A experiência da Embrapa Milho e Sorgo com análises de

solo cultivado com milho transgênico

Francisco Adriano de Souza

Embrapa Milho e Sorgo - CNPMS

Porque nos devemos zelar pela saúde do solo ?

1. Nos solos ocorrem processos chave para equilíbrio da vida no planeta, em sua maioria mediados por comunidades microbianas

• Purificação e armazenamento de água • Decomposição/Mineralização • Fixação biológica de Nitrogênio • Ciclagem de Nutrientes

2. Tipicamente, existem 40 milhões de células bacterianas/g de solo (Whitman et al. 1998), totalizando uma massa que excede a biomassa de plantas e animais no planeta (Hogan 2010)

3. Fonte de biodiversidade

Porque devemos monitorar as comunidades microbianas no solo ?

1. Microrganismos são praticamente onipresentes e reagem rápido à alterações químicas e físicas no ambiente

2. Alterações em comunidades microbianas são muitas vezes precursoras de mudanças na saúde e na vitalidade do ambiente como um todo.

3. Comunidades microbianas exercem funções essenciais para a funcionamento do sistema solo-planta

4. Existem metodologias bem estabelecidas para o estudo de comunidades microbianas

Background da Equipe do CNPMS em Microbiologia do Solo

• Fixação Biológica de Nitrogênio

• Micorrizas

• Microrganismos Promotores do Crescimento de Plantas

• Controle Biológico

• Solubilizadores de Rochas

• Monitoramento qualidade do solo

– Atividade Enzimática

• Banco de Germoplasma

Background em Microbiologia do Solo

• Acesso a diversidade microbiana

–Domínio de metodologia clássicas, baseadas em técnicas dependentes de cultivo;

–Domínio de técnicas moleculares – independentes de cultivo

Detecção de alterações em comunidades de microrganismos por técnicas moleculares

Porcentagem de distribuição de clones de Fungos Micorrízicos Arbusculares recuperados de 4 bibliotecas e

sua identidade filogenética por BLAST (Fonte – Gomes não publicado

Projetos

• Impacto da utilização do milho Bt em lepidopteros-praga, predadores e organismos não-alvo

– Líder: Simone Martins Mendes

• 2010-2012

• Impacto ambiental de milho transgênico expressando toxinas de Bacillus thuringiensis sobre a entomofauna, microbiota do solo e produção de grãos

– Líder: Fernando Hercos Valicente

• 2/1/2011 a 30/12/2014

Projeto 1: Impacto da utilização do milho Bt em lepidopteros praga, predadores e organismos não-

alvo

• Objetivos/Hipóteses

• Hipótese 1: A utilização de plantas de milho Bt não afeta a incidência e atividade de organismos não-alvo

• Impactos de toxinas Bt sobre a estrutura e função de comunidades bacterianas na rizosfera

• Diversidade funcional da comunidade bacteriana do solo

• Diversidade genética da microbiota através de eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE)

• Hipótese 2: Restos vegetais de plantas Bt podem afetar a comunidade microbiana do solo e apresentar distintas taxas de decomposição, alterando a ciclagem de nutrientes

• Decomposição e ciclagem de nutrientes a partir de resíduos de plantas Bt

Projeto 1: Impacto da utilização do milho Bt em lepidopteros praga, predadores e organismos não-

alvo

• Qualidade biológica do solo rizosférico de plantas

transgênicas de milho, expressando proteínas CryAb e Cry1F

• Atividade Enzimática

• Perfil Metabólico de Comunidades

Figura 1: Ilustração da determinação da atividade da urease e arginase

0,15 g Agitação

Reagente A e C + Incubação 37ºC + Reagente D e E Centrifugação Leitura

400 nm

SOLO

0,5 g

1,0 g SOLO

Agitação

Reagente A + Incubação 37ºC + Reagente B

Centrifugação Reagente C e D

Leitura

Incubação

660 nm

100μl

SOLO

Extração/

Diluição

Centrifugação (4000g, 15’)

Inoculação em placas ECOPLATES - BIOLOG

Figura 2: Ilustração da determinação da atividade das fosfatases

Figura 3: Ilustração da determinação da diversidade funcional da comunidade microbiana

Figura 1: Ilustração da determinação da atividade da urease e arginase

0,15 g Agitação

Reagente A e C + Incubação 37ºC + Reagente D e E Centrifugação Leitura

400 nm

SOLO

0,5 g

1,0 g SOLO

Agitação

Reagente A + Incubação 37ºC + Reagente B

Centrifugação Reagente C e D

Leitura

Incubação

660 nm

100μl

SOLO

Extração/

Diluição

Centrifugação (4000g, 15’)

Inoculação em placas ECOPLATES - BIOLOG

Figura 2: Ilustração da determinação da atividade das fosfatases

Figura 3: Ilustração da determinação da diversidade funcional da comunidade microbiana

Qualidade biológica do solo rizosférico de plantas transgênicas de milho, expressando proteínas CryAb e Cry1F

Efeito local predominante, não ocorrendo diferença significativa

entre as variedades de Milho Bt avaliadas e sua isolínea

Qualidade biológica do solo rizosférico de plantas transgênicas de milho, expressando proteínas CryAb e Cry1F

Efeito local predominante, não ocorrendo diferença significativa

entre as variedades de Milho Bt avaliadas e sua isolínea

Perfil Metabólico de Comunidades Microbianas - BIOLOG EcoPlates™

• Esta abordagem tem sido eficaz na detecção de alterações espaciais e temporais

em distintas comunidades microbianas.

– Mede a capacidade da comunidade em metabolizar 31 fontes de carbono distintas, por ensaio, em triplicata

– Incubação a 27 C por até ~ 120 horas, com avaliações diárias

– Leitura colorimétrica Simples

Tabela 1. Atividade metabólica (Total – BIOLOG - Ecoplates), Número de substratos utilizados (S), Diversidade metabólica (Índice de Shannon - H) em 72 horas de incubação para amostras de solo não rizosférico e rizosférico de 3 genótipos de milho transgênicos e não transgênicos, em solo de várzea e cerrado

• Projeto 2: Impacto ambiental de milho transgênico expressando toxinas de Bacillus thuringiensis sobre a entomofauna, microbiota do solo e produção de grãos

• Objetivos

• A utilização de plantas de milho Bt não afeta a a estrutura e a função de comunidades microbianas do solo incidência e atividade de organismos não-alvo

• Impactos de toxinas Bt sobre a estrutura e função de comunidades bacterianas na rizosfera

• Diversidade funcional da comunidade bacteriana do solo

• Diversidade genética da microbiota através de eletroforese em gel de gradiente (DGGE), T-RFLP e clonagem/sequenciamento

• Projeto 2: Delineamento Experimental

Blocos casualizados com 4 repetições

• Ano 1 Safra 2010/2011 – 12 tratamentos

• Ano 2 Safra 2011/2012 – 18 tratamentos

• (Janeiro de 2012)

• O experimento plantado na mesma posição ano após ano

• Duas Localidades – Sete Lagoas e Janaúba

• Duas épocas de amostragem – 30 e 45 dias após plantio

• Tratamentos

• Milho Bt

• Isolinha

• Isolinha + tratamento químico

Experimento Janúba ano 2 – Safra 2011/2012

• Projeto 2: Parâmetros Avaliados

Micorrizas

• Taxa de colonização radicular

• Diversidade molecular da comunidade colonizando raízes (T-RFLP)

Fixadores de Nitrogênio

• Diversidade molecular genes Nif (DGGE)

Comunidade Bacteriana Total

• Diversidade molecular da comunidade por 16S rRNA (DGGE)

Perfil Metabólico da Comunidade Bacteriana

• BIOLOG – Ecoplates

Decomposição palhada Milho Bt

• Ensaios in vitro

Tabela 2. Atividade metabólica (Total – BIOLOG - Ecoplates), Diversidade metabólica (Índice de Shannon - H) e Equitabilidade – E de amostras de solo rizosférico de 6 genótipos de milho transgênicos e não transgênicos, no Município de Sete Lagoas Ano 2 – Safra 2011/2012

Atividade H E

Genótipo Coleta 1

Coleta 2

Coleta 1

Coleta 2

Coleta 1

Coleta 2 MON 810 16.59 Aa 21.71 Bb 3.30 ns 3.38 ns 0.97 ns 0.98 ns

Isolinha 1 + Q 18.89 Aa 18.04 Aa 3.38 ns 3.40 ns 0.98 ns 0.99 ns

Isolinha 1 16.55 Aa 20.43 Ab 3.33 ns 3.39 ns 0.97 ns 0.99 ns

Bt11 16.92 Aa 21.50 Ab 3.29 ns 3.41 ns 0.96 ns 0.99 ns

Isolinha 2 + Q 16.94 Aa 21.26 Ab 3.28 ns 3.39 ns 0.96 ns 0.99 ns

Isolinha 2 21.59 Aa 18.27 Aa 3.38 ns 3.37 ns 0.99 ns 0.99 ns

HERCULEX 16.72 Aa 21.20 Ab 3.32 ns 3.38 ns 0.97 ns 0.99 ns

Isolinha 3 + Q 18.94 Aa 22.05 Ab 3.36 ns 3.40 ns 0.98 ns 0.99 ns

Isolinha 3 17.65 Aa 16.75 Aa 3.33 ns 3.39 ns 0.97 ns 0.99 ns

MON8034 15.22 Aa 21.52 Bb 3.32 ns 3.41 ns 0.97 ns 0.99 ns

Isolinha 4 + Q 18.29 Aa 19.83 Ab 3.30 ns 3.42 ns 0.96 ns 1.00 ns

Isolinha 4 21.09 Aa 23.12 Ab 3.37 ns 3.40 ns 0.98 ns 0.99 ns

DKB390 CINCO 14.89 Aa 16.25 Aa 3.19 A 3.39 B 0.94 ns 0.99 ns

Isolinha 5 17.62 Aa 16.25 Aa 3.36 ns 3.42 ns 0.98 ns 1.00 ns

Isolinha 5 + Q 20.33 Aa 20.13 Ab 3.38 ns 3.39 ns 0.98 ns 0.99 ns

IMPACTO VIPTERA 17.27 Aa 18.53 Aa 3.32 ns 3.39 ns 0.97 ns 0.99 ns

Isolinha 6 10.87 Aa 17.65 Ba 3.14 ns 3.38 ns 0.92 A 0.98 B

Isolinha 6 + Q 19.35 Aa 20.64 Ab 3.37 ns 3.38 ns 0.98 ns 0.99 ns

Letras maiúsculas comparam médias entre coletas – Scott-Knott a 5% Letras minúsculas comparam médias entre colunas (genótipos) – Scott-Knott a 5%

Tabela 3. Atividade metabólica (Total – BIOLOG - Ecoplates), Diversidade metabólica (Índice de Shannon - H) e Equitabilidade – E de amostras de solo rizosférico de 6 genótipos de milho transgênicos e não transgênicos, no Município de Janaúna, MG Ano 2 – Safra 2011/2012

Atividade H E

Genótipo Coleta 1

Coleta 2

Coleta 1

Coleta 2

Coleta 1

Coleta 2 MON 810 16.66 A 21.01 B 3.42 ns 3.39 ns 1.00 ns 0.99 ns

Isolinha 1 + Q 17.17 A 19.76 A 3.41 B 3.37 A 0.99 ns 0.98 ns

Isolinha 1 13.19 A 20.58 B 3.38 A 3.41 B 0.99 ns 0.99 ns

Bt11 14.12 A 18.09 B 3.41 B 3.37 A 0.99 ns 0.98 ns

Isolinha 2 + Q 14.38 A 20.93 B 3.42 ns 3.41 ns 1.00 ns 0.99 ns

Isolinha 2 15.39 A 18.83 A 3.40 ns 3.38 ns 0.99 ns 0.98 ns

HERCULEX 16.92 A 20.45 A 3.42 ns 3.40 ns 0.99 ns 0.99 ns

Isolinha 3 + Q 14.90 A 20.02 B 3.40 ns 3.39 ns 0.99 ns 0.99 ns

Isolinha 3 15.55 A 19.21 A 3.40 ns 3.40 ns 0.99 ns 0.99 ns

MON8034 13.89 A 20.57 B 3.40 ns 3.40 ns 0.99 ns 0.99 ns

Isolinha 4 + Q 14.31 A 19.98 B 3.41 ns 3.41 ns 0.99 ns 0.99 ns

Isolinha 4 15.06 A 22.15 B 3.40 ns 3.41 ns 0.99 ns 0.99 ns

DKB390 CINCO 16.14 A 18.70 A 3.41 ns 3.39 ns 0.99 ns 0.99 ns

Isolinha 5 15.23 A 21.02 B 3.40 ns 3.41 ns 0.99 ns 0.99 ns

Isolinha 5 + Q 17.46 A 20.02 A 3.41 ns 3.40 ns 0.99 ns 0.99 ns

IMPACTO VIPTERA 18.03 A 20.46 A 3.41 ns 3.41 ns 0.99 ns 0.99 ns

Isolinha 6 13.62 A 20.27 B 3.39 ns 3.41 ns 0.99 ns 0.99 ns

Isolinha 6 + Q 16.85 A 21.17 B 3.40 ns 3.39 ns 0.99 ns 0.99 ns

Letras maiúsculas comparam médias entre coletas – Scott-Knott a 5%

Conclusões • Projeto 1: O cultivo de milho Bt, nas condições avaliadas,

não tem causado mudanças significativas na atividade das enzimas Arginase, Fosfatase ácida e alcalina e Urease;

• Projeto 1: O cultivo de milho Bt, nas condições avaliadas, não causou mudanças significativas no perfil metabólico de comunidades microbianas amostradas da rizosfera das plantas;

• Projeto 2: O cultivo de milho Bt, nas condições avaliadas, causou mudanças significativas no perfil metabólico de comunidades microbianas amostradas da rizosfera das plantas no município de Sete Lagoas, mas não em Janaúba.

• Em sua maioria causando aumento na atividade metabólica da comunidade microbiana

Equipe

• Dra. Christiane Abreu de Oliveira Paiva

• Dra. Eliane Aparecida Gomes

• Dr. Francisco Adriano de Souza

• Dr. Ivanildo Evódio Marriel

• M.Sc. Ubiraci Gomes de Paula Lana

Obrigado pela Atenção!!!