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A. IDENTIFICAÇÃO DA PROPOSTA
Projeto: Inibidores de transportadores ABC para controle de carrapato bovino e
Babesia spp.
Área: Agrobiotecnologia para a produtividade, sustentabilidade e qualidade da
produção agropecuária.
B. QUALIFICAÇÃO DO PRINCIPAL PROBLEMA A SER ABORDADO
O carrapato bovino Rhipicephalus microplus é uma espécie de ampla distribuição
mundial (ESTRADA-PENÃ et al., 2006). No Brasil, o carrapato bovino é encontrado em
quase todo o país e sua frequência varia de acordo com as condições climáticas bem como
em função da raça de bovinos criados (GONZALES, 1995). As infestações por R. microplus
são conhecidas pelo seu efeito adverso na produtividade pecuária (JONSSON, 2006), reflexo
em anemia e perdas na produção de leite e carne (SUTHERST et al., 1983). A produção de
couro também é afetada em função das lesões e reações inflamatórias nos pontos de fixação
do carrapato na pele do animal (PEREIRA et al., 2005). A transmissão de patógenos dos
gêneros Babesia e Anaplasma por esta espécie de carrapato aumenta ainda mais os prejuízos.
Babesiose é uma doença causada pela infecção por parasitas intraeritrocitários do gênero
Babesia, transmitidos por carrapatos, que acomete várias espécies de animais (HOMER et
al., 2000). As principais espécies capazes de infectar bovinos são B. bovis, B. bigemina e B.
divergens, entretanto as espécies B. major, B. ovata, B. occultans e B. jakimovi também
podem infectá-los (World Organization for Animal Health, 2014). Em áreas onde há
exposição contínua ao carrapato infectado com Babesia spp, parte dos animais entra em
contato desde jovens com o hemoprotozoário e desenvolve imunidade, que é reforçada a cada
nova infestação por carrapatos. Dessa forma, o rebanho fica protegido da doença ao longo de
toda a vida. Tais regiões são denominadas como áreas de estabilidade enzoótica, nas quais
há exposição à babesia, mas poucos animais apresentam sinais clínicos decorrentes do
desenvolvimento da doença (MAHONEY & MIRRE, 1974; SMITH et al., 2000). Em regiões
nas quais a ocorrência de carrapato não é constante ao longo do ano são conhecidas como
áreas de instabilidade enzoótica. Neste tipo de região parte dos animais do rebanho não são
infectados quando jovens, tornando-os suscetíveis ao desenvolvimento da doença. Portanto,
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as áreas de instabilidade enzoótica são as regiões mais sensíveis para ocorrência de casos de
babesiose (DE VOS, 1979; DE WAAL & COMBRINK, 2006).
Estima-se que anualmente as perdas decorrentes da infestação pelo R. microplus
possam atingir US$ 2 bilhões no Brasil (GRISI et al., 2014). Desta forma, o controle eficiente
do carrapato é fundamental para a manutenção da sanidade do rebanho e desenvolvimento
da bovinocultura nacional. Atualmente a principal forma de controle é através do uso de
acaricidas, cujo uso iniciou-se de forma sistemática com a utilização de compostos arsenicais
no ano de 1896 na Austrália (ANGUS, 1996). A descoberta das propriedades inseticidas do
DDT (diclorodifeniltricloroetano) em 1939, e o subsequente desenvolvimento de pesticidas
orgânicos facilitou o controle de carrapatos. Inseticidas e acaricidas de várias categorias,
como organoclorados, organofosfatos, amidinas e piretróides, são ou foram eficazes para o
controle do carrapato (GRAF et al., 2004). Atualmente, os mercados têm à disposição
derivados de sete classes distintas de acaricidas: organofosforados (clorpirifós, coumafós,
etion), piretróides (flumetrina, cipermetrina, deltametrina), amidinas (amitraz), lactonas
macrocíclicas (ivermectina, abamectina, doramectina, moxidectina), fenilpirazóis (fibronil),
inibidores da síntese de quitina (fluazuron) e espinosinas (espinosade).
É importante destacar que o uso de acaricidas foi um dos fatores preponderantes no
desenvolvimento da pecuária bovina em várias regiões, e é até hoje o método mais eficiente
para controle do carrapato. Entretanto, o uso desta metodologia traz consigo algumas
consequências negativas, como selecionar populações de carrapatos resistentes aos acaricidas
utilizados (BENELLI et al., 2016; GUPTA et al., 2016) e a presença de resíduos nos produtos
destinados ao consumo humano e também no ambiente. Desta forma, alternativas ao melhor
uso de acaricidas devem ser buscadas.
Um dos métodos alternativos ao uso de acaricidas que apresentam maior potencial é
a vacinação (WILLADSEN, 2004; GUERRERO et al., 2012b). Em 1994 e 1995, foram
lançadas duas vacinas comerciais contra o carrapato, a TickGardTM, desenvolvida na
Austrália (WILLADSEN et al., 1995), e a GAVAC, desenvolvida em Cuba (RODRÍGUEZ
et al., 1995). Ambas vacinas foram formuladas com o antígeno Bm86, uma glicoproteína de
membrana presente no intestino do carrapato (WILLADSEN et al., 1989). Entretanto, as
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vacinas existentes ainda não asseguraram o grau de proteção necessário para suprimir o uso
de acaricidas, apesar de reduzirem o número de aplicações (DE LA FUENTE et al., 2007;
VALLE et al., 2004; WILLADSEN et al., 1996). Ainda assim, elas foram o primeiro passo
para o desenvolvimento de outras vacinas com maior eficácia. Vários grupos de pesquisa,
inclusive os grupos dos laboratórios do Brasil e Uruguai desta proposta, estão investigando
aprimoramentos nos métodos de controle do carrapato bovino (ALI et al., 2015; ALMAZÁN
et al., 2012; LEAL et al., 2006; MARITZ-OLIVIER et al., 2012; PARIZI et al., 2011;
PECONICK et al., 2008; WILLADSEN, 2006).
Atualmente, das sete classes de acaricidas disponíveis no mercado, somente fluazuron
e espinosade não possuem relatos de resistência para R. microplus. Devido ao rápido aumento
de resistência aos acaricidas supõem-se que em breve a resistência a acaricidas dessas classes
também será problema para a produção pecuária. O curto período de tempo entre as gerações
do carrapato favorece a rápida seleção de populações resistentes (KUNZ & KEMP, 1994). A
rapidez com que populações de carrapatos resistentes a acaricidas se estabelecem é
evidenciada pela observação de que, em 11 fazendas, após um período de 8 a 24 meses de
uso contínuo de piretróides a resistência a esses acaricidas aumentou mais de 60 vezes, sendo
que nesse período a frequência do alelo que confere resistência passou de 5 a 46% para 66 a
96% (RODRIGUES-VIVAS et al., 2011).
No Brasil não existe atualmente um programa oficial de controle do carrapato. Por
esta razão, os critérios para a aplicação dos acaricidas são definidos exclusivamente pelos
produtores, e em geral as informações sobre a epidemiologia do parasita são negligenciadas.
Acaricidas são escolhidos por diversos critérios, nem sempre avaliando a eficácia, e muitas
vezes a sua aplicação é inadequada, diminuindo o sucesso do tratamento (LABRUNA, 2008).
Uma mesma população de carrapato pode apresentar resistência para duas ou mais
classes de acaricidas, o que é conhecido como resistência cruzada. Este fenômeno é
acentuado nos casos em que um mesmo mecanismo confere resistência a mais de um
acaricida. O caso clássico é a resistência cruzada dos piretróides com o DDT (NOLAN et al.,
1977), que se deve a mutações que levam a alterações no sítio alvo que ambas as drogas
compartilham, o canal de sódio controlado por voltagem (FFRENCH-CONSTANT et al.,
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2004). Além disso, populações de carrapatos resistentes a múltiplas drogas têm sido descritas
(BENAVIDES et al., 2000; FERNÁNDEZ-SALAS et al., 2012).
O grupo das lactonas macrocíclicas, dividido em avermectinas (ivermectina,
abamectina e doramectina) e milbemicinas (moxidectina) são compostos estruturalmente
relacionados. As lactonas macrocíclicas possuem amplo espectro de ação, sendo eficazes
para o controle de endoparasitas e ectoparasitas. A resistência às lactonas macrocíclicas foi
primeiramente descrita no Brasil nos estados do Rio Grande do Sul (MARTINS &
FURLONG, 2001) e São Paulo (KLAFKE et al., 2006). Mais recentemente, foram descritos
casos no México (PEREZ-COGOLLO et al., 2010) e no Uruguai (CASTRO-JANER et al.,
2011). Os mecanismos de resistência a essa droga foram estudados nestas e em outras
espécies, e foram atribuídos à insensibilidade do sítio alvo, canal de cloro controlado por
glutamato, em Caenorhabditis elegans (GLENDINNING et al., 2011) e Tetranychus urticae
(KWON et al., 2010), e à atividade das enzimas de detoxificação, principalmente P450, em
Pediculus humanus humanus (YOON et al., 2011) e Leptinotarsa decemlineata
(ARGENTINE et al., 1992). Contudo, o mecanismo predominantemente descrito é a
detoxificação mediada por transportadores ABC (ATP-binding cassette), sendo relatado em
diversas espécies de nematódeos como C. elegans (JAMES & DAVEY, 2009), Haemonchus
concortus (BARTLEY et al., 2009; LIFSCHITZ et al., 2010a), Trichostrongylus
colubriformis (BARTLEY et al., 2009; DICKER et al., 2011), Onchocerca vulvulus
(BOURGUINAT et al., 2008), Ostertagia ostertagi (LIFSCHITZ et al., 2010b) e artrópodes
como Sarcoptes scabiei (MOUNSEY et al., 2010), P. h. humanus (YOON et al., 2011),
Culex pipiens (BUSS et al., 2002) e Chironomus riparius (PODSIADLOWSKI et al., 1998).
Transportadores ABC
Os transportadores ABC pertencem a uma das maiores famílias de proteínas
transmembrana e são identificados tanto em células procarióticas quanto eucarióticas
(HIGGINS & LINTON, 2003; LAGE, 2003). Os transportadores ABC são reconhecidos por
sua habilidade em modular a absorção, distribuição e excreção de toxinas nos organismos
(LESLIE et al., 2005; SZAKÁCS et al., 2008). O papel dos transportadores ABC na
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resistência às drogas é descrito em bactérias, fungos, endoparasitas e ectoparasitas
(KERBOEUF et al., 2003; KOENDERINK et al., 2010; LAGE, 2003; LESPINE et al., 2008;
POELARENDS et al., 2002). Este quadro dificulta enormemente o tratamento dessas
doenças, principalmente porque os transportadores ABC são relacionados à resistência a
múltiplas drogas, limitando o número de drogas disponíveis para o tratamento delas (LAGE,
2003; LESLIE et al., 2005).
Especificamente em R. microplus, o grupo de pesquisa brasileiro inserido nessa
proposta demonstrou a participação de transportadores ABC na resistência à ivermectina
(POHL et al., 2011). O tratamento com inibidores de transportadores ABC leva um aumento
significativo dos efeitos tóxicos da ivermectina em larvas e fêmeas adultas provenientes de
populações resistentes a esta droga. Em larvas, os efeitos tóxicos da ivermectina foram
observados pelo aumento da mortalidade, enquanto em fêmeas, o efeito mais considerável
foi a redução da postura e, também, na viabilidade dos ovos. Além disso, foi observado que
a alimentação artificial de fêmeas com sangue acrescido de 20 ng/mL de ivermectina reduziu
significativamente o índice de fertilidade e a viabilidade dos ovos na população sensível ao
acaricida. Na população resistente ao acaricida, efeito semelhante foi atingido somente
quando o inibidor de transportadores ABC ciclosporina A (CsA) foi adicionado ao
tratamento, ocorrendo também um significativo aumento de mortalidade das fêmeas (POHL
et al., 2011).
O aumento da transcrição de genes codificadores de transportadores ABC é associado
ao aparecimento da resistência em diversas espécies de parasitas. Corroborando com a
literatura, fêmeas de R. microplus resistentes à ivermectina apresentaram transcrição
induzida do gene codificador de um transportador ABC (RmABCB10) no intestino, porta de
entrada da ivermectina que é ingerida durante o repasto sanguíneo. A importância desse
transportador foi validada pelo silenciamento do gene por RNAi (RNA de interferência) no
intestino de fêmeas de R. microplus. Foi observado, pela diminuição na viabilidade dos ovos
das fêmeas, aumento da toxicidade da ivermectina nos carrapatos que tiveram o RmABCB10
silenciado (POHL, 2012).
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Resultado semelhante foi observado em uma linhagem de células embrionárias de R.
microplus resistentes à ivermectina (POHL et al., 2014). A toxicidade da ivermectina foi
aumentada quando as células foram tratadas com o inibidor CsA, indicando a participação
de transportadores ABC na detoxificação da droga. Além disso, ao expor células resistentes
ao acaricida, observou-se um aumento da transcrição de RmABCB10, indicando que
provavelmente o mesmo mecanismo induzido in vivo foi selecionado in vitro, validando os
resultados obtidos (POHL et al., 2014).
Devido à capacidade de transportar diversos tipos de drogas, os transportadores ABC
são responsabilizados pelo fenótipo de resistência a múltiplas drogas em diversos
organismos, incluindo R. microplus (POHL et al., 2011). Uma vez que populações de
carrapato resistentes a múltiplas drogas são comumente relatadas (BENAVIDES et al., 2000;
FERNÁNDEZ-SALAS et al., 2012; ORTIZ et al., 1995), analisamos a participação destas
proteínas na resistência a outros acaricidas em uma população de carrapato resistente a quatro
classes de acaricidas (lactonas macrocíclicas, organofosforados, piretróides e amitraz)
(POHL et al., 2011). Os inibidores de transportador ABC também aumentaram
significativamente a toxidade de duas outras lactonas macrocíclicas, moxidectina e
abametina, e do organofosforado clorpirifós, em larvas dessa população. Da mesma forma, a
toxicidade do amitraz foi aumentada quando as larvas foram expostas ao inibidor CsA. Este
resultado mostra que a detoxificação de drogas pelos transportadores ABC não é um
mecanismo exclusivo da ivermectina, mas sim um mecanismo comum para diferentes classes
de acaricidas e que deve ter importância fundamental na defesa desse parasita.
Adicionalmente, mostramos que em R. microplus os transportadores ABC são importantes
também na detoxificação de heme liberada durante a digestão do sangue do hospedeiro
(LARA et al, 2015). Em conjunto, todos estes resultados validam a participação do
transportador RmABCB10 no transporte de heme e de acaricidas no carrapato R. microplus.
Em hemoparasitas, os transportadores ABC também estão envolvidos na habilidade
em modular a absorção, distribuição e excreção de toxinas (LESLIE et al., 2005; SZAKÁCS
et al., 2008). Em Plasmodium falciparum, o agente causador da malária, mutações em
diferentes posições do gene que codifica o transportador ABC PfMDR1 são atribuídas à
diminuição de sensibilidade do parasita a drogas como a cloroquina e amodiaquina, enquanto
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o aumento da expressão desse gene não é observado em populações resistentes
(KOENDERINK et al., 2010). Em nematódeos parasitas, como H. contortus e O. volvulus, e
de vida livre, como C. elegans, o aumento de expressão de transportadores ABC relaciona-
se com resistência à ivermectina e moxidectina (HUANG & PRICHARD, 1999; JAMES &
DAVEY, 2009; XU et al., 1998). Entretanto, em babesia e anaplasma pouco é conhecido
sobre a função dos transportadores ABC. Contudo, seus transportadores ABC são similares
a moléculas que em outros organismos foram associadas à resistência a drogas (dado não
publicado).
Estes resultados sustentam a ideia de que a coadministração de inibidores de
transportador ABC e ivermectina aumenta a suscetibilidade do carrapato à ivermectina, e que
as doses e a frequência de aplicação do acaricida podem ser diminuídas. Sendo assim, o
aparecimento da resistência pode ser retardado e os níveis de resíduos do acaricida na carne
e no leite serem diminuídos. Os dados obtidos com o estudo dos transportadores ABC em R.
microplus pelo grupo brasileiro presente nesta proposta possibilitaram a submissão de um
pedido de patente para uso da associação de carrapaticidas com inibidores de transportadores
ABC para controle de carrapato (número do registro: BR1020160164524, “Método de
controle de carrapatos com inibidores de transportadores ABC").
Para demonstrar o envolvimento dos transportadores ABC na resistência a acaricidas,
foram utilizados ciclosporina A e MK571, dois inibidores clássicos dos transportadores ABC
(POHL et al., 2011). Entretanto, a estratégia do uso de inibidores de transportadores ABC
associados à acaricidas para controle do carrapato necessita da caracterização de inibidores
mais adequados para evitar efeitos colaterais da inibição de transportadores ABC no
hospedeiro vertebrado e viabilizar aplicação comercial no futuro. A confirmação da
participação de transportadores ABC na resistência à ivermectina permitirá a investigação de
estratégias para aumentar a eficiência desse acaricida. A estratégia a ser utilizada é o uso de
inibidores de transportadores ABC para bloquear os mecanismos de resistência a
ivermectinas. Paralelamente, iremos analisar o efeito dos inibidores de transportadores ABC
sobre a biologia da Babesia spp, tendo como objetivo controlar, tanto o carrapato como as
babesias.
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Neste projeto primeiramente iremos caracterizar o efeito de diferentesinibidores de
transportadores ABC na fisiologia do carrapato R. microplus e de Babesia spp. O segundo
objetivo é caracterizar transportadores ABC de populações de campo (resistentes e sensíveis
a diferentes acaricidas) e analisar as alterações na expressão de genes em carrapatos
resistentes a ivermectinas, expostos ou não ao acaricida e a inibidores de transportadores
ABC, através da análise da expressão gênica global por RNAseq de diferentes tecidos de R.
microplus. Finalmente, baseado nos resultados preliminares, testaremos em bovinos tratados
simultaneamente com ivermectina e inibidores de transportadores ABC o efeito causado
sobre uma infestação de carrapato.
C. OBJETIVOS E METAS
OBJETIVOS
Tendo em vista a disseminação de populações de carrapatos resistentes a acaricidas,
bem o papel na transmissão dos hemoparasitas:
1- Caracterizar o efeito de diferentes inibidores de transportadores ABC na fisiologia
do carrapato R. microplus e de Babesia spp.
2- Determinar eventos relacionados a alterações na expressão de genes em carrapatos
resistentes a ivermectinas, expostos ou não expostos ao produto, através da análise da
expressão gênica global em tecidos de R. microplus.
3- Caracterizar o efeito de inibidores de transportadores ABC na resistência a acaricidas
através do tratamento de populações de campo, resistentes e sensíveis a diferentes acaricidas,
com diferentes inibidores de ABC.
METAS
1. Identificar e caracterizar molecularmente transportadores ABC em R. microplus,
Babesia bovis e B. bigemina;
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2. Avaliar o efeito de diferentes inibidores de transportadores ABC sobre isolados
de R. microplus resistentes e sensíveis a acaricidas;
3. Testar o efeito de diferentes inibidores de transportadores ABC sobre o cultivo
de Babesia bovis e B. bigemina;
4. Analisar diferenças no perfil de transcrição de genes de transportadores ABC
entre cepas de carrapatos resistentes e sensíveis a ivermectinas na presença e
ausência da mesma;
5. Testar o efeito de diferentes inibidores de transportadores ABC sobre o controle
do carrapato em infestações em bovinos e transmissão de Babesia bovis e B.
bigemina pelo carrapato;
6. Contribuir para o desenvolvimento da pesquisa e ensino nas instituições
envolvidas, baseado no oferecimento de cursos e estágios entre docentes e
estudantes, permitindo treinamento em técnicas apenas disponíveis em outros
laboratórios parceiros;
7. Aumentar o intercâmbio entre alunos dos grupos de pesquisa aprimorando a
formação de recursos humanos, possibilitando que pesquisadores e estudantes
adquiram experiência em ambiente com cultura científica diversificada de modo
a apressar a inserção internacional dos estudantes que participam diretamente do
projeto.
D. METODOLOGIA
O laboratório onde o trabalho será desenvolvido no Brasil possui o Certificado de
Qualidade em Biossegurança, Laboratório de Imunologia CQB n° 0060/98 (D.O.U 170,
04/09/1998).
Animais
Este projeto foi submetido para análise da Comissão de Ética no Uso de Animais da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
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No Brasil, a colônia de carrapatos R. microplus será alimentada em bovinos oriundos
do município de Santa Vitória do Palmar (RS), região livre de R. microplus, Babesia spp. e
Anaplasma spp. Os bovinos da raça Hereford de 6-18 meses de idade serão mantidos isolados
em estábulo, junto ao Laboratório de Entomozooses da Faculdade de Veterinária, UFRGS.
Os carrapatos serão mantidos durante a fase de vida livre em estufa a 28°C com 85% de
umidade.
No Uruguai, os experimentos serão realizados com carrapatos da colônia de R.
microplus mantida pelo Instituto de Investigaciones Veterinárias “Miguel C. Rubino”. Os
bovinos serão mantidos em sistema de confinamento no “Miguel C. Rubino”, para
manutenção da cepa de R. microplus e para obtenção de material para os experimentos.
No Brasil, Uruguai e Argentina, os carrapatos R. microplus de população de campo
serão coletados em bovinos provenientes de fazendas comerciais que apresentarem
população de carrapatos resistentes a acaricidas.
Clonagem e caracterização molecular de transportadores ABC
Iniciadores para uso nas reações de PCR serão projetados a partir de bancos de
sequências dos grupos de pesquisa. A clonagem será realizada com estes iniciadores e cDNA
sintetizados a partir de RNA obtido de carrapatos R. microplus da colônia da UFRGS e de
populações de campo do Brasil, Uruguai e Argentina para permitir análise da variabilidade
dos genes. A clonagem será confirmada por PCR, clivagem por enzima de restrição e
sequenciamento para posterior caracterização da sequência predita de aminoácidos. As
sequencias codificadoras de isolados de estudo do Uruguai e Brasil já estão clonados e
servirão de base para as análises.
Avaliação de inibidores de transportadores ABC sobre a toxicidade da
ivermectina in vitro
Os ensaios serão conduzidos utilizando-se inibidores de ABC (zosuquidar, Ko143,
elacridar, reversan, dexverapamil, tariquidar) que serão inoculados juntamente com
ivermectina em diferentes concentrações, em exemplares do carrapato R. microplus.
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Também serão testados grupos controles negativos, no quais os carrapatos serão tratados
somente com inibidores e um grupo controle positivo, tratado com ivermectina.
Em seguida ao tratamento, os carrapatos serão mantidos em câmara incubadora do tipo
BOD sob temperatura de 27 ºC e umidade relativa acima de 85% para analisar a
sobrevivência dos carrapatos, a capacidade de postura das fêmeas e a eclosão dos ovos. Serão
realizadas observações diárias para obtenção destes parâmetros biológicos.
Avaliação de inibidores de transportadores ABC em Babesia spp.
O sistema estacionário microaerofílica (Levy e Ristic, 1980) será utilizado para
estabelecer e manter as Babesia spp. As culturas de células em meio contendo 10% de
hemáceas bovinas e suplementado com 40% soro bovino mantidos a 37 °C. Os inibidores de
ABC serão adicionados em diferentes concentrações à cultura. A troca de meio será realizada
cada 24 h de cultura e subculturas serão feitas a cada 48 h ou de acordo com a parasitemia
desejada, avaliada por esfregaço do cultivo.
Avaliação de inibidores de transportadores ABC sobre a toxicidade da
ivermectina in vivo
Os ensaios serão conduzidos utilizando-se os inibidores de ABC que mostraram melhor
atividade nos experimentos in vitro. Os inibidores serão inoculados em bovinos, juntamente
com ivermectina, em diferentes concentrações. Os princípios ativos serão testados quanto a
sua capacidade em conferir aos bovinos uma proteção contra a infestação de carrapatos em
ensaio de infestação experimental.
A proteção à infestação será avaliada por parâmetros biológicos (percentagem e peso
das fêmeas ingurgitadas, coletadas após o ciclo parasitário; percentagem das fêmeas jovens
coletadas após o ciclo parasitário; percentagem de fêmeas que realizam postura após o ciclo
parasitário; percentagem dos ovos que eclodem).
Avaliação da transcrição dos genes em tecidos por RT-PCR quantitativo (qRT-
PCR).
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A detecção e quantificação da transcrição dos genes serão avaliadas nos diferentes
tecidos do carrapato e amostras de Babesia spp. por PCR em tempo real. A qRT-PCR será
realizada utilizando iniciadores específicos. Os genes de actina e proteína ribossomal 40S
serão utilizados como controles constitutivos.
Sequenciamento em larga escala
Os sequenciamentos dos transcritos dos tecidos de carrapatos sensíveis e resistentes,
tratados e não tratados com inibidores de transportador ABC serão realizados pela tecnologia
de RNA-seq com a plataforma Illumina (MiSeq e HiSeq). A montagem será realizada com
informações públicas disponíveis do genoma R. microplus (Bellgardet al, 2012) e dados de
transcriptomas que foram realizados pelo nosso grupo de pesquisa (dados ainda não
publicados). A expressão diferencial será analisada por diferentes programas disponíveis em
softwares apropriados em R (Bioconductor).
A anotação será realizada baseada no sistema de nomenclatura universal derivado do
projeto ‘Gene Ontology’ (‘GO’, tttp://www.geneontology.org/) e complementado com as
informações de vias metabólicas, utilizando o KEGG (Kyoto Enciclopedia of Genes and
Genomes). Finalmente os dados serão disponibilizados em um banco de dados com acesso
online.
E. PRINCIPAIS CONTRIBUIÇÕES CIENTÍFICAS, TECNOLÓGICAS OU
DE INOVAÇÃO DA PROPOSTA
Ao final do projeto, o resultado previsto é aumentar a compreensão sobre o papel dos
transportadores ABC do carrapato R. microplus e dos hemoparasitas. Dentro deste objetivo
pretendemos identificar moléculas inibidoras dos transportadores e que tenham potencial
para serem utilizadas para melhorar a eficiência dos princípios ativos em uso. Paralelamente,
pretendemos analisar a participação destes inibidores na transmissão de Babesia spp. pelo
carrapato. São previstas apresentações dos resultados em congressos da área, assim como a
publicação de artigo científico em revista de circulação internacional, além da formação de
recursos humanos com orientação de estudantes de graduação e pós-graduação.
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O estudo funcional nos transportadores ABC é um passo importante para o melhor
entendimento da fisiologia do carrapato bovino e dos parasitas intracelulares por ele
transmitidos. Estas proteínas podem ser alvos de drogas para o controle do carrapato,
apresentando-se como uma alternativa para melhorar a eficiência dos acaricidas. Como o
combate ao carrapato tem elevado custo, a obtenção de meios de controle mais eficazes teria
um impacto econômico direto na cadeia produtiva da pecuária bovina brasileira.
F. ORCAMENTO
Orçamento passagens e diárias
Intercâmbio de pesquisador brasileiro a Argentina
Passagem Porto Alegre – Buenos Aires – Porto Alegre R$ 1.500,00
Seguro-saúde R$ 150,00
Intercâmbio de pesquisador brasileiro ao Uruguaia
Passagem Porto Alegre – Montevideo – Porto Alegre R$ 1.000,00
Seguro-saúde R$ 150,00
Intercâmbio de estudante brasileiro a Argentina
Passagem Porto Alegre – Buenos Aires – Porto Alegre R$ 1.500,00
Seguro-saúde R$ 150,00
Intercâmbio de estudantes ao Brasil
Diárias para Intercâmbio de pesquisador argentino (10 dias) R$ 1.900,00
Diárias para Intercâmbio de estudante argentino (15 dias) R$ 2.900,00
Diárias para Intercâmbio de estudante uruguaio (15 dias) R$ 2.900,00
Diárias para Intercâmbio de estudante argentino (15 dias) R$ 2.900,00
Diárias para Intercâmbio de estudante uruguaio (15 dias) R$ 2.900,00
Viagem para avaliação do projeto
Passagem Porto Alegre –Brasília –Porto Alegre R$ 2.000,00
Diárias R$ 400,00
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Passagem Porto Alegre –Brasília –Porto Alegre R$ 2.000,00
Diárias R$ 400,00
Subtotal R$ 22.750,00
Despesas de custeio:
Reagentes para biologia molecular (reagentes para extração de
DNA
e RNA, reagentes para sequenciamento, reagentes para qPCR
reagentes para clonagem) R$ 30.000,00
Consumíveis para bioquímica (teste com inibidores) R$ 10.000,00
Consumíveis para biologia molecular (tubos, ponteiras, placa
para qPCR) R$ 15. 000,00
Consumíveis para sequenciamento (RNAseq) R$ 30.000,00
Reagentes em geral para soluções R$ 10.000,00
Bovinos para manutenção da linhagem de carrapato R$ 5.000,00
Serviços de Terceiros (manutenção de equipamentos) R$ 10.000,00
Serviços de Terceiros (manutenção de equipamentos) R$ 10.000,00
Subtotal R$ 120.000,00
Total do Projeto R$ 142.750,00
G. CRONOGRAMA FÍSICO FINANCEIRO
Meta/Atividade
Semestre
Identificar e caracterizar transportadores ABC em R. microplus,
Babesia bovis e B. bigemina
X X
Avaliar o efeito de diferentes inibidores de transportadores ABC
sobre isolados de R. microplus resistentes e sensíveis a acaricidas
X X
15
Testar o efeito de diferentes inibidores de transportadores ABC
sobre o cultivo de Babesia bovis e B. bigemina
X X X
Analisar diferenças no perfil de transcrição de genes entre cepas de
carrapatos resistentes e sensíveis a ivermectinas em presença e
ausência da mesma
X X X X
Testar o efeito de diferentes inibidores de transportadores ABC
sobre o controle do carrapato em infestações em bovinos e
transmissão de Babesia bovis e B. bigemina pelo carrapato
X X
Avaliação da transcrição dos genes em tecidos por PCR quantitativo
(qPCR)
X X X X
Sequenciamento de larga escala X X X
Cronograma de Viagens
Atividade 1 ano 2 ano
Viagem ao Brasil de um pesquisador argentino para
ministrar um curso em pós-graduação
10 dias
Viagem a Argentina de um pesquisador brasileiro para
ministrar um curso em pós-graduação
10 dias
Viagem a Uruguai de um pesquisador brasileiro para
ministrar um curso em pós-graduação
10 dias
Viagem a Argentina de estudante brasileiro, para realizar
experimentos
15 dias
Viagem ao Brasil de estudante argentino, para realizar
experimentos
15 dias 15 dias
16
Viagem ao Brasil de estudante uruguaio, para realizar
experimentos
15 dias 15 dias
H. PARTICIPANTES DO PROJETO, E TÍTULO DO PROJETO NA
ARGENTINA
Nome do projeto na chamada na Argentina:
Estudios transcriptómicos para la caracterización del efecto de inhibidores de transportadores
ABC sobre la garrapata común del bovino y los patógenos que transmite.
Coordenadores:
Brasil: Itabajara da Silva Vaz Junior
Argentina: Andrea Puebla
Uruguai: Uruguaysito Benavides
Equipes nos Brasil
Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS)
Permanentes
Prof. Itabajara da Silva Vaz Junior, doutor, UFRGS, coordenador do projeto
Prof. Carlos Termignoni, doutor, UFRGS
Pós-doutorandos
Mariana Loner Coutinho, pós-doutoranda no PPGBCM, UFRGS.
Luís Fernando Parizi, pós-doutorando no PPGBCM, UFRGS;
Daiane Oldiges, pós-doutoranda no PPGCV, UFRGS;
Lucas Dedavid pós-doutorando no PPGBCM, UFRGS
17
Discentes
Gabriela Sabadin, doutoranda PPGBCM, UFRGS;
Marina Xavier, doutoranda PPGBCM, UFRGS;
Lucía Laura Sánchez Di Maggio, doutoranda PPGBCM, UFRGS.
Centro de Biociências e Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro (UENF)
Permanentes
Prof. Carlos Logullo, doutor, UENF
Pós-doutorando
Renato Martins da Silva pós-doutorando no PPGCA, UFRGS
Discentes
Josias Alves Machado, doutoranda no PPGCA UEENF
Camila Fernanda Waltero Orjuela, doutoranda no PPGCA UEENF.
Equipe Colaboradora da Argentina
Instituto de Biotecnología, Inst. Nacional de TecnologíaAgropecuaria (INTA)
Permanentes
Andrea Puebla, doutora INTA
Marisa Farber, doutora INTA
Máximo Rivarola, doutor INTA
18
Colaboradores
Silvina Wilkowsky, doutora INTA
Laura Lozina, doutora INTA
Elvio Ríos, doutor INTA
Néstor Sarmiento, doutor INTA
Paula del Carmen Fernandez, INTA
Pós-doutorando
Ludmila Lopez Arias, pós-doutoranda INTA
Equipe Colaboradora do Uruguai
Laboratorio de Inmunología, Departamento de Ciencias Microbiológicas Facultad de
Veterinaria e Laboratorio de Biología Parasitaria. Facultad de Ciencias, Uruguay,
UDELAR, Montevideo
Permanentes
Uruguaysito Benavides, professor, coordenador no Uruguai
Patricia Berasain doutora.
Discentes
Carolina Acevedo, doutoranda PPGCV, UDELAR
Fernanda Alzugaray, doutoranda PPGCV, UDELAR
19
I. DEMONSTRAÇÃO DO MECANISMO DE INTERAÇÃO E GRAU DE
COMPLEMENTARIDADE ENTRE OS PROJETOS
Durante as duas últimas décadas, os grupos de pesquisa da UFRGS e da UENF têm
desenvolvido projetos de pesquisa envolvendo a caracterização de proteínas do carrapato R.
microplus. Os pesquisadores do grupo proponente publicaram mais de 100 artigos sobre o
carrapato em revistas indexadas, sendo que a grande maioria destes artigos resultou de
colaborações entre os dois grupos brasileiros. Uma das características da interação entre os
grupos é a estreita colaboração em diversos projetos de pesquisa e no intercâmbio de alunos
de graduação e pós-graduação. Em 2008, esta integração foi consolidada com a criação do
Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Entomologia Molecular.
Também nos últimos 10 anos temos mantido uma colaboração com o Laboratorio de
Inmunología da Facultad de Veterinaria da UDELAR (Uruguai). O proponente de desse
projeto, Itabajara Vaz, é orientador dos Programa de Posgrado da Facultad de Veterinaria e
Programa de Posgrado de Biotecnologia da Faultad de Ciencia da UDELAR e neste programa
orientou 2 alunas de mestrado e está orientando quatro estudantes de doutorado. Esta
interação, financiada por vários projetos CAPES, CNPq e UDELAR tem permitido que
estudantes brasileiros e uruguaios realizem diversos estágios nos laboratórios de ambos
países. Nos projetos em conjunto estamos caracterizando proteínas de populações do
carrapato dos dois países e realizando análises imunológicas para avaliar o potencial para
desenvolvimento de uma vacina contra o carrapato. Baseado nos resultados já obtidos, já
publicamos 4 artigos em colaboração e solicitamos patentes no Brasil e no Uruguai. Mais
recentemente, avançamos na colaboração com a Profa. Patrícia Berasain iniciando estudos
conjuntos para identificar em R. microplus e Fasciola hepatica proteínas ligadoras de
heparina e inibidores de serinoproteases.
Há 3 anos, iniciamos uma colaboração com um grupo de pesquisa argentino do
Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), devido a experiência que os
pesquisadores do INTA têm sobre biologia molecular de parasitas e a capacidade técnica e
infraestrutura para análise de sequenciamento em massa de DNA/cDNA. Os pesquisadores
20
do INTA também têm experiência na biologia dos parasitas Babesia spp. e Anaplasma spp.
Este conhecimento permitirá ampliar o foco dos nossos estudos, analisando a biologia destes
parasitas em associação com a do carrapato. Este foco permitirá ampliar o estudo de
alternativas para o melhorar a produtividade da pecuária destes países.
Em vistas disto, o projeto agora submetido fortalecerá a interação dos grupos de
pesquisa dos três países, assim como possibilitará que estudantes da pós-graduação realizem
experimentos no outro país e que pesquisadores ministrem disciplinas nos outros países. A
cooperação internacional para estudar um problema comum, o carrapato R. microplus,
permite que populações diferentes de carrapato sejam estudas comparativamente e constituí
fator que aumenta as possibilidades de que sejam identificadas novas alternativas para o
controle do parasita.
Este relato demonstra que a integração entre os grupos de pesquisa tem permitido o
desenvolvimento de estudos necessários para atingir os objetivos propostos utilizando-se
sinergicamente a infraestrutura e os recursos humanos existentes nos vários laboratórios.
Além disso, acreditamos que os recursos obtidos pela presente proposta contribuirão
significativamente não apenas para o desenvolvimento das teses de alunos que trabalham
com o carrapato bovino, mas também para o aumento do conhecimento sobre o carrapato. O
apoio a presente proposta será fator importante para consolidar as interações científicas e
auxiliará a atingir os objetivos traçados.
J. Detalhamento das atividades a serem executadas
As atividades do projeto serão baseadas nas interações prévias e expertises dos grupos
de pesquisa envolvidos. A caracterização das atividades biológicas dos transportadores ABC
de carrapato e sua relação com resistência a acaricidas, tem realizada pelo grupo de pesquisa
da UFRGS e UENF. A partir dos dados iniciais, tem existido uma colaboração com o grupo
da UDELAR para o estudo de transportadores ABC em populações de carrapato de campo.
Paralelamente os grupos argentinos e brasileiros têm realizados projeto focando a análise
21
transcriptômica de diferentes tecidos de carrapatos e o grupo argentino tem grande
experiência no estudo dos parasitas Babesia spp.
No atual projeto iremos utilizar sinergicamente a infraestrutura e os recursos humanos
existentes nos vários laboratórios com o objetivo de ampliar o foco do estudo dos
transportadores ABC para populações de carrapatos do Brasil, Uruguai e Argentina, bem
como para os hemoparasitas Babesia spp.
As atividades vinculadas a caracterização dos transportadores ABC de carrapato por
meio de inibidores serão realizadas no Brasil e Uruguai. O estudo dos transportadores ABC
de Babesia spp. será realizado na Argentina. No Brasil e Uruguai serão realizadas as
clonagens dos genes de transportadores ABC. As análises das expressões por qPCR, em
carrapato e Babesia spp., serão realizadas nos três países. Os transcriptomas de parasitas
tratados e não tratados com inibidores serão realizados na Argentina e a análise dos dados
serão realizadas no brasil e Argentina. Os experimentos do efeito de tratamento com
inibidores de transportadores ABC sobre a transmissão de Babesia spp. para bovinos serão
realizados no Uruguai.
Os intercâmbios de estudantes servirão para otimizar os usos das diferentes
infraestruturas dos diferentes laboratórios com as atividades de estudante. Uma doutoranda
do Brasil (transcriptoma de carrapatos) e uma doutoranda do Uruguai (caracterização
biológica de transportadores ABC em carrapatos de campo) realizarão suas teses com
resultados diretamente relacionados ao projeto. Outros estudantes terão parte de suas teses
vinculadas a este projeto.
A cooperação internacional para estudar um problema comum constituí fator que
aumenta as possibilidades de que sejam identificadas novas alternativas para o controle dos
parasitas.
Os intercâmbios dos pesquisadores e estudantes estão detalhados abaixo:
Intercâmbio de pesquisador brasileiro na Argentina
A viagem servirá para realizar um curso para a pós-graduação e discutir resultados do
projeto.
22
Intercâmbio de pesquisador brasileiro no Uruguai
A viagem servirá para realizar um curso para a pós-graduação e discutir resultados do
projeto.
Intercâmbio de pesquisador argentino no Brasil
A viagem servirá para realizar um curso para a pós-graduação e discutir resultados do
projeto.
Intercambio de estudante brasileiro na Argentina
A viagem servirá para realizar experimentos relacionados a sequenciamento em larga
escala de transcriptomas de carrapatos.
Intercâmbio de estudante argentino no Brasil
A viagem servirá para realizar experimentos relacionados a análise transcrição de
genes (qPCR) de cultivos de Babesia spp.
Intercâmbio de estudante uruguaio no Brasil
A viagem servirá para realizar experimentos relacionados a análise transcrição de
genes (qPCR) de carrapatos.
K. INFRAESTRUTURA E APOIO TÉCNICO PARA O
DESENVOLVIMENTO DO PROJETO
O grupo proponente é formado por pesquisadores com experiência consolidada. Neste
sentido, os equipamentos necessários para o desenvolvimento deste projeto encontram-se
disponíveis em suas instituições de origem.
Estábulos para bovinos para manutenção da colônia de carrapato e experimentos de
vacinação, localizado na Faculdade de Veterinária da UFRGS e na UDELAR..
Equipamentos básicos utilizados para purificação e caracterização de proteínas, como
cromatógrafos, espectrofotômetros, fluorímetros, ultracentrífugas, distribuídos pelos
laboratórios participantes além de equipamentos para biologia molecular (termocicladores,
speed-vac, estufas, fluxos laminares) e cintiladores líquidos encontram-se disponíveis na
UFRGS, UENF, UDELAR e INTA.
23
Sala de cultura e equipamentos para cultivo celuar na UFRGS, UENF e INTA.
Equipamentos para eletroforese bidimensional estão disponíveis na UFRGS e INTA.
Plataforma de sequenciamento Illumina (equipamentos HiSeq e MiSeq) e
equipamento de genotipagemem larga escalar e análises de perfil de expressão (Inst.
Biotecnología, INDEAR, Fundación Leloir, INTA).
Unidad de Bioinformática do Instituto de Biotecnología (INTA), para processamento
e análise de dados de genômica funcional que permite a montagem e análise de dados de
transcriptoma
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