72511582-Apostila-Pratica

UNIDADE DE ENSINO SUPERIOR VALE DO IGUAÇU

CURSO DE FARMÁCIA

DISCIPLINA: TOXICOLOGIA CLÍNICA

APOSTILA DE ANÁLISES TOXICOLÓGICAS

PROFESSORA:

Elaine Anton

APRESENTAÇÃO

O presente trabalho é uma compilação de várias técnicas ministradas na

disciplina de Toxicologia de outras Universidades, que também estão sendo usadas

nos laboratórios de Emergências Toxicológicas dos Centros de Controle de

Intoxicações, bem como de algumas análises realizadas em laboratórios da Polícia

Técnico-Científica, com a finalidade de sistematizar as aulas práticas da disciplina de

Toxicologia.

Profª. Elaine Anton

SUMÁRIO PROCEDIMENTOS GERAIS NO LABORATÓRIO .................................................... 2

ANÁLISES TOXICOLÓGICAS ................................................................................... 4

DIAGNÓSTICO DAS INTOXICAÇÕES AGUDAS ...................................................... 8

MODELO DE REQUISIÇÃO PARA ANÁLISE TOXICOLÓGICA ................................ 9

MODELO DE FICHA PARA ANÁLISE TOXICOLÓGICA ......................................... 10

MODELO DE LAUDO PARA ANÁLISE TOXICOLÓGICA ........................................ 11

TESTES COLORIMÉTRICOS RÁPIDOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE AGENTES TÓXICOS – TOXICOLOGIA DE MEDICAMENTOS ................................................. 13

TESTES RÁPIDO PARA TRIAGEM DE MEDICAMENTOS (IMUNOCROMATOPLACAS) ................................................................................... 17

MARCHA SISTEMÁTICA PARA EXTRAÇÃO DE MEDICAMENTOS DE MATERIAL BIOLÓGICO ............................................................................................................. 19

DETERMINAÇÃO DE PARACETAMOL EM ESPECTROFOTÔMETRO UV-Vis ..... 26

DETERMINAÇÃO DE SALICILATOS EM ESPECTROFOTÔMETRO UV-VIS (MÉTODO DE KAYE) ............................................................................................... 31

IDENTIFICAÇÃO DE AGENTES TÓXICOS ............................................................. 36

TESTE RÁPIDO PARA TRIAGEM DE DROGAS DE ABUSO - IMUNOCROMATOPLACAS ..................................................................................... 39

IDENTIFICAÇÃO DE CANABINÓIDES EM ERVA IN NATURA POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA – (CCD) ........................................... 42

IDENTIFICAÇÃO DE CANABINÓIDES EM URINA POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DE ALTA EFICIÊNCIA – (CCDAE / HPTLC) .......................... 44

IDENTIFICAÇÃO DE COCAÍNA EM AMOSTRAS DE PRODUTO .......................... 47

TESTES COLORIMÉTRICOS RÁPIDOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE AGENTES TÓXICOS ................................................................................................................. 51

IDENTIFICAÇÃO DE AGROTÓXICOS POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD) ..................................................................................................... 52

DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA COLINESTERASE PLASMÁTICA .............. 55

DETERMINAÇÃO DE METEMOGLOBINA .............................................................. 58

DETERMINAÇÃO DE CARBOXIEMOGLOBINA NO SANGUE ............................... 62

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COMUNICAÇÃO

Pelo presente, estamos levando ao conhecimento dos alunos as seguintes

informações:

A freqüência às aulas será OBRIGATÓRIA, respeitando-se os horários pré-

determinados.

Será OBRIGATÓRIA a utilização de guarda-pó nas aulas práticas.

Não fumar, comer ou ingerir líquidos no laboratório.

Conserve as bancadas livres de materiais que não estão sendo usados.

Recomenda-se muito cuidado na utilização de substâncias corrosivas e

inflamáveis.

Solventes e líquidos fumegantes deverão ser manipulados dentro das capelas.

Não torne a colocar no frasco de origem o reagente dele retirado ou nele

introduzir objetos estranhos (pipetas, etc.), evite assim a contaminação do reagente

e possibilitar a sua conservação por mais tempo.

Não deixar frascos de reativos abertos.

Zelar pela conservação do material utilizado e pela ordem do laboratório,

deixando a vidraria usada nos locais indicados.

Os alunos serão responsáveis pelas suas amostras, durante o andamento das

análises.

Atender às recomendações para o despejo do material utilizado.

Usar luvas e pós-pipetas para manuseio do material biológico.

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PROCEDIMENTOS GERAIS NO LABORATÓRIO 1. Rejeitos químicos

- Para o recolhimento dos rejeitos químicos devem ser utilizados recipientes de vidro ou de plástico resistentes, que estejam em perfeitas condições, principalmente com relação à vedação dos mesmos. Evitar frascos com vazamentos.

- O recolhimento dos rejeitos químicos não deve ultrapassar 2/3 da capacidade do recipiente. Frascos extremamente cheios criam riscos quando transportados.

- Antes do recolhimento dos rejeitos químicos ativos, deve-se ter o devido cuidado no sentido da desativação destes. Lembrar que frascos contendo rejeitos químicos ativos, sem nenhuma indicação no rótulo, expõem os funcionários do setor a sérios riscos.

- Os frascos contendo rejeitos deverão ser rotulados e perfeitamente identificados com o nome do laboratório, material, responsável e data.

1.1 Solventes orgânicos clorados (ex: clorofórmio, tetracloreto de carbono, diclorometano, dicloroetano, etc).

Tendo em vista que esta classe de rejeitos químicos não possibilita nenhum tipo de tratamento prévio dentro do laboratório, devem ser armazenados em recipiente plástico resistente com tampa, para que posteriormente sejam recuperados ou eliminados.

1.2 Solventes não clorados (ex: álcoois, acetonas, éteres, hexano, benzeno, tolueno, etc).

O procedimento adotado para estes solventes, é o mesmo adotado para solventes orgânicos clorados, citados no item 1.1.

1.3 Metais pesados, cátions, ânions em meio aquoso (ex: chumbo, mercúrio, cobre, zinco, etc). O tratamento dos rejeitos inorgânicos compreende as seguintes etapas:

- O material deve ser lançado em bombonas de plástico de 50 litros no final de cada experiência.

- Quando o volume de rejeitos atingir 50% do volume total da bombona sobre a mistura, adicionar excesso de soda cáustica e cal virgem. Deixar decantar o precipitado.

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- Por sifonagem, separar o precipitado do sobrenadante em novas bombonas. Testar se ainda ocorre precipitação com o sobrenadante.

- Repetir o procedimento até não mais formar nenhum precipitado. O sobrenadante final pode ser lançado na pia (estas etapas são realizadas por técnicos da universidade).

1.4 Ácidos e bases

Soluções aquosas diluídas de ácidos e bases deverão ser colocadas em

recipiente tipo béquer e neutralizadas no final de cada experiência. Depois de neutralizado, o material poderá ser lançado na pia, visto que sais do tipo cloretos, sulfatos, carbonatos, fosfatos, etc., na forma diluída não são prejudiciais ao meio.

2. Descarte materiais biológicos

- Urina: as amostras de urina devem ser descartadas em recipiente próprio contendo hipoclorito de sódio. Os frascos coletores devem ser descartados em saco plástico branco leitoso e encaminhados à coleta de lixo hospitalar.

- Sangue: as amostras de sangue devem ser descartadas em tubos ou frascos bem vedados e à prova de vazamentos em recipientes de paredes rígidas, e devidamente identificados com o símbolo internacional de “Risco Biológico”. O vasilhame deve ser lacrado, acondicionado em saco plástico branco leitoso e encaminhado para a coleta hospitalar. 3. Lavagem do material

- A limpeza da vidraria deve ser feita com detergente neutro. - Enxaguar três vezes com água corrente, - A seguir enxaguar duas vezes com água destilada ou deionizada. - Secar a temperatura ambiente. - Resíduos de detergentes no material utilizado podem causar alterações nos

resultados e contaminar os reagentes. Certifique-se o material a ser utilizado está devidamente limpo e seco.

4. Bibliografia PORTARIA SMSA-SUS/BH Nº 017 de 03 de março de 1999. Fiscalização sanitária em laboratórios de análises clínicas no município de Belo Horizonte. Disponível em: http://www.pbh.gov.br/smsa/biblioteca/gevis/port_017_99.pdf. Acesso em 25/11/2009. UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA. Boletim Oficial. Sistema de coleta de resíduos químicos. Disponível em:notes.ufsc.br/aplic/boletim.nsf/0/121 c4ea357070a400325642c005de5aa?OpenDcument. Acesso em 26/04/2006.

http://www.pbh.gov.br/smsa/biblioteca/gevis/port_017_99.pdf

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ANÁLISES TOXICOLÓGICAS

Um laboratório de análises toxicológicas tem grande importância, tanto do ponto de vista das análises que pode oferecer, quanto das informações que seus profissionais podem fornecer.

Com a larga utilização das substâncias químicas na atualidade, um aumento no número de análises tem sido registrado. Para atender, no entanto, às expectativas exigidas para a obtenção de resultados confiáveis, precisamos de profissionais treinados e capazes de lidar com diferentes instrumentos analíticos, isto porque, as análises toxicológicas necessitam de metodologia variada, que atenda as suas características peculiares.

Para entendermos melhor o que isto significa, podemos dividir a toxicologia em 5 áreas principais: Toxicologia Ocupacional, Ambiental, de Alimentos, de Medicamento e Social. Em cada uma destas áreas vamos encontrar necessidades diferentes. Por exemplo, na Toxicologia Ocupacional, pouco valor tem o fato de mencionarmos que este ou aquele agente tóxico foi identificado no sangue do trabalhador, uma vez que, na maioria das vezes, sabemos as condições de exposição; há necessidade, sim, de se quantificar tal substância e se tentar correlacionar o valor obtido com o quadro tóxico exibido. Entretanto, isto não ocorre na área de Toxicologia Social. Exemplo: um indivíduo em controle de farmaco-dependência à anfetamina, se encontrarmos o fármaco inalterado ou seus produtos de biotransformação, não precisamos quantificá-los, pois sua identificação já basta a esta finalidade.

Assim sendo, a realização de Análises Toxicológicas dependerá da finalidade destas, decorrendo daí, questões como: natureza da substância a ser pesquisada, amostra a ser utilizada, a concentração esperada, o método mais adequado etc.

Quanto a Finalidade, esta poderá ser:

- Forense: toda análise com propósitos legais. Então, uma análise do tipo forense poderia estar incluída em quaisquer das áreas da Toxicologia anteriormente citadas.

- Controle terapêutico: nível sanguíneo de fármacos, principalmente aqueles que possuem estreita margem de segurança.

- Limite de Tolerância e Limite Biológico de exposição: controle do nível de exposição e prevenção no ambiente de trabalho.

- Avaliação da qualidade dos Alimentos - Dose Diária Aceitável.

- Avaliação da qualidade do ar, da água e dos solos.

- Auxílio diagnóstico nas emergências toxicológicas e outras.

Dentro do exposto, poderemos abordar outros aspectos relacionados a cada sub-item mencionada qual seja:

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Tipo de amostra: a finalidade da amostra está diretamente ligada à finalidade da análise e da substância a ser pesquisada. Exemplos: na avaliação da exposição ocupacional aos compostos liberadores do íon cianeto, não adiantaria colhermos a amostra e dizermos que há a presença deste íon, mas sim dizermos o quanto há, de maneira exata, pois isto poderia definir o destino do trabalhador exposto. Neste caso, o sangue seria útil na avaliação do íon cianeto e também a urina, como exame suplementar dosando-se tiocianato urinário.

No controle terapêutico a amostra biológica ideal é o sangue; em exames anti-dopping é a urina, sangue e a saliva; na verificação de intoxicações letais são as víceras (rins, fígado, baço, cérebro, pulmões etc.), sangue, urina, conteúdo estomacal etc.

Natureza da substância: ou seja, suas propriedades fisico-químicas e como se comporta, pois dependendo destes fatores, uma substância deverá ser pesquisada neste ou naquele local. Exemplos: os inseticidas organoclorados são muito lipossolúveis e deverão ser pesquisados preferencialmente no sangue e no tecido adiposo; para um gás irritante, de ação local e sem ação sistêmica a melhor amostra seria o ar do ambiente geral ou do ambiente de trabalho.

Concentração esperada - disto resultará implicações relativas à sensibilidade das técnicas empregadas: altamente sensíveis, por exemplo, na determinação de resíduos de inseticidas organoclorados (aqui necessitaríamos de um cromatógrafo a gás acoplado a um detector de captura de elétrons); pouco sensíveis, por exemplo, na identificação de fenobarbital em conteúdo estomacal proveniente de necrópsia de indivíduo com histórico de uso excessivo desse fármaco (neste caso, poderíamos, utilizar a cromatografia em camada delgada). Isso tudo, redundaria noutro fato, ou seja, a disponibilidade de equipamentos.

Método mais adequado - uma revisão bibliográfica especializada seria necessária para avaliação dos métodos utilizados, para escolha do mais indicado e que se enquadre dentro da realidade do laboratório.

Existem ainda outros fatores a serem considerados. Uma substância poderá ser amplamente biotransformada no organismo e se a pesquisa for efetuada na urina poderemos não encontrá-la e sim, seus produtos de biotransformação. Se um indivíduo está exposto a benzeno no seu ambiente de trabalho e recebemos urina para análise, o que podemos dosar é o fenol urinário ou o ácido trans-trans mucônico, pois o benzeno é quase que completamente biotransformado e desta maneira excretado.

A forma de distribuição da substância no organismo também é um importante fator a ser considerado. De que adiantaríamos pesquisar chumbo no soro se esse agente se encontra em torno de 99 % ligado aos eritrócitos?

De posse destes dados e de outros complementares relacionados a toxicocinética e a toxicodinâmica, poderíamos iniciar a análise propriamente dita que, seja ela qual for, via de regra apresenta três fases:

1ª fase - Separação: eliminação dos componentes indesejáveis onde se encontra a substância objeto de análise.

2ª fase - Extração: retirada do elemento do meio onde se encontra.

3ª fase - Identificação e /ou quantificação

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Entre uma fase e outra podemos incluir uma fase de purificação.

ANÁLISE DOS RESULTADOS

Após execução de uma Análise toxicológica, obtemos um resultado. Entretanto, isto não representa tudo. Há que se analisar todo um conjunto de fatores envolvidos com este resultado. Vamos supor que após determinação da digoxina sérica, encontramos uma concentração de 2 ng/ml (duas nanograma de digoxina por mililitro de soro). Essa concentração está contida dentro da faixa considerada terapêutica (1,0 - 2,0 ng / ml). Entretanto, este paciente foi enviado ao laboratório para controle terapêutico justamente por exibir sinais de intoxicação. Como proceder diante de uma situação destas? Vemos, então, que há a necessidade de se pensar em outros fatores relacionados com o quadro apresentado. Esse indivíduo não poderia apresentar uma massa cardíaca sadia menor? Ou, então, esse indivíduo não estaria submetido a uma terapia associada que estivesse produzindo sinergismo?

A partir daí, percebemos que deve haver uma preocupação constante quanto aos fatores que envolvem cada caso em particular e que a obtenção de um valor numérico, pura e simplesmente, não significa muito. O histórico do paciente é de fundamental importância para que uma análise toxicológica chegue a bom termo.

Finalizando o Toxicologista Analítico deve ser, antes de qualquer coisa, um exímio analista, intimamente familiarizado com os modernos equipamentos e técnicas que possam supri-lo com rapidez, sensibilidade precisão e exatidão. Deve estar igualmente habilitado na aplicação dos princípios básicos da Toxicologia, na interpretação de seus achados para formar suas conclusões, quando estas se fizerem necessárias.

TIPO DE AMOSTRAS

1 - AMOSTRAS BIOLÓGICAS:

- víceras (estômago com seu conteúdo, fígado, rins, vesícula biliar, cérebro, intestinos, etc.);

- sangue, soro, plasma; - urina; - saliva; - fezes; - pelo, unhas, cabelos; - leite materno; - ar expirado; - bile; - vômitos;

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- gorduras; - líquido céfalo raquidiano; - líquidos provenientes de lavagem estomacal ou de diálise.

2 - AMOSTRAS NÃO BIOLÓGICAS: (vetor que serve de meio de transporte do agente).

- Alimento;

- Ar (do ambiente geral);

- Ar (do ambiente de trabalho);

- Água;

3 OUTRAS

- Relacionadas com intoxicações agudas e/ou letais: copos c/ líquidos, frascos com agrotóxicos, frascos com produtos de limpeza, embalagem de medicamentos, seringas com líquidos, etc.

- Relacionadas com a "Lei anti-tóxico": vegetais, pós, ampolas, seringas com líquidos, etc.

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DIAGNÓSTICO DAS INTOXICAÇÕES AGUDAS

Banco de referência Amostras autênticas Amostras adicionadas

Salicilatos Carbamatos Escolha do método de análise

Fenotiazínicos

Imipramínicos

Sulfas

Metais

Paraquat / Diquat

Colinesterase

Paracetamol

Voláteis

Clorados Reações diretas Extração seletiva

Benzodiazepínicos Escolha do método de análise

Triagem Confirmação e quantificação

Camada delgada HPLC Fase gasosa

Col. A Col. B Sistemas solventes

Fármacos especiais

S1 S2

FID / EC / NPD

Resultados

Agentes cromogênicos

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MODELO DE REQUISIÇÃO PARA ANÁLISE TOXICOLÓGICA

REQUISIÇÃO PARA ANÁLISE TOXICOLÓGICA Para: (preencher o nome do laboratório, endereço e número do telefone) Discutir sobre necessidades especiais ANTES de enviar as amostras

Data/hora da admissão:

Data/hora da ingestão ou exposição:

Medicamentos prescritos ou usados no tratamento:

Médico:

Telefone/beep:

Endereço do hospital para relatório (informação):

Assinatura: Data:

Drogas/venenos reivindicados ou suspeitos:

Paciente: Outros nomes:

Idade/data de nascimento: Sexo:

Consultante: Responsável:

Número do Protocolo:

Detalhes clínicos/investigação requisitada/prioridades:

Amostra Data Hora

Sangue (10 mL heparinizado)

Urina (50 mL)

Cateter: sim ( ) não( )

Conteúdo estomacal (50 mL)

Outros (fornecer detalhes)

Adaptado de OMS / IPCS. Basic Analytical Toxicology. Geneva: WHO, 1995. p.35.

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MODELO DE FICHA PARA ANÁLISE TOXICOLÓGICA

FICHA TOXICOLÓGICA

Análise Qualitativa Laboratório Testes Realizados

Paciente: Médico: 1. Salicilatos

Hospital: Telefone / beep: 2. Fenotiazínicos

Teste requisitado: Prioridade: 3. Imipramínicos

Amostra Laboratório Data Hora 4. Compostos triclorados

5. Paracetamol

6. Paraquat/diquat

7. Etanol

8. Clorados, etc.

9. Ferro

10. CCD drogas ácidas + básicas

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13.

14.

15.

16.

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Responsável pela Análise:

Data / Hora:

Observações:

Adaptado de OMS / IPCS. Basic Analytical Toxicology. Geneva: WHO, 1995. p.39.

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MODELO DE LAUDO PARA ANÁLISE TOXICOLÓGICA

UNIDADE DE ENSINO SUPERIOR VALE DO IGUAÇU UNIGUAÇU

LABORATÓRIO DE TOXICOLOGIA

Rua Padre Saporiti, 717 – Rio d’ Areia CEP 84600-600 FONE: (42)3522-6192 e-mail: prof_elaineanton@uniguaçu.edu.br

Paciente: Hospital: Unidade: Médico (a): Data Coleta: Hora: Protocolo: Data Entrada: Hora:

Suspeita Tipo de análise Resultado

Material: Método: Observação:

Responsável:

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TOXICOLOGIA

DE MEDICAMENTOS

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TESTES COLORIMÉTRICOS RÁPIDOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE AGENTES TÓXICOS – TOXICOLOGIA DE MEDICAMENTOS Os testes rápidos de coloração e/ou precipitação para identificação de agentes tóxicos têm seu valor como triagem. A partir dos resultados obtidos com tais testes, podemos direcionar um pouco mais o trabalho analítico. Para que seja possível a comparação de coloração, são utilizados nestes testes controles positivo (adicionado de medicamentos) e negativo (isento de medicamentos), podendo-se então comparar a coloração obtida com a amostra suspeita.

1. Salicilatos

A presença de salicilatos pode ser identificada pela adição de solução de cloreto férrico a urina do paciente.

Os polifenóis, quando em presença do elemento ferro, podem ter os oxigênios de suas hidroxilas oxidados ou formar complexos com aquele elemento. Esses produtos apresentam uma coloração que varia do azul ao violeta, por terem maior número de ligas duplas conjugadas do que seu precursor.

Como o ácido acetilsalicílico não possui hidroxila fenólica disponível, somente o ácido salicílico é capaz de formar complexos com sais de ferro.

Procedimento:

a) A 1 mL de urina adicionar 0,5 mL de cloreto férrico 1%. Esta reação não é específica; vale como triagem para todos os compostos fenólicos. Para concentrações maiores do que 150 mg/mL (nas intoxicações agudas) a cor violeta é inconfundível.

b) Ferver cerca de 2 mL de urina em tudo de ensaio sem tampa, por aproximadamente 2 min. Esfriar (temperatura ambiente) e adicionar cloreto férrico 10% gota a gota. Inicialmente forma-se um precipitado esbranquiçado que após ficará púrpura (azul-violáceo). Derivados fenólicos também dão essa reação. O aquecimento elimina corpos cetônicos que podem estar interferindo na análise.

c) Em tubo de centrífuga, acidificar 5 mL de urina com cerca de 2 gotas de ácido sulfúrico 6N. Adicionar 2,5 mL de éter etílico e agitar por 1 minuto por inversão. Centrifugar por 5 minutos a 2000 rpm. Transferir o éter decantado para outro tudo e agitar com 2,5 mL de água destilada e uma gota de cloreto férrico 10%. A camada aquosa ficará violácea.

Reagentes:

Cloreto férrico 1%: pesar 1 g de cloreto férrico e elevar o volume para 100 mL com água destilada em balão volumétrico.

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Cloreto férrico 10%: pesar 10 g de cloreto férrico e elevar o volume para 100 mL com água destilada em balão volumétrico.

Ácido sulfúrico 6N: diluir 16,7 mL de ácido sulfúrico concentrado em água destilada e levar para 100 mL em balão volumétrico. 2. Paracetamol

O paracetamol é em sua maior parte metabolizado por conjugação com ácido glicurônico previamente a excreção urinária. A hidrólise do conjugado glicurônico se dá por tratamento com ácido clorídrico concentrado, resultando em p-aminofenol. Este se conjuga com solução de fenol e hidróxido de amônio, resultando numa tintura fortemente colorida, assim dando um teste qualitativo sensível. Cor azul desenvolvida em 10 min. indica a presença de fenacetina ou paracetamol.

Procedimento:

Em tubo de ensaio adicionar 1 mL de urina, 1 mL de HCl concentrado. Submeter ao banho de água fervente por 20 minutos. Resfriar a temperatura ambiente (jamais resfriar na torneira). Retirar 0,2 mL da urina hidrolisada e adicionar 5 mL de fenol 1% e 3 mL de NH4OH 4M.

Reagentes:

Solução aquosa de fenol 1%: colocar 1 g de fenol em balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com água destilada. Solução de hidróxido de amônio 4M: colocar 10,4 mL de hidróxido de amônio em um balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com água destilada.

3. Clorpromazina e outros fenotiazínicos

Fenotiazinícos são extensamente metabolizados. Clorpromazina, por exemplo, possui mais de 50 metabólitos em humanos. O teste descrito abaixo é baseado na reação de muitos destes compostos com íon férrico sob condições ácidas.

Prodecimento:

a) Com reagente FPN

A 1 mL de urina adicionar 1 mL do reagente FPN. Uma coloração rosa-vermelha indica a presença de fenotiazínicos (a coloração depende da quantidade presente). Interferentes: constituintes endógenos da urina, pigmentos biliares.

A reação com FPN é rápida (5 segundos); se a coloração aparecer após alguns minutos provavelmente é interferente; o ácido salicílico não sendo estável em meio fortemente ácido não interfere nesta reação.

Obs.: quando colocar o reagente FPN colocá-lo gota a gota pelas paredes do tubo. Não agitar o tubo. Resultados positivos devem ser confirmados por CCD.

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b) Com cloreto de ouro

A 1 gota de urina adicionar 1 gota de cloreto de ouro. Uma coloração vermelha indica clorpromazina e outros fenotiazínicos.

Reagentes: FPN: misturar 5 mL de solução aquosa de cloreto Férrico 50 g/L, 45 mL de solução aquosa de ácido Perclórico 20% (20 mL HClO4 em 100 mL H2O) e 50 mL de solução aquosa de ácido Nítrico 50% (50 mL HNO3 em 100 mLde H2O).

Reagente Cloreto de ouro: misturar partes iguais de ácido tricloroacético 20% e cloreto de ouro a 0,25%.

4. Antidepressivos tricíclicos (imipramina e derivados)

O antidepressivo tricíclico imipramina é usado extensamente, sendo metabolizada por desmetilação para desipramina, a qual também é usada como antidepressivo. O teste descrito abaixo, (Teste de Forrest), é baseado na reação destes compostos com solução de dicromato de potássio acidificada.

Procedimento: Em tubo de ensaio colocar 0,5 mL de amostra (urina ou conteúdo estomacal). Adicionar 1 mL do Reagente de Forrest e misturar por 5 segundos. Observar, imediatamente, o surgimento de coloração. Colorações que variam do amarelo-esverdeado até verde escuro ou azul sugerem a presença dos antidepressivos tricíclicos (imipramina e desipramina).

Reagente de Forrest:

25 mL da solução aquosa de dicromato de potássio 0,2%;

25 mL de solução aquosa de ácido sulfúrico 30%;

25 mL de solução aquosa de ácido perclórico 20%;

25 mL de solução aquosa de ácido nítrico 50%.

Obs: Misturar sempre volumes iguais (ideal para uma análise é 2 mL do reagente de Forrest – 0,5 mL de cada reagente). Solução estável se mantida em refrigeração a 4oC.

K2Cr2O7 0,2 % (0,2 g K2Cr2O7 – H2O reagente q.s.p. 100 mL)

H2SO4 30 % v/v (30 mL H2SO4 – H2O reagente q.s.p. 100 mL)

HClO4 20 % v/v (20 mL HClO4 – H2O reagente q.s.p. 100 mL)

HNO3 50 % v/v (50 mL – H2O reagente q.s.p. 100 mL)

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6. Bibliografia:

COSTA, A. F. Farmacognosia. Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian, 1972. v. III, Cap. 10. p. 640.

DECKER, W.J. Spot Tests for rapid diagnosis of poisoning. Clin. Toxic., 4: 89-97, 1971.

MEREK, S. B.; PIVA, R.; ITINOSE, A. M. Padronização de spot testes para uso em laboratórios com atendimento em emergência toxicológicas. Rev. Bras. An. Clin. 36: 143-144, 2004.

MOFFAT, A. C. (ed). Clarke's isolation and identification of drugs. London: Pharmaceutical Press, 2004.

MORAES, R. L. F. Determinação da salicemia em crianças portadoras de artrite reumatóide juvenil por colorimetria e espectrofluorimetria. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Universidade de São Paulo. S.P. Dissertação de Mestrado, 1986.

OMS/IPCS. Monographs: analytical and toxicological data. Basic Analytical Toxicology. Geneva: WHO, 1995. p. 59-236.

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TESTES RÁPIDO PARA TRIAGEM DE MEDICAMENTOS (IMUNOCROMATOPLACAS) 1. Fundamento analítico:

Estes testes fornecem somente um resultado preliminar. Um método de teste alternativo deve ser usado a fim de obter um resultado analítico mais específico. A cromatografia gasosa com espectrometria de massa (CG/MS) é o método confirmatório preferido. Outros métodos químicos de confirmação estão disponíveis.

Os Quick Screen testes para medicamentos são testes competitivos rápidos de imuno-análise qualitativa para detecção de medicamentos e seus metabólitos na urina. É um dispositivo absorvente cromatográfico em que as drogas ou os metabólitos da droga em uma amostra competem com o combinado de droga/proteína retido em uma membrana porosa por um número limitado de locais obrigatórios que apresentam conjugados de anticorpos coloridos. O dispositivo do teste emprega uma combinação original de anticorpos monoclonal e policlonal para identificar seletivamente medicamentos e seus metabólitos na urina com um elevado grau de confiança.

Caso a urina adicionada ao dispositivo apresente níveis abaixo da sensibilidade de detecção do teste, o conjugado anticorpo/colorido ligado ao conjugado droga/proteína fica na região do teste (T) do dispositivo. Isto produz uma faixa colorida do teste que não obstante sua intensidade indica um resultado negativo.

Caso a urina adicionada ao dispositivo apresente níveis acima da sensibilidade de detecção do teste, a droga livre na amostra liga-se ao conjugado anticorpo/colorido, impedindo que o conjugado anticorpo/colorido ligue-se ao conjugado de droga/proteína retido na região (T) do dispositivo. Isto impede o desenvolvimento de uma faixa colorida, indicando uma amostra potencialmente positiva.

2. Medicamentos: Benzodiazepínicos, opióides, barbitúricos e antidepressivos tricíclicos.

3. Limites de detecção: As concentrações de interrupções (cut-off) para cada classe de medicamentos no painel de Quick Screen teste são: BZD Benzodiazepínicos 200 ng/mL OPI Opióides 300 ng/mL BAR Barbitúricos 300 ng/mL TCA Antidepressivos tricíclicos 1000 ng/mL 4. Amostra: A urina deve ser coletada em um recipiente limpo de vidro ou plástico. Ela pode ser refrigerada (2º-8ºC) por 2 dias ou congelada (-20ºC) por um longo período. A urina que for refrigerada deve alcançar a temperatura ambiente (15º-25ºC) antes de ser testada. As amostras que forem congeladas devem ser descongeladas e misturadas antes do teste. Caso haja amostras com grande quantidade de partículas, estas urinas devem ser clareadas por centrifugação ou deixadas em repouso para sedimentar antes de serem testadas.

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5. Procedimento: - Abra a dobradura do cartucho no entalhe, remova o aparelho de teste. Tome cuidado para não tocar na membrana exposta. - Segure o conta-gotas verticalmente e pingue 05 gotas de urina dentro do reservatório destinado para a amostra. - Aguarde 10 (dez) minutos. - Leia o resultado do teste imediatamente. Resultados lidos após terem passados 15 (quinze) minutos não devem ser considerados. 6. Interpretação dos resultados: Positivo Um resultado positivo será indicado quando uma (1) faixa colorida de cor lilás aparecer apenas na região de controle (C), mas não na região de teste (T). Este resultado sugere que a amostra contenha medicamento em um nível igual ou superior ao da concentração cut-off para aquele medicamento. A intensidade da cor do controle positivo não deve ser usada como referência. Negativo Um resultado negativo é indicado quando duas (2) faixas coloridas de cor lilás aparecem, uma na região de controle (C) e outra na região de teste (T). Este resultado sugere que a amostra contenha medicamento em um nível abaixo ao da concentração cut-off para aquele medicamento.

Inválido Um teste deve ser considerado inválido se nenhuma faixa aparecer na região de controle (C). A presença de uma faixa de controle é necessária para confirmar o desempenho da análise. 7. Controle de qualidade: Uma linha processual interna foi incorporada ao dispositivo do teste para ajudar a assegurar o desempenho e a confiabilidade ao Kit. Entretanto, o uso de controles externos é recomendado. Os controles positivos e negativos dentro de 25% da concentração cut-off devem produzir os resultados previstos. 8. Bibliografia: Quick Screen teste Barbitúricos. San Diego: Pharmatech Inc. 2005. Bula de kit. Quick Screen teste Benzodiazepinas. San Diego: Pharmatech Inc. 2005. Bula de kit. Quick Screen teste Opiódes. San Diego: Pharmatech Inc. 2005. Bula de kit. Quick Screen teste Tricíclico Antidepressivo. San Diego: Pharmatech Inc. 2005. Bula de kit.

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MARCHA SISTEMÁTICA PARA EXTRAÇÃO DE MEDICAMENTOS DE MATERIAL BIOLÓGICO

Esta metodologia é de ordem qualitativa, aplicada em suspeitas de intoxicação por medicamentos e outras substâncias e baseia-se na comparação da amostra com um padrão do agente toxicante suspeito. Baseia-se em uma extração líquido/líquido, os medicamentos e outras substâncias são extraídos de material biológico com solventes orgânicos, em pH ácido e básico. Os extratos obtidos são concentrados, aplicados em placas cromatográficas e eluidos em sistema solvente.

1. Amostras:

Urina (coletada recentemente ou conservada a 4ºC), sangue total com anticoagulante, conteúdo estomacal, vísceras, medicamentos suspeitos, outros.

2. Extração:

Para identificação de medicamentos através de cromatografia em camada de delgada ou outros métodos, devemos primeiramente extraí-los do meio em que se encontram. Assim, extraímos as substâncias em meio ácido, neutro e básico e depois realizamos a sua identificação.

2.1 Substâncias de caráter ácido e/ou neutro:

- Colocar 10 mL da amostra num béquer de 20 mL e ler o pH;

- Ajustar o pH entre 4,0 – 5,0 por meio de solução de H2SO4 0,5 N (+/- 3gotas) e transferir a amostra para um funil de separação;

- Extrair com 10 mL de clorofórmio : isopropanol (9:1) agitando vigorosamente por 2 minutos;

- Deixar o funil em repouso (± 5 min) para separação das fases (orgânica/aquosa);

- Filtrar a fase orgânica (inferior) em papel filtro contendo sulfato de sódio anidro (o equivalente a ponta de uma espátula pequena) e recolher o extrato em béquer de 50 mL (Rác);

- Na fase remanescente (aquosa – urina) repetir os itens acima recolhendo o filtrado no mesmo béquer.

- Evaporar em temperatura ambiente. O béquer deve ser colocado a uma distância de aproximadamente 0,5 cm da porta da capela, estando esta semi-fechada e ligada (abertura deve ser de 0,5 cm mais alta do que a altura do béquer). A porta da capela ao lado deve estar totalmente fechada. Dessa forma, a evaporação acontece em 10 minutos. Pode haver formação de água de condensação na parede do béquer e posteriormente no fundo. Confirmar se é realmente água da seguinte maneira: transferir o líquido do fundo do béquer para um eppendorf com auxílio de uma micropipeta. Adicionar 5 gotas de diclorometano, se

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haver formação de 2 fases, confirma-se a presença de água de condensação. Pode-se desprezá-la do béquer e proceder somente com o extrato.

- Reservar o extrato para cromatografar.

2.2 Substâncias de caráter básico e/ou neutro:

- Adicionar a camada aquosa remanescente no balão de separação, solução de NH4OH a 10% até a obtenção de pH 8 a 9 (+/- 8 gotas).

- Extrair com 10 mL de clorofórmio : isopropanol (9:1) agitando vigorosamente por 2 minutos;

- Deixar o funil em repouso (± 5 min) para separação das fases (orgânica/aquosa);

- Filtrar a fase orgânica (inferior) em papel filtro contendo sulfato de sódio anidro e recolher o extrato em béquer de 50 mL (Ralc);

- Na fase remanescente (aquosa – urina) repetir os itens 3, 4 e 5 recolhendo o filtrado no mesmo béquer. Adicionar aproximadamente 2 gotas de ácido clorídrico:metanol (1:100 v/v);

- Evaporar em temperatura ambiente. O béquer deve ser colocado a uma distância de aproximadamente 0,5 cm da porta da capela, estando esta semi-fechada e ligada (abertura deve ser de 0,5 cm mais alta do que a altura do béquer). A porta da capela ao lado deve estar totalmente fechada. Dessa forma, a evaporação acontece em 10 minutos. Pode haver formação de água de condensação na parede do béquer e posteriormente no fundo. Confirmar se é realmente água da seguinte maneira: transferir o líquido do fundo do béquer para um eppendorf com auxílio de uma micropipeta. Adicionar 5 gotas de diclorometano, se haver formação de 2 fases, confirma-se a presença de água de condensação. Pode-se despreza-la do béquer e proceder somente com o extrato.

- Reservar o extrato para cromatografar.

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3. Fluxograma simplificado da extração de agentes tóxicos de material biológico

Amostra – 10mL urina, lavado gástrico, e outros

Acidificar (pH 4-5 com H2SO4 0,5N)

Extrair c/ 10mL clorofórmio:isopropanol 9:1

Fase orgânica

Extrato ácido no

Resíduo Ácido

Evaporar

Filtrar sobre

Na2SO4 anidro

Fase orgânica

Extrato Alcalino

Resíduo Alcalino

Evaporar

Filtrar sobre

Na2SO4 anidro

Fase aquosa (descartar)

Fase aquosa

Alcalinizar c/ NH4OH 30% até

pH 8-9 extrair com 10mL

clorofórmio-isopropanol 9:1

Obs.: Colocar nos extratos alcalinos 1-2 gotas de HCl diluído em metanol (1 ml de HCl em 100 ml de metanol) para evitar perdas em relação aos derivados anfetamínicos

(Rac)

(Ralc)

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4. Identificação por cromatografia em camada delgada:

Após a evaporação dos resíduos (Rácido e Ralcalino), ressuspendê-los com 5 gotas da mistura de solvente orgânico clorofórmio-isopropanol (9:1).

4.1. Aplicação:

Utilizando microcapilares, transferir 3 microgotas das amostras e 3 microgotas dos padrões para as placas cromatográficas ativadas a 110° C por 1 hora.

4.2. Eluição: Sistemas Eluentes: 1. Clorofórmio- acetona ( 9:1). 2. Metanol - amônio (100:1,5 ).

Após a aplicação, colocar as placas em cubas previamente saturadas contendo o sistema eluente adequado. Deixar correr até 12 cm, retirar as cromatoplacas e secar em temperatura ambiente até a evaporação total dos eluentes.

4.3. Revelação: A revelação deve ser realizada em três etapas:

1)Observar as cromatoplacas sob luz ultravioleta (UV) de ondas curtas (254 nm) e

ondas longas (366 nm). 2) A seguir vaporizar com os agentes cromogênicos específicos.

3) Observar novamente as cromatoplacas sob luz ultravioleta (UV) de ondas curtas (254 nm) e ondas longas (366 nm). 5. Agentes cromogênicos: - Solução de cloreto férrico a 5 % (Salicilatos) - Solução de nitrato mercuroso a 1 % (Barbitúricos) - Reativo de Dragendorff Modificado (Alcalóides e Geral)

- Reativo cloroplatínico acidificado (Geral) - Reagente de Forrest (Imipramina)

5.1 Preparação dos agentes cromogênicos:

5.1.1 Solução de cloreto férrico 5%:

Pesar 5 g de cloreto férrico (FeCl3) e dissolver em quantidade de água destilada suficiente para completar 100 mL de solução.

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5.1.2 Nitrato mercuroso 1%:

Pesar 1 g de nitrato mercuroso (HgNO3) e dissolver em quantidade de água destilada suficiente para completar 100 mL de solução.

5.1.3 Reativo de Dragendorff Modificado:

Adicionar 1,0 g de Iodo para cada 100 mL do Reativo de Dragendorff.

Reativo de Dragendorff

Solução A: 2,0 g de subnitrato de bismuto

25 mL de ácido acético

100 mL de água destilada

Solução B: 40 g de Iodeto de potássio


Solução de uso: 10 mL de A + 10 mL de B + 20 mL de ácido acético + 100 mL de água destilada.

5.1.4 Reativo Cloroplatínico Acidificado:

Solução ácido cloroplatínico a 10% ........................ 3,0 mL Água destilada ......................................................... 97 mL Solução de iodeto de potássio a 6% ..................... 100 mL

Para cada 100 mL de solução adicionar 2 mL de ácido clorídrico concentrado.

5.1.5 Reagente de Forrest:

25 mL de solução aquosa de dicromato de potássio 0,2%;

25 mL de solução aquosa de ácido sulfúrico 30%;

25 mL de solução aquosa de ácido perclórico 20%;

25 mL de solução aquosa de ácido nítrico 50%.

Obs: Misturar sempre volumes iguais (ideal para uma análise é 2 mL do reagente de Forrest – 0,5 mL de cada reagente). Solução estável se mantida em refrigeração a 4oC.

K2Cr2O7 0,2 % (0,2 g K2Cr2O7 – H2O reagente q.s.p. 100 mL)

H2SO4 30 % v/v (30 mL H2SO4 – H2O reagente q.s.p. 100 mL)

HClO4 20 % v/v (20 mL HClO4 – H2O reagente q.s.p. 100 mL)

HNO3 50 % v/v (50 mL – H2O reagente q.s.p. 100 mL)

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6. Cálculo do valor de Rf: Rf = distância percorrida pela substância em cm Χ 100 distância percorrida pelo solvente em cm

7. Fatores interferentes:

A CCD é uma técnica que envolve muitas variáveis, assim diversos fatores podem interferir no resultado da análise, devendo estes ser bem controlados durante todo o procedimento analítico.

Tais fatores podem ser: experiência do analista; extração eficiente; intensidade da reação de cor quando na aplicação dos reativos cromogênicos; alteração dos valores de Rf em função da temperatura ambiente, saturação da cuba, natureza do adsorvente, dos solventes e das placas cromatográficas utilizadas. 8. Validade do método:

Os principais parâmetros envolvidos na identificação de uma substância por CCD são a detecção e os valores de Rf.

A detecção envolve a visualização da substância à luz UV (em 254 ou 366 nm) ou ainda pela aplicação de determinado reagente ou combinação de reagentes (reativos cromogênicos) proporcionando uma reação de cor característica da substância em análise.

A verificação dos valores de Rf se dá através da utilização de diferentes sistemas solventes. Assim a associação destes dois parâmetros, juntamente com utilização de padrões de referência em todas as análises, faz com que se tenha controle do método e segurança na identificação da substância pesquisada. 9. Sensibilidade:

Em sua dissertação de mestrado, Vieira (1979), relata boa sensibilidade para concentrações de 5mg/L.

10. Bibliografia: BRITO-FILHO, D. Toxicologia Humana e Geral. 2 ed. Rio de Janeiro: Atheneu. 1988. p. 676. FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO/USP. Análises toxicológicas de urgência: apoio analítico aos centros de intoxicação. Ribeirão Preto: USP, 1984. 67p.

MELLO, S.M.; MACHADO, R.G.P.; FERNANDES, M.D. Manual de Técnicas Analíticas. UNICAMP: Centro de Controle de Intoxicações/Laboratório de Toxicologia.

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MOFFAT, A. C. (ed). Clarke's isolation and identification of drugs. London: Pharmaceutical Press, 2004. OMS/IPCS. Monographs: analytical and toxicological data. Basic Analytical Toxicology. Geneva: WHO, 1995. p. 59-236. VIEIRA, R.V. Identificação de fármacos em urina por cromatografia em camada delgada: Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Universidade de São Paulo. S.P. Dissertação de Mestrado, 1979.

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DETERMINAÇÃO DE PARACETAMOL EM ESPECTROFOTÔMETRO UV-Vis

1. Princípio do método:

Cerca de 25 a 30% do Paracetamol (Acetaminofeno) administrado no organismo se liga às proteínas plasmáticas sendo necessário um pré-tratamento da amostra com ácido tricloroacético para precipitação das proteínas.

O método se baseia na reação do acetaminofeno (N-acetil p-aminofenol) com o ácido nitroso formando assim o 2-nitro-4-acetaminofenol o qual assume uma coloração amarela em meio alcalino. A intensidade desta coloração é proporcional à concentração de acetaminofeno e pode ser medida em espectrofotômetro UV-Visível no comprimento de onda ótimo de 430 nm.

2. Amostra:

Soro ou plasma (soro apresenta menor interferência na metodologia). Coletar a partir da 4a hora da ingestão do paracetamol e registrar o horário da coleta.

Obs: Não usar como anticoagulante heparina ou outras soluções que contenham o-cresol como preservativo.

3. Estabilidade:

Armazenar em geladeira a 4°C por no máximo uma semana.

4. Preparo das soluções:

4.1 Ácido tricloroacético 3% à Pesar 3 g de CCl3COOH (ácido tricloroacético) e dissolver em cerca de 50 mL de água destilada. Completar o volume para 100 mL em balão volumétrico.

4.2 Hidróxido de sódio 8 M à Dissolver 32 g NaOH em 50 mL de água destilada e completar o volume para 100 mL em balão volumétrico.

4.3 Nitrito de sódio 0,07 M à Pesar 0,0241 g de nitrito de sódio e dissolver em 5 mL de água destilada. Solução instável deve ser preparada na hora do uso.

4.4 Solução estoque de paracetamol 1,0 mg/mL à Dissolver 0,1000 g de paracetamol em pequena quantidade de etanol e transferir para um balão volumétrico de 100 mL. Completar o volume com água destilada. Deve ser preparada sempre que uma nova curva for feita.

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5. Curva de calibração:

A partir da Solução Estoque de paracetamol 1,0 mg/mL e soro (branco), preparar a curva de calibração:

P 25,0 mg/L: Pipetar 0,25 mL de solução estoque de paracetamol em balão volumétrico de 10 mL e completar o volume com soro.





6. Procedimento:

- Utilizando tubos Falcon de 15 mL, pipetar 500 µL do branco (soro isento de paracetamol), de cada ponto da curva de calibração, da amostra em duplicata e do soro controle.

- Adicionar 3 mL da solução de ácido tricloroacético 3 % em cada tubo e agitar em vórtex durante 30”.

- Centrifugar por 15 minutos a 2500 rpm.

- Transferir 2 mL do sobrenadante para um tubo de ensaio de 5 mL.

- Adicionar 0,5 mL de nitrito de sódio 0,07 M e homogeneizar.

- Colocar os tubos em banho-maria a 37ºC durante 10 minutos.

- Retirar do banho-maria e adicionar 2 gotas de NaOH 8M.

- Agitar em vórtex e efetuar a leitura da absorbância em 430 nm dentro de no máximo 1 hora.

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7. Fluxograma analítico:

Realizar as leituras em espectrofotômetro λλλλ = 430 nm

Branco da Amostra 500 uL de soro ou plasma

(sem paracetamol)

- 3 mL de ácido tricloroacético 3 % - Vórtex por 30 segundos - Centrífuga, 2500 rpm por 15minutos

- 2 mL do sobrenadante - 0,5 mL de nitrito de sódio 0,07 M - Banho-maria a 37º por 10 minutos - 2 gotas de NaOH 8 M - Vórtex por 30 segundos

Curva de calibração e

Soro Controle 500 uL de soro ou plasma

Amostras em Duplicata

500 uL de soro ou plasma

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8. Interpretação do resultado:

A interpretação do resultado das análises de paracetamol é realizada através

do NOMOGRAMA DE RUMACK (Figura 1) pela correlação entre a concentração de paracetamol e o tempo de ingesta.

Para tanto se deve fazer a coleta da amostra de sangue a partir de 4 horas após a ingesta do fármaco, onde se tem o pico de absorção.

A quantificação do paracetamol é importante para avaliação do risco de dano hepático, em casos de intoxicação aguda.

Figura 1: Nomograma de RumacK

9. Interferentes:

- Os medicamentos: fenilbutazona, oxifenilbutazona, ácido salicílico, teofilina, 4-amino salicílico e levodopa;

- Uso de heparina como anticoagulante e soluções que contenham o-cresol.

10. Bibliografia:

BRITO-FILHO, D. Toxicologia Humana e Geral. 2 ed. Rio de Janeiro: Atheneu. 1988. p. 619.

HALE, P.W.; POLKLIS, A. Evalution of a modified colorimetric assay for the determination of acetaminophen in serum. Journal Analytical Toxicology. 7: 249-251. 1983.

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ITINOSE, A.M.; SZNELWAR, R.B. Determinação de paracetamol em soro por espectrofotometria na região do visível. Rev. Farm. Bioq. 18 (2): 164-176, 1987.


MORAES, E.C.F.; SZNELWAR, R. B.; FERNICOLA, N.A.G.G. Manual de Toxicologia Analítica. São Paulo: Roca, 1991. p. 130-131.

OLSON, K. (Ed.). Poisoning & drugs overdose. East Norwalk : Appleton e Lange, 1994. p. 61-63.

OMS/IPCS. Monographs: analytical and toxicological data. Basic Analytical Toxicology. Geneva: WHO, 1995. p. 59-236.

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DETERMINAÇÃO DE SALICILATOS EM ESPECTROFOTÔMETRO UV-VIS (MÉTODO DE KAYE)

1. Princípio do Método:

Os salicilatos são hidrolisados com ácido nítrico formando ácido salicílico. Este último, por possuir uma hidroxila aromática, interage com nitrato férrico produzindo um composto colorido que é medido em espectrofotômetro a 540 nm.

2. Amostra:

Soro. Coletar a partir da 6a hora da ingestão e registrar o horário da coleta.

3. Reagentes:

1. Solução padrão de salicilato – 250 ug/mL: 25 mg de ácido salicílico em q.s.p. de metanol e completar o volume para 100 mL com água destilada em balão volumétrico .

2. Solução de ácido nítrico 0,07 N: diluir 4,7 mL de ácido nítrico concentrado (d=1,42 g/ml e T=70,5%) em 1000 mL de água destilada.

3. Solução de nitrato férrico a 1% em ácido nítrico 0,07 N: diluir 0,47 mL de ácido nítrico concentrado em 100 mL de água destilada. Em seguida, adicionar 1 g de de nitrato férrico.

4. Procedimento:

- Colocar em dois tubos de ensaio marcado “A” (Amostra) e “BA” (Branco da Amostra) alíquotas de 0,2 mL de amostra.

- Em outros dois tubos marcados “P” (Padrão) e “BP” (Branco do Padrão) colocar alíquotas de 0,2 mL da solução padrão de salicilatos.

- Adicionar 0,8 mL de água destilada em todos os tubos.

- Adicionar 1 mL da solução de nitrato férrico aos tubos “A” e “P”. Nos tubos “BA” e “BP” adicionar 1 mL da solução de ácido nítrico 0,07 N.

- Homogeneizar e aguardar 5 minutos.

- Efetuar as leituras das absorbâncias em 540 nm usando o branco correspondente.

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5. Fluxograma analítico:

COLOCAR FLUXOGRAMA !!

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6. Cálculo:

Conc. Salic. Amostra (mg%) = Absorbância Amostra x 25

Absorbância Padrão

7. Interpretação do resultado:

A interpretação do resultado das análises para determinação de Salicilatos é feita através do NOMOGRAMA DE DONE.

Para tanto se deve fazer a coleta da amostra de sangue a partir de 6 horas após a ingesta do fármaco, onde se tem o pico de absorção.

O Nomograma de Done (Figura 2) permite uma avaliação do prognóstico do paciente através da correlação da concentração plasmática de salicilato e, o tempo de ingesta.

Figura 2: Nomograma de Done

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8. Bibliografia:

KAYE, S. Handbook of Emergency Toxicology, 3 ed. Illinois : Charles C. Thomas. 1963, p. 116-117. MORAES, R. L. F. Determinação da salicemia em crianças portadoras de artrite reumatóide juvenil por colorimetria e espectrofluorimetria. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Universidade de São Paulo. S.P. Dissertação de Mestrado, 1986.

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TOXICOLOGIA SOCIAL

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IDENTIFICAÇÃO DE AGENTES TÓXICOS Os testes rápidos de coloração e/ou precipitação para identificação de agentes tóxicos têm seu valor como triagem. A partir dos resultados obtidos com tais testes, podemos direcionar um pouco mais o trabalho analítico. Para que seja possível a comparação de coloração, são utilizados nestes testes controles positivo (amostra que contém o agente tóxico) e negativo (amostra que não contém o agente tóxico), podendo-se então comparar a coloração obtida com a amostra suspeita.

1. Efedrina

1.1 Teste colorimétrico

Colocar uma pequena porção do material em tubo de ensaio; adicionar 0,1 mL de sulfato de cobre 12,5% e 1 mL de hidróxido de sódio 45%. Há o aparecimento de coloração violeta. Junte 1 mL de éter etílico e agite. A camada etérea deve tornar-se violácea, indicando presença de efedrina na amostra. Reagentes:

Sulfato de cobre 12,5%: pesar 2,5 g de sulfato de cobre e elevar o volume para 20 mL com água destilada. Hidróxido de sódio 45%: pesar 45 g de hidróxido de sódio e elevar o volume para 100 mL com água destilada em balão volumétrico.

1.2 Espectrofotometria Equipamento: espectrofotômetro de varredura (190 nm – 1100 nm). Diluir a amostra suspeita (pó / drágea) em ácido sulfúrico 0,5 N, por se tratar de um agente tóxico com características básicas. Para obtenção da linha base, realizar a leitura somente com o veículo da diluição. Em seguida efetuar a leitura em espectrofotômetro de varredura no intervalo de comprimentos de onda de 200 a 400 nm.

Interpretação do resultado: a efedrina apresenta picos de absorbâncias em 251 nm, 257 nm e 263 nm.

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Figura 1: Picos de absorbâncias da efedrina

Reagentes: H2SO4 0,5 N: diluir 1,5 mL de ácido sulfúrico concentrado em água destilada e elevar-se o volume para 100 mL em balão volumétrico.

2. Aminas secundárias (metanfetamina):


Colocar uma gota de cada solução do reativo de Feigel-angel sobre o material suspeito. Há o aparecimento de coloração violeta intensa.

Reagentes:

Reativo de Feigel-angel

Solução de nitroprussiato de sódio 1%: pesar 0,2 g de nitroprussiato de sódio e elevar o volume para 20 mL com água destilada.

Solução de acetaldeído 50%: pesar 50 g de acetaldeído e elevar o volume para 100 mL com água destilada em balão volumétrico.

Solução de carbonato de sódio 15%: pesar 3 g de carbonato de sódio e elevar o volume para 20 mL com água destilada.

3. Benzidamina


Adicionar, em uma placa escavada de porcelana, uma gota do reativo de Mandelin à amostra suspeita (pó / drágea) e uma gota do reativo como branco da reação. Observar o desenvolvimento de coloração marron-esverdeada que indica a presença de cloridrato de benzidamina.

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Reagentes:

Reativo de Mandelin: dissolver 1,0 g de vanadato de amônia em 1,5 mL de água destilada e completar para 100 mL com ácido sulfúrico concentrado.

4. Bibliografia:

DECKER, W.J. Spot Tests for rapid diagnosis of poisoning. Clin. Toxic., 4: 89-97, 1971.


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TESTE RÁPIDO PARA TRIAGEM DE DROGAS DE ABUSO - IMUNOCROMATOPLACAS 1. Fundamento analítico:

Estes testes fornecem somente um resultado preliminar. Um método de teste

alternativo deve ser usado a fim de obter um resultado analítico mais específico. A cromatografia gasosa com espectrometria de massa (CG/MS) é o método confirmatório preferido. Outros métodos químicos de confirmação estão disponíveis. A consideração clínica e o julgamento do profissional devem ser aplicados a qualquer resultado de teste de abuso de drogas, particularmente quando os resultados preliminares positivos são observados. Este teste é um imunoensaio de ligação competitiva onde a droga ou os metabólitos da droga em uma amostra de urina competem com os compostos da droga quimicamente marcados por um anticorpo restrito nos sítios de ligação. Ao utilizar anticorpos que são específicos para as diferentes classes de drogas, o ensaio permite a detecção independente e simultânea de seis drogas em uma única amostra. O tempo aproximado é de 10 minutos. No procedimento de ensaio, a urina se mistura com o conjugado de cor-anticorpo marcado e migra pela membrana. Se a concentração de uma certa droga for inferior ao limite de detecção do teste, o anticorpo marcado-conjugado de cor se liga ao antígeno conjugado imobilizado na membrana, desenvolvendo uma faixa de cor lilás na área teste (identificada de ”C” e “T”) para aquela droga. Inversamente, se o nível da droga for igual ou superior ao limite de detecção, o anticorpo-conjugado de cor se liga a droga livre, formando um complexo antígeno-anticorpo-corante. Este complexo compete com o antígeno conjugado sobre a membrana, impedindo o desenvolvimento da faixa de cor lilás. Independente dos níveis da droga em uma amostra ocorre o aparecimento da faixa lilás em cada área controle (marcadas com “C”) devido a uma reação imunoquímica paralela. Estas faixas servem como um controle de qualidade interno e demonstram o reconhecimento do anticorpo, indicando que os reagentes estão quimicamente ativos e que o teste foi realizado de forma correta. 2. Substâncias: Benzodiazepínicos, cocaína, anfetaminas, metanfetamina, tetrahidrocanabinol, opióides. 3. Limites de detecção: As concentrações de interrupções (cut-off) para cada classe de drogas no painel de drogas de abuso são:

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THC Tetrahidrocanabinol 50 ng/mL* OPI Opióides 300 ng/mL COC Cocaína 300 ng/mL* AMP Anfetaminas 1000 ng/mL* BZD Benzodiazepínicos 300 ng/mL MET Metanfetamina 500 ng/mL *Concentração de interrupção (cut-off) de triagem recomendada pela Substance Abuse and Mental Health Services Administration. 4. Amostra:

A urina deve ser coletada em um recipiente limpo de vidro ou plástico. Ela pode ser refrigerada (2º-8ºC) por 2 dias ou congelada (-20ºC) por um longo período. A urina que for refrigerada deve alcançar a temperatura ambiente (15º-25ºC) antes de ser testada. As amostras que forem congeladas devem ser descongeladas e misturadas antes do teste. Caso haja amostras com grande quantidade de partículas, estas urinas devem ser clareadas por centrifugação ou deixadas em repouso para sedimentar antes de serem testadas. 5. Procedimento:

- Deixar as amostras dos pacientes e os componentes do kit atingirem a

temperatura ambiente. - Remover um dispositivo do teste do envelope laminado e identificar a

amostra. - Mergulhar a extremidade do dispositivo na amostra da urina até a tarja onde

se lê: INSERT THIS END por mais de 10 segundos. - Remover o dispositivo da amostra de urina e colocar em uma superfície

plana. Ler o resultado do teste entre 4 a 7 minutos após a adição da amostra.

7. Interpretação dos resultados: Importante: São necessárias duas faixas do controle para validar os resultados do teste. Se não aparecer a faixa de cor lilás em qualquer uma das áreas (C), descartar o dispositivo e testar a amostra novamente com um novo dispositivo. Positivo Ausência de uma faixa de cor lilás em qualquer das seis tiras (AMP, BZD, COC, MET, OPI, THC) indica um resultado positivo para a droga correspondente. Negativo A presença de uma faixa de cor lilás em qualquer tira indica que o nível da droga correspondente ou seu metabólito está abaixo do limite da sensibilidade.

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Inválido Se a linha na área Controle (C) não aparecer num intervalo de 5 minutos, repetir o ensaio com um novo dispositivo. 8. Controle de qualidade: Uma linha processual interna foi incorporada ao dispositivo do teste para ajudar a assegurar o desempenho e a confiabilidade ao Kit. Entretanto, o uso de controles externos é recomendado. Os controles positivos e negativos dentro de 25% da concentração cut-off devem produzir os resultados previstos. 9. Bibliografia: Multi-Drogas One Step Teste. Diadema: Inlab Diagnóstica – Alamar Tecno Científica Ltda. 2002. Bula de Kit.

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IDENTIFICAÇÃO DE CANABINÓIDES EM ERVA IN NATURA POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA – (CCD)

Os princípios ativos de plantas da espécie Cannabis sativa podem ser retirados da erva in natura através de extração com solvente orgânico. Após aplicação e eluição em cromatografia de camada delgada, esses agentes podem ser revelados pela adição de agentes cromogênicos. 1. Amostra: erva in natura 2. Extração de ∆∆∆∆9-THC (∆∆∆∆9-Tetra-HidroCanabinol)

- Colocar aproximadamente 100 mg da amostra em um gral de porcelana. Adicionar cerca de 20 mL de éter de petróleo e macerar com o pistilo, deixar em repouso por 10 min, pode-se deixar macerando por 12 a 24 horas;

- Após maceração, adicionar uma ponta de espátula de carvão ativado, filtrar com papel filtro, sob um béquer com fundo afunilado;

- Evaporar em temperatura ambiente. O béquer deve ser colocado a uma distância de aproximadamente 0,5 cm da porta da capela, estando esta semi-fechada e ligada (abertura deve ser 0,5cm mais alta do que a altura do béquer). A porta da capela ao lado deve estar totalmente fechada. Dessa forma, a evaporação acontece em 10 minutos. Pode haver formação de água de condensação na parede do béquer e posteriormente no fundo. Confirmar se é realmente água da seguinte maneira: transferir o líquido do fundo do béquer para um eppendorf com auxílio de uma micropipeta. Adicionar 5 gotas de éter de petróleo, se haver formação de 2 fases, confirma-se a presença de água de condensação. Pode-se desprezá-la do béquer e proceder somente com o extrato.

3. Aplicação: - Ressuspender com 5 gotas de éter de petróleo e aplicar em placa de sílica gel

60 com auxílio de um capilar. - Aplicar todo o volume em que foi feita a ressuspensão. Utilizando

microcapilares, transferir microgotas das amostras e do padrão para as placas cromatográficas ativadas a 110º C por 1 hora. 4. Eluição:

- Após a aplicação, colocar as placas em cubas de vidro pré-saturadas, contendo o sistema eluente Clorofórmio / Tolueno (2:1). Para as cubas pequenas, prepara-se aproximadamente 30mL de eluente;

- Colocar a placa na cuba de forma que o eluente não toque a linha de aplicação das amostras;

- Deixar eluindo até a linha do solvente chegar a 0,5cm do fim da placa; - Deixar secar naturalmente.

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5. Revelação:

A revelação deve ser realizada em três etapas:

1) Observar as cromatoplacas sob luz ultravioleta (UV) de ondas curtas (254 nm) e ondas longas (366 nm).

2) A seguir vaporizar com os agentes cromogênicos específicos. 3) Observar novamente as cromatoplacas sob luz ultravioleta (UV) de ondas curtas

(254 nm) e ondas longas (366 nm).

5.1. Agente cromogênico: Benzidina tetrazotada (B.T.A.)

5.2 Preparo do agente cromogênico: Benzidina tetrazotada

Solução A: Benzidina ................................................................................ 5,0 g HCl concentrado ................................................................ 14,0 mL H2O destilada q.s.p. ................................................................... 1 L Guardar em frasco escuro Solução B: Nitrito de sódio a 10 % Misturar volumes iguais das soluções A e B no momento de usar.

6. Bibliografia: MOFFAT, A. C. (ed). Clarke's isolation and identification of drugs. London: Pharmaceutical Press, 2004.

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IDENTIFICAÇÃO DE CANABINÓIDES EM URINA POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DE ALTA EFICIÊNCIA – (CCDAE / HPTLC)

A CCDAE é uma técnica mais rápida, eficiente e sensível que a CCD convencional, podendo ser dito que se trata de um aperfeiçoamento da mesma. A tabela I, apresenta uma comparação entre CCD e CCDAE.

Tabela I – Comparação entre cromatografia em camada delgada e cromatografia em camada delgada de alta eficiência.

Parâmetro CCD CCDAE Tamanho usual da placa 20 x 20 cm 10 x 10 cm Volume aplicado de cada amostra

1 – 5 µL 0,1 – 0,2 µL

Número de amostras por placa

7 - 10 10 - 20

Diâmetro da mancha 3 – 6 mm 1 mm Tempo de corrida 30 – 200 min 3 – 20 min Limites de detecção por absorção de luz por fluorescência

~ 5 ng ~ 0,5 ng

1. Amostra:

A urina deve ser coletada em um recipiente limpo de vidro ou plástico. Ela pode

ser refrigerada (2-8ºC) por 2 dias ou congelada (-20ºC) por um longo período. A urina que for refrigerada deve alcançar a temperatura ambiente (15-25ºC) antes de ser testada. As amostras que forem congeladas devem ser descongeladas e misturadas antes do teste. Caso haja amostras com grande quantidade de partículas, estas urinas devem ser clareadas por centrifugação ou deixadas em repouso para sedimentar antes de serem testadas.

2. Extração:

- Colocar aproximadamente 5mL da amostra em um tubo Falcon de 15mL. Adicionar 0,5mL de NaOH 1N e homogeneizar por inversão;

- Colocar o tubo no banho-maria a (50 a 60°C) durante 15 min para hidrólise; - Resfriar a temperatura ambiente, jamais utilizar água para isso; - Acidificar com 1 mL de HCl 1N para conferir ao meio um pH entre 2-3; - Adicionar 5mL de n-hexano e colocar no agitador horizontal em baixa rotação

por 25min. Não colocar em vórtex, pois a formação de espuma é prejudicial; - Centrifugar por 5 min a 2000rpm; - Retirar a fase orgânica (superior) com auxílio de uma pipeta Pasteur. - Evaporar em temperatura ambiente. O béquer deve ser colocado a uma

distância de aproximadamente 0,5cm da porta da capela, estando esta semi-fechada e ligada (abertura deve ser 0,5cm mais alta do que a altura do béquer). A porta da capela ao lado deve estar totalmente fechada. Dessa forma, a evaporação acontece em aproximadamente 20 minutos. Pode haver formação de água de condensação

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na parede do béquer e posteriormente no fundo. Confirmar se é realmente água da seguinte maneira: transferir o líquido do fundo do béquer para um eppendorf com auxílio de uma micropipeta. Adicionar 5 gotas de n-hexano, se haver formação de 2 fases, confirma-se a presença de água de condensação. Pode-se desprezá-la do béquer e proceder somente com o precipitado.

2.1 Preparo dos reagentes: - NaOH 1N: pesar 4 g de NaOH e dissolver em 100 mL de água destilada. - HCl 1N: em proveta de 100 mL com tampa, colocar 80 mL de água destilada, adicionar 8,3 mL de HCl concentrado e completar o volume com água. 3. Aplicação:

- Ressuspender com 5 gotas de clorofórmio:metanol (3:1) e aplicar todo o volume em placa cromatográfica de silicagel 60, 10 x 10 cm, para HPTLC (CCDAE) de cromatografia de alta eficiência com auxílio de um capilar;

- Aplicar todo o volume em que foi feita a ressuspensão; - Usar padrão de maconha com éter de petróleo.

4. Eluição:

Após a aplicação, colocar as placas em cubas de vidro pré-saturadas, contendo o sistema eluente n-heptano / n-butanol / ácido acético ( 18:1,8:0,2 mL); Para as cubas pequenas, prepara-se aproximadamente 20mL de eluente; Colocar a placa na cuba de forma que o eluente não toque a linha de aplicação das amostras; Deixar eluindo até a linha do solvente chegar a 0,5cm do fim da placa;

Deixar secar naturalmente. 5. Revelação:

A revelação deve ser realizada em três etapas:

1) Observar as cromatoplacas sob luz ultravioleta (UV) de ondas curtas (254 nm) e

ondas longas (366 nm). 2) A seguir vaporizar com os agentes cromogênicos específicos. 3) Observar novamente as cromatoplacas sob luz ultravioleta (UV) de ondas curtas

(254 nm) e ondas longas (366 nm).

5.1. Agente cromogênico: Fast Blue Seqüência de revelação

a. Nebulizar a placa com dietilamina; b. Secar a temperatura ambiente; c. Nebulizar com solução de Fast Blue BB 0,1 % (preparar na hora); d. Aguardar 10 minutos e observar a placa;

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5.2 Preparo do agente cromogênico:

Fast Blue 0,1 % : dissolver 0,01 g de Fast Blue em 1 mL de metanol e adicionar 9 mL de água. 6. Bibliografia: REINHARDT, V. E.; MÍDIO, A F. Revisão dos métodos analíticos para a detecção de canabinóides em material biológico. Rev. Bras. Tox. 8 (2): 29-40, 1995.

SPINELLI, E.; SILVA, O. A. Identificação de usuários de cannabis por cromatografia em camada delgada de alta eficiência. Rev. Bras. Tox. 8 (2), 21-28, 1995.

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IDENTIFICAÇÃO DE COCAÍNA EM AMOSTRAS DE PRODUTO 1. Amostra: Pó suspeito

2. Reação colorimétrica:

Os testes rápidos de coloração e/ou precipitação para identificação de agentes tóxicos têm seu valor como triagem. A partir dos resultados obtidos com tais testes, podemos direcionar um pouco mais o trabalho analítico. Para que seja possível a comparação de coloração, são utilizados nestes testes controles positivo (amostra que contém o agente tóxico) e negativo (amostra que não contém o agente tóxico), podendo-se então comparar a coloração obtida com a amostra suspeita.

Seqüência para identificação

a) Reativo de Tiocianato de cobalto

Colocar uma pequena quantidade (ponta de uma pequena espátula) do pó suspeito em um eppendorf, ou placa escavada. Adicionar 2 gotas de tiocianato de cobalto glicerinado. Coloração azul indica indícios sugestivos da possível presença de cocaína. b) Reação de Scott Acrescentar 2 gotas de HCl 6N no eppendorf ou placa escavada que foram utilizados para a reação do tiocianato. Homogeneizar bem até ficar na cor rosa clara. Adicionar algumas gotas de clorofórmio P.A. Coloração azul indica indícios sugestivos da possível presença de cocaína.

OBS: É importante utilizar sempre as mesmas quantidades de tiocianato de cobalto glicerinado 2% e ácido clorídrico 6N.

Reagentes:

Reativo de Tiocianato de Cobalto: pesar 1 g de cloreto de cobalto, mais 1,5 g de tiocianato de sódio ou potássio e misturar em 90 mL de água destilada. Adicionar glicerina na mesma proporção do reativo.

Reativo de Scott:

HCl 6N: mistura-se mesmo volume de ácido clorídrico concentrado com água destilada. 3. Reação microquímica:

Em um béquer colocar uma pequena amostra de cocaína e adicionar 0,5 mL de HCl 0,1 N. Concentrar em lâmina de microscópio umas gotas dessa mistura mais algumas

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gotas de ácido cloroplatínico a 5%. Visualiza-se ao microscópio cristais em forma de folhas de palmeira. Reagentes: HCl 0,1N : diluem-se 1,7 mL de ácido clorídrico concentrado em até 20 mL de água destilada. Ácido cloroplatínico 5%: pesar 5 g de ácido cloroplatínico e dissolver em quantidade de água destilada suficiente para completar 100 mL de solução. 4. Cromatografia em camada delgada:

4.1 Solubilização: Colocar uma pequena amostra do pó suspeito em um béquer e adicionar 1mL etanol. Misturar e em seguida aplicar em placa de cromatografia recoberta com sílica gel.

4.2 – Aplicação:

Utilizando microcapilares, transferir microgotas das amostras e do padrão para as placas cromatográficas ativadas a 110º C por 1 hora.

4.3 – Eluição:

Após a aplicação, colocar as placas em cubas de vidro pré-saturada, contendo o sistema eluente metanol-amônia (100: 1,5). Deixar correr por 12 cm, retirar as cromatoplacas e secar em temperatura ambiente até a evaporação total do eluente.

4.4 – Revelação:

Vaporizar as cromatoplacas com um dos agentes cromogênicos:

- Reativo de Draggendorff - Reativo Cloroplatínico Acidificado 4.5 - Preparação dos agentes cromogênicos

4.5.1 Reativo de Draggendorff:

Solução A: 2,0 g de subnitrato de bismuto

25 mL de ácido acético


Solução B: 40 g de Iodeto de potássio


Solução de uso: 10 mL de A + 10 mL de B + 20 mL de ácido acético + 100 mL de água destilada.

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4.5.2 Reativo cloroplatínico acidificado

Solução ácido cloroplatínico a 10% ............................................. ...........................3,0 mL Água destilada ......................................................................................................... 97 mL Solução de iodeto de potássio a 6% ..................................................................... 100 mL Para cada 100 mL de solução adicionar 2 mL de ácido clorídrico concentrado. 5. Bibliografia: CALABRESE, A.J.; ASTOLFI, E.A. Toxicologia. Buenos Aires : Kapelsuz, 1972. MOFFAT, A. C. (ed). Clarke's isolation and identification of drugs. London: Pharmaceutical Press, 2004. VIEIRA, R.V. Identificação de fármacos em urina por cromatografia em camada delgada: Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Universidade de São Paulo. S.P. Dissertação de Mestrado, 1979.

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TOXICOLOGIA OCUPACIONAL

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TESTES COLORIMÉTRICOS RÁPIDOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE AGENTES TÓXICOS Os testes rápidos de coloração e/ou precipitação para identificação de agentes tóxicos têm seu valor como triagem. A partir dos resultados obtidos com tais testes, podemos direcionar um pouco mais o trabalho analítico. Para que seja possível a comparação de coloração, são utilizados nestes testes controles positivo (amostra que contém o agente tóxico), e negativo (amostra que não contém o agente tóxico), podendo-se então comparar a coloração obtida com a amostra suspeita.

1. Paraquat e Diquat

A urina ou lavado/conteúdo gástrico podem ser testados quanto a presença de paraquat usando o método baseado na redução do cátion paraquat a um radical iônico azul, na presença de um álcali e ditionito de sódio.

A 1mL de urina (lavado/conteúdo gástrico) adicionar 20 mg de bicarbonato de sódio (equivalente à ponta de espátula) e 20 mg de ditionito de sódio. Misturar. Aguardar a efervescência desaparecer. Fazer leitura em fundo branco. 2. Bibliografia: ZENECA AGRÍCOLA. O tratamento por intoxicação por paraquat. São Paulo: Zeneca Agrícola. 1998.

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IDENTIFICAÇÃO DE AGROTÓXICOS POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)

Os agentes inibidores da enzima acetilcolinesterase podem ser retirados da urina ou lavado gástrico através de extração ácida com solvente orgânico. Após aplicação e eluição em cromatografia de camada delgada, esses agentes podem ser revelados pela adição de agentes cromogênicos.

1. Amostra:

Urina ou lavado gástrico, devidamente coletados, com data e hora da coleta, mantida sob congelamento ou refrigeração no caso da impossibilidade da análise imediata.

2. Extração:

- Colocar 10 mL da amostra em um tubo Falcon de 50 mL e medir o pH. Acertá-lo com H2SO4 – 0,5 N para conferir ao meio um pH 4,0;

- Adicionar 10 mL de diclorometano, agitando primeiramente por 1 minuto no vórtex e depois por 30 minutos no agitador horizontal, realizando assim a extração ácida;

- Centrifugar por 10 minutos na velocidade de 3000 rpm (não ultrapassar jamais);

- Retirar a fase inorgânica (superior) através de aspiração com bomba de vácuo ou pipeta Pasteur. Se houver formação de camada de emulsão, não aspirá-la;

- Filtrar os extratos sobre sulfato de sódio (Na2SO4) anidro, reunindo esses extratos em um béquer com fundo afunilado;

- Evaporar em temperatura ambiente. O béquer deve ser colocado a uma distância de aproximadamente 0,5cm da porta da capela, estando esta semi-fechada e ligada (abertura deve ser 0,5cm mais alta do que a altura do béquer). A porta da capela ao lado deve estar totalmente fechada. Dessa forma, a evaporação acontece em 10 minutos. Pode haver formação de água de condensação na parede do béquer e posteriormente no fundo. Confirmar se é realmente água da seguinte maneira: transferir o líquido do fundo do béquer para um eppendorf com auxílio de uma micropipeta. Adicionar 2 gotas de diclorometano, se haver formação de 2 fases, confirma-se a presença de água de condensação. Pode-se desprezá-la do béquer e proceder somente com o precipitado.

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3. Fluxograma para extração de agrotóxicos:

4. Aplicação:

- Ressuspender com 5 gotas de diclorometano e aplicar em placa de sílica gel 60 com auxílio de um capilar. Aplicar todo o volume em que foi feita a ressuspensão. Aplicar microgotas de padrão de organofosforado e carbamato.

5. Eluição:

- Após a aplicação, colocar as placas em cubas de vidro pré-saturada, com sistema clorofórmio / acetona (9:1). Para as cubas pequenas, prepara-se aproximadamente 30mL de eluente (27 mL de clorofórmio : 3mL de acetona). - Colocar a placa na cuba de forma que o eluente não toque a linha de aplicação das amostras. Deixar eluindo até a linha do solvente chegar a 0,5cm do fim da placa. Deixar secar naturalmente.

Amostra (10mL) urina, lavado gástrico, etc

Fase orgânica

Acidificar (pH 4-5 com H2SO4 10%)

Extrair com 10mL de diclorometano

Extrato orgânico

Resíduo (Rácido) CCD

Evaporar

Filtrar sobre

Na2SO4 anidro

Fase aquosa (descartar)

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6. Revelação:

Vaporizar as cromatoplacas conforme a sequência de revelação descrita a seguir:

- Organofosforados: Tampar a região da placa destinada a revelação de carbamatos com uma placa de vidro. Borrifar a placa com cloreto de paládio a 0,5%.

- Carbamatos: Tampar a região da placa usada para a revelação de organofosforados. Misturar volumes iguais das soluções A e B (2mL de cada) e borrifar a placa. Deixar secar em estufa 80°C de 5 a 10 minutos. Misturar volumes iguais da solução C com etanol absoluto (2mL de cada) e borrifar na placa.

6.1 Preparação dos reagentes para revelação:

- Cloreto de paládio a 0,5%: o cloreto de paládio não dissolve diretamente em água. Deve-se primeiro dissolver 0,5g em algumas gotas de HCl 20% após, completar o volume para 100mL com água destilada.

- Solução A: solução de p-nitroanilina a 1% em HCL 2N. Pesar 1g de p-nitroanilina e dissolver em 100mL de ácido clorídrico 2N. Conservar em geladeira;

- Solução B: solução de nitrito de sódio 3%. Pesar 3g de nitrito de sódio e dissolver em 10mL de água destilada. Estabilidade de 1 mês em geladeira;

- Solução C: solução de hidróxido de sódio 80%. Pesar 80g de hidróxido e sódio e dissolver em 100mL de água destilada.

7. Bibliografia:

UNIVERSIDADE NACIONAL DE LA PLATA . Disponível em: http://www.biol.unlp.edu.ar/toxicologia/seminarios/parte_2/bibliografia_sem_2.html. Acesso em: 30/08/2006.

http://www.biol.unlp.edu.ar/toxicologia/seminarios/parte_2/bibliografia_sem_2.html

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DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA COLINESTERASE PLASMÁTICA

1. Princípio do método:

A colinesterase catalisa a hidrólise do iodeto de butiriltiocolina com formação de tiocolina que em uma reação secundária com o ácido 5,5-ditio bis-2-nitrobenzóico (DTNB), forma o 5-mercaptano-2-nitrobenzóico de coloração amarela (Figura 4). A intensidade da cor é diretamente proporcional a atividade da colinesterase, a qual pode ser determinada em espectrofotômetro na região do visível a 405 nm.

Figura 4: Reação de catálise da colinesterase

2. Amostra:

Soro ou plasma – 0,5 mL. O plasma pode ser utilizado desde que colhido com heparina ou EDTA. Os anticoagulantes a base de citrato, fluoreto ou oxalato produzem inibição enzimática leve e por isso não devem ser utilizados.

Estabilidade: a amostra deve ser preferencialmente fresca. Pode ser conservada até 07 dias sob refrigeração, sem conservantes. Se necessário transportar a amostra recomenda-se o congelamento e analisar a amostra imediatamente após o degelo.

3. Equipamento:

- Espectrofotômetro UV-Vis.

4. Reagentes:

• Solução de tampão fosfato pH 7,7 – 50 mmol/L – Diluente 100 mL

Estável até data indicada no frasco, quando estocado a temperaturas entre 2 e 8°C.

• Substrato 30x3 mL (Reagente de cor):

- Iodeto de butiriltiocolina – 7 mmol/L;

- Ácido 5,5’– ditiobis – 2 – nitrobenzóico – 0,25 mmol/L.

Estável até a data indicada no frasco, quando estocado a temperaturas entre 2 e 8°C.

Iodeto de 5-butiriltiocolina + H2O Iodeto de tiocolina + Butirato

Iodeto de Tiocolina + Ácido 5,5-ditio bis-2-nitrobenzóico

5-Mercaptano-2-nitrobenzóico + 2-Nitrobenzóico-5-mercaptanotiocolina

colinesterase

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• Cloreto de sódio a 0,9% (que não acompanha o Kit)

5. Preparo das soluções:

Solução de Reação: adicionar 3 mL de tampão fosfato em um frasco de substrato. Tampar e agitar suavemente, por inversão, até dissolução completa. Reconstituir somente no momento do uso. Estável por 1 hora quando mantido a temperaturas entre 15 e 25°C.

6. Método:

• Zerar o espectrofotômetro com ar.

• Transferir 3,0 mL da solução de reação para a cubeta de leitura (faces paralelas devido volume) e adicionar 20 µL do soro (amostra). Misturar imediatamente e ler a absorbância, disparando simultaneamente o cronômetro. Voltar a ler depois de 30, 60, 90 e 120 segundos.

• Determinar a diferença média da absorbância a cada 30 segundos (∆∆∆∆A/30 seg) subtraindo cada leitura da anterior e fazendo a média dos valores. Utilizar a média para os cálculos.

OBS: a 37°C utilizar amostra diluída 1:2 com solução de cloreto de sódio a 0,9% e continuar o procedimento conforme descrito acima. Multiplicar o resultado obtido por 2.

7. Parâmetros:

- Temperatura dos reagentes: 25, 30 ou 37°C;

- Comprimento de onda: 405 nm;

- Fenda: 1 cm;

- Temperatura de leitura (ambiente e reagentes): 25, 30 ou 37°C.

OBS: Os valores de referência devem ser interpretados em função da temperatura de reação.

8. Cálculo:

Atividade da enzima (U/L) = ∆∆∆∆A/30seg x 22.710

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9. Valores de referência:

25°°°°C 30°°°°C 37°°°°C

3200 – 9000 U/L 3962 – 11142 U/L 4970 – 13977 U/L

10. Índice Biológico Máximo Permitido (IBMP)

Depressão da atividade da colinesterase plasmática em 50%, em relação à medida realizada pré-ocupacionalmente, indica exposição excessiva, devendo o trabalhador ser afastado da exposição. Com a finalidade de realização de monitorização biológica, o horário da coleta não é crítica, desde que realizada a avaliação pré-ocupacional.

11. Bibliografia:

BRASIL, Secretaria de Segurança e Saúde no Trabalho. Portaria n. 24 de 29 de dezembro de 1994, Brasília. Seção 1, p. 21278-21282 [ NR7 – Programa de Controle Médico de Saúde Ocupacional].

Colinesterasa. Francisco A. Zaccara. Rosário: Wiener Laboratórios S.A.I.C. 2000. Bula de kit.

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DETERMINAÇÃO DE METEMOGLOBINA

1. Princípio do teste:

O princípio considera a determinação de metemoglobina presente na amostra em relação à hemoglobina total. A quantidade de metemoglobina na amostra é medida no comprimento de onda de 632 nm (D1). Após a adição de ferricianeto de potássio ocorre a oxidação do Fe+2 da hemoglobina a Fe+3 (com conseqüente formação de metemoglobina), o que possibilita a leitura da hemoglobina total convertida, no comprimento de onda de 632 nm (D3). O íon cianeto é utilizado para produção de cianometahemoglobina (D2 e D4), complexo não mensurável no comprimento de onda de 632 nm, sendo a leitura obtida considerada como a dos interferentes na amostra.

2. Amostra:

Sangue total, devidamente coletado com anticoagulante EDTA ou Heparina, com data e hora da coleta, mantida sob refrigeração no caso da impossibilidade da análise imediata. A determinação deve ser feita em no máximo 2 horas após a coleta. Amostras hemolisadas devem ser desprezadas.

3. Padrões, Controles, Reagentes e outros insumos:

- Tampão Fosfato pH 6,8 (Solução A: dissolver 2,8g de fosfato dissódico 7H2O em 100mL de água destilada e ajustar o pH em 6,8 com HCl ou NaOH diluídos. Solução B: dissolver 1,16g de fosfato monobásico de sódio anidro em 100mL de água destilada. Solução de uso: misturar 49,1mL da solução A com 50,9mL da solução B).

- Cianeto de potássio 5%: colocar 5g de cianeto de potássio em um balão volumétrico de 100mL e completar o volume com água destilada.

- Ferrocianeto de potássio 5%: colocar 5g de ferrocianeto de potássio em um balão volumétrico de 100mL e completar o volume com água destilada.

- Triton X – 100 1%: transferir 1mL de Triton X –100 para um balão volumétrico de 100mL e completar o volume com água destilada.

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4. Procedimento detalhado:

- Pipetar 0,2 mL de sangue em um tubo de Falcon de 15mL contendo 4,0mL de tampão fosfato e 6,0mL de solução detergente Triton X-100 1%. O lisado tamponado pode ser guardado por 24h a 4ºC sem alteração significante;

- Pipetar 3mL dessa solução em duas cubetas de espectrofotômetro (marcar como cubeta “A” e cubeta “B”);

- Ler a absorbância da cubeta “A” em 632nm (D1); - Adicionar 30µL da solução de KCN 5% a cubeta ”A”, homogeneizar e medir

novamente a absorbância em 632nm (D2); - A cubeta “B”, adicionar 30µL de K3FeCN6, esperar 5 minutos, e medir a

absorbância a 632nm (D3); - Adicionar 30µL de KCN a cubeta “B”, homogeneizar e ler novamente no

mesmo comprimento de onda (D4).

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5. Fluxograma analítico

Leitura em λ = 632 nm D3

30 µL de K3FeCN6, esperar 5 min, homogeneizar

30 µL de KCN 5% repouso de 1 min


Amostra (em duplicata)

0,2 mL de sangue + 4,0 mL de tampão fosfato

+ 6,0 mL de solução Triton 1% Colocar 3 mL dessa solução em

cada cubeta

CUBETA A CUBETA B

30 µL de KCN 5% repouso de 1 min



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6. Cálculos: % Metemoglobina = (D1 – D2 / D3 – D4) x 100

7. Controle da qualidade:

Amostras controle para determinação de metemoglobina não podem ser encontradas comercialmente. Pode-se determinar, em paralelo, a concentração de metemoglobina de uma amostra de recente de doador saudável como controle normal.

8. Valores de referência: Valores menores ou iguais a 2% são tidos como normais.

OBS: Quando o comprimento de onda de D2 for maior do que D1 o resultado da determinação é menor que 2%.


Valores de metemoglobinemia superiores a 5%, indicam exposição excessiva, devendo o trabalhador ser afastado da exposição. Com a finalidade de realização de monitorização biológica, recomenda-se a coleta pré e pós jornada de trabalho.

10. Bibliografia:


HEGESH, E.; GRENER, N.; COHEN, S.; BOCHKOUSKY, R.; SHUVAL H.I. A sensitive kicromethod for the determination of methemoglobin in blood. Clin.Chim.Acta. 30: 679-682, 1970.

MORAES, E.C.F.; SZNELWAR, R. B.; FERNICOLA, N.A.G.G. Manual de Toxicologia Analítica. São Paulo: Roca, 1991.

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DETERMINAÇÃO DE CARBOXIEMOGLOBINA NO SANGUE 1. Princípio do método: O princípio do método compara os níveis de hemoglobina reduzida e carboxihemoglobina. A hemoglobina é reduzida utilizando ditionito de sódio para se obter um sistema bicomponente, composto por Hbred e COHb, determinado através das absorbâncias em 420nm e 432nm. As razões das absorbâncias nestes comprimentos de onda são particularmente sensíveis a quantidade de CoHb presente na amostra. A porcentagem de COHb é calculada correlacionando-se as absorbâncias das amostras com os coeficientes de absortividade molar da Hbred e da COHb nos comprimentos de onda apropriados. 2. Amostra: A amostra de sangue deve ser colhida no final da jornada de trabalho em vaccuntainer heparinizado e conservada a 4 °C por no máximo uma semana. Para os fumantes devem ser colhidas duas amostras, antes e após a jornada de trabalho.

3. Material:

- sol. tampão pH= 6,85: KH2PO4 /K2HPO2 0,1 M - sol. hemolisante: dilluir o tampão com água 1:10. Preparar semanalmente - sol. diluente: dissolver 25 mg de ditionito de sódio em 20 mL de sol. tampão.

Preparar antes do uso. 3. Técnica:

1. Em tubo de ensaio com tampa, colocar 0,1 mL de sangue e 12 mL de sol. hemolisante. Agitar, deixar em repouso por 10 minutos;

2. Diluir 0,2 mL do hemolizado com 2,3 mL de sol. diluente. Tampar; 3. Deixar a temperatura ambiente por 10 minutos. Ler as absorbâncias a 420 e

432 nm, usando como branco a sol. diluente.

5. Cálculo da % da carboxiemoglobina:

% COHb = 1 – (AR. F1) x 100 AR (F2 – F1) – F3 + 1 Sendo: AR = Abs. 420 Abs. 432

F1 = Abs Hb 432 = 1,3330 Abs Hb 420

F2 = Abs HbCO 432 = 0,4787 Abs Hb 420

F3 = Abs HbCO 420 = 1,9939 Abs Hb 420

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6. Valores de referência: Valores menores ou iguais a 1% para não fumantes são tidos como normais.


Valores de carboxihemoglobinemia superiores a 3,5% para indivíduos não fumantes indicam exposições excessivas, devendo o trabalhador ser afastado da exposição. Com a finalidade de realização de monitorização biológica, recomenda-se a coleta pré e pós jornada de trabalho. 8. Bibliografia: BEUTLER, E. & WEST, C. – Simplified determination of carboxihemoglobin. Clin. Chem., 30(6):871-4, 1984.


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72511582-Apostila-Pratica