prpria estan-quicidade.
2.3 Sistema de Bombagem
Foi precisamente em relaoaos sistemas de bombagem que sur-
giram as primeiras limitaes tecno-lgicas no desenvolvimento dos
cro-matgrafos de lquidos.
Como se afirmava em 1941, numartigo no Journal of
Biochemistry(1358-1368, 1941), da autoria de A. J. P. Martin(1910-
(e R. L. M. Synge (1914-), em cro-matografia de lquidos "a nica
formade obter a mais baixa HETP (alturaequivalente a um prato
terico) serautilizando partculas com a menordimenso possvel e uma
elevadadiferena de presses ao longo dacoluna".
Assim sendo, e havendo apossibilidade tecnolgica de
obterpartculas de pequenas dimenses(menos de 60 microns), seria
necessriodesenvolver um sistema de bombagemque permitisse gerar e
suportar altaspresses na cabea da coluna, porforma a garantir uma
diferena depresses entre esta e a presso sadada mesma (cujo valor
ser de 1 a 5 atm),gerando ainda pulsaes de fluxo toreduzidas quanto
possvel.
Assim, as caractersticas fun-damentais de um Sistema de
Bombagemdevero ser as seguintes:
fluxo estvel e isento de pul-saes, por forma a prevenir
contri-buies indesejveis a nvel do sistemade deteco;
ampla gama de fluxos, per-mitindo uma maior flexibilidade;
reprodutibilidade do volumedeslocado, por forma a permitir
repro-dutibilidade de tempos de reteno,salientando as
caractersticas quali-tativas da cromatografia de lquidos;
resistncia a altas presses(400 a 500 atm), pelas razes
previa-mente enunciadas.
2.3.1 Sistema de Bombagemde Pisto Simples
O primeiro sistema utilizado, nofim da dcada de 50 ainda antes
deCsaba Horvath baseou-se numa bom-ba de pisto simples, cuja
concepose inspirou nas bombas de seringa, aqual se completava com a
fase mveldesejada e posteriormente seriadespejada a cadncia e
consequen-temente ao fluxo desejado.
As vantagens bvias de talsistema residiam na inexistncia
depulsaes, dado que o movimento deesvaziamento do pisto constante,
efacilidade de controle de fluxos, uma
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vez que apenas temos de controlar avelocidade linear de um nico
eixo.
Tais vantagens eram contraba-lanadas por um rol de vrias
desvan-tagens, entre as quais se contam anecessidade de completar o
cilindroonde se movimenta o pisto ao fim decada cromatograma e a
bvia dificul-dade em garantir uma elevada estan-quicidade, a
despressurizao do sis-tema sempre que se completa o cilindro,pondo
em causa a estabilidade do leitocromatogrfico, a dificuldade no
de-senvolvimento de mtodos, dado sernecessrio trabalhar com o
cilindrocompleto com uma fase mvel de dadacomposio, obrigando, caso
no sejaa fase mais adequada 6 separao, areench-lo aofim de cada
cromatogra-ma, redundando em falta de flexibilidadeno
desenvolvimento de aplicaes e aum gasto suplementar de solventes
etempo e, por ltimo, o aparato instru-mental necessrio, dado que
sendo asdimenses das partculas relativamenteelevadas (40-60 microns
contra os 3-5--lo microns actuais), osfluxos deveriamser
forosamente baixos para permitiruma boa resoluo e por outro lado
ostempos de anlise desusadamenteelevados actualmente, separamos
4cidos nucleicos em 5 minutos a umfluxo de 1 ml/min (o que implica
umgasto de cerca de 5 ml de eluente),enquanto a mesma separao
tomavamais de 2 horas a 0,2 ml/min (o queimplica 5 vezes mais gasto
de eluente),bem como a quase impossibilidade deoperao em gradiente
de solventes,por todas as razes anteriormentereferidas.
De seguida, no incio da dcadade 60,foram desenvolvidos os
primeirossistemas baseados em bombas depisto simplesentre os quais
se contao sistema de Csaba Horvth cujaoperao se baseia no movimento
devai-vm de um pisto numa cmara devolume limitado, dispondo de
duasvlvulas anti-retorno (6 entrada esada), e que, por forma a
diminuir aspulsaes,
utiliza uma velocidade deavano (impulso de solvente)
conside-ravelmente mais lenta (cerca de 8 a 10vezes) que a
velocidade de retrocesso(alimentao do pisto). Tal sistemaprovou-se
fivel, resistente e resolveutecnologicamente (pela incorporaodas
vlvulas anti-retorno e vedantes dealta resistncia) um dos
problemasmaiores da cromatografia de lquidos a alta presso de
trabalho. Outravantagem bvia a possibilidade deutilizao de duas ou
mais bombas emparalelo para obteno de gradientesde solventes. No
entanto, tal sistema(ainda utilizado por alguns fabricantesactuais,
dada a sua simplicidade e baixo
custo), tem uma desvantagem inerentesua prpria concepo: a gerao
de
pulsos, os quais transmitidos ao detec-tor, do origem a picos
"fantasmas" ,osquais no sendo demasiado notadosem detectores
espectrofotomtricos(UV-VIS e fluorimtricos), impedem asua utilizao
com detectores altamentesensveis a pulsos, como sejam osdetectores
de ndice de refracodiferencial, electroqumico, de condu-tividade
electroltica e, o mais sensvelde todos, o espectrmetro de
massa(cujas razes sero explanadas maisadiante).
2.3.2 Sistema de Bombagemde Pisto Duplo
No ltimo estgio de desenvol-vimento, que o actual, o sistema
debombagem utilizado o de duplo pistode movimento recproco, que tal
comoo sistema de pisto simples anterior-mente descrito, dispe de
distintasvelocidades consoante a fase em quese encontram mais lenta
quando emfase de impulso e mais rpida quandoem fase de carga.
Este sistema apresenta van-tagens sobre todos os demais,
dadoque, dispondo das mesmas caracte-rsticas mecnicas das bombas
depisto simples, suprime as pulsaesatravs do movimento alternado
dosseus pistes (carga pisto 1/ descargapisto 2 seguida de descarga
pisto 1 /carga do pisto 2).
Resumidamente, temos comovantagens fundamentais dos sistemasde
duplo pisto recproco, e quase comoextrapolao do sistema de
pistosimples, uma relativa simplicidademecnica, elevada
fiabilidade, possibi-lidade de operar a altas presses eausncia de
pulsaes.
Os cromatgrafos de lquidosKONIK HPLC 500 B utilizam o sistema
debombagem de duplo pisto recprocoem srie, ao que adicionamos
umavelocidade diferencial de movimentode pisto com o fim de reduzir
asvariaes de presso (pulsaes). Oprincpio de funcionamento consiste
emutilizar duas cmaras e apenas duas"check valves" (vlvulas
anti-retorno):uma entrada do pisto 1 (ou dealimentao) e outra sada
do pisto 2(ou de bombagem). Alm disso, o pisto1 trabalha a uma
velocidade cerca de30% mais rpida que o pisto 2 talresulta em que
evitamos os momentos"mortos" do pisto 2 (que devido
suamenor velocidade quase no apresentapulsaes) garantindo uma
bomba-gem constante atravs do pisto 1(muito mais rpido porm muito
maispulsante).
Como exempla das unidadesmais modernas, podemos referir que
ascaractersticas fundamentais do sis-tema de bombagem do
cromatgrafode lquidos KONIK HPLC 500 B so asseguintes:
total ausncia de pulsaesem toda a gama de fluxos, permitindo
aoperao em HPLC microbore e ana-ltica, dado o conceito dinmico
domovimento dos pistes;
opes de cabeas analtica(0,01 a 8 ml/min) e semi-preparativa
(0,06a 48 ml/min), permitindo uma maiorflexibilidade na utilizao do
sistema;
opo biocompatvel/inica,com peas fixas e mveis em
PEEK(cabegas),Teflon(retentores),rubi(vl-vulas anti-retorno) e
safira (pistes),permitindo a sua utilizao com solu-es e tampes de
pH entre 1 e 14;
possibilidade de operara altaspresses (500 atm -7000 psi), em
quais-querdasopes(analtica,semi-prepa-rativa ou biocompatvel);
sistema de lavagem automti-ca de mbolo em todas as verses,como
equipamento standard, prevenin-do a precipitao de tampes nospistes
e diminuindo a necessidade deinterveno/assistncia tcnica
aoequipamento;
2.3.3. Controle de Sistemas deBombagem. Gradientes de
Solventes
Outra rea de desenvolvimentoem que se verificou uma grande
evolu-o foi no controle do sistema debombagem. Nos primeiros
sistemascomercializados, a seleco do fluxoefectuava-se por passos
discretos,geralmente de 0.1 ml/min, por meio deum controle analgico
que transmitiaatravs de um circuito elctrico/electrnico uma
frequncia de refe-rncia para o motor elctrico.
Actualmente, apesar de algunsfabricantes utilizarem nosseus
modelosde baixo de gama o sistema analgico,o controle dos
cromatgrafos efec-tuado por meio de um microprocessadorincorporado
o qual permite noapenas controlar os caudais da bombacomotambm a
presso da mesma (porprogramao
de mximos e mnimos), aprogramao de gradientes (sejam elesa baixa
ou a alta presso), acessriosexternos (injectores
automticos,fornos de colunas, detectores progra-mveis, sistemas
de tratamento dedados, vlvulas de comutao, etc.) eoutros.
A evoluo dos sistemas debombagem aponta para sistemas
total-mente controlados atravs de um com-putador e por meio de um
programa deaplicaes (software) dedicado e de
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uma interface tipo RS-232, permitindo'ento no s o controle de
fluxos comoa integrao, sob o mesmo ambiente,do controle dos
sistemas de deteco,injeco e tratamento de dados.
Por sua vez, o gradiente de sol-ventes e a sua programao
tambmcontaram com uma notvel evoluo,principalmente no decorrer da
decadede 70 e 80. Os primeiros sistemas utili-zados baseavam-se na
tcnica dosfluxos parciais, ou seja, consoante acontribuio parcial
desejada de cadasolvente, operava-se manualmente ofluxo de cada
sistema de bombagempor forma a obter-se o fluxo finalpretendido.
Como facilmente se de-preende, tal sistema requeria a totaldedicao
do seu operador, pois aobteno de um cromatograma demo-rava em media
1 a 2 horas, revelando--se a sua operao totalmente contra-produc
ente.
No incio da decade de 70,foramdesenvolvidos os primeiros
sistemas degradientes com controle automatizado,onde se permitia
controlar o fluxo deduas bombas isocrticas cada umadelas com um dos
solventes desejadospermitindo a programao da variaodos seus fluxos
parciais por determi-nado perodo de tempo e por conse-guinte, da
composio do eluente. Estesistema denomina do sistema degradiente
binrio a alta presso eencontra-se actualmente "em vias
deextino".
As principais vantagens dosistema de gradientes a alta
pressoresumem-se a ausncia de "bolhas"durante a mistura de
solventes, dadoque a mesma ocorre a uma pressogeralmente superiora
80-100 atm, sendoesta mistura bastante optimizada pelofacto de
dar-se a alta presso, garan-tindo uma elevada reprodutibilidade
domtodo (desde que se use o mesmosistema cromatogrfico), somando
porltimo a vantagem adicional de que emcaso de avaria de uma das
unidades debombagem, continuar a dispr-se deum cromatgrafo
isocrtico.
As desvantagens de um tal sis-tema residem na
irreprodutibilidade deresultados/composies de solventesaquando da
sua passagem a um sistemaisocrtico, dado que uma mistura a
altapresso, e considerando as distintascompressibilidades dos
solventes, notem forosamente a mesma composi-o que uma mistura
efectuada pres-so atmosfrica, bem como a irreprodu-tibilidade de
resultados/composiesde solventes de sistema para sistema,dadas as
distintas compressibilidadesobtidas por distintos sistemas
debombagem. Por outro lado, temos umamaior complexidade mecnica,
pela
existncia de duas bombas de sol-ventes, que devem actuar de
formacoordenada e por conseguinte ori-ginando um frequente recurso
aassistncia tcnica e um elevado custona aquisio e manuteno,
pelasmesmas razes.
Em 1984, KONIK INSTRUMENTSdesenvolveu o seu segundo croma-tgrafo
de lquidos, o KONIK KNK-500G(precursor do KONIK HPLC-500-G e
quesubstituiu o seu predecessor KONIKKNK-8800, lanado em 1979),
onde pelaprimeira vez se empregou, a nvel mun-dial,osistema de
gradientes quaternrioa baixa presso. Neste sistema, ogradiente de
solventes obtido atravsda abertura e fecho coordenados deuma vlvula
de quatro vies, a qual actuaproporcionalmente a composio deeluente
desejada.
As principais vantagens destesistema em relao ao sistema
degradientes a alta presso encontram--se ao nvel da simplicidade
efiabilidademecnicadado que se necessita ape-nas de uma bomba ao
invs de dues exigindo porm um sofisticado controlepor
microprocessador. Comovantagemadicional, temos que a mistura
doscomponentes do eluente ocorre bpresso atmosfrica, permitindo a
di-recta aplicao a um sistema isocrticode um mtodo isocrtico
desenvolvidopor tal sistema de gradientes, mistu-rando na composio
encontrada oscomponentes da fase mvel, o que noocorre com o sistema
a alta presso,dadas as distintas compressibilidadesde cada um
deles. A nica eventualdesvantagem com que nos defrontamos a
necessidade de utilizar um sistemade desgasificao porasperso de
hliopara evitar a formao de bolhas de are optimizar a mistura dos
componentesdo eluente, o que em todo o caso aconselhvel em qualquer
sistemacromatogrfico seja ele de mistura aalta ou de baixa presso,
de gradientesou isocrtico.
Resumidamente, temos a con-cluir como vantagens do sistema
degradientes a baixa presso os seguintesfactores:
simplicidade mecnica, dadoapenas necessitar de uma bomba
desolventes;
mistura de solventes a pres-so atmosfrica, o que garante
totalreprodutibilidade de composies desolventes para a sua utilizao
iso-crtica;
total reprodutibilidade demtodos, independentemente do siste-ma
cromatogrfico, dado o j anterior-mente exposto;
custo reduzido; reduzidas dimenses, o que
permite uma razovel economia de es-pao laboratorial;
controletotalmente automati-zado por meio do
microprocessadorincorporado na unidade cromatogr-fica, necessitando
de uma minimainterveno do utilizador;
capacidade para gradientesde ate 4 solventes.
e como desvantagens:necessidade de aspergir um
gs inerte (usualmente hlio) nos sol-ventes, porforma a satur-los
e prevenira eventual formao de "bolhas" de ardurante a mistura;
necessidade de controle pormicroprocessador incorporado
naunidade cromatogrfica.
Attulo de referncia, os termos"high performance liquid
chromatogra-phy (HPLC)" (cromatografia de lquidosde alta eficcia
CLAE), "eluioisocrtica" (pare descrever o uso deuma fase mvel de
composio cons-tante ao longo do tempo) e "gradientede eluentes"
(para descrever o uso deuma fase mvel de composio varivelao longo
do tempo) aplicados cro-matografia de lquidos devem-se aCsaba
Horvath.
2.4 Sistemas de Deteco
Em relao aos sistemas dedeteco, a sua evoluo pode serresumida a
adaptao e adequao deequipamentos j conhecidos (espec-trofotmetros,
espectrofluormetros,refractmetros, etc.) a utilizao emfluxo
constante, ou seja, adequando asclulas de fluxo continuo a uma
geo-metria miniaturizada que evite as con-tribuies de eventual
refraco dofeixe luminoso durante a passagem daamostra (pare no
comprometer a suaperformance) e a formao de "volu-mes mortos", bem
como a evoluosofrida a nvel electrnico pela minia-turizao
requerida.
Como referncia, podemos in-dicer que os detectores mais
utilizadosem cromatografia de lquidos so o de-tector
espectrofotomtrico (UV-VIS), odetector de ndice de
refracodiferencial, o detector espectrofluo-rimtrico, o detector
condutimtrico e odetector electroqumico ou amperom-trico,
chamando-se a ateno pare quea investigao levada a cabo sobrenovos
sistemas de deteco pare HPLCoriginou novas categories de
detectoresuniversais e selectivos, como sejam odetector de rede de
diodos (PDA), o de-tector de infra-vermelhos (IR e FT-IR),
odetector fototrmico (PTD), o detectorpolarimtrico ou de rotao
ptica, o
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detector de foto-ionizao (PID), o de-tector de ionizao de chama
(FID) epor Ultimo, o espectrmetro de massa(MS), sobre o qual nos
debruaremosem detalhe a seguir.
2.5 Sistemas de Tratamentode Dados
Tambm os sistemas de trata-mento de dados em
cromatografiasofreram avanos sensveis em relaoaos sistemas de h trs
dcadas.
Os primeiros sistemas utilizadosbasearam-se em registadores
poten-ciomtricos, os quais aps o registodos picos obrigavam o
operador aquantific-los manualmente por plani-metria, triangulao ou
pesagem.
Em meados da dcada de 70assiste-se ao surgimento da
primeiragerao de integradores electrnicosdigitais, com os quais se
permitequantificar os picos automaticamente,por integrao de rea
e/ou clculo daaltura de pico. Estes sistemas, a prin-cpio de operao
bastante complexa elimitada, deram origem aos actuaisintegradores,
que no apenas integramreas como tambm permitem amemorizao de mtodos
e respectivascurvas de calibrao para cada pico,memorizao de
cromatogramas e oseu reprocessamento, seleco dediversos mtodos de
quantificao(rea, altura de pico, padro interno,padro externo, adio
de padro, etc.)e dispem j de interfaces tipo RS-232para conexo a
computadores pes-soais.
Com a expanso e quase bana-lizao verificada na utilizao
decomputadores pessoais, no princpioda dcada de 80 alguns
fabricantes decromatgrafos, entre os quais se contaKONIK
INSTRUMENTS, iniciaram odesenvolvimento de sistemas detratamento de
dados baseados empa cotes integrados interface
A/D(analgica/digital) + programa infor-mtico (software) dedicado.
Estes sis-temas, alm de cumprirem excelen-temente as funes de um
integradorde altas prestaes, permitem tambmelaborar um arquivo de
dados per-manente em discos flexveis (floppydisks) e adicionam uma
maior rapidezno processamento de dados com aflexibilidade conferida
pelos actuaisprogramas informticos para proces-samento de texto,
criao de base dedados e folhas de clculo e conexo asistemas em rede
tipo LAN (Local AreaNetwork) e/ou LIMS (Laboratory Infor-mation
Management System), paragesto integrada e total automatizaodo
laboratrio. Em 1992, a KONIK inicioua comercializao do sistema de
tra-
tamento de dados computorizadoKONIKROM,que constitui uma
evoluodos seus precedentes PEAKMASTER eEASYCHROM, o qual permite na
suaverso bsica o tratamento de dadosde ate 4 detectores e a expanso
ateum mximo de 16 detectores simul-taneamente, permitindo o
armazena-mento de at 100 mtodos e respectivascurvas de calibrao
para cada umadas substncias a analisar, uma altaresoluo para
cromatografi capilar,um mdulo opcional para GPC (Gel Per-meation
Chromatography) e compati-bilidade com redes LAN e LIMS, tudoisto
por um custo cerca de 20% superiora um integrador de 2 canais.
3. INTERFACES LC-MS
Como fabricantes de equipa-mentos para cromatografia desde
1976,KONIK INSTRUMENTS teve a opor-tunidade de acompanhara evoluo
donvel de exigncias dos utilizadores dastcnicas cromatogrficas, as
quaiscresceram muito mais rpida e for-temente do que a tecnologia
empreguena fabricao das unidades instru-mentais, concretamente a
nvel dasensibilidade e especificidade dedeteco de compostos.
Por outro lado, os nveis desensibilidade, especificidade e a
pos-sibilidade de somar as suas capaci-dades analticas qualitativa
e quanti-tativa para compostos orgnicos daespectrometria de massa
(MS),semprecativaram os cromatografistas, ansio-sos por poder
juntar a estas a capa-cidade separativa da cromatografia,pelo que
ainda na dcada de 60 sedesenvolveram as primeiras interfacesGC-MS
(cromatografia de gases espectrometria de massa).
Desde o incio se revelaramcrticos os problemas de introduo
deumfluxo de gs na cmara de ionizaodo espectrmetro de massa, a qual
seencontra sob vcuo, dado que osanalizadores de massa necessitam
deum valor de vcuo relativamente ele-vado da ordem dos 105 a 10-6
mbarpara trabalharem de forma optimizadae isenta de interferncias
de camposelectrostticos e magnticos externos.No havendo ainda
acesso tecnologiadas colunas capilares, foram criadosdistintos
mtodos de acoplamento,entre os quais se contam as interfacesGC-MS
tipo "open-split", com o intuitode reduzir a quantidade de gs
aintroduzir no espectrmetro de massa.Actualmente as interfaces
GC-MS soefectuadas pela prpria coluna capilar,inserida num "tubo"
termostatizado(para prevenir uma indesejada conden-sao), dados os
baixos fluxos de gs
portador a que se opera a separaocromatogrfica em colunas
capilares.
A espectrometria de massa,como tcnica analtica quantitativa
equalitativa de alta sensibilidade eespecificidade, d-nos no s
umaindicao precisa do peso molecularda substncia em anlise
comotambmuma informao extraordinariamentedetalhada da sua forma
estrutural,traduzindo-se numa "impresso digital"real da substncia
em anlise. Com-binada de forma dinmica com acromatografia de gases,
a espectro-metria de massa d origem ao mtodoanaltico mais especfico
e sensvel decaracterizao de substncias presen-tes numa mistura
voltil complexa,mesmo se estivermos em presena depicos
cromatogrficos sobrepostos.
Por outro lado, a cromatografiade lquidos permite levar a cabo
aseparao de substncias que no sosuficientemente estveis e/ou
volteispara serem analisadas por GC, o queinfelizmente ocorre com a
vasta maioriade compostos orgnicos conhecidos;desta forma, a
combinao dinmicada espectrometria de massa com acromatografia de
lquidos estende agama de substncias que podem seranalisadas por
espectrometria demassa, que com a sua especificidade,permite obter
poder adicional a nvelanaltico na resoluo de substnciascom eluio
sobreposta, o que no sepode obter em LC com deteco con-vencional
(espectrofotometria de UV--VIS, fluorescncia, etc.).
Com a tentativa de acoplar acromatografia de lquidos
espectro-metria de massa, os problemas deoptimizar uma interface
agravaram-se,dada a quase impossibilidade de manterfluxos
suficientemente baixos a pres-ses to elevadas de trabalho no LC e
dificuldade emtransferir os solutos paraa fase gasosa, fundamental
na cmarade ionizao (sob vcuo), pelo que osfabricantes se viram na
necessidadede desenvolver interfaces dedicadaspara conexo LC-MS e
que diferem emmuito da simplicidade previamentereferida das conexes
GC-MS.
As interfaces LC-MS que deseguida discutiremos so as
seguintes:Moving Belt (MB)Continuous Flow FAB (CF-FAB)Thermospray /
Plasmaspray (TSP/PSP)Particle Beam (PB)Electrospray (ESI)
De salientar que a maior partedestas interfaces so
compatveistantocom espectrmetros de massa quadru-polares como de
sector magntico. Aopo por um ou outro sistema serdefinida pela
capacidade analtica
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Fig. 1
1 - Analisador
2- Fonte El/CI
3 - Vaporizador de Amostra
4 - Escova do Vaporizador
5 - Ligao a Bomba de Vcuo 2
6- Ligao Bomba de Vcuo 1
7 - Escova
8 - Rolamento Director
9 - Amostra proveniente do HPLC
10- Cinta Condutora
11 - Vedantes do Tnel
desejada; enquanto que a mximaespecificidade e sensibilidade em
MSse obtm com espectrmetros de massade sector magntico de alta
resoluo(geometrias BE, EB ou EBE)ou sistemashbridos MS-MS
(geometrias GO, EBC1,EBEC1 ou ainda EBEBE), para anlisesde rotina
sera suficiente um sistemaquadrupolar, que se apresenta como asoluo
de menor custo associada auma excelente fiabilidade,
reproduti-bilidade e robustez.
3.1 Moving Belt (MB)
A interface "Moving Belt" (CintaMvel) (fig. 1) foi a primeira
interfaceLC-MS idealizada e colocada em fun-cionamento de forma bem
sucedida,tendo sido tambm a primeira interfacecomercialmente
disponvel.
Tal sistema, hoje praticamenteem desuso, consiste em depositar
oeluente proveniente do LC sobre umacinta em movimento continuo
umaplataforma rolante transportando aamostra ate fonte de ionizao
doespectrmetro de massa.
Durante o processo de trans-ferncia, a substncia dissolvida
noeluente e depositada sobre a cintaatravessa uma srie de comportas
devcuo diferencial (vacuumlocks), sendode seguida o solvente
evaporado porefeitotrmico, deixando a substncia aanalisar sob a
forma de uma "mancha"ou "borro" slido sobre a superfcieda cinta que
entrada do espectrmetrode massa, na fonte de ionizao El/CI,
instantaneamente vaporizado.
Por forma a evitar (ou atenuar)o "efeito de memria"
inter-amostras,
so utilizados os sistema de "escovas"ou de sobreaquecimento da
cinta, natentativa de retirar da superfcie damesma
quaisquervestgios da amostraque possam ainda existir aps a
va-porizao instantnea desta.
Como principais vantagens do"Moving Belt" temos a destacar:
permite obter espectros "cls-sicos" em ionizao El e CI,
possibi-litando a sua posterior pesquisa embibliotecas de
espectros;
6 compatvel comtcnicas deionizao que actuam sobre
superfcies,tais como o FAB e o Cs-SIMS;
permite a anlise tanto decompostos ligeiramente polares
comoaltamente polares.
Entre as suas desvantagens,contam-se as seguintes:
elevada complexidade mec-nica;
elevada dificuldade em anularos "efeitos de memria" inter-a
mostras,independentemente do sistema
utili-zadorescovas"ousobreaquecimento);
baixa sensibilidade paraamostras volteis, dado o
tratamentotrmico a ser sofrido pelas amostras;
baixa tolerncia a fases m-veis com elevado teor de gua.
3.2 Continuous Flow FastAtom Bombardment (CF-FAB)
A interface/fonte de ionizaoCF-FAB (Ionizao por Bombardea-mento
Atmico de Fluxo Continuo) (Fig.2), usualmente referida tambm
comoDynamic-FAB (FAB Dinmico), consistenuma modificao das fontes
deionizao convencionais por FAB ouSIMS, por forma a permitir a
suaadaptao a uma situao de fluxocontinuo.
5
Fig. 21 - Analisador2- Extremidade da Sonda3 - Isolador Trmico4
- Capilar de Silica Fundida5 - Amostra proveniente do HPLC6- Eixo
da Sonda7 - Bloco de Cobre Aquecido8 - Feixe Primrio
Tal modificao consiste emsubstituir a sonda convencional
(queresumidamente um tubo metlicodispondo de uma extremidade
plana,onde se deposita uma gota de amostra)por uma sonda "oca", a
qual permiteque um fluxo continuo de eluente +amostra seja bombeado
ate ao "alvo"do canho de ies, situado na suaextremidade superior, o
qual dispe deum difusor adequado que regula a suadisperso na cmara
de ionizao.
Ao distinguir o difusor ("alvo"(,
as molculas da amostra diludas nosolvente so bombardeadas por
tomosneutros (FAB) ou ies Cs (SIMS). Aionizao tem ento lugar por
meio doimpacto atmico gerado e os ies daamostra assim formados so
"extra-dos" da matriz lquida e "pulverizados"na fase gasosa,
permitindo a posterioranlise de massas.
A ionizao por FAB conside-rada uma tcnica de ionizao "fraca",que
optimiza prioritariamente a anlisea nvel de pesos moleculares.
Porformaa optimizar o processo de ionizao, oeluente usualmente
contm entre 3 a10% de glicerol.
Outro dado importante que,por forma a manter o alto vcuo
reque-rido na fonte de ionizao, o fluxo m-ximo permitido por uma
interface LC-MS tipo CF-FAB est limitado a 10 pl/min.
Como principais vantagens do"CF-FAB" temos a destacar:
simplicidade mecnica;sendofundamentalmente uma
tcnica de ionizao "fraca", permiteobter uma vasta informao a
nvel depesos moleculares;
permite a anlise tanto decompostos polares como inicos.
Entre as suas desvantagens,contam-se as seguintes:
necessidade de adicionaruma elevada percentagem de glicerolfase
mvel, o que restringe o desen-volvimento de mtodos em HPLC ou
anecessidade de uma bomba suple-mentar para adio ps-coluna
daquantidade de glicerol necessria,implicando maior complexidade
mec-nica;
limitaes crticas a nvel defluxos de solvente, os quais devem
serinferiores a 10 pl/min;
necessidade de recorrer acolunas capilares para HPLC caso
sedeseje proceder a anlises LC-MS "on-line", d ad as as srias
restries defluxo;
3.3 Thermospray/Plasmas-pray (TSP/PSP)
A interface/fonte de ionizaoTSP/PSP a tcnica de conexo LC-MS
24cn
C7
-
13
artigos
de mais vasta utilizao, dada a suasimplicidade.
Tal tcnica consiste em sobre-aquecer e vaporizar o eluente
entradada fonte, o qual passa de seguidaatravs de um pequeno
orifcio dandoorigem a um jacto tipo "aerosol",ocorrendo ento a
vaporizao eionizao da amostra em simultneo.
A interface/fonte de ionizaoTSP convencional requer um
tampovoltil(electrlito)diludo na fase mvel,por forma a obter ies
reactivos quepermitem ionizar as molculas da amos-tra em soluo. Tal
facto d origem aque a ionizao sejatanto mais efectivaquanto mais
polar seja a amostra.
As fontes de ionizao TSPmodernas, denominadas Plasmaspray(PSP)
(fig. 3), incorporam elctrodos dedescarga ou filamentos aquecidos
quepossibilitem que as amostras apoiarespossam ser ionizadas
eficazmente.Outra inovao adicional nas actuaisfontes de ionizao PSP
a existnciade um elctrodo de repulso inica (ionrepeller electrode)
o qual d origem areaces de fragmentao no interiorda prpria fonte, o
que optimiza sig-nificativamente a anlise estrutural daamostra.
Como principais vantagens dasfontes de ionizao TSP/PSP temos
adestacar:
tal como as fontes CF-FAB, asfontes TSP/PSP sofontes de
ionizao"fracas", optimizando a anlise a nvelde pesos
moleculares;
a incorporao de um elc-trodo de repulso inica permite induziruma
fragmentao molecular perfeita-mente controlada;
a ionizao por TSP/PSP atcnica mais amplamente utilizada emLC-MS,
dispondo portanto de uma vastabibliografia;
as contribuies relativas composio e ao fluxo do eluente
somnimas, sendo portanto as suas even-tuais restries perfeitamente
negligen-civeis;
permite a anlise tanto decompostos polares como inicos.
Entre as desvantagens destatcnica, contam-se as seguintes:
necessria a utilizao deum tampo voltil, para optimizar
avaporizao e ionizao da amostra;
as amostras devem apresen-tar-se isentas de matria slida, pois
deoutra forma poder-se- obstruir o vapo-rizador
apresenta uma elevada sensi-bilidade composio qumica dasoluo
(solvente + amostra), a qualexerce uma elevada influncia
naoptimizao dos mtodos.
3.4 Particle Beam (PB)
A interface LC-MS "ParticleBeam" (Feixe de
Partculas) (fig. 4)consiste em um elaborado sistema
quesuplantoutotalmente as interfaces tipo"Moving Belt" como mtodo
de eleiopara ionizao El e Cl em LC-MS. Talinterface distingue-se
pela sua extremafacilidade de operao a qual se deveessencialmente
sua simplicidademecnica.
O princpio de funcionamentoda interface PB consiste emfazer
passaro eluente atravs de um nebulizadorpneumtico (o qual consiste
basica-mente num t em cujas extremidadesse conecta respectivamente
o HPLC,uma garrafa pressurizada de hlio e acmara de dissoluo), de
forma aproduzir uma nuvem de vapor formadapor gotculas pulverizadas
da misturaamostra + solvente. Estas gotculas sotransportadas atravs
de uma cmarade dissoluo aquecida, onde se iniciaa formao de
pequenos agregados departculas da amostra, sendo ossolventes
volatilizados e retirados pormeio de um separador de
vcuodiferencial de dois estgios, cujoconceito muito similar ao "jet
separa-tor" utilizado em GC-MS. As partculasremanescentes, que
constituem aamostra a analisar, so seguidamenteintroduzidas na
fonte de ionizao El/CIonde so vaporizadas e ionizadas.
Os espectros obtidos ao utilizaruma interface PB seguida de
ionizaoEl/CI dispem de uma informao a nvelestrutural
consideravelmente maiscompleta que a obtida por ionizaoTSP/PSP,
pelo que estas tcnicas soconsideradas complementares.
Como principais vantagens dainterface PB LC-MS temos ento
adestacar:
simplicidade mecnica, ha-
Fig. 41 - Analisador2- Linha de Tranferncia de Gases3 - Fonte
El/CI4 - Linha de Transferncia5 - Skimmer 2
Fig. 31 - Amostra proveniente do HPLC2 - Spray de Aerosol3 -
Elctrodo de Plasmaspray4 - Elctrodo Repulsor5- Ligao Bomba de
Vcuo6- Entrada para o Analisador7 - Vaporizador Capilar
Aquecido
vendo por isso substitudo quasetotalmente a interface "Moving
Belt";
permite obter espectros "cls-sicos" em ionizao El e Cl,
possibi-litando a sua pesquisa em bibliotecasde espectros;
as contribuies relativas composio e ao fluxo do eluente somnimas
sendo portanto as suaseventuais restries
perfeitamentenegligenciveis;
permite a anlise tanto decompostos ligeiramente polares
comofortemente polares.
Entre as suas desvantagens,contam-se as seguintes:
6 necessrio que as amostrasseja apenas parcialmente volteis,
poisde outra forma grande pa rte serarrastada juntamente com o
solvente;
6 bastante restrita a utilizaode tampes insolveis, os quais
sovulgarmente utilizados em HPLC.
3.5 Electrospray (ESI)
A interface/fonte de ionizaoElectrospray (fig. 5) a tcnica
mais
6- Ligao Bomba de Vcuo 17 - Skimmer 18 - Entrada de Hlio9-
Nebulizador
10 - Amostra proveniente do HPLC11 - 0-Ring12- Cmara de
Dissoluo13- Ligao a Bomba de Vcuo 2
11
10
-
4Presso
BombaAtmosfrica
Difusora(cerca de105 mbar)
artigos
recente de combinao LC-MS, sendoa interface que tem
demonstradoconstituir o passo mais importante ateao momento actual
no sentido de obteruma interface LC-MS "universal".
Esta fonte de ionizao conta-se como a mais "fraca" entre
qualqueroutra at hoje desenvolvida, permitindoanalisar pela
primeira vez molecules deelevada instabilidade trmica por LC-MS,
sendo possvel encontrar nabibliografia j existente aplicaes
bemsucedidas de anlise de protenas depesos moleculares na ordem de
150.000Dalton.
Na fonte de ionizao ESI, asmolculas da amostra so
simultanea-mente nebulizadas e ionizadas a pres-so atmosfrica da
seguinte forma: asoluo que contm a amostra in-troduzida atravs de
um tubo capilarem ago inox situado a poucos milmetrosde um elctrodo
de forma cncava edispondo de um orifcio central, entreos quais
mantida uma diferena depotencial de 4 a 6 kV, de forma a que
osolvente que emerge do capilar dorigem a um "spray" electrosttico
emdireco ao referido elctrodo (fig. 6).Os ies em fase gasosa
formados apresso atmosfrica pela evaporaoinica descrita so ento
sugadosatravs do orifcio existente no elc-trodo para o alto vcuo do
espectr-metro de massa.
Um espectro "em estado bruto"de um nico componente obtido por
ESIfrequentemente apresenta series depicos representando ies com
cargasdistintas. Este tipo de dados "em bruto"so posteriormente
processados pelosistema de tratamento de dados porforma a permitir
a identificao de umnico pico identificativo do verdadeiropeso
molecular. Por outro lado, as maissofisticadas fontes de ionizao
ESIfrequentemente incluem a possibilidade
Fig. 51 - Amostra proveniente do HPLC2- Capilar3- Ligao Bomba
Rotative (cerca de 1 mbar)4- Analisador5 - Skimmer6- Orifcio de
Amostragem7 - Elctrodo de Vrtex
de induzir fragmentaes molecularespor coliso, onde a anlise
estruturalda amostra o objectivo a atingir.
As fontes ESI clssicas, talcomo as fontes CF-FAB, esto
restrin-gidas a fluxos da ordem dos 10 til/min.As fontes mais
modernas e sofisticadas,que incluem acessrios de nebulizaopneumtica
(sistemas similares aosutilizadores nas fontes PB) do
"spray"electrosttico, permitem utilizar fluxossuperiores a 0.1
ml/min, constituindoassim a fonte ESI a fonte de eleiopara
colunas microbore.As principais vantagens da in-
terface/fonte de ionizao Electrosprayso as seguintes:
o facto de ser a mais "fraca"fonte de ionizao (no actual estgio
dedesenvolvimento tecnolgico), Per-mitindo a obteno de uma preciso
noclculo de pesos moleculares melhorque 0.01%;
permite a anlise de mol-culas com peso molecular de 100 a maisde
100.000 Dalton;
permite induzir de formaperfeitamente controlada a fragmen-tao
molecular;
constitui o mtodo de eleiopara a anlise de digestes enzimticasde
protenas;
permite a sua aplicao naanlise de molculas polares, inicas ede
elevada termo-sensibilidade.
As desvantagens desta fonteso as seguintes:
restrio defluxo do eluente avalores da ordem de 0.1 a 0.2
ml/min;
requer amostras compostaspor molecules polares.
4. CONCLUSESApesar do objectivo da maior
parte dos investigadores e principaisfabricantes seja conceber e
utilizaruma interface LC-MS "universal",como pudemosverificar
nenhuma delaso .
Tal facto leva a que a maiorparte dos laboratrios utilize
parale-lamente mais de uma das tcnicas decombinao LC-MS descritas
porformaa garantir a maior e mais flexvel gamade potencialidades
analticas, o queimplica elevados custos tanto a nvelinstrumental
como a nvel de manu-teno.
H a referir que, como fabri-cantes de equipamentos de
croma-tografia de lquidos e espectrometriade massa, o Departamento
de Inves-tigao e Desenvolvimento de KONIKINSTRUMENTS encontra-se
nestemomento a desenvolver intensa acti-vidade na explorao das
potencia-
lidadesfuturas dasfontes de ionizao/interface tipo electrospray
na conexoHPLC-MS, pelas razes anteriormenteapontadas.
Glossrio
B - Sector MagnticoCF - Fluxo ContinuoCI - Ionizao QumicaE -
Sector ElectrostticoEl - Ionizao por Impacto ElectrnicoESI -
Ionizao por ElectrosprayFAB - Ionizao por BombardeamentoAtmicoGC -
Cromatografia de GasesHPLC - Cromatografia de Lquidos deAlta
EficinciaLC - Cromatografia de LquidosLSIMS - Espectrometria de
Massa deIes Secundrios em Fase LquidaMB - Cinta MvelMS -
Espectrometria de MassaPSP - Ionizao por Plasmaspray
- GuadrupoloTSP - Ionizao por Thermospray
Referncias
R. B. Chust, Bol. Soc. Port. Qum. 39(1990) 43-53L. S. Et-tre,
Int. Lab. 21 )8) (1991) 18-24L. S. Et-tre, Int. Lab. 21 (9) (1991)
18-27
Agradecimentos
Desejamos apresentar os nos-sos sinceros agradecimentos ao
Eng.Josep Mestre (Director de Investigaoe Desenvolvimento de KONIK
INSTRU-MENTS), ao Doutor Jose M. Gilbert(Presidente e Director
Geral do GrupoKONIK), ao Doutor Martins Montes (Di-rector do
Laboratrio de InvestigaoAplicada de KONIK INSTRUMENTS) emuito
especialmente aos nossos nu-merosos clientes e utilizadores em
Por-tugal pelo suporte prestado na ela-borao deste trabalho.
* O contedo deste artigo foi objectode uma conferncia sob o
mesmottulo no decorrer do 13.0 Encontro
Anual da Sociedade Portuguesade Qumica (Instituto Superior
Tcnico, Lisboa, Janeiro 1992).**Consultor Tcnico-Comercial,
KONIKINSTRUMENTS (Porto)*** Director do Laboratrio de Apli-caes,
KONIK INSTRUMENTS (Lisboa)**** Director Geral, KONIK INSTRU-MENTS
(PORTUGAL)
26
C)
