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4 microbiota na soja

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  • 1. Pesq. agropec. bras., Braslia, v.43, n.1, p.71-82, jan. 2008Avaliao qualitativa e quantitativa da microbiota do solo 71Avaliao qualitativa e quantitativa da microbiotado solo e da fixao biolgica do nitrognio pela sojaRosinei Aparecida de Souza(1), Mariangela Hungria(2), Julio Cezar Franchini(2),Ligia Maria de Oliveira Chueire(2), Fernando Gomes Barcellos(2)e Rubens Jos Campo(2)(1)Universidade Estadual de Londrina, Departamento de Qumica, Caixa Postal 60001, CEP 86051-990 Londrina, PR.E-mail: [email protected] (2)Embrapa Soja, Caixa Postal 231, CEP 86001-970 Londrina, PR. E-mail: [email protected],[email protected], [email protected], [email protected] O objetivo deste trabalho foi definir, para as condies edafoclimticas do Brasil, nveis aceitveis dedisperso de alguns parmetros biolgicos, utilizados em estudos de impacto ambiental de novas tecnologiasusadas na cultura da soja. Dois ensaios com soja convencional e transgnica foram conduzidos em 11 municpiosde seis estados e no Distrito Federal; os parmetros avaliados foram: carbono e nitrognio da biomassa microbiana,respirao basal e quociente metablico microbiano, eletroforese do DNA do solo em gis desnaturantes (DGGE),fixao biolgica do nitrognio, populao de rizbios, nmero e massa de ndulos secos, ocupao dos ndulospelas estirpes de Bradyrhizobium, massa de matria seca da parte area, nitrognio total e nitrognio comouredos na parte area.A variabilidade temporal de: carbono e nitrognio, da biomassa microbiana, da respiraobasal e do quociente metablico microbiano foi adequada, e o coeficiente de variao mximo aceitvel foiestimado em 35%.A homogeneidade entre repeties, tratamentos e coletas foi confirmada por DGGE. Em solospobres em nitrognio, os parmetros de massa de ndulos e massa da parte area, com coeficiente de variaomximo de 33 e 18%, respectivamente, foram adequados para avaliar a fixao biolgica do N, que contribuiu com72 a 88% do nitrognio total da parte area.Termos para indexao: Bradyrhizobium, Glycine max, biomassa microbiana, DGGE, monitoramento ambiental,transgnicos.Quantitative and qualitative evaluations of soil microbes and biologicalnitrogen fixation in soybeanAbstract The objective oh this work was to define, for edaphoclimatic conditions of Brazil, acceptable levels ofdispersion of some biological parameters, used in studies of environmental impact due to the adoption of newtechnologies with the soybean crop. Two experiments were performed in eleven counties, in six states and in theFederal District, with conventional and transgenic soybean. Evaluated parameters were: carbon and nitrogen ofthe microbial biomass, microbial respiration, microbial metabolic quotient, electrophoresis of soil DNA indenaturating gradient gel (DGGE), biological nitrogen fixation, number of rhizobial cells, nodule number andnodule dry weight, nodule occupancy by Bradyrhizobium strains, shoot dry weight, total nitrogen in shoot andnitrogen as ureides in shoot. The temporal variability for carbon and nitrogen of microbial biomass, microbialrespiration and microbial metabolic quotient was adequate, and the maximum coefficient of variation was estimatedat 35%. The homogeneity between replicates, treatments and harvests was confirmed by the DGGE method.In N-poor soils, the parameters of nodules and shoot dry weight, with maximum coefficient of variation 33and 18%, respectively, were adequate for evaluation of biological nitrogen fixation, which contributed from72 to 88% of total nitrogen in shoot.Index terms: Bradyrhizobium, Glycine max, microbial biomass, DGGE, environmental monitoring, transgenics.IntroduoDesde a expanso comercial da cultura da soja noBrasil, na dcada de 1960, grandes esforos foramempreendidos no melhoramento das cultivares e naseleo de estirpes de Bradyrhizobium japonicum eB. elkanii, para tornar viveis taxas elevadas de fixaobiolgica do nitrognio (FBN) (Hungria et al., 2006).At94% do N requerido pelas cultivares mais produtivaspode ser fornecido pela FBN, o que permite rendimentossuperiores a 4.000 kg ha-1 (Hungria et al., 2006).A expanso acentuada de reas cultivadas com sojatransgnica no Brasil causa preocupao quanto agarantir a eficincia do processo de FBN.A incorporao

2. Pesq. agropec. bras., Braslia, v.43, n.1, p.71-82, jan. 2008R.A. de Souza et al.72de genes de tolerncia a herbicidas ou inseticidas nodeveria afetar a simbiose, contudo, a regulao de outrosgenes pode ser alterada pela introduo do genetransgnico, e o herbicida especfico pode afetar abactria (Zablotowicz & Reddy, 2004). H preocupaocom os possveis efeitos da transgenia na microbiota dosolo, que podem ocorrer pela liberao de novas protenasna rizosfera, pela persistncia de DNA transgnico emmaterial senescente no solo que interage com amicrobiota, e pela transferncia de genes paramicrorganismos indgenas (ODonnell & Gorres, 1999).A importncia dos microrganismos para a qualidadedo solo e da FBN, para a nutrio das leguminosas, temdemandado a anlise de diversos parmetrosmicrobiolgicos em ensaios de monitoramento ou deavaliao de impactos ambientais. Contudo, a viabilidadede avaliar esses parmetros simultaneamente, em largaescala, e com amostras de diferentes agroecossistemasainda no foi confirmada.O objetivo deste trabalho foi definir, para as condiesedafoclimticas do Brasil, nveis aceitveis de dispersode alguns parmetros biolgicos utilizados em estudosde impacto ambiental de novas tecnologias usadas nacultura da soja.Material e MtodosForam realizadas avaliaes em dois conjuntos deensaios, em reas comerciais (Ensaio 1) e em ensaiosexperimentais (Ensaio 2), conduzidos nas principaisregies produtoras de soja do Brasil (Tabela 1).Os experimentos com soja convencional (Ensaio 1)foram instalados em delineamento experimental emblocos ao acaso, com trs repeties, conduzidos na safra2002/2003, em propriedades de agricultores em seismunicpios tradicionais de produo de soja: So LuizGonzaga, Passo Fundo, Ponta Grossa, Cascavel,Londrina e Dourados. A localizao, o clima e tipo desolo de cada local encontram-se na Tabela 1.As coletas para as anlises microbiolgicas foramrealizadas nos estdios V4 (terceira folha trifoliadaestendida e a quarta aberta) e R2 (florescimento pleno).Todas as reas haviam sido cultivadas com soja cominoculao por vrios anos, e apresentavam populaesestabelecidas de Bradyrhizobium; entretanto, no setem informaes sobre a inoculao nessas safras, bemcomo sobre as cultivares utilizadas e o sistema de cultivoadotado. Nenhuma das reas recebeu fertilizantenitrogenado.Os experimentos com soja convencional e eventotransgnico para tolerncia a herbicida foram conduzidosem sete estaes experimentais (privadas ou daEmbrapa) (Ensaio 2) na safra 2004/2005, em: PontaGrossa, Londrina, SantoAntnio de Posse, Sete Lagoas,Santo Antnio de Gois, Braslia e Planaltina; asinformaes sobre os municpios encontram-se naTabela 1. As cultivares de soja utilizadas foram aConquista e a Conquista evento transgnico, que contmuma cpia nica de gene para tolerncia a um herbicidaespecfico.Os ensaios foram conduzidos no sistemaconvencional, e as parcelas foram constitudas de quatrofileiras de 5 m de comprimento, espaadas em 0,5 m.O delineamento experimental foi o de blocos ao acaso,com quatro repeties e trs tratamentos: Conquistatransgnica com herbicida especfico; Conquistatransgnica com herbicidas convencionais; e Conquistaconvencional com herbicidas convencionais.A semeadura foi realizada manualmente. As prticasculturais de preparo do solo, fertilizao, irrigao,inoculao e controle de pragas foram aplicadasuniformemente em cada ensaio, conformeTabela 1. Localizao, clima e tipo de solo nos municpios onde os experimentos foram conduzidos(1).(1)LV: Latossolo Vermelho; LB: Latossolo Bruno; NT: Nitossolo Vermelho; AVA: Argilossolo Vermelho-Amarelo; AV: Argissolo Vermelho. 3. Pesq. agropec. bras., Braslia, v.43, n.1, p.71-82, jan. 2008Avaliao qualitativa e quantitativa da microbiota do solo 73recomendaes tcnicas para a cultura. As coletasforam realizadas nos estdios de pr-plantio (PP), R2 e,em cinco locais, em R8 (maturao plena).Para as anlises quantitativa e qualitativa damicrobiota do solo, foram coletadas sete subamostrasdeformadas de solo (010 cm), na rea total da parcelaantes do plantio, ou nas entrelinhas aps a germinao.As amostras foram transportadas para o laboratrio,homogeneizadas e peneiradas (malhas de 4 mm), ederam origem a amostras compostas que foramarmazenadas em sacos de plstico na geladeira, a 4C,pelo mximo de dez dias. Para a anlise da diversidademicrobiana, subamostras de cada amostra compostaforam mantidas a -80CA anlise do C e do N da biomassa microbiana (CBM eNBM) foi realizada com uso do mtodo de fumigao-extrao (Brookes et al., 1985; Vance et al., 1987). O teordeCnosextratosfoideterminadocolorimetricamente,apsa oxidao com Mn3+, e o teor de N nas mesmas fraesfoi determinado por digesto via mida, seguida dadeterminaocolorimtricado N amoniacal (N-NH4) pelomtodo de azul de indofenol; os valores de biomassamicrobiana obtidos foram expressados em microgramade C ou micrograma de N da biomassa microbiana porgrama de solo seco (Franchini et al., 2007).A respiraobasal (RB) foi avaliada pela determinao do C do CO2(C-CO2), liberado e capturado em uma soluo de NaOH0,5N, em amostras no fumigadas, incubadas por dezdias; os valores de respirao obtidos foram expressadosem micrograma de C-CO2 por grama de solo secopor dia. O qCO2 foi obtido pela diviso da RB pelo CBM[(g de C-CO2 g-1 C microbiano h-1) x 104].A extrao do DNA total do solo, para o estudo dacomposio bacteriana, avaliada em gel desnaturante(DGGE),foirealizadaemamostrasde0,25 gdesolo,como Ultraclean Soil DNA Kit, conforme especificaes dofabricante.Foramrealizadasduasreaesdeamplificaodo DNA total do solo, para a regio que codifica o gene16S rRNA,seguidaspelaeletroforesedosprodutosdePCRem um aparato de DGGE, e os gis foram corados efotografados sob radiao UV (Hungria et al., 2003).A populao de riz

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