A prokaryotic alternative oxidase present in the bacterium

Novosphingobium aromaticivorans

Pal Stenmark, Par Nordlund

FEBS Letters 552 (2003) 189-192

Introdução

A AOX Ocorrência:

Todas as plantas superiores, alguns fungos, tripanossomas e na bactéria N. Aromaticivorans.

Funções: Transferir diretamente elétrons da ubiquinona reduzida

para o oxigênio; Em algumas plantas volatilizar aminas para atrair

polinizadores; Evitar formação de ROS, pelo acumulo de ubiquinona

reduzida quando a via principal estiver bloqueada, ou quando a carga energética estiver alta;

Plasticidade metabólica, balanceando o metabolismo de carbono e o transporte de elétrons.

Introdução

Introdução

Regulação:

Introdução

Regulação: Em plantas, a enzima é homodimérica e tem sua

atividade aumentada pela redução das pontes dissulfeto entre as sub-unidades;

É também estimulada por α-ceto ácidos, especialmente o piruvato, o qual reage com grupos sulfidrilas da porção N-terminal da proteína;

Em fungos, a enzima é monomérica e não é estimulada por α-ceto ácidos, porém é estimulada por ADP, AMP e GMP.

Introdução

Regulação:

Introdução

Materiais e Métodos

Clonagem e expressão: A AOX de N. aromaticivorans (NaAOX) foi clonada no

plasmídio pUNI-10, originando o vetor pUNI-NaAOX. pUNI-NaAOX foi então recombinado com o vetor de alto

nível de expressão pHB-MALc2X e e ao de baixa expressão pHB-MALc2M, originando os vetores de expressão pNaAOX-C2X e pNaAOX-C2M, ambos com proteína de fusão MPB

Ensaio de complementação: Bactérias E.coli heme-deficientes (SASX41B) foram

transformadas pelos vetores de expressão e induzidas por IPTG.

Materiais e Métodos

Regulação da NaAOX em N. aromaticivorans A expressão da NaAOX foi medida por Western

blot, usando um anticorpo para a AOX de S. guttatum

Foram analisadas culturas de N.aromaticivorans em meios com glicose ou lactose, com e sem agitação para modular diferentes níveis de oxigênio

Resultados e Discussão

Atteia, A et al. 2003

Resultados e Discussão

A NaAOX possui 229 aminoácidos; Possui 58% de similaridade com a AOX de A.

thaliana, não incluindo ~134 aminoácidos na porção N-terminal;

Não possui a cisteína regulatória; Pelo tamanho reduzido, deve possuir os atributos

mínimos para uma AOX funcional.

Resultados e Discussão

Aparentemente a indução da construção de alto nível de expressão por IPTG levou ao estresse das células, impedindo a formação de colônias;

Bactérias portando essa construção expressaram a NaAOX em altos níveis quando induzidas em meio LB líquido.

Resultados e Discussão

Resultados e Discussão

Resultados e Discussão

Durante o ciclo de vida, a bactéria é exposta a condições nas quais as oxidases normais são inibidas;

Juntamente com o o Complexo I, a AOX possibilitaria o bombeamento de prótons quando tais oxidases estivessem inibidas;

O aumento dos níveis da NaAOX em condições de baixa concentração de oxigênio, indica que a proteína não atua simplesmente na eliminação do excesso de oxigênio celular;

Resultado e Discussão

Como N. aromaticivorans utiliza muitos compostos como fonte de carbono e energia e a glicose possui maior energia do que a lactose, a NaAOX deve atuar balanceando o metabolismo de carbono e o transporte de elétrons;

A alta similaridade entre a AOX de N. aromaticivorans e a de plantas é um forte indício que o gene tenha sido adquirido diretamente de plantas por transferência horizontal;

Outro indicio forte de transferência horizontal é a existência de espécies do gênero Novosphingobium que têm plantas como habitat.