Lima, LM©

HUBER, Paula C.; ALMEIDA, Wanda P. and FATIMA, Ângelo de. Glutationa e enzimas relacionadas: papel biológico e importância em processos patológicos. Quím. Nova [online]. 2008, vol.31, n.5, pp. 1170-1179.

Glutationa reduzida (GSH) é um dos principais antioxidantes do meio intracelular e está implicada na prevenção de inúmeras doenças promovidas pelo excesso de radicais livres ou espécies reativas oxigênio (câncer; aterosclerose, artropatias, diabetes e envelhecimento).

glutationa oxidase

glutationa redutase

glutationa peroxidase

GSH apresentar elevada capacidade de doar e- (forte redutor), o que é evidenciado por seu elevado potencial redox negativo GSH/GSSH (E’0 = -0.33 V). Para seu efeito antioxidante é necessário sua oxidação à glutationa dissulfeto (GSSG) via GO e GSH-Px

GSH é abundante no interior das células (atingindo concentrações na ordem dos mM)

O fígado é o órgão mais envolvido na destoxicação de xenobióticos e também é o local de maior

reserva de GSH (exportando GSH para outros órgãos).

glutationa atinge a sua maior concentração intracelular nas células parenquimatosas (cerca de 10 mM)

do fígado saudável

Os hepatócitos são as células mais especializadas na síntese de GSH a partir dos seus percursores, na

reciclagem de GSH a partir de GSSG

A eliminação do conjugados de S-glutationa a partir da célula é um processo dependente de ATP

mediado por glicoproteínas membranares pertencentes à família MRP (mutidrug-resistance protein).

Logo, as proteínas da família MRP são essenciais no transporte de conjugados de S-glutationa para o

espaço extracelular

A razão GSH/GSSG é normalmente utilizada para estimar o estado redox dos sistemas biológicos

Em situações normais a GSSG representa apenas uma pequena fracção da glutationa total (<10%)

http://www.medicinacomplementar.com.br/temaSET04.asp

GSH synthesis. Synthesis of GSH occurs via a two-step ATP-requiring enzymatic process. The first step is catalyzed by glutamate-cysteine ligase (GCL), which is composed of catalytic and modifier subunits (GCLC and GCLM). This step conjugates cysteine with glutamate, generating γ-glutamylcysteine. The second step is catalyzed by GSH synthase, which adds glycine to γ-glutamylcysteine to form γ-glutamylcysteinylglycine or GSH. GSH exerts a negative feedback inhibition on GCL.

Shelly C. Lu, Glutathione synthesis Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. Volume 1830, Issue 5, May 2013, Pages 3143–3153

Lima, LM©

??

Estrógenos (androstenodiona) via adrenal e

(androstenodiona e testosterona) via tecidos

periféricos Pós-menopausa

Biossíntese de estrogênio por ação de Aromatases (Membro da família de enzimas monooxigenase CYP450, a qual converte andrógeno C-19 em estrogênio C-18 através de três hidroxilações sequenciais)

Lima, LM©

http://www.us.femara.com/info/page/about-assistance

Before therapy: Androgen (a hormone found in both men and women)

is produced by fat, muscle, and adrenal glands. Aromatase enzyme is

needed to convert androgen into estrogen, which results in tumor

growth.

With therapy: FEMARA (Novartis) binds to the aromatase enzyme

and blocks it from converting androgen to estrogen, thereby reducing

growth of the tumor.

N

N

N

NC CNFemara®

Lima, LM©

CN

CH3

NC

CH3

CH3H3C

N

N N

Anastrozole (Arimidex®)

N

N

N

NC CN

Letrozole (Femara®) Brodie, A. Trends in Endocrinology & Metabolism (2002) 13: 61-65

O

CH3

CH3

O

H

HH

CH2

Exemestane (Aromasin®)

OH

O

CH3

CH3

O

H

HH

Formestane (Formastat®)

Lima, LM©

N

NH2

HO

Hserotonina

Mediador Inflamatório

Aumento da Permeabilidade

Vascular

Merck

1963

Screening ca. 350 compostos

indólicos

N

H3CO

OH

O

CH3

O

Cl

Indometacina

(Indocid®, 1963)

N

HO

H

O

OH

CH3

metabólito ativo

Fase I

Hidrólise

O-demetilação

ácido indolilacético

N

HO

H

O

OH

MAO

Similaridade estrutural

Psicose, cefaléia

frontal, depressão,

Vertigem,

alucinações, etc.

“efeito orto” N

OH

O

CH3

H3C

O

Tolmetin (Tolecti n®, 1976)

N

OH

O

CH3

OH3C

Cl

Zomepirac (1980)

Proteção

metabólica

Proscrito 1983

Reações

anafiláticas

F

CH3

OH

O

SH3C

O

sulindaco

serotonina

Lima, LM©

NN

CF3

F

S

H3C O

O

protótipo

Modificações

Moleculares

inativo

IC50> 100 mM (COX-1)

IC50= 0,1 mM (COX-2)

Modificações

Moleculares

R

CF3

Cl

F

CH3

OCH3

SCH3

NHCH2

CO2H

3-CH3

2-CH3

IC50 (COX-1)

<100 mM

17 mM

25 mM

15 mM

2,58 mM

1,19 mM

13,8 mM

>250 mM

33,9 mM

18,1 mM

IC50 (COX-2)

8,23 mM

0,01 mM

0,041 mM

0,04 mM

0,008 mM

0,009 mM

0,016 mM

11,2 mM

0,069 mM

0,11 mM

R1

SO2NH2

SO2NH2

SO2NH2

SO2NH2

SO2NH2

SO2NH2

SO2NH2

SO2NH2

SO2NH2

SO2NH2

Penning, TD et al. (1997) J. Med. Chem. 40: 1347-1365

NN

CF3

SH3C

O O

F

SC-58125

NN

CF3

R1

R

esqueleto básico

t1/2= 117h

NN

CF3

Cl

SH2N

O O

NN

CF3

H3C

SH2N

O O

celecoxibCOX-2 seletivo

IS=460

t1/2 = 8 h

Lima, LM©

alpidem 2.250

N

N

Cl

O

N

CH3

H3C

Cl

CYP1A2

GTS/GSH

N

N

Cl

O

N

CH3

H3C

Cl

SG

2.251

N

N

Cl

Cl

O

HO

2.252

N

N

H3C

O

N CH3

H3C

CH3

zolpidem 2.37

CYP3A4

ADHN

N

HO2C

O

N CH3

H3C

CO2H

2.253

homólogo inferior

Lima, LM©

ansiolítico (agonista de receptores de serotonina); ↑efeito 1ª passagem; ↓ biodisponibilidade oral

N

N

N N N

O

Obuspirona

N

N

N N N

O

Obuspirona-análogo

F

IC50 (5HT1A) = 0,025

t1/2 = 4,6 h IC50 (5HT1A) = 0,063

t1/2 = 52,3 h

ansiolíticos (antagonista receptores de taquicinina NK2)

O

N

Cl

Cl

N

CH3

OH

Cl

Cl

N

OH

pA2 (NK2)= 9.5

t1/2 = < 10 min (HLM)

N

O

pA2 (NK2)= 9.3

t1/2 = ~30 min (HLM)

N-desalquilação

Cl

Cl

NN

O

pA2 (NK2)= 8.5

t1/2 = <10 (HLM)

LogD = 2.2

N

NS

CH3

O O

Cl

Cl

NN

O

pA2 (NK2)= 8.5

t1/2 = <120 (HLM)

LogD = 1,7

N

NS

NH2

O O

↓ lipossolubilidade

Lima, LM©

Pró-Fármaco: Substância desprovida de atividade farmacológica intrínseca, termo

cunhado por Albert em 1958.

Design Ad hoc x Post hoc

PRO-FÁRMACO

5% do total de

medicamentos disponíveis

são pro-fármacos

Posteriormente modificado para: 1) substância com nenhuma ou pouca atividade farmacológica, sofrendo biotransformação a metabólitos ativos terapêuticamente. 2) Derivado de um fármaco conhecido, de propriedades físico-químicas melhoradas, aumentando a biodisponibilidade do fármaco original, e que mediante processo enzimático ou químico é transformado no fármaco que lhe deu origem, antes de atingir o seu local de ação ou ainda no próprio local de ação (Korolkovas & Burckhalter, 1988). O processo de obtenção do pró-fármaco dá-se o nome de latenciação de fármacos. Consiste essencialmente em converter, mediante modificação química, um composto biologicamente ativo em forma de transporte inativa que, após ataque enzimático ou químico, liberará o fármaco ativo.

Lima, LM©

Lima, LM©

cloranfenicol

amargo

Post- hoc

insípido

lipases pancreáticas (duodeno)

O2N

OH

N

H

O

Cl

Cl

OH O2N

OH

N

H

O

Cl

Cl

OH

OH

CYP450

O2N

OH

N

H

O

Cl

OH

O

-cloridrinaO2N

OH

OPalmitato

N

H

O

Cl

Cl

Farmicetina® (Pfizer)

HO

HO

NH2

CO2H

HO

HO

NH2

L-Levodopa/carbidopa

(Doença de Parkinson)

Post- hoc

MAO/COMT

dopamina

descarboxilação via dopa-descarboxilase(SNC)

spontaneous

Lima, LM©

Lima, LM©

spontaneous

Inhibit CYP 2B6 (in human)

Lima, LM©

N

N

N

NH2N

HN

HO

1'

2'3'

5'

4'

abacavir [t1/2 = 3h]

adenosina

fosfotransferase

4'

5'

3' 2'

1'

N

N

N

NH2N

HN

OP

O

HO

HO

Monophosphato de abacavir

desaminase

citossólica

OP

O

HO

HO

HN

N

N

NH2N

O

1'

2'3'

5'

4'

Monophosphato de Carbovir

[metabólito ativo t1/2 = 15~20h]

quinases

celulares

Triphosphato de Carbovir

4'

5'

3' 2'

1'

OP

O

O

HOPO

OHO

P

HO O

OHHN

N

N

NH2N

O

abacavir [t1/2 = 3h]

4'

5'

3' 2'

N

N

N

NH2N

HN

HO

Fase 1

(Alc. desidrogenase= ADH

hepática)

Fase 2

(UDPGA)

N

N

N

NH2N

HN

OOHO2C

HO OH

OH

5'

N

N

N

NH2N

HN

HO O

Yuen, GJ et al Clin Pharmacokinet. 2008;47(6):351-71.

N

N

N

NH2N

HN

H O

reações

alérgicas

e/ou tóxicas

Lima, LM© Kamat , S S et al., Biochemistry, 2011, 50 (11), pp 1917–1927

adenine Adenine deaminase (ADE)

hypoxanthine

D= Asp

E= Glu

Lima, LM©

N

N

N

N

NH2

O

P CH3

O

OOO

O

O

O

OO

1'

2'3'

5'

4'

Tenofovir disoproxilfumarato

5'

N

N

N

N

NH2

O

P CH3

HO

OHO

N

N

N

N

NH2

O

P CH3

HO

OO

POOH

OH

5'

adenilato

quinase

Tenofovir

Tenofovir difosfato

nucleosideo

difosfoquinase

N

N

N

N

NH2

O

P CH3

HO

OO

POOH

PO

HO

HO

Esterase

CYP(?)

Lima, LM©

OHHN

OH

HO

Terbutalina

OHHN

O

O

O

N

O

N Bambuterol (Pró-f'ármaco)

Otimização de

Propriedades

farmacocinéticas

Hidrólise

via colinesterases antiasmático

antviral

aumenta 87-94%

a biod. oral

da ampicilina

Biodisponibilidade oral: 36-44%

dose = 3 x ao dia 1 dose diária

O

NH2

N

H

N

S

O

OOHampicilina

(uso oral)

N

H

N

S

O

OO

O

O

N

H

N

S

O

OO

O

O

pivampicilina

talampicilina

Lima, LM©

sulfenamida

ATPase inativada

ácido sufênico

Lima, LM©

CH3

CO2H

F

SH3C

O

R-sulindaco

CH3

CO2H

F

SH3C

O

S-sulindaco

CH3

CO2H

F

SH3C

metabólito ativo

(inibidor da COX, AINE)

[H]

CH3

CO2H

F

SH3C

OO

metabólito inativo

FMO

[O]

acumulado

na urina e plasma

metabolismo

Estereoespecífico

enantiômero S

70% da dose

administrada

CYP450

Hamman, M.A. et al. Biochem.

Pharmacol. 2000, 60, 7

Lima, LM©

In vitro:

Hepatócitos isolados

(humanos ou de espécies animais)

Microssoma hepático

(humanos ou de espécies animais)

CYP450 recombinantes

In vivo:

Ratos, coelhos, primatas

e humanos (plasma e urina)

Animais transgênicos

In sillico QSAR, docking,

Programas de predição

metabólica

(e.g. Pallas, Metasite e Meteor)

LC-MC; LC-MS-MS; LC-NMR; NMR-MS

HPLC-MS; HPLC-NMR

Nassar, A-E.F. et al (2004) Drug Discov. Today 9: 317

Lima, LM©

In vitro techniques for investigating drug metabolism

Liver major site for the

biotransformation

of xenobiotics

enzymes

Models of drug metabolism Liver preparations

subcellular fractions

purified enzymes

S9 microsomes

S9= submitochondrial fraction; hepatocytes = parenchymal cells of the liver

cytosolic and

membrane-bound

enzymes

9,000 x g S9 + 100,000 x g

membrane-bound

enzymes

CYP450

storage at -80 C

Hepatocytes

Liver

enzymatic dissociation

using collagenase perfusion

CYP450

Cellular system

contain many enzymes and

cofactors not present in

the microsomal fraction

short-term (4h)

Undergo de-

differentiation

tissue homogenates

differential centrifugation

Advantages: Easy preparation and

storage; contains

cofactors; contains

soluble and M bound

enzymes.

Disadvantages: Crude preparation;

High protein conc.

Lima, LM©

Predição Metabólica in Silico

• QSAR

• “Docking” • Reatividade Química • SoM • Banco de dados de

transfor. metabólicas

Qual(is) é (são) a posição mais provável (is) do metabolismo? Qual a transformação metabólica mais provável? Qual isoenzima participa do metabolismo?

Lima, LM©

O

O

H

H

H

H

H

H

O

O

H

H

H

H

H

H

Modelagem por homologia

(estrutura cristalográfica do CYP2C5)]

CYP1A1 e CYP2A6

O

O

H

H

H

H

H

H

O

O

H

H

H

H

H

H

CYP1A1 CYP2A6

CYP1A2 CYP2A6

In silico

Lima, LM©

In silico

Ahlstrom, MM et al. J. Med. Chem. 2007, 50, 4444-4452

Lima, LM©

Predição Metabólica in Silico

MetaSite

Cruciani, G. et al., J. Med. Chem., 48, 6970-6979, 2005

Lima, LM©

Predição Metabólica in Silico

Quais sítios?

Que isoformas?

MetaSite

Cruciani, G. et al., J. Med. Chem., 48, 6970-6979, 2005

Lima, LM©

Predição Metabólica in Silico

MetaSite3 calculations in aprindine substrate. The reactions predicted for aprindine were: N-dealkylation (position a), N-oxidation (b), aromatic oxidation (c), benzylic oxidation (d), aromatic oxidation (e).

Cruciani, G. et al. Drug Discovery Today: Technologies 2013, 10, e-155

Lima, LM©

Predição Metabólica in Silico

Long, A. Drug Discovery Today: Technologies 2013, 10, e-147

Partial SMARTCyp analysis of tramadol, acenocoumarol and MK445526 using the standard (CYP3A4), 2D6 and 2C9 models. Green bars/circles represent sites of metabolism corresponding to confirmed experimental metabolites and red bars/circles sites of metabolism corresponding to unconfirmed experimental metabolites. The y-axis in each bar-chart represents the relative SMARTCyp scores for each isoform model applied to each compound. Scores are relative and specific to the model/compound combination and cannot be inter-compared.

Lima, LM©

Fígado Preparação do fígado

1. Centrifugação a 900 g, 30 min, 4 °C

2. Centrifugação a 10.000 g, 1 h, 4 °C

3. (remoção restos celulares e fração nuclear)

Fração citosólica Fração microssomal

Quantificação

de proteínas Quantificação

de proteínas

Conservação a -80° C CABRERA, M. et. al. Toxicology Letters 2009, 190, 140-149.

Fração S9*

Ultracentrifugação 100.000 g, 1 h, 4 °C

(sedimentar a fração microssomal)

Enzimas de

Fase I e II

Enzimas de Fase I:

CYP450, FMO e

Carboxilesterase

Glicuronil-

transferase

* Fração S9: fração submitocondrial

In vitro

Lima, LM©

Fração microssomal + amostra

(Concentração final = 100 μM) Incubação a 37 °C por

0, 60 e 120 minutos

Centrifugação

(13000 rpm, 15 min, t.a.)

Adição de 500 μL de

metanol gelado e 500 µL

de acetonitrila gelada

Análise do sobrenadante

por CLAE**

Cofatores:

• MgCl2

• NADPH*

• Glicose 6-fosfato

• Glicose 6-fosfato-deidrogenase

Controles:

• Fração microssomal na presença de

cofatores (com e sem amostra);

• Fração microssomal na ausência de

cofatores (com e sem amostra);

• Sem fração microssomal na presença de

cofatores (com e sem amostra).

Com cofatores

Citocromo P450 (CYP450)

Flavina-mooxigenase (FMO)

Sem cofatores

Carboxilesterase (CES)

Oliveira, R. O. (2010) Dissertação de Mestrado, IQ-UFRJ.

In vitro

Lima, LM© Oliveira, R. O. (2010) Dissertação de Mestrado, IQ-UFRJ.

Cromatogramas obtidos por CLAE-PDA para LASSBio-998 em fração microssomal hepática de ratos utilizando bifenil-4-carboxilato

de metila (20 µM) como padrão interno: LASSBio-998 no tempo 0 (A) e incubado por 120 minutos (B) com fração microssomal na

presença de cofatores; LASSBio-998 no tempo 0 (C) e incubado por 120 minutos (D) com fração microssomal na ausência de

cofatores. A concentração de incubação da amostra com a fração microssomal foi de 100 µM, diluídas para 20 µM para leitura por

CLAE-PDA [Shimadzu – LC20AD; coluna Kromasil 100-5C18 (4,6 mm x 250 mm); detector SPD-M20A (Diode Array) em UV 254

nm; fluxo: 1 mL/minuto; fase móvel: 70% de acetonitrila, 30% de água e 0,1% de TFA].

Lima, LM©

0 30 60 90 120

0

5

10

15

20

25

Sem CofatoresCom Cofatotes

Tempo (min)

LA

SS

Bio

-99

8 (mM

)

0 30 60 90 120

0

5

10

15

20

25

Sem CofatoresCom Cofatotes

Tempo (min)

LA

SS

Bio

-99

8 (mM

)

t1/2= 60,6 minutos Produtos

t1/2 sem

cofatores

(minutos)

t1/2 com

cofatores

(minutos)

LASSBio-998 66 75,3

LASSBio-1494 407,6 533,1

LASSBio-1495 1155 138,6

LASSBio-1496 630 74,5

LASSBio-1497 59,7 32,7

In vitro

Lima, LM©

In vitro

Oliveira, R. O. (2010) Dissertação de Mestrado, IQ-UFRJ.

N

O

O

NH

O NH

O

O

CH3

LASSBio-998

C20H23N3O5

PM = 385.41

N

O

OH

NH

O NH

O

O

C18H19N3O5

PM = 357.36

N

O

O

NH2

O

O

CH3

C13H12N2O4

PM = 260.24

N

O

O

NH

O NH

HO

HO

CH3

hidrolases hidrolases

CYP450

O-desalquilação hidrolases

C19H23N3O5

PM = 373.40N

O

OH

NH2

O

O

C11H8N2O4

PM =232.19

0 30 60 90 120

0

5

10

15

20

25

Sem CofatoresCom Cofatotes

Tempo (min)

LA

SS

Bio

-99

8 (mM

)

0 30 60 90 120

0

5

10

15

20

25

Sem CofatoresCom Cofatotes

Tempo (min)

LA

SS

Bio

-99

8 (mM

)

Carboxilesterase (CES)

Lima, LM©

N

O

OH

NH

O NH

O

O

C18H19N3O5

PM = 357.36

Lima, LM©

CYP

1A

2

CYP

2C

9

CYP

2D

6

CYP

3A

4

CYP

1A

2

CYP

2C

9

CYP

2D

6

CYP

3A

4

Hyland, R et al Br J Clin Pharmacol (2001) 51, 239

In vitro

Lima, LM©

In vitro

O metabolismo do sildenafil na presença de enzimas CYP recombinantes

6x

Hyland, R et al Br J Clin Pharmacol (2001) 51, 239

MetaPrint2D

SMARTCyp

MetaSite

ACD

O

OH

NH

CH3

CH3

propranolol

O

OH

NH

CH3

CH3

OH3C

metoprolol

O

OH

NH

CH3

CH3

O

betaxolol

O

OH

NH

CH3

CH3

O OH3C

esmolol

Fármaco Biodisponibilidade oral (%) Tempo de meia vida (h)

Propranolol ca. 25 3-5

Metoprolol ca. 40 3-4

Betaxolol ca. 80 14-22

Esmolol --- 0.13