# 17A revista doMicrobiologista.

www.sbmicrobiologia.org.br

informativo sbm • ano 4 / 2011

ISS

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1. Corte histológico corado por H&E aumento de 100 vezes. Infecção intra-testicular em hamster, causada pela inoculação de 1x106 leveduras de Paracoccidioides brasiliensis (isolado Pb 18) tratadas com 50 µg/mL de laminina. Observe em destaque, célula gigante contendo fungo “internalizado” Fonte: Adriana Pardini Vicentini, 1997, Tese de Doutorado (Caracterização da glicoproteína de 43 kDa de Paracoccidioides brasiliensis como proteína ligante de laminina e seu papel na patogenicidade fúngica.

2. Microscopia eletrônica de varredura. Adesão de leveduras de Paracoccidioides brasiliensis (isolado Pb 18) previamente incubadas com 50 µg/mL de laminina a células MDCK. Fonte: Adriana Pardini Vicentini, 1997, Tese de Doutorado (Caracterização da glicoproteína de 43 kDa de Paracoccidioides brasiliensis como proteína ligante de laminina e seu papel na patogenicidade fúngica.

3. Imunoreatividade, por imunodifusão dupla em gel de agarose, de soros de pacientes com paracoccidioidomicose ativa frente a filtrado de cultura obtido a partir da amostra 113 de Paracoccidioides brasiliensis. C+: controle positivo (anticorpo policlonal anti-antígeno de P. brasiliensisi), Ag: antígeno (filtrado de cultura) e S1 a S5: soros teste. Fonte: Adriana Pardini Vicentini, Laboratório de Imunodiagnóstico das Micoses, Centro de imunologia, Instituto Adolfo Lutz.

4. Imunoreatividade, por immunoblotting, do filtrado de cultura obtido a partir do isolado 113 de Paracoccidioides brasiliensis, cultivado a 36º C em caldo NGTA (neopeptona, glicose, tiamina e asparagina) durante 20 dias frente a três amostras de soro de pacientes com paracoccidioidomicose ativa. Observe o reconhecimento das frações de 43 e 70kDa (gp43 e gp 70), apontadas como marcadores sorológicos da doença. Fonte: Adriana Pardini Vicentini, Laboratório de Imunodiagnóstico das Micoses, Centro de imunologia, Instituto Adolfo Lutz.

5. Perfil eletroforético de três preparações antigênicas distintas de Paracoccidioides brasiliensis, em gel de poliacrilamida contendo duodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Linha 1: Padrão de Peso Molecular, Linha 2: Filtrado de Cultura obtido da amostra B-339 de P. brasiliensis, Linha 3: Filtrado de Cultura obtido da amostra 113 de P. brasiliensis e Linha 4: Filtrado de Cultura obtido do pool das amostras B-339 e 113 de P. brasiliensis. Gel a 10% de acrilamida, corado pela prata. Fonte: Adriana Pardini Vicentini, Laboratório de Imunodiagnóstico das Micoses, Centro de imunologia, Instituto Adolfo Lutz.

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ÍndiceEditorial

Expediente

É com grande satisfação que publicamos a 17ª edição da Revista Microbiologia in Foco. Continuamos com os objetivos iniciais selecionando temas abrangentes e de interesse na divulgação da Microbiologia. Voltamos a enfatizar que esperamos e contamos com a colaboração ativa dos leito-res sugerindo temas e encaminhando artigos para publicação. Esperamos que a comunidade de microbiologistas continue a colaborar ativamente para que essa iniciativa possa alcançar o objetivo de divulgar a microbiologia nos mais diversos setores da comunidade brasileira.Lembramos que a revista é de informação e divulgação e é composta de várias seções:Seção 1: Ciência in foco: artigos de informação sobre temas relevantesSeção 2: Resenhas: comentários sobre livrosSeção 3: Resumos comentados de trabalhos científicos relevantesSeção 4: Homenagem a profissionais com destaque no desenvolvimento da Mi-crobiologiaSeção 5: Ensino em MicrobiologiaSeção 6: Departamento in Foco: Departamentos em destaque: Noticias de interes-se da MicrobiologiaSeção 7: Leitor in Foco: espaço aberto ao leitorSeção 8: Empresas in Foco - Informes publicitários: espaço destinado a empresas

Agradecemos a todos que colaboraram com a edição número 17 da revista Micro-biologia in Foco e contamos com a colaboração dos colegas para futuros artigos.

PrezadoMicrobiologista,

Ciência in FocoSINGLE CELL GENOMICS . . . . . . . . . 5

BIODIVERSIDADE DO SOLO: INESTIMADA FONTE DE RIQUEZA ECOLÓGICA E BIOTECNOLÓGICA . . . 9

IMUNODIAGNÓSTICO DA PARACOCCIDIODOMICOSE . . . . . . 18

ATIVIDADE MICROBIANA COMO BIOINDICADORES DE TOXICIDADE AMBIENTAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

BACTERIOCINAS: PEPTÍDEOS NATURAIS PARA A PRESERVAÇÃO DE ALIMENTOS . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

QUORUM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

SBM IN FOCO . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

AGENDA IN FOCO . . . . . . . . . . . . . . 47

CURSO DE ESPECIALIZAÇÃO E APERFEIÇOAMENTO EM MICROBIOLOGIA . . . . . . . . . . . . . . . 48

FIQUE SÓCIO . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

Adalberto Pessoa JuniorPresidente

Marina B . MartinezEditora

Carlos P . TabordaEditor

SBM in FocoRevista da Sociedade Brasileira de Microbiologia

Ano 4, nº 17São Paulo: SBM, 2011

Periodicidade Trimestral

Editores:Carlos P. Taborda e Marina B. Martinez

Tiragem:2000 exemplares - Circulação NacionalDistribuição gratuita para sócios SBM

Impressão:Vox Editora Ltda.(11) 3871-7300

Diagramação:Hermano Design Editorialhermano@nextis.com

Responsabilidade autoral:Todos os artigos assinados são de responsabilidade dos respectivos autores

Responsabilidade editorial:Tífani Luri N. Hanashiro

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Ciência in Foco

SINGLE CELL GENOMICS

AS PORTAS SE ABREM

Nos idos do século XVI, Girolamo Fra-castoro estabelecia as bases fundamen-tais do que viria a ser a teoria microbia-na. Postulou, em seu magnum opus “De Contagione et Contagiosis Morbis” que as doenças epidêmicas eram transmiti-das de um indivíduo a outro através de “esporos” albergados em “fómites”, o que implicava que há mais vida no mundo do que podemos ver, prima facie. Mas foi so-mente 127 anos depois, que Antonie van Leeuwenhoek foi o primeiro ser humano a observar diretamente os “esporos” de Fracastoro – mesmo que ele não soubes-se do que se tratavam inicialmente.

Com seu microscópio incrivelmente rudimentar, de lente única, van Leeu-wenhoek escancarou as portas do mundo microbiológico à humanidade. O advento da microscopia óptica, de-senvolvido por vários no século XVII, fomentou um avanço sem precedentes na biologia. Mas a simples observação de microrganismos era muito descritiva e pouco analítica: durante os séculos XVII e XVIII havia-se a consciência da exis-tência desse submundo, conhecia-se até, de vista, alguns protagonistas, mas não havia técnica que permitisse isolar e trabalhar com uma única espécie, e, portanto, ficava difícil provar ou refutar uma hipótese.

OBTENDO QUORUM

A propriedade fisiológica de se re-produzir assexuadamente, por simples

John Anthony McCulloch, Juliana Pérez ChaparroInstituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará, Belém-PA, Brasil. johnmcc@ufpa.br

fissão binária, é intrínseca à maioria dos micro-organismos. Louis Pasteur usou--se dessa propriedade para sepultar de uma vez por todas a teoria da geração espontânea. Bastava um caldo nutriente, e poder-se-ia gerar quantidades de cé-lulas bacterianas ad libitum. Trabalhan-do em cima do alicerce construído por Pasteur, microbiologistas como Robert Koch, Theodor Escherich e Edwin Klebs consolidaram as bases da microbiologia experimental usada até hoje, que é a de isolamento de uma colônia de micro--organismos em meio semi-sólido. Num ágar nutriente, a rede sólida de agarose polimerizada impede a homogeneização das células por movimento browniano, o que resulta na imobilização de uma única célula, que então divide in loco até que a montanha de células empilhadas uma sobre a outra seja tão grande a ponto de ser visível a olho nu. Uma cul-tura pura, gerada a partir de uma única célula é o instrumento fundamental para a pesquisa e rotina de microbiologia. Mas há uma série de suposições e ge-neralizações implícitas no procedimento, sendo que essas suportam a validade do método. Vamos a elas.

Primeiramente, assume-se que uma colônia bacteriana é oriunda de uma úni-ca célula, e que, portanto, contém uma única espécie. Pode-se ter certeza de tal fato se a colônia estiver isolada, uma vez que existe uma possibilidade, é claro, de duas células terem caído a micrômetros uma da outra e que essas duas geraram uma única colônia, mas a probabilidade disso ter acontecido é insignificante se a

diluição for grande o suficiente a ponto de obter colônias uniformemente espa-çadas uma da outra.

Assume-se, também, que as células contidas numa única colônia, por terem vindo de uma única célula, são isogê-nicas. Isso porque, como procariotos se reproduzem por fissão binária, há replicação do genoma celular antes da divisão celular. Logo, ao trabalhar com uma massa de células obtidas de cultura pura, pode-se ter a certeza que todas apresentarão o mesmo genótipo, e por consequência, o mesmo fenótipo.

Paremos para refletir os pormenores desse último ponto. O salto não é trivial. Quando se obtém um resultado de prova bioquímica ou da presença ou sequência de um determinado gene, expressamos que esse é o resultado obtido para o iso-lado, ou seja, para aquela solitária célula empoleirada na superfície do ágar, na etapa de isolamento. Mas na verdade não o é. A falácia mora no fato de que, na realidade, estritamente falando, o re-sultado genotípico ou fenotípico obtido é, na realidade, a média populacional gerada na cultura pura para o que se está medindo.

Em microbiologia, até agora tem-se trabalhado com populações inteiras “iso-gênicas” de procariotos (geradas numa cultura pura) porque a sensibilidade dos métodos comumente usados em micro-biologia exige um alto número de cópias de determinado gene ou seu produto de expressão. Por exemplo, quando um isolado coco Gram positivo é catalase positiva, dizemos que o isolado pertence

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à família Staphylococcaceae, mas, na realidade, é que todas as milhões de cé-lulas (ou a sua maioria esmagadora) que compreendem o inóculo da prova tinham quantidade suficiente de catalase para gerar oxigênio molecular a partir de água oxigenada a ponto de formar bolhinhas visíveis. Se, por acaso, ocorresse uma mutação no gene que codifica a enzima catalase logo nas primeiras divisões de célula da cultura de isolamento, de modo a rendê-la não funcional, toda a massa celular do inóculo não teria catalase su-ficiente para dar um resultado catalase positiva. Chegaríamos, então, à conclu-são errônea de que o isolado pertence à família Streptococcaceae. Então porque rotineiramente nos fiamos na fidelidade do aparelho replicador procariótico para obter resultados em microbiologia, se há o risco de que isso gere um resultado que não seja a expressão da verdade? É por uma questão de probabilidade.

APOSTANDO COM SOBRIEDADE

É de fundamental importância ter uma noção de escala para compreender o que está acontecendo. O número de células em uma colônia é da ordem de 109 (10). Como uma colônia isolada é gerada a partir de uma única célula, é necessário que ocorram 109 replicações de DNA para gerá-la. Uma estimativa da taxa de muta-ção por genoma por geração em E. coli é da ordem de 10-4, ou seja, a cada 104 ge-rações, há uma mutação em pelo menos um gene (6). Logo, numa dada colônia, ocorreria, em média, 109 x 10-4 mutações = 105 mutações. Esse número surpreen-dente pode ser diminuído se levarmos em consideração que a maior parte das mu-tações são deletérias, e, portanto não são passadas à próxima geração. Considere-mos, por exemplo, que apenas 1% das mutações seja tolerável a ponto de não impedir a replicação da célula. Mesmo assim, teríamos 1% de 105 = 103 muta-ções na colônia. Dado que o genoma de uma célula bacteriana tem entre 3.000 e 5.000 genes, em média, a probabilidade de haver mutação em um dado gene é de 1 em 3 a 1 em 5, o que é muito alto. Lo-gicamente, a taxa de mutação não é igual ao longo do genoma, genes constitutivos têm uma taxa de mutação bem menor

que genes acessórios, especialmente se o isolado estiver se multiplicando fora do seu nicho usual.

Agora, veja bem que o número de mutações não é igual ao número de mu-tantes na colônia, tudo depende se uma dada mutação ocorre nas divisões ini-ciais ou finais. A partir de uma célula, 109 células são geradas por apenas 29 divi-sões (= log2 109). Se uma mutação ocor-rer nas divisões iniciais, ela será ampli-ficada exponencialmente. Se, por outro lado, uma mutação ocorrer em uma das divisões finais, o número de mutantes na colônia será bem menor, ou até insignifi-cante, uma vez que não houve divisões suficientes para a expansão clonal da mutação, levando à sua baixa repre-sentatividade na colônia. Por isso, ao avaliarmos apenas um ou um punhado de genes de um isolado bacteriano, seja de forma fenotípica (prova bioquímica) ou genotípica, o que é comum na rotina, para que haja um artifício (mutação na etapa de isolamento) no gene avaliado, é preciso que uma mutação ocorra jus-tamente no gene a ser avaliado (o que é relativamente provável), e que ainda ela ocorra numa das divisões iniciais. Dado que a maioria esmagadora das replica-ções celulares ocorre nas divisões finais, a probabilidade de uma mutação ocorrer no final do crescimento populacional também é esmagadoramente maior. Mas, é claro, pode ocorrer nas divisões iniciais. De fato, como exemplo, algumas cepas de S. aureus catalase negativa já foram isoladas (2), mas o evento é raro a ponto de não comprometer a utilidade do teste da catalase, que avalia tão so-mente um único gene.

Desde 2005, com o lançamento de plataformas de sequenciamento de nova geração (NGS), o custo de se-quenciamento de DNA e do poder de processamento computacional, que já vinham caindo de maneira exponencial, caiu de forma a fomentar a migração da microbiologia como ciência descritiva a ciência analítica. Por consequência, tecnologias NGS estão cada vez mais acessíveis e, portanto, prevalentes, e a previsão é que essa tendência siga (11). O problema é que, ao se avaliar o geno-ma completo, ou um conjunto grande de genes de um isolado bacteriano, a pro-babilidade de que pelo menos algumas

características genéticas avaliadas não sejam a expressão da realidade fisioló-gica do isolado é altíssima, pela relativa alta taxa de mutação de procariotos, já supramencionada.

Uma solução seria isolar uma célula de seu nicho por uma técnica indepen-dente de cultivo e, então, avaliar o seu genoma. Ademais, o isolamento de procariotos por método independente de cultivo seguido de seu estudo traz a vantagem primorosa de poder estu-dar espécies que são de cultivo difícil ou virtualmente impossível no laborató-rio. E a vasta maioria das espécies de procariotos não são cultiváveis por téc-nicas convencionais (14), de forma que a maior parte da fisiologia da microbio-diversidade ainda não é conhecida. O campo para a bioprospecção desses mi-crorganismos é imenso, e a sua incursão incorrerá, forçosamente, a genômica de célula única (single-cell genomics).

Os desafios técnicos a serem trans-postos para a implementação dessa abordagem são multifacetados. Vamos a eles.

ISOLANDO O INVISÍVEL

A separação física de uma única cé-lula com diâmetro na ordem de unidades de micrômetros de outras células pode ser obtida através de vários métodos. O mais simples é a diluição seriada de uma suspensão bacteriana em solução estéril até a densidade de célula única (19). Calcula-se uma diluição que resul-te numa concentração de uma célula por um dado volume, e saber-se-á que num frasco contendo metade desse volume ter-se-á a probabilidade de 50% de que a célula esteja contida no frasco. A des-vantagem desse método é a incerteza associada ao processo.

Células bacterianas também já fo-ram isoladas por citometria de fluxo (13, 15). Marcy et al (2007) chegaram a desenvolver um chip microfluídico especificamente para o isolamento de uma única célula microbiana e a subse-quente lise e reações de amplificação gênica in loco. O engenhoso microchip é construído com túneis que conduzem o fluxo de uma célula procariótica em suspensão a uma câmara de lise (3,5 nL), outra de neutralização (3,5 nL) em

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finalmente a uma câmara de reação (50 nL). O fluxo é controlado por válvulas acionadas eletronicamente. Usando esse aparato, os autores conseguiram amplificar >1000 genes de células iso-ladas (únicas) do desconhecido grupo TM7, um filo até agora não cultivado e muito pouco conhecido da microbiota gingival humana.

Células procarióticas também já foram isoladas por sistemas de micro--manipulação acoplados a microscópios ópticos (5, 17). Já utilizados amplamente em aplicações envolvendo células euca-rióticas (1), muito maiores, e, portanto, mais fáceis de micro-manipular, siste-mas de micro-dissecção a laser envol-vem o corte de uma região contendo uma célula num suporte, e o isolamento desse suporte, e consequentemente da célula, que então pode seguir para ex-tração e amplificação de DNA. O desafio é aplicar esses sistemas a procariotos, especialmente porque, como são se-res unicelulares e muito pequenos, há a necessidade de primeiro estendê-los em uma matriz de forma a ficarem em camada única. Contudo, há o risco que nas regiões da matriz de suporte, DNA contaminante do ambiente (de outras células lisadas e vírus, por exemplo) es-tejam presentes como contaminantes do DNA alvo (celular).

MULTIPLICAI-VOS

Uma única célula procariótica contém uma quantidade de DNA na ordem de fe-mtogramas (10-15 g) (8). Atualmente, as plataformas de sequenciamento de nova geração conseguem gerar gigabases de leitura a partir de microgramas (10-6 g) de DNA isolado. Uma célula procarióti-ca contém 10-6/10-15 = 109 vezes menos DNA que o necessário para construir--se uma biblioteca NGS útil (no estado da arte de hoje). A amplificação do DNA celular é, portanto, um passo inescapá-vel para o sequenciamento do genoma celular. A amplificação de DNA por PCR usando DNA polimerases termoestáveis levará à amplificação de sequências es-púrias, devido à usual baixa fidelidade das enzimas comercialmente disponí-veis e falta de atividade corretora.

A amplificação do genoma inteiro (Whole Genome Amplification - WGA)

já foi alcançada por Amplificação por Deslocamento Múltiplo (Multiple Dis-placement Amplification - MDA), que envolve a utilização de uma DNA po-limerase de altíssima fidelidade, com função corretora, numa reação iso-térmica. A enzima mais utilizada para MDA é a φ29 (phi29) DNA polimerase, isolada do fago φ29. Essa notável enzima consegue amplificar um DNA molde por um fator de 109 vezes (3, 4, 8, 9, 12, 13, 16, 19).

Apesar das óbvias vantagens que a φ29 DNA polimerase possui para genô-mica de célula única, ainda há pormeno-res a serem tratados na utilização dessa enzima. Usando como molde DNA extra-ído a partir de uma única célula, vários estudos incorreram na falta de represen-tatividade genômica, ou seja, parte do genoma não foi amplificado em quanti-dade suficiente para gerar leituras (4, 7, 9, 12, 18, 19). Também há o problema de formação de quimeras na etapa de MDA. Devido à amplificação em cadeia catalisada pela φ29 DNA polimerase, chega um ponto em que a concentração de DNA recém sintetizado é tal que há a aproximação física de duas cadeias nascentes, o que pode ser usado como molde pela enzima, gerando uma mo-lécula quimérica(8). Essa molécula de DNA sintetizado com seqüência espúria poderá depois dar problemas na fase de montagem de genoma.

A seqüência genômica completa de um procarioto obtida de DNA isolado a partir de uma célula única já foi obtida. Todavia, trata-se de Candidatus Sul-cia muelleri DMIN, um endosimbionte de uma planta que, apesar de ser um procarioto, é poliploide, contendo de 200 a 900 cópias de seu genoma em uma única célula (17). Até o momento da escrita desse texto (junho de 2011), não há a descrição de obtenção de uma sequência completa de genoma a partir de uma única cópia do genoma isolado de uma única célula procarióti-ca. O desenvolvimento de técnicas que permitam tal feito fomentarão, como o microscópio de van Leeuwenhoek, uma mudança de paradigma, possibili-tando não somente a descoberta e bio-prospecção dos procariotos e das vias metabólicas até agora desconhecidas, mas também uma abordagem analítica

da ecologia de microbiotas, bem como a elucidação de fenômenos populacio-nais microbiológicos pouco compreen-didos, tal como a hetero-resistência a antibióticos.

REFERÊNCIAS

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10. Mashimo K., Y. Nagata, M. Kawata, H. Iwasaki, and K. Yamamoto. 2004. Role of the RuvAB protein in avoiding spontaneous formation of deletion mutations in the Esche-richia coli K-12 endogenous tonB gene. Bio-chemical and biophysical research communi-cations 323:197-203.

11. Metzker M. L. 2009. Sequencing techno-logies — the next generation. Nature Reviews Genetics. Nature Publishing Group 11:31-46.

12. Paez J. G., M. Lin, R. Beroukhim, J. C. Lee, X. Zhao, D. J. Richter, S. Gabriel, P. Herman, H. Sasaki, D. Altshuler, C. Li, M. Meyerson, and W. R. Sellers. 2004. Genome coverage and sequence fidelity of phi29 poly-merase-based multiple strand displacement whole genome amplification. Nucleic acids research 32:e71.

13. Raghunathan A., H. R. Ferguson, C. J. Bornarth, W. Song, M. Driscoll, and R. S. Lasken. 2005. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Applied and environ-mental microbiology 71:3342-7.

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15. Rodrigue S., R. R. Malmstrom, A. M. Berlin, B. W. Birren, M. R. Henn, and S. W. Chisholm. 2009. Whole genome amplifica-tion and de novo assembly of single bacterial cells. PloS one 4:e6864.

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18. Yilmaz S., M. Allgaier, and P. Hugenholtz. 2010. Multiple displacement amplification compromises quantitative analysis of meta-genomes. Nature Methods. Nature Publishing Group 7:943-944.

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Ciência in Foco

BIODIVERSIDADE DO SOLO: INESTIMADA FONTE DE RIQUEZA ECOLÓGICA E BIOTECNOLÓGICA

1 . SOLO: INESTIMADA FONTE DE RIQUEZA

Apesar dos avanços significativos quanto ao conhecimento sobre diversi-dade de plantas superiores e animais, nosso conhecimento em relação aos microrganismos, sobre sua diversidade, riqueza, padrão de distribuição global, assim como as funções desempenhadas nos ecossistemas continua insuficiente.

Os microrganismos vêm evoluindo há aproximadamente 4 bilhões de anos, e até 2 bilhões de anos atrás eram a única forma de vida na Terra. Eles foram responsáveis por alterações na atmosfe-ra primitiva da Terra e pelo surgimento de formas de vida mais complexas. Em virtude da sua longa história evolutiva e da necessidade de adaptação aos mais distintos ambientes, os microrganismos acumularam uma impressionante diver-sidade genética, que excede, em muito,

Maria Regina Silveira Sartori da Silva; Mercedes BustamanteUniversidade de Brasília – Departamento de Ecologia

Paula Tavares; Lucas Silva Carvalho; Julianna PeixotoUniversidade de Brasília – Departamento de Biologia Celular

Débora Farage Knupp dos SantosUniversidade Católica de Brasília - Programa de Pós-graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia

Ricardo Henrique KrügerUniversidade de Brasília – UnB, Instituto Central de Ciências Sul – Dept. de Biologia Celular, Laboratório de Enzimologia.

Cep. 700910-900 Brasília, DF, Brazil - E-mail: kruger@unb.br - Phone: +55+61+3107-2977 FAX: +55+61+3273-4608

a diversidade dos organismos eucarion-tes (Ward, 1998). Os microrganismos representam o repertório mais rico em diversidade química e molecular na na-tureza, constituindo a base de processos ecossistêmicos, como os ciclos biogeo-químicos e a cadeia trófica, além de manterem relações vitais entre si e com os organismos superiores (Hunter-Ce-vera, 1998). Estes estão presentes em todos os processos para manutenção da vida na Terra, desde ciclagem dos elementos químicos pela decomposição da matéria orgânica até a produção de alimentos, bebidas e medicamentos bem como em interações mutualísticas com plantas e animais.

A diversidade de microrganismos é tão grande quanto desconhecida. Uma das razões para o nosso pouco conhe-cimento sobre microrganismos é que eles são pequenos e invisíveis aos nos-sos olhos (Pace, 1996), contrastando

com o tamanho de plantas e animais. A grande variedade de habitats onde são encontrados, como solo, água, plantas, animais, ar, poeira, lagos, vulcões, tam-bém dificulta sua identificação, tornando seu estudo, uma pesquisa com custos elevados. Alguns destes habitats pos-suem uma quantidade enorme e desco-nhecida de microrganismos. Um grama de solo, por exemplo, pode conter 10 bilhões de microrganismos, representan-do milhares de espécies (Rosseló-Mora &Amann, 2001).

Há pouco tempo atrás, os microrga-nismos tinham que ser cultivados para serem identificados (Pace, 1996) e, além disso, a freqüência de ocorrência das populações, a sazonalidade, e em muitos casos, a dependência de hospe-deiros e/ou substratos específicos para sua sobrevivência e multiplicação tam-bém eram importantes limitações (Tor-svik & Øvreås, 2002). Os estudos dos

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microrganismos nos diversos ambientes foram limitados exclusivamente a técni-cas microscópicas, de enriquecimento e cultivo. Essas técnicas, isoladamente, muitas vezes não forneciam maiores informações quanto à composição mi-crobiana, devido às dificuldades ineren-tes às condições ideais para o cultivo e isolamento dos microrganismos, uma vez que alguns deles são bastante sele-tivos quanto aos meios e outros podem estar em estado VBNC (viáveis, mas não cultiváveis até o momento) no meio am-biente (Rosado et al., 1997; Rosado & Duarte, 2002) (Figura 1).

O aperfeiçoamento de técnicas moleculares e o uso da bioinformática têm oferecidos novas respostas sobre a diversidade microbiana, assim como permite acompanhar uma população de microrganismos no ambiente sem a necessidade de isolamento e cultivo. O número de espécies microbianas iden-tificadas cresce a cada ano, abrindo a oportunidade de novas aplicações para estas espécies.

A caracterização e a manutenção dos recursos fornecidos pelos microrganis-mos são essenciais para a manutenção da biodiversidade e processos ecossis-têmicos associados, e para o uso direto pelo homem como fonte de novos pro-dutos biotecnológicos que possam ser fornecidos por estes.

2 . BIODIVERSIDADE

Biodiversidade pode ser definida como “variabilidade de organismos vivos de todas as origens, compre-endendo, os ecossistemas terrestres, marinhos e outros aquáticos e os com-plexos ecológicos de que fazem parte. Portanto, biodiversidade engloba to-dos os recursos vivos da Terra e a sua importância para o ser humano pode ser considerada como um conjunto de riquezas, sendo um patrimônio natural de uma nação” (CDB, 1992).

O Brasil é considerado o país de maior diversidade biológica do pla-neta, tornando-o alvo de interesse e intensas discussões sobre a forma de sua utilização econômica. A impor-tância da biodiversidade foi compre-endida há poucos anos, observando--se que, quanto maior biodiversidade possui um país, uma maior varieda-de de produtos poderia desenvolver principalmente em termos farmacoló-gicos. Várias leis e regulamentações foram aprovadas para tornar o uso da biodiversidade legal. Todas as pes-quisas a serem realizadas no Brasil referentes à biodiversidade, tanto por pesquisadores brasileiros quanto estrangeiros, tem de cumprir deter-minadas etapas para sua liberação (Figura 2).

O conceito de biodiversidade está comumente associado a animais e plan-tas visíveis, atraídos pela beleza ou pelo tamanho. No entanto, a maior parte da biodiversidade reside em habitats como o solo, em especial, nos microrganismos ali existentes.

3 . BIODIVERSIDADE DO SOLO

A estrutura fundamental para o de-senvolvimento da vida nos ecossistemas terrestres é o solo, representando um sistema natural complexo e dinâmico, composto por seres vivos, ar, água, ma-téria orgânica e minerais que interagem entre si.

O solo é um sistema heterogêneo, descontínuo e estruturado, formado por três fases: sólida, líquida e gasosa. A fase sólida consiste em partículas minerais do solo, que interagindo formam os agrega-dos do solo. As partículas minerais pos-suem uma constituição química variada, podendo ser classificadas com base em seu tamanho em areia, silte e argila (di-âmetros <0, 002 mm, entre 0, 002 e 0,05 mm e entre 0,05 e 2 mm, respectivamen-te) (Jesus & Moreira, 2008). Os agrega-dos do solo podem ser classificados em microagregados (diâmetro < 250 μm) e macroagregados (diâmetro > 250 μm). A fase líquida consiste na solução do solo, constituída por água e materiais nela dis-solvidos. A fase gasosa representa o ar contido no espaço poroso do solo, com características distintas do ar atmosféri-co, devido a atividade biológica (Moreira & Siqueira, 2006). A complexa interação entre estas três fases determina um am-biente caracterizado por microhabitats, com diferentes características químicas, físicas e mineralógicas e propiciando o estabelecimento de diferentes comunida-des biológicas (Figura 3).

Dentre os seres vivos que habitam o solo, os microrganismos estão dire-tamente ligados à manutenção deste sistema. Eles não vivem no solo na for-ma de culturas puras, e sim, na forma de uma comunidade complexa, onde uma grande variedade de interações é desenvolvida. A diversidade de micror-ganismos é essencial para a diversida-de de processos que ocorrem no solo e para a manutenção da estrutura física do solo. A comunidade de microrganismos

Figura 1. Modelo esquemático representando a proporção entre microrganis-mos cultiváveis e não-cultiváveis.

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do solo pode funcionar também, como um reservatório de nutrientes, onde es-tes são imobilizados temporariamente, reduzindo perdas por lixiviação, possi-bilitando um uso posterior pelas plantas (Espindola et al. 2001).

A manutenção dos estoques de car-bono e nitrogênio do solo está direta-mente relacionada à estrutura da comu-nidade microbiana. Os solos possuem três vezes mais C que a atmosfera, onde o balaço entre as entradas e saídas de C neste compartimento influencia as con-centrações de CO2 na atmosfera (Post & Know, 2000). A fixação do nitrogênio é realizada em sua maior parte pelas bactérias fixadoras de nitrogênio que se encontram no solo. Este processo contri-bui com 65% do total do nitrogênio fixado (Moreira & Siqueira, 2006).

O estudo sobre a diversidade de mi-crorganismos no solo tornou-se muito importante, além dos motivos já citados, pois este ainda pode apresentar um gran-de valor biotecnológico com potencial para extração de enzimas, antibióticos e produtos ainda inexplorados (Reis Júnior et al., 2002). Com todo o potencial a ser explorado, o solo ainda é considerado um dos habitats menos estudados do plane-ta, e só recentemente começou-se a en-tender que sua diversidade é fator impor-tante na regulação e no funcionamento dos ecossistemas (Copley, 2000).

O aumento da população humana traz a necessidade de abertura de novas áreas para a criação de cidades, estra-das, agricultura e criação de animais. A derrubada e alteração da cobertura vegetal influenciam as propriedades fí-sicas, químicas e biológicas determinan-tes das condições do solo, agindo assim diretamente sobre a comunidade micro-biana. As alterações são refletidas na composição, atividade e quantidade de biomassa da comunidade microbiana. A permanência de um determinado grupo de microrganismos no ecossistema fica condicionada à sua habilidade de adap-tação e resposta a essas mudanças am-bientais (Kirchner et al., 1993; Pereira et al., 1999).

Se considerarmos que 80-90% dos processos que ocorrem no solo são reações mediadas por microrganismos (Nannipieri et al., 2003), a biomassa microbiana do solo torna-se um com-

ponente crítico de todos os ecossis-temas naturais ou manipulados pelo homem.

Algumas práticas agrícolas podem promover alterações críticas da co-munidade microbiana do solo. Dentre estas práticas estão o uso de altas quantidades de fertilizantes inorgânicos e pesticidas que provocam mudanças na densidade de fungos e bactérias, supressão ou promoção de crescimen-

to ou atividade microbiana e mudanças estruturais na comunidade microbiana. Estas mudanças podem contribuir para uma perda da diversidade e/ou função da comunidade microbiana (Heilmann et al., 1995, Girvan et al., 2004). Além do manejo da agricultura, o tipo de solo, bem como, o tipo de planta estabelecido são fatores determinantes da estrutura da comunidade microbiana (Garbeva et al., 2004).

Figura 2. Etapas para acessar ao Patrimônio Genético e/ou Conhecimento Tradicional Associado. Abreviações utilizadas: CTA – Conhecimento Tradicio-nal associado; ICMBio – Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiver-sidade; MMA – Ministério do Meio Ambiente; CGEN – Conselho de Gestão do Patrimônio Genético.

Figura 3. (A) Modelo esquemático de perfil de solo com região mais intensa de atividade microbiana – rizosfera. (B) Modelo esquemático de microagregado de solo e colônia de micro-organismo.

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4 . METODOLOGIAS DE ESTUDO APLICADAS À ECOLOGIA MICROBIANA

É importante ressaltar que técnicas clássicas de cultivo de microrganismos em laboratório não são adequadas para a exploração de toda a variabilidade do conteúdo genético presente em amos-tras de solo. Por isso, torna-se necessá-rio a utilização de técnicas moleculares para termos acesso a essa diversidade.

O estudo sobre a diversidade mi-crobiana pode ser baseada na avalia-ção da pequena subunidade (SSU) do gene do rRNA (16S em procariotos e 18S em eucariotos). Os genes da SSU rRNA oferecem uma série de vantagens para o estudo de comunidades micro-bianas pois estão presentes em todos os organismos, consistem de regiões conservadas e regiões variáveis per-mitindo a diferenciação entre diferentes populações microbianas e os bancos de dados de sequências disponíveis, são amplos o suficiente para permitir a cria-ção dos oligonucleotídeos iniciadores universais ou grupo específico, além de

permitir uma análise mais refinada dos dados obtidos.

As técnicas moleculares de fingerprin-ting nos permitem identificar um padrão ou perfil da diversidade microbiana baseada na separação física dos ácidos nucléicos das espécies (Figura 4). As mais utiliza-das para fins de estudos de comunidades microbianas são: Análise do espaço ribo-somalintergênico (RISA); Polimorfismo do comprimento de fragmentos de restrição terminal (T-RFLP); Eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) (Figura 4A). As metodologias podem ser usadas para comparação de diversas comunida-des microbianas de diferentes ambientes ou o comportamento de uma comunidade isolada. Um dos pontos mais fortes para se utilizar essas técnicas em ecologia mi-crobiana é a análise simultânea de várias amostras, que podem monitorar a dinâmi-ca complexa da comunidade microbiana e suas flutuações sazonais ou após per-turbações ambientais (Muyzer, 1999).

Após essa primeira análise de po-der discriminativo, é possível selecionar quais amostras serão interessantes para posteriores análises mais refinadas, tais

como: construção de bibliotecas meta-genômicas seguidas de sequenciamento (Figura 4B).

Atualmente, com o aprimoramento das tecnologias de sequenciamento de DNA de última geração, os recentes estudos avançaram significativamente sobre o conhecimento das comunida-des microbianas. O uso da plataforma 454 GS20 FLX Titanium (Roche), por exemplo, tem facilitado a identificação e classificação de uma variedade de frag-mentos rDNA 16S de bactérias. Recen-temente, o uso da plataforma Illumina permitiu um aumento no número de da-dos gerados em trabalho realizado com comunidades microbianas de amostras ambientais e diminuição de custos (Bar-tram et al.,2011).

Durante três décadas o sequencia-mento de moléculas de DNA era lidera-do pelo método de Sanger. Apesar dos avanços contínuos como a introdução de sistemas de eletroforese de capilar, este método tem mostrado ser caro e demorado. Atualmente temos o que de-nominamos de sequenciamento de DNA de alto desempenho ou NGS (“Next Ge-neration Sequencing” – ex: pirosequen-ciamento). Essas novas metodologias de sequenciamento de DNA em conjunto com técnicas de fingerprinting têm gera-do novos caminhos para uma rápida ca-racterização microbiológica, favorecen-do no nosso conhecimento de ecologia microbiana (Roesch et al., 2007).

Hoje em dia, várias plataformas de sequenciamento de segunda geração estão disponíveis no mercado, diferindo basicamente do sequenciamento tradicio-nal de Sanger pelo dramático aumento no número de pares de bases sequenciados obtidos numa única corrida a um menor custo-benefício. Uma vantagem adicio-nal consiste na rapidez do processo de sequenciamento, uma vez que procedi-mentos básicos e utilizados em sequen-ciamento de Sanger como a clonagem de insertos de DNA em vetores não são mais requeridos. Entretanto, os fragmentos de variados tamanhos gerados pelo sequen-ciamento de segunda geração apresen-tam acurácia menor em relação aos frag-mentos gerados pelo sequenciamento de Sanger (Shendure & Li 2008). No caso específico de análise de genes marca-dores para estudos de riqueza e diversi-

Figura 4. Modelo esquemático mostrando opções de técnicas que podem ser utilizadas para acessar a diversidade microbiana de amostras ambientais.

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dade microbiana, a utilização das novas tecnologias de sequenciamento podem levar a uma super-estimativa de riqueza, às vezes, com três ordens de magnitude superior à riqueza real. Com objetivo de corrigir estes erros, bioinformatas desen-volveram softwares específicos com no-vos algoritmos para obtenção de dados mais robustos e confiáveis (Ribeca & Valiente 2011; Quince et al., 2009). Esta correção in silico é de vital importância para estudos relacionados com diversida-de microbiana, uma vez que a ausência de correção neste caso específico, po-dem superestimar a diversidade genética (Kunin et al., 2009).

De uma maneira geral, há uma ampla variedade de aplicações para o sequen-ciamento de segunda geração, que vão desde o sequenciamento de novo de ge-nomas, re-sequenciamento, análise da expressão gênica bem como a análise de metagenomas de amostras ambien-tais complexas.

Atualmente a tecnologia de sequen-ciamento de segunda geração encontra--se ao alcance de muitos pesquisadores. A grande dúvida é: Qual plataforma de sequenciamento é mais adequada para uma pesquisa específica? A resposta deve levar em consideração a natureza do delineamento experimental. Para essa escolha, é necessário que o pesquisador compreenda as principais diferenças ob-servadas entre cada plataforma. As pla-taformas mais comuns no Brasil são 454 (http://www.454.com), o Illumina (http://www.illumina.com), SOLiD (http://www.appliedbiosystems.com/solid) e mais re-centemente Ion Torrent (www.iontorrent.com). Uma breve comparação entre elas informa que o 454 é a plataforma capaz de gerar os maiores fragmentos de DNA, variando entre 400-500 pares de base, quando compara do ao Illumina (35-75 pares de bases) e ao SOLiD que proporciona fragmentos de aproximada-mente 50 pares de base. A plataforma Ion Torrent gera fragmentos em torno de 200 pares de base. Outra comparação interessante é a quantidade de dados gerados por cada plataforma. Dessa ma-neira o Illumina é capaz de gerar a maior quantidade de dados atingindo > 25,000 megabases de dados. Em seguida, o SO-LiD, > 20,000 megabases e por último a plataforma 454 com a possibilidade de

geração de 400-600 megabases de da-dos que podem ser alcançados através de uma única corrida. O Ion Torrent pode gerar até 100 megabases de dados. Fi-nalmente, o tempo de duração da corrida entre as plataformas sugere outra vari-ável importante, enquanto a plataforma 454 gasta em média 5 horas por corrida, a plataforma do Illumina pode gastar entre 3-7 dias e o SOLiD pode alcançar 10 dias (Metzker, 2010). A plataforma Ion Torrent pode gastar entre 2 e 6 horas por corrida, ou como exemplo, o fechamento do geno-ma humano, exigiu 1.600 corridas no chip 314; 267 corridas no 316; e 28 corridas no 318. Considerando que cada uma des-sas etapas leva cerca de duas horas, o sequenciamento mais demorado foi feito em poucos dias (Rothberg et al., 2011).

Embora as diferenças entre as múl-tiplas plataformas sejam marcantes, o maior desafio ultimamente para o se-quenciamento de segunda geração resi-de na bioinformática, devido à necessi-dade da análise de massiva quantidade de dados. A dificuldade começa com o fato de ainda não haver um método de análise padrão e uniforme a ser segui-do pelos pesquisadores, dificultando a comparações entre estudos. Outra limitação são os bancos de dados que ainda apresentam anotações genômica incompletas (Horner et al., 2009). Ape-sar dessas limitações, os estudos reali-zados com o auxílio do sequenciamento de segunda geração nos tem fornecido dados que estão revolucionando o cam-po da biologia molecular, e em particular a microbiologia.

Neste aspecto, é importante ressal-tar que o Distrito Federal conta com um Centro de Genômica de Alto Desempe-

nho com dois aparelhos de última gera-ção (GAIIx Illumina e o 454 da Roche) para suprir diferentes aplicações experi-mentais, localizada na Universidade Ca-tólica de Brasília/Campus II - Asa Norte (Figura 5). Esse projeto foi realizado com o empenho compartilhado de dife-rentes instituições como o laboratório da Policia Civil do Distrito Federal (PCDF), o Laboratório de Saúde Central de Saú-de do Distrito Federal (Lacen – DF), a Universidade Católica de Brasília (UCB), a Universidade de Brasília (UnB) e a Embrapa. Essa estrutura é pioneira na América do Sul, servindo como modelo para o Brasil.

5 . EXPLORAÇÃO BIOTECNOLÓGICA (BIOPROSPECÇÃO)

A bioprospecção é o processo pelo qual estão sendo acessados os recursos naturais e novos produtos estão sendo descobertos. O uso destes recursos so-fre constantes mudanças, desde que o homem deixou a caça e coleta, e passou a domesticação de animais e plantas, selecionando variedades produtivas mais interessantes (Azevedo, 2003).

Em particular, a bioprospecção de-pende dos recursos biológicos, uma valiosa fonte de biodiversidade. Molé-culas derivadas de produtos naturais, particularmente aqueles produzidos pe-las plantas e microrganismos, fornecem estruturas químicas inovadoras para o desenvolvimento de novos produtos. Muitos dos fármacos mais valiosos têm sido derivados diretamente, ou indireta-mente, de fontes de produtos naturais, por exemplo, ácido acetilsalicílico (aspi-

Figura 5. Equipamentos que fazem parte do Centro de Genômica de Alto De-sempenho do Distrito Federal. Foto (A) Prof. Ricardo Kruger (UnB) ao lado GAIIx Illumina ; Foto (B) Doutoranda Alinne Castro (UnB) ao lado do 454 da Roche.

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rina) da casca do salgueiro e penicilina a partir do fungo Penicillium.

As necessidades humanas movi-mentam o aperfeiçoamento no uso dos recursos naturais, e as atuais demandas superam a oferta dos recursos. Para a microbiologia, a “domesticação” de um organismo mostrou-se difícil, pois ape-nas uma ínfima parte pode ser cultivada (Azevedo, 2003). Com isto surge a per-gunta de como utilizar e obter recursos inovadores e mais adequados que su-pram as novas demandas do mercado e da sociedade? Seja um antibiótico mais eficaz e menos nocivo ao ser humano ou uma enzima de interesse para a geração de bioenergia.

A bioprospecção é um mercado que tem importância crucial para a tecnolo-gia nos próximos anos. O mercado de enzimas, por exemplo, possui receitas recordes, com previsão de ganhos em torno de US$2,18 bilhões no mercado americano para 2014, segundo dados do The Freedonia Group. O crescimen-to estimado da indústria de enzimas está em torno de 4,8% ao ano até 2014, sendo os principais mercados poten-ciais os voltados para fármacos e para biocombustíveis.

De acordo com um relatório en-comendado pelo Fórum Econômico Mundial (FEM) intitulado “The Future of Industrial Biorefineries” divulgado em ju-nho de 2010, a conversão de biomassa em combustíveis, energia e outros sub-produtos tem o potencial de contribuir com mais de US$ 230 bilhões para a economia mundial até 2020. De olho no crescimento deste mercado e no desen-volvimento sustentável, a bioprospecção de enzimas viáveis economicamente para a indústria é de extremo interesse.

O solo apresenta uma ampla comuni-dade microbiana, com as mais diversas formas de interação com o ambiente a sua volta, incluindo as mais variadas maneiras de obtenção de recursos nu-tricionais e de competição. Estes fatos contribuem para uma enorme gama de produtos, como enzimas hidrolíticas que clivam os mais diversos polímeros de açúcar, antibióticos com as mais varia-das características (Schloss, 2003).

Como encontrar estes novos recur-sos tão valiosos? São vastas as fontes de amostras biológicas com grande

potencial, onde os microrganismos de solo despontam como uma das princi-pais fontes de bioativos com potencial industrial. No entanto, a prospecção em microrganismo é de difícil acesso devi-do à natureza das amostras e técnicas de cultivo pouco eficazes. Isto torna ne-cessário um avanço tecnológico em bio-prospecção que, no mínimo, acompanhe a demanda por novos recursos.

A obtenção dos bioativos de interes-se passa a ser possível através da tria-gem de bibliotecas metagenômicas, com uso das mais diferentes ferramentas para identificação da atividade almejada. Entretanto, não é uma tarefa fácil, pois o observado é que para aquisição de um bioproduto como, por exemplo, um antibiótico, apenas 1 em 20.000 clones apresentam a atividade desejada (Brady, 2007).

6 . METAGENOMA

A metagenômica é uma abordagem recente para o estudo de comunidades microbianas. Este termo foi criado pela Dra. Jo Handelsmann (Handelsman, 2004) para identificar a técnica que visa o isolamento do DNA total de uma dada amostra ambiental, com o objetivo de acessar maior quantidade de material genético dos microrganismos presentes, a fim de abranger nas análises os mi-crorganismos cultiváveis e os ainda não cultiváveis.

A partir do entendimento de que os microrganismos cultiváveis em uma amostra ambiental são minoria no solo, estima-se que estão entre 0,1 e 1% (Handelsman, 2004), o estudo apenas de microrganismos ambientais cultivá-veis subestima muito a diversidade ge-nética e funcional em uma dada amos-tra, o que prejudica o desenvolvimento de inovações biotecnológicas que pos-sam provir do metabolismo de microrga-nismos ainda não isolados e, portanto, desconhecidos.

Em linhas gerais, bibliotecas meta-genômicas são construídas com o DNA total extraído, que é digerido com en-donucleases e clonado diretamente em hospedeiros bacterianos. Estas podem ser exploradas de duas maneiras, basi-camente: a exploração por sequência e a exploração funcional.

A primeira envolve a identificação de genes pela utilização de marcadores filogenéticos, como o 16S rRNA. O uso de marcadores conservados permite, entre outros, o estudo da diversidade microbiana. Entretanto, o isolamento de novos genes não é possível com a utili-zação desta abordagem.

A exploração funcional se dá pela seleção fenotípica. Os clones são con-frontados com substratos específicos na tentativa de isolar clones com atividades pontuais, como a produção de enzimas de interesse industrial (amilases, lipa-ses, celulases, endoglucanases, etc), de moléculas antibióticas e com fenótipos específicos como clones com atividade resistente a quimioterápicos, antibióticos e outros compostos tóxicos e/ou poluen-tes. Esta abordagem permite a identifi-cação de novos genes e novos produtos com potencial utilização biotecnológica.

Assim, a metodologia metagenômica tem contribuído muito para o isolamen-to e aplicação de moléculas de origem microbiana na indústria, na saúde huma-na e animal, na área bioenergética e na área ambiental em geral.

Resistoma – uma aplicação metagenômica

A resistência a antibióticos é tema preocupante em saúde pública. O sur-gimento de microrganismos resistentes tem agravado a saúde humana, muitas vezes esgotando as alternativas tera-pêuticas em determinadas doenças in-fecciosas e em diversos procedimentos médicos (WHO, 2001; Martinez et al., 2009). Entretanto, a resistência anti-microbiana não é um evento recente e provavelmente possui outras funções na natureza, além daquela relacionada à proteção pelos microrganismos.

A hipótese mais discutida sobre o papel de antibióticos na natureza é a de que essas moléculas estão envolvidas na sinalização entre mi-crorganismos. O objetivo principal da sinalização microbiana – ou comunica-ção célula a célula – é modular a ex-pressão gênica de um grupo de seres para homogeneizar o comportamento dos microrganismos frente a mudan-ças ambientais, como a presença de poluentes, toxinas, mudanças de tem-

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peratura, pH, estresse oxidativo, entre outros (Keller & Surette, 2006).

Esta hipótese parte do conhecimen-to de que os antibióticos são moléculas que se comportam de modo diferente a depender da concentração em que se encontram no meio. Em concentrações subinibitórias (como é provável que este-jam presentes na natureza) influenciam na regulação da transcrição gênica, ou seja, possuem efeitos benéficos à célula. Entretanto, em concentrações altas e tó-xicas – como as atribuídas ao ambiente clínico e hospitalar – promovem a morte celular. Este comportamento dual é de-nominado efeito hormético e diversas outras moléculas o exibem.

Assim, nos ambientes naturais, é proposto que os genes de resistência tenham papel na regulação dos sinais produzidos pelos entes de um grupo de microrganismos, em contrapartida dos antibióticos que, provavelmente, pos-suem função na sinalização em si.

Então, a transição dos elementos de resistência do meio ambiente para o convívio humano altera o contexto ambiental e, assim, a função dos genes de resistência também se modifica e se adapta às novas condições. A presen-ça de antibióticos diferentes e em altas concentrações é comum nos ambientes

hospitalares e, consequentemente, a pressão seletiva nos microrganismos é muito mais alta que na natureza. Nes-te caso, a seleção de microrganismos multirresistentes é estimulada nestes ambientes e os genes de resistência passam a ter papel importante – e mais claro – na sobrevivência e competição entre microrganismos (BOX 1).

Esse fato fortalece o papel dos genes de resistência exclusivamente na prote-ção celular contra os compostos tóxicos nos ambientes hospitalares (D’Costa et al. 2007; Martinez 2008).

Entretanto, apesar da função de re-sistência ser muito evidente neste caso, os genes de resistência antimicrobiana ainda podem promover a transferência lateral de genes e a virulência, funções estas já demonstradas em algumas ce-pas quando confrontadas com alguns tipos de antibióticos, mesmo em concen-trações não letais (Aminov, 2009).

Desde a introdução da terapia antibióti-ca pela descoberta da penicilina nos anos 40, a resistência antimicrobiana tem se desenvolvido e disseminado com rapidez. A pressão seletiva sob a qual as bactérias são confrontadas, derivada principalmente pelo uso irracional dos antibióticos na saú-de humana, animal e agricultura, promove o desenvolvimento de bactérias multirre-

sistentes e estimula a transferência desses elementos de resistência entre os micror-ganismos de um dado local.

Bactérias de solo são as principais produtoras de antibióticos e a maioria dos utilizados hoje na prática clínica são derivados do metabolismo secundário desses seres. Por essa razão, os genes de resistência antimicrobiana também são abundantes nos solos. Porém, a pesquisa pelos elementos de resistên-cia ambientais ainda é subestimada. A maioria dos estudos relacionados à re-sistência antimicrobiana é derivada da análise de cepas patogênicas isoladas do ambiente clínico, e os reservatórios ambientais são pouco abordados.

Assim, a metagenômica pode ser aplicada para acessar a diversidade dos genes de resistência antimicrobiana de um dado local e permite a inclusão de microrganismos ainda não cultiváveis nas análises. Desta maneira, denomina--se resistoma o conjunto de genes de resistência antimicrobiana presentes em um ambiente.

A partir desta ideia, a exploração funcional de clones metagenômicos derivados de amostras ambientais, par-ticularmente de amostras de solos, tem contribuído muito para a abordagem da diversidade desses genes neste ecossis-tema e já identificou novos genes ligados à resistência a antibióticos (Riesenfeld et al., 2004; Allen et al., 2009). Outros ambientes também são utilizados para a descrição do resistoma e de novos elementos de resistência antimicrobiana como a microflora oral humana (Diaz--Torres et al., 2003), a mucosa intestinal de porcos orgânicos (Kazimierczak et al., 2009) e do inseto Lymantriadispar (Allen et al., 2009).

A elucidação dos mecanismos de re-sistência antimicrobiana presentes nos ambientes naturais é essencial para a formulação de planos de contingência e previsão da transferência destes ele-mentos de resistência entre os microrga-nismos, assim como sua disseminação pelos microrganismos patogênicos.

É importante, ainda, para conhecer melhor as funções e os reservatórios dos genes de resistência e dos antibió-ticos na natureza um estudo da ecologia microbiana nos ambientes naturais livres da interferência humana.

BOX 1 :Diagrama mostrando o ciclo dos genes de resistência antimicrobiana dos am-bientes naturais para o convívio humano. Acredita-se que, na natureza, os genes de resistência antimicrobiana possuam funções diversas às de resistência propriamente dita – inclusive, a função de resistir e sobreviver à ação de antibióticos parece ser secundária às ações de regulação, virulência, sinalização e outras (quadro verde). Quando esses genes são transportados para o convívio humano, em especial para o ambiente hospitalar (quadro amarelo), os genes de resistência e os microrganismos se adaptam às novas condições – a pressão seletiva é muito maior nestes ambientes, dada pela alta concentra-ção de antimicrobianos e outras substâncias. Isso provoca modificações nos genes que se adaptam quase que exclusivamente para resistir às moléculas tóxicas e, ao retornarem para a natureza (quadro vermelho), não conseguem exercer as antigas funções, provo-cando mudanças ecológicas pontuais e globais imprevisíveis.

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7 . PERSPECTIVAS

As metodologias moleculares desen-volvidas e aperfeiçoadas nas últimas décadas foram essenciais para que pu-déssemos superar as limitações impos-tas pela abordagem clássica de estudo de populações microbianas, evitando o isolamento e cultivo dos microrganis-mos, desencadeando assim, uma série de estudos de ecologia microbiana que mudaram significativamente a perspec-tiva da diversidade microbiana. Com o desenvolvimento das pesquisas em mi-crobiologia ambiental, tem-se observa-do uma tendência de adoção de novas técnicas para se avaliar a presença de microrganismos em diversos ambientes.

O resultado esperado de um maior conhecimento sobre a diversidade mi-crobiana é muito importante, pois preci-samos compreender melhor as funções exercidas pelas comunidades microbia-nas nos ambientes e o conhecimento das suas interações com outros com-ponentes da biodiversidade. Em adição, os benefícios econômicos e estratégicos estão relacionados com a descoberta de microrganismos (ou sequencias de DNA!) potencialmente exploráveis nos processos biotecnológicos para a ob-tenção de novos antibióticos e agentes terapêuticos, produtos químicos, enzi-mas para aplicações industriais e tecno-lógicas, biorremediação de poluentes e biolixiviação. Outros benefícios podem incluir o prognóstico e prevenção de do-enças emergentes em seres humanos, animais e plantas, e a otimização da ca-pacidade microbiana para a fertilização dos solos e despoluição das águas.

Diante da vasta diversidade repre-sentada pelos microrganismos ainda não cultivados e às limitações de cultivo, torna-se necessário a adoção de novas estratégias para a exploração plena e preservação dos recursos genéticos microbianos. Além disso, nestes dois aspectos, a crescente alteração no uso do solo e sua degradação comprometem diretamente as pesquisas futuras da mi-crobiota nativa.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem a CAPES, CNPq e a FAPDF pelo suporte finan-

ceiro. A doutoranda Alinne Castro (UnB) pelas sugestões.

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Ciência in Foco

IMUNODIAGNÓSTICO DA PARACOCCIDIODOMICOSE

A paracoccidioidomicose (PCM) é micose sistêmica, de natureza granulo-matosa crônica, que acomete principal-mente os pulmões, o sistema fagocítico macrofágico e tecidos mucocutâneos1.

Sua relevância em Saúde Pública está diretamente relacionada a um con-junto de fatores como: a existência de extensas áreas endêmicas; o frequente comprometimento de indivíduos na fase mais produtiva da vida; a possibilidade de ser considerada uma doença profis-sional, o longo tempo necessário para o tratamento dos doentes; a elevada taxa de recidiva, principalmente devido às falhas e abandono do tratamento, e as importantes sequelas detectadas em grande parte dos pacientes. Todas estas

Adriana Pardini VicentiniBióloga, Doutora em Ciências, Pesquisador Científico V do Centro de Imunologia do Instituto Adolfo Lutz, responsável

pelo Laboratório de Imunodiagnóstico das Micoses, Docente-orientadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências, Área de Concentração Pesquisas Laboratoriais em Saúde Pública, da Coordenadoria de Controle de

Doenças da Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil. E-mail: apardini@ial.sp.gov.br

Angela Noronha PassosBióloga, Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Ciências, Área de Concentração Pesquisas Laboratoriais

em Saúde Pública, da Coordenadoria de Controle de Doenças da Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil. E-mail: anpassos@uol.com.br

Camila Mika KamikawaBióloga, Bolsista Fedial do Centro de Imunologia do Instituto Adolfo Lutz, Laboratório de Imunodiagnóstico das

Micoses, São Paulo, SP, Brasil. E-mail: camilamika@yahoo.com.br

Luciane Regina Franciscone SilvaBióloga, Bolsista do Programa de Aprimoramento Profissional “Imunologia e Biologia Molecular Aplicados a Doenças de Interesse em Saúde Pública” Centro de Imunologia do Instituto Adolfo Lutz, Laboratório de Imunodiagnóstico das

Micoses, São Paulo, SP, Brasil. Email: lufranciscone@ig.com.br

Valdelene Sayuri KoharaBiomédica, Biologista do Centro de Imunologia do Instituto Adolfo Lutz, Laboratório de Imunodiagnóstico das Micoses,

São Paulo, SP, Brasil. E-mail: vs.kohara@gmail.com

condições determinam um expressivo e elevado custo sócio-econômico para o Estado e/ou Federação2,3,4.

PESQUISA DE ANTICORPOS

É evidente o fato de que o diagnósti-co de certeza de processos infecciosos derive da demonstração do agente etio-lógico em preparados histológicos, exa-me a fresco ou cultivo5.

Contudo, em algumas situações o estado físico ou clínico dos pacientes impossibilita o acesso ao local da lesão, impedindo assim a coleta do material biológico6.

Vale a pena enfatizar, que o longo pe-ríodo (2 a 6 semanas) necessário para

o crescimento e identificação dos fungos termo-dimórficos em cultura, dificulta, de certa forma, o diagnóstico, uma vez que provoca atraso na liberação do resultado e, consequentemente, na introdução de medidas terapêuticas específicas5.

Historicamente, na PCM a pesquisa de anticorpos6 e antígenos7 específicos no soro de pacientes empregando-se técnicas sorológicas, além de importan-te auxílio diagnóstico, tem a função de monitorar o curso da doença durante e pós-tratamento permitindo a obtenção de resultados mais rápidos, quando comparados aos exames de cultura e histopatológico, sendo que em alguns casos se traduz na primeira indicação da natureza micótica da doença, principal-

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mente naqueles indivíduos com sinais clínicos inaparentes5,8. A técnica utiliza-da, portanto, há que aliar sensibilidade à especificidade para que o valor preditivo seja máximo e reprodutível9.

Apesar de técnicas sorológicas como imunodifusão dupla, imunofluorescência indireta, contraimunoeletroforese, ELI-SA e immunoblotting serem emprega-das para o diagnóstico confirmatório da PCM, visando à pesquisa de anticorpos e/ou antígenos, os índices de resultados falsos positivos e/ou negativos ainda são expressivos, estando a especificidade e sensibilidade da técnica diretamente rela-cionadas ao antígeno empregado10.

Segundo Fava-Netto11, o primeiro teste amplamente utilizado no diagnósti-co e acompanhamento de pacientes com PCM foi a fixação de complemento (FC), desenvolvido por Moses12, empregando como antígeno extrato de P. brasilien-sis em salina, obtendo sensibilidade de 80%. Posteriormente, o emprego de an-tígeno polissacarídico de P. brasiliensis elevou a sensibilidade da técnica para 90%13,14. Contudo, devido a sua baixa especificidade e às dificuldades metodo-lógicas envolvidas, como a instabilidade das hemáceas e do complemento, esta técnica agora é raramente utilizada13.

A imunonifusão dupla (ID) foi pri-meiramente utilizada no diagnóstico da PCM por Ferri15 e permanece há 50 anos como método de escolha, empregado rotineiramente pelos laboratórios clíni-cos devido ao seu fácil procedimento, baixo custo operacional, sensibilidade entre 65 a 100%8, especificidade e va-lor preditivo de 100%. Além disso, esta técnica consente que os clínicos reali-zem o acompanhamento sorológico dos pacientes, verificando a diminuição dos títulos de anticorpos anti-P. brasiliensis, permitindo também avaliar a eficácia da terapia antifúngica10.

Segundo Siqueira16, os resultados da ID podem variar na dependência da pre-paração antigênica utilizada, da forma da doença e do início do tratamento.

Inúmeros trabalhos relatam o empre-go de preparações antigênicas distintas na realização do ensaio de ID, tais como filtrado de cultura da fase filamentosa17, extrato citoplasmático de leveduras18 e cell-free antigen19. Entretanto, para a re-alização do ensaio de ID, a preparação

antigênica de escolha, é o exoantígeno bruto obtido a partir de células levedu-riformes, devido à simplicidade na pro-dução e maior estabilidade quando com-parado aos demais, além do importante fato de produzir sensibilidade em torno de 94% e especificidade de 100% sendo o valor preditivo de 100%20,21,22.

Na ID, quando se utiliza como antí-geno filtrado de cultura obtido a partir de leveduras de P. brasiliensis frente a so-ros de pacientes com suspeita clínica de PCM, é possível detectar até três linhas de precipitação: linha 1 (perto do orifício do antígeno), linha 2 (posição intermedi-ária) e linha 3 (perto do orifício do soro). A linha 1 é detectada em aproximada-mente 95 a 98% dos soros de pacientes portadores de doença ativa, sendo a últi-ma a desaparecer após a instauração da terapia antifúngica14,23. A linha 2 tem sido identificada em 60 a 65% dos casos, sendo a segunda a desaparecer após o início do tratamento específico, enquan-to a terceira linha tem sido observada em apenas 30 a 35% dos casos, sendo a primeira a desaparecer. O número de bandas observadas no ensaio de ID está intimamente relacionado à severidade/gravidade da doença14.

Del Negro et al.24 avaliaram soros de 43 pacientes com PCM ativa, por ID empregando como antígeno, filtrado de cultura obtendo 93,5% de reatividade.

Sob avaliação multicêntrica, utilizan-do como antígeno filtrado de cultura, denominado Ag7 caracterizado por ser constituído por aproximadamente 90% da fração imunodominante (gp43) de P. brasiliensis, obtido da amostra B-339 cultivada em meio Negroni modificado, a 36º C, durante sete dias, verificou-se que a técnica apresentou 84,3% de sen-sibilidade e 98,9% de especificidade25.

Valle et al.26, utilizando como subs-trato antigênico filtrado de cultura, de leveduras, concentrado e dialisado a partir de um pool de isolados de P. bra-siliensis, obteve 90,2% de sensibilidade frente a soros de 245 pacientes na fase pré-tratamento.

Da Silva22 avaliou, por ID, 75 amos-tras de soros de pacientes com PCM comprovada frente a diferentes prepa-rações antigênicas (Ag), demonstrando que a reatividade dos soros dos pacien-tes foi de 90% para Ag somático e com-

ponente solúvel da superfície externa da parede celular de P. brasiliensis de 5, 10, 15 e 20 dias; 86,6% para cell free anti-gen; 83,3% para Ag metabólico; 80% Ag 113 NGTA e 76,6% para Ag113 Negroni.

Neves et al.27 relataram a ausência de reatividade, pela ID, de soros de pa-cientes com doença em atividade frente a antígenos de P. brasiliensis. Os au-tores observaram que estes pacientes continham baixos níveis de IgG e IgG1 específicas, quando comparados aos elevados níveis de IgG2 de pacientes com ID positivas. Os mesmos sugerem que a ausência de reatividade na ID pode estar relacionada à produção de IgG2 de baixa afinidade direcionada a epítopos glicídicos

Visando buscar alternativas para a realização do imunodiagnóstico da PCM, Gomes28 avaliou a aplicabilidade do teste de aglutinação com látex na de-tecção de anticorpos anti-P. brasiliensis contra antígeno bruto do fungo. Dos 51 soros testados, a autora obteve 84,3% de reatividade, sendo que os padrões de aglutinação variaram de 1+ a 4+ com títulos variando entre 1:2 a 1:64. A auto-ra descreve não ter observado resulta-dos falsos positivos quando amostras de pacientes hígidos (soro humano normal) foram analisadas, contudo a existência de reatividade cruzada frente a soros de pacientes com aspergilose e histoplas-mose, e com doenças não fúngicas foi relatada. A sensibilidade, especificidade e valores preditivos, positivo e negativo, produzidos pelo teste de látex foram 84,31%, 81,05%, 70,49% e 90,59%, respectivamente. Segundo a autora, os resultados encontrados sugerem que esta metodologia possa ser útil no so-rodiagnóstico da PCM, visto apresentar vantagens como baixo custo e rápida execução,

O teste de ELISA (Enzyme Linked ImmunonoSorbent Assay) tem sido utili-zado para a detecção de anticorpos em quase todas as micoses sistêmicas, se-não em todas. Apesar disso, em relação ao imunodiagnóstico da paracoccidioi-domicose a técnica, devido sua elevada sensibilidade e baixa especificidade, ain-da oferece grandes porcentagens de re-atividade cruzada, principalmente frente a soros de pacientes com histoplasmo-se, candidíase, doença de Jorge Lobo e,

20

recentemente, frente a soros de pessoas aparentemente sadias, residentes em áreas endêmicas para PCM29.

Pons et al.30 foram os pioneiros no emprego da metodologia de ELISA vi-sando a detecção de anticorpos anti-P. brasiliensis. Desde então, esta técnica sorológica tem sido o alvo de inúmeras publicações visando a detecção de an-ticorpos séricos anti-P. brasiliensis8 bem como de antígenos circulantes7,31,32.

Segundo Camargo8 o emprego desta gama de antígenos distintos tem confe-rido geralmente alta sensibilidade, mas não necessariamente alta especificidade à reação de ELISA.

Pesquisadores brasileiros como Mendes-Giannini et al.33 e Camargo et al.34 contribuíram substancialmente para o desenvolvimento da metodologia de ELISA visando a pesquisa de anticorpos séricos anti-P. brasiliensis.

Mendes-Giannini et al.33 padroniza-ram um ensaio de ELISA de absorção para o imunodiagnóstico da PCM empre-gando como antígeno filtrado de cultura de P. brasiliensis, conseguindo 100% de sensibilidade e 88% de especificidade. Os autores demonstraram, entretanto, a ocorrência de reatividade cruzada frente a soros de pacientes portadores de mi-coses como histoplasmose e doença de Jorge Lobo. Buscando eliminar ou mini-mizar esses índices de resultados falsos positivos, as amostras de soros foram primeiramente absorvidas com antígeno de Histoplasma capsulatum.

Camargo et al.34 avaliaram a metodo-logia de ELISA para detecção e quantifi-cação de anticorpos séricos anti-P. brasi-liensis utilizando antígeno metabólico de P. brasiliensis obtido a partir de células leveduriformes. Os autores avaliaram o ensaio de ELISA frente a amostras de soro de pacientes com PCM e com ou-tras micoses sistêmicas, e fixando um cut-off de 1:400, demonstraram sensibi-lidade de 95% e especificidade de 97%, sugerindo que o teste poderia fornecer novas perspectivas para o diagnóstico sorológico da paracoccidioidomicose. Entretanto, o tratamento prévio dos so-ros com células inativadas de Candida albicans diminuiu, mas não aboliu, a reatividade cruzada frente a soros he-terólogos, pois soros de pacientes com histoplasmose e candidíase foram de-

tectados acima do valor limite de positi-vidade indicado para PCM.

Melhores resultados foram obtidos pelo magnetic-ELISA (Magnetic-Enzyme Linked Immunosorbent Assay), utilizan-do antígeno somático, verificando-se 14,2% de reatividade cruzada com so-ros de pacientes com histoplasmose, no qual a taxa de densidade óptica dos soros positivos para PCM esteve entre 0,8 e 2,635, indicando também melhores resultados no seguimento sorológico dos pacientes quando comparado a outros testes, como fixação de complemento36.

Sabe-se que a sensibilidade e a es-pecificidade dos métodos sorológicos esta intimamente relacionada ao tipo de preparação antigênica utilizada na con-dução da reação. Especificamente para ensaios imunoenzimáticos como ELISA, estes parâmetros podem variar não ape-nas pelo tipo e/ou qualidade do antígeno utilizado na reação, mas também na de-pendência do cut-off adotado.

Em 1987, Cano et al.37 avaliaram o desempenho do ensaio de ELISA em-pregando antígeno citoplasmático de P. brasiliensis, demonstrando que 66% dos soros analisados reagiram a títulos maiores ou iguais a 1:128. Apenas 4 a 5% dos soros de doadores normais, pacientes com histoplasmose e outras micoses sistêmicas reagiram a essa di-luição, conferindo 95% de especificidade ao teste.

Diversos autores têm demonstrado que apesar da utilização do antígeno imunodominante de P.brasiliensis, ou seja, a glicoproteína de 43 kDa (gp43) purificada e tratada com metaperioda-to de sódio (agente antioxidante) não tem-se observado melhora expressiva nos índices de especificidade do ELI-SA29,38,39,40.

Mendes-Giannini et al.33 obtiveram sensibilidade de 100% empregando a metodologia de ELISA de absorção, no entanto, a especificidade do ensaio foi diminuída pela reatividade cruzada frente a soros de pacientes com outras doenças fúngicas como histoplasmose, doença de Jorge Lobo, criptococose e candidíase. Segundo a autora, mesmo utilizando gp 43 purificada e tratada com metaperiodato de sódio, a especificida-de da técnica não excedeu 84%, prova-velmente devido à maior exposição de

epítopos de carboidrato constituintes da gp43 após o acoplamento em placas de poliestireno. Interessante enfatizar que apesar da reatividade cruzada, o ensaio de ELISA, normalmente, tem apresenta-do resultados satisfatórios especialmen-te na diferenciação dos níveis de anti-corpos produzidos nas diferentes formas clínicas bem como no seguimento soro-lógico de pacientes com PCM durante o tratamento24,41.

Camargo et al.42 avaliaram a aplica-bilidade do ensaio de ELISA de captura empregando anticorpos monoclonais anti-gp43 para detecção de imunoglobu-lina G anti-gp43. Os autores obtiveram índices de sensibilidade e especificida-de superiores aos obtidos por outros ensaios enzimáticos, ou seja, 100% e 96,7%, respectivamente. No mesmo es-tudo, a gp43 foi analisada também por ELISA convencional, utilizando amostras de soro de pacientes com PCM compro-vada e soros de pacientes portadores de outras infecções fúngicas, demostrando que soros heterólogos (principalmente histoplasmose e doença de Jorge Lobo) reagem na mesma faixa das amostras de pacientes com PCM ativa. Esses resultados contraditórios podem ser ex-plicados pela forma como a gp43 é apre-sentada para os anticorpos nos diferen-tes ensaios. Quando a gp43 é fixada em substratos sólidos, em placas de ELISA, por exemplo, ocorrem mudanças con-formacionais na molécula, fazendo com que os epítopos sejam reconhecidos por soros heterólogos, e quando a molécu-la está em solução, como no ELISA de captura, a gp43 assume diferentes con-formações, apresentando epítopos mais reativos com anticorpos específicos. A deglicosilação da gp43 frequentemente abole a reação com soros heterólogos

É indiscutível que o ensaio de ELISA de captura representa um avanço na detecção de anticorpos específicos anti--P. brasiliensis. Contudo, por se tratar de uma metodologia in house, o emprego desta técnica na rotina laboratorial implica necessariamente na obrigatoriedade de profissionais qualificados para o preparo dos constituintes do método, ou seja, an-tígeno purificado e anticorpo monoclonal. Além disso, deve-se salientar que o ELI-SA de captura apresenta custo superior quando comparado ao método conven-

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cional/clássico. Estes aspectos, infeliz-mente fazem com que a utilização desta metodologia não seja possível em muitos laboratórios. Em contrapartida, o ELISA convencional tem se mostrado uma me-todologia excelente para a detecção de anticorpos anti-P.brasiliensis em alguns laboratórios, devido a sua fácil execução, a não necessidade do emprego de anti-corpo monoclonal e/ou antígeno purifica-do, por fornecer resultados quantitativos, por permitir automatização, detectando até nanogramas de anticorpos por mililitro de soro com alta sensibilidade, variando de 95 a 100%14,34.

Técnicas imunoenzimáticas como western-blott ou immunoblotting (IB) possuem alta sensibilidade e foram empregadas originalmente para carac-terizar a resposta imune humoral aos antígenos de P. brasiliensis10. Contudo, devido a sua natureza complexa e fal-ta de padronização, infelizmente ainda não é exequível para uso em todos os laboratórios de mico-sorologia, estando o emprego da mesma restrita a Labora-tórios de Referência43.

Blotta e Camargo44 e Taborda e Ca-margo45 relatam que o immunoblotting pode ser utilizado no auxílio diagnóstico e seguimento dos pacientes em trata-mento, apresentando sensibilidade e especificidade de 100%, necessitando, entretanto, da utilização de preparações antigênicas, com concentrações ade-quadas de gp43 e gp70. Segundo os autores, a taxa de reatividade cruzada e/ou resultados falsos-positivos, frente à amostras de soros de pacientes portado-res de micoses heterólogas ou mesmo frente a soros de indivíduos considera-dos saudáveis é de 4,3 %

Camargo e colaboradores46 avalia-ram por IB a capacidade discriminatória de exoantígeno obtido a partir de filtrado de cultura da amostra B-339 de P. bra-siliensis frente a 97 soros de pacientes com PCM (25 soros de pacientes antes do tratamento antifúngico e 72 soros de pacientes na vigência de terapia especí-fica) e frente a soros heterólogos, bem como de indivíduos saudáveis residentes em zona endêmica para esta patologia. A análise dos resultados demonstrou que anticorpos anti-P. brasiliensis da classe IgG reagiram preferencialmente frente a quatro frações antigênicas: 70, 52, 43 e

20-21 kDa, sendo observado que a fra-ção de 43 kDa (gp43) foi reconhecida por 100% dos soros de pacientes com PCM e a de 70 kDa (gp70), por 96%.

Mendes-Giannini et al.47 detectaram por immunoblotting a presença da gp43 em 28 soros de pacientes com PCM, divididos em três grupos. Grupo 1 cons-tituído de 12 soros de pacientes portado-res da forma juvenil, avaliados em três diferentes períodos: antes, 10 e 24 me-ses pós tratamento. Grupo 2 com cinco soros de pacientes com a forma crônica, que não se encontravam na vigência de tratamento. Grupo 3 constituído de seis soros de pacientes considerados clini-camente curados há mais de um ano. Soros de indivíduos saudáveis foram utilizados como controle da reação. Em relação aos pacientes com PCM juvenil, verificou-se que 100% das amostras ob-tidas antes do início do tratamento reco-nheceram de forma específica a gp43 e, a partir do décimo mês de quimioterapia, a detecção da mesma acontecia com menor freqüência, tornando-se inde-tectável após 24 meses de tratamento. Observou-se que 100% dos soros de pacientes com PCM crônica reagiram frente à fração de 43 kDa e que a mesma não foi detectada por soros de pacientes considerados clinicamente curados.

Blotta e Camargo44 avaliaram por IB 60 soros de pacientes com PCM, obser-vando que 100% reconheciam de forma específica a gp43. Ortiz e cols.48 de-monstraram que o antígeno recombinan-te de 27 kDa era reconhecido por IB por 91% dos soros com PCM avaliados, não sendo observada reatividade cruzada frente a soros heterólogos. Este achado é de considerável interesse, visto que proteínas recombinantes fornecem uma fonte altamente reprodutível de antíge-nos definidos.

Takahachi e cols.49 avaliaram por im-munoblotting 78 soros de pacientes com suspeita clínica de PCM, que apresen-taram ausência de reatividade por ID. Os autores empregaram como antígeno filtrado de cultura da amostra B-339 de P. brasiliensis, observando que das 78 amostras, 51 (65,4%) reagiram de forma específica frente à gp43. Segundo Del Negro e cols.50, são raros os casos de pacientes que apresentam ausência de reatividade pelas provas de ID e contrai-

munoeletroforese. Entretanto, quando isto ocorre e os soros são avaliados por immunoblotting os mesmos reagem fren-te à gp43.

Silva e cols.51 avaliaram por immuno-blotting 23 soros de pacientes com con-firmação clínica e micológica de PCM e com ausência de anticorpos anti-P. bra-siliensis, pela ID, frente a duas prepara-ções antigênicas distintas, observando que 95,4% dos soros reconheceram de forma específica a gp43 e 100%, gp70, descritas como marcadores sorológicos da doença.

Vidal e cols.52 relatam o caso de um paciente com resposta sorológica atípi-ca, ou seja, o não reconhecimento por immunoblotting da gp43; reagindo, con-tudo, frente à fração antigênica de 70 kDa, descrita na literatura como sendo reconhecida por aproximadamente 96% dos soros de pacientes com PCM. Os resultados de Silva e Vidal e cols.51,52 podem ser explicados, talvez, pelos achados de Berzaghi e cols.53, sendo que a ausência de reatividade à gp43 pelas provas de ID e IB se deva a não secreção/expressão desta molécula pela amostra fúngica responsável pela infecção dos pacientes; ou ainda pelos achados de Campos e cols.54 relaciona-dos à existência de diferentes isoformas da molécula de 43 kDa.

Passos et al.43 avaliaram os parâme-tros intrínsecos dos ensaios de ID e IB, frente a 36 amostras de soro de pacien-tes com PCM ativa e 49 soros de doado-res de sangue. Os autores observaram para ID sensibilidade de 81% e eficiência de 92%. Para o IB, a sensibilidade foi de 94% e eficiência de 98%. Para ambas as técnicas a especificidade foi de 100%. A análise de concordância (índice kappa de Cohen) entre as ambas foi conside-rada boa (k = 0. 76). Os autores conclu-íram que as metodologias são comple-mentares para o diagnóstico presuntivo, prognóstico da doença e possível detec-ção precoce do processo infeccioso e/ou de recaídas.

PESQUISA DE ANTÍGENOS

A partir do sucesso obtido com me-todologias direcionadas à detecção de antígenos circulantes em outras doen-ças fúngicas, tais como candidíase55,

22

criptococose56, aspergilose57 e histoplas-mose58, investigações foram conduzi-das com o intuito de detectar antígenos circulantes de P. brasiliensis nos fluidos biológicos de pacientes com a doença.

Inicialmente, através de ensaios de imunoprecipitação foi possível detectar antígenos circulantes no soro de indi-víduos infectados por P. brasiliensis, estabelecendo-se uma correlação entre a presença de antígenos e doença ati-va, provando, além disso, ser uma fer-ramenta promissora para o diagnóstico da micose. Entretanto, esta metodologia não permite a caracterização das fra-ções antigênicas reconhecidas pelas imunoglobulinas durante a resposta imu-ne humoral59.

Freitas da Silva e Roque-Barreira31 avaliaram a detecção de antígenos cir-culantes de P.brasiliensis de pacientes com doença em atividade através de um ELISA de competição, capaz de detectar 6 ng de antígeno por mililitro de soro. Vinte e sete (30,68%) das 88 amostras testadas mostraram-se reativas, sendo observada frequência de reatividade nos soros de pacientes com a forma aguda da doença. Segundo os autores, o follow--up de um caso mostrou uma correlação entre os níveis de antígenos detectados no soro e evolução da doença. Reações falsos-positivas foram observadas frente a soros de pacientes com histoplasmo-se, criptococose e aspergilose.

O primeiro trabalho descrevendo a utilização de anticorpos monoclonais no estudo da PCM, foi desenvolvido com ELISA de inibição utilizando anticor-pos monoclonais IgG de camundongos BALB/c direcionados a uma proteína de 87 kDa, derivada de filtrado de cultura de leveduras de P. brasiliensis, revelan-do 100% de sensibilidade na detecção de antígenos em pacientes com a forma aguda e, 83,3 % e 60% respectivamente para as formas crônica unifocal e multi-focal. Entretanto, a reatividade cruzada foi alta frente a soros de pacientes com aspergilose e histoplasmose. Além dis-so, os autores concluíram que a meto-dologia mostrou-se eficiente para a ava-liação do acompanhamento sorológico dos pacientes, pois se obteve correlação significativa (p < 0,001) entre o declínio da concentração de antígeno circulante nos fluidos biológicos dos pacientes com

PCM, de ambas as formas clínicas, e a melhora ou mesmo cura clínica60.

Marques-da-Silva et al.61,62,63 empre-garam o ELISA de inibição para avaliar a antigenemia em pacientes com PCM empregando anticorpos monoclonais direcionados às proteínas consideradas marcadores sorológicos de P. brasilien-sis, gp43 e gp70, em espécimes clínicos (soro, lavado broncoalveolar e líquido ce-falorraquidiano). Os autores verificaram que a gp43 esteve presente em 100% dos soros de pacientes com a forma aguda e crônica unifocal da doença em concentrações médias de 18,23 μg/mL e 7,64 μg/mL, respectivamente. Na forma crônica multifocal 95,31% dos pacientes analisados demonstraram concentração média de gp43 circulante de 8,64 μg/mL. Amostras de líquido cefalorraqui-diano e lavado broncoalveolar também foram 100% reativas neste ensaio, com concentrações médias de 19,26 μg/mL e 16,06 μg/mL, respectivamente, provan-do serem espécimes viáveis para o diag-nóstico da PCM. Em relação à detecção da fração de 70 kDa (gp70), níveis eleva-dos foram observados no soro (11,86 μg/mL), seguido de lavado broncoalveolar (7,5 μg/mL) e líquido cefalorraquidiano (6,78 μg/mL), onde esteve presente em 100% das amostras testadas, com exce-ção de soros de pacientes com a forma crônica multifocal (98,43%).

A sensibilidade destes ensaios variou de acordo com o espécime clínico fican-do em torno de 90 a 100% com especi-ficidade de 100%. Esta metodologia se mostrou eficiente para a análise durante o seguimento de pacientes em tratamen-to com itraconazol, nos quais os níveis de antígenos circulantes declinaram de forma correlacionada com a diminuição dos níveis de anticorpos, sendo que após 12 meses de tratamento, os níveis de gp43 foram menores que 5 μg/mL e os de gp70 indetectáveis32,64. Entretanto, apesar dos resultados promissores, tan-to no diagnóstico como no seguimento de pacientes após a instituição do tra-tamento, a viabilidade de uso na rotina clínica é desconhecida65.

Diante do exposto, os ensaios soro-lógicos, apesar de suas limitações, são importante no primo-diagnóstico e monito-ramento da paracoccidioidomicose, princi-palmente quando métodos mais sensíveis,

ELISA e/ou immunoblotting, são utilizados em associação a ensaios mais específi-cos como a imunodifusão dupla. Estudos adicionais sobre o reconhecimento das glicoproteínas de 43 e 70 kDa (gp 43 e gp 70) em indivíduos saudáveis e naqueles portadores da doença são necessários especialmente para interpretar de forma apropriada a presença e intensidade des-tes marcadores sorológicos.

Importante salientar que o diagnós-tico do processo infeccioso provocado por P.brasiliensis não deve ser único, ou seja, sendo necessário a associação de critérios clínicos, epidemiológicos, laboratoriais, de imagem (raio X de pul-mão e/ou tomografia computadorizada), exames micológicos (direto, isolamento e cultura), histopatológico e imunológico.

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Ciência in Foco

ATIVIDADE MICROBIANA COMO BIOINDICADORES DE TOXICIDADE AMBIENTAL

Os testes ecotoxicológicos surgiram para avaliação de risco na poluição aquática, contudo se mostrou muito eficiente como ferramenta complemen-tar na detecção da toxicidade de locais biorremediados (Hubálek et al., 2006). A biorremediação baseia-se na capacida-de dos microrganismos em metabolizar determinado poluente em produtos ino-fensivos a saúde humana e ao ambiente (Vidali, 2001). No entanto, em alguns casos os produtos intermediários, for-mados durante a biodegradação, podem acarretar um caráter mais tóxico que o da substância original (Nunes-Halldor-son et al., 2004).

A capacidade do solo na transforma-ção do contaminante por meio da inte-ração de processos bióticos e abióticos pode afetar a biodisponibilidade do po-luente ao organismo, alterando sua to-xicidade. Portanto, é impossível prever, apenas com análises químicas, quanto cada fração da mistura contribui para o efeito tóxico aos organismos vivos (Ho-oper e Anderson, 2009).

Os bioensaios expõem o organismo teste ao meio contaminado, seja água, sedimento ou solo, e avaliam os efeitos da contaminação no crescimento, no comportamento, na sobrevivência, na re-produção, no metabolismo, entre outros. Estes são os parâmetros que podem ser

Jaqueline Matos Cruz, Paulo Renato Matos Lopes, Ederio Dino Bidoia

Departamento de Bioquímica e Microbiologia, IB, Universidade Estadual Paulista, UNESP, Av 24 A, n.1515, Rio Claro, São Paulo 13506-900, Brasil.

afetados pela contaminação e facilmente detectáveis. Os testes ecotoxicológicos podem ser classificados em agudo ou crônico de acordo com o tempo de ex-posição. Os testes de toxicidade aguda são de curto tempo e mensura o efeito da exposição a concentrações relativa-mente altas do poluente. Porém, os tes-tes de toxicidade crônica são de longo tempo e medem o efeito da exposição a concentrações relativamente menores (Kapanen e Itavaara, 2002).

Bioensaios com microrganismos

Cada microrganismo reage diferen-temente à presença do contaminante, algumas espécies podem ter seu cresci-mento ou atividade seriamente inibidas. Porém, as espécies capazes de utilizar o contaminante como fonte de energia poderão assumir a condição de espé-cie dominante, podendo causar sérias conseqüências ao equilíbrio ecológico (Wang et al., 2004).

Os testes de toxicidade com micror-ganismos são simples, rápidos e bara-tos, resultando em um aumento no uso para fins de monitoramento ambiental (Abbondanzi et al., 2003). Os testes com bactérias podem ser realizados utilizan-do uma cultura pura de uma espécie bem definida ou uma mistura de micror-

ganismos. A reprodutibilidade do tes-te, ou seja, executado sob as mesmas condições apresentam resultados seme-lhantes, facilita a padronização e a com-paração entre os resultados, quando uti-lizando apenas uma única espécie (Ribo et al., 2000). Os bioensaios com cultura pura podem ser realizados até mesmo com espécies exóticas ao ambiente em estudo, desde que o parâmetro medido seja considerado comum para todos os microrganismos. Toda via, os bioensaios com cultura mista de espécies que ocor-rem naturalmente no ambiente fornecem informações ecologicamente viáveis dos efeitos do composto em estudo (Kapa-nen e Itavaara, 2002).

Um aspecto a se considerar no uso de bactérias em bioensaios é a permea-bilidade da célula a substância tóxica de natureza hidrofóbica. As bactérias gram--negativas são envoltas por membrana citoplasmática, parede celular de peptí-deoglicana e membrana externa, sendo uma efetiva barreira contra difusão de contaminantes hidrofóbicos. Porém, co-nhece-se pouco sobre a influência dessa barreira de semi-permeável na sensibili-dade do teste utilizando bactérias (Bitton e Koopman, 1992).

As variáveis medidas nos ensaios ecotoxicológicos podem ser letalidade, taxa de crescimento, mudanças na di-

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versidade da espécie, respiração, inibi-ção da degradação ou de uma enzima especifica, entre outras (Dutka et al., 1983; Mehrasbi et al., 2003; Nwuche e Ugoji, 2008). A exposição a ambientes contaminados pode causar mudanças fundamentais na atividade microbiana, afetando a transformação da matéria orgânica e o ciclo de nutrientes no ecos-sistema (Hooper e Anderson, 2009).

A atividade microbiana como um in-dicador de qualidade ambiental pode ser usado para avaliar casos como: conta-minação de pesticidas, hidrocarbonetos, metais pesados, restauração de locais contaminados e sistemas de tratamento de esgoto (Marwood et al., 1998; Brohon et al., 2001; Pascual et al., 2000).

Bioensaios com Vibrio fischeriA bactéria marinha Vibrio fischeri

emite luz naturalmente, devido a reações químicas que ocorrem no organismo, ca-talisadas pela enzima luciferase. Em al-gumas bactérias luminosas encontram--se proteínas acessórias que geralmente causam mudança no comprimento de onda da luz emitida, essas proteínas se juntam a luciferase e altera o espectro de emissão (Karatani e Hastings, 1993).

Esse teste de toxicidade leva em consideração a comparação da biolumi-nescência da bactéria V. fischeri antes e após a exposição ao composto tóxico. A concentração da substância tóxica que causa redução de 50% na emissão de luz após a exposição a determinado tem-po é designada como EC50 (Parvez et al., 2006).

O ensaio da bioluminescência emiti-da por V. fischeri é realizada pelo uso de kits comerciais como Microtox, Aboatox, LUMIStox, dentre outros. Normalmente, os kits acompanham o aparelho para medir a luminosidade emitida, porém ou-tra forma de avaliar pode ser realizada pelo uso de espectrofotômetro de fluo-rescência (Mariscal et al., 2003).

Ao contrário da maioria dos bioen-saios que utilizam como parâmetros reprodução e crescimento, o uso da ati-vidade microbiana como parâmetro de toxicidade impede o efeito de uma subs-tância tóxica no metabolismo microbiano (Parvez et al., 2006).

Embora o ensaio da inibição da bio-luminescência tenha sido originalmente

aplicado para análise de amostras aquá-ticas, esse ensaio também é proposto para avaliar a toxicidade de solo conta-minado (Ronnpagel et al., 1995; Brohon et al., 2001). Porém, nesse caso são necessárias algumas modificações, pois a presença de partículas que alteram a turbidez e/ou a cor da amostra, pelo con-tato com o solo ocasionando em leituras errôneas. Além disso, o microrganismo utilizado no teste tem uma salinidade ótima correspondente ao ambiente ma-rinho, o que difere para o solo (Abbon-danzi et al., 2003). Segundo Molnár et al. (2007), o teste de bioluminescência de V. fischeri foi um sensível indicador de toxicidade para solo contaminado com creosoto.

Diferente dos bioensaios com orga-nismos aquáticos que necessitam de 96 horas para obter resultados de toxi-cidade, o bioensaio com V. fischeri pode medir a toxicidade em minutos. Deste modo, Kaiser (1993) relata a importância em estudar a correlação da sensibilidade dos bioensaios com bactérias em rela-ção aos outros bioensaios com peixes, algas e mamíferos que necessitam de maiores cuidados, tempo e custo. Nos estudos de Dalzell et al. (2002) foram comparados cinco diferentes bioensaios quanto a sensibilidade, custo do teste, relevância e facilidade na execução. Os resultados demonstraram que a inibição da bioluminescência de V. fischeri foi o bioensaio mais sensível para todos os ti-pos de contaminantes e custo moderado para execução do teste.

Devido a essas vantagens, vários pesquisadores estão utilizando o teste da inibição da bioluminescência como ensaios toxicológicos com diferentes contaminantes (El-Alawi et al., 2002; Hu-bálek et al., 2007; Marwood et al., 1998).

Atividade da desidrogenase microbiana

No ambiente, a atividade enzimá-tica é essencial para a transformação de energia e ciclagem dos nutrientes. A atividade enzimática microbiana é responsável por tornar os nutrientes disponíveis para que outros organismos possam assimilar. A oxidação nos siste-mas biológicos é freqüentemente indício de desidrogenação e grande parte das enzimas que catalisam reações de oxi-

dação são desidrogenases (Nelson e Cox, 2002). Estas são enzimas intrace-lulares responsáveis pela produção de energia para os organismos (Perreira et al., 2007).

As substâncias tóxicas que afetam o ambiente têm relação direta com a atividade enzimática dos microrga-nismos. O método que estima a ativi-dade da desidrogenase microbiana, avalia a redução de 2,3,5-cloreto de trifeniltetrazolium (TTC) a 1,3,5-trife-nilformazam (TPF) após incubação, sendo o TTC um aceptor artificial de elétrons. Outro aceptor utilizado com a mesma função do TCC é o “2-p-iodo--nitrophenyl-phenyltetrazolium chloride (INT)” que reduz a “iodonitrophenylfor-mazan (INTF)”. Assim, pode-se avaliar o impacto de determinada substância aos microrganismos com a inibição da atividade da desidrogenase microbiana (Alef, 1995).

A atividade da desidrogenase é fre-qüentemente utilizada para determinar a qualidade microbiana do solo sob in-fluência de poluentes como metais pe-sados, pesticidas e petróleo (Margesin et al., 2000; Pascual et al., 2000; Shen et al., 2005). Wyszkowska et al. (2006) relatavam o aumento da atividade da desidrogenase microbiana com a conta-minação de diesel no solo. Baran et al. (2004) encontraram correlação positiva entre a atividade da desidrogenase e a concentração de alguns tipos de hidro-carbonetos aromáticos policíclicos.

Ao analisar a atividade desidrogená-sica microbiana do efluente de refinaria de petróleo, Nwanyanwu e Abu (2010) re-velavam que alguns isolados bacterianos têm sua atividade diminuída. Entretanto, Streptococcus sp. RW3 e Pseudomonas sp. RW4 tiveram a atividade estimulada com a adição de 12,5% de contaminante. Os autores atribuíram o fato a capacida-de dessas bactérias em utilizar fenóis e outros poluentes inorgânicos. Lapinskie-ne et al. (2006) utilizaram o TTC para testar a atividade da desidrogenase mi-crobiana em solo contaminado com óleo diesel e biodiesel e revelam que o diesel a concentração acima de 3% foi tóxico a atividade microbiana, enquanto o biodie-sel aumentava a atividade microbiana a medida que aumentava a concentração do biocombustível.

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CONSIDERAÇÕES FINAIS

No meio ambiente os microrganis-mos são responsáveis por vários pro-cessos essenciais à vida. Substâncias tóxicas que inviabilizem as células mi-crobianas ou comprometam seu meta-bolismo podem alterar profundamente a qualidade do ambiente. Assim, os microrganismos são muito aplicados em bioensaios para estimar o impacto do contaminante a microbiota. Além disso, a facilidade na execução, o baixo custo e o rápido resultado em relação aos testes de ecotoxicidade com outros organismos tornaram os microrganis-mos freqüentemente utilizados como organismos-teste.

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Ciência in Foco

BACTERIOCINAS: PEPTÍDEOS NATURAIS PARA A PRESERVAÇÃO DE ALIMENTOS

1 . INTRODUÇÃO

Na indústria de alimentos, já existem muitas medidas visando prevenir ou mi-nimizar a contaminação bacteriana que possa resultar na deterioração dos ali-mentos ou em doenças veiculadas por esses alimentos. Entretanto, apesar de todas as precauções, os surtos relacio-nados a essas infecções ainda ocorrem em frequências alarmantes (Deegan et al., 2006). Listeria monocytogenes, o agente da listeriose, é de particular in-teresse na indústria alimentícia, uma vez que este patógeno é de difícil controle por causa da sua distribuição ubíqua, da sua tolerância a altos níveis de sais e da sua habilidade de crescer em pH ácido e sob temperaturas de refrigera-ção. Além da L. monocytogenes, outros patógenos podem causar doenças asso-ciadas a alimentos, incluindo Staphylo-coccus aureus e várias bactérias Gram--negativas, tais como Escherichia coli O157:H7, Campylobacter spp., Vibrio spp., Aeromonas spp., Salmonella spp., entre outras (Deegan et al., 2006). Por

Hilana Ceotto Depto de Microbiologia Geral, IMPPG, UFRJ, Av. Carlos Chagas Filho, 373,

Rio de Janeiro, RJ, 21941-902, hceotto@micro.ufrj.br

Maria do Carmo de Freire BastosDepto de Microbiologia Geral, IMPPG, UFRJ, Av. Carlos Chagas Filho, 373,

Rio de Janeiro, RJ, 21941-902, mcbastos@micro.ufrj.br

isso, a qualidade e a segurança alimen-tares tornaram-se objetivos de interes-se internacional. A redução das perdas econômicas devido à deterioração dos alimentos e dos custos de produção, o impedimento da transmissão de micror-ganismos patogênicos durante a cadeia alimentar e a atenção às demandas dos consumidores por alimentos pron-tos para o consumo, frescos, ricos em nutrientes e vitaminas e minimamente processados e preservados tornaram--se os maiores desafios para a indústria alimentícia. Como resultado, tem havi-do um crescente interesse por agentes antimicrobianos naturais, sem efeitos tóxicos e que possam ser usados como biopreservativos que tenham como alvo microrganismos patogênicos ou deterio-rantes de alimentos.

O termo biopreservação se refere ao aumento da vida de prateleira e da segurança dos alimentos empregando--se microrganismos e/ou seus produtos metabólicos (Ross et al., 2002). As bac-teriocinas (Bac) são peptídeos bacteria-nos produzidos ao nível dos ribossomos

e com atividade inibitória contra outras bactérias (Cotter et al., 2005). As bac-térias Gram-positivas são a maior fonte de Bac investigadas quanto à aplicação visando-se a qualidade e a segurança alimentares. Por isto, esta revisão irá abordar diferentes aspectos relaciona-dos à preservação dos alimentos pelas Bac.

2 . A BIOLOGIA DAS BACTERIOCINAS

A produção das Bac pode ser consi-derada vantajosa para as bactérias pro-dutoras, uma vez que essas substâncias podem matar ou inibir outras bactérias que competem pelo mesmo nicho eco-lógico ou por nutrientes. As bactérias produtoras de Bac desenvolveram um sistema de proteção contra a Bac produ-zida, denominado imunidade. Cada Bac tem, geralmente, o seu sistema de imu-nidade, que é expresso junto com o gene estrutural da Bac (Cotter et al., 2005).

As Bac produzidas pelas bactérias Gram-positivas são as mais estudadas.

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Elas formam um grupo heterogêneo de peptídeos e de proteínas. Elas podem ser ativas contra outras bactérias perten-centes apenas a espécies relacionadas à espécie da bactéria produtora (espec-tro de ação estreito) ou pertencentes a diferentes espécies e gêneros bacteria-nos (espectro de ação amplo). As Bac produzidas por bactérias Gram-positivas geralmente são inativas contra as bacté-rias Gram-negativas por causa da resis-tência conferida pela membrana externa. Por isso, a atividade dessas Bac contra as bactérias Gram-negativas tem sido descrita apenas em situações em que a integridade na membrana externa foi comprometida. Entretanto, existem ca-sos raros de Bac naturais, como algu-mas enterocinas, que possuem atividade contra microrganismos Gram-negativos (Maqueda et al., 2004).

Os seus determinantes genéticos estão arranjados na forma de operons, que podem estar localizados no cromos-somo bacteriano, embora eles sejam mais frequentemente encontrados em plasmídeos.

Em 2009, Bierbaum & Sahl e Nissen-Meyer et al. propuseram modi-ficações na classificação das Bac pro-duzidas por bactérias Gram-positivas para acomodar os dados relacionados à descrição anual de várias Bac, al-

gumas com características novas. De acordo com esta classificação, essas Bac podem ser agrupadas em três clas-ses, todas com subdivisões. As Bac das classes I e II são as mais amplamen-te investigadas, uma vez que ocorrem mais frequentemente e possuem apli-cação potencial na indústria alimentícia (Gálvez et al., 2007; Settanni & Cor-setti, 2008). Os membros de ambas as classes são distintos em termos de es-trutura das Bac e da maquinaria envol-vida na produção e no processamento das mesmas. O conhecimento acerca de todos os aspectos da biologia das Bac, incluindo-se: a elucidação do re-lacionamento entre estrutura e função, a produção, a imunidade, a regulação e o modo de ação, é fundamental quando se considera as aplicações industriais dessas substâncias. Entretanto, para uma revisão mais detalhada desses as-pectos, sugerimos aos interessados a leitura de recentes publicações sobre o tema (Bierbaum & Sahl, 2009; Nissen--Meyer et al., 2009). Exemplos de Bac de ambas as classes e com potencial aplicação na preservação de alimentos estão descritos na Tabela 1.

As Bac de classe I ou lantibióticos são geralmente pequenos peptídeos (<5 kDa) que possuem ácidos aminados in-comuns, tais como a lantionina (Lan) e a

b-metil-lantionina (MeLan), entre outros, que são formados por modificações do peptídeo, ocorridas após a tradução. As modificações pós-tradução geralmente envolvem três ácidos aminados: serina (Ser), treonina (Thr) e cisteína (Cys). A desidratação da Ser e da Thr leva à formação da dideidroalanina (Dha) e da dideidrobutirina (Dhb), respectivamente. Lan e MeLan são formadas pela adição do grupo tiol de uma Cys a uma Dha ou Dhb, respectivamente, o que gera a formação de pontes-tioéter entre elas. Como resultado da presença dessas pontes intramoleculares, os lantibióticos são estruturas policíclicas, contendo anéis Lan e MeLan, o que lhes confere rigidez e termorresistência, além de con-tribuir para a sua atividade antimicrobia-na (Bierbaum & Sahl, 2009).

Já, as Bac de classe II são peptíde-os menores do que 10 kDa, geralmente termorresistentes e que não apresentam ácidos aminados modificados após a tradução.

Recentemente, foi proposta a criação de uma quarta classe de Bac para en-globar as Bac cíclicas, cujos extremos amino e carboxi do peptídeo maduro são ligados covalentemente (van Belkum et al., 2011). Essas Bac cíclicas foram enquadradas por Nissen-Meyer et al. (2009) na subclasse IIc.

TABELA 1 . EXEMPLOS DE BAC COM POTENCIAL DE APLICAÇÃO COMO BIOPRESERVATIVOS .

Bacteriocina Classe/Subclasse

Bactéria produtora Microrganismos inibidos Potencial aplicação na preservação de alimentos (referência)

Nisina I/AI Lactococcus lactis subsp. lactis L. monocytogenes S. aureus

Produtos lácteos(de Arauz et al., 2009)

Variacina I/AI Kocuria varians Bacillus cereus Sobremesas à base de leite (O’Mahony et al., 2001)

Warnericina RB4 I/AII Staphylococcus warneri RB4 Alyciclobacillus acidoterrestris Sucos cítricos(Minamikawa et al., 2005)

Lacticina 3147 I/B L. lactis DPC3147 BALNI L. monocytogenes

Produtos lácteos (Ryan et al., 1996; McAuliffe et al., 1999)

Pediocina PA1/AcH II/a Pediococcus acidilactici L. monocytogenes Clostridium spp.

Produtos lácteos (Rodriguez et al., 2002)

Lactocina AL705 IIa Lactobacillus curvatus Listeria spp.Brochothrix thermosphacta

Carnes empacotadas a vácuo(Castellano et al., 2008)

Lactocina 705 IIb L. curvatus Listeria spp.B. thermosphacta

Carnes empacotadas a vácuo(Castellano et al., 2008)

Enterocina AS-48 II/c (IV) Enterococcus faecalis S-48

Geobacillus stearothermophilus B. cereus

B. thermosphacta

Sucos de frutas e verduras (Maqueda et al., 2004)

BALNI, bactérias do ácido láctico não-iniciadoras

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A classe III é a menos numerosa, sendo composta por peptídeos maiores do que 10 kDa e geralmente termossen-síveis.

As Bac que têm sido testadas na pre-servação de alimentos pertencem geral-mente às classes I ou II e agem através da permeabilização da membrana das bactérias sensíveis. A maioria delas é produzida por bactérias do ácido lácti-co (BAL). As BAL são bactérias Gram--positivas, não formadoras de esporos, microaerofílicas, que incluem diversos gêneros, tais como: Lactococcus, Lac-tobacillus, Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, e Carnobac-terium, entre outros, que são fermenta-dores estritos, tendo geralmente o ácido láctico como o principal produto da fer-mentação (de Arauz et al., 2009).

3 . BACTERIOCINAS PRODUZIDAS POR BAL

As BAL têm sido usadas em diversos processos fermentativos (de leite, vege-tais, carnes, entre outros) porque elas contribuem de forma significativa para o sabor, a textura e, em muitos casos, para o valor nutritivo dos alimentos. Uma vez que Bac são produzidas por muitas BAL durante o seu crescimento, elas são consideradas ingredientes naturais encontrados em todos os alimentos fer-mentados e produtos lácteos e, desta forma, têm sido consumidas pelos seres humanos há milhares de anos (Randa-zzo et al., 2009).

As Bac produzidas pelas BAL pos-suem propriedades que as tornam apro-priadas para a biopreservação: (i) pos-suem o status GRAS (geralmente reco-nhecidas como seguras); (ii) geralmente, não são ativas e nem tóxicas para as células eucarióticas; (iii) são inativadas por proteases digestivas, tendo pouca influência sobre a microbiota intestinal; (iv) são geralmente tolerantes a varia-ções de pH e de temperatura; (v) pos-suem um amplo espectro de ação contra bactérias deteriorantes de alimentos e patogênicas; (vi) geralmente, exibem um modo de ação bactericida e nenhuma re-sistência cruzada com antibióticos e (vii) os seus determinantes genéticos estão geralmente localizados em plasmídeos, facilitando manipulações genéticas, in-

clusive a sua transferência para outras bactérias de importância na indústria ali-mentícia (Gálvez et al., 2007).

Em geral, os estudos sobre seguran-ça alimentar empregando-se Bac como preservativos seguem as seguintes eta-pas: (i) isolamento das bactérias; (ii) testes de produção de Bac; (iii) caracteri-zação das Bac; (iv) produção de Bac em sistemas tendo alimentos como modelos e (v) aplicação in situ. Atualmente, as únicas Bac empregadas comercialmente são a nisina e a pediocina PA-1.

3 .1 . NisinaA nisina é, sem dúvida, a Bac me-

lhor estudada. Ela tem sido utilizada em aproximadamente 50 países para esten-der a vida de prateleira de uma ampla gama de produtos lácteos e não-lácteos. A nisina é um lantibiótico produzido por estirpes de L. lactis subsp. lactis, e foi a primeira Bac produzida por BAL descrita (Rogers & Whittier, 1928). Este lantibió-tico é fabricado através da fermentação do leite ou do soro do leite e o produto final é comercialmente disponível como NisaplinTM (Danisco, Copenhagen, Dina-marca) e pode ser adquirido de diferen-tes fornecedores (Deegan et al., 2006).

As variantes A e Z da nisina diferem apenas pela substituição de um único ácido aminado: a histidina na posição 27 na nisina A é substituída por uma aspa-ragina na nisina Z. Embora esta modifi-cação estrutural não tenha efeito sobre a atividade antimicrobiana, ela confere à nisina Z maior solubilidade e difusão, quando comparada à nisina A, que são características importantes para a sua aplicação em alimentos (de Vos et al., 1993).

A nisina é um agente bactericida eficaz contra bactérias Gram-positivas, incluindo estirpes de Streptococcus spp., Staphylococcus spp. e Listeria spp. Embora os alimentos fermentados sejam geralmente considerados relativamente livres de patógenos, Listeria spp. é um microrganismo apto a sobreviver e cres-cer em alimentos fermentados, produzi-dos a partir de matérias-primas contendo o organismo (Guinane et al., 2005).

Os esporos produzidos por Bacillus spp. e Clostridium spp., importantes bactérias envolvidas na deterioração de alimentos e/ou em casos de infecções,

são particularmente susceptíveis à ação da nisina. Nestes casos, os esporos parecem ser mais sensíveis do que as células vegetativas, especialmente após tratamentos térmicos (Delves-Broughton et al., 1996). Provavelmente, a capaci-dade da nisina de inibir a germinação de esporos está relacionada à formação de poros na membrana das células, nos es-tágios iniciais da germinação (Bierbaum & Sahl, 2009).

3 .2 Pediocina PA-1/AcHA pediocina PA-1 é uma Bac de clas-

se II com forte atividade antilistéria, pro-duzida por algumas estirpes de pedio-cocos, geralmente isoladas de carnes. A pediocina AcH, produzida por P. acidi-lactici H, é idêntica à pediocina PA-1. A pediocina PA-1/AcH também está apro-vada para uso em alimentos. Esta Bac tem sido explorada comercialmente na forma de ALTATM 2431 (Kerry Bioscience, Carrigaline, Co. Cork, Irlanda).

3 .3 Bacteriocinas produzidas por outras bactérias

Desde a descoberta da nisina e da sua aplicação na indústria de alimentos, o estudo das Bac tem atraído o interes-se de vários pesquisadores. Nas últimas três décadas, a crescente pesquisa acerca das Bac resultou na descoberta e na caracterização de um arsenal de no-vos peptídeos antimicrobianos produzi-dos não somente por BAL, mas também por outras bactérias.

Para que a aplicação em alimentos seja viável, qualquer estirpe produtora de Bac deve atender a importantes cri-térios: (i) a bactéria deve, preferencial-mente, possuir o status GRAS; (ii) a Bac deve apresentar um amplo espectro de atividade, que inclua patógenos e/ou microrganismos deteriorantes de ali-mentos, ou atividade específica contra um determinado patógeno; (iii) a Bac deve ser termoestável para suportar o processamento térmico; (iv) a Bac não deve apresentar riscos à saúde; (v) a in-clusão da Bac nos produtos alimentares deve levar a efeitos benéficos, como a melhoria da segurança e da qualidade e (vi) ela deve ter uma alta atividade espe-cífica (Cotter et al., 2005).

Apesar da nisina e da pediocina PA-1 serem, atualmente, as únicas Bac pro-

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duzidas comercialmente, muitas outras descritas até agora possuem potencial aplicação em alimentos (Tabela 1). Um exemplo, é a hyicina 3682 (Figura 1), uma das Bac recentemente identificadas pelo nosso grupo e produzida por Staphylo-coccus hyicus. A hyicina 3682 é capaz de inibir importantes patógenos veiculados por alimentos (Fagundes et al., 2011).

4 . EFICÁCIA DAS BACTERIOCINAS EM SISTEMAS ALIMENTARES

A aplicação de Bac na conservação de alimentos pode oferecer vários be-nefícios: (i) estender a vida de prateleira do alimento; (ii) fornecer proteção extra durante as condições de abuso de tempe-ratura; (iii) diminuir o risco de transmissão de patógenos através da cadeia alimen-tar; (iv) melhorar as perdas econômicas devido à deterioração de alimentos; (v) reduzir a aplicação de conservantes quí-micos; (vi) permitir a aplicação de trata-mentos térmicos menos severos, sem comprometer a segurança alimentar, melhor preservando os nutrientes e as vitaminas, assim como as propriedades organolépticas dos alimentos e (vii) satis-fazer as demandas industriais e dos con-sumidores (Gálvez et al., 2007).

Embora muitas Bac tenham sido iso-ladas de BAL associadas a alimentos, elas não são necessariamente eficazes em todos os sistemas envolvendo ali-mentos. Portanto, os resultados da ini-bição dos microrganismos-alvo obtidos a partir de sistemas in vitro devem ser confirmados por estudos realizados em sistemas in vivo.

As Bac podem ser introduzidas nos alimentos através de pelo menos três estratégias diferentes: (i) adicionando--se o peptídeo purificado ou semipu-rificado diretamente ao alimento; (ii) mediante a incorporação de um ingre-diente baseado em um produto fermen-tado pela estirpe produtora de Bac ou (iii) através da produção da Bac in situ, utilizando-se as estirpes Bac+ como culturas iniciadoras dos processos fer-mentativos, coculturas ou culturas pro-tetoras (Deegan et al., 2006).

O uso de Bac purificadas/semipuri-ficadas nem sempre é atraente para a indústria alimentícia, uma vez que as Bac devem ser rotuladas como aditivos. Neste caso, o seu uso requer aprovação. As duas outras alternativas (ingrediente fermentado/produção in situ) não neces-sitam de aprovação ou de declarações no rótulo como conservantes. Estas op-ções são frequentemente consideradas mais viáveis para a incorporação de Bac a um alimento (Deegan et al., 2006).

A eficácia das Bac em alimentos de-pende de diversos fatores relacionados aos alimentos e que, na maioria dos casos, envolvem: (i) interações da Bac com componentes dos alimentos (gor-dura ou proteínas); (ii) precipitação; (iii) inativação por condições que afetam a atividade biológica, como a degradação proteolítica ou a oxidação e (iv) distribui-ção desigual das moléculas de Bac na matriz alimentar (Coma, 2008). A compo-sição química e as condições físicas dos alimentos, tais como pH, osmolaridade e teor de gordura também podem ter uma influência significativa sobre a atividade das Bac. Por exemplo, a solubilidade, a

estabilidade e a atividade biológica da nisina são dependentes do pH do meio. Sob condições neutras e alcalinas, a ni-sina é quase insolúvel, mas tanto a sua solubilidade quanto a sua estabilidade aumentam significativamente com a re-dução do pH. A nisina é 228 vezes mais solúvel em pH 2,0 do que em pH 8,0 (Liu & Hansen, 1990). Adicionalmente, em pH 2,0, a nisina pode ser autoclavada a 121oC por 15 min, sem inativação. Em processos fermentativos, em pH <6,0, mais de 80% da nisina produzida são li-berados no meio. Por outro lado, em pH> 6,0, a maioria das moléculas da nisina está associada com a membrana celular (Penna et al., 2005). A lacticina 3147 (ou-tro lantibiótico produzido por lactococos) mantém a sua atividade em pH neutro e é particularmente estável sob a ação do calor em pH ácido (Penna et al., 2005).

Os alimentos são ecossistemas complexos, com diferentes composi-ções microbianas. Nas matrizes ali-mentares, os microrganismos raramen-te encontram-se distribuídos de forma homogênea, com tendência para formar microcolônias em um alimento sólido, ou para crescer na forma de biofilme na superfície dos alimentos. A micro-biota dos alimentos pode interferir na atividade da Bac dependendo da carga microbiana, da sua diversidade, da sua sensibilidade às Bac e das interações microbianas com o sistema alimentar (Gálvez et al., 2007).

4 .1 Uso de estirpes produtoras de bacteriocinas in situ

O uso de culturas Bac+ na indústria de alimentos exige uma cuidadosa sele-ção de estirpes que devem ser: (i) bem adaptadas ao ambiente do alimento no qual será utilizada; (ii) capazes de cres-cer sob as condições de processamento e/ou de armazenamento dos alimentos e (iii) capazes de produzir quantidades suficientes de Bac para inibir o patóge-no-alvo ou bactérias responsáveis pela deterioração. Portanto, é necessário se implementar abordagens experimentais apropriadas a fim de se selecionar estir-pes produtoras de Bac adequadas para o uso na produção de alimentos (Gálvez et al., 2007).

As estirpes Bac+ podem ser usadas tanto diretamente, como culturas inicia-

Figura Figura 1. Inibição de L. monocytogenes pela hyicina 3682, um lantibiótico produzido por S. hyicus 3682.

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doras, como coculturas em combinação com uma cultura iniciadora, ou como culturas protetoras, especialmente, no caso de alimentos não-fermentados (Gálvez et al., 2007). A atividade antimi-crobiana pode constituir uma caracterís-tica secundária das culturas iniciadoras, enquanto representa a característica única necessária às culturas protetoras ou coculturas.

Quando usada como cultura inicia-dora, a estirpe Bac+ deve ser capaz de realizar de forma eficaz o processo de fermentação desejado, além de produ-zir quantidade de Bac suficiente para proteger o alimento. As coculturas não precisam contribuir para a fermentação, entretanto, também não devem interferir na função principal da cultura iniciadora. Por esta razão, a resistência da cultura iniciadora à Bac é desejável. Diferenças na densidade de inóculo, o tempo de geração menor da cultura iniciadora ou um atraso na produção da Bac poderão também permitir o crescimento da estir-pe iniciadora, sem a interferência da Bac produzida pela cocultura Bac+.

Culturas protetoras Bac+ podem ain-da ser usadas para inibir tanto bactérias deteriorantes de alimentos quanto mi-crorganismos patogênicos, durante o pe-ríodo de vida de prateleira dos alimentos não-fermentados. Uma cultura protetora pode crescer e produzir Bac durante o armazenamento dos alimentos sob refri-geração e/ou em condições de abuso de temperatura. No primeiro caso, o cresci-mento das culturas protetoras deve inibir o crescimento de bactérias patogênicas/deteriorantes e ter um impacto neutro sobre as propriedades físico-químicas e organolépticas dos alimentos. Entretan-to, sob abuso de temperatura, a cultura protetora pode até mesmo agir como um microrganismo deteriorante, assinalan-do que a alimento está impróprio para o consumo (Gálvez et al., 2007).

A produção de Bac in situ oferece diversas vantagens quando comparada com a produção ex situ (a ser descrita a seguir) sobre os aspectos legal e de cus-tos. A redução dos custos dos processos de biopreservação pode ser atraente, especialmente, para os países em desen-volvimento, onde a segurança alimentar pode representar um sério problema de saúde pública (Gálvez et al., 2007).

4 .2 Bacteriocinas como aditi-vos de alimentos (produção de bacteriocina ex situ)

As preparações de Bac parcialmente purificadas ou purificadas, produzidas ex situ, são obtidas a partir do cultivo da es-tirpe produtora em um substrato alimen-tar, tal como leite ou soro de leite. Os produtos resultantes podem ser conside-rados, sob o ponto de vista legal, como aditivos alimentares ou ingredientes, uma vez que alguns de seus componen-tes podem desempenhar uma função re-conhecida no alimento, como o aumento do teor de proteínas ou espessamento. Esses produtos também podem conter outros metabólitos celulares, tal como o ácido láctico, proporcionando uma fun-ção adicional de bioproteção (Gálvez et al., 2007).

A carne é um excelente substrato para o crescimento bacteriano. Portan-to, se métodos adequados de restrição do seu crescimento não forem usados , ela facilmente se deteriora. Clostridium perfringens é a principal causa de doen-ças de origem alimentar bacteriana em países onde o consumo de carnes e de aves é elevado (Castellano et al., 2008). Embora os nitratos sejam comumente utilizados para impedir o crescimento de clostrídios em carnes, a preocupação com a presença de nitritos potencial-mente tóxicos tem levado a indústria alimentícia a procurar métodos alterna-tivos de preservação. A natureza anfi-pática da nisina limita a sua aplicação em vários produtos, incluindo carnes, devido a sua interação com a gordura e com outros componentes dos alimentos, o que reduz a sua atividade antimicro-biana em matrizes alimentares (Taylor et al., 2007). Nestes casos, o potencial de emprego de outras Bac tem sido in-vestigado. A leucocina A, as enterocinas, as sakacinas e as carnobacteriocinas podem prolongar a vida de prateleira da carne fresca. No entanto, os resultados mais promissores foram obtidos em car-nes utilizando-se a pediocina PA-1.

Bac, como as plantaricinas e a en-terocina AS-48, também podem ser empregadas para a conservação dos alimentos de origem vegetal (Settanni & Corsetti, 2008). As plantaricinas S e T apresentaram atividade antimicrobiana contra BAL em azeitonas verdes (Leal-

-Sánchez et al., 2003). Já a enterocina AS-48 poderia ser empregada na con-servação de sucos de maçã e de vege-tais enlatados, inibindo o crescimento de Bacillus licheniformis e de Bacillus coa-gulans, respectivamente (Grande et al., 2006; Lucas et al., 2006).

4 .3 . Uso de bacteriocinas para promover a qualidade dos ali-mentos

As Bac também podem ser usadas para promover a qualidade dos alimen-tos, ao invés de simplesmente serem empregadas para se evitar problemas de deterioração ou de segurança. Por exemplo, as Bac podem ser usadas para controlar o crescimento de BAL não-iniciadoras (BALNI) em queijos e vinhos. O crescimento descontrolado de BALNI, principalmente lactobacilos, pode causar grandes perdas econômi-cas, uma vez que esses microrganismos frequentemente afetam a qualidade do queijo, além de provocarem a produção de compostos indesejáveis em vinhos. O emprego de culturas iniciadoras produ-toras de Bac pode reduzir significativa-mente esses problemas.

Como algumas BALNI podem me-lhorar o sabor de alguns alimentos, a sua completa eliminação nem sempre é desejável. Este problema foi contorna-do através da utilização de um sistema no qual uma estirpe de Lactobacillus paracasei, com reduzida sensibilidade à lacticina 3147 (obtida pela exposição repetida a concentrações crescentes desta Bac), foi usada junto com a cultura iniciadora, produtora da lacticina 3147, na produção de queijo cheddar. Enquan-to outras BALNI foram inibidas durante o período de amadurecimento, o mutante resistente pôde tolerar a presença da lacticina 3147 e se tornou a microbiota dominante no queijo (Ryan et al., 2001).

As Bac também podem ser aplica-das visando-se melhorar os processos fermentativos. O queijo geralmente tem um tempo de maturação de pelo menos alguns meses, durante o qual ocorre a autólise gradual das culturas iniciadoras. Esta lise resulta na liberação de enzimas intracelulares que hidrolisam a caseína do queijo a pequenos peptídeos e áci-dos aminados. Esses ácidos aminados liberados são os compostos precursores

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responsáveis pelo desenvolvimento do sabor do queijo. Como a lise celular é um processo lento e muitas vezes um passo limitante na maturação do queijo, a lise precoce controlada pode ser van-tajosa para o desenvolvimento do sabor (Guinane et al., 2005).

4 .4 Uso de bacteriocinas em embalagens bioativas

Além das três abordagens descritas acima, comumente utilizadas na aplica-ção de Bac para a preservação de ali-mentos, o uso de Bac em embalagens bioativas representa uma quarta estraté-gia de aplicação dessas susbtâncias, na qual as Bac podem ser incorporadas em embalagens destinadas a permanecerem em contato com os alimentos. Este sis-tema combina a função de preservação das Bac com materiais de embalagem convencional, que protegem os alimentos de possíveis contaminantes externos. A deterioração de alimentos refrigerados geralmente começa com o crescimento microbiano sobre a superfície, o que re-força a vantagem do uso de Bac em con-junto com a embalagem, promovendo um aumento, tanto da segurança alimentar como da vida de prateleira de produtos alimentícios (Coma, 2008).

Tais embalagens bioativas podem ser preparadas através da imobilização direta da Bac na embalagem do alimen-to, ou pela adição de um sachê contendo a Bac dentro da embalagem. O carrea-dor em que se encontra a Bac atua como um reservatório e um difusor das molé-culas de Bac para o alimento durante o armazenamento do produto, garantindo

uma fonte contínua de Bac, dependente de gradiente. Esse carreador também pode proteger a Bac da inativação cau-sada pela interação com componentes dos alimentos e da inativação enzimá-tica. Além disso, a aplicação localizada de Bac, precisamente na superfície dos alimentos, requer quantidades muito me-nores de Bac, quando comparada à apli-cação em todo o alimento, diminuindo os custos do processo (Gálvez et al., 2007).

Uma variedade de métodos tem sido proposta para a imobilização de Bac, incluindo sílica, amido de milho, encap-sulamento em lipossomas e incorpora-ção em revestimentos de gel e filmes de diferentes materiais, tais como: alginato de cálcio, gelatina, celulose, proteína de soja, silicone, polietileno, náilon, ou ou-tros filmes plásticos à base de polímeros (Gálvez et al., 2007). Na maioria dos ca-sos, as preparações imobilizadas de Bac são aplicadas na superfície dos alimen-tos processados para se evitar a conta-minação após o processo, bem como a proliferação de bactérias indesejáveis.

Outra possibilidade para as embala-gens bioativas é a incorporação do an-timicrobiano a um revestimento comestí-vel aplicado por imersão ou pulverização sobre o alimento. Entretanto, a seleção dos agentes bioativos incorporados é li-mitada aos compostos comestíveis. Por exemplo, filmes de quitosana ou de ce-lulose associados à Bac também podem ser incluídos neste conceito de embala-gem (Coma, 2008).

Alguns exemplos de aplicação, des-critos na literatura, estão apresentados na Tabela 2.

5 . CONCLUSÃO

Dentre as técnicas de conservação disponíveis, a indústria de alimentos tem procurado substituir a metodologia tradi-cional por novas tecnologias de preser-vação de alimentos. Entretanto, apesar dos investimentos em pesquisa, poucas dessas novas tecnologias têm sido im-plementadas pela indústria de alimentos até o presente momento. Os exemplos descritos anteriormente demonstram que o uso de Bac, especialmente aque-las produzidas por bactérias associa-das a alimentos, pode contribuir para a conservação dos alimentos. Tanto a sua adição como a sua produção in situ por bactérias dos alimentos podem desem-penhar um papel benéfico no controle de populações microbianas indesejáveis.

As Bac podem proporcionar uma alter-nativa nova, segura e uma barreira eficaz que, combinada com outros métodos de controle, pode maximizar a proteção con-tra patógenos nos alimentos, inclusive naqueles minimamente processados. A seleção apropriada deste conjunto de barreiras, em relação ao número neces-sário, à dosagem de cada uma e à se-quência de aplicação, para se alcançar um resultado específico, são importantes fatores para a melhoria da conservação de alimentos. Entretanto, o emprego das Bac na indústria alimentícia deve visar apenas o controle de baixos níveis de microrganismos contaminantes, uma vez que o seu uso deve ser considerado uma estratégia adicional às boas práticas de produção, processamento, armazena-mento e distribuição dos alimentos.

TABELA 2 . USO DE BAC EM EMBALAGENS BIOATIVAS

Bacteriocina Método de imobilização Alimento Microrganismo-alvo Referência

Enterocina 416 K1 Filme de polietileno Salsichas Ricota

L. monocytogenes Iseppi et al., 2008

Bacteriocina 324 Filme de polietileno Carne de porcoCarne moída

Salsichas

L. monocytogenes Mauriello et al., 2004; Ercolini et al., 2006

Enterocinas A e B Filme de alginato Presunto cozido fatiado L. monocytogenes Marcos et al., 2007

Nisina Filme de alginato Carne fresca S. aureus Millete et al., 2007

Nisina + EDTA Plástico Carnes E. coli Siragusa et al., 1999

Nisina Embalagem de celulose Queijo cheddar Presunto

S. aureusL. innocua

Scannell et al., 2000

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Ciência in Foco

QUORUM SENSING – APRENDENDO A LINGUAGEM DAS BACTÉRIAS

INTRODUÇÃO

Na década de 1970, acreditava-se que as bactérias viviam uma vida sim-ples, onde a comunicação célula a célu-la era reservada apenas aos organismos mais complexos. Ou seja, elas estavam fadadas a uma vida que se resumia a uma repetição de divisões celulares. Porém, nas últimas três décadas este conceito mudou, já que foi descoberto que as bactérias eram capazes de sentir sinais químicos de outros organismos, e ainda, capazes de formar comunidades onde seus membros podiam interagir e/ou comunicar uns com os outros (1).

As bactérias comunicam-se umas com as outras utilizando uma sinalização química de moléculas. Especificamente, elas liberam, detectam e respondem ao acúmulo destas moléculas, chamadas de auto indutores (AIs, do inglês: auto inducers ). A detecção dos AIs permite com que as bactérias sejam capazes de distinguir entre uma densidade popula-cional bacteriana baixa ou alta, o que faz com que haja um controle da expressão de genes que acompanha e responde, juntamente com o número de células. Este processo, denominado quorum sensing (QS), permite com que uma po-pulação de bactérias controle coordena-damente a expressão de genes de toda

Eliane de Oliveira FerreiraUniversidade Federal do Rio de Janeiro, Pólo Xerém; eliane_ferreirarj@micro.ufrj.br; Centro de Ciências da Saúde,

Av. Carlos Chagas Filho, 373, Ilha do Fundão, Bloco I, 2o andar, Lab. de Biologia de Anaeróbios, CEP.: 21941-001

uma comunidade bacteriana (2). O QS de certa forma confunde a distinção que existe entre células eucarióticas e proca-rióticas, já que permite com as bactérias comportem-se como organismos multi-celulares, o que trás diversos benefícios que seriam inatingíveis para elas indi-vidualmente. Diversos comportamen-tos são regulados pelo QS, incluindo a simbiose (Sinorhizobium meliloti), a produção de antibióticos (Erwinia caro-tovora), a conjugação plasmidial (Agro-bacterium tumefaciens) a virulência e a formação do biofilme em Pseudomonas aeruginosa. Estudos mais recentes (3; 4) mostram que a alta especificidade assim como uma comunicação universal através do QS existe, o que permite com que as bactérias comuniquem-se não apenas entre si (intraespecífico), mas também com outras espécies (interespe-cífico) (5). E ainda entre Reinos, ou seja, com seus hospedeiros.

O QS foi descrito primeiramente na bactéria bioluminescente Vibrio fischeri (6; 7) encontrada em diversos ambien-tes marinhos (Figura 1B). V. fisheri vive em simbiose com diversos animais mari-nhos, como por exemplo, a lula havaia-na - Euprymna scolopes – (Figura 1A). Nesta parceria, o hospedeiro usa a luz produzida pelo V. fischeri para propósi-tos específicos, tais como atrair a presa,

evitar os predadores ou até mesmo para achar um parceiro(a).

Em troca da luz, V. fischeri reside em um ambiente rico em nutrientes (8; 9). Um complexo enzimático denominado luciferase é responsável pela produção da luz em V. fischeri e a bioluminescência só acontece quando esta bactéria atinge altas concentrações. Tal processo é con-trolado pelo QS. Especificamente, a pro-dução, o acúmulo e a resposta são con-trolados pela presença da menor quanti-dade de homoserinas lactonas aciladas (HSL, do inglês: homoserine lactones), autoindutores, que regulam a produção de luz de acordo com a concentração de V. fisheri, permitindo a emissão de luz somente dentro do órgão especializado da lula. A razão pela qual este fenômeno acontece é devido a grande quantidade de nutrientes neste órgão, que permite com que V. fischeri alcance altas densi-dades populacionais e, segundo porque dentro deste órgão os AIs não difundem e alcançam altas concentrações capa-zes de serem detectadas pelo V. fischeri. Este circuito de regulação do QS em V. fisheri foi descoberto na década de 1980 (11; 12). Os autores demonstraram que, com o aumento da densidade bacteriana de V. fischeri, a concentração do AI tam-bém aumentava. Quando esta concen-tração atingia a escala de micromolar, o

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AI interage com uma proteína chamada de LuxR (receptor/regulador), formando o complexo LuxR/AI que se liga ao pro-motor da luciferase ativando a sua trans-crição. Desta forma, este circuito QS permite com que a produção da luz (Bio-luminscência) esteja finamente correla-cionada com a densidade populacional bacteriana (Figura 2C). Por dez anos, o sistema de sinal-resposta de V. fischeri LuxI/LuxR era curioso e o único exemplo de comunicação bacteriana que parecia ter evoluído com o propósito de colo-nização simbiótica de um hospedeiro. Porém, hoje em dia sabe-se que existem mais de 70 sistemas QS do tipo LuxI/R em bactérias Gram negativas (13; 14; 15; 16) (Figura 2A). As bactérias Gram positivas com baixo conteúdo G+C, tam-bém apresentam um sistema de comu-nicação baseado tipicamente em oligo-peptídeos modificados como AIs. Estes sinais são normalmente conhecidos como polipeptídeos autoindutores – AIPs (do inglês: autoinducing polypeptides) (Figura 2B). Os AIPs são produzidos no citoplasma como peptídeos precursores e são subsequentemente clivados, modi-ficados e exportados. Os AIPs interagem especificamente com domínios externos de proteínas sensoras do tipo kinase da membrana citoplasmática. A interação do AI com seu sensor cognato estimula a atividade kinase do sensor da proteí-na kinase, resultando na fosforilação de sua proteína regulatória. A resposta da

proteína do regulador fosforilado liga-se ao DNA e altera a transcrição dos genes alvo. Entre os exemplos de comporta-mentos controlados pelo QS dos AIPs estão a competência genética e espo-rulação de Bacillus subtilis (17), a com-petência para a aquisição de DNA em Streptococcus pneumoniae (18) e fato-res de virulência em Staphylococcus au-reus (19) e Enterococcus faecalis (20). Apesar dos sinais de AIs e do aparato de detecção, serem similares, tanto o QS por LuxIR e AIPs funcionam de maneira em que a resposta é elucidada apenas para o AI da espécie bacteriana que está produzindo. Esta especificidade da sina-lização acontece devido as diferenças sutis em seus AI e receptores.

A diversidade química das moléculas do QS

A maioria dos sinais do QS ocorre por moléculas orgânicas pequenas (<1000 Da) ou peptídeos com 5-20 aminoácidos (Figura 3A) (21). Todos os auto induto-res do tipo AHL compartilham um anel do tipo homoserina lactona e diferem ape-nas nas cadeias laterais de acil (Figura 3B) (22).

As bactérias Gram-negativas, por exemplo, podem utilizar como molécu-las sinais as AHL, 2-alquil-4-quinolonas (AQs), cadeias longas de ácidos graxos e ácidos graxos metil ésteres, assim como o AI-2, um termo coletivo para

um grupo de furanonas derivadas do diidroxipentanediona (DPD), que será explicado posteriormente, utilizando pelas bactérias Gram-negativas e posi-tivas. Existem ainda algumas variações de AIPs produzidas pelos estafilococos. Estreptomices, no entanto, sintetiza um g- butirolactona, como por exemplo o fa-tor A, que é estruturalmente relacionado com as AHLs. As moléculas de QS po-dem ainda ser subdivididas caso intera-jam com receptores da superfície celular (p.ex.: AIPs de estafilococos), ou sejam internalizados (p. ex.: AHLs, AQs, os peptídeos Phr de Bacillus subtilis e os fe-rormônios de conjugação de E. faecalis).

A procura de AHL putativas em bac-térias Gram-negativas aumentou devido ao desenvolvimento de um biosensor AHL baseado em fusões de genes re-porteres como o lux e lacZ (24) ou pela indução da pigmentação (p. ex.: viola-ceína da bactéria Chromobacterium vio-laceum). Estes ensaios revelaram que bactérias que pertencem a diversos ni-chos ecológicos (marinho, água doce ou solo), plantas e animais incluindo vários patógenos, simbiontes, extremófilos, etc, produzem AHLs. Dentre algumas espé-cies estão Acidithiobacillus, Acinetobac-ter, Aeromonas, Brucella, Burkholderia, Enterobacter, Pseudomonas, Ralstonia, Vibrio, Yersinia, etc (21). Em Escherichia coli e Salmonella, por exemplo, não fo-ram encontradas AHLs, mas elas apre-sentam um receptor SdiA da classe da proteína LuxR que respondem a AHLs de outras bactérias (25).

A linguagem universal das bactérias – LuxS

Os sistemas de QS descritos aqui, até agora, baseiam-se no reconheci-mento preciso de um AI por seu receptor cognato. Este sistema de comunicação é requerido para evitar que o sinal das espécies bacterianas seja perturbado por qualquer “ruído”. Além disso, permi-te com que a conversa entre elas seja privada, ou seja, entre membros da sua própria espécie. Porém, uma outra forma de conversação foi descoberta, onde as bactérias teriam uma linguagem univer-sal. Desta forma, muitas bactérias apre-sentam além de um sistema espécie es-pecífico (AI-1- intraespecífica), outro não

Figura 1. A- Lula havaina adulta (Euprymna scolopes), hospedeiro simbionte da bactéria marinha Vibrio fischeri (Fonte: E.G. Ruby, 1996; M.J. McFall-Ngai, 2000). B- Micrografia mostrando o V. fischeri fluorescente (Fonte: Projeto Ge-noma do V. fischeri)

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específico (AI-2 – interespecífica). Isso implicaria em dizer que as bactérias são capazes não somente de “sentir” a con-centração de membros da sua própria espécie, mas também de outras espé-cies da sua vizinhança. Além disso, res-postas distintas permitem com que uma determinada espécie de bactéria module seu comportamento se ela é minoria ou maioria em um consórcio bacteriano.

Os estudos interespecíficos de co-municação começaram a partir de estu-dos com uma bactéria marinha biolumi-nescente chamada Vibrio harveyi (26). Esta bactérias apesar de ser evolutiva-mente relacionada com V. fischeri, não vive em associação simbiótica com ou-tros organismos marinhos. Pelo contrá-rio, ele é encontrado vivendo de maneira livre na água do mar, em sedimentos, na superfície da água ou em intestinos de animais marinhos. De maneira similar ao V. fischeri, V. harveyi também controla a sua bioluminescência utilizando o QS, porém ele não usa o sistema do tipo LuxI/LuxR, como fazem a maioria das bactérias Gram-negativas. V. harveyi de-senvolveu um sistema de comunicação com características típicas de bactérias Gram positivas e negativas. Esta bacté-rias usa um AI acil-HSL similar aos das bactérias Gram-negativas, mas a detec-ção do sinal consiste de um aparato com duas proteínas, similar com das bacté-rias Gram- positivas. V. harveyi produz dois AIs denominados AI-1 e AI-2 (27). AI-1 é uma acil-HSL, mas a sua síntese não é dependente de LuxI como em V. fischeri. Um locus gênico luxLM, que não tem homologia com LuxI, é necessário para que a síntese do AI-1 aconteça. O segundo AI-2 não é uma HSL, e sim uma furanona (28) e a sua síntese é dependente da proteína LuxS. A figura 4 esquematiza a comunicação por QS de V. harveyi. Os sensores cognatos LuxN e LuxPQ reconhecem o AI-2 e AI-2, res-pectivamente. LuxP é uma proteína peri-plasmática solúvel e o receptor primário do AI-2. O complexo LuxP/AI-2 interage com LuxQ e envia uma sinalização via AI-2. Lux N e LuxQ são proteínas regula-doras e sensores kinase que através de uma cascata de fosforilação passam o sinal para uma proteína chamada LuxU (29) que por sua vez sinaliza para LuxO. Esta proteína é um ativador transcricio-

nal dependente do fator sigma (s) que parece estar envolvido na ativação de um repressor (letra x na figura 4) do ope-

ron luciferase (luxCDABE). Um ativador transcricional chamado de LuxR também é necessário para expressão da lucifera-

Figura 2. Três tipos do sistema Quorum sensing. a- Em bactérias Gram negativas, as AHL (triângulos) são

produzidos por proteínas tipo LuxI e detectadas pelas proteínas tipo LuxR. As AHLs difundem-se pela membrana celular e aumentam

a concentração no ambiente externo proporcionalmente ao aumento do número de células. LuxR, quando reconhece ao AI cognato, liga-se a ele-

mentos do DNA e ativa a transcrição dos genes alvo (xyz); b- As bactérias Gram positivas sintetizam oligopeptídeos (linhas onduladas), AIPs, que nor-malmente são modificadas a aminoácidos específicos e secretadas ativamen-te. A detecção destas moléculas ocorre via dois componentes transcricionais de sinal, levando a fosforilação de uma proteína regulatória, que se liga ao promotor do DNA e regula a transcrição dos genes alvo (xyz) (Fonte: Federle e Bassler, 2003); c- QS em Vibrio fischeri. A proteína LuxI sintetiza os AIs (lo-

sangos), 3-0x0-C6-HSL que aumenta sua concentração proporcionalmente ao número de células. Este acúmulo de AIs acontece tanto no meio extra

quanto intracelular. Desta forma, Lux R reconhece o AI o que leva a formação de um complexo. Este complexo liga-se a região lux box

que irá controlar a transcrição dos genes luxR, luxI e luxCDABE, levando a geração de luz.

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se, porém este não apresenta homologia com o LuxR de V. fischeri ou de outras bactérias Gram negativas.

Mas qual seria a vantagem de se ter dois sistemas de comunicação por QS? Talvez, a resposta esteja no fato de que V. fischeri utilize o sistema intraespécie por estar em cultura pura e em um órgão do hospedeiro especializado em produzir luz, enquanto que V. harveyi habita am-bientes que apresentam outras espécies bacterianas. Talvez, esta bactéria utilize os sistema específico do QS, AI-1, para determinar a sua própria densidade po-pulacional, e o não específico, AI-2, para saber a quantidade de células das ou-tras espécies vizinhas. Pensando nisso, já foi demonstrado que V. harveyi possui genes apenas são controlados ou pelo AI-1 ou AI-2 e, estes genes permitem com que esta bactéria regule seu com-portamento de acordo com as espécies bacterianas predominantes que estejam ao seu redor.

A idéia de que existia uma conversa universal acontecendo entre espécies bacterianas foi concretizada com a clo-nagem do gene luxS, ou seja, a proteí-na funcional necessária para a síntese do AI-2 em V. harveyi. Um análise no banco de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI) mos-trou que haviam homólogos do LuxS em diversas espécies bacterianas que já tinham seu genoma sequenciado, mostrando que elas também tinham o gene luxS (Tabela 1).

Tabela 1

Um é pouco, dois é bom, três é só o começo – AI-3 .

Organismos eucariotos utilizam di-versos hormônios para regular diferen-tes aspectos na sua fisiologia e para manter a homeostase. A comunicação que existe em procariotos através dos AIs é similar a realizada pelo hormônios, fazendo com as bacterianas coordenem seu comportamento em uma população.

No trato gastrintestinal (TG), o núme-ro de bactérias comensais é pelo menos uma ordem de grandeza maior do que as células eucarióticas. Durante o processo de evolução, as bactérias foram expos-tas aos hormônios dos hospedeiros e as

Figura 3. Estruturas de diferentes autoindutores. A- Os AIs do tipo acil homo-serina lactona de bactérias Gram-negativas. O anel de acil homoserina lactona é compartilhado em todas as estruturas; B- AIs oligopeptídeos utilizados por bactérias Gram- positivas. (Fonte: Taga e Bassler, 2003)

Figura 4. O sistema híbrido de QS em Vibrio harveyi. O autoindu-tor, AI-1, uma acil-HSL (pentágonos verdes) é sintetizado por LuxLM. Um segundo autoindutor, AI-2, uma furanona (pentágonos vermelhos) é sinteti-zado pela enzima LuxS. Os dois AIs acumulam de acordo com o aumento da densidade bacteriana. O sensor do AI-1 é LuxN e outras duas prteínas, LuxP e LuxQ, funcionam juntas para detectar AI-2. A informação é então passada para LuxU e para LuxO, ambas por uma cascata de fosoforilação. LuxO controla a transcrição da proteína repressora (x) e da proteína ativadora LuxR para que a expressão da dos genes do operon luxCDABE (luciferase) aconteça. (Fonte: Bassler et al., 1993)

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células eucarióticas as suas respectivas comunidades microbianas. Desta forma, não seria nenhuma surpresa se bacté-rias patogênicas interceptassem este sinal para desenvolver doença (31). O conhecimento de que os hormônios ca-tecolaminas (epinefrina e norepinefrina) são capazes de promover o crescimen-to bacteriano não é nenhuma novidade (32). Diversos estudos tem demonstrado que algumas bactérias patogênicas são capazes de reconhecer certas moléculas do hospedeiro para ativar a expressão de fatores de virulência.

O sistema de QS pelos hormônios epinefrina e a norepinefrina/AI-3 foi des-coberto por Sperandio e cols. Em 2003 durante um estudo de regulação da ex-pressão de genes de virulência em Es-cherichia coli enterohemorrágica (EHEC). O estudo desta comunicação celular detectou um novo AI, chamado de AI-3. Porém, foi demonstrado que a síntese do AI-3 não era dependente do gene luxS. Os autores observaram que EHEC era capaz de perceber a presença do AI-3 produzido pelas bactérias da microbiota normal do hospedeiro e ativar e expressar genes de virulência, codificado pela ilha de patogenicidade LEE (do inglês: locus

enterocyte effacement). LEE codifica o sistema de secreção tipo III (TTSS), que funciona como uma seringa, injetando proteína efetoras no citoplasma da célu-la eucarótica. A expressão dos genes do locus LEE levam a formação das lesões do tipo attaching e effacing (A/E). Estas lesões são caracterizadas pela destrui-ção das microvilosidades e o rearranjo dos filamentos de actina do citoesqueleto da célula eucariótica, o que faz com que ocorra a formação dos pedestais.

EHEC é capaz de interceptar os hor-mônios liberados no TG do hospedeiro e ativar a expressão de genes que são utilizados na colonização da mucosa do TG humano. Desta forma, quando EHEC alcança o TG humano, ela é capaz de perceber a presença da epinefrina e no-repinefrina e ativar a transcrição dos ge-nes da ilha da patogenicidade LEE e da regulação do flagelo. Estes hormônios substituem a presença do AI-3 para ati-var os genes de virulência. Pela primeira vez, ficou estabelecido de que uma co-municação entre as células procarióticas e eucarióticas estava acontecendo (34).

Outros resultados demonstraram que a “conversa” pelas moléculas AI-3/epi-nefrina/norepinefrina é mediada por um

sensor de histidina quinase, QseC. Este sensor detecta a presença não somente do AI-3, como também dos hormônios. A estrutura química do AI-3 ainda não é conhecida, mas sabe-se que é um com-posto aromático e que este se liga no mesmo receptor para epinefrina e nore-pinefrina na bactéria. Existem evidência que mostram que QseBC constitui um sistema de 2 componentes. Na presença do AI-3/epinefrina/norepinefrina no TG, o QseC é ativado e se auotofosforila; logo em seguida QseC traduz o sinal do seu cognato que responde ao sinal, o QseB, que ativa a transcrição de um regulador principal do flaglo, o fhlDC. Além disso, o reconhecimento do AI-3 e dos hormônios colinérgicos por QseC podem ser espe-cificamente bloqueados pela ativação de seu antagonista, fentolamina, mostrando que QseC é um receptor adrenérgico.

Este sistema AI-3/epinefrina/norepine-frina não é exclusivo de EHEC. Análises in silico já mostraram a presença de análogos do QseC em outras bactérias tais como: Salmonella sp., Shigella flexineri, Franci-sella tularensis, Haemophilus influenzae e outros. Estudos in vivo já mostraram evi-dências de que o QseC é importante para a virulência de S. Typhimurium.

TABELA 1- BACTÉRIAS QUE APRESENTAM O GENE luxS

Actinobacillus pleuropneumoniae Helicobacter hepaticus Salmonella typhi

Bacillus anthracis Helicobacter pylori Salmonella typhimurium

Bacillus cereus Klebsiella pneumoniae Shigella typhimurium

Bacillus halodurans Lactobacillus gasseri Shigella flexneri

Bacillus subtilis Lactobacillus plantarum Sinorhizobium meliloti

Bifidobacterium longum Lactococcus lactis Staphylococcus aureus

Borrelia burgdoferi Leuconostoc mesenteroides Staphylococcus epidermidis

Campylobacter jejuni Leuconostoc oenos Streptococcus agalactiae

Clostridium acetobolyticum Listeria innocua Streptococcus gordonii

Clostridium difficile Listeria monocytogenes Streptococcus mutans

Clostridium perfringens Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae

Deinococcus radiodurans Oceanobacillus iheyensis Streptococcus pyogenes

Enterococcus faecalis Oenococcus oeni Vibrio anguillarum

Enterococcus faecium Pasteurella multocida Vibrio cholerae

Escherichia coli Porphyromonas gingivalis Vibrio harveyi

Haemophilus ducreyi Proteus mirabilis Vibrio parahemolyticus

Haemophilus influenzae Salmonella enterica Vibrio vulnificus

Haemophilus somnus Salmonella paratyphi Yersinia pestis

BLAST do algorismo disponível no NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) utilizado para identificar os homólogos do gene luxS em V. harveyi em espécies bacterianas cujos genomas já estão sequenciados. A produção de AI-2 já foi observado em outras espécies que não constam na tabela acima, mas que os genomas ainda não estão sequenciados, indicando que elas também apresentam o gene luxS (Fonte: Federle e Bassler, 2003).

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Quorum sensing na virulência bacteriana .

Uma das premissas da microbiologia é que as bactérias são capazes de per-ceber as alterações ambientes e altera-rem seu comportamento na tentativa de sobreviver. Quando o ambiente em que a bactéria está é alterado, a resposta bacteriana é normalmente a de alterar a expressão de certos genes o que resulta em uma chance maior de sobrevivência. As bactérias patogênicas não são dife-rentes. O que é considerado patogênia talvez possa ser facilmente observado como uma simples adaptação do com-portamento bacteriano na tentativa de sobreviver. É fato, que muitas destas alterações, convertam-se na expressão de diversos fatores de virulência que na maioria das vezes agridem o hospedei-ro, o que resulta em quadros infecciosos.

Durante a infecção bacteriana, inú-meros determinantes de virulência, como proteínas efetoras, toxinas, biofilme, etc, são produzidos na tentativa de burlar o sistema imunológico do hospedeiro, e é claro levar a sobrevivência bacteriana. As alterações ambientais, que levam a expressão de fatores de virulência, po-dem ser diversas, como: pH, osmolari-dade, temperatura, potencial redox e até mesmo algumas moléculas do hospedei-ro. Além disso, as bactérias podem ainda perceber moléculas de outras bactérias, pelo QS, e saber o que está acontecen-do em uma comunidade bacteriana. As bactérias não utilizam apenas os siste-mas de comunicação para alterarem seu comportamento e expressarem genes específicos.

Pseudomonas aeruginosa e Serratia marcescens, ambos, patógenos oportu-nistas, usam o sistema QS para controlar a expressão de diversos fatores de viru-lência, dentre eles estão a produção de biofilme, que normalmente são produzidos em implantes médicos, como catéteres, o que leva a uma persistência da infecção. Além disso, devido a natureza do biofilme, os antibióticos não tem o efeito esperado. P. aeruginosa apresenta um sistema QS similar ao LuxI/LuxR, chamado de LasI/LasR que controla não somente a produ-ção do biofilme, mas de enzimas extrace-lulares, além da transcrição de um segun-do sistema QS, Rh1I/Rh1R (3).

O patógeno intracelular Brucella melitensis usa as AHL para regular ma-cromoléculas durante a patogênese: um flagelo polar e o sistema de secreção tipo IV (35). B. melitensis utiliza um sis-tema diferente do LuxI/LuxR, já que seu regulador, VjbR, ativa genes associados com a biossíntese do flagelo e do tipo de secreção IV, na ausência da AHL es-pecífica para esta espécie. Na presença da AHL, VjbR está inativo e os genes são expressos em baixas quantidades. Ou seja, uma alta concentração bacte-riana resulta em uma baixa expressão dos fatores de virulência. Este tipo de comportamento é diferente ao que já foi mencionado até agora, e funciona de maneira antagônica ao que já foi visto. Talvez, este tipo de comportamento es-teja vinculado ao tipo de vida desta bac-térias, que apresentam um ciclo de vida intracelular no hospedeiro.

Outra bactéria que também utiliza este tipo de estratégia é o Vibrio chole-rae. Para que uma infecção aconteça é preciso, antes de mais nada, o contato do microrganismo com seu hospedeiro; e ainda, que haja um inóculo adequado. Para V. cholera a primeira premissa é ver-dadeira, mas a segunda sempre deixou os microbiologistas intrigados. Esta bac-téria Gram-negativa é uma habitante do ambiente marinho, e é conhecido por ser o agente causador da cólera humana. V. cholerae apresenta um sistema QS bas-tante similar ao de V. harveyi. A produção de um AI-1, chamado nesta bactéria de CAI-1 (do inglês: cholerae auto inducer-1) é sintetizado por uma enzima, a CqsA (do inglês: cholerae quorum sensing autoin-ducer). O CAI-1 é sentido pela proteína sensora CqsS. O outro sistema regula-do pelo AI-2 (LuxP/LuxS) é exatamente igual ao de V. harveyi. Os dois sistemas em conjunto levam a ativação do LuxU e LuxO que irão, por conseguinte, ativar os genes de virulência. Ao adquirirmos esta bactéria, o que ocorre pela ingestão de água ou alimentos contaminados, esta apresenta uma baixa concentração bac-teriana, e é neste momento que a pouca quantidade do CAI-1 e AI-2 fazem com esta bactéria ative genes responsáveis pela expressão de uma adesina para a aderência as células do epitélio intestinal, o TCP (do inlgês: toxin coregulated pilus) e da enterotoxina colérica (CT). (31)

Neste momento, o hospedeiro come-ça a desenvolver a diarréia aquosa (qua-dro agudo da doença) pela presença da toxina. Com o decorrer da infecção, tanto a densidade bacteriana quanto a de CAI-1 e AI-2 aumentam fazendo com que este patógeno reprima a expressão de TCP e CT e comece a expressar uma protease, que é responsável pela libera-ção desta bactéria do epitélio intestinal e liberação do V. cholerae nas fezes aquo-sas, que pode agora infectar outros hos-pedeiros. Este sistema, é fantástico já que permite com que a bactéria entre em contato com o hospedeiro, aumente em número e saia, ou seja, caso o hospedei-ro resista ao quadro diarréico da doença, ele naturalmente é curado e a bactérias retornam ao ambiente. Vale lembrar que a maioria das bactérias causam infec-ções persistentes e não agudas.

Em Escherichia coli e Samonella Typhimurium não tem o homólogo ao LuxI e não produzem AI-1, mas elas co-dificam um homólogo ao LuxR, chamado SdiA que ao ser super expresso mostrou um feedback negativo na expressão de genes envolvidos no efeito attachement/ effacing (A/E) em E. coli enterohemorrá-gica (EHEC) e uma regualção positiva de genes localizados no plasmídeo de virulência, incluindo rck, em S. Typhi-murium. O verdadeiro papel de SdiA ainda não foi totalmente desvendado, mas tanto EHEC quanto S. Typhimurium respondem ao AI-1 produzido por outras bactérias, o que pode trazer vantagens para estas bactérias que normalmente causam infecção no trato gastrintestinal que é altamente colonizado pela micro-biota do hospedeiro (25). São inúmeros o fatores de virulência controlados pelo sistema QS e a tendência é que esta lis-ta fique cada vez mais longa. (3)

O império contra-ataca: interferindo com o QS

A descoberta de que as bactérias patogênicas utilizam uma sinalização para controlar a expressão dos fatores de virulência abriu uma nova linha de pesquisa que busca conseguir estraté-gias terapêuticas contra as infecções bacterianas. A sinalização bacteriana, então, poderia ser bloqueada de diver-sas maneiras.

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Drogas que interfiram nas vias bio-químicas para síntese das moléculas de sinalização podem se tornar estraté-gias bastante promissoras. As AHL são moléculas conservadas produzidas por diferentes bactérias e tem uma parte composta por homoserina lactona, o que faz com existam pelo menos enzimas capazes de hidrolisar as AHLs.

Outra maneira seria utilizando dro-gas que interfiram nas vias bioquímicas da síntese das moléculas sinalizadoras. Este tipo de estratégia já foi demons-trado em P. aeruginosa. Uma outra al-ternativa terapêutica seria o de inibir os receptores cognatos das moléculas sen-soras. Moléculas sintéticas análogas as moléculas sensoras podem ser criadas para ligarem-se ao receptor cognato, sem ativar a cascata de sinalização (36).

Uma outra estratégia, além de inter-ferir com a molécula sensora e recepto-ra, seria a de manipular os eventos que ocorrem após a ligação do AI com o seu receptor cognato, utilizando uma molé-cula que interfira na regulação da trans-crição do genes. Hung e colaboradores em 2005 (37) identificaram a virstatina, como um inibidor da expressão do genes de V. cholerae responsáveis pela coloni-zação no hospedeiro.

A ativação do sistema QS ajuda as bactérias patogênicas a esconderem seus fatores de virulência do hospedei-ro até que alcancem um número maior e suficiente para burlar a resposta imu-ne. O atraso na produção de moléculas extracelulares na expressão de fatores de virulência poderiam evitar a detec-ção pelo sistema imune. Desta forma, a utilização de sistemas análogos que ativassem a expressão de tais genes precocemente durante o processo infec-cioso poderia ser benéfico para alertar o hospedeiro da presença do patógeno antes que algum dano maior fosse cau-sado. Porém, além da identificação de moléculas terapêuticas que ajam como agonistas das moléculas bacterianas, pouco progresso foi feito com relação ao seu uso (38). Além disso, esta aplicação em particular pode ser mais difícil do que a inibição da sinalização química, já que o diagnóstico da doença teria quer ser bastante precoce.

O sistema imunológico dos mamífe-ros também tem evoluído no combate

das moléculas de sinalização bacteriana. Estudos recentes encontraram fatores ci-toplasmáticos capazes de inativar a AHL de P. aeruginosa, N-(3-oxododecanoyl)-L- homoserine lactone (OdDHL). Estes fatores, paraoxanase (PON), pertencem a família das proteínas PON1, PON2 e PON3 (39). As PONs estão envolvidas na detoxificação de vários organofosfa-tos e agem como lactonases. Porém, pelo fato delas estarem localizadas in-traceluarmente, elas não agiriam no QS típico e sim apenas daquelas bactérias com ciclo de vida intracelular ou nas OdDHL que conseguissem passar pelas células dos mamíferos.

Quarenta anos se passaram desde as primeiras observações a respeito da comunicação bacteriana e as pesquisas neste assunto ainda trazem descobertas fantásticas. Outros estudos, sugerem que é apenas o começo da descoberta de moléculas que realizam a comunica-ção na população bacteriana. Mesmo porque a diversdade bacteriana e do TG ainda é pouco conhecida e alguns estudos apontam certas disparidades. Mesmo assim, é um campo bastante promissor e, que com certeza ainda ajudará a responder diversos enigmas sobre a vida bacteriana e alguns deles com certeza benéficos ao homem.

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29- Freeman, J.A. and Bassler, B.L. (1999). Sequence and function of LuxU: a two-com-ponent phosphorelay protein that regulates quorum sensing in Vibrio harveyi. J Bacteriol. 1999 Feb;181(3):899-906.

30- Bassler, B.L., Wright, M., Showalter, R.E. e Silverman, M.R. (1993). Intercellular sig-nalling in Vibrio harveyi: sequence and func-tion of genes regulating xpression of lumines-cence. Mol. Microbiol. 9: 773-786.

31- Kaper, J.B. e Sperandio, V. (2005). Bacte-rial cell-to-cell signaling in the gastrointestinal tract. Infect and Immun. 73 (6): 3197-3209.

32- Lythe, M. e Ernst, S. Catecholamine indu-ce growth of Gram negative bacteria. (1992) Life Sci. 50: 203-212.

33- Sperandio V, Torres AG, Jarvis B, Nataro JP, Kaper JB. (2003). Bacteria-host communi-cation: the language of hormones. Proc Natl Acad Sci U S A. 22;100(15): 8951-6. Epub 2003 Jul 7.

34- Pacheco, A.R. e Sperandio, V. (2009). Inter-kingdom signaling: chemical language between bacteria and host. Curr Opin Micro-biol. 12(2): 192-8. Epub 2009 Mar 21.

35- Delrue RM, Deschamps C, Léonard S, Nijskens C, Danese I, Schaus JM, Bonnot S, Ferooz J, Tibor A, De Bolle X, Letesson JJ. (2005). A quorum-sensing regulator controls expression of both the type IV secretion sys-tem and the flagellar apparatus of Brucella melitensis. Cell Microbiol. 7(8):1151-61.

36- Geske GD, O’Neill JC, Miller DM, Matt-mann ME, Blackwell HE. (2008). Modulation of bacterial quorum sensing with synthetic ligands: systematic evaluation of N-acylated homoserine lactones in multiple species and new insights into their mechanisms of action. J Am Chem Soc. 7;129(44):13613-25. Epub 2007 Oct 10.

37- Hung DT, Shakhnovich EA, Pierson E, Mekalanos JJ. (2005). Small-molecule inhibi-tor of Vibrio cholerae virulence and intestinal colonization. Science. 28;310(5748):670-4. Epub 2005 Oct 13.

38- Smith KM, Bu Y, Suga H. (2003). Library screening for synthetic agonists and antago-nists of a Pseudomonas aeruginosa autoin-ducer. Chem Biol.10(6): 563-71.

39- Khersonsky O, Tawfik DS. (2005). Struc-ture-reactivity studies of serum paraoxonase PON1 suggest that its native activity is lac-tonase. Biochemistry. 44(16): 6371-82.

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Em 2009 a Sociedade Brasileira de Microbiologia implantou o Selo de Aprovação SBM, com o objetivo de promover a aprovação de produtos sanitariamente adequados quanto à presença de microrganismos. Em paralelo ao Selo, foi criado o Departamento de Avaliação de Produtos pela SBM, responsável pelas análises e pesquisas dos produ-tos, incluindo as embalagens e informações ao consumidor.

A aprovação do produto começou a ser uma exigência do mercado e os fabricantes passaram a se preocupar mais em adequar sua produção e seus produtos dentro de parâmetros qualitativos e com preços competitivos. O programa de aprovação da SBM visa certificar produtos quanto a sua qualidade microbiológica e/ou sua capacidade ger-micida.

O processo de aprovação pela SBM segue um programa internacional, cujas diretri-zes emanam da Organização Mundial de Saúde.

O primeiro produto a receber o Selo de Aprovação da SBM foi o Dettol® produzido pela empresa Reckitt-Benckiser nas formas de sabonete em barra, sabonete líquido e gel anti-séptico. Este selo foi concedido após avaliação de parecer técnico-específico emitido por especialistas indicados pela SBM.

APROVADO PELA SBM CONFIANÇA NA QUALIDADE

DO PRODUTO

Como solicitar o Selo SBM

As empresas interessadas em encaminhar seus produtos para avaliação do programa de aprovação da SBM devem: - Enviar carta à Sociedade Brasileira de Microbiologia e solicitar que o produto, fabricado ou comercializado no Brasil seja analisado

para receber o Selo de Aprovação SBM; - Também é preciso enviar estudos já realizados sobre o produto, como análises, pesquisas e formulação, além de informações

adicionais que houver; - Caso a comissão de avaliação achar necessário, novos testes em laboratórios credenciados poderão ser solicitados.

Depois do envio deste material, o SBM firma com a empresa solicitante um protocolo de pesquisa, informando os objetivos, procedi-mentos e tempo de estudo. A realização dos ensaios dura entre 30 a 90 dias e todas as análises realizadas, materiais e equipamentos utilizados obedecem a normas específicas para cada produto. Sendo o produto aprovado, deverá a Empresa assinar um Contrato que rege todos os pontos do relacionamento com a SBM.

Para tornar possível mais essa atividade da SBM, foi realizado um convênio de parceria com empresa tradicional em proficiência, a Controllab.

Para obtenção de maiores esclarecimentos entre em contato com:sbm@sbmicrobiologia.org.br

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SBM IN FOCO - A FORMA DIRETA DE FALAR COM OS MICROBIOLOGISTAS.

Apresentamos o plano de comercialização para 4 edições da Revista Microbiologia in Foco.

Periódico da Sociedade Brasileira de Microbiologia, com tiragem de 2000 exemplares e distribuição gratuita. Revista de informação e divulgação sobre temas em bacteriologia, micologia e virologia nas várias áreas de abrangência da Microbiologia: ambiental, agrí-cola, básica, de alimentos, industrial, médica humana e veterinária e oral.

A revista ainda conta com espaços para divulgação de consensos, agenda científica, atualidades e oportunidades de trabalho.

Venha fazer parte deste veículo de informação atualizada!

Atenciosamente,Marina Baquerizo Martinez e Carlos P. Taborda - Editores

Sociedade Brasileira de Microbiologia

página inteira

21 x 28 cm1/2 página

18 x 12 cmPara anunciar entre em contato com José Jair Cagnotto:E-mail: financeiro@sbmicrobiologia.org.br

Telefone: (11) 3813-9647 ou 3037-7095

WWW.SBMICROBIOLOGIA.ORG.BR

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Agenda in Foco

AGENDA 2012

XXI Congresso Latino-Americano de MicrobiologiaData: 28/10/2012 à 01/11/2012.Local: Mendes Convention Center – Santos, SP – Brasil.

III Simpósio Internacional de Microbiologia Clínica – SIMC2012Data: 28/10/2012 à 01/11/2012.Local: Mendes Convention Center – Santos, SP – Brasil.

XIII Encontro Nacional de Microbiologia Ambiental – ENAMAData: 28/10/2012 à 01/11/2012.Local: Mendes Convention Center – Santos, SP – Brasil.

I Workshop Sul-Americano de Microbiologia Polar – SAMP Data: 28/10/2012 à 01/11/2012.Local: Mendes Convention Center – Santos, SP – Brasil.

XIV Simpósio Brasileiro de Micobactérias – SIBRAMICData: 28/10/2012 à 01/11/2012.Local: Mendes Convention Center – Santos, SP – Brasil.

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Coodernadora: Dra . Marina Baquerizo MartinezProfa . Titular da FCF-USP

Graduados em •Biologia •Farmácia •MedicinaVeterinária •Biomedicina •EngenhariadeAlimentos •Medicina •EngenhariaQuímica •Odontologia

Público Alvo

Especialização

Interessados em atuar na área de microbiologia de alimentos, ambiental, industrial e clínica.

Seleção: Ficha de inscrição e Envio de currículo

Duração: 18 meses, aulas quinzenais, sextas-feiras das 19:00 a 23:00 horas e sábados das 9:00 as 18:00 horas

CargaHoráriaTotal: 760 horas

Aperfeiçoamento

Profissionais que atuam na área de microbiologia de alimentos, ambiental, industrial e clínica. E queiram aprimorar seus conhecimentos específicos.

Seleção: Ficha de inscrição e Envio de currículo

Duração: 8 meses, aulas quinzenais, sextas-feiras das 19:00 a 23:00 horas e sábados das 9:00 as 18:00 horas

CargaHoráriaTotal: 180 horas

www.sbmicrobiologia.org.brAv. Prof. Lineu Prestes 2415 ICB III | Cidade Universitária | São Paulo | SP | CEP: 05508-000

Tel: 11 3037-7095 | 11 3813-9647 | curso@sbmicrobiologia.org.br

Cursos de Especialização e Aperfeiçoamento em Microbiologia

•MicrobiologiaClínica •MicrobiologiadeAlimentos•MicrobiologiaIndustrial •MicrobiologiaAmbiental

Início das turmas em janeiro e julho

Os sócios da SBM têm direito a descontos especiais nos eventos promovidos ou patrocinados pela SBM . Para usufruir do desconto de associado em nossas atividades é imprescindivel estar anuente a dois anos consecutivos com a sociedade. Além disso, têm acesso livre à revista científica Brazilian Journal of Microbiology (BJM e que se destina à publicação de trabalhos de pesquisa originais, notas breves e revisões, envolvendo todos os aspectos da Microbiologia. É considerada uma das revistas científicas mais importantes do nosso país. O BJM tem uma política muito severa de avaliação dos trabalhos submetidos à publicação, sendo cada manuscrito avaliado por pelo menos dois revisores criteriosamente selecionados.

A revista Microbiologia in Foco tem o objetivo de promover o intercâmbio de informações científicas entre os associados, publi-cando os autores nacionais de expressão. Adota o mesmo critério de avaliação e excelência que a SBM sempre adotou. Enviaremos o último número da Microbiologia in Foco a todos os novos asso-ciados, após sua efetiva associação, um exemplar da revista, no

período composto entre os dias 05 e 10. Nos meses seguintes, os associados receberão regularmente os novos números publicados da revista.

Fique sócio da SBM. Veja informações no site: www.sbmicrobiologia.org.br Lembre-se: um sócio da SBM integra a maior e mais represen-

tativa associação da comunidade científica que atua na microbio-logia nacional.

Valores para associaçãoCategoria de Sócio .............................................. Anuidade 2012Aluno de Graduação ..................................................R$ 85,00Aluno de Pós-Graduação (Mestrado e Doutorado) ............................................ R$ 135,00Aluno de Pós-Doutorado ........................................... R$ 165,00Profissional ............................................................... R$ 195,00

FIQUE SÓCIOFIQUE SÓCIO

Representantes de ÁreaRepresentantes de Área

Biênio 2012-2013

SBM 2012-2013

PresidenteAdalberto Pessoa Junior, USP-SP

Vice PresidenteAlexandre Soares Rosado, UFRJ-RJ

1º SecretárioCarla Taddei de Castro Neves, USP-SP

2º SecretárioLauro Santos Filho, UFPB-PB

1º TesoureiroCarlos Pelleschi Taborda, USP-SP

2º TesoureiroMaria Cristina Dantas Vanetti, UFV-MG

Conselho FiscalBernadette D. G. M. Franco, USP-SP

Sergio E. L. Fracalanza, UFRJ-RJAgnes Marie Sá Figueiredo, UFRJ-RJ

Coleções de CulturaManuela da Silva, FIOCRUZ-RJCarlos Augusto Rosa, UFMG-MG

EnsinoKarla Tereza Silva Ribeiro, UFPA-PAMarcela Pellegrini Peçanha, PUC-SP/UNISO

Infecção HospitalarAfonso Luis Barth, UFRGS-RSAna Lúcia Darini, USP-SP

Microbiologia de AlimentosBernardette G. Franco, USP-SPRicardo Souza Dias, FUNED-MG/Metodista de Minas-MG

Microbiologia AmbientalVivian Pelizari, USP-SPRaquel Paixoto, UFRJ-RJ

Microbiologia ClínicaElizabeth de Andrade Marques, UERJ-RJMaria Baquerizo Martinez, FCF/USP

Microbiologia IndustrialEleni Gomes, UNESP-Rio Preto, SPLuiz Henrique Guimarães, USP-Ribeirão Preto, SP

Microbiologia MédicaLeila Carvalho Campos, FIOCRUZ-BATânia Aparecia Tardelli G. do Amaral, UNIFESP-SP

MicologiaCélia Maria de Almeida Soares, UFG-GOMarcio Rodriges, UFRJ-RJ

MicotoxinasAdriana de Almeida Palma, ITAL-SPMarta Taniwaki, ITAL-SP

Parasito-HospedeiroSandro R. de Almeida, USP-SPDario Simões Zamboni, USP-Ribeirão Preto, SP

Microbiologia do SoloItamar Soares de Melo, Embrapa-SPVânia Maria Maciel Melo, UFC-CE

Microbiologia VeterináriaOdir Antônio Dallagostin, UFPel-RSRinaldo Aparecido Mota, UFRPE-PE

VirologiaFlávio Guimarães da Fonseca, UFMG-MGLuciana Barros de Arruda, UFRJ-RJ

Genética de Microrganismos e BioinformáticaArtur Luiz da Costa Silva, UFPA-PAGustavo Goldman, USP-SP