Apostila Microbiologia UESB

Microbiologia Clínica Profª Grazielle Mendes UESB Página 2

Aulas Práticas de Microbiologia

Prof.ª Grazielle Mendes

Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia-UESB


NORMAS DE SEGURANÇA NO TRABALHO NO LABORATÓRIO

DE MICROBIOLOGIA

As aulas práticas de Microbiologia têm como objetivo ensinar ao acadêmico os princípios

gerais e métodos utilizados no estudo de microbiologia. Nestas aulas utilizaremos uma variedade de bactérias, sendo algumas patogênicas para o homem, portanto é essencial que as normas sejam seguidas, a fim de se evitar contaminações acidentais. 01- O uso do guarda-pó é obrigatório. 02- Cabelos longos devem ser amarrados de forma a não interferir com reagentes e equipamentos. 03- Limpar e desinfetar a superfície das bancadas antes e depois de cada aula prática. 04- Lavar e sanificar as mãos ao iniciar a análise, ao sair do laboratório e sempre que for necessário.

Se for portador de algum ferimento nas mãos, procurar não tocar no material. 05- Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado antes de iniciar a análise. 06- Utilizar exclusivamente material estéril para a análise. 07- No caso de derramamento do material contaminado, proceder imediatamente a desinfecção e

esterilização. O mesmo procedimento deverá ser repetido se ocorrer ferimentos ou cortes. 08- Não comer, beber ou fumar no laboratório. 09- Manter canetas, dedos e outros longe da boca. 10- Não utilizar material de uso pessoal para limpar os objetos de trabalho. 11- Avisar ao professor em caso de contaminação acidental. 12- Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, jamais deixando-os sobre a

bancada. 13- Flambar as alças, agulhas e pinças antes e após o uso. 14- Os cultivos após a leitura devem ser esterilizados, portanto não os colocar na estufa ou despejar

na pia. 15- Ao acender o Bico de Bunsen, verificar se não há vazamento de gás ou substâncias inflamáveis

por perto. 16- Trabalhe sempre próximo ao fogo.

OBS: A utilização do Bico de Bunsen é essencial pois visa a diminuição de microrganismos no campo de trabalho através do calor. Para isso ele apresenta uma regulagem que torna possível selecionar o tipo de chama ideal para o trabalho. No caso da Microbiologia deve ser utilizada a chama azul porque esta atinge maior temperatura e não forma fuligem. É importante ressaltar que a chama apresenta diferentes zonas, e tal fato é importante para que o processo de Flambagem seja executado adequadamente, já que certas zonas da chama devem ser evitadas. As zonas da chama são: Zona Neutra (é uma zona fria e, portanto, não deve ser utilizada para Flambagem), Zona Redutora e Zona Oxidante (são zonas onde já ocorre a combustão e, portanto, já podem ser usadas para a Flambagem). (fig. 1).

Figura 1


AULA 1: MICROSCOPIA A FRESCO Sabemos que as bactérias são seres microscópicos, portanto a sua observação direta depende do

uso do microscópio. Essa observação pode ser feita mediante o uso de corantes ou a fresco, sem coloração.

A microscopia a fresco permite verificar viabilidade, tamanho, forma natural das bactérias e atividades celulares como a motilidade bacteriana.

A respeito da motilidade é possível observar dois movimentos: o movimento flagelar, que é ativo e característico de bactérias dotadas de flagelos, e o movimento browniano, o qual é passivo e ocorre na direção das correntes líquidas que se formam nas preparações.

Técnica: Será utilizada a técnica denominada Gota Pendente, na qual o inóculo fica suspenso em uma lâmina escavada (lâmina de Koch).

1- Retire com uma alça esterilizada uma gotícula da cultura-teste. 2- Deposite esta gotícula no centro de uma lamínula previamente limpa e seca. 3- Coloque um pouco de vaselina nas bordas da concavidade da lâmina escavada, também limpa e seca. 4- Inverta a lâmina côncava sobre a lamínula de forma que a gotícula ocupe o centro da concavidade. 5- Inverta novamente a posição da lâmina, de forma que a gotícula fique pendente no centro da

concavidade. 6- Leve a preparação ao microscópio e focalize a gota com objetiva de 40x com luz reduzida (as

bactérias possuem índice de refração próximo ao da água). Diferencie os dois tipos de movimento: ativo (flagelar) e passivo (browniano). O movimento flagelar é caracterizado pelo deslocamento, pela mudança da posição da bactéria, enquanto que o browniano não acarreta mudança na posição, não há deslocamento autônomo da bactéria.


Para ajudar você a fixar o conteúdo, foram elaboradas algumas perguntas a respeito desta aula. Responda-as e entregue ao seu professor de laboratório. 1- Desenhe o que foi visualizado na observação direta de microrganismos, exemplificando o

movimento observado. 2- Qual é a finalidade da utilização da técnica de gota pendente? Nome do(a) acadêmico(a): __________________________________________________


Nome do(a) professor(a): ________________________________________________________

AULA 2: MEIOS DE CULTIVO E TÉCNICAS DE SEMEADURA Meios de Cultivo Os meios de cultivo, também chamados meios de cultura, são complexos que se destinam ao cultivo

artificial de microrganismos. As técnicas de semeadura permitem que o cultivo destes microrganismos nos meios de cultura seja

eficiente e que as seguintes finalidades sejam atingidas:

- crescimento bacteriano; - isolamento bacteriano; - estudo da morfologia colonial; - pesquisa de patogenicidade; - pesquisa das características bioquímicas.

Os meios de cultivo devem conter as substâncias exigidas pelas bactérias para o seu crescimento e

multiplicação. Para que possam fazer a síntese de sua própria matéria nutritiva devem dispor de fontes de carbono (proteínas, açúcares), fontes de nitrogênio (peptonas) e fontes de energia. São também necessários alguns sais inorgânicos, vitaminas e outras substâncias favorecedoras do crescimento.

Classificação dos meios de cultivo: - Quanto à consistência: Meios líquidos: são aqueles em que os nutrientes estão dissolvidos em uma solução aquosa. O

crescimento bacteriano nesse meio muda seu aspecto, ou seja o meio sofre uma turvação. Meios semi-sólidos: são aqueles que possuem na sua composição, além dos nutrientes, uma pequena

porcentagem de um polissacarídeo proveniente de algas marinhas, chamado ágar. São geralmente utilizados em tubos e a partir desse tipo de cultura é possível observar a motilidade bacteriana.

Meios sólidos: são aqueles que possuem uma porcentagem maior de ágar (cerca de 15 g/litro de água destilada), além dos nutrientes. Podem ser dispostos em tubos ou em Placas de Petri, dependendo da finalidade. Através do meio sólido em placas de Petri é possível, utilizando-se a técnica do esgotamento, conseguir o isolamento de colônias bacterianas e, portanto, é o meio ideal para que seja feito o estudo da morfologia colonial. Já a cultura em ágar inclinado fornece somente o crescimento bacteriano com a obtenção de uma biomassa de microrganismos.

- Quanto à função: Meios simples: possuem os componentes essenciais para o crescimento de microrganismos pouco

exigentes. Ex: caldo simples. Meios de enriquecimento: são adicionadas ao meio simples substâncias enriquecedoras como sangue,

soro, ovo, extrato de leveduras, etc. Ex: Ágar sangue. Meios seletivos: aqueles que favorecem o desenvolvimento de determinados microrganismos em

detrimento de outros, geralmente pela adição de substâncias inibidoras. Ex: Ágar Salmonella-Shigella.


Figura 1

Meios diferenciais: permitem o desenvolvimento de grupos de microrganismos com características relativamente definidas, o que permite diferenciar um grupo ou uma espécie de microrganismo. Ex: Ágar MacConkey.

Meios de manutenção: são aqueles destinados a manter a viabilidade de uma cultura bacteriana. Ex: Ágar Nutriente.

-Quanto à natureza: Meios animados: são constituídos de células vivas, como animais de laboratório, tecidos vivos ou ovo

embrionado. Meios inanimados: não possuem células vivas. Podem ser naturais ou sintéticos. Naturais são aqueles

que possuem substâncias provenientes da natureza, e o sintético contém substâncias obtidas em laboratório. Ainda podemos obter meios de cultivo semi-sintéticos, que são resultantes da união dos dois anteriores.

Os meios de cultivo são preparados e armazenados seguindo um rigoroso controle de qualidade,

pois devem ser mantidas todas as suas propriedades nutricionais e garantida a esterilidade até o momento de sua utilização.

Técnica de Semeadura A escolha da técnica para o cultivo de microrganismos varia de acordo com o tipo de meio de cultura e a

finalidade do cultivo, porém algumas regras devem ser seguidas nas inoculações: - A agulha e alça de níquel-cromo (também chamada de agulha e alça de platina) devem ser

esterilizadas por flambagem antes e após qualquer cultivo. Tome cuidado de esfriá-las antes da coleta.

- Os recipientes devem sempre ser abertos próximos à chama do bico de Bunsen. - Deve-se evitar ao máximo que as tampas dos tubos e placas fiquem sob a bancada durante o cultivo.

Para garantir uma semeadura correta, deve-se evitar ao máximo perfurar ou rasgar o ágar, pois poderá

ocorrer acúmulo de bactérias neste setor do meio além de alterar as condições de crescimento bacteriano.

Técnica I: Meio Líquido 1- Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é apresentada. 2- Mergulhe a alça carregada de bactérias no tubo com o meio de cultivo e agite a alça. Técnica II: Meio semi-sólido 1- Mergulhe a Agulha de níquel-cromo esterilizada na cultura bacteriana que lhe é fornecida.


2- Faça uma “injeção” com a agulha carregada com bactérias no meio de cultivo semi-sólido.

Técnica III: Meio sólido (ágar inclinado) 1- Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é apresentada. 2- Encoste levemente a alça na parte mais baixa do plano inclinado e suba fazendo estrias na superfície

do ágar.

Técnica IV: Meio sólido (Placa de Petri – técnica do esgotamento) 1- Divida a Placa de Petri em três partes, fazendo linhas com a caneta retroprogetor na parte de baixo da

placa. 2- Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é apresentada. 3- Faça estrias em cada divisão, respeitando as linhas e utilizando da melhor forma possível toda a

superfície da placa.

Figura 4

Figura 2

Figura 3


Para ajudar você a fixar o conteúdo, foram elaboradas algumas perguntas a respeito desta aula. Responda-as e entregue ao seu professor de laboratório.

1- Cite os três tipos de meio de cultivo utilizados na aula prática e suas finalidades.

2- Qual a finalidade do cultivo em meio sólido em placa através de estrias de esgotamento? Explique.

3- Como se analisa o resultado obtido no crescimento do meio semi-sólido? Nome do(a) acadêmico(a): __________________________________________________


Nome do(a) professor(a): ________________________________________________________ AULA 3: MICROSCOPIA DE GRAM

A parede celular de bactérias Gram-positivas difere-se das bactérias Gram-negativas pela presença

de uma espessa camada de peptidoglicano e pela ausência de uma membrana externa. Esta diferença de constituição da parede celular é a base da coloração de Gram, uma técnica primordial no diagnóstico microbiológico, visto que através dela se definem características morfológicas e tintoriais da bactéria em pesquisa.

A coloração de Gram consiste em tratar bactérias sucessivamente com cristal violeta, lugol, álcool-acetona e fuccina (ou safranina). O cristal vioeta e o lugol formam um complexo denominado iodopararosanilina, o qual confere coloração roxa tanto pelas bactérias Gram-positivas, quanto as Gram-negativas. Com a adição de álcool-acetona, as bactérias Gram-negaticas liberam o complexo formado, pois a camada de peptidoglicano é de pequena espessura, enquanto que as Gram-positivas retêm o complexo, permanecendo roxas. A adição de fuccina (ou safranina) não altera a cor das Gram-positivas, mas confere a cor avermelhada as bactérias Gram-negativas, que foram descoloridas pelo álcool-acetona.

Técnica:

-Esfregaço da cultura bacteriana líquida: 1- Flambe uma alça, deixe esfriar, mantendo-a próximo a chama. 2- Retire uma amostra da cultura com a alça e deposite no centro da lâmina. 3- Espalhe o material com a alça em movimento circular, obtendo um esfregaço de forma oval, uniforme

e fino. 4- Fixe o esfregaço, passando a lâmina na chama do bico de Bunsen, como se cortando a chama,

repetindo este procedimento 3 vezes, para que o material fique bem aderido. -Esfregaço de cultura bacteriana sólida:

1- Flambe uma alça, deixa esfriar, mantendo-a próximo a chama. 2- Retire uma gota da água estéril e deposite sobre a lâmina. 3- Flambe novamente a alça, espere esfriar, e retire uma amostra da cultura sólida. 4- Leve a amostra até a gota de água depositada sobre a lâmina, e homogeinize com movimentos

circulares, para obter um esfregaço de forma oval, uniforme e fino. 5- Fixe o esfregaço, passando a lâmina na chama do bico de Bunsen, como se cortando a chama,

repetindo este procedimento 3 vezes, para que o material fique bem aderido. - Adição de Corantes: 1- Coloque a lâmina com o esfregaço sobre um suporte. 2- Cubra a lâmina com cristal violeta (Gram I) e deixe agir por 1 minuto. 3- Lave a lâmina em jato fraco de água corrente, do lado contrário ao esfregaço. 4- Cubra a lâmina com lugol (Gram II), deixe agir por 1 minuto e depois lave novamente a lâmina. 5- Cubra a lâmina com a solução de álcool-acetona (Gram III), verifique a descoloração que deve ocorrer

em cerca de 20 segundos. 6- Cubra a lâmina com fuccina Gram IV), deixe agir por 30 segundos, e, novamente lave a lâmina. 7- Seque inicialmente o lado da lâmina oposto ao esfregaço com papel toalha, e a seguir seque o restante

da lâmina na chama do bico de Bunsen (como se estivesse “cortando” a chama). 8- Leve a lâmina ao microscópio e observe em objetiva de imersão. (Não esqueça de colocar uma gota de

óleo para imersão sobre o esfregaço)


Para ajudar você a fixar o conteúdo, foram elaboradas algumas perguntas a respeito desta aula. Responda-as e entregue ao seu professor de laboratório.

1- Faça um desenho esquemático do que foi visualizado no microscópio, mostrando a morfologia bacteriana e a reação tintorial.

2- Fale sobre o fundamento da técnica de Gram. Nome do(a) acadêmico(a): __________________________________________________



AULA 3 – COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN (BAAR) 1.Princípio A parede celular das micobactérias, devido ao seu alto conteúdo lipídico,apresenta resistência a coloração. Entretanto, uma vez coradas, as micobactérias resistem ao descoramento por solventes orgânicos fortes (como o álcool-ácido) e, por isso, são chamadas de álcool-ácido resistentes. Esta coloração é realizada para detectar a presença e evidenciar as características morfológicas e tintoriais dos Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR). 2.Amostra 2.1 Tipo de amostra:Escarro, lavado brônquico, lavado bronco-alveolar, secreção traqueal, aspiradotraqueal, LCR, urina, líquidos estéreis em geral, fezes, linfa, secreção muco-nasal. 3.Metodologia - Preparar o esfregaço do material e fixar com calor. As amostras de vias aéreas superiores deve ser manipuladas com máscaras, óculos e luvas. - Cobrir a lâmina com fucsina de Ziehl por 5 minutos, aquecendo-a por duas vezes durante este período, até a emissão de vapores. Não deixar ferver. - Descorar com álcool-ácido, até que toda a fucsina seja eliminada. - Cobrir com azul de metileno (coloração de fundo) por 2 minutos. - Secar e observar ao microscópio com objetiva de 100x (imersão). 4. Interpretação A observação de bacilos álcool-ácidos resistentes (coradas em rosa) é altamente sugestiva de micobactérias, sendo o Mycobacterium tuberculosis e o M. leprae osmais frequentes. Outras micobactérias também são álcool-ácido-resistentes. 5. Interferentes - Riscos na lâmina podem ser confundidos com BAAR se o observador não tiver muita experiência.- Além das micobactérias, outras bactérias podem apresentar álcool-ácidoresistência parcial ou total (Ex. Nocardia, Rhodococcus )

AULA 4:TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS (ANTIBIOGRAMA)

Antibiogramas são bioensaios conduzidos “in vitro” que visam testar a sensibilidade de bactérias

aos antimicrobianos. A proposta primária deste teste é guiar o clínico na escolha do agente apropriado para a terapia. Os testes de rotina fornecem dados acumulados, que são informações sobre os agentes para uso empírico. Além disso, estes testes são utilizados para avaliar “in vitro” a atividade de novos agentes, e auxiliar no mapeamento da emergência de bactérias resistentes. A suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensível, intermediário ou resistente; ou quantitativamente em termos de MIC (minimun inhibitory concentration) ou MBC (minimun bactericidal concentration).

1- Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Método de diluição: consiste em preparar sucessivas diluições dos antibióticos em meio sólido ou líquido e em seguida semear a bactéria em estudo. Após incubação determina-se MIC e/ou MBC.

2- Método de difusão de Bawer e Kirk (modificado pela FDA): é um teste qualitativo, no qual discos de papel impregnados com o antibiótico são colocados na superfície do ágar uniformemente semeado com o microrganismo. A droga se difunde no ágar e produz inibição do agente sensível,


SWAB

formando um halo de inibição que deve ser medido e comparado com tabelas padronizadas. Para a garantia desta técnica, alguns fatores são essenciais:

Meio de Cultura: normalmente é utilizado o meio Muller-Hinton, que se caracteriza por ser um meio enriquecedor e com ausência de substâncias antagônicas.

Cultura Bacteriana: o teste deve ser realizado com cultura pura de bactérias, devendo-se realizar a coloração de Gram. A densidade do inóculo deve corresponder a turbidez 0,5 na escala padrão de turbidez (Escala de Mac-Farland).

Técnica: Para cumprir os objetivos desta aula será utilizado o método de difusão: 1- Sature um swab de algodão com a suspensão bacteriana (Fig 1). Remova o excesso de umidade

girando o swab contra a parede do tubo.

2- Semeie a suspensão sobre a superfície estéril de uma placa contendo ágar Muller-Hinton, utilizando sucessivamente três direções para obter um inóculo uniformemente espalhado sobre toda a superfície do ágar ( Fig 2 ).

3- Distribua cinco discos de antibiótico, sendo cada um de um antimicrobiano diferente, sobre a superfície do ágar inoculado, seguindo o esquema abaixo (Fig 3). Deixe uma distância de aproximadamente 1 cm entre a borda da placa e o disco.

4- Pressione levemente os discos para que não se desprendam durante a incubação. 5- Incube as placas por 24 horas a 37°C. Análise dos Resultados

Através da análise dos resultados poderemos classificar os microrganismos testados em: “resistente”, “intermediário”, “moderadamente sensível”, e “sensível”, dependendo da formação ou não de halo inibitório e também de seu diâmetro(Fig 4).

Figura 1

Figura 2

Figura 3

Figura 4


No caso de formação de um halo inibitório, este deve ter seu diâmetro medido, e a medida encontrada deve ser comparada com tabelas padronizadas (Fig 5) . De modo geral, estas tabelas determinam medidas de diâmetro, e dessa forma a medida encontrada em cada caso pode então ser enquadrada em uma das quatro categorias supracitadas.

FIGURA 5: Exemplo de Tabela de Halos de Sensibilidade

Antimicrobiano Código [µg] Halos de Inibição (mm)

Resistente Intermediário Moderadamente sensível Sensível

Bacitracina BAC 10 < 8 9 a 12 - > 13 Cefotaxima CTX 30 < 14 - 15 a 22 > 23 Gentamicina GEN 10 < 12 13 a 14 - > 15 Tetraciclina TET 30 < 14 15 a 18 - > 19

Vancomicina VAN 30 < 9 10 a 11 - > 12 EXEMPLO: Se para um determinado microrganismo, utilizando-se o antimicrobiano Gentamicina,

foi medido o diâmetro de um halo de inibição e constatou-se que este era de 16 mm, tal microrganismo deve ser classificado como sensível para a Gentamicina. Entretanto se o diâmetro do halo fosse de 13 mm o microrganismo seria classificado como intermediário a Gentamicina. No caso de não formação de um halo de inibição, o microrganismo seria considerado resistente.


Para ajudar você a fixar o conteúdo, foram elaboradas algumas perguntas a respeito desta aula. Responda-as e entregue ao seu professor de laboratório. 3- Descreva os resultados obtidos, indicando qual a bactéria utilizada, a formação ou não do

halo de inibição para cada antimicrobiano utilizado, indicando o tamanho do halo, caso este tenha se formado, e a classificação da bactéria a respeito de sua sensibilidade a cada antimicrobiano.

2- Explique como se forma um halo de inibição. Nome do(a) acadêmico(a): __________________________________________________



AULA 05 – COLETA DE SECREÇÃO DE OROFARINGE 1.Princípio Isolar bactérias patogênicas de secreção de orofaringe, especialmente estreptococos beta-hemolíticos do grupo A, uma vez que se faz necessária a terapia imediata. A urgência não é justificada apenas pela doença básica(faringite, amigdalite), mas também para evitar complicações posteriores,potencialmente graves, como febre reumática, glomerulonefrite e endocardite reumática. 2.Amostra 2.1.Tipo de amostra: Secreção de orofaringe, faringe, amígdalas e/ou pontos purulentos dessas regiões. 2.2.Material para coleta: - 01 abaixador de língua - 02 lâminas para microscopia - 01 swab estéril - 01 placa de Agar sangue ou- 01 tubo de Stuart (meio de transporte) Procedimento: •Sentar o paciente e inclinar levemente a cabeça de modo aobter boa iluminação na cavidade oral; •Expor o máximo as amígdalas, com o abaixador de língua; •Esfregar o swab, de maneira rotatória, nas amígdalas e na faringe posterior. Coletar também qualquer outro ponto de pus; •Cuidar para não tocar com o swab na parede da cavidade bucal e não carregar saliva, caso contrário haverá contaminação da amostra. •Rolar o swab no início de um quadrante da placa de ágar sangue(AS) e, posteriormente, fazer um esfregaço em lâmina; •Caso não esteja disponível a placa de AS, introduzir o swab emum meio de transporte de Stuart, imediatamente após a coleta. 2.3.Estabilidade da amostra: Amostra em placa: encaminhada em até 2 horas em temperatura ambiente; Amostra em meio de transporte: 24 horas em temperatura ambiente 3.Metodologia: 3.1 Bacterioscopia: Após fixar o esfregaço, corar pelo método de Gram e observar ao microscópio com objetiva de 100x, verificando a presença de leucócitos, células e bactérias. 3.2. Semeadura e isolamento:Com auxílio de uma alça de platina, fazer a semeadura do material no meiopela técnica de isolamento.Incubar em jarra com 5% de tensão de CO² por 24-48 horas. roceder a identificação baseada na morfologia das colônias e hemólise emAgar sangue. 4.Interferentes Qualquer antibiótico administrado previamente a coleta poderá fornecer resultados falso negativos. A falta de uma técnica adequada de coleta poderá levar a uma contaminação da amostra por bactérias da microbiota normal,presentes na saliva e na cavidade oral (ex.: Estreptococos do grupo Viridans eestafilococo coagulase-negativo). Isto pode gerar dificuldades na interpretação clínica do resultado. Entretanto, este tipo de contaminante não deve ser valorizado em culturas de orofaringe.


Atividade: Após o período de incubação, selecionar uma colônia da placa, fazer um esfregaço e corar pelo Gram. Observar ao microscópio

AULA 06 – IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS E BACILOS GRAM-NEGATIVOS NÃOFERMENTADORES

Procedimento 1: 1.Cada dupla receberá uma bactéria em Agar inclinado e deverá proceder aidentificação do microrganismo. 2.Inocular a bactéria nos meios de identificação bioquímica e fazer a prova da citocromo-oxidase. 3.Incubar as provas de identificação a 35 ± 1oC por 24 horas. Procedimento 2: 1.Interpretar e anotar os resultados das provas bioquímicas. 2.Colocar os resultados em tabelas de identificação bioquímica. 3.Identificar o microrganismo. (Tabelas de identificação em anexo)

PROVAS BIOQUÍMICAS UTILIZADAS NA IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS

METABOLISMO DE CARBOIDRATOS 1- Fermentação de carboidratos: Algumas bactérias são capazes de hidrolizar os carboidratos (dissacarídeos até glicose), e metabolizar a glicose até ácidos (com ou sem liberação de gás) e/ou álcoois. Carboidrato ( manitol, sacarose, lactose, etc. ) glicose ác. pirúvico ácidos, álcoois e gases. Meio utilizado: meio de cultura indicador que contém: caldo simples + carboidrato + indicador de pH (indicador de Andrade ) + tubo de Durhan. TÉCNICA: a) repicar o microrganismo já isolado para o meio contendo o carboidrato e incubar em estufa a 37° C por 24 horas. b) Leitura: observar se houve produção de ácidos (viragem da cor do meio) com ou sem produção de gás (formação de bolha no interior do tubo de Durhan). 2- Prova do citrato: Muitas bactérias são capazes de utilizar o citrato (ác. orgânico do ciclo de Krebs) como fonte de carbono . .A enzima que cataliza a clivagem do citrato recebe várias denominações, dentre elas, citratoliase e citrilase. Os produtos de clivagem são acetato e oxaloacetato, este último sendo subseqüentemente convertido em Piruvato e CO2 , por uma oxalacetato descarboxilase. citrato citrilase oxalacetato oxalacetato Ác. Pirúvico + CO2 + descarboxilase acetato O piruvato é utilizado pela célula ( para seu metabolismo ) e o CO2 é liberado no meio de cultura. O CO2 liberado reage então com o sódio ( proveniente do sal citrato de sódio


incorporado na composição do meio de cultura ), formando carbonato de sódio ( composto alcalino ), que promove a viragem da cor do meio, devido a alcalinização. Meio utilizado: Citrato de Sódio + H2O + Indicador de pH ( azul de bromotimol ). O pH final do meio após preparo: 6.8 . Indicador de pH: azul de bromotimol: verde em meio ligeiramente ácido ( 6.8 ) e azul em pH acima de 7,6. Técnica: repicar o microrganismo já isolado no meio do citrato e incubar na estufa a 37° C por 24 horas. Leitura: - teste positivo: meio de cultura azul (a bactéria utilizou o citrato, liberando CO2,) - teste negativo: meio inalterado ( verde ): bactéria não utilizou o citrato. 23 METABOLISMO DE PROTEÍNAS A decomposição de proteínas ( liberação de aminoácidos ) conduz à produção de substâncias pútridas (de mal cheiro) como: H2S, Indol e escatol e etc. Neste experimento, observaremos a utilização ou não de certos aminoácidos pelas bactérias ( necessários ao seu metabolismo ), através da detecção da presença de substâncias pútridas. Meio de cultura utilizado: Meio SIM. ( S=sulfeto; I=indol; M=motilidade ) Composição: peptona (proteína que serve como fonte de tryptofano e cistina), sal de metal pesado (sal de ferro ou chumbo), água e ágar. TÉCNICA: Semear com agulha ( picada até + ou - 1/3 do tubo ) a bactéria já isolada para o meio SIM. Incubar em estufa a 37ºC por 24 horas. Após incubação, adicionar de 3 a 5 gotas do reativo de Kovacs e proceder a leitura. FUNDAMENTO: 1- Produção de Indol: degradação do tryptofano Tryptofano triptofanase Ác. pirúvico e indol produzida pela bactéria Ác. pirúvico: utilizado pelo metabolismo da bactéria. Indol: liberado no meio de cultura. Adicionar após incubação, de 3 a 5 gotas do reativo de Kovacs ( solução de paradimetilaminobenzaldeido ). Se houver liberação de indol, formar-se-á um anel vermelho ( composto denominado rosindol) Resultado: - Indol positivo: anel vermelho - Indol negativo: não utilização do tryptofano. Presença de anel amarelo (cor do reativo de Kovacs) 2- Produção de H2S: Cistina: aminoácido que contém enxofre (S). Degradação da cistina com liberação de H2S. Cistina 2 cisteína cisteína dessulfidrilase H2S + ác. pirúvico produzida pela bactéria Ác. pirúvico; utilizado no metabolismo da bactéria.


H2S: liberado no meio de cultura. O H2S liberado combina-se com o sal de ferro ou chumbo, dando como resultado um precipitado de cor negra. Resultado: - H2S positivo: precipitado preto - H2S negativo: sem precipitado

AULA 07 – IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAM-POSITIVOS 1.Princípio Identificar os cocos Gram-positivos até o gênero:Staphylococcus, Streptococcus eEnterococcus. 2. Prova da catalase Quando houver suspeita de cocos Gram-positivos, realizar uma bacterioscopia e depois a prova da catalase. a)Em uma lâmina limpa, pingar uma gota de peróxido de hidrogênio 20 volumes b)Com auxílio de uma alça, transferir uma colônia para a lâmina e emulsioná-la no peróxido c)Um desprendimento intenso de bolhas indica resultado POSITIVO 3. Catalase-positivos Inocular a colônia suspeita no plasma e incubar a 35oC por 4 horas. Após o período de incubação, a formação de um coágulo indica um resultado positivo e identifica S.aureus. 4. Observar as hemólises e características das colônias em agar sangue de carneiro 5% Esquema de identificação de cocos Gram-positivos de importância médica(vide tabela)

AULA 08 – UROCULTURA 1.Princípio Crescimento bacteriano em meios de cultura seletivos e diferenciais que propiciam o desenvolvimento de patógenos de interesse em infecções urinálise sua quantificação pela semeadura com alça calibrada. O objetivo é isolar e quantificar bactérias patogênicas do trato urinário, diferenciando infecção de colonização. 2.Amostra 2.1.Tipo de amostra:Urina colhida por micção (jato intermediário), punção suprapúbica,cateterização ou sonda uretral. 2.2.Preparo da amostra Não é exigido 3.Estabilização e armazenamento A urina que não for transportada ao laboratório em até uma hora ou semeada dentro de duas horas após a coleta deve ser refrigerada até o momento da semeadura, podendo permanecer nestas condições por, no máximo, 24 horas. 4.Materiais inadequados - Jato primário de urina (a não ser por solicitação médica) - Amostra em frasco não estéril - Urina colhida com coletor e contaminada com fezes (bebês) - Amostra colhida de bolsa coletora de pacientes sondados 5.Metodologia 5.1.Semeadura e isolamento •Para a cultura quantitativa de urina utilizar a alça calibrada de 1 µl(1:1000) ou 10 µl (1:100).


•Após a homogeneização da amostra, proceder a semeadura com alça apropriada em ágar CLED e ágar Mac Conkey, pela técnica de esteira. Esta semeadura constará inicialmente de uma estria central na superfície do Agar, seguida de um estriamento perpendicular a esta estria inicial, possibilitando assim, a obtenção de colônias isoladas para contagem.

•Incubar as placas a 35oC por 18-24 horas. •Analisar as características das colônias e proceder a identificação(Bacilos Gram-negativos ou Cocos Gram-positivos).5.2.Contagem de colônias •Caso seja utilizada a alça de 1 µl, o número de UFC será dado pela contagem das colônias do mesmo aspecto na placa, multiplicado por 1000. • Caso seja utilizada a alça de 10 µl, o número de UFC será dado pela contagem das colônias do mesmo aspecto na placa, multiplicado por 100. 6.Interpretação De acordo com o número de microrganismos isolados e sua quantidade,proceder a interpretação de acordo com a necessidade.O crescimento de uma ou duas espécies em contagem superior a 100.000UFC/ml dever ser sempre valorizado (identificação + antibiograma).Desenvolvimento de três ou mais espécies em contagens inferiores a 100.000UFC/ml devem ser analisadas criteriosamente em cada caso. 6.1.Modelo de resultado Desenvolvimento deEscherichia coli:Contagem de colônias: Superior a 100.000 UFC/ml Cultura negativa:Contagem de colônias: zero UFC/ml 7.Interferentes O uso de antibióticos e diuréticos pode diminuir sensivelmente a contagem de colônias. Amostras colhidas inadequadamente poderão apresentar contaminação bacteriana por microbiota normal da uretra e/ou vaginal. Amostras não refrigeradas poderão apresentar um subcrescimento de bactérias contaminantes, “positivando” a cultura

AULA 09 – COPROCULTURA 1.Princípio O crescimento bacteriano em meios de cultura seletivos e diferenciais propicia o enriquecimento e o desenvolvimento de patógenos de interesse nas gastroenterites. A partir disto é possível a sorotipagem de bactérias enteropatogênicas (Salmonella, Shigella, E. coli invasora EIEC eE. Coli enteropatogênica - EPEC) presentes na amostra. 2.Amostra


Fezes recentes em frasco de boca larga estéril ou em meio de transporte ou swab retal em meio de transporte. Estabilidade e armazenamento da amostra: A amostra, em meio de transporte,pode permanecer até 24 horas em temperatura ambiente. O armazenamento após a semeadura direta e enriquecimento da amostra, deve ser feito sob refrigeração por mais 24 horas. Entretanto, a refrigeração pode inviabilizar algumas cepas de Shigella. . 3.Metodologia 3.1Exame macroscópico: Anotar sempre o aspecto das fezes (p. ex.: diarréicas, moldadas,mucosanguinolentas, etc) 3.2Exame microscópico direto: A partir de um frasco sem meio de transporte realizar uma suspensão em salina sobre uma lâmina e observar a presença de leucócitos em objetiva de 40x.3. 3Bacterioscopia de Gram:Realizar apenas quando solicitado pelo médico ou para a pesquisa de Campylobacter (presença de leucócitos e bacilos Gram-negativos curvos). Preparar uma suspensão em salina conforme dito acima, deixar secar e corar pelo método de Gram. 3.4Semeadura e isolamento:

Proceder a semeadura direta por esgotamento no meio MacConkey, Hektoen eno caldo GN. Incubar as placas por 18-24 horas e o caldo GN por 4 horas(máximo 6 horas). Repicar do caldo GN para uma placa com XLD e incubá-la por18 – 24 horas a 35oC.Identificar as

colônias de interesse por meio de provas bioquímicas.

Sorologia: Após a leitura das provas de triagem, realizar a sorologia indicada, caso necessário, conforme descrito a seguir. Procedimento:

Adicionar 2 – 3 colônias suspeitas a 1 mL de salina e homogeneizar bem. Colocar em uma placa escavada, 1 gota do anti-soro e misturar com uma gota da suspensão

bacteriana. Homogeneizar por 2 minutos. Observar aomicroscópio (10x) a presença de aglutinação. Anti-soros utilizados :

2)Salmonella polivalente somático e flagelar. 3)Shigella: S. flexneri, S. sonnei, S. boydii, S. dysenteriae .4)EPEC (crianças até 02 anos): polivalentes A, B e C 5)EIEC: polivalentes A e B 4.Modelo de resultado Será relatada a presença ou ausência dos enteropatógenos aqui pesquisados,conforme faixa etária (a EPEC só deve ser pesquisada em crianças até 2 anos deidade).Exemplos: “Não houve desenvolvimento de Salmonella, Shigella e E. coli enteropatogênica clássica”.“Desenvolvimento de Salmonella ”.


5.Interferentes A bacterioscopia não pode ser realizada com amostra em meio de transporte,pois este prejudica a coloração e causa interferência no método. A semeadura em grandes quantidades de amostra pode causar a viragem do pH dos meios e não permitir a obtenção de colônias isoladas. Algumas cepas de EPEC podem apresentar aglutinação inespecífica com todos os antisoros (cepas autoaglutináveis). Nestes casos, re-isolar as cepas e repetir a sorologia. Caso a aglutinação se repita, o resultado é inconclusivo

AULA 10 – HEMOCULTURA 1.Princípio O Objetivo da hemocultura é a realização do isolamento, identificação e antibiograma de bactérias que possam estar envolvidas em um processo infeccioso da corrente sanguínea. Isto é possível através da incubação das amostras em caldos de enriquecimento na proporção de 1:10, para que haja diluição das prováveis substâncias inibitórias presentes no sangue. O frasco de hemocultura contém ainda um anticoagulante (SPS), vácuo e CO2, permitindo assim o desenvolvimento da grande maioria dos microrganismos envolvidos em bacteremias. O número de amostras varia conforme solicitação médica. Quanto maior o número de amostras coletadas, maior será a probabilidade do isolamento do agente etiológico causador da infecção. 2.Amostra Tipo de amostra: Sangue venoso ou arterial. Procedimentos: •Fazer rigorosa assepsia da pele do paciente, utilizando algodão embebido em álcool 70%. Deixar o álcool agir por 1 minuto. •Enquanto isso, friccionar um algodão embebido em álcool 70% na tampa de borracha do frasco de hemocultura. Identificar o frasco. •Puncionar a veia do paciente e coletar o volume de sangue recomendado (5 a10 mL para adultos e 2 a 4 mL para crianças). Transferi-lo imediatamente para o frasco de hemocultura. Enviar o frasco para o setor. •No setor, incubar as amostras e observar uma a uma a cada 24 horas para pesquisa de hemoculturas positivas. •No caso da detecção de hemocultura positiva (por turvação, grumos ou hemólise), proceder da seguinte maneira. Hemoculturas positivas: •Homogeneizar bem a amostra e, com auxílio de uma seringa de insulina, coletar0,1 mL da amostra e transferir uma gota para Agar sangue, Mac Conkey. Incubaras placas a 37oC por 24 horas. Transferir uma gota para preparar lâminas para corar pelo Gram. •Caso haja crescimento, identificar a bactéria com provas bioquímicas e realizar o antibiograma específico para o patógeno isolado. Hemocultura negativas: Devem ser incubadas por 7 dias a 37oC, observando-as a cada 24 horas. Após o término da incubação, liberar o resultado da hemocultura como Negativo.

AULA 10 - CULTURA DE PONTA DE CATETER 1.Princípio Desenvolvimento e quantificação de bactérias, utilizando o Agar sangue. 2.Tipo de amostra


3.Procedimento •Deixar a placa com Agar sangue a temperatura ambiente. •Com auxílio de uma pinça estéril (flambada e resfriada), retirar a ponta de cateter do frasco e rolar o mesmo por toda a extensão da placa (4 a 5vezes) •Incubar a 35oC por 24 horas. •Observar se houve crescimento e, caso positivo, contar o número de unidades formadoras de colônias (UFC) de cada espécie (geralmente cresce um único tipo). •Confeccionar uma lâmina para Gram e proceder a identificação conforme o tipo de bactéria isolada. 4.Interpretação Por estar em contato direto com a corrente sanguínea a colonização da ponta do cateter oferece risco eminente de disseminação destas bactérias para o sangue.Cateteres colonizados por 15 UFC ou mais constituem uma importante fonte de infecção. 5.Modelo de resultado Deve-se relatar a bactéria isolada e o número de UFC encontrado. Exemplo:Microrganismo isolado:Staphylococcus aureus Contagem de colônias: 89 UFC/segmento Ou Não houve desenvolvimento de microrganismos

AULA 10 – CULTURA DE ESCARRO 1.Princípio Crescimento bacteriano em meios de cultura seletivos, diferenciais e enriquecidos, que propiciem o desenvolvimento da maioria dos patógenos de interesse clínico nesse tipo de material. 2.Amostra Escarro Coleta:Expectorar a amostra de maneira que esta seja representativa do trato respiratório inferior Enviar o frasco para o laboratório dentro de 1 hora 3.Material inadequado Amostra contendo muita saliva 4.Metodologia BACTERIOSCOPIA •Observar a presença de leucócitos, células epiteliais e bactérias (fazer o Gram mesmo que o médico não tenha solicitado) •Observar em aumento de 10x. Se for observada uma quantidade superiora 10 células epiteliais e/ou quantidade inferior a 25 leucócitos por campo(observar 10 campos), incluir no laudo a seguinte observação:“Amostra não representativa do trato respiratório inferior. Sugerimos repetir exame, observando rigorosamente as instruções de coleta”. SEMEADURA E ISOLAMENTO Semear em ágar chocolate, Agar sangue e Mac Conkey pela técnica deisolamento. Incubar a 35º C por 24 horas. O Agar chocolate deve ser incubado em tensão de CO 2. Observar o crescimento e fazer uma bacterioscopia (Gram) das colônias de prováveis patógenos e proceder a identificação. 5.Resultados 5.1Interpretação A cultura de escarro é de valor questionável. Isto é devido ao fato deste material ser invariavelmente contaminado por bactérias da microbiota normal do trato respiratório superior.


Por outro lado, o escarro não é o material mais representativo do quadro infeccioso do trato respiratório inferior. A análise microbiológica de outros materiais como lavado brônquico, aspirado traqueal,leva a resultados mais conclusivos. Para contornar o problema de contaminação com bactérias não patogênicas, pesquisar principalmente microrganismos cuja patogenicidade é bem estabelecida neste tipo de material. Dentre estes, os mais freqüentes são: Staphylococcus aureus:++++ Pseudomonas aeruginosa+++ Streptococcus pneumoniae:++ Klebsiella pneumoniae: ++ Haemophilus influenzae: ++ Moraxella catarrhalis: ++ As bactérias acima descritas devem ser pesquisadas primeiramente na cultura do escarro de rotina, exceto quando houver solicitação médica em pacientes gravemente debilitados (ex. em UTIs). Atividade prática: Observe as lâminas de escarro coradas pelo Gram e, de acordo com os critérios acima descritos, classifique essas amostras em adequadas ou inadequadas.Observe cerca de 10 campos em aumento de 10x e faça uma média.

AULA 11 – CULTURA QUANTITATIVA DE ASPIRADO TRAQUEAL 1.Princípio Desenvolvimento e quantificação de bactérias Gram negativas e Gram positivas, utilizando meios de cultura apropriados (Agar sangue, Agarchocolate e Mac Conkey) e um fluidificante. 2.Amostra 2.1 Tipo de amostra Aspirado traqueal 2.2 Coleta Coleta: procedimento médico 2.3Preparo da amostra: BACTERIOSCOPIA Preparar duas lâminas diretamente do material e corar pelo Gram paraavaliar a qualidade da amostra (controle de qualidade interno, resultadonão divulgado). SEMEADURA •Homogeneizar bem a amostra •Misturar 1 mL da amostra com 1 ml de N-acetilcisteína 1%(fluidificante) (Diluição ½) •Da mistura anterior (Diluição ½), adicionar 100 µl mais 900 µl desolução fisiológica estéril e homogeneizar bem (Diluiçã 1/10)Diluição final 1/20 •Inocular 1 µl e semear pela técnica de esteira. (Diluição final:1/20.000)25 •Incubar a 35oC por 24 horas •Observar o crescimento e caso positivo anotar a quantidade decolônias de cada tipo e confeccionar uma lâmina das colônias deinteresse para iniciar a identificação. •Proceder a identificação conforme o tipo de bactéria isolada. 3.Resultados


3.1Interpretação A quantificação de bactérias neste tipo de amostra é importante para estabelecer uma melhor correlação com uma infecção e descartar a probabilidade de uma contaminação pela microbiota normal. Para calcular o número total de colônias por mililitro de amostra, contar todas as colônias e multiplicar por 20.000. (Exemplo: contagem de 50 colônias x20.000 = 1.000.000 UFC/ml) Valor significativo para aspirado traqueal: 106UFC/ml (1.000.000UFC/ml) O resultado será expresso conforme abaixo.: 3.2Modelo de resultado No laudo deve constar a bactéria identificada e o número de colônias contadas.Exemplo:“Desenvolvimento de Klebsiella pneumonia Contagem de colônias: 1.000.000 UFC/ml”.“Não houve desenvolvimento de bactériasContagem de colônias: zero UFC/ml”. 4.Interferentes A presença de contaminantes do trato respiratório superior pode fornecerresultados falso-positivos. Entretanto, nestes casos a contagem de colônias é geralmente baixa

AULA 12 - CULTURA DE LÍQUOR 1.Princípio A meningite aguda é a principal manifestação de infecção do SNC e representa uma emergência médica. Geralmente a concentração de microrganismos no líquor é baixa, daí a importância da concentração da amostra antes do processamento. Por se tratar de um material estéril em condições habituais, qualquer achado no exame bacterioscópico ou cultura deve ser considerado e criteriosamente reportado. 2.Amostra A amostra deve ser coletada em um tubo estéril e encaminhada ao laboratório a temperatura ambiente o mais rápido possível. Dependendo do microrganismo presente, prazos superiores a 1 hora podem ser prejudiciais ao exame. O volume mínimo recomendável para o isolamento de bactérias é1 mL, porém volumes menores podem ser aceitos. Quando houver pedido de citologia e bioquímica, o material deve ser primeiramente encaminhado a bacteriologia e depois aos demais setores.Coleta da amostra: equipe médica especializada 3.Procedimento Avaliar em conjunto com a cultura os parâmetros físico-químicos,citológicos e bioquímicos do líquor. • Transferir a amostra para um tubo estéril. •Centrifugar a 4.000 rpm por 15 minutos. •A partir do sedimento, inocular em Agar chocolate e Agar sangue(pela técnica de isolamento) e prepara lâminas para corar peloGram. •Incubar as placas a 35oC com 5% de CO2por 24-48 horas. •Após período de incubação, observar se há crescimento bacteriano. •Identificar por provas bioquímicas. 4.Resultado O isolamento de qualquer bactéria é forte indício de meningite, entretanto observar a correlação dos achados na cultura com características físico-químicas, bioquímicas e citológicas do líquor é essencial. Liberar no laudo o gênero e espécie do microrganismo isolado. Exemplo de resultado:Cultura de líquor:“Desenvolvimento de Neisseria meningitidis”.


AULA 15 – COLETA DE LINFA DO LÓBULO DA ORELHA E/OU DOBRA DO COTOVELO.

1. Técnica de Coleta de Material para Baciloscopia: •receber o paciente e explicar sobre o exame; •selecionar os sítios de coleta , fazer assepsia; •usar lâminas de vidro novas e limpas , identificá-las com o nome do paciente e olocal da coleta. •demarcar as lâminas do lado que serão feitos os esfregaços; •usar uma lanceta para cada paciente; •fazer boa isquemia com a pinça de Kelly e a incisão, sem sangrar; •colocar o material coletado na lâmina previamente demarcada. Espalharcircularmente e cuidadosamente até obter os esfregaços homogêneos com 1 cmde diâmetro; •Corar as lâminas com Zhiel-Neelsen (BAAR) e observar ao microscópio para pesquisa de bacilos álcool-ácido resistentes

Aula 16:ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS

1 - INTRODUÇÃO: 1.1 - IMPORTÂNCIA DO ESTUDO DOS FUNGOS Os fungos são seres vivos e apresentam uma característica marcante que é a ubiqüidade, ou seja, se encontram amplamente disseminados na natureza, onde desempenham efeitos benéficos (manutenção do equilíbrio dos diversos ecossistemas, participação no ciclo de vida na terra, fertilização do solo, etc.) e maléficos (causando doenças e deteriorando alimentos e materiais) para a humanidade. Ressalta-se também a utilização desses microrganismos em indústrias de alimento e bebidas (queijo, pão, vinho, cerveja, etc.), farmacêutica (antibióticos, hormônios, alucinógenos) e química (enzimas, ácidos orgânicos, vitaminas, pigmentos, etc.). Os fungos são também largamente usados como ferramentas em pesquisa básica de genética, fisiologia, bioquímica, entre outras. O habitat natural desses microrganismos é bastante variado, permitindo classificá-los como anemófilos (fungos do ar), geofílicos ou telúricos (do solo), aquáticos (da água), zoofílicos (de animais), antropofílicos (do homem) e fitofílicos (de vegetais). Portanto, é possível promover o isolamento desses microrganismos de qualquer um destes locais, ou de materiais como madeira, couro, alimentos e detritos de um modo geral. Para isto, é necessário que sejam fornecidas condições ambientais e nutrientes adequados para promover o desenvolvimento destes microrganismos nos meios de cultura. 1.2 - FINALIDADES DO ISOLAMENTO São várias as situações onde se faz necessário o isolamento dos fungos: - Estudo da microbiota fúngica de determinada região. - Avaliação de poluição ambiental. - Determinação do grau de contaminação de determinados ambientes. - Verificação de contaminação de alimentos e medicamentos. - Obtenção de amostras de interesse industrial.


- Diagnóstico etiológico de micoses. - Obtenção de amostras para o preparo de antígenos. - Estudo da correlação de alergia com a presença de fungo no ambiente. 1.3 - OBJETIVO DAS AULAS Apresentar as técnicas mais utilizadas em micologia, discutindo a metodologia de isolamento e identificação de fungos. Para tal, usaremos um modelo de estudo dos fungos anemófilos, que pode ser adaptado para outras investigações. 2 - ISOLAMENTO DOS FUNGOS 2.1 - SEMEADURA EM MEIOS DE CULTURA a) Meio de cultura mais utilizado: Agar Sabouraud Composição química: água, agar-agar, peptona, dextrose ou maltose, pH: ácido (em torno de 5.6) b) Outros meios de cultura utilizados em micologia: - Agar Mycosel - este meio apresenta composição química semelhante ao Agar Sabouraud, porém acrescido de antimicrobianos (Cloranfenicol - antibacteriano e Cicloheximida ou Actidione - inibidor do crescimento de fungos saprófitas), sendo muito utilizado no isolamento de fungos patogênicos. O Agar Mycosel é um meio seletivo para isolamento de fungos patogênicos. - DTM - meio seletivo e indicador utilizado no isolamento de dermatófitos. - Czapeck-Dox - utilizado no isolamento de fungos presentes em escarro e outras secreções ( tem substâncias que fluidificam o muco). - Chlamydospore agar - utilizado para induzir a formação de clamidosporos. - Agar fubá, agar arroz, agar batata - meios pobres, mas ricos em carboidratos que estimulam a esporulação, sendo usados no microcultivo 8.2 - CONDIÇÕES DE INCUBAÇÃO: - Temperatura: - ambiente - para os fungos dimórficos: 1 tubo a 37ºC e outro à temperatura ambiente. - Atmosfera: aerobiose - Tempo: fungos saprófitas - em torno de 3 dias ( 3 a 7 dias) fungos patogênicos - de 5 a 30 dias 2.3 - ACOMPANHAMENTO DO DESENVOLVIMENTO E ANÁLISE DA COLÔNIA 3 - IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS A identificação dos fungos se baseia principalmente em características morfológicas (macro e microscópicas), reprodutivas e metabólicas. 3.1 - CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS Na análise da morfologia colonial várias características devem ser observadas como: aspecto da colônia, cor, bordos, superfície, consistência, presença de protuberância e sulcos. 3.2 - CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS Nesta observação devemos analisar não apenas a micromorfologia como também aspectos relacionados à reprodução dos fungos. Verifica-se, portanto, se o microrganismo é uni ou multicelular, a forma e tamanho das células, a presença de hifas, de células leveduriformes e de pseudo-hifa, se a hifa é septada ou cenocítica, a presença de estruturas facultativas (cápsula, rizóides e haustórios), o tipo de reprodução e o aspecto dos esporos e do corpo de frutificação. 3.3 - CARACTERÍSTICAS METABÓLICAS (OU BIOQUÍMICAS)


São várias as provas de identificação de fungos que se baseiam em aspectos metabólicos. Dentre elas podemos citar o zimograma (prova de fermentação de carboidratos), o auxanograma (prova de assimilação de carboidratos e de compostos nitrogenados) e pesquisa de enzimas (urease, por exemplo). Estas provas bioquímicas (principalmente zimograma e auxanograma) são indispensáveis na identificação de leveduras. 3.4 - OUTRAS PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO . Tubo germinativo . Termotolerância . Dimorfismo . Perfuração do pêlo . Sensibilidade à cicloheximida 4 - TIPOS DE EXAMES MICROSCÓPICOS: 4.1 - COLORAÇÃO DE GRAM Esta coloração, muito utilizada na bacteriologia, permite também a observação microscópica dos fungos, desde que a colônia ou o material a ser analisado permita a confecção e fixação de esfregaço, conforme recomendado para tal método. Os fungos são Gram positivos, ou seja, se coram de roxo. 4.2 - TRATAMENTO PELA POTASSA ( KOH ) Este é o procedimento mais utilizado para exame direto de espécimes clínicos (escamas de pele, pêlos, fragmentos de unha, escarro, secreções, etc.). O hidróxido de potássio (usado em concentrações de 20 a 40%) é uma substância clareadora que digere os elementos tissulares, permitindo uma melhor visualização das estruturas fúngicas (hifas, células leveduriformes, esporos). 35 4.3 - COLORAÇÃO COM TINTA NANQUIM A tinta nanquim ou tinta da China é um corante utilizado para verificação da presença de cápsula (que não se cora). Ex: Cryptococcus neoformans, Rhodotorula. 4.4 - COLORAÇÃO COM LACTOFENOL DE AMANN OU AZUL DE ALGODÃO O lactofenol é o corante mais utilizado para observação microscópica de fungos, após o seu desenvolvimento em meios de cultura. Na sua composição química encontramos: água, fenol, ácido lático,glicerina e azul de algodão (ou de metila). O estudo da micromorfologia dos fungos, corado pelo lactofenol, pode ser realizado basicamente através de 2 técnicas: retirada de fragmentos de colônia e o microcultivo. A técnica do microcultivo (ou cultura em lâmina) pode ser realizada em uma placa de Petri contendo uma lâmina sobre um suporte de vidro. Esta vidraria é previamente esterilizada e sobre a lâmina coloca-se um bloco (um cubo) do meio de cultura. Geralmente se usa o agar batata para o estudo dos bolores e agar fubá para leveduras. O fungo a ser analisado é então repicado para o pedaço de meio de cultura e coberto com lamínula. Para se criar um ambiente úmido, coloca-se um pouco de água destilada estéril dentro da placa, que é incubada à temperatura ambiente. Após 15 dias, ou quando houver um bom desenvolvimento dofungo no meio de cultura (inclusive na lamínula), retira-se a lamínula que deverá ser colocada sobre uma outra lâmina com 1 gota de lactofenol e observada ao microscópio, no menor, médio e maior aumento. 4.5 - EXAME COM FITA DUREX Esta técnica permite a colheita de material e observação microscópica de casos de pitiríase versicolor (micose de pele causada pela levedura Malassezia furfur). 4.6 - EXAME HISTOPATOLÓGICO


Os exames histopatológicos são de grande relevância no diagnóstico de doenças infecciosas e permitem a detecção de fungos nos tecidos. 5- ATIVIDADES A SEREM DESENVOLVIDAS NAS AULAS PRÁTICAS SOBRE ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS ANEMÓFILOS . Observação de exposição sobre fungos . Descrição da morfologia colonial: Os alunos deverão observar todas as colônias expostas, procurando analisar as semelhanças e diferenças entre os mesmos tipos morfológicos. A seguir, escolher uma colônia de bolor e uma de levedura e anotar as principais características de cada uma, fazendo a diferenciação entre elas. A tabela de identificação macromorfológica dos fungos (em anexo) poderá servir de base para tal descrição. . Observação da micromorfologia Os alunos deverão fazer observação microscópica dos fungos focalizados, analisando as características e diferenças de micélio, órgãos de reprodução (corpo de frutificação) e esporos. Anotar (ou desenhar) as características observadas. Correlacionar os dados da micromorfologia dos fungos focalizados com os tipos expostos em culturas. Muitos fungos expostos nas culturas estão igualmente focalizados nos microscópios. Coleta de material Os alunos deverão escolher um ambiente para investigar a presença de fungos anemófilos. Neste local, as placas de Petri contendo agar Sabouraud deverão ser abertas e expostas ao ar, por aproximadamente 15 minutos. Em seguida, as placas serão fechadas, identificadas e incubadas à temperatura ambiente. . Acompanhamento do desenvolvimento de colônias Os alunos deverão retornar ao laboratório todos os dias para acompanhar o experimento e verificar se está havendo crescimento de colônias de fungos na superfície dos meios de cultura. Anotar o tempo de crescimento, o número e variedade de colônias. Comparar com a de outros colegas e tentar determinar possíveis diferenças ou semelhanças. . Descrição da morfologia colonial: ( dos isolados em sua placa): Após o desenvolvimento dos fungos no meio de cultura, escolher uma colônia e descrever a sua macromorfologia. . Descrição da micromorfologia: A colônia de fungo anemófilo escolhida será agora analisada sob o aspecto microscópico, utilizando a técnica de fragmento de colônia. Com a agulha de platina flambada e fria, raspar a superfície da colônia escolhida para obter pequenos fragmentos. Estes serão colocados sobre uma lâmina, juntamente com 1 gota de lactofenol e cobertos por lamínula. Em seguida, observar ao microscópio no menor, médio e maior aumento. Anotar (ou desenhar) as características observadas. Estes dados poderão permitir a identificação do fungo escolhido. . DESCRIÇÃO FINAL DO FUNGO ESCOLHIDO: Baseando-se na análise da macro e micromorfologia do fungo por sua equipe escolhido, dê sua descrição final, e se possível, o gênero a que este fungo pertence.


TABELA DE IDENTIFICAÇÃO MACROMORFOLÓGICA DOS FUNGOS 1- Micélio ( aspecto macroscópico ): ( ) leveduriforme (levedura) ( ) filamentoso (bolor) ( ) aéreo ( o que se projeta acima do meio de cultura) ( ) rasteiro (o que cresce sobre ou abaixo do meio de cultura) 2- Cor da colônia: ......................................................................... 3- Presença de pigmento: ( reverso da colônia - verso da placa) .............................................................. 4- Bordos: ( ) inteiro ( ) franjado ( ) liso ( ) ondulado ( ) encrespado ( ) arredondado 5- Superfície: ( ) lisa ( ) rugosa ( ) cerebriforme ( ) coriácea ( ) algodonosa ( ) mucóide ( ) cremosa ( ) concêntrica ( ) opaca ( ) aveludada ( ) brilhante ( ) pulverulenta ( ) pastosa 6- Sulcos: ( ) presentes ( ) ausentes 7- Tipo: ( ) seca ( ) úmida 8- Protuberância central: ( ) presente ( ) ausente 9- Elevação: ( ) achatada ( ) levantada ( ) amontoada 10- Reverso da colônia: ............................................................................................................................. 11- Morfologia colonial final após a identificação: ............................................................................................................................................................ ............................................................................................................................................................ ............................................................................................................................................................ ............................................................................................................................................................ OBS: Esta tabela tem por finalidade orientá-lo na verificação das principais características macromorfológicas que deverão ser observadas. Entretanto, não significa que a colônia que você deseja identificar tenha todos os itens descritos acima, e além disto, para cada item poderá ser observada mais de uma característica. (por exemplo: a superfície de uma colônia poderá ser ao mesmo tempo: lisa, pastosa e brilhante).

Documents

Apostila Microbiologia UESB