AÇÃO DO LINALOL SOBRE O SISTEMA CARDIOVASCULAR DE RATOS NORMOTENSOS

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEAR

KARILANE MARIA SILVINO RODRIGUES

AO DO LINALOL SOBRE O SISTEMA CARDIOVASCULAR

DE RATOS NORMOTENSOS

FORTALEZA-CEAR

2010

1


AO DO LINALOL SOBRE O SISTEMA CARDIOVASCULAR DE RATOS

NORMOTENSOS

Dissertao ao Curso de Mestrado Acadmico em Cincias Fisiolgica da Universidade

Estadual do Cear, como requisito parcial para a obteno do grau mestre em Fisiologia.

rea de Concentrao: Fisiologia.

Orientadora: Profo. Dr. Mohammed Saad Lahlou

FORTALEZA CEAR 2010

2

R696a Rodrigues, Karilane Maria Silvino

Ao do linalol sobre o sistema cardiovascular

de ratos normotensos. / Karilane Maria Silvino

Rodrigues Fortaleza, 2011.

146 p. : il.

Orientador: Profo. Dr. Mohammed Saad Lahlou

Dissertao Mestrado Acadmico em Cincias

Fisiolgicas Universidade Estadual do Cear,

Centro de Cincias da Sade.

1. Linalol. 2. Sistema cardiovascular. 3. Msculo

liso vascular. 4. Aorta. I. Universidade Estadual do

Cear, Centro de Cincias da Sade .

CDD: 574-1

3


AO DO LINALOL SOBRE O SISTEMA CARDIOVASCULAR DE RATOS

NORMOTENSOS

Dissertao ao Curso de Mestrado Acadmico em Cincias Fisiolgica da Universidade

Estadual do Cear, como requisito parcial para a obteno do grau mestre em Fisiologia.

rea de Concentrao: Fisiologia.

Aprovada em: 30/ 09 /2010.

BANCA EXAMINADORA

________________________________________________

Prof. Dr. Mohammed Saad Lahlou (Orientador)

Universidade Estadual do Cear UECE

________________________________________________

Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhes

Universidade Federal do Cear - UFC

________________________________________________

Profa. Dra. Andrelina Noranha Coelho de Souza

Universiade Estadual do Cear - UECE

4

A Deus, por tudo e a minha amada av Eridan

Tabosa (In Memoriam) por me fazer acreditar que tudo posso.

5

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais Jaime e Edineide Rodrigues, minhas razes.

A minha irm Kesiane, que mesmo distante se faz presente em todos os

momentos da minha vida.

A minha tia Auri, sinnimos de persistncia e coragem.

Ao meu orientador professor Saad Lahlou, por aceitar-me como orientanda,

pela amizade, disposio, prestatividade e inteligncia na conduo deste

trabalho.

As minhas queridas amigas Diana e Dieniffer, no s pela contribuio valiosa

para execuo deste trabalho, mas tambm por se fazerem presente em todos

os momentos.

A professora Ediara, por ter despertado em mim o amor pela pesquisa.

Aos meus amigos, Jones, Leidiane, Neto, Davi, Loeste, Estela, Tiago, Vanessa

e Patrick por me ensinarem a arte da amizade.

Ao aluno de doutorado Rodrigo Siqueira, pela ajuda eficaz.

Ao amigo professor Walter Zin, pelo exemplo de competncia e correo.

Ao professor Henrique Leal Cardoso, pelo auxlio inestimvel e incansvel

disponibilidade com que sempre me recebeu.

Ao professor Pedro Magalhes, pela acolhida e constante incentivo.

As professoras Andrelina Noronha e Crystianne Callado, pela amizade e pelas

orientaes sbias e oportunas.

6

A todos os professores do Mestrado que contriburam para minha formao.

A minha querida paciente Maria Ceales (In Memoriam), pelas lies de vida e

por haver despertado em mim o desejo de superao.

A Ecila e Lindalva, pela afetuosidade e presteza.

Ao amigos de laboratrio Luiz Junior, Kerly Shamyra, Walber Ferreira e Roseli

Barbosa, pelo apoio incessante.

Ao LEF E LAFAMULI, laboratrios que realizei a parte experimental deste

trabalho.

Ao Pedro Melites, por sua imensa solicitude no auxlio desta pesquisa.

Ao Frank, pelo empenho para com os animais.

Aos guardas da Universidade Estadual do Cear e da Universidade Federal do

Cear, pela sentinela constante.

Ao Biotrio Central da Universidade Federal do Cear, por ceder animais para

que esta pesquisa fosse realizada.

7

O Senhor fez a terra produzir os medicamentos: O homem sensato no os despreza

Eclesistico 31-4.

8

RESUMO

O linalol, um monoterpeno, constituinte de diversos leos essenciais e possui

atividades antiinflamatria, antinociceptiva e anti-microbiana, j comprovadas. No entanto, pouco se conhece sobre seus efeitos no sistema cardiovascular,

sendo este, portanto, o objetivo deste estudo. Avaliamos o efeito do linalol in vivo em ratos normotensos e anestesiados, e in vitro em aorta isolada de rato. Para isso utilizamos ratos Wistar machos, (250-350g). Nos experimentos in

vivo estes animais foram anestesiados com pentobarbital sdico para canulao da aorta abdominal e da veia cava inferior. O linalol foi injetado

manualmente em bolus no volume de 0,1 ml, seguido de injeo de 0,2 ml de soluo salina. Cada animal recebeu uma srie crescente de doses (1, 5, 10 e 20 mg/kg, n = 6) atravs do cateter intravenoso e o curso temporal das

alteraes de PAM e FC foi registrado. Um procedimento similar foi realizado em outro grupo de ratos (n = 7) que foram submetidos 15 minutos antes a uma

bivagotomia realizada a nvel cervical. O linalol em ratos intactos foi capaz de provocar hipotenso e bradicardia de forma dose-dependente (P < 0,01; ANOVA a uma via). Na dose de 10 e 20 mg/kg as respostas hipotensoras e

bradicardizantes foram bifsicas.Similarmente em ratos bivagotomizados injees i.v. de doses crescentes do linalol (1, 5, 10 e 20 mg/kg) induziram uma

hipotenso e bradicardia (fase 2) de forma dose-dependentes (P < 0.01, ANOVA a uma via) que se tornam significativas tambm nas doses de 1 e 5mg/kg, respectivamente. Entretanto, a fase 1, para hipotenso e bradicardia,

induzidas pelo linalol nas doses de 10 e 20 mg/kg foi complemente abolida (P

9

ABSTRACT

Linalool a monoterpene, constituent of several essential oils, and has proven anti-inflammatory, antinociceptive, anti-microbial activities. However, little is known about its effects on the cardiovascular system, so this is the objective of this study. We evaluated the effect of linalool in vivo in anesthetized normotensive rats and in vitro in isolated rat aorta. We used male Wistar rats (250-350g). In vivo experiments these animals were anesthetized with sodium pentobarbital for cannulation of the abdominal aorta and vena cava. Linalool was injected manually in a bolus volume of 0.1 ml followed by injection of 0.2 ml of saline. Each animal received a series of incrementing doses (1, 5, 10 and 20 mg / kg, n = 6) via the intravenous catheter and the time course of changes in MAP and HR was recorded. A similar procedure was performed in another roup of rats (n = 7) which underwent a bilateral vagotomy be performed at cervical level. Linalool in intact rats was able to cause hypotension and bradycardia dose-dependently (P

10

LISTA DE TABELAS

TABELA I. Lista de plantas medicinais permitidas pela ANVISA no Brasil e

suas aes teraputicas. 20 TABELA II. Denominao dos terpenos. 22

TABELA III. Valores mdios do tempo de latncia (em segundos) para a induo dos

efeitos hipotensores e bradicardizantes (fases 1 e 2) pelo LIN intravenoso nas doses

estudadas, em ratos intactos ou submetidos bivagotomia cervical. 57

11

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1. Acoplamento Eletromecnico e Farmacomecnico do msculo liso

vascular. 28 FIGURA 2. Representao da ativao da protena monomrica G. 31 FIGURA 3. Representao esquemtica do relaxamento do msculo liso

vascular. 32 FIGURA 4. Estrutura qumica do Linalol. 39

FIGURA 5. Sistema de registro das contraes mecnicas. 47 FIGURA 6. Representao esquemtica do efeito relaxante do linalol em contraes

sustentada por K80 com endotlio. 48 Figura 7. Representao esquemtica do efeito relaxante do linalol em contraes

sustentada por K80 sem endotlio. 48 Figura 8. Representao esquemtica do efeito relaxante do linalol em contraes sustentada por FE (0,1mM) com endotlio. 49 Figura 9. Representao esquemtica do efeito do linalol sobre as contraes de

CaCl2 na presena de K60 sem Ca2+

. 49 Figura 10. Representao esquemtica do feito relaxante do linalol sobre a contrao

sustentada de fenilefrina na presena de bloqueadores de canais de potssio (TEA 5mM). 50 Figura 11. Representao esquemtica do feito relaxante do linalol sobre a contrao

sustentada de fenilefrina na presena de bloqueadores de canais de potssio (4-AP 3mM). 50 FIGURA 12. Mudanas mximas da presso arterial media (PAM) e da freqncia cardaca (FC) induzidas pela administrao intravenosa do linalol (1mg/kg) em ratos anestesiados antes ou depois da bivagotomia. 53 FIGURA 13. Mudanas mximas da presso arterial media (PAM) e da freqncia cardaca (FC) induzidas pela administrao intravenosa do linalol (5mg/kg) em ratos anestesiados antes ou depois da bivagotomia. 54 FIGURA 14. Mudanas mximas da presso arterial media (PAM) e da freqncia cardaca (FC) induzidas pela administrao intravenosa do linalol (10mg/kg) em ratos anestesiados antes ou depois da bivagotomia. 55 FIGURA 15. Mudanas mximas da presso arterial media (PAM) e da freqncia cardaca (FC) induzidas pela administrao intravenosa do linalol (20 mg/kg) em ratos anestesiados antes ou depois da bivagotomia. 56

12

FIGURA 16. Traado representativo mostrando as alteraes bifsicas na presso

arterial media (A; MAP) e a freqncia cardaca (B; FC) induzidas pela administrao intravenosa do linalol (10 mg/kg) em ratos anestesiados. 58 FIGURA 17. Efeito do linalol (1-

mantida por K80 mM em anis isolados de aorta de ratos com endotlio (END+). 59 FIGURA 18. Efeito do linalol (1- mantida por K80 mM em anis isolados de aortas de ratos sem endotlio (END-). 60 FIGURA 19. Comparao do efeito vasorrelaxante do linalol (1- anis

isolados de aorta de ratos pr-contridos com K80 com endotlio (END+) e sem endotlio (END-) ratos. 61 FIGURA 20. Efeito do linalol (1- mantida por fenilefrina (FE 0,1 M) em anis isolados de aorta de ratos com endotlio (END +). 62 FIGURA 21. 2 (0,1-

20mM) em anis isolados de aorta de ratos mantidos em meio sem Ca2+. 64 FIGURA 22. 2 (0,1- 20

mM) em anis isolados de aorta mantidos em meio sem Ca2+. 64 FIGURA 23. Efeito do linalol (1000 M) sobre a contrao induzida pelo CaCl2 (0,1- 20 mM) em anis isolados de aorta mantidos em meio sem Ca2+. 65 FIGURA 24. Efeito do linalol (1- mantida por

fenilefrina (FE 0,1 M) em anis isolados de aorta de ratos com endotlio na presena de 4 AP (3 mM). 66 FIGURA 25. Efeito do linalol (1- a contrao induzida e mantida por

fenilefrina (FE 0,1 M) em anis isolados de aorta de ratos com endotlio na presena de 4-AP (3mM). 67

13

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

[Ca2+]i Concentrao intracelular de clcio ACh Acetilcolina AMPc 3'-5' adenosina monofosfato cclico ANOVA Anlise de Varincia AT1- Receptor de angiotensia II

ATP Adenosina Trifosfato Ca2+ Clcio CaCl2 Cloreto de Clcio DAG Diacilglicerol EC50 Concentrao capaz de gerar 50% do efeito mximo END- Endtelio Vascular EGTA cido etileno-bis (-amino-etil-ter)-N,N,N,N-tetractico FHDE Fator hiperpolarizante do endotlio FE - Fenilefrina GMPc- guanosina monofosfato cclico

IP3 1,4,5-trifosfatidilinositol K+ Potssio KB Krebes Hanseleit KCl Cloreto de Potssio K60 60 mM de Cloreto de Potssio K80 80mM de Cloreto de Potssio L-NAME - N-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride MLCK Quinase cadeia leve de miosina MLCP Fosfatase de cadeia leve de miosina MLV Msculo Liso Vascular MYPT1- Miosina fosfatase subunidade alvo 1 NO xido ntrico NOS xido ntrico sintetase OEAc leo Essencial de Aniba Canelilla OEAzr leo Essencial Aniba zerumbet OECn leo Essencial de Croton nepetaefolius ORCz leo Essencial de Croton Zenhtneri OEMv leo Essencial de Mentha villosa OEOg leo Essencial Ocimum gratissimum OMS Organizao Mundial de Sade PAM Presso Arterial Mdia PIP2 Inositol Difosfato PGI2 Prostaciclinas PKC Protena quinase C PLC Fosfolipase C rMCL cadeia leve regulatria da miosina Rho Protena monomrica G Rhok- Rho-quinase ROCCs Canais de clcio operados por receptor RS Retculo Sarcoplasmtico

14

SACs Canais Ativados por Estresse SERCA bomba de clcio do retculo sarcoplasmtico SOCs Canais para clcio operados por receptor UECE Universidade Estadual do Cear UFC Universidade Federal do Cear VOCCs Canais de clcio operados por voltagem 0Ca2+ - Soluo sem Cloreto de Clcio

15

Sumrio

Pgina

Resumo 09

Abstract 10

Lista de Tabelas 11

Lista de Figuras 12

Lista de Siglas e Abreviaturas 14

1. INTRODUO 18

1.1 Consideraes Gerais 18

1.2 Plantas Medicinais 19

1.3 Olos Essenciais e Constituintes Terpnicos 20

1.4 Sistema Cardiovascular e Constituintes Terpnicos 23

1.4.1 Estrutura e funo do sistema cardiovascular 23

1.4.2 Regulao da Presso Arterial 25

1.4.3 Msculo liso vascular 27

1.4.4 Msculo liso vascular e canais de potssio 34

1.4.5 Ativiadade cardiovascular de terpenos 36

1.5 Atividade Biolgica e Farmacolgica do Linalol

39

16

42

2. OBJETIVOS 42

2.1 Objetivo Geral 42

2.2 Objetivos Especficos 42

3. MATERIAL E MTODOS 43

3.1 Animais 43

3.2 Extrao do linalol 43

3.3 Solues e drogas 43

3.4 Experimentos In vivo 44

3.4.1 Cateterizao dos animais 44

3.4.2 Sistema de registro 45

3.4.3 Protocolos Experimentais 45

3.5 Experimentos In vitro 46

3.5.1 Registro da atividade contrtil e, aorta isolada 36

3.5.2 Protocolos Experimentais 47

3.6 Anlise Estatstica 50

17

4. RESULTADOS 51

4.1 Experimentos In vivo 51

Estudo dos efeitos cardiovasculares do linalol em ratos anestesiados: influncia da vagotomia bilateral.

51

4.2 Experimento In vitro 58

Efeito relaxante do linalol sobre a contrao sustentada e induzida por potssio em anis de artria aorta isolada de ratos.

58

Efeito relaxante do linalol sobre a contrao sustentada e induzida por fenilefrina em anis de artria aorta isolada de ratos.

61

Efeito Inibitrio do Linalol na Contrao Induzida por CaCl2 na Presena de K60 em soluo 0Ca2+.

62

Efeito relaxante do linalol sobre a contrao sustentada de fenilefrina na presena de bloqueadores de canais de potssio em artria aorta isolada de rato.

65

5. DISCUSSO 68

6. CONCLUSO 73

REFERNCIAS 74

18

1. INTRODUO

1.1 Consideraes Gerais

De acordo com Hanse e Lambert (2007) as patologias

cardiovasculares tornam-se cada vez mais comuns no mundo atual, tendo uma

maior prevalncia na populao idosa. Isso acontece devido a diversos fatores,

dentre eles destacam-se a mudana no estilo de vida e a longevidade, alm da

interferncia de fatores genticos. Conforme pesquisa realizada Organizao

Mundial de Sade (OMS) em 2003 essas patologias so responsveis por 30%

de mortes por ano no mundo.

Em funo desses dados o sistema cardiovascular tem sido um dos

principais focos de pesquisas, que buscam incessantemente por medidas

curativas e at mesmo preventivas, a fim de oferecer maiores benefcios para a

sociedade.

Dentre esses estudos destacam-se os que tm como foco central o

efeito das plantas medicinais ou produtos naturais e suas aes no sistema

cardiovascular. As substncias ativas encontradas nessas plantas so

responsveis pelos efeitos biolgicos e farmacolgicos nos tecidos orgnicos.

Como relatado por Calixto (2000) aproximadamente 25% dos medicamentos

conhecidos so originrios de plantas. No Brasil apenas 5% dos medicamentos

so de origem vegetal, mesmo com a grande diversidade de plantas medicinais

conhecidas nesse pas. Com isso, percebe-se que a sociedade cientfica pouco

tem dado valor enorme fonte de conhecimento que as plantas e seus

derivados fornecem, j que elas podem ser utilizadas no s como

instrumentos farmacolgicos, mas tambm terapeuticamente findando na

melhora da qualidade de vida da populao.

Portanto, pesquisas neste sentido levam ao crescimento da cincia, e tambm,

a busca de se tentar minimizar os efeitos lesivos das diversas patologias que

19

acarretam danos ao sistema orgnicos e mais precisamente ao sistema

cardiovascular.

1.2 Plantas Medicinais

As plantas, desde a antiguidade, vm sendo utilizadas pelo homem

como fontes teraputicas. Isso acontece em conseqncia ao fcil acesso,

baixo custo e principalmente, pelo empirismo. O estudo sobre medicamentos

derivados de plantas comum em pases subdesenvolvidos, devido

biodiversidade da flora e a aceitao popular (SIXEL e PECINALLI, 2005).

Algumas destas plantas e seus derivados j foram investigados com o intuito

de compreender suas possveis aes nos sistemas orgnicos.

Estima-se que existam aproximadamente 200.000 espcies de

plantas no mundo, das quais cerca de 20.000 espcies so utilizadas na

medicina tradicional, entretanto, a maioria delas no foi avaliada quimicamente

ou farmacologicamente (SARTORATTO et al., 2004; BERTINI et al., 2005). O

Brasil conhecido mundialmente no s por ser uma potencia

economicamente emergente, mas tambm por apresentar uma flora bastante

diversificada e pouco explorada pela sociedade cientfica. Conforme relatado

por Dias (1996) o pais com uma das maiores variaes genticas vegetais do

mundo. O Nordeste brasileiro, no foge a regra, apesar da baixa pluviosidade,

uma regio formada predominantemente por vegetao da Caantiga sendo

caracterizada por plantas de pequeno porte, na sua maioria arbustos, alm

disso, apresenta riqueza em plantas medicinais.

As plantas medicinais podem ser estudadas de duas maneiras:

atravs da Farmacologia dos Produtos Naturais que leva em considerao as

caractersticas bioqumicas e farmacolgicas das plantas e atravs da

Etnofarmacologia que envolve um estudo de acordo com a medicina popular,

ou seja, leva em considerao aspectos tnicos e culturais de uma

20

determinada populao e/ou de uma dada regio que utiliza as plantas com

fins teraputicos (SIXEL e PECINALLI 2005).

A populao uti liza plantas medicinais para preveno ou cura de

doenas na forma de chs, inalaes e/ou lambedores ou at mesmo na forma

de cataplasma (MATOS, 2000). No Brasil a Agncia Nacional de Vigilncia

Sanitria (ANVISA) regulamenta o uso de algumas plantas medicinais nos

servios de sade pblica (Tabela 1). Ressalta-se que este uso deve ter sua

eficcia e segurana teraputicas comprovadas previamente por pesquisas,

para que assim se possam obter os reais efeitos das plantas estudadas

(MATOS, 2000).

Nome popular da planta Forma de uso Indicao teraputica

Alho leo ou extrato seco Hepatoproteror

Babosa Creme Gel Queimaduras

Erva doce Infuso Antiespasmdico

Gengibre Infuso Prfilaxia de nuseas

Hortel Infuso Expectorante

Maracuj Infuso Sedativo

Melissia Infuso Sedativo e

Antiespasmdico

Tabela I: Lista de plantas medicinais permitidas pela ANVISA no Brasil e suas aes

teraputicas (ANVISA, 2000).

21

1.3 leos Essenciais e Constituintes Terpnicos

As atividades biolgicas de uma planta medicinal so influenciadas

pela composio qumica do leo essencial (OE). Este ltimo pode ser extrado

das flores, folhas, caules, frutos ou razes e definido como um conjunto de

substncias volteis, derivada dos metabolismos secundrios, que produzem o

aroma da planta. So encontrados, especialmente nas plantas labiadas,

mirtceas, conferas, rutceas, laurceas e umbelferas (LAVABRE, 1993).

A gnese dos OEs dada por clulas especiais, glndulas ou ductos

localizados em um rgo particular ou distribudos em vrias partes da planta

sendo encontrados na forma de pequenas gotas. As funes principais desses

leos so de proteger as plantas de doenas e parasitas, auxi liar na

polinizao alm, de ajud-las na adaptao s mudanas que acontecem no

meio ambiente (LAVABRE, 1993).

Segundo Simes et al. (1999) h cinco mtodos de extrao de OE

so eles: enflorao, prensagem, extrao com solventes orgnicos, extrao

por fludo supercrtico e extrao por arraste de vapor dgua. O mais

empregado (para obteno do OE) o ltimo, devido ao baixo custo

(CRAVEIRO et al., 1981). Neste processo o leo evaporado e condensado

por resfriamento (CRAVEIRO et al., 1976, 1981). Bertini et al (2005) ressaltam,

que a composio dos OEs sofre influncias do clima, da estao do ano, das

condies geogrficas, do perodo da colheita, dos fatores genticos da

espcie e da tcnica de destilao.

Os OEs so substncias largamente uti lizados na indstria, como

aromatizantes, para preparao de perfumes, sabes, desinfetantes e

cosmticos, na preparao de alimentos como doces caseiros, licores, bebidas

aromticas e refrescantes, conferindo o odor caracterstico destes produtos

(JACOBS, 1948; LE MOAN, 1973; CRAVEIRO et al., 1977; LE BOURHIS,

1968, 1970; ITOKAWA et al., 1980, 1981, 1988, BAKKALI et al., 2008). Alm

das propriedades aromatizantes, os OEs apresentam atividades biolgicas e

farmacolgicas que variam conforme seus constituintes (BAKKALI et al., 2008).

22

Atualmente, alm dos OEs seus constituintes esto sendo

estudados com o objetivo de compreender qual das substncias em si

responsvel pelos efeitos biolgicos conferido aos leos. Os constituintes

comearam a ser isolados no final do sculo XIX, sendo o primeiro relato

datado de 1833. Apesar disso, estruturas qumicas s foram determinadas

partir 1958. A identificao de constituintes pode ser feita por cromatografia

gs-liquido (CRAVEIRO et al., 1981).

Os constituintes qumicos mais comuns dos OEs so formados por

uma combinao de terpenos, fenis, aldedos alcois, steres, cetonas,

nitrognio e enxofre (LAVABRE, 1993). Os terpenos so formados por

unidades isoprnicas, contendo apenas hidrognio e carbono em usa estrutura.

As molculas dos terpenos encontrados nos OEs possuem entre 10 a 30

tomos e so classificados confrome mostrado na tabela II:

Denominao Nmero de Carbonos

Monoterpenos 10 tomos de carbono

Sesquiterpenos 15 tomos de carbono

Diterpenos 20 tomos de carbono

Sesterpenos 25 tomos de carbono

Triterpenos 30 tomos de carbono

Tabela II: Denominao dos terpenos

Os terpenos, por sua diversidade, so bastante estudados e so

capazes de produzir diversos efeitos farmacolgicos e biolgicos (LEAL-

CARDOSO e FONTELES, 1999).

Adicionalmente, os OEs so utilizados pela populao com

finalidades sedativas, estomquicos, antiespasmdicos, antidiarricos

(FREISE, 1935; ITOKAWA et al., 1981; KIUCHI et al., 1992; BEZERRA, 1994),

antiparasitrios, antimicrobianos, analgsicos, diurticos, hipotensores (LUZ et

al., 1984; MENDONA, 1989, MENDONA et al., 1991), antimalricos

(KLAYMAN, 1985), antisfilitico (MENDONA, 1989), nos tratamentos da asma,

23

das doenas respiratrias, da rinite alrgica (BEZERRA, 1994; SILVA et al.,

2003), da clica menstrual, da diarria sanguinolenta, da amebase e giardase

(MATOS, 1994), alm de outras aplicaes.

Diversos OEs e constituintes terpnicos apresentam aes

farmacolgicas j comprovadas cientificamente, podendo-se destacar:

atividades antibacteriana, pr-inflamatria, pr-nociceptiva, anti-inflamatria,

antinociceptiva, analgsica, antioxidante, anticonvulsivante e moduladora

contrtil do msculo esqueltico, cardaco e liso (ALBUQUERQUE et al., 1995;

MAGALHES, 1997, 2002; COELHO-DE-SOUZA, 1997; COELHO-DE-SOUZA

et al., 1997, 1998; SANTOS e RAO, 1997, 1998; BEZERRA et al., 2000; LEAL-

CARDOSO et al., 2002; MADEIRA et al., 2002; C; MAGALHES et al.,

1998a,b, 2003, 2004; HAJHASHEMI et al., 2004; COELHO-DE-SOUZA et al.,

2005; LIMA-ACCIOLY et al., 2006; EVANGELISTA et al., 2007; BATISTA et al.,

2008; SOUSA et al., 2009; PINTO et al., 2009 MELO et al., 2010; PEIXOTO-

NEVES et al., 2010).

Bakkali et al (2008) afirma que os OEs so formados por uma

mistura de 20 a 60 constituintes. Os majoritrios em concentraes, em geral,

so capazes de determinar os efeitos e as propriedades biolgicas. Por

exemplo, o OE da Aniba rosaeodora Ducke (OEAr) rico em um monoterpeno

denominado linalol que apresenta diversas aes j comprovadas. Outros

constituintes merecem destaque pelos seus efeitos j comprovados

cientificamente tais como: 1,8 cineol e metil-eugenol para o OE do Croton

nepetaefolius (OECn), trans-anetol e estragol para o OE do Croton zehntneri

(OECz), xido de piperitenona para o OE mentha villosa (OEMv), eugenol para

o OE de Ocimum gratissimum (OEOG), 4 terpineol para o OE de Alpinia

zerumbet (OEAz) e o 1-nitro-2-feniletano para o OE da Aniba canelilla (OEAc)

(BERTINI et al., 2005; SARTORATTO et al., 2004; BERIC et al., 2008 e

BAKKALI et al., 2008).

24

1.4 Sistema Cardiovascular e Constituintes Terpnicos

1.4.1 Estrutura e funo do sistema cardiovascular

O sistema cardiovascular um dos principais sistemas responsveis

pela homeostasia corporal, pois a nutrio e a remoo de escria (resduos

metablicos) dos tecidos orgnicos so mantidas por ele atravs de um

suprimento sanguneo adequado (BERNE et al., 2004).

Segundo Berne e colaboradores (2004), um sistema composto por

uma bomba propulsora de sangue, chamada de corao e pelos vasos

sanguneos. O corao dividido em duas bombas em srie, composta de um

trio e um ventrculo cada, sendo estes capazes de distribuir o sangue para o

pulmo (circulao pulmonar) e para os demais rgos corporais (circulao

sistmica). Essas duas circulaes acontecem em uma nica direo, devido

existncia de estruturas formadas de tecido conjuntivo denominadas de valvas

cardacas. Estas, por sua vez, esto localizadas entre as cmaras cardacas

(valvas atrioventriculares), e dentro das artrias pulmonar e artica em relao

aos ventrculos direito e esquerdo (valvas de semilunares), respectivamente .

O fluxo de sangue que ejetado do corao em um adulto saudvel

aproximadamente de 5 l/min, e resultante da soma dos volumes ejetados

durante a sstole ventricular (momento em que o msculo cardaco contrai) que

acontece de forma intermitente de acordo com os eventos conhecido como

ciclo cardaco. Este fluxo suficiente para nutrir os sistemas corporais em

condies de repouso, sendo necessrio que o sangue passe por um circuito

de tubos denominados de vasos sanguneos (BERNE et al., 2004; NETTER,

2004).

Os vasos sanguneos so formados por trs camadas de tecidos

distintas: camada adventcia, camada mdia e camada ntima. A camada

adventcia a mais externa e mais forte das trs, sendo composta de tecido

25

conjuntivo denso, mas rico em componentes celulares como fibroblastos e

macrfagos. A tnica mdia a mais espessa formada principalmente de

tecido muscular, alm de elastina e colgeno. A camada ntima constituda

por uma nica camada de clulas, o endotlio e suas fibras elsticas elas

recobrem a luz do vaso, tendo contato direto com o fluxo sanguneo, encontra-

se dispostas longitudinalmente e imersas em substncias intracelular amorfa

(BERNE et al., 2004)

A aorta a principal artria conectada ao ventrculo esquerdo. A

partir dela surgem as outras artrias do corpo humano. o primeiro vaso a

receber o sangue, recm ejetado e com a maior quantidade de oxignio

alcanada aps a recente passagem pela circulao pulmonar. O fluxo

sanguneo dentro da aorta, em decorrncia a sua retrao elstica, torna-se

mais contnuo sendo, tambm, responsvel pela presso diastlica e pelo

fechamento da vlvula artica o que impede o retorno do sangue para a

cavidade ventricular. Em uma regio chamada de leito mesentrico, a aorta

comea a se ramificar para dar origem s mdias (artrias distribuidoras),

pequenas artrias e as arterolas que oferecem maior resistncia ao fluxo

sanguneo.

O prximo caminho percorrido pelo sangue at chegar aos tecidos

alvos so os capilares. Estes tubos, de pequena espessura, so responsveis

pela irrigao dos tecidos propriamente dita. Em conseqncia a sua estrutura,

os capilares proporcionam uma baixa velocidade ao fluxo sanguneo.

Aps as trocas homeostticas impulsionadas pelos gradientes

qumicos e pelas foras de Starling o sangue retorna ao corao passando

pelas vnulas at chegar s veias de maiores calibres (conhecidas por

apresentarem maior capacitncia) as quais desembocam no trio direito. As

veias e vnulas so estruturas de baixa presso hidrosttica e possuem

vlvulas que direcionam o fluxo sanguneo at seu destino, o trio direito

(BERNE et al., 2004; NETTER, 2004).

Como se pode perceber h uma mudana na constituio das

estruturas vasculares, conforme estes vasos se afastam da bomba propulsora,

so submissos ao controle do sistema nervoso central e local, alm de

26

sofrerem interferncias diretas de hormnios, nervos autonmicos, e de uma

variedade de drogas (BERNE et al., 2004). O controle local acontece em

decorrncia presena do msculo liso vascular (MLV) que d aos vasos

sanguneos a capacidade de alterar seu dimetro conforme a necessidade

corporal.

Cabe ressaltar que este sistema de vasos sanguneos e seus

controles so fundamentais para o controle da presso arterial mdia e esta

para a homeostasia.

1.4.2 Regulao da presso arterial

Presso arterial, conforme detalhado por Berne e colaboradores

(2004), a fora que o fluxo sanguneo exerce sobre as paredes dos vasos

sanguneos. Para tentar manter a presso em seus nveis fisiolgicos o

organismo faz uso de diversos mecanismos que sero descritos a seguir.

O equilbrio da presso arterial mdia (PAM) mantido pela

regulao permanente entre o dbito cardaco e a resistncia vascular

perifrica (KATZUNG, 2003). Esta regulao deve ocorrer em faixas temporais

diferentes, ou seja, respostas orgnicas acontecem em diferentes tempos

(curto, mdio e longo prazos) que se unem para ajustar os nveis pressricos

(GUYTON, 2006).

Os barorreceptores so responsveis pelas respostas rpidas

(reflexos) s variaes de presso. Eles esto localizados em pontos

estratgicos (devido sua alta irrigao sangunea), precisamente no arco

artico e seio carotdeo. So estruturas sensveis s eventuais alteraes na

presso. (BERNE, et al., 2004 e GUYTON, 2006). Quando estes receptores

especiais so estimulados, os impulsos originados neles so emitidos at o

ncleo do trato solitrio, no bulbo, cuja estimulao provoca reduo da PAM

atravs do sistema nervoso autnomo. Como por exemplo, em casos de

aumento da PAM, a frequncia de impulsos nervosos emitidos pelos

27

barorreceptores, ser maior e causar, por conseguinte, vasodilatao, inibio

cardaca e reduo da presso arterial (BERNE, et al., 2004).

Em mdio prazo, tem-se como principal evento a liberao de renina

pelas clulas justaglomerulares dos rins. Esta enzima chega circulao e

catalisa a quebra do angiotensinognio, que produzido no fgado, em

angiotensina I, que, por sua vez, atravs da lise de sua molcula pela enzima

conversora de angiotensina, forma um potente vasoconstritor denominado de

angiotensina II (BERNE, et al., 2004 e GUYTON,2006). Este sistema renina-

angiotensina normalmente acionado quando h reduo dos nveis

pressricos e refora as aes do barorreflexo.

Convm salientar que os vos sanguneos que ajudam a

controlar os nveis pressricos o fazem atravs do mecanismo conhecido como

auto-regulao que dividido em: endotelial, metablico e miognico. O

primeiro feito por substncia liberados pelo endotlio vascular, como xido

ntrico e fator relaxante derivado pelo endotlio que atuam nos vasos

sanguneos (CARVALHO et al., 2001; STANKEVICIUS, 2003). O controle

metablico governado conforme a demanda e /ou necessidade de um rgo,

ou seja, respostas vasodilatadoras ou vasoconstritoras so efetuadas conforme

o catabolismo ou anabolismo dos tecidos corporais (BERNE, 1980).

O controle miognico outro mecanismo essencial para o controle

do fluxo sanguneo. Este mecanismo explica como o MLV capaz de contrair

ou relaxar conforme as alteraes na presso transmural (BERNE, et al.,

2004). Por esta razo o MLV torna-se indispensvel no controle da resistncia

perifrica total, do tnus arterial e venoso, bem como na distribuio do fluxo

sanguneo corporal. Enfatizando o que foi descrito por Webb e Hilgers (2005), o

MLV apresenta clulas altamente especializadas contendo canais inicos e

protenas contrteis e reguladoras responsveis pe los processos de contrao

relaxamento, resultando em um equilbrio das necessidades orgnicas.

28

1.4.3 Msculo liso vascular

O msculo liso vascular (MLV) composto por clulas

histologicamente mononucleadas com formato fusiforme. Conforme o vaso e a

estrutura por ele irrigada, o arranjo de suas clulas varia entre helicoidal ou

circular. Este ltimo e mais comum arranjo o que provoca a reduo do

lmen do vaso durante o processo de contrao (ou seja, atravs desta

disposio celular o MLV contra de maneira simultnea) (BERNE et al.,2004).

Na luz vascular encontram-se as clulas endoteliais que se projetam para o

interior do MLV (junes mioendoteliais) permitindo assim, a transferncia de

ons entre si e explicando a interao entre ambas as estruturas (BERNE et

al.,2004; FLTOU e VANHOUTTE, 2006).

O MLV participa do controle da resistncia perifrica total e de

extrema importncia para que os vasos sanguneos apresentem um tnus

(estado contrado do MLV que influenciado pela mnima concentrao de

Ca2+ no interior da clula muscular lisa). Este estado de semi contrao uma

caracterstica vascular que permite os vasos modularem seu dimetro

conforme a situao metablica (MISSIANE et al., 1991). O tnus vascular

mantido por mecanismos intrnsecos do MLV, mas pode sofrer alteraes

mediadas por fatores neurognicos, biognicos endcrinos, parcrinos, alm

de outros sinais como frmacos ou liberao circulante de Ca2+ (KNOT et al.,

1996).

Para o processo contrtil do MLV, necessria interao entre os

miofilamentos (actina e miosina) e, para tanto, o aumento da concentrao de

clcio intracelular ([Ca2+]i), torna-se indispensvel (KNOT et al., 1996). Fato que

necessrio acontecer de forma oposta para que o MLV relaxe, ou seja, os

ons de clcio (Ca2+) devem ser retirados do mioplasma, por diversos

mecanismos a fim de retornar os nveis de Ca2+ as concentraes de repouso.

O Ca2+ necessrio para a contrao provm de fontes distintas: do

meio extracelular e do meio intracelular. Para acontecer o influxo destes ons a

membrana celular das clulas musculares lisas composta por diversos canais

29

que auxiliam nestes mecanismos, so eles: canais para Ca2+ operados por

voltagem (VOCCs), canais para Ca2+ operados por receptor (ROCCs); canais

operados por estoque (SOCs), e aqueles ativados por estresse mecnico

(SACs) (MCFADZEAN e GIBSON, 2002). Em relao ao Ca2+ proveniente do

meio interno da clula s possvel pela existncia dos estoques intracelulares

como o retculo sarcoplasmtico (RS), que mesmo no sendo bem

desenvolvido capaz de acumular diversos ons de Ca2+ participando na

regulao deste on no sarcoplasma (SPERELAKIS, 1993; MCFADZEAN e

GIBSON, 2002;).

No msculo liso, os principais canais para Ca2+ do tipo VOCCs so

os canais lentos ou do tipo L, caracterizados pela alta seletividade este on

(KNOT et al., 1996). Quando acontece uma despolarizao da membrana e a

consequente abertura desses canais, tem-se o aumento da [Ca2+]i com o

desenvolvimento de contrao e fora muscular, pelo deslizamento entre as

protenas contrteis (actina e miosina). Este processo conhecido como

acoplamento eletromecnico (Figura 1). A outra forma de promover a contrao

atravs da sinalizao do Ca2+, no necessita de uma despolarizao e

conhecido como acoplamento farmacomecnico que pode ser provocado por

vrios agentes que elevam o Ca2+ no interior da clula muscular lisa (Figura 1)

(HERMSMEYER et al., 1988; REMBOLD, 1992; WEBB, 2003).

30

Figura 1 Acoplamento eletromecnico e farmacomecnico do MLV. PIP2 (inositol difosfato) rMLC (cadeia leve regulatria da miosina) Adaptado de: Webb, 2003.

Conforme referido acima, o acoplamento eletromecnico depende

de uma despolarizao da membrana que deve ser suficiente para ultrapassar

o limiar de excitabilidade, gerando um potencial de ao (BERNE et al., 2004,

HERMSMEYER et al., 1988; MCFADZEAN e GIBSON, 2002). A propagao

do potencial de ao ocorre atravs dos canais juncionais (gap junctions),

acarretando na ativao dos diversos canais inicos e catinicos, promovendo

o influxo de Ca2+ para o interior da clula o que resulta na contrao da

musculatura lisa (REMBOLD, 1992; WEBB, 2003).

Este mesmo mecanismo pode ser intensificado pela liberao de

mais Ca2+ do RS atravs dos receptores de rianodina, presente nesta estrutura.

Os receptores de rianodina so compostos por estruturas tetramricas com um

grande domnio citoslico e dois segmentos transmembrana -helicoidal

(KATZ, 1996).

Quando se trata do acoplamento farmacomecnico imprescindvel

a ao de um agonista que se liga a um receptor acoplado protena G

heterotrmerica. A subunidade da protena G, ativa a fosfolipase C (FLC),

uma enzima presente na membrana plasmtica que promove a formao de

31

dois segundos mensageiros: o trifosfato de inositol (IP3) e o diacilglicerol

(DAG), atravs da clivagem do inositol difosfato (PIP2) (Figura 1). O IP3 tem

uma funo especfica de ligar-se a receptores presentes no RS o que

resultar no extravasamento de Ca2+ para o citosol atravs dos receptores de

rianodina (WEBB, 2003). Isso acarreta na contrao muscular e alterao da

fora contrtil (REMBOLD, 1992). O DAG juntamente com o Ca2+ por sua vez

responsvel pela ativao da protena quinase C (PKC) que proporciona

diversas aes dependendo do msculo liso (Figura 1) (WEBB, 2003).

Ao aumentar a [Ca2+]i do MLV, por qualquer que seja a via de

sinalizao, inicia-se a contrao muscular. O passo primordial para contrao

a ligao de quatro ons de Ca2+ com protena calmodulina (peso molecular

de 16.700 kDa), que representa cerca de 1% de todas as protenas celulares

(BERNE et al., 2004). O complexo formado entre o Ca+ e a calmodulina

estimula a quinase C dependente de calmodulina que atua fosforilando e assim

ativando a enzima quinase de cadeia leve de miosina (Figura 1) (MLCK). A

MLCK, ento, expe seu stio cataltico e fosforila o aminocido Ser19 da

cadeia leve regulatria da miosina (rMCL). Ademais, a MLCK promove a

ativao da ATPase da miosina necessria para energizar a miosina,

resultando no deslizamento entre os filamentos finos e grossos e

desenvolvendo assim, o ciclos das pontes cruzadas, a gerao de fora e

encurtamento no MLV (Figura 1) (REMBOLD, 1992).

Alm da contrao dependente de Ca2+ h outra forma de contrao

do MLV em que necessrio um aumento da sensibilizao do aparato

contrtil ao Ca2+, ou seja, aumenta-se a afinidade dos filamentos grossos e

finos para uma dada [Ca2+]. Esta sensibilizao o estgio em que uma

contrao maior produzida por uma dada [Ca2+]i (SOMYLO e SOMYLO,

1994), podendo a mesma ser positiva ou negativa dependendo da via

estimulada (KIZUB et al., 2010). Por exemplo, a sensibilizao ser maior

quando um pequeno aumento da [Ca2+]i produz uma mxima fosforilao da

rMCL (REMBOLD, 1992).

A fosforilao da rMCL, alm de ser regulada pela MLCK, tambm

sofre interferncia de uma fosfatase denominada de fosfatase da cadeia leve

32

de miosina (MCLP) (Figura 1), que responsvel pela retirada do fosfato de

alta energia que mantm o MLV no seu estgio contrado (ITO et al., 2004).

Destarte, afirma-se que o balano entre a MLCK e a MCLP so imperativos

para o estado de fosforilao da rMCL. A MCLP apresenta trs subunidades,

uma subunidade cataltica com peso de 38 kDa (PP1c) e duas regulatrias uma

com peso de 110kDa, chamada de miosina fosfatase subunidade alvo 1

(MYPT1) e outra de 20 kDa a pequena subunidade regulatria M20 (WEBB,

2003 e ITO et al., 2004). Quando se tem a fosforilao da MCLP inibi-se sua

atividade enzimtica, o que provoca a manuteno do estado contrado do

msculo (WEBB, 2003).

Algumas hipteses so estudadas para a atuao da MCLP e a

sensibilizao dos miofilamentos. Uma delas a ativao da protena

monomrica G (Rho) dependente de Rho-quinase (RhoK) (Figura 2). Estes

mecanismos promovem a fosforilazao da CPI-17 (substrato da RhoK) que

por sua vez, se liga a subunidade PP1c da MCLP o que prolonga a contrao e

a fora do msculo liso (KIMURA, et. al., 1996).

A MCLP a principal protena inibitria responsvel pelo

relaxamento da musculatura lisa vascular. A inativao desta protena gera

como conseqncia a manuteno do acoplamento entre os filamentos de

miosina e actina (KIZUB et al. 2010), o que pode acontecer atravs da ao da

RhoK e a PCK.

33

Figura 2 Representao da ativao da protena monomrica G. Rho A (protena

monomrica G) ROCK (Rho-quinase).Adaptado de: Webb, 2003.

Quanto ao relaxamento do MLV h uma perda de fora contrtil e o

retorno do msculo s condies basais. Para tanto, fundamental a reduo

da [Ca2+]i e a retirada do fosfato de alta energia da rMLC. Para que este ltimo

evento acontea precisa-se da ativao da MCLP (SOMLYO e SOMLYO,

2000) (Figura 3). A diminuio da [Ca2+]i resultado da combinao de alguns

fatores como: inativao das correntes de Ca2+, ativao da bomba Ca2+-

ATPase do RS, efluxo de Ca2+ para o meio extracelular pela bomba de Ca2+

presente na membrana celular e por fim, pelo trocador de sdio e Ca2+

(SPERELAKIS, 1993).

Com isso, afirma-se que o relaxamento vascular pode ser promovido

por inibio dos VOCCs por voltagem que provocam hiperpolarizao da

membrana ou atravs de agentes farmacolgicos que promovem o aumento de

adenosina monofosfato cclico (AMPc) e guanosina monofosfato cclico

(GMPc), ou ainda reduzir a sensibilidade do aparato contrtil ao on Ca2+

34

(REMBOLD, 1992). No mais, como descrito por Mcfadzean e Gibson (2002),

substncias como: neurotransmissores ou hormnios que provoquem

hiperpolarizao da membrana da clula muscular lisa fechando os canais para

Ca2+, promovem dilatao vascular.

Figura 3 Representao esquemtica do relaxamento do MLV. VOCC (canal de Ca2+

operados por voltagem) ROCC (canal de Ca2+

operados por receptor) Ca,Mg-ATPase (bomba de clcio) Na

+/Ca

2+ (trocador sdio-clcio). MLC (cadeia leve de miosina) Adaptado de: Webb,

2003.

Atravs do GMPc o relaxamento no msculo liso acontece por

abertura de canais para K+ o que leva a hiperpolarizao celular e

posteriormente a reduo do influxo de Ca2+ (ROBERTSON et al., 1993). Pode

atuar, tambm, ativando a bomba de Ca2+-ATPase no RS (SERCA) ou

aumentando a atividade do trocador Na2+/Ca2+ presente na membrana

citoplasmtica, tendo como consequncia a diminuio do Ca2+ intracelular

(REMBOLD, 1992; BERNE et al., 2004). Alm do mais, o GMPc capaz de

reduzir a concentrao de IP3 por inibir a FLC.

Quando se trata do acrscimo do AMPc sugere-se que o

relaxamento do MLV tambm dado pela reduo da [Ca2+]i por atuao nos

35

canais de Ca2+. Alm disso, h estudos que mostram a atuao do AMPc nos

canais de K+ ativados por Ca2+ ou ATP e/ou pela fosforilao da MLCK

(REMBOLD, 1992).

O endotlio vascular e os canais de potssio so essenciais,

essenciais no s para a manuteno do tnus, mas tambm para o

relaxamento vascular. O primeiro encontra-se na luz do vaso sanguneo e

apresenta-se como uma camada de clulas delgadas e atuante no

funcionamento vascular, sendo fonte de uma srie de substncias capazes de

promover relaxamento e contrao do MLV. Desta forma, o endotlio atua

como agente protetor contra desenvolvimento de leses nos vasos sanguneos

(CARVALHO et al., 2001). Como relatado por KATZUNG (2003) o endotlio

sintetiza xido ntrico (NO), prostaciclinas (PGI2) e o fator hiperpolarizante

derivado do endotlio (FHDE), como agentes vasodilatadores, e as

endotelinas, angiotensina II e tromboxano A2 como substncias

vasoconstritoras. Fisiologicamente, h o equilbrio entre essas substncias

sendo os efeitos dilatadores mais operantes que os contraturantes, mantendo a

homeostasia vascular (FLTOU e VANHOUTTE, 2006).

O NO um radical livre gasoso, inorgnico e altamente difusvel,

alm de ser um potente vasodilatador. formado a partir da L-arginina atravs

da atuao de uma famlia de vrias isoformas de NO sintetase, o que resulta

na formao da L-citrulina e NO. Atua como vasorelaxante por ativar a guanilil

ciclase que resulta no aumento do GMPc que atuar inibindo a MLCK. O NO

tem outra funo que a de inibir a agregao de neutrfilos ao endotlio. As

PGI2 derivada da sntese dos eicosanides tm propriedades especficas, pois

apresenta-se como vasodilatadoras e inibidoras da agregao plaquetria

(CARVALHO et al., 2001 e STANKEVICIUS, 2003).

O relaxamento dado pelas PGI2 dependente dos receptores

expressos nas clulas musculares lisas que provocam. Aps sua ativao, o

aumento de AMPc ativa os canais de potssio levando hiperpolarizao

celular, reduzindo a [Ca2+]i diminuindo, por conseguinte, a afinidade entre os

filamentos de actina e miosina (CARVALHO et al., 2001; STANKEVICIUS et al.,

2003). O mesmo fato leva a vasodilatao atravs do FHDE, estando mais

36

envolvido na promoo do relaxamento nos vasos de maiores resistncias do

que nas grandes artrias (CARVALHO et al., 2001).

As endotelinas exercem vrias aes no organismo, atravs de

diversos receptores nos tecidos, destacam-se nos vasos sanguneos, corao,

rins, pulmes e sistema nervoso central. Causam uma vasoconstrio dose

dependente e aes inotrpicas e cronotrpicas positivas. Apresentam

tambm, ao sobre os rins inibindo a excreo de sdio e gua e provocam

vasocontrio no msculo liso traqueal e brnquico. Esto envolvidas na

proliferao e na hipertrofia das clulas vasculares (FLTOU e VANHOUTTE,

2006). Apresentam-se sobre diferentes isoformas endotelina 1, 2 e 3, sendo a

primeira o mais potente vasoconstritor (CARVALHO et al., 2001).

A angiotensina II outra substncia que promove contrao do MLV.

Atua, principalmente em seus receptores AT1 que encontram-se ligado

protena G que ativa a FLC aumentando a concentrao de DAG e IP3

elevando a [Ca2+]i e por fim, tendo a contrao vascular. Pelo exposto, nota-se

que o entendimento da fisiologia cardiovascular importante para

compreenso dos avanos das pesquisas cientficas que visam ao tratamento

de distrbios orgnicos como a Hipertenso Arterial Sistmica (HAS),

utilizando-se, principalmente, das plantas medicinais e seus efeitos

cardioprotetores.

1.4.4 Msculo liso vascular e canais de potssio

Os canais para potssio so estruturas tetramricas que contm seis

unidades transmembranas, conforme descrito por KO e colaboradores (2008).

Desempenha diversos papis como: liberao de neurotransmissores,

hormnios e excitabilidade celular e na reatividade do MLV, estando

diretamente relacionados com os mecanismos que envolvem estmulos

vasoconstritores e vasorrelaxantes alm do prprio tnus vascular (GHATTA,

37

et al., 2006). Nos vasos, existem quatro tipos de canais de potssio, sendo

classificados em dependente e no dependente de voltagem. Na primeira

categoria so includos os canais de potssio dependente de voltagem e os

canais ativados por Ca2+, e na segunda os canais sensveis a ATP e os

retificadores de potssio.

Os canais ativados por voltagem (Kv) so responsveis pelo efluxo

de potssio em reposta a despolarizao da clula muscular lisa, retornando o

potencial ao seu repouso, esto diretamente relacionados com a manuteno

do tnus do vaso. Vrias substncias so utilizadas para o bloqueio destes

canais, dentre os quais destaca-se, a 4-aminopiridina (4-AP). Quando isso

acontece tem-se a manuteno da despolarizao do MLV (STANDEN e

QUALE, 1998; KO et al., 2008).

O segundo tipo de canais de potssio ativados por alteraes no

potencial de repouso so os ativados por Ca2+ (KCA) os que mais predominam

no MLV. Conforme exposto por Ghatta e colaboradores (2006) foram os

primeiros canais de potssio a serem estudados, devido a sua influncia sobre

o tnus vascular. So ativados pela [Ca2+]i e pela despolarizao, sendo

responsveis pela manuteno do potencial de membrana em vasos de

pequeno calibre. Por terem grande atuao no sistema cardiovascular, diversas

substncias que so uti lizadas para fins teraputicos apresentam ao direta

sobre esses canais, tanto provocando sua abertura ou seu fechamento

(GHATTA et al., 2006). Uma das principais substncias uti lizadas para o

bloqueio destes canais o tetraeti lamnio (TEA) (KO et al., 2008).

Os canais sensveis a ATP (KATP) se apresentam como uma forma

de complexos octamricos e foram os primeiros a serem estudados no sistema

cardiovascular, estando relacionados com diversas patologias, como por

exemplo, HAS, diabetes e angina. Alguns bloqueadores so utilizados com

finalidade teraputica, dentre os quais destaca-se a glibenclamida (GLY) que

atua nesses canais de potssio resultando na despolarizao das clulas que,

como, por exemplo no pncreas, leva ativao das clulas pancretica e

liberao de insulina pelas mesmas. Como exposto por Nelson (1990) este

canais no MLV so fundamentais j que quando so ativados provocam a

38

hiperpolarizao celular, inibindo a entrada de clcio provenientes do meio

extracelular.

Por fim, os canais de potssio retificadores (K IR) que no MLV h

evidncias que eles so responsveis pela manuteno do potencial de

membrana e pelo tnus em vasos de pequenos calibres (PARK et al., 2007a,b).

Pelo exposto, percebe-se a importncia desses canais na manuteno do

funcionamento ideal dos vasos sanguneos.

1.4.5 Atividade cardiovascular de terpenos

So poucos os dados na literatura que relatam os possveis efeitos

hipotensores e/ou anti-hipertensivos dos OEs (ou de seus respectivos constituintes) e

menos ainda, no que diz respeito aos seus mecanismos de ao no sistema

cardiovascular. Esses estudos podem vir a corroborar com o uso das plantas

aromticas, na medicina popular, para o tratamento de diversas patologias, inclusive

da hipertenso arterial sistmica, cuja prevalncia alta em nossa sociedade.

Na literatura internacional, existem alguns relatos a cerca dos efeitos

cardiovasculares de OEs de algumas plantas aromticas abundantes na regio do

Norte-Nordeste do Brasil com largo uso na medicina popular. So os OEs presentes

no Croton nepetaefolius Baill. (Euphorbiaceae) (marmeleiro vermelho), Mentha x

villosa Huds. (Labiatae) (menta rasteira), Alpinia zerumbet Burt e Smith

(Zingiberaceae) (sin: Alpinia speciosa Schum) (colnia), Croton zehntneri Pax et Hoffm

(Euphorbiaceae) (canela de cunh), Ocimum gratissimum L (Labiatae) (alfavaca) e a

Aniba canelilla Mez (Lauraceae) [Syn. A. Elliptica A.C. SM., Cryptocarya canelilla

Kunth] (casca-preciosa).

Foi mostrado que a administrao intravenosa (i.v.) do OECn, OEMv,

OEAz, OECz, OEOg e OEAc induz reduo dose-dependentes da PAM e da

freqncia cardaca (FC) em ratos normotensos (LAHLOU et al., 1996a, 1999, 2001,

2002c,d, 2004c, 2005; de SIQUEIRA et al., 2006a,b) ou hipertensos, DOCA-sal

(LAHLOU et al., 1996b, 2000, 2002a, 2003; INTERAMINENSE et al., 2005),

acordados. Efeitos similares foram observados aps o tratamento i.v. com os

principais constituintes desses OEs tais como 1,8-cineol (LAHLOU et al., 2002b), o

39

metil-eugenol (LAHLOU et al., 2004a), o eugenol (LAHLOU et al., 2004b), o xido de

piperitenone (LAHLOU et al., 2001, 2002a; GUEDES et al., 2002), o anetol (de

SIQUEIRA et al., 2006a), o estragol (de Siqueira et al., 2006a), 4 terpineol (LAHLOU

et al., 2002c, 2003) e o 1-nitro-2-feniletano (de SIQUEIRA et al., 2010;

INTERAMINENSE et al., 2010), sugerindo que os efeitos cardiovasculares do OECn,

OEMv, OEAz, OEAc, OECz e OEOg podem ser parcialmente atribudos as aes

do(s) seu(s) respectivo(s) principal(ais) constituinte(s). Um conjunto de argumentos

decorrentes de experimentos realizados tanto in vivo quanto in vitro sugere que o

efeito hipotensor desses OEs assim como de seus principais constituintes resulta, em

grande parte, de seus efeitos vasodilatadores diretos sobre a musculatura lisa

vascular (LAHLOU et al., 1999, 2000, 2001, 2002a,b,c,d, 2003, 2004a,b,c, 2005; de

SIQUEIRA et al., 2006a; INTERAMINENSE et al., 2007; MAGALHES et al., 2008;

PINTO et al., 2009). Entretanto, o mecanismo envolvido na mediao da hipotenso e

bradicardia induzidas pelo OECz (i.v.) em ratos normotensos difere daquele dos

demais OEs estudados at hoje. De fato, estudos recentes mostraram que a

hipotenso induzida pelo OECz assim como seus principais constituintes, anetol e

estragol, so principalmente de origem reflexa (reflexo vago-vagal) atravs da

estimulao dos receptores vaniloides (TPRV1) localizados nas fibras sensoriais

vagais (de SIQUEIRA et al., 2006b). Aps sua injeo intra-arterial, o OECz foi ainda

capaz de provocar uma hipotenso reflexa de origem espinhal, como foi mostrado por

capsaicina (de SIQUEIRA et al., 2006b).

Tambm foi demonstrado que a injeo i.v. do 1-nitro-2-feni letano

induziu uma queda de PAM e FC, bifsica: o primeiro componente (fase 1)

rpido e foi caracterizado como um reflexo vago-vagal, o segundo componente

(fase 2) ocorre mais tardio e parece ser decorrente de uma ao direta desse

constituinte na musculatura lisa vascular. A fase 1 induzida pelo o 1-nitro-2-

feniletano est ausente aps injeo direta no ventrculo esquerdo,

completamente abolida pela bivagotomia ou o pr-tratamento perineural com a

capsaicina, mas permaneceu inalterada pelo o pr-tratamento com o

antagonista dos receptores vanilides TPRV1, capsazepina ou com o

antagonista dos receptores serotoninrgicos 5-HT3, ondansetron. Em ratos

normotensos acordados, a hipotenso e bradicardia (fase 1) induzida pelo 1-

nitro-2-feniletano foi completamente abolida pelo pr-tratamento com

metilatropina. Em preparaes articas oriundas de ratos normotensos, 1-nitro-

2-feni letano induziu um relaxamento, dependente da concentrao da

40

contrao induzida por fenilefrina (FE) (de SIQUEIRA et al., 2010). Estes

dados sugerem que o reflexo vago-vagal induzido pelo 1-nitro-2-feniletano

iniciado nas aferncias vagais pulmonares e no nas cardacas. O mecanismo

de transduo deste reflexo ainda no est definido, e parece no envolver a

ativao dos receptores vanilides nem os receptores serotoninrgicos 5-HT3

localizados nos nervos vagais sensoriais. A fase 2 da resposta hipotensora do

1-nitro-2-feniletano parece esta mediada, pelo menos em parte, atravs de um

mecanismo vasodilatador perifrico (de SIQUEIRA et al., 2010). Efeitos

similares do 1-nitro-2-feni letano foram tambm observados em ratos

espontaneamente hipertensos (SHRs) segundo o mesmo mecanismo de ao

daquele mencionado acima em ratos normotensos (INTERAMINENSE et al.,

2010).

Quando se faz meno ao OE que extrado do OEAr pouco se sabe sobre

seus efeitos biolgicos e/ou farmacolgicos e principalmente no sistema

cardiovascular. Quimicamente este leo apresenta um teor muito elevado de um

monoterpeno alcolico, j citado, que o linalol. No OEAr a porcentagem de linalol

varia entre 74 a 96% de todo o leo, este variao acontece, como os demais OEs,

em conseqncia a localidade em que encontrada planta matrix, alm da forma da

coleta (ALCNTARA, YAMAGUCHI E JUNIOR-VEIGA,2010).

41

1.5 Atividade Biolgica e Farmacolgica do Linalol

O linalol um constituinte encontrado alm da Aniba rosaeodora

(conhecida popularmente como pau rosa) em diversas plantas presentes nas

regies Norte e Nordeste do Brasil tais como: Piper crassinervium, Croton

cajucara Benth e Hyssopus officinalis L. var. decumbens. O linalol um

monoterpeno de extrema importncia para as indstrias de cosmticos e

alimentcios, j que utilizado, como fixador de fragrncias (BAKKALI, et al.,

2008).

Quimicamente, o linalol, (3,7-Dimethyl-1,6-octadien-3-ol) apresenta-

se como um monoterpeno alcolico tercirio de cadeia aberta (Figura 4) com

frmula molecular C10H18O. Possui peso molecular 154,3 com densidade 0,86

g/ml (SIGMA ALDRICH, 2003), tendo ponto de ebulio de aproximadamente

198 a 199C.

Figura 4 - Estrutura qumica do linalol. Monoterpeno alcolico tercirio de cadeia aberta e suas unidades isoprenicas Fonte: Usta et al., 2009.

Diversos estudos demonstraram que linalol um constituinte que

medeia em parte a atividade antiinflamatria e antinociceptiva (BIGHETI, et al.,

1999; HIRUMA-LIMA et al., 2000; PEANA et al., 2003; PEANA et al., 2004a; e

BATISTA et al., 2010). Conforme descrito por Peana e colaboradores (2003 e

42

2004a) a administrao do linalol induz e feito antinociceptivo e antiinflamatrio

em diferentes modelos experimentais, inibindo o edema de pata pela

carragenina e reduzindo a dor induzida por diferentes estmulos tais como

contores, em resposta ao cido actico, placa quente e injeo de formalina.

Seu efeito antinociceptivo parece envolver a transmisso glutamatrgica,

dopaminrgica e opiide sem excluir a participao dos canais de potssio

sensveis a ATP (PEANA et al., 2004b) nem a participao dos receptores da

adenosina A1 e A2 (PEANA et al., 2006a) neste efeito. Foi mostrado que a

reduo da liberao/produo do NO , em parte, responsvel pelo

mecanismo molecular da atividade antinociceptiva do linalol (PEANA et al.,

2006b).

Este monoterpeno, quando administrado tanto por via perifrica

quanto central, tambm foi responsvel pela antinocicepo em camundongos,

por inibir a dor causada por glutamato, mostrando que h envolvimento dos

receptores glutaminrgico, nesta ao (BATISTA et al., 2008). O linalol tambm

j teve seu efeito testado na dor neuroptica causada por ligadura do nervo

perifrico. Seu efeito foi de reduzir, temporariamente, a dor mecnica quando

administrado por sete dias consecutivos (BERLIOCCHI et al., 2009).

Apresenta tambm, efeito anestsico local inibindo neurnios do

sistema nervoso central e sensorial (NARUSUYE et al., 2005). O OEAr produz

diminuio na excitabilidade neuronal evidenciada pela reduo da amplitude

de potencial de ao provavelmente dada pelo seu maior constituinte, o linalol,

em preparao de nervo isolado de rato (de ALMEIDA et al., 2009). Afirmao

confirmada por Leal-Cardoso e colaboradores (2010) em que o linalol agiu no

sistema sensorial somtico bloqueando canais de sdio dependente de

voltagem em nervo citico de ratos apresentando com isso, atividades

anestsicas locais. O mesmo foi observado em nervos citico de rs

(ZALACHORAS, et al., 2010).

Re e colaboradores (2000) relataram o efeito do linalol na juno

neuromuscular do diafragma. Segundo esta pesquisa o composto em questo

atua reduzindo a eficcia do impulso nervoso na liberao de acetilcolina,

tendo atuao no neurnio pr-sinptico, o que sugere a atuao do linalol

sobre os canais dependentes de voltagens como sdio e/ou potssio na juno

neuromuscular.

Outros efeitos tambm foram listados para o linalol tais como: anti -

leishmaniose (ROSA et al., 2003) e anti-microbiano, podendo ser utilizado no

combate aos microorganismos causadores de infeces hospitalares,

principalmente em pacientes imunocomprometidos, destacando-se neste grupo

os portadores de HIV e transplantados (ALVIANO, et al., 2005).

Dependendo da dose o linalol, apresenta efeitos anticonvulsivantes

por ser agonista de receptores ionotrpicos de NMDA (BRUM et al., 2001).

43

Alm destas propriedades apresenta aes hipnticas e hipotrmicas. Alm

disso, o linalol apresentou aes sedativas, quando inalado por cerca de 1h,

sem trazer comprometimento nas funes motoras de camundongos (LINCK et

al., 2009). Este mesmo efeito foi evidenciado em ratos pela potencializao

de tempo de sono induzido pelo pentobarbital (de ALMEIDA et al., 2009).

No que se refere a toxicidade do linalol sua dose letal baixa,

quando comparada a outros constituintes dos OEs, tornando-se, por este

motivo, alvo de estudos para futuramente possuir aplicabilidade teraputica. As

pesquisas dos efeitos txicos das substncias esto relacionadas com via de

administrao, tempo, durao e frequncia da dose, o que foi demonstrado

por Venncio (2006). O linalol apresentou baixa toxicidade aguda em vrios

modelos experimentais e com diferentes vias de administrao (BICKERS et

al., 2003) o que justifica o interesse deste constituinte em diversas reas da

cincia bsica.

Estudos em humanos comprovaram que a estimulao olfatria pela

inalao do ch de jasmim, rico em linalol induz uma bradicardia e tem efeito

sedativo sendo este constituinte responsvel por tal ao (KUDORA et al.,

2005). A estimulao olfatria com o linalol em ratos anestesiados reduz a

presso arterial via ativao dos receptores histaminrgicos H3 centrais

(TANIDA et al., 2006).

Sabendo-se das diversas aes biolgicas do linalol, pouco se

explorou sobre seus efeitos no sistema cardiovascular e menos ainda no MLV

por isso a necessidade de estud-lo. Sobretudo do ponto de vista de seus

mecanismos de ao sobre o MLV, abrindo espao para descoberta de novas

substncias farmacologicamente ativas.

44

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral:

Estudar os efeitos cardiovasculares do linalol em ratos normotensos.

2.2 Objetivos Especficos:

Estudar os efeitos do linalol sobre a presso arterial mdia e a

freqncia cardaca de ratos anestesiados;

Averiguar oefeito do linalol sobre a contratilidade de preparaes de

aorta isolada;

Verificar a influncia do dos canais de potssio na mediao dos efeitos

vasculares do linalol;

Analisar a influncia do Ca2+ extracelular sobre o efeito do linalol na

contratilidade vascular;

45

3 MATERIAS E METDOS

3.1 Animais

Foram utilizados ratos Wistar machos, adultos normotensos provenientes

do Biotrio da Universidade Federal do Cear (UFC), situado no Campus do PICI. Os

ratos possuam pesos entre 250 e 350 g, foram mantidos sob condies de

temperatura constante (22 2 C) com ciclo claro escuro padro (12 horas claro/12

horas escuro), gua e alimento ad libitum. Os experimentos foram realizados

conforme o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, publicado pelo US

National Institute of Health (NIH publicaes 85-23, revisado em 1996) em anlise

pelo Comisso de tica para Uso de Animais da Universidade Estadual do Cear

(CEUA UECE), sob o n do processo: 10244898 1.

3.2 Extrao do Linalol

O linalol que ser utilizado neste estudo foi isolado a partir do OEAr

atravs de tcnicas cromatogrficas pela equipe do Prof. Dr. Jos Guilherme Soares

Maia (Faculdade de Engenharia Qumica e de Alimentos, Universidade Federal do

Par, Belm, PA). O grau de pureza do linalol de 99,5%.

3.3 Solues e Drogas

Para os experimentos in vitro o linalol (forma levgira) foi dissolvido em

soluo de Krebs Henseleit (KB) e Tween 80 (0,5%) e homogeneizado imediatamente

antes do uso. As outras substncias tais como fenilefirna (FE), Acetilcolina (ACh),

dimetilsulfxido (DMSO), cido etileno glicol-bis (-amino ter) N,N,N,N,-tetraactico

(EGTA), 4-AP e TEA (Sigma Chemical Co.) foram dissolvidos em gua destilada ou

em DMSO conforme as recomendaes da prpria indstria. O meio de perfuso que

46

foi usado foi a soluo de KB, contendo em mM: NaCl 118,4; KCl 4,75; KH2PO4 1,18;

NaHCO3 25; MgSO4 1,18; CaCl2 1.9 e glicose 5. Solues de meio de perfuso sem

Ca2+ foram preparadas omitindo a adio do CaCl2 na soluo de KB com ou sem

adio de EGTA 1mM. A soluo nutritiva foi mantida aereda com carbognio,

temperatura de 37C e o pH ajustado para 7,4 atravs de HCl 1M ou NaOH 1M.

A adio de linalol ou das outras substncias foi realizadas de forma direta

no banho onde os volumes especficos foram calculados a fim de atingir as

concentraes finais desejadas nas cmaras de banho para rgos isolados.

3.4 Experimento in vivo

3.4.1 Cateterizao dos animais

Os ratos foram anestesiados com injeo intraperitoneal de pentobarbital

(50mg/kg, i.p.) Em seguida, dois cateteres heparinizados (125 Ul/ml em salina

isotnica), foram implantados a aorta abdominal (para registro da PA e da FC), e na

veia cava inferior (para administrao de drogas), atravs da artria e veia femoral

esquerda, respectivamente; ambos 1 cm abaixo da artria renal, como descrito

previamente (LAHLOU et al., 1990). Posteriormente, os animais alojados em gaiolas

individuais receberam uma injeo intramuscular de penicilina (24000 Ul). Todos os

experimentos de registro cardiovascular foram realizados 48 horas aps o

procedimento cirrgico.

3.4.2 Sistema de Registro

No momento do experimento, o cateter arterial foi conectado a um

transdutor de presso fisiolgica (MLT844, ADInstruments) acoplado a um polgrafo

digital PowerLab (PowerLab 8/30, modelo ML870, ADInstruments, Bella Vista, NSW,

Austrlia) ligado a um amplificador de sinal (Octal Bridge Amplifier, modelo ML228). A

PAM foi calculada como diastlica +[(sistlica-diastlica)/3]. A FC assim como a PAM

foram obtidas atravs do uso do Software ChartTM v5.5.4 com o sinal obtido do

transutor.

47

3.4.3 Protocolos experimentais

Para delinear as respostas cardiovasculares ao linalol foi utilizado o

seguinte protocolo. Ratos foram anestesiados com pentobarbitl sdico (50mg/kg, i.p.),

suplementado sempre que necessrio (15mg/kg). O animal encontrava-se em posio

supina respirando espontaneamente atravs de um traquestomo.

Antes de cada experimento, foi permitida a estabilizao da PAM e FC por

um perodo de 15 a 20 min. Dessa forma, foram identificados os valores basais

desses parmetros. As suas eventuais alteraes desses parmetros foram

monitoradas por um perodo de 10 min ps-injeo. O linalol foi injetado manualmente

em bolus no volume de 0,1 ml, seguido de injeo de 0,2 ml de soluo salina. Cada

animal recebeu uma srie crescente de doses (1,5,10 e 20 mg/kg, n=6) atravs do

cateter intravenoso e o curso temporal das alteraes de PAM e FC foi registrado, Um

procedimento similiar foi realizado em outro grupo de ratos (n=7) que foram

submetidos, 15 min antes, a uma bivagotomia realizada ao nvel cervical.

3.5 Experimentos In vitro

3.5.1 Registro da atividade contrtil em aorta isolada

Os animais foram sacrificados por cmara de CO2, seguida por pesagem e

dissecao. Este ltimo ocorreu mediante a inciso ventral e abertura da caixa

torcica por exciso do esterno e de parte das costelas foi possvel a visualizao e

retirada dos rgos intratorcicos para o acesso aorta torcica que ser transferida

para uma placa de Petri com soluo nutritiva de KB, para porvindoura remoo do

tecido adiposo e do tecido conectivo aderido.

Aps a limpeza, a aorta foi seccionada em anis (4 a 5 mm de

comprimento). Em seguida foi suspensas em banhos para rgo isolado (5 ml),

contendo o meio de perfuso a 37 C (pH = 7,4), aerado continuamente com soluo

48

carbognica, 95% O2 e 5% CO2. As preparaes de aorta foram contradas com uma

tenso passiva de 1 g. Esta tenso foi registrada atravs de um transdutor de fora

isomtrico atravs de fixadores de ao inoxidvel ligados a um fio de algodo e a

outra extremidade a uma base fixa.

Os sinais eltricos captados pelo transdutor foram decodificados e digitalizados

pelos hardwares PowerLab - Data Acquisition Systemse Quad Bridge

Amp (ADInstruments). Os registros dos protocolos de contrao da

musculatura lisa foram obtidos atravs do software LabChart 7 (ADInstruments)

para anlise posterior (Figura 05).

Figura 5 Sistema de registro das contraes mecnicas. Foto: LAFAMULI- Laboratrio de Farmacologia do Msculo Liso- UFC, 2010.

Aps a montagem, as preparaes foram submetidas a um perodo de

estabilizao (cerca de 60 minutos) tempo necessrio para adaptao da preparao

s novas condies. Ao trmino deste perodo foi considerado que a preparao

atingiu seu novo tnus basal.

49

3.5.2 Protocolos experimentais

Para todos os experimentos, descritos a seguir, existiram preparaes

controles e experimentais que foram submetidas aos mesmos protocolos e condies.

Os experimentos foram iniciados com uma contrao controle induzida pela adio de

60mM de cloreto de potssio (K60) ao banho com o intuito de averiguar a viabilidade

do tecido. Quando duas contraes controles, sucessivas, mostraram amplitudes

similares, a preparao foi considerada vivel para o experimento. Para avaliar a

integridade do endotlio, cada preparao foi pr-contrada por FE (0,1 M) e quando

a amplitude da contrao estava estvel a preparao foi exposta Ach na

concentrao de 1M. O endotlio foi considerado intacto se a ACh administrada

fosse capaz de induzir um relaxamento da musculatura lisa da aorta maior que 50%

da contrao, preexistente.

Para avaliar se a atividade vasorrelaxante do linalol foi dependente do

endotlio, os experimentos foram realizados em anis sem endotlio, que foi removido

mecanicamente, imediatamente aps disseco, por uma suave frico do lmen da

aorta com um fio de ao inoxidvel. A ausncia do efeito vasorrelaxante induzido pela

ACh foi tomada como uma evidncia de que a preparao foi efetivamente desnudada

do endotlio.

Srie 1: Nesta srie, os efeitos relaxantes de concentraes crescentes do

linalol (1-5000 M) sobre a contrao mantida por K+ (80 mM) ou FE (0,1 M) foram

estudadas (figuras 6, 7 e 8), em preparaes de aorta com ou sem endotlio mantidas

em com Ca2+ nos experimentos realizados com o K+ e com endotlio quando o agente

contraturante foi a FE. O efeito do veculo tambm foi analisado. O linalol e veculo

foram adicionados de forma cumulativa.

Figura 6 Representao esquemtica do efeito relaxante do linalol em contraes sustentadas por K80 com endotlio.

50

Figura 7 Representao esquemtica do efeito relaxante do linalol em contraes

sustentadas por K80 sem endotlio.

Figura 8 Representao esquemtica do efeito relaxante do linalol em contraes

sustentadas por FE (0,1 M) com endotlio.

Srie 2: Aps verificar a responsividade do tecido pela induo de uma

contrao por K60, a preparao de anis de aorta foi mantida em uma soluo de KB

sem CaCl2 e com quelante de Ca2+ (EGTA 1mM). Em seguida, a preparao foi lavada

com soluo de KB sem Ca2+ e depois foi acrescentado ao banho, K60 e realizada

uma curva concentrao-efeito ao Ca2+ pela adio de concentraes crescentes e

cumulativas de CaCl2 (0,1; 0,3; 1; 3; 10 e 20 mM). Esta curva foi tomada como

controle. A preparao ento foi novamente lavada com KB com Ca2+ e EGTA (1 mM)

e uma nova curva concentrao-efeito para o Ca2+ foi realizada, porm na presena de

100, 300 ou 1000 de linalol. As curvas concentrao-efeito obtidas em presena

de linalol foram quantificadas e comparadas com a curva controle, ou seja, sem a

presena do constituinte em estudo (figura 9).

Figura 9 Representao esquemtica do efeito do linalol sobre as contraes de CaCl2 na presena de K60 sem Ca

2+.

Srie 3: Nesta serie, o papel dos canais de potssio na mediao dos

efeitos vasorrelaxantes do linalol foi investigado. Para isso, os efeitos relaxantes do

linalol (1-5000 M) foram estudados em preparaes incubados 30 min precedentes

51

adio do linalol com um dos seguintes inibidores dos canais de potssio: TEA (5 mM)

(figura 10) e 4 AP (3 mM) (figura 11). As mudanas no tnus vascular foram expressas

como porcentagem da contrao induzida por FE.

Figura 10 Representao esquemtica do efeito do linalol sobre a contrao sustentada

induzida por FE na presena de bloqueadores de canais de potssias (TEA 5mM).

Figura 11 Representao esquemtica do efeito do linalol sobre a contrao sustentada induzida por FE na presena de bloqueadores de canais de potssias (4-AP 3mM)..

3.6 Anlise Estatstica

Todos os resultados foram expressos como mdia erro padro da

mdia (EPM, n = 3-6 por grupo). O valor da EC50 (mdia geomtrica 95%

intervalo de confiana), definido como a concentrao do linalol (M) requerida

para produzir 50% da reduo da resposta mxima da contrao induzida por

K+ (ou FE), foi utilizado para avaliar a sensibilidade vascular para este

monoterpeno. A significncia (P < 0,05) dos resultados foi determinada pelo

uso de testes t de Student (pareado ou no pareado) e anlise de varincia a

uma via (concentraes ou grupos) ou duas vias (tratamento x doses ou

tratamento x concentraes), seguida pelo teste de contraste (Dunnett or

Holm-Sidak) quando apropriado. Os dados foram analisados atravs do

programa Sigma Plot 10 e o Sigma Stat 3,5.

52

4. RESULTADOS

4.1 Experimentos in vivo

Estudo dos efeitos cardiovasculares do linalol em ratos anestesiados:

influncia da vagotomia bilateral

Em ambos os grupos, intactos e bivagotomizados, os nveis basais

da PAM e FC, antes das injees de qualquer uma das doses do linalol,

permaneceram estveis durante todo o perodo do registro (P > 0,05; ANOVA

uma via). Portanto, os valores mdios da PAM e da FC basais em ratos

anestesiados foram 108,2 6,2 mmHg e 368 15 batimentos/min (bpm),

respectivamente (n = 13 ratos). Em ratos intactos, injees intravenosas de

doses crescentes do linalol (1, 5, 10 e 20 mg/kg) induziram uma hipotenso e

bradicardia (fase 2) dose-dependentes (P < 0,01; ANOVA a uma via) que se

tornaram significativas (P < 0,01, teste t de Student pareado) partir de 1

(Figura 12) e 5 (Figura 13) mg/kg, respectivamente. Apenas nas doses de 10

(Figura 14) e 20 mg/kg (Figura 15), as respostas hipotensoras e

bradicardizantes do LIN foram bifsicas (Figura. 16). O primeiro componente

(fase 1) foi rpido com um tempo de latncia oscilando entre 1,4-2,7 segundos,

j o segundo componente (fase 2) ocorre mais tardiamente com um tempo de

latncia oscilando entre 4,8-11,1 segundos. A tabela 1 mostra os valores

mdios do tempo de latncia, em segundos, para a induo dos efeitos

hipotensores e bradicardizantes (fases 1 e 2) do linalol nas doses estudadas

em ratos intactos ou submetidos bivagotomia cervical. Vale salientar que em

ratos intactos, o tempo de latncia da fase 2 para hipotenso e bradicardia

similar quele registrado em ratos bivagotomizados (6,1-13,3 segundos).

53

Na dose de 10 mg/kg, a PAM e FC permaneceram

significativamente (P < 0,05, teste de Dunnett) reduzidos a 1 (37,37 4,65 e -

16,55 3,63%, respectivamente), 3 (-31,23 6,17 e -16,18 3,21%,

respectivamente) e 5 (-16,20 4,72 e -12,79 2,96%, respectivamente) min

aps da administrao. J na dose de 20 mg/kg, a PAM e FC permaneceram

significativamente (P < 0,05, teste de Dunnett) reduzidos a 1 (-59,11 3,34 e -

31,36 3,01%, respectivamente), 3 (-49,04 9,08 e -30,54 4,06%,

respectivamente), 5 (-35,91 10,05 e -30,78 8,38%, respectivamente) e 10 (-

18,62 5,81 e -15,31 2,16%, respectivamente) min aps da administrao.

Em ratos bivagotomizados, injees intravenosas de doses

crescentes do linalol (1, 5, 10 e 20 mg/kg) induziram uma hipotenso e

bradicardia (fase 2) dose-dependentes (P < 0.01, ANOVA a uma via) que se

tornam significativas tambm nas doses de 1 (Figura 12) e 5 (Figura 13) mg/kg,

respectivamente. Entretanto, a fase 1, para hipotenso e bradicardia, induzidas

pelo linalol nas doses de 10 (Figura 14) e 20 mg/kg (Figura 15) foi

complemente abolida (P < 0,01, teste t de Student pareado) em ratos

bivagotomizados. Isto no foi verificado para a fase 2.

54

Figura 12: Mudanas mximas da presso arterial media (PAM) e da freqncia cardaca

(FC) induzidas pela administrao int ravenosa do linalol (1 mg/kg) em ratos anestesiados

antes ou depois da bivagotomia. Os dados (media EPM) foram expressos em porcentagem

dos valores basais (n = 6-7 ratos por grupo). *P < 0,05 pelo o teste t de Student pareado vs. os

valores basais.

55


(FC) induzidas pela administrao int ravenosa do linalol (5 mg/kg) em ratos anestesiados

antes ou depois da bivagotomia. Os dados (media EPM) foram expressos em porcentagem

dos valores basais (n = 6-7 ratos por grupo). *P < 0,05 pelo o teste t de Student pareado vs. os

valores basais.

56


(FC) induzidas pela administrao intravenosa do linalol (10 mg/kg) em ratos anestesiados

antes ou depois da bivagotomia. A fase 1 da hipotenso e bradicardia do linalol foi

completamente abolida (#P < 0,01, teste t de Student pareado) pela bivagotomia. Os dados

(media EPM) foram expressos em porcentagem dos valores basais (n = 6-7 ratos por grupo).

*P < 0,05, **P < 0,01 pelo o teste t de Student pareado vs. os valores basais.

57


(FC) induzidas pela administrao intravenosa do linalol (20 mg/kg) em ratos anestesiados

antes ou depois da bivagotomia. A fase 1 da hipotenso e bradicardia do linalol foi

completamente abolida (#P < 0,01, teste t de Student pareado) pela bivagotomia. Os dados

(media EPM) foram expressos em porcentagem dos valores basais (n = 6-7 ratos por grupo).

*P < 0,05, **P < 0,01 pelo o teste t de Student pareado vs. os valores basais.

58

Doses do LIN

(mg/kg, i.v.) 1 5 10 20

Ratos intactos

Fase 1

Hipotenso AUSENTE AUSENTE 2,75 0,10 1,82 0,06

Bradicardia AUSENTE AUSENTE 2,06 0,21 1,36 0,49

Fase 2

Hipotenso 5,87 0,15 8,46 0,60 10,18 0,50 11,13 0,47

Bradicardia 4,83 0,16 6,21 0,57 7,28 0,33 7,41 0,49

Ratos

submetidos

bivagotomia

Fase 1

Hipotenso AUSENTE AUSENTE AUSENTE AUSENTE

Bradicardia AUSENTE AUSENTE AUSENTE AUSENTE

Fase 2

Hipotenso 7,50 0,38 9,43 0,35 11,07 0,43 13,29 0,31

Bradicardia 6,14 0,28 7,64 0,40 8,57 0,48 10,71 0,61

Tabela III: Valores mdios do tempo de latncia (em segundos) para a induo dos efeitos

hipotensores e bradicardizantes (fases 1 e 2) pelo linalol (LIN) intravenoso (i.v.) nas doses

estudadas, em ratos intactos ou submetidos bivagotomia cervical. Os dados foram expressos

em media EPM. (n = 6-7 ratos por grupo).

59

Figura 16: Traado representativo mostrando as alteraes bifsicas na presso arterial mdia

(A: PAM) e na freqncia cardaca (B: FC) induzidas pela administrao intravenosa de linalol

(10mg/Kg) em ratos anestesiados. A seta indica o momento da injeo. B.p.m (batimentos por

minutos.

4.2. Experimentos in vitro

Efeito relaxante do linalol sobre a contrao sustentada e induzida por

potssio em anis de artria aorta isolada de ratos.

Esta srie experimental teve como finalidade estudar o efeito do

linalol sobre o acoplamento eletromecnico. Nas preparaes com o endotlio

intacto, o linalol (1- 5000 M, n=6) relaxou completamente a contrao induzida

60

e sustentada por K80 de maneira dependente de concentrao, um efeito que

tornou significante a parir da concentrao de 100 M, (p

61

Em relao aos experimentos realizados sem a presena do endotlio vascular, percebe-se que o relaxamento produzido pelo linalol foi

significante a partir da concentrao 300 M (p

62

Linalo l ( M )

1 10 100 1000 10000

% C

on

trao

K+ (

80m

M)

-20

0

20

40

60

80

100

120

EN D + (n = 6)

C TR L EN D + ( n =3)

EN D - (n= 7)

C TR L EN D - (n= 4)

Figura 19: Efeito do linalol (1- 5000 M) na reverso da contrao induzida e mantida por K +

(80mM) em aorta isolada de ratos com e sem END. Os crculos cheios representam o grupo experimental (n = 6) e os crculos vazados o grupo controle (n = 3). J os quadrados cheios

representam o grupo experimental (n = 7) e os quadrados vazados o grupo controle (n = 4). Os resultados foram expressos em % da resposta mxima da contrao mdia % EPM%. n= nmero de experimentos. O smbolo * representa significncia estatstica para p < 0,05 em

relao ao controle (ANOVA, Holm-Sidak). O eixo y representa a % da contrao do K+

80 mM e o eixo x representa as concentraes aplicadas de linalol.

Efeito relaxante do linalol sobre a contrao sustentada de fenilefrina em

artria isoloda de ratos.

O linalol tambm foi capaz de reverter contrao produzida por

fenilefrina (0,1 M). Este constituinte foi adicionado de forma cumulativa sobre o

plat da contrao de fenilefrina (1-5000 M) (figura 13). O relaxamento obtido

M (p

63

Linalo l ( M )

0,1 1 10 100 1000 10000

% C

on

trao

FE

(0,1

M)

-20

0

20

40

60

80

100

120

EN D + (n= 4)

C TR L EN D + (n=3)

Figura 20: Efeito do linalol (1- 5000 M) na reverso da contrao induzida e mantida por FE

(0,1 M) em aorta isolada de ratos com endotlio. Os c rculos cheios representam o grupo experimental (n = 4) e os crculos vazados o grupo controle (n = 3). Os resultados foram

expressos em % da resposta mxima da contrao mdia % EPM%. n= nmero de experimentos. O s mbolo * representa significncia estatstica para p < 0,05 em relao ao

controle (ANOVA seguido de Holm-Sidak). O eixo y representa a % da contrao do FE 0,1 M e o eixo x representa as concentraes aplicadas de linalol.

Efeito Inibitrio do Linalol na Contrao Induzida por CaCl2 na Presena

de K60 em soluo 0Ca2+ .

A fim de avaliar o efeito do LIN sobre os VOCCs, contraes foram

induzidas por influxo de Ca2+ em aorta isolada despolarizada por soluo K60.

Inicialmente, segmentos de aorta com endotlio intacto foram incubados em

uma soluo KB sem Ca2+ (0Ca2+) e, em seguida, concentraes cumulativas e

crescentes de CaCl2 (0,120 mM) foram adicionadas ao banho para promover

uma

contrao. Logo depoi

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AÇÃO DO LINALOL SOBRE O SISTEMA CARDIOVASCULAR DE RATOS NORMOTENSOS