Apostila Microbiologia 2014-2 Engenharia Ambiental

8/16/2019 Apostila Microbiologia 2014-2 Engenharia Ambiental

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA AMBIENTAL

DEA 07785 – LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA E ECOTOXICOLOGIA

Profa. Regina de Pinho Keller

Prof. Sérvio Túlio Alves Cassini

Prof. Celson Rodrigues

Prof. Paulo Wagnner

Professores de Microbiologia

Larissa Lopes Roldi

Auxiliar Técnica


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Sumário

NORMAS DE SEGURANÇA PARA AS AULAS PRÁTICAS: ............................................................... 3

CONCEITOS BÁSICOS DE DESINFECÇÃO E ESTERILIZAÇÃO: ..................................................... 4

COMO TRABALHAR COM MICROSCÓPIO ....................................................................................... 5

COMO PREPARAR O RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS ............................................................... 7

AULA PRÁTICA I ................................................................................................................................. 8

MEIOS DE CULTURA, TÉCNICAS DE SEMEADURA E ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS

AMBIENTAIS ....................................................................................................................................... 8

PARTE 01 – ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS A PARTIR DE AMOSTRAS AMBIENTAIS DIVERSAS10

PARTE 02 – ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS A PARTIR DE AMOSTRAS AMBIENTAIS E

CULTURAS PURAS PELA TÉCNICA DE ESTRIAMENTO ............................................................... 10

AULA PRÁTICA II .............................................................................................................................. 12

ISOLAMENTO DE FUNGOS A PARTIR DE AMOSTRAS AMBIENTAIS ........................................... 12

AULA PRÁTICA III ............................................................................................................................. 16

DETECÇÃO DE INDICADORES DE POLUIÇÃO FECAL EM ÁGUAS (MÉTODO

CROMOFLUOROGÊNICO) ............................................................................................................... 16

.......................................................................................................................................................... 19

AULA PRÁTICA V ............................................................................................................................. 20

IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS (MÉTODO DA COLORAÇÃO DE GRAM)................................... 20

AULA PRÁTICA VI ............................................................................................................................ 23

IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS POR TESTES BIOQUÍMICOS .................................................... 23

AULA PRÁTICA VII ........................................................................................................................... 25

DESINFECÇÃO MICROBIANA COM AGENTES FÍSICOS E QUÍMICOS ......................................... 25

PARTE 01 – DESINFECÇÃO COM AGENTES FÍSICOS .................................................................. 25

PARTE 02 – DESINFECÇÃO COM AGENTES QUÍMICOS .............................................................. 26

AULA PRÁTICA VIII .......................................................................................................................... 28

TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS – TSA (Antibiograma) ................................ 28

AULA PRÁTICA IX ............................................................................................................................ 30

ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS COM BACTÉRIAS Vibrio fischeri ................................................ 30


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DEA 07785 - LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA E ECOTOXICIDADE

As aulas práticas de Microbiologia e Ecotoxicologia têm como objetivo ensinar os princípios gerais e métodos

utilizados nessa área de estudo. Nestas aulas teremos contato com uma variedade de bactérias, sendo algumas

delas, patogênicas para o homem, portanto é essencial que as normas sejam seguidas a fim de se evitar

contaminações acidentais.

NORMAS DE SEGURANÇA PARA AS AULAS PRÁTICAS:

Cuidados Pessoais:

→ É indispensável o uso de JALECO no laboratório, que deve ser de mangas compridas e estar abotoado;

→ Não comer (inclusive balas e chicletes), beber e fumar no laboratório;

→ Cabelos longos devem ser amarrados de forma a não interferir com reagentes e equipamentos;

→ Todo o material pessoal (bolsas, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser mantido longe das bancadas de trabalho;

→ Utilizar na bancada somente o material necessário ao trabalho prático: roteiro de aula e caneta para anotações;

→ Evitar a desordem do ambiente e prestar atenção às atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes e/ou

a contaminação indevida dos materiais esterilizados;

→ Em caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas, ferimentos, aspiração de culturas,

etc), comunicar imediatamente o professor ou o técnico responsável pela aula.

Descarte de material:

→ Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes próprios, existentes nos laboratórios. NUNCA deixá-los dispostos diretamente sobre bancadas ou pias;

→ Placas de petri, contaminadas ou não, deverão permanecer tampadas sobre a bancada;

→ Lâminas fornecidas para visualização deverão ser colocadas em recipiente próprio para posterior

descontaminação;

→ Tubos com culturas deverão ser devolvidos para as estantes.

Terminados os trabalhos práticos:

→ Esterilizar alças e fios de platina;

→ Após as aulas, as culturas de microorganismos deverão ser descontaminadas antes de serem descartadas;

→ Verificar se as torneiras de água e gás estão fechadas;

→ Limpar microscópios e cobri-los com a capa;

→ Desligar lâmpadas e microscópios;

→ Retirar as luvas e descartar em lixo próprio;→ Tirar o jaleco e guardar;

→ Lavar cuidadosamente as mãos com água e sabão ou antisséptico.


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CONCEITOS BÁSICOS DE DESINFECÇÃO E ESTERILIZAÇÃO:

A condição sanitária de uma dada população humana é determinada, em larga escala, por sua capacidade de

controlar eficazmente as populações microbianas. Os processos podem ser específicos, como o uso de

medicação capaz de eliminar os microrganismos infectantes, ou podem ser mais gerais, como as práticas

sanitárias de assepsia. As principais razões para desenvolver o controle de microrganismos são, em resumo:

1) prevenir a transmissão de doenças e infecções;

2) prevenir a contaminação ou crescimento de microrganismos nocivos

3) prevenir a deterioração e dano de materiais por microrganismos.

Os microrganismos podem ser removidos, inibidos ou mortos por agentes físicos ou químicos. Uma grande

variedade de técnicas e de agentes pode ser utilizada, agindo de modos diferentes e tendo seu próprio limite de

aplicação prática. Os termos a seguir são usados para descrever os processos físicos e os agentes químicos

destinados ao controle dos microrganismos:

ESTERILIZAÇÃO: Processo de destruição total ou remoção de todas as formas de vida de um material ou

ambiente, através de métodos físicos ou químicos. Do ponto de vista microbiológico, um material estéril está

completamente livre de todos os microrganismos.

DESINFECÇÃO: Consiste na destruição, remoção ou redução dos microrganismos presentes num material

inanimado. Visa eliminar a potencialidade infecciosa do objeto, superfície ou local.

ASSEPSIA: Procedimentos que visam evitar o retorno da contaminação a um objeto, superfície ou local.

ANTI-SEPSSIA: Previne o crescimento ou ação dos microrganismos. Em geral, a desinfecção ocorre em tecidosvivos, como pele e mucosas.

BACTERICIDA: é um agente que mata as bactérias. De modo similar, os termos: fungicida, viricida e

esporocida se referem aos agentes que matam os fungos, vírus e esporos, respectivamente. As formas

esporuladas não são necessariamente eliminadas por estes agentes.

LIMPEZA: Remoção de sujidades que indispensavelmente antecede os procedimentos de desinfecção ou

esterilização.


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COMO TRABALHAR COM MICROSCÓPIO

Em primeiro lugar é essencial que você conheça as partes ópticas e mecânicas dos microscópios:

- Mantenha o microscópio livre de poeira, vapores ácidos e do contato com reagentes. Para mantê-lo seco, cubra

com capa de flanela, pois evita o pó e a multiplicação de fungos Obs: as capas devem ser lavadasperiodicamente;

- Fazer a assepsia das luvas ou das mãos para manusear o microscópio;

- Não manusear o equipamento com as mãos sujas ou molhadas;

- Na remoção do equipamento, segure-o firmemente com uma das mãos no braço e outra na base, ou com as

duas no braço, a depender do modelo. Coloque-o bem apoiado sobre a mesa de trabalho de superfície plana,

evitando qualquer movimentação brusca. Nunca desloque o aparelho com a lâmpada acesa ou logo após ter

sido apagada;

- Muita atenção é necessária quando se observa a preparação em meio líquido, pois há sempre o risco de molhar

a lente frontal da objetiva; portanto o conselho é retirar o excesso de líquido com papel de filtro, antes de colocar

a lâmina sobre a platina; em caso de acidente, enxugar imediatamente com papel absorvente macio;


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UTILIZAÇÃO DAS LENTES

Na observação de uma preparação, inicie sempre pela objetiva de menor aumento; para focalizar

com aquelas de 20 ou 40 vezes, proceda da seguinte forma:

- Escolha uma estrutura na preparação, movendo a lâmina através do charriot até que o objeto fique exatamente

no centro do campo, mesmo que embaçado;

- Olhe pela ocular e eleve a mesa de platina com o ajuste macrométrico lentamente. Assim que a imagem

aparecer, mesmo confusa, pare e complete a focalização com o ajuste micrométrico.

A LENTE OBJETIVA DE IMERSÃO

- É a lente de maior aumento (100x) e seu uso é mais delicado, pois a distância focal entre a face da objetiva e a

parte superior da lamínula diminui quando a ampliação é aumentada.

- Em primeiro lugar, assegure-se da existência de algo no campo, posicionando a objetiva de menor aumento.

- Certifique-se que a iluminação e o objeto estão bem centrados, posicione o revólver entre uma lente e outra ecoloque uma gota de óleo no centro da operação. O óleo deve ter o mesmo índice de refração da lente objetiva;

- Coloque a lente objetiva de imersão em contato com a gota de óleo ainda convexa, até a mudança de forma da

mesma. Posicione os olhos nas oculares e complete a focalização com o micrométrico.


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COMO PREPARAR O RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS

PÁGINA 01:

PÁGINAS SEGUINTES:

Introdução – Pequeno parágrafo introduzindo o leitor para o assunto que vai ser apresentado no relatório.

Objetivos – Descrever os objetivos da aula prática.

Resultados e Discussão – Apresentar os resultados na forma de esquemas, fotos, desenhos, figuras, tabelas,

gráficos e etc. Discutir os resultados obtidos utilizando informações obtidas em livros-texto e artigos científicos.

Evitar o uso de referências obtidas em sites não científicos da internet.

Conclusão – Concluir o trabalho apresentado com base no que foi proposto nos objetivos da prática.


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AULA PRÁTICA I

MEIOS DE CULTURA, TÉCNICAS DE SEMEADURA E ISOLAMENTO DE

MICRORGANISMOS AMBIENTAIS

I.INTRODUÇÃOO estudo de microrganismos exige o prévio isolamento e identificação e, para isso, são utilizados diversos meios

de cultura. Estes meios são misturas de nutrientes que possibilitam o crescimento e multiplicação in vitro dos

microrganismos. Em geral, os meios devem dispor de fontes de carbono (carboidratos) e fontes de nitrogênio

(proteínas) como requisitos mínimos para que os microrganismos possam sintetizar a sua própria energia. São

também necessários alguns sais inorgânicos e vitaminas.

Os meios de cultura podem ser classificados, basicamente, quanto à consistência (Líquidos, Semissólidos e

Sólidos) e quanto à função (Simples, Enriquecimento, Seletivo, Diferencial, Manutenção). E quanto ao seu

preparo, os meios de cultivo devem ser preparados e armazenados seguindo um rigoroso controle de qualidade.Toda a manipulação realizada em laboratório (com meios, cultura e material utilizado) requer certos cuidados

para evitar a contaminação. Esses procedimentos formam um conjunto de técnicas assépticas.

A inoculação é a contaminação proposital de um meio de cultura, ou seja, é a transferência de microrganismos

para um meio de cultura a fim de que estes se desenvolvam possibilitando sua identificação. A inoculação em

diferentes meios envolve diferentes técnicas de semeadura. Técnica de semeadura é o método pelo qual são

transferidos inóculos microbianos de um meio de cultura, ou do material a ser analisado (ex: secreções, alimentos

e etc.), para outro meio de cultura. A escolha da técnica para o cultivo de microrganismos varia de acordo com o

tipo de meio de cultura e a finalidade do cultivo.

Os meios de cultura, em geral, depois de preparados, são distribuídos em tubos de ensaio ou placas de Petri.

Para o preparo de um meio de cultura mínimo em tubos de ensaios, basta pesar os componentes do meio de

cultura (Tabela 01) e hidrata-los com H2O destilada, até volume final desejado. Em seguida, realiza-se a completa

dissolução dos componentes, por agitação ou aquecimento, e esterilização.

Tabela 01. Funções e massas dos componentes a serem pesados para o preparo de 1L de ágar nutriente.

COMPONENTES FUNCÕES g

Extrato de Carne Carboidratos, compostos nitrogenados, vitaminas, sais. 3,0

Peptona Nitrogênio orgânico, algumas vitaminas 5,0

NaCl Íons e requerimento osmótico 8,0

Agar Solidificar 15,0

Após a completa dissolução dos componentes, o meio é distribuído nos tubos de ensaio, que em seguida são

tampados com algodão e colocados na posição vertical dentro de um recipiente, que é então fechado e

autoclavado para a esterilização do material. Em seguida os tubos são distribuídos sobre a bancada na posição

inclinada, para a solidificação do meio. É importante observar a posição do agar, este deve ocupar o terço inferior

do tubo.


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À semelhança do preparo dos tubos, para o preparo do meio mínimo em placas de Petri, os componentes da

tabela acima são pesados e hidratados com H2O destilada, até a completa dissolução em um erlenmayer,

conforme o item anterior. Em seguida o erlenmayer é fechado com papel e autoclavado. Após a esterilização do

meio é realizada a distribuição do meio pronto em placas previamente esterilizadas, ou em placas descartáveis

estéreis.

ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS

O isolamento de bactérias consiste na obtenção de culturas chamadas puras, que contêm apenas os

microrganismos de interesse. Trata-se de um importante passo na determinação correta do microrganismo, pois

somente em colônias isoladas é que se consegue aplicar testes de identificação relacionados com a morfologia

da colônia ou com a produção de um produto específico.

Apesar da possibilidade de se utilizar microrganismos geneticamente modificados, ainda é possível encontrar

uma grande variedade de novos microrganismos no meio ambiente, sendo que muitos podem ser de alto interesse

comercial. A primeira etapa para a utilização destes microrganismos é a etapa de isolamento de uma colônia, já

que todo o seu estudo é dependente da possibilidade de cultivar e manter estes microrganismos viáveis em

laboratórios, através das culturas puras.

O metabolismo e as necessidades nutricionais específicas dos microrganismos variam de espécie para espécie,

sendo possível distinguir vários grupos de microrganismos, de acordo com o conhecimento, por exemplo, dos

nutrientes necessários para o seu crescimento ou pelos produtos específicos liberados ou consumidos durante o

metabolismo. Com o conhecimento destas particularidades é possível formular meios de cultura que promovam

o crescimento de um determinado microrganismo ou grupo de microrganismo no laboratório.

O isolamento se inicia com a escolha da fonte mais provável de conter o microrganismo desejado como solo,

água, ar, lodo, alimentos, partes do corpo, dentre outras fontes. Em seguida, as características específicas queum organismo possui para se desenvolver em certo ambiente são usadas como fatores seletivos no processo de

isolamento. A pressão seletiva é utilizada no isolamento de microrganismos que se desenvolvem

preferencialmente em determinados substratos, na presença de certos compostos ou no cultivo sob condições

que são adversas a outros microrganismos que não são de interesse.

Ao final da prática, os alunos devem ter adquirido habilidades relacionadas ao procedimento de semeadura dos

microrganismos em o meio de cultura, bem como, a aplicação de técnicas de isolamento por estrias.

II.MATERIAIS

- Tubos de ensaio esterilizados - Erlenmeyer esterilizado - Swab estéril

- Placas de Petri esterilizadas - Alças de semeadura - Lamparinas

- Água destilada esterilizada - Culturas de bactérias - Tubos com meio de culturaestéril

- Salina esterilizada - Placas com meio de culturaestéril


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III.METODOLOGIA

PARTE 01 – ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS A PARTIR DE AMOSTRAS AMBIENTAIS DIVERSAS

- Identifique as placas contendo meio de cultura estéril de acordo com o grupo, data e tipo de amostra;

- Com uma caneta própria, faça uma divisão da placa em quadrantes desenhando no vidro da placa que contém

o ágar;- Com o auxílio de um swab umedecido em salina, colete amostras de superfícies diversas, ex: couro cabeludo,

celular, mochila, torneiras, maçanetas, etc;

- Remova a tampa da placa e, genti lmente, passe o swab pela superfície do ágar no quadrante determinado para

cada amostra coletada;

Amostra 1: ___________________

Amostra 2: ___________________

Amostra 3: ___________________

Amostra 4: ___________________

- Cubra a placa com filme plástico e incube a 37ºC por 48 horas ou em temperatura ambiente por 7 dias.

- Uma placa aberta será disposta sobre a bancada durante a prática por 15 min para que seja coletada amostra

do ar ambiente;

OBS: As placas deverão ser incubadas invertidas para evitar que o meio se desidrate e que a água de

condensação caia sobre o meio.

- Após a incubação, retire as placas da estufa e observe o crescimento bacteriano nas diferentes áreas da placa.

PARTE 02 – ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS A PARTIR DE AMOSTRAS AMBIENTAIS E CULTURAS

PURAS PELA TÉCNICA DE ESTRIAMENTO

O isolamento de bactérias em meios de cultura sólidos é realizado por meio de técnicas de estriamento, que

consistem no espalhamento de inóculos bacterianos na superfície do meio de cultura em diferentes direções e

de maneira organizada, de acordo com a disposição do meio. Nesta parte da aula deverão ser realizados

estriamentos, em tubos de ensaio e placas de Petri, de acordo com o representado nas figuras abaixo.


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2.1 AMOSTRAS AMBIENTAIS

- Identificar dois tubos contendo meio de cultura estéril de acordo com o grupo, data e tipo de amostra;

- Para o isolamento de bactérias provenientes de amostras ambientais serão utilizadas duas amostras, sendo

uma líquida e uma sólida;

- Em cada tubo de ensaio contendo meio de cultura inclinado, remova a tampa de algodão, próximo do bico de

Bunsen e realize estrias com auxílio da alça de repicagem;AMOSTRA LÍQUIDA: ______________: Mergulhe a alça no líquido e, com cuidado, realize o estriamento como

mostra a figura anterior;

AMOSTRA SÓLIDA: _______________: Misture a amostra sólida em água esterilizada e retire uma alíquota com

a ponta da alça de repicagem e realize o estriamento de acordo com o indicado na figura anterior;

- Incube os tubos a 37ºC por 48 horas ou a temperatura ambiente por 7 dias;

- Após a incubação, retire os tubos da estufa e observe o crescimento bacteriano nas diferentes áreas do tubo.

2.2 CULTURAS PURAS

ESTRIAMENTO EM PLACAS DE PETRI

- Identifique duas placas de Petri contendo meio de cultura estéril de acordo com o grupo, a data e tipo de amostra;

- Todo o procedimento deve ser feito próximo à lamparina;

- Com uma alça previamente esterilizada, toque numa das colônias escolhidas com a ponta do alça e semeie em

placa de Agar nutriente seguindo os movimentos de estriamento, conforme se observa na figura abaixo;

- Após a primeira estria, flambe a alça e gire a placa cerca de 90˚ para puxar a nova estria. Repita esse passo

pelo menos mais 1 vez;

- Lembre-se de que a quantidade de material a ser inoculada deve ser mínima, caso contrário, pode haver a

justaposição das colônias impossibilitando seu isolamento;

- Após a semeadura, inverter as placas e incubá-las a 30-37°C, por 48 horas, ou à temperatura ambiente por até

7 dias.

ESTRIAMENTO EM TUBOS DE ENSAIO

- Identifique dois tubos de ensaio contendo meio de cultura estéril de acordo com o grupo, a data e o tipo deamostra;

- Todo o procedimento deve ser feito próximo à lamparina;

- Com uma alça previamente esterilizada, toque numa das colônias escolhidas da cultura com a ponta do alça e

semeie no tubo de Agar nutriente fazendo movimento de estria do fundo do tubo para sua superfície, de acordo

com o mostrado anteriormente;

- Após a semeadura, incubar os tubos a 30-37°C, por 48 horas, ou à temperatura ambiente por até 7 dias.


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AULA PRÁTICA II

ISOLAMENTO DE FUNGOS A PARTIR DE AMOSTRAS AMBIENTAIS

I.INTRODUÇÃO

Os fungos são microrganismos unicelulares (leveduras) ou multicelulares (filamentosos), formados por células

eucarióticas, podendo apresentar reprodução sexuada (forma teleomórfica), reprodução assexuada (formaanamórfica), ou ambas. São aclorofilados, heterotróficos (quimiorganotróficos), portanto incapazes de realizar

fotossíntese ou sintetizar a matéria a partir de elementos simples. A nutrição dos fungos ocorre por absorção,

através da liberação de exoenzimas sobre o substrato, cujas moléculas são “quebradas” em formas mais simples,

ocorrendo a absorção por qualquer parte do sistema vegetativo ou por estruturas especiais. Os fungos necessitam

de C, N, P, K, Ca e Mg, além dos micronutrientes. De modo geral são aeróbios (filamentosos), entretanto alguns

estão envolvidos nos processos fermentativos (leveduras). A temperatura de crescimento varia entre 0 a 35 oC,

sendo a maioria mesófilos. O pH varia entre 3-8, mas normalmente toleram pH ácido. Sob o ponto de vista

morfológico, as formas filamentosas apresentam as células tubulares, denominadas de hifas, sendo o conjunto

de hifas denominadas de micélio. As hifas podem ser contínuas, simples ou ramificadas, sendo também não

septadas (cenocíticas) ou septadas (apocíticas) e constituem a estrutura somática ou vegetativa dos fungos. A

estrutura reprodutiva normalmente corresponde aos esporos, com morfologia extremamente variada, de acordo

com a espécie. Quando isolados em meio de cultura apropriado os fungos formam colônias cujo crescimento é

concêntrico (crescimento em diâmetro e indeterminado).

Os fungos exercem uma função crítica importante e contínua no ambiente: reciclam a matéria orgânica que muitas

vezes se constitui num poluente e/ou contendo nutrientes em formas não aproveitáveis pelos outros organismos.

O fungo atua na matéria viva (parasita, em humanos, animais ou plantas), na matéria morta (saprófitos) ou na

matéria viva inicialmente (biotróficos) e continua a decompor depois de morta (necrotrófico) ou ainda quando

parasita outros fungos (hiperparasita). Quando causa a morte do hospedeiro denomina-se de parasitóide. Fungos

podem ser parasitas obrigatórios (não cultivado in vitro ) ou facultativos (sapróbios/ parasitas). Alguns fungos

podem formar associações com plantas (micorrizas) ou com algas (líquenes) ou são utilizados como alimentos

(cogumelos) ou em processos biotecnológicos e ou em biorremediação ambiental.

O isolamento de fungos em meio de cultura permite a obtenção de culturas pura, pré-requisito para sua

caracterização, identificação e utilização em inúmeras atividades científicas e tecnológicas, dependendo da

finalidade. Deve assim, nos seus aspectos mais simples e básicos, ser de conhecimento dos estudantes de

graduação em Engenharia Ambiental e, portanto, ao final da prática, os alunos devem ter adquirido habilidadesrelacionadas ao procedimento de isolamento de fungos a partir de amostras ambientais: sólidas e líquidas, pelo

método de diluição em placas e em tecido vegetal necrosado, pelos métodos de isolamento direto e indireto.

II.MATERIAIS

- Amostras ambientais (terriço e tecidos vegetais necrosados por fungos);

- Placas de Petri com o meio de cultura Sabouraud Dextrose Ágar + Antibióticos (SDA+A) (80 placas);

- A = Sulfato de estreptomicina e Cloranfenicol (250 mg de cada/litro de meio de cultura);

- Solução de Hipoclorito de Sódio 1% (500 mL);

- Peneiras (duas); canetas vitrográficas (duas); filme plástico transparente;


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- Tubos de ensaio, contendo o meio de cultura (SDA+A) (80 tubos); erlenmyers de 250 mL esterilizados (40);

pipetas de vidro esterilizadas, de 10 mL e de 5 mL (20 de cada); micropipeta para 100 µL (ponteiras estéreis).

- Pinças, estiletes metálicos de ponta fina, alças microbiológicas descartáveis, alças de Drigalski (“rodinho”),

lâminas, lamínulas para microscopia e lactofenol (dois frascos com 50 mL);

III.METODOLOGIA

III.1.ISOLAMENTO A PARTIR DE TERRIÇO (MÉTODO DE DILUIÇÃO EM PLACAS)

01. Coletar cinco (5) subamostras de solo (terriço), fazer uma amostra composta, misturando rigorosamente,

peneirar e secar à temperatura ambiente por 7 dias.

02. Retirar 5 g do solo seco ao ar, colocar em um erlenmyer de 250 mL, acrescentar 50 mL de água destilada

esterilizada (diluição 1:10) e agitar em shaker durante 10 minutos, a 150 rpm (agitação mecânica).

03. Transferir, utilizando pipeta esterilizada, 10 mL da suspensão para 90 mL de água esteri lizada (diluição 1:100),

em erlenmyer de 250 mL, e agitar brevemente (agitação manual).

04. A partir da suspensão anterior (diluição 1:100), transferir 1 mL, utilizando pipeta esterilizada, para 100 mL de

água destilada esterilizada (diluição 1:10.000 = 10-4) em um terceiro erlenmyer de 250 mL.

05. Transferir 0,1 mL da suspensão anterior (diluição 1:10.000 = 10-4), utilizando micropipeta com ponteira estéril,

para o centro de uma placa de Petri contendo o meio de cultura SDA+A e espalhar com uma alça de vidro (alça

de Drigalski). Esta etapa deve ser realizada trabalhando próximo à chama de um bico de Bunsen.

06. Proceder à identificação da placa preparada (amostra, responsável e data).

07. Aplicar uma fita de PVC, parafilme ou equivalente sobre toda a lateral da placa ou sobre toda a placa (para

evitar a desidratação rápida do meio). Incubar em BOD a 28°C ou em condições ambientais de laboratório

(bancada), em local reservado para tal, durante 7 dias.

08. Após a incubação, para quantificação, contar as colônias fúngicas desenvolvidas na placa e multiplicar o

número médio de colônias pelo fator de diluição, obtendo-se o número por grama da amostra original.

III.2.ISOLAMENTO DE FUNGOS A PARTIR DE TECIDOS VEGETAIS NECROSADOS

III.2.1. ISOLAMENTO DIRETO

01. Selecionar tecido vegetal que apresente esporulação fúngica sobre as lesões (necroses), visíveis à olho nuou sob microscópio estereoscópico.

02. Pegar uma placa de Petri contendo o meio de cultura SDA+A e com caneta vitrográfica marcar cinco pequenos

círculos equidistantes seu fundo.

03. Deslizar uma alça microbiológica descartável (esterilizada) sobre o local esporulado no tecido vegetal

necrosado e, em seguida, abrindo o mínimo possível a placa de Petri, transferir o conteúdo (esporos fúngicos)

para um dos círculos marcados. Repetir o procedimento para os demais círculos. Nesta etapa, todo o trabalho

deve ser conduzido próximo à chama de um bico de Bunsen.



evitar a desidratação rápida do meio).


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06. Incubar em BOD a 28°C ou em condições ambientais de laboratório (bancada), em local reservado para tal,

durante 7 dias.

III.2.1. ISOLAMENTO INDIRETO

01. Lavar, com água de torneira, o tecido vegetal necrosado.

02. Cortar com bisturi, lâmina de barbear inoxidável ou tesoura, fragmentos vegetais correspondentes aos bordos

das lesões necróticas do vegetal.

03. Colocar os fragmentos dentro de placa com hipoclorito de sódio a 1%, por 2 minutos.

04. Transferir, utilizando uma pinça previamente flambada e resfriada, os fragmentos para uma placa de Petri

contendo água destilada esterilizada (remoção do excesso de hipoclorito).

05. Transferir cinco fragmentos da placa com água, para outra placa de Petri contendo o meio de cultura SDA+A,

distribuindo-os de forma pentagonal e distanciados de aproximadamente 2 cm dos bordos da placa. Esta etapa

deve ser trabalhada próximo à chama de um bico de Bunsen.



evitar a desidratação rápida do meio) incubando-a, em seguida, em BOD a 28°C ou em condições ambientais de

laboratório (bancada), em local reservado para tal, durante 7 dias.

IV.RESULTADOS

Expresse os resultados destas aulas práticas desenhando (nos círculos correspondentes) e nomeando (apontar

com setas) as estruturas fúngicas observadas no microscópio. Abaixo do desenho de cada fungo, no caso do

Método 1, coloque o número de colônias, expressando em unidades formadoras de colônia (UFC) por grama de

solo (UFC/g de solo). No caso dos Métodos 2, abaixo de cada desenho, nomeie o fungo observado, no mínimo

ao nível de gênero.


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Complemente respondendo as seguintes questões:

01. Qual a finalidade e como se classificam os meios de cultura utilizados para o cultivo de fungos em laboratório?

02. O que é uma cultura pura de um fungo e qual a sua importância?

03. O que são condições assépticas de trabalho na manipulação de fungos em laboratório? Cite exemplos de

como proceder neste sentido e a importância destes procedimentos.

04. Qual o papel dos fungos no saneamento ambiental, com ênfase em processos de biorremediação ao nível do

solo? Cite exemplos.

05. Qual o papel dos fungos na produção e no armazenamento de produtos agrícolas e qual as conseqüências

ambientais decorrentes? Cite exemplos.


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AULA PRÁTICA III

DETECÇÃO DE INDICADORES DE POLUIÇÃO FECAL EM ÁGUAS

(MÉTODO CROMOFLUOROGÊNICO)

I.INTRODUÇÃO

A água, por possuir múltiplos usos, como abastecimento público, recreação, produção de energia, paisagismo e

etc, é de fundamental importância para a vida. A água merece uma atenção especial, pois pode conter diferentes

contaminantes químicos e ainda veicular diversos microorganismos, como vírus, bactérias, fungos e protozoários.

A detecção e quantificação de contaminantes e microrganismos em águas é uma das formas de se avaliar a sua

qualidade, permitindo a sua caracterização como apropriada ou não para os diferentes usos.

Podemos quantificar os microrganismos, em especial bactérias, de forma direta ou indireta. A forma direta de

quantificação é a contagem em placa, e a indireta mais utilizada é a técnica do NMP (Número Mais Provável). A

contagem de colônias em placas é uma técnica quantitativa direta aonde cada colônia crescida numa placa de

Agar corresponde a uma unidade formadora de colônia (UFC) proveniente do material. A técnica do número maisprovável é um método indireto de contagem em meio líquido, onde a partir de uma evidência da presença de uma

bactéria ou grupo de bactérias é possível se estimar o número mais provável desta no material analisado. Dentre

os muitos microrganismos que podem ser quantificados incluem-se: contagem total de bactérias, coliformes,

Staphylococcus Bacillus , etc.

Como seria muito caro e trabalhoso avaliar diretamente todos os patógenos nas amostras de águas, uma

alternativa para a avaliação da qualidade sanitária da água é a pesquisa de bioindicadores, ou seja, organismos

não patogênicos constituintes da microbiota normal das fezes de animais de sangue quente, que quando

encontrados indicam a ocorrência de contaminação fecal, evidenciando o risco da presença de patógenos. Fezeshumanas contêm de 20-30% de resíduos alimentares não digeridos, sendo o restante constituído de água e

bactérias. No indivíduo saudável essas bactérias constituem os habitantes normais do intestino, onde a

Escherichia coli é a representante característica. Assim, a presença de Escherichia coli em água caracteriza a

contaminação fecal e é indicativa da presença de patógenos entéricos.

Ao final da prática, os alunos devem ser capazes de realizar o método cromofluorogênico, identificar e quantificar

os indicadores de poluição fecal (E.coli e Coliformes totais) presentes em amostras de águas.

II.MATERIAIS

- Frascos para coleta de

amostras (higienizados)- Meio de cultura para coliformes - Incubadora

- Frascos para diluição do meio

de cultura- Água destilada estéril - Lâmpada UV

- Máquina seladora de cartelas - Pipetas estéreis - Cartelas para colimetria


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III.METODOLOGIA

- Coletar amostras (água, esgoto, etc.) utilizando frascos estéreis;

- Com o auxílio de uma pipeta graduada, diluir serialmente as amostras coletadas para frascos de diluição

previamente preparados (10-1, 10-2, 10-3, etc.);

- Para amostras de esgotos pré tratados, diluir até 10

-4

. No caso de esgotos brutos (EB) fazer a diluição até 10

-

6. Para água mineral e água de torneira, diluir só até 10-1;

- Adicionar 2,35 g do meio de cultivo MUG às três últimas diluições da série e agitar até a solubilização total do

meio;

- Identificar no verso de cada cartela a amostra, a diluição, a data e o nome da dupla. Em seguida, verter o

conteúdo de cada frasco para a cartela correspondente;

- Selar a cartela na seladora e incubar a 37 ºC, por 16-20 horas;

- Avaliar a coloração de cada poço nas cartelas. A cor amarela indica a presença de coliformes totais. Cartelas

com poços amarelos devem ser expostos à radiação UV (lâmpada UV portátil) para observar os poços com

fluorescência indicando a presença de E.coli ;

- Anotar o número de poços grandes e pequenos positivos para coliformes totais e E.coli ;

- Utilizar a tabela, em anexo, para leitura do Número Mais Provável (NMP) referente aos poços grandes x

pequenos. Este número deve ser multiplicado pelo fator de diluição utilizado;

- LEITURA FINAL: número de microrganismos (CT ou E.coli )/100 mL de amostra. Comentar este resultado frente

à legislação pertinente.


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AULA PRÁTICA V

IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS (MÉTODO DA COLORAÇÃO DE GRAM)

I.INTRODUÇÃO

A morfologia individual e as reações colorimétricas constituem, em geral, os critérios preliminares para

identificação e posterior classificação das bactérias. O exame microscópico de um microrganismo é, em geral,

suplementado com o uso de corantes, que além de facilitar sua observação, permite a visualização de

importantes estruturas. Porém, antes de ser corado, o microrganismo deve ser fixado à lâmina, através de

secagem por simples exposição ao ar ou secagem na chama.

Os corantes são sais compostos por radicais iônicos cromóforos. Podem ser básicos quando tem a cor do seu

íon positivo ou ácido, quando tem a cor do seu íon negativo. A célula bacteriana é negativamente carregada,

portanto, atrai corantes básicos. Os corantes básicos mais comuns são: cristal violeta, azul de metileno e a

safranina.

Existem inúmeros métodos para coloração, porém o método de Gram é o método de coloração de bactérias mais

utilizado. Consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes:

cristal violeta, iodo, etanol-acetona e fucsina básica. Está técnica permite a separação de amostras bacterianas

em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das bactérias observadas.

A coloração de Gram é uma coloração diferencial, pois não cora todos os tipos de células igualmente. Aquelas

bactérias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta com o iodo coram-se em violeta (Gram

positivas), enquanto as que não retêm o complexo coram-se em vermelho (Gram negativas) com a fucsina.

Ao final da prática, os alunos devem ter adquirido habilidades relacionadas à aplicação da coloração de Gram,identificação e diferenciação de bactérias gram-positivas e gram-negativas.

II.MATERIAIS

- Cristal Violeta - Fucsina diluída 1:10 - Lâminas

- Lugol (iodo ou iodeto de potássio) - Cultura de bactérias - Microscópio

- Mistura álcool-acetona - Pipetas de Pasteur

- Alças de

semeadura


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III.METODOLOGIA

III.1.PREPARO DE ESFREGAÇO A PARTIR DE MEIO SÓLIDO

- Colocar 1 gota de água ou solução fisiológica sobre a lâmina limpa.

- Atentando para as precauções de assepsia, tomar uma pequena porção da cultura com a alça estéril.

- Espalhar a cultura na gota suficientemente para obter um esfregaço fino.

- Secar a preparação ao ar ou na chama da lamparina.

- Deixar a lâmina esfriar completamente para poder corá-la.

III.2.COLORAÇÃO

- Cobrir o esfregaço seco e fixado com solução de cristal violeta;

- Após 1 minuto, lavar a lâmina com água destilada, em jato suave, deixando escorrer o cristal violeta;

- Cobrir a lâmina com solução de lugol e aguardar 1 minuto;- Desprezar a solução de lugol e lavar a lâmina com água destilada corrente;

- Inclinar a lâmina e gotejar álcool-acetona 95% (agente descolorante) até que não haja desprendimento de

corante;

- Lavar a lâmina rapidamente em água corrente;

- Cobrir o esfregaço com a solução de fucsina e aguardar 30 segundos;

- Lavar a lâmina rapidamente com água, secar a temperatura ambiente;

- Examinar a preparação ao microscópio.


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AULA PRÁTICA VI

IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS POR TESTES BIOQUÍMICOS

I.INTRODUÇÃO

Para identificar grupos ou espécies de bactérias ou leveduras, os microbiologistas investigam, por exemplo, as

atividades metabólicas destes microrganismos “in vitro ”. Os Testes, ou Provas, Bioquímicas servem para auxiliar

a identificação do microrganismo através da verificação das transformações químicas, que ocorrem na célula,

pela ação de suas enzimas. Como, muitas vezes, um microrganismo possui um sistema enzimático específico,

promovendo transformação bioquímica específica, os testes bioquímicos podem ser utilizados na prática para a

sua caracterização.

Para a realização dos testes bioquímicos é necessário utilizar meios de cultivo especiais contendo o substrato a

ser analisado e fornecer ao microrganismo as condições nutritivas e ambientais necessárias ao seu

desenvolvimento. Sendo assim, após a prática, os alunos devem ter desenvolvido habilidades relacionadas à

identificação de microrganismos por diferentes testes bioquímicos, além de ter adquirido conhecimento sobre

alguns meios de cultivos especiais utilizados nestes testes.

II.MATERIAIS

- Alça de semeadura flambável - Tubos com meio para produção de H2S

- Lamparina - Tira de papel com acetato de chumbo 10%

- Cultura da bactéria a ser identificada - Tubos com meio para redução do nitrato

- Lâminas de vidro - Reagentes A e B de Griess-slova

- Água oxigenada - Meio para formação de Indol

- Tubos com meio gelatina - Reagente de kovacs

- Meio para Voges-Proskauer (VP) - Meio para Vermelho de Metila (VM)

- Soluções A e B para VP - Indicador vermelho de metila


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III.METODOLOGIA

- Realizar os testes bioquímicos, de acordo com a tabela abaixo;

Testes bioquímicas Reagente Procedimento

Catalase Água oxigenada

Transferir algumas colônias da

cultura para uma lâmina de vidro e

pingar até 3 gotas da água

oxigenada sobre a colônia;

Hidrolise da gelatina Gelatina

Transferir uma colônia da cultura

para o meio mergulhando a alça

até o fundo do tubo;

Produção de H2S Tira de papel com acetato de chumbo 10%

Tranferir uma colônia para o meio

mergulhando a alça neste;

Posicionar a tira de papel nabeirada do tubo, entre o algodão e

o vidro;

Redução do nitrato Reagentes de Griess-SlovaTransferir uma colônia para o meio


Indol (triptofanase) KovacsTransferir uma colônia para o meio


Vermelho metila (VM) Vermelho de metila em álcool etílico

Transferir uma colônia para o meio


Voges-Proskauer (VP) Alfa naftol 5% em álcool absolutoTransferir uma colônia para o meio


Citrato Citrato

Transferir uma colônia para o meio

pela técnica de estriamento em

tubo;

Lactose

Glicose

- Inocular as bactérias nos diferentes meios de cultura e incubar por 24 horas. Observar o crescimento das

bactérias e discutir os resultados utilizando a tabela de identificação em anexo.


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AULA PRÁTICA VII

DESINFECÇÃO MICROBIANA COM AGENTES FÍSICOS E QUÍMICOS

PARTE 01 – DESINFECÇÃO COM AGENTES FÍSICOS

I.INTRODUÇÃO

A condição sanitária da população humana é determinada, em larga escala, por sua capacidade de controlar

populações microbianas de forma eficiente. Toda a forma de prevenção de transmissão de doenças,

contaminação por microrganismos nocivos ou deterioração e danos de materiais por microrganismos estão

diretamente associados aos processos específicos ou gerais de práticas sanitárias de assepsia.

Os microrganismos podem ser removidos, inibidos ou mortos por agentes físicos ou químicos. Uma grande

variedade de técnicas e de agentes pode ser utilizada, agindo de modos diferentes e tendo seu próprio limite de

aplicação prática. As técnicas de esterilização, por exemplo, promovem a eliminação ou destruição completa das

formas de vida de todos os microrganismos presentes em determinado material ou ambiente. Mesmo aqueles

que apresentam formas de resistência denominadas esporos, podem ser totalmente destruídos tornando os

materiais ou ambientes estéreis. Porém na maioria das atividades, o que se exige é a aplicação de práticas

sanitárias de desinfecção. Os diferentes processos de desinfecção não têm o objetivo de tornar os ambientes ou

os materiais estéreis, mas sim, eliminar a sua potencialidade infecciosa.

Os processos de desinfecção que utilizam agentes físicos são os mais comuns, devido ao baixo custo e não

formação de produtos tóxicos. O calor e a radiação ultravioleta são os principais exemplos. O calor, em geral,

acima da temperatura ideal de crescimento, promove a desnaturação de proteínas estruturais e enzimas, levando

à perda da integridade celular e, consequentemente, à morte. Já a radiação ultravioleta é capaz de provocar os

mesmos efeitos finais, porém sua ação se dá em nível do material genético celular, provocando a destruição dasmoléculas de DNA.

Ao final da prática, os alunos devem ter adquirido habilidades relacionadas à aplicação de métodos de

esterilização e desinfecção física e avaliação do crescimento microbiano sobre a ação do calor e da luz

ultravioleta.

II.MATERIAIS

- Tubos esterilizados - Banho-maria - Ponteiras esterilizadas

- Pipetas esterilizadas - Placas com ágar - Pipetador automático

- Tubos contendo meio A1 + E. coli - Alça de Drigalski

III.METODOLOGIA

III.1.TESTE DE AÇÃO DO CALOR SOBRE BACTÉRIAS

- Identificar 2 tubos esterilizados e 3 placas contendo meio A1+ágar com o nome do grupo, data e condição de

teste;

- Adicionar 2,0 mL de cultura de bactérias (Escherichia coli ) a cada tubo e submetê-los aos seguintes tratamentos:


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TUBO 1: colocar durante 10 minutos em banho maria a 600C, retirar uma alíquota de 0,1mL, aplicar na superfície

de uma placa contendo meio A1 + Agar, espalhar a suspensão bacteriana por toda a superfície da placa com

uma alça de Drigalski e incubar a placa invertida por 24 h a 370C;

TUBO 2: colocar durante 10 minutos em banho maria a 1000C, retirar uma alíquota de 0,1mL, aplicar na superfície

de uma placa contendo meio A1 + Agar, espalhar a suspensão bacteriana por toda a superfície da placa com

uma alça de Drigalski e incubar a placa por 24 h a 370C;

TUBO 3 (CONTROLE POSITIVO): Retirar uma alíquota de 0,1mL da cultura inicial, aplicar na superfície de uma

placa contendo meio A1 + Agar e espalhar por toda a superfície da placa com uma alça de Drigalski. Incubar a

placa por 24 h a 370C.

III.2.TESTE DE AÇÃO DA LUZ UV SOBRE BACTÉRIAS

- Identificar 3 placas contendo meio A1+ágar com o nome do grupo, data e condições de teste;

- Retirar alíquotas de 0,1mL de tubos de cultura de bactérias (Escherichia coli ), aplicar na superfície das placase espalhar com uma alça de vidro.

- Expor as placas sob a luz UV da seguinte forma:

- Colocar as três placas dentro do fluxo laminar, ascender a lâmpada UV.

- Retirar uma placa após 5, 15 e 30 minutos de exposição.

- Incubar todas as placas por 24 horas a 37°C.

PARTE 02 – DESINFECÇÃO COM AGENTES QUÍMICOS

I.INTRODUÇÃO

Os agentes químicos são utilizados para controlar o crescimento de microrganismos tanto em tecidos vivos com

em objetos inanimados. Em caso de materiais sensíveis ao calor, como, por exemplo, bolsas de sangue para

transfusão, seringas plásticas descartáveis, entre outros, alguns agentes químicos especiais são utilizados e

denominados de esterilizantes químicos. Porém a maioria dos agentes químicos somente reduz a população

bacteriana, sendo mais utilizados em processos sanitários de desinfecção e anti-sepsia.

Os principais grupos de agentes químicos desinfetantes e anti-sépticos aplicados no controle de microrganismossão os álcoois, halogênios (iodo e cloro) e detergentes. Os álcoois (etílicos, isopropílicos, combinados com iodo)

são utilizados, em geral, na concentração de 70% por 10 minutos, para a anti-sepsia da pele e desinfecção de

superfícies. Quando combinados com o iodo (0,5 a 20%), os álcoois têm seu poder de penetração na parede

celular elevado, potencializando as suas ações anti-sépticas. Os halogênios são representados principalmente

pelos compostos clorados (ex: hipocloritos 0,5 a 20 g/L de cloro livre) e agem a nível celular, desnaturando

proteínas e enzimas e inativando os ácidos nucléicos. São utilizados na desinfecção de água, superfícies em

geral, equipamentos de laticínios, restaurantes e domésticos. Já os detergentes com suas ações tensoativas,

umectante e emulsionante, causam transformações em proteínas e lipídeos, desestabilizando a membrana e

desnaturando as proteínas microbianas.


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Ao final da prática, os alunos devem ter adquirido habilidades relacionadas à aplicação de métodos de

esterilização e desinfecção química e avaliação do crescimento microbiano sob a ação de soluções de álcool

70%, hipoclorito de sódio e detergente.

II.MATERIAIS

- Tubos esterilizados - Ponteiras esterilizadas - Alça de Drigalski - Álcool 70%

- Pipetas esterilizadas - Pipetador automático - Detergente - Álcool 92%

- Placas com ágar + meio

A1

- Tubos contendo A1 +

Escherichia coli

- Hipoclorito - Hipoclorito 1:100

III. METODOLOGIA

- Teste da eficácia antisséptica dos agentes químicos sobre as bactérias.

III.1. ÁLCOOL 70% e 92%

- Identificar uma placa contendo meio A1 + ágar com o nome do grupo, data e condições de teste;

- Adicionar 5,0 mL de álcool na concentração escolhida em um tubo de ensaio e adicionar 0,5 mL da cultura;

- Após 10 minutos, retirar 0,1 mL do tubo, adicionar à placa contendo meio A1+Agar, espalhar as células com

uma alça de Drigalski e incubar as placas a 37o C por 24h;

III.2. HIPLOCLORITO DE SÓDIO (ÁGUA SANITÁRIA) CONCENTRADA E DILUÍDA 1:100

- Identificar 2 placas contendo meio A1 + ágar com o nome do grupo, data e condições de teste;

- Adicionar 5,0 mL da concentração escolhida de hipoclorito em um tubos de ensaio esterilizado e adicionar uma

alíquota de 0,5 mL da cultura. Após 2 minutos, retirar 0,1 mL do tubo e adicionar à placa contendo meio A1+Agar.

Espalhar as células com uma alça de Drigalski e incubar as placas a 37o C por 24h;

- Repetir todo o procedimento após 10 minutos.

III.3. DETERGENTE

- Adicionar 5,0 mL de detergente em um tubo de ensaio, adicionar uma alíquota de 0,5 mL da cultura. Após 2

minutos, retirar 0,1 mL de cada tubo, adicionar em uma placa contendo meio A1+Agar. Espalhar a suspensão

bacteriana com uma alça de vidro e incubar as placas a 37o C por 24h;

- Repetir todo o procedimento após 15 minutos.


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AULA PRÁTICA VIII

TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS – TSA (Antibiograma)

I.INTRODUÇÃO

O teste de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA) ou antibiograma determina o perfil de sensibilidade do

microrganismo a uma determinada droga. Normalmente indicados para organismos patogênicos, o TSA éutilizado para selecionar a droga mais eficiente no tratamento, uma vez que o sucesso na terapêutica

antimicrobiana de uma infecção bacteriana depende da sensibilidade do agente à droga utilizada.

A seleção dos antimicrobianos para a realização dos antibiogramas de rotina deve seguir alguns princípios. Um

deles baseia-se no reconhecimento de que alguns agentes antimicrobianos podem ser agrupados em classes,

devido ao seu espectro de atividade. Assim, um só representante de classe necessita ser testado, a não ser

quando dentro de uma mesma classe de antimicrobianos não exista a possibilidade de equivalência.

Uma bactéria é considerada sensível a um antimicrobiano quando o seu crescimento é inibido, in vitro , por uma

determinada concentração. Esta concentração inibitória do antimicrobiano pode ser determinada direta ou

indiretamente. A determinação direta é feita pelos chamados métodos da diluição, e, a indireta, pelo método de

difusão em placa com discos impregnados com as drogas.

No método de diluição, meios com concentrações variadas do antibiótico, obtidas por diluição, são inoculados

com o microrganismo. A menor concentração que evita o crescimento após a incubação de 12 a 24 horas é a

concentração inibitória mínima. No método de difusão, discos de papel impregnados com o antibiótico são

colocados uniformemente na superfície do meio sólido semeado com o microrganismo. Após a aplicação forma-

se um gradiente de concentração pela difusão do antibiótico a partir do disco, com consequente inibição do

crescimento do microrganismo sensível ao antibiótico. Devido à sua simplicidade e por poderem ser realizadosrapidamente, os métodos de difusão com disco têm preferência sobre os de diluição para os testes de rotina.

A prática pretende desenvolver nos alunos a habilidade em avaliar o perfil de susceptibilidade de microrganismos

Gram-positivos e Gram-negativos às drogas antimicrobianas. A presença ou ausência de crescimento da amostra

bacteriana em torno dos discos é interpretada como resistência ou sensibilidade do microrganismo ao

antimicrobiano. Os halos são medidos e comparados com valores padronizados pelo CLSI – Chemical Laboratory

and Standards Institute .

II.MATERIAIS

- Swab estéril - Pinça de aço

- Discos impregnados com antimicrobianos

- Placas contendo ágar Muller Hinton estéreis- Tubos com suspensão de bactérias em salina


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III.METODOLOGIA

III.1. PREPARO DO INÓCULO (MÉTODO DA SUSPENSÃO DIRETA)

- Em um tubo de ensaio contendo 3 mL da solução salina esterilizada, foram suspensas 3 colônias de mesma

morfologia, retiradas da cultura de bactérias, com alça estéril;

- A turbidez da suspensão foi ajustada gotejando-se salina até o ponto 0,5 da escala de MacFarland.

III.3. INOCULAÇÃO NAS PLACAS

- Identificar as placas de petri, contendo meio sólido, com a data e o nome ou iniciais dos alunos;

- Proceder a semeadura introduzindo um swab estéril na suspensão bacteriana e eliminar o excesso de líquido

por compressão na parede do tubo, em até 15 min após o preparo do inóculo. Espalhar o inóculo uniformemente

(três direções diferentes), de modo a cobrir toda a superfície do ágar;

- Aguardar de 5 a 15 minutos, à temperatura ambiente, para que o inóculo seja completamente absorvido peloágar antes de aplicar os discos.

III.4. APLICAÇÃO DOS DISCOS

- Com uma pinça flambada e resfriada, retirar um disco de antimicrobiano do frasco, abrir a placa próximo à

lamparina, colocar o disco e comprimi-lo gentilmente contra o ágar para que fique aderido à superfície;

- Tomar nota dos antibióticos também pelo código impresso na superfície dos discos.

III.5. INCUBAÇÃO DAS PLACAS

- Aguardar por até 15 minutos após aplicação dos discos e incubar as placas invertidas por 16 a 18 horas a 35ºC.

III.6. LEITURA E INTERPRETAÇÃO DAS PLACAS

- Após o tempo de incubação, verificar a presença de halos ao redor dos discos de antimicrobianos. Medir o

diâmetro dos halos de inibição do crescimento bacteriano e anotar os resultados. Comparar os resultados obtidoscom a tabela de sensibilidade.


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AULA PRÁTICA IX

ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS COM BACTÉRIAS Vibrio fischeri

I.INTRODUÇÃO

O monitoramento da poluição especialmente em ambientes aquáticos pode ser realizado pelos parâmetros

tradicionais, Turbidez, DBO, DQO, Nitrogênio, Fósforo, além dos parâmetros microbiológicos como, por exemplo,a avaliação de coliformes totais (método cromofluorogênico). Em alguns casos, além da poluição, pretende-se

avaliar a presença de contaminantes que, em geral, apresentam toxicidade ao meio ambiente. A avaliação da

toxicidade é realizada por ensaios ou testes toxicológicos. Há, essencialmente, dois tipos de testes ecotox: testes

agudos e testes crônicos. Para testes agudos mais frequentemente utiliza-se microcrustáceos (Daphnia ) ou

bactérias luminescentes (Vibrio fischeri ) com o analisador Microtox © 500.

Os ensaios no Microtox © 500 consistem em testes de toxicidade aguda de simples execução baseados na análise

da luminescência emitida pelas bactérias (Vibrio fischeri ) em amostras com diferentes diluições. O analisador de

toxicidade Microtox ©

500 é um fotômetro controlador de temperatura que mantém as condições adequadas deensaios para os reagentes e as amostras (aproximadamente 15°C). O sistema é calibrado para registrar a

luminescência emitida por bactérias, sendo um teste rápido (15 min.). A partir da diferença entre as intensidades

de luminescência de cada amostra diluída é atribuída a toxicidade à amostra.

Ao final da prática, os alunos devem ter adquirido habilidades relacionadas à aplicação do método de análise

toxicológica aguda, utilizando bactérias Vibrio fischeri , além de ser capaz de avaliar os efeitos toxicológicos a

partir dos resultados obtidos na análise no Microtox © 500.

II.MATERIAIS

- Reagentes para Microtox 500: Solução Diluente, Solução de Ajuste osmótico (OAS), Reagente de reconstituição

para bactéria e Bactéria Vibrio fischeri liofilizada.

- Tubos, micropipetas e ponteiras estéreis.

III.METODOLOGIA

- Ligar o equipamento cerca de 20 minutos antes de iniciar o teste para estabilizar a temperatura.

III.1.PREPARO DA AMOSTRA

- Medir os seguintes parâmetros da amostra: pH, turbidez, salinidade e oxigênio dissolvido (OD).Teste de pH: entre 6,0 e 8,5 (se o pH estiver fora ajustar para 7±0,2 com HCl 1N ou NaOH 1N, porém a sol.

adicionada não pode exceder 5% do volume total da amostra)

Turbidez: limite 100 NTUs

Salinidade: mínima de 20g/L de NaCl

OD: maior que 0,5 mg/L

III.2.ENSAIO TOXICOLÓGICO

- Escolher a opção Basic test no software Microtox OMNI (duas amostras com quatro diluições cada).

- Posicionar as cubetas no termobloco;


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- Adicionar 1,0 mL do reagente de reconstituição na posição “reagent well ”;

- Adicionar 500 µL de solução diluente nas cubetas B1 - B5 e D1 – D5;

- Adicionar 1,0 mL de solução diluente nas cubetas A1 - A4 e C1 – C4;

- Adicionar 250 µL de solução OAS + 2.500 µL da amostra 01 em A5 e da amostra 02 em C5;

- Misturar e depois descartar 750 µL das cubetas;

- Fazer uma diluição seriada (1:2) transferindo 1,0 mL:

- A5 para A4; A4 para A3; A3 para A2

- C5 para C4; C4 para C3, C3 para C2

- Descartar 1,0 mL de A2 e 1,0 mL de C2;

- Esperar 5 minutos

III.2.1.REATIVAÇÃO DA BACTÉRIA

- Retirar a ampola com a bactéria liofilizada do congelador;

- Abrir a ampola com o mínimo de manuseio para não alterar a temperatura;

- Transferir o reagente de reconstituição pré-resfriado da posição “reagent well ” para a ampola;

- Misturar utilizando a micro pipeta, retornar a solução para a cubeta e posicioná-la no “reagent well ”.

- Transferir 10 µL da cubeta para B1 a B5; e D1 a D5;

- Esperar 15 minutos

- Colocar a cubeta B1 na posição de leitura e pressionar o botão SET e verificar a fluorescência;

- Pressionar START no programa Microtox OMNI para iniciar a sequência de leituras do teste e seguir asinstruções indicadas na tela;

- Colocar a cubeta em destaque na tela na cavidade de leitura e pressionar o botão READ;

- Fazer a leitura das cubetas B1 a B5 e D1 a D5;

- Após as leituras transferir imediatamente as amostras de:

- A1 para B1; A2 para B2; ........ A5 para B5;

- C1 para D1; C2 para D2; ........ C5 para D5

- Pressionar START para iniciar a contagem do tempo


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- Quando chegar a 5 minutos realizar a leitura das cubetas B1 a B5 e D1 a D5 novamente;

- Repetir esse passo depois, quando a contagem atingir 15 minutos.

III.2.2.LEITURA E INTERPRETAÇÃO DAS LEITURAS

- Tabela de leitura da luminescência em cada diluição nos tempos 0, 5 e 15 minutos. Preencher com os valores

obtidos no teste.

AMOSTRA

Amostra 01 Amostra 02

Diluições Diluições

1= 2= 3= 4= 1= 2= 3= 4=

T0

T5

T15

EC50

- O que significam os valores de EC50 em relação ao efeito tóxico das amostras? Qual das amostras apresenta

maior toxicidade?

Documents

Apostila Microbiologia 2014-2 Engenharia Ambiental