CENTRO UNIVERSITÁRIO DE JARAGUÁ DO SUL – UNERJCENTRO DE TECNOLOGIA E ARTES

CURSO DE ENGENHARIA DE ALIMENTOSDISCIPLINA: MICROBIOLOGIA GERAL

ATIVIDADES PRÁTICAS

PROFª Silvia Helena Olitta Morato Figueiredo

Jaraguá do SulAbril/2005

CUIDADOS A SEREM TOMADOS NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

1- Não deixe seus pertences sobre os balcões onde os experimentos são realizados;

2- Desinfetar a bancada com álcool comercial, no início e término de cada aula prática;

3- Não fume, não coma no laboratório. Evite levar a boca qualquer objeto como lápis, canetas, etc;

4- Não use fracos do laboratório para tomar água;5- Comunique imediatamente ao professor, qualquer acidente como

derramamento de culturas sobre a bancada, ferimentos, aspirações de culturas, etc;

6- Coloque sempre os materiais contaminados (pipetas, alças, etc) nos recipientes indicados;

7- Siga as normas de uso de aparelhos. O microscópio deve ser manuseado cuidadosamente e após o seu uso deve ser desligado, o fio enrolado e colocado a capa;

8- Não esqueça de lavar as mãos com desinfetante no inicio e no término da aula.

Orientações para elaboração dos relatórios práticos

Seguir a metodologia científica para elaboração de relatórios, enfatizando:

1- Descrever o objetivo do exercício (o que se prentende comprovar);2- Descrever a metodologia utilizada;3- Descrever e discutir os resultados obtidos.

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MATERIAIS DE LABABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

1- Autoclave (calor úmido) - Seu funcionamento baseia-se no vapor d’água sob pressão, e é utilizada para esterilização de materiais usados em microbiologia, principalmente meios de cultura;

2- Forno de Pasteur (calor seco) – Usado para esterilizar materiais secos tais como tubos, placas, etc;

3- Estufa de incubação – Onde os microrganismos são mantidos durante o seu desenvolvimento em uma temperatura constante;

4- Microscópio – Para a observação dos microrganismos;5- Placa de Petri – Recipiente redondo de vidro com tampa rasa,

destinada ao cultivo de microrganismos em meio sólido;6- Tubo de cultura – Destinado ao cultivo de microrganismos em pequeno

volume de meio (líquido ou sólido);7- Pipeta graduada – Utilizada para diluição, inoculação, etc. Contém um

tampão de algodão em uma das extremidades;8- Espátula de Drigalsky – Bastonete de vidro com formato de triângulo é

usado para distribuir homogeneamente uma cultura líquida sobre o meio de cultura sólido contido na placa de Petri;

9- Cabo de Kolle – Cilindro em cuja extremidade há um fio de platina ou outra liga metálica (níquel-cromo) que pode ser reto (agulha) ou encurvado (alça). Serve para semear microrganismos em meio sólido ou líquido;

10-Lâminas – São retângulos de vidro claro e transparente, de espessura média e bordos polidos, que servem para o exame de microrganismos ao microscópio;

11-Lamínulas – Pequenos quadrados de vidro, muito finos e transparentes, destinados a cobrir a preparação contida na lâmina, nos ensaios “ a fresco”, evitando aberrações da imagem e refração dos raios luminosos;

12-Lâminas escavadas – Servem á chamada “ensaio em gota pendente”, em que o material é observado numa gota de líquido, e possuem uma ou duas depressões (10 a 12 mm de diâmetro);

13-Lâminas hematimétricas – Também denominadas lâminas de contagem, são escavadas e milimetradas e permitem contar o número de células em suspensão contidas num volume determinado de meio de cultura líquido;

14-Tubos de Durham – Tubos pequenos, cilíndricos, medindo 5X20mm mais ou menos, que são colocados invertidos no meio líquido contido num tubo de cultura; durante a esterilização, o tubo de Durham fica cheio do líquido; após a inoculação e fermentação o líquido é deslocado, total ou parcialmente, pelo gás formado em uma fermentação;

15-Frascos de Erlenmeyer – Servem para guardar quantidades maiores de meio de cultura e também para o desenvolvimento de microrganismos em meio líquido, com ou sem agitação e aeração;

16-Frascos conta-gotas- Servem para corantes, são de vidro na cor neutra ou escura;

17-Cubas para material usado – Destinam-se a conter o material contaminado;

18-Pinça para lâmina – Serve para fixar uma lâmina com material que vai sofrer coloração, podendo ser de metal ou madeira;

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19-Algodão – Serve de tampão de frascos e tubos contendo meio de cultura ou soluções esterilizadas, pois funciona como um filtro para microrganismos.

PREPARAÇÃO DOS MATERIAIS DE LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

É muito importante a assepsia dos materiais e do próprio laboratório, quando se trabalha com microrganismos, isto porque, qualquer matéria estranha pode ser uma fonte de contaminação.O chão do laboratório deve ser limpo todos os dias com pano molhado e desinfetante. Os balcões e todas as outras superfícies também devem ser desinfetadas.

Placas de Petri – se forem usadas devem ser autoclavadas (120°C, 20min), o meio de cultura escorrido ainda quente, lavadas com água e sabão e deixadas por algumas horas em solução detergente. Depois disso são passadas em água corrente, secas e preparadas para a esterilização. As tampas são revestidas com discos de papel de filtro e as placas são então embrulhadas ou colocadas em estojos apropriados para serem esterilizadas em estufa a 180°C por 90 minutos.

Tubos de cultura – se tiverem culturas desenvolvidas, devem ser inicialmente autoclavados como descrito acima. Após a lavagem,e antes da esterilização são tamponados com algodão. A esterilização é feita em estufa de Pasteur (180°C por 90minutos) ou em autoclave, quando já possuem meio de cultura em seu interior.

Pipetas – são lavadas com água corrente, deixadas em solução detergente e novamente passadas em água. Depois de secas, coloca-se uma mecha de algodão na boquilha e em seguida, são esterilizadas em estojos especiais ou embrulhadas em papel.

Lâminas e Lamínulas - uma vez retiradas do microscópio, são colocadas numa cuba contendo solução detergente. Lavadas, deixadas uma noite em solução sulfocrômica e lavadas novamente.

Solução sulfocrômicaBicromato de potássio comercial – 60g Ácido sulfúrico concentrado comercial - 460mlÁgua destilada -200mlPesar o bicromato de potássio e colocar em um balão, dissolver em água. Aquecer lentamente para dissolver bem. Colocar o balão num balde cheio de água fria e juntar lentamente pela parede do balão o ácido sulfúrico,agitando sempre para não precipitar ( deve-se ter cuidado para que não se rompa o balão). No caso de precipitação, juntar aos poucos água fria ou morna para ficar transparente (mais ou menos 400ml de água). Guardar em frasco apropriado e devidamente etiquetado.

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Alça de inoculação – devem ser flambadas antes e depois de qualquer operação de semeadura. É importante que se faça o resfriamento da alça antes de ser colhido o material.

Semeadura em tubo de cultura - devem ser flambados a boca do tubo de cultura após a retirada e antes da colocação do tampão de algodão. O tampão de algodão deve ser mantido pelo dedo mínimo da mão direita e nunca deve ser deixado sobre a mesa do laboratório.

As placas de Petri- devem ser manuseadas com cuidado e não poderão ficar abertas no ambiente, além do cuidado de manuseá-las sempre próximo da chama. Uma vez semeadas, devem ser incubadas em estufa, com a tampa voltada para baixo.

Flambar – Esterilizar a boca do tubo ou do material usado antes e depois de seu uso.

Referência

NEDER, R. N. Microbiologia – Manual de laboratório. São Paulo, Nobel. 1992. 138p.SOUNIS, E. Curso Prático de Microbiologia. Rio de Janeiro, Livraria Atheneu Editora. 2ed. 1989. 267p.NASCIMENTO, G. G. F. Apostila de aulas práticas de microbiologia. UNIMEP. Piracicaba- SP. 1999

AIRIMUV : AR E INFECCIOLOGIA

Durante muito tempo, a ideia que a vida possa emergir do mundo inerte manteve-se espalhada, dando corpo á teoria da « geração espontanea ». Foi sómente em 1862 que o cientista Louis Pasteur varreu esta teoria demonstrando que o desenvolvimento de organismos num meio préviamente esterilizado é únicamente devido a uma contaminação por microorganismos contidos no ar ambiente. Existem portanto microorganismos « flutuando » no ar que nos rodeia e que respiramos. Estes microorganismos serão capazes de se replicarem e de proliferarem desde que encontrem um meio favorável ao seu desenvolvimento. Pasteur demonstrou que estes micróbios podem ser destruidos e que o aquecimento a uma temperatura elevada permite igualmente interromper toda a proliferação destes microorganismos.

A flora encontrada no ambiente em geral não é patogénica. No entanto, certos microorganismos em suspensão no ar ambiente são potêncialmente agentes infecciosos e vão veícular as doenças por transmissão do tipo « aerotransportada ». De acordo com o seu tamanho e modo de reprodução, são classificados como vírus (organismos muito pequenos, necessitando de uma célula hospedeira para se multiplicarem) como bactérias (visíveis ao microscópio, multiplicando-se em meios inertes nutritivos) ou ainda em leveduras (organismos de tamanho superior, com um nivel muito importante de resistência no meio exterior). Existe uma fonte muito importante destes microorganismos: as mucosas nasais e orais em caso de infecção (« constipação », gripe, …) produzem em grande quantidade microorganismos. Os espirros e a emissão de perdigotos projectam gotículas aerotransportadas de secreções naso-faringeas ( gotículas de Flügge, com um tamanho á roda de 5 µm.) potêncialmente infectantes. A mão levantada á frente do nariz e da boca do sujeito que tosse ou espirra não faz mais que desviar a trajectória destas gotículas que se encontram em suspensão no ar ambiente e vão ser inaladas pelas pessoas na vizinhança imediata (os

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sujeitos atingidos são infectados por inalação do aerossol produzido pelas pessoas contaminadas ou infectadas a uma distância que pode ir até aos 2 m.).

Este modo de transmissão pode ser responsável por epidemias, mesmo pandemias (a uma mais larga escala) como a gripe ou a SARS (sindroma agudo respiratório severo) no sudeste da Ásia e trata-se então de um problema á escala da saúde publica. A crença actual é que a transmissão do vírus H5N1 (vírus responsável pela gripe aviária) que circula actualmente no mundo animal, não passa ao homem. Após certas transformações, este vírus poderia tornar-se transmissivel por via aérea, de humano a humano. Estas transformações (por « recombinação genética » entre vírus ou por « mutação genética ») são presentemente sempre hipotéticas e teóricas mas são um risco potêncial a levar em consideração, produzindo as medidas de prevenção executadas pelos poderes públicos.

Imagina-se sem dificuldade que o ar hospitalar não fuja a esta propagação de microorganismos. O ar ambiente pode ser a origem para o homem de infecções específicas, «infecções nosocomiais» contraidas especificamente no recinto hospitalar. Em certas zonas do hospital pode mesmo produzir-se uma concentração de germens potencialmente patogénicos e que por vezes adquirem um poder de resistência aos tratamentos anti-infecciosos. Sabe-se de facto a gravidade de uma infecção tal como a aspergilose devida a uma levedura (Aspergillus flavus ou niger a mais frequente) contraida através das vias respiratórias (por inalação) por pessoas hospitalizadas e desde já enfraquecidas por uma outra afecção que motivou a sua hospitalização. Por vezes certas bactérias estão em contacto com tecidos abertos (sem protecção da pele) durante intervenções cirúrgicas encontram ai um meio propício ao seu desenvolvimento. Estes riscos impôem ao meio hospitalar normas muito rígidas relativas á qualidade do ar, e também para a da água.

O estudo do ar exterior mostra que contém partículas inertes, as mais frequentes de natureza mineral ou orgânica. Calcula-se que a massa total destas partículas inertes não ultrapassará 1g/m3 (ou seja á roda de 100 a 300.000 partículas/mm3). A presença destas partículas inertes é variavel em função da poluição e dos fenómenos metereológicos. O exterior contém igualmente como vimos, partículas « vivas » podendo originar o nascimento de microorganismos tais como bactérias ou leveduras. Os microorganismos só vivem raramente em estado livre no ar. O seu transporte aéreo necessita frequentemente de um suporte, talvez uma poeira ou através da transmissão inter-humana  das gotículas de saliva (gotículas de Flügge).A concentração destas partículas « vivas » foi calculada em menos de 2000/mm3 no ar ambiente. Esta concentração varia igualmente em função da estação e das condições.

Em situação fechada (por exemplo num compartimento) o numero de partículas emitidas é muito mais importante na presença de vários individuos. Com efeito, uma pessoa em repouso (sentada num escritório) emite á volta de 100.000 partículas/mn, e uma pessoa em actividade emitirá de 5 milhões (deslocamento vivo) a 30 milhões de partículas (actividades desportivas em local fechado). Estas partículas serão de natureza diferente: partículas inertes (produzidas pelo compartimento ele próprio, detritos de têxteis ou diferentes materiais), microorganismos principalmente produzidos pela ou pelas pessoas presentes no local. Estes microorganismos têm um poder patogénico variável. Estes microorganismos têm também uma duração de vida muito heterogénea (de alguns minutos para um vírus a várias semanas para certos esporos). Para tomar o exemplo do hospital, a presença de partículas provocando a nascença de microorganismos é diferente em qualidade e em quantidade de um hospital para outro e, no seio de um mesmo hospital, de um quarto de doente para outro.

A relação entre ar e infecção não é sempre fácil de estabelecer porque a contaminação do ar não implica forçosamente uma infecção. Com efeito a infecção dependerá em parte da natureza do microorganismo (concentração do agente, virulencia e capacidade patogénica), dos modos de contaminação, por exemplo a porta de entrada cutânea durante uma intervenção cirúrgica e por outro lado a receptividade do hospedeiro, estado imunitário, lesão das barreiras naturais (por exemplo perda de substância no caso de um grande queimado).

Os agentes responsáveis pelas infecções transmissíveis por via aérea são: as micobactérias, as legionelas, certos vírus, vírus da varicela, da gripe, VRS (vírus respiratório sincitial, responsável pelas epidemias invernais de bronquiolite na criança jovem), vírus do sarampo e vírus da rubeola, CMV (cytomégalovírus) e certos cogumelos e parasitas (aspergillus e Pneumocystis carini). Ao por-se em causa estes microorganismos especificos implica com frequencia o isolamento dos pacientes contaminados para evitar a transmissão inter-humana. Algures, no meio hospitalar, em certas situações (bloco operatório, quarto de paciente enxertado imuno-deprimido) a qualidade do ar deve ser próxima do meio estéril. Os controlos particulares e microbiológicos do ar são praticados regularmente para dominar e prevenir a contaminação aerotransportada.

O ar torna-se um vector de partículas e de microorganismos, particularmente nos locais fechados e de ajuntamento humano. Estes elementos são potencialmente responsáveis por situações de risco

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patogénico e a vigilância e o dominio da qualidade do ar tornam-se cada vez mais importantes na nossa época de epidemias potencialmente identificadas (SRAS, gripe aviária, legionelose…), de grandes ajuntamentos de população (transmissão local em zonas de fortes concentrações humanas) e da migração rápida de pessoas através de meios de transporte modernos (difusão geográfica).

 

EXERCÍCIO N°1

PREPARAÇÃO DO MATERIAL DE LABORATÓRIOMaterial- Placas de Petri- Tubos de cultura- Pipetas- Papel de filtro, tesoura, pinça, papel de embrulho, fita crepe, caneta- AlgodãoMétodo

1- Cortar um disco de papel de filtro com o diâmetro um pouco maior que o da tampa da placa de Petri, colocar na parte interna da tampa. Fechar a placa e embrulhar, fechar com fita crepe e levar para ser esterilizada em forno de Pasteur por 180°C 90minutos.

2- Fazer um tampão de algodão que se ajuste firmemente ao tubo de cultura. Em seguida, enrolar o conjunto de tubos em papel de embrulho de modo a proteger o algodão e esterilizar em forno de Pasteur por 180°C 90minutos.

3- Introduzir com um pinça, uma mecha de algodão na boquilha da pipeta. Embrulhar individualmente, fechar com fita crepe, anotar o volume e esterilizar em forno de Pasteur por 180°C 90minutos.

RECORDANDO A TÉCNICA PARA PIPETAR SOLUÇÃOMaterial- Becker de 150ml- Solução de azul de metileno

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- Pipetas de 10ml; 5ml; 2ml; 1ml; 0,5ml.

Método1- Pipetar o volume integral de cada pipeta e transferir para o becker-

repetir a operação 3 vezes.2- Com a pipeta de 10 ml, pipetar 5ml; 2,5ml e 0,5ml, transferir para o

becker.3- Com a pipeta de 5ml, pipetar 4ml; 2ml e 0,1ml, transferir para o becker.4- Com a pipeta de 2ml, pipetar 1ml; 0,5ml e 0,1ml, transferir para o

becker.5- Com a pipeta de1ml, pipetar 0,5ml; 0,3ml e 0,1ml, transferir para o

becker.6- Com a pipeta de 0,5ml, pipetar 0,4ml, 0,2ml e 0,1ml, trnasferir para o

becker.

Questões1- Por que é colocado papel de filtro na tampa da placa de Petri?2- Por que se coloca algodão na boquilha da pipeta em microbiologia?3- Por que se deve ter tantos cuidados com a assepsia, quando se trabalha

com microrganismos?

EXERCÍCIO N°2

PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA

MEIOS DE CULTURA E CULTIVO DE MICRORGANISMOS

Para o cultivo e identificação de microrganismos, usam-se soluções e substâncias nutritivas denominadas meios de cultura, que devem atender às exigências nutricionais das espécies de microrganismos a ser cultivada.

Esses meios quanto às substâncias nutritivas podem ser:1- Meios sintéticos - quando os componentes são quimicamente

definidos;2- Meios complexos - quando se adiciona ao meio substâncias complexas por exemplo: extrato de carne, peptona, sangue, etc.

Em relação ao estado físico, os meios de cultura podem ser:1- Meios líquidos – também denominados de caldos;2- Meios sólidos – quando se adiciona ao caldo 1,5 a 2% de ágar.

Quanto à força seletiva e diferencial, podem ser:

1- Meios enriquecidos – quando se acrescentam substâncias como sangue, soro, etc; para microrganismos com exigências nutritivas mais complexas;

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2- Meios seletivos – quando são adicionados ao meio de cultura substâncias que impedem o crescimento de certos microrganismos e possibilita o crescimento de outros. Ex: meio de SS, meio de Mac Conkey, etc

3- Meios Diferenciais – quando contém substâncias que indicam certas características bioquímicas dos microrganismos. Ex: o sangue adicionado ao meio indica se uma bactéria é hemolítica ou não.

4- Meios de enriquecimento – quando favorece o crescimento de determinados microrganismos. Ex. adição de selenito favorece o crescimento de Salmonella..

Referência.NEDER, R. N. Microbiologia – Manual de laboratório. São Paulo, Nobel. 1992. 138p.NASCIMENTO, G. G. F. Apostila de aulas práticas de microbiologia. UNIMEP. Piracicaba- SP. 1999

Material-Meio de Nutrient Broth (NB), Sabouraud Agar (AS), Nutriente Agar (NA)- Tubos de cultura;- Frascos de Erlenmeyer de 250ml;- Provetas de 100ml, 200ml, 500ml;- Balança, algodão, papel alumínio, espátula de para pesagem, água destilada, bastão de vidro.

Método

Grupos de 1, 3, 7 e 10 (preparar 200ml cada) - Pesar 4,6g de Nutrient Agar(NA), adicionar 200ml de água destilada, agitar e aquecer no microondas até dissolver. Tampar e esterilizar em autoclave a 121°C a 1atm de pressão por 20 minutos.

Grupos 2, 4, 8 e 11 (preparar 100ml cada)- Pesar 6,5g de Sabouraud Agar (AS), adicionar 100ml de água destilada, agitar e aquecer no microondas até dissolver. Tamponar e esterilizar em autoclave a 121°C a 1atm de pressão por 20 minutos.

Grupos 5, 6, 9 e 12 (preparar 100ml cada)- Pesar 0,8g de Nutrient Broth, adicionar 100ml de água destilada, dissolver a frio com bastão de vidro e com auxilio de uma pipeta distribuir 5ml em tubos de cultura. Tamponar e esterilizar em autoclave a 121°C a 1atm de pressão por 20minutos.

Questões

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1- Para que serve o meio de cultura?2- Qual a temperatura e tempos ideais para esterilização de meios de

cultura na autoclave? 3- Por que os meios de cultura não podem ser esterilizados dentro das

placas de Petri?4- Por que os meios de cultura não são esterilizados em forno de Pasteur?5- Para que serve o ágar na composição do meio de cultura?

EXERCÍCIO N°3

MICRORGANISMOS DO AR E AMBIENTE

Microrganismos encontram-se em praticamente todos os ambientes; ar, água e principalmente no solo, deste passam ao ar pelo vento sendo arrastados por partículas de poeira. Do ar passam para nossa superfície contaminando água e alimentos.As condições que favorecem a sobrevivência e o crescimento de muitos microrganismos (nutriente, umidade e temperatura adequada) são as mesmas sob as quais vivem as populações humanas, assim é inevitável que vivamos entre grande quantidade de germes.

Material - Placas de Petri contendo Nutriente Agar (NA) e Agar Sabouraud (AS) - Cotonete

Método

a) Presença de microrganismos no arRetirar a tampa de uma placa de Petri com NA e outra com AS e deixar abertas no ambiente determinado por 15 minutos. Fechar e incubar a placa de NA a 37°C por 24h e a AS na temperatura ambiente por 5 dias.

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b) Presença de microrganismo no laboratórioUtilizando placas de NA inocular da seguinte forma:Placa 1- passar o cotonete na superfície de qualquer objeto do laboratório e depois na superfície do meio de cultura. Tomar cuidado para não “ferir” o meio;Placa 2- tocar a superfície do meio de cultura com a ponta dos dedosFechar e incubar as placas a 37°C por 48horas.

ResultadoDescrever em termos gerais a aparência dessas colôniasFazer a distinção entre uma colônia de fungo e bactéria

Questões1- Qual a importância em se cultivar microrganismos em laboratório?2- Qual a finalidade prática de se conhecer os microrganismos do

ambiente?3- Quais as precauções que devem ser tomadas para controlar os

contaminantes do laboratório?4- O que é uma colônia de bactéria? E de fungo?5- Neste experimento houve influência do meio de cultura no aparecimento

de fungos e bactérias?

ReferênciaNASCIMENTO, G. G. F. Apostila de aulas práticas de microbiologia. UNIMEP. Piracicaba- SP. 1999

EXERCÍCIO N°4

TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

Para se observar o desenvolvimento de um microrganismo é indispensável que sejam tomadas precauções de assepsia e empregar técnicas adequadas de repicagem de modo a preservar as características de cada linhagem.

Material:- culturas- tubos com nutriente líquido (NB)- placas de Petri com NA e AS- alça de inoculação e pipetas.

Método:

A) Semeadura do inoculo de bactérias desenvolvida em meio líquido.

a.1) transferir 0,1ml da cultura desenvolvida em meio líquido para tubo de cultura contendo este mesmo meio. Agitar após a inoculação e incubar a 37ºC por 24 horas.a.2) inocular 0,1ml de cultura desenvolvida em meio líquido para placa de Petri contendo NA e espalhar com a alça de Drigalsky. Incubar a 37ºC por 24 horas

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B) Repique do inoculo de bactéria desenvolvida em meio sólido

Utilizando a alça de inoculação ou alça de platina, transferir a cultura de bactéria desenvolvida em meio sólido para tubos com meio sólido inclinado (NA) e nutriente líquido (NB).Incubar a 37ºC por 24horas

C) Repique em estrias Utilizando a alça de inoculação repicar a cultura bacteriana desenvolvida no meio sólido para a placa de Petri pelo método da estria.

Resultado- Observar o crescimento da bactéria em meio líquido ( turvação, formação de película ou sedimento);- Observar o crescimento da bactéria nos tubos com meio inclinado e nas placas de Petri.

EXERCÍCIO N°5

COLORAÇÃO DE GRAM

O exame microscópico de bactérias pode ser feito a partir de uma suspensão de células em meio líquido ou desenvolvidas em meio sólido, através de colorações. Essa técnica possibilita observar as características morfológicas de bactérias e sua melhor visualização, além de poder evidenciar também diferenças entre células de diferentes espécies ou dentro da mesma espécie pelo uso de corantes apropriados.

A coloração de Gram é bastante utilizada pois a maioria das bactérias se cora por este método, permitindo que sejam obtidas informações relacionadas a sua morfologia, principalmente no que diz respeito a parede celular, por esta vantagem esta coloração é um dos procedimentos utilizados na taxonomia das bactérias.

Material:- Culturas:- Corantes específicos para o método de coloração

Método:a) Preparo do esfregaço.

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Colocar uma gota da suspensão bacteriana em uma lâmina e espalhar ligeiramente com a alça de platina para que as células sejam homogeneamente distribuídas. Secar a preparação no ar.

Fixar o esfregaço, passando a lâmina diretamente na chama, evitando o superaquecimento. Esperar que esfrie completamente ante de corar.

b) Coloração: - cobrir o esfregaço com cristal violeta por 1 minuto;- escorrer o corante e cobrir com lugol por 1 minuto;- escorrer o corante e lavar em água corrente;- lavar com álcool-acetona por 30 segundos e depois lavar em água corrente;- colorir com safranina por 30 segundos;- lavar em água corrente e secar com papel de filtro;- observar no microscópio com a objetiva de imersão.

Resultado.- anotar a forma da bactéria e seus arranjos de crescimento;- anotar a resposta da reação de Gram.

Questões1- Qual a importância da coloração de Gram?2- Qual a finalidade de se usar lugol e álcool nesse tipo de coloração?3- Qual finalidade de se usar a safranina nesse tipo de coloração?

EXERCÍCIO N°6

CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE FUNGOS

a) Fungos Filamentosos

Os fungos filamentosos, também conhecidos por bolores, são constituídos por hifas que se ramificam e se entrelaçam formando micélio. A parte do micélio que penetra no substrato digerindo-o e absorvendo-o é o micélio vegetativo. O micélio reprodutivo é o responsável pela produção de esporos e varia grandemente nas diferentes espécies de fungos, servindo para classificá-los e identificá-los.

MaterialCultura de:Lâminas e lamínulas

MétodoExaminar macroscopicamente e microscopicamente as culturas fornecidas em placas de Petri. Para o exame à fresco, colocar uma gota do corante azul de metileno em uma lâmina e com a alça, emulsionar uma pequena quantidade da cultura do fungo a ser observado. Cobrir com a lamínula e observar no microscópio no aumento de 400X.

Resultado

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Identificar as estruturas observadas ao microscópio: hifas, estrutura de reprodução, esquematizando-as.

b) Fungos unicelulares - Leveduras

As leveduras são fungos unicelulares que se reproduzem ma comumente por brotamento. Muitas vezes os brotos se separam imediatamente da célula mãe formando o pseudo-micélio ( as células ficam ligadas em cadeias). A forma das células também é de grande importância na taxonomia das leveduras.

MaterialCultura de:Lâminas e lamínulas

MétodoExaminar macroscopicamente as culturas fornecidas em placas de Petri observando cor, brilho.Para o exame micorscópico colocar uma gota do corante azul de metileno em uma lâmina e emulsionar pequena quantidade do material. Cobrir com a lamínula e observar no microscópio no aumento de 400X.

ResultadoDesenhar as estruturas observadas no microscópio como forma, tamanho, modo de reprodução.

EXERCÍCIO N°7

CONTROLE DO CRESCIMENTO MICROBIANO

Os microrganismos podem sobreviver em ambientes com diferentes condições físicas e químicas, havendo no entanto, limitações toleradas por eles. Sabe-se que em condições naturais podem ocorrer efeitos inibitórios seletivos ou mesmo letais sobre a flora microbiana. A inibição ou destruição dos microrganismos depende, em parte, da intensidade das condições físicas que lhes são impostas.Cultura:

a) Ação de agentes físicos

Efeito da temperatura 1- Alta temperaturaDividir o fundo de uma placa contendo NA em quatro setores, riscando com um lápis pelo lado de fora. Fazer uma estria com a alça no quadrante 1 (t= 0) e colocar o tubo no banho maria por 5, 10 e 20 minutos. Após cada intervalo de tempo, realizar uma semeadura nos outros quadrantes da placa. Incubar por 48h a 37°C2- Baixa temperatura

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Semear a cultura microbiana em placa contendo NA e incubar em temperatura de 3° a 5°C por 48horas.

b) Ação de agentes químicos

MaterialCultura:Álcool 50% e 70%Água oxigenada 3,5 e 10%Placas com NAPolvedineCotonetes esterilizados

Método- Colocar 5ml de cada uma das soluções fornecidas em tubos esterilizados. Em cada uma desses tubos acrescentar 0,5 ml da cultura bacteriana. Após 5, 10 e 30 minutos, transferir com uma alça de cada mistura para um dos quadrantes da placa de Petri contendo NA. Incubar por 48horas a 37°C.

- ação de antisséptico sobre a pele: umedecer um cotonete em uma solução salina e esfregar vigorosamente a pele das costas de uma das mãos, numa área de aproximadamente 4 cm de diâmetro, inoculando a seguir uma superfície de uma das metades da placa de NA. Umedecer um segundo cotonete com o PVPI e esfregar na pele da outra mão, numa área do mesmo diâmetro que a primeira. Esperar 5 minutos para que haja ação do antisséptico e a área seque. Passar nesta área um terceiro cotonete umedecido em salina, tomando cuidado para não atingir a área circundante à assepsia. Inocular a outra metade da placa com esse cotonete. Incubar a placa por 48horas a 37°C

Resultado: comparar o crescimento, comparando com o controle sem tratamento.

Questões1- Por que nas concentrações mais altas de NaCl o crescimento foi inibido?2- Que conclusão chegou em relação aos experimentos?

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EXERCÍCIO N°8

ANTIBIOGRAMA

A prova da sensibilidade a drogas antimicrobianas é utilizada para orientar o tratamento clínico (principalmente no caso daqueles que adquiriram resistência), para investigação epidemiológica, testes de novos antibióticos e identificação preliminar de algumas bactérias. Basicamente dois métodos são utilizados para avaliar a sensibilidade dos microrganismos às drogas: método da diluição e difusãoa) Método da diluição: pela técnica da diluição em tubos, pode-se determinar a menor quantidade de antimicrobiano para inibir o crescimento de um organismo (CIM= concentração mínima inibitória)b) Método da difusão: se fundamenta na capacidade de difusão do antibiótico através de um meio sólido, inibindo ou não o crescimento do microrganismo. Este método é mais comumente empregado e consiste na utilização de discos de papel impregnados com quantidades conhecidas de drogas, as quais são colocadas na superfície de uma placa inoculada. O halo de inibição pode ser influenciado pela composição do meio de cultura, densidade do inoculo, concentração do antibiótico no disco, difusibilidade do antibiótico no meio e período de incubação.

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MaterialCultura de:Agar Mueller-Hinton (MH)Discos de antibióticos:

MétodoEm uma placa de Petri contendo meio de MH, inocular 0,1 ml da cultura bacteriana fornecida e espalhar o inóculo com a alça de Drigasky.Colocar os biodiscos de antibióticos na superfície do meio com uma pinça estéril, pressionando levemente e mantendo um espaçamento de modo que fiquem suficientemente separados uns dos outros para evitar a superposição dos halos de inibição.Anotar o nome do antibiótico, sua sigla e sua concentração no biodisco.Incubar a 37ºC por 48horas.ResultadoA leitura da placa deverá ser feita medindo-se o diâmetro dos halos de inibição(incluindo o diâmetro do biodisco) e comparando com os dados da tabela e anexo. Classificar como resistente, sensível e intermediário).

Critérios de interpretação baseados no método de Bauer & Kirby, 1966

Diâmetro em milímetro

Antimicrobiano Conc. disco Resistente Intermediário SensívelAc. Pipemidico 20mcg 13 ou - 14 a 18 19 ou +Ac. Nalidíxico 30mcg 13 ou - 14 a 18 19 ou +Amoxilina 10mcg BGN entéricos 11 ou - 12 a 13 14 ou +Staphylococcus 20 ou - 21 a 28 29 ou +Aztreonam 30 mcg 15 ou - 16 a 21 22 ou +Amicacina 30 mcg 14 ou - 15 a 16 17 ou + Ampicilina 10 mcg BGN entéricos 13 ou - 14 a 16 17 ou +Staphylococcus 28 ou - --- 29 ou +Canamicina 30 mcg 13 ou - 14 a 17 18 ou +Carbenicilina 100 mcg 18 ou - 20 a 22 23 ou +Cefalotina 30 mcg 14 ou - 15 a 17 18 ou +Cefoxitina 30 mcg 14 ou - 15 a 17 18 ou +Cefotaxima 30 mcg 14 ou - 15 a 22 23 ou +Ceftriaxona 30mcg 13 ou - 14 a 20 21 ou +Cefalexina 30mcg 14 ou - 15 a 17 18 ou +Cefadroxil 30mcg 14 ou - 15 a 17 18 ou +Ceftazidima 30mcg 14 ou - 15 a 17 18 ou +Ciprofloxacina 5mcg 15 ou - 16 a 20 21 ou +Clindamicina 2mcg 14 ou - 15 a 20 21 ou +Cloranfenicol 30mcg 12 ou - 13 a 17 18 ou +Eritromicina 15mcg 13 ou - 14 a 22 23 ou +Estreptomicina 10mcg 11 ou - 12 a 14 15 ou +

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Gentamicina 10mcg 12 ou - 13 a 14 15 ou +Imipenem 10mcg 13 ou - 14 a 15 16 ou +Lincomicina 2mcg 14 ou - 15 a 16 17 ou +Neomicina 30mcg 12 ou - 13 a 16 17 ou +Netilmicina 30mcg 12 ou - 13 a14 15 ou +Nitrofurantoina 300mcg 14 ou - 15 a 16 17 ou +Norfloxacina 10mcg 12 ou - 13 a 16 17 ou +Oxacilina 1mcg 9 ou - 10 a 13 14 ou +Penicilina G 10 unid.Enterococos 14 ou - -- 15 ou +Staphycoccus 28 ou - -- 29 ou +Polimixina B 300 UI 8 ou - 9 a 11 12 ou +Rifampicina 30mcg 11 ou - 12 a 18 19 ou +Sulfazotrin 25mcg 10 ou - 11 a 15 16 ou +Sulfonamida 300mcg 12 ou - 13 a 16 17 ou +Tetraciclina 30mcg 14 ou - 15 a 18 19 ou +Tobramicina 10mcg 12 ou - 13 a 14 15 ou +Vancomicina 30mcg 9 ou - 10 a 11 12 ou +

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