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ADRIANA RIBEIRO DOS SANTOS RIOS
IMUNOEXPRESSÃO DO FATOR DE NECROSE TUMORAL ALFA
EM MEMBRANAS OVULARES DE PARTOS PREMATUROS DE
GESTANTES TABAGISTAS
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação
em Ciências da Saúde da Faculdade de Ciências Médicas
da Santa Casa de São Paulo para a obtenção do título de
Mestre em Medicina.
São Paulo – 2013
ADRIANA RIBEIRO DOS SANTOS RIOS
IMUNOEXPRESSÃO DO FATOR DE NECROSE TUMORAL ALFA
EM MEMBRANAS OVULARES DE PARTOS PREMATUROS DE GESTANTES
TABAGISTAS
Dissertação apresentada ao Curso da Pós-
graduação em Ciências da Saúde da Faculdade de Ciências
Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do
titulo de Mestre em Medicina
Área de Concentração: Tocoginecologia
Orientador: Prof. Dr. Sebastião Piato
Co-orientadora: Profa. Dra. Maria Antonieta Longo
Galvão da Silva
São Paulo – 2013
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
Rios, Adriana Ribeiro dos Santos
Imunoexpressão do fator de necrose tumoral-alfa em
membranas ovulares de partos prematuros de gestantes
tabagistas .Adriana Ribeiro dos Santos Rios. São Paulo, 2012.
Dissertação de Mestrado. Faculdade de Ciências Médicas
da Santa Casa de São Paulo – Curso de Pós-Graduação em
Ciências da Saúde.
Área de Concentração: Ciências da Saúde
Orientador: Sebastião Piato
Co-Orientador: Maria Antonieta Longo Galvão da Silva
1. Fator de necrose tumoral alfa 2. Trabalho de parto
prematuro 3. Membranas extra-embrionárias 4. Imunoistoquímica 5. Tabagismo
BC-FCMSCSP/63-12
Dedicatória
Dedico esse trabalho aos meus pais, José Nilton e Vilma, pelo apoio constante em meus
estudos e seus esforços para a minha formação acadêmica;
Meu esposo Oswaldo Rios, por sua presença confortadora nos momentos difíceis e por
me ensinar que é preciso perdoar;
Minhas amadas filhas, Ana Beatriz e Giovana, que tentam compreender porque mamãe
não está sempre presente e às vezes sem paciência e que sempre me recebem com
grande amor e carinho;
Deixo um pensamento:
Os momentos difíceis da vida são passíveis de se passar pois o vivemos com turbulentos
sentimentos, o mais complicado é recomeçar após esses momentos, pois reiniciamos
com a razão e a razão nos põe a provas extremamente difíceis .
Adriana Rios
Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo qualquer um pode começar
agora e fazer um novo fim.
Chico Xavier
Meus agradecimentos especiais para:
Minha querida Professora Doutora Maria Antonieta Longo Galvão Silva, por sua
recepção calorosa e sua paciência e disposição constantes.
Meu querido mestre Professor Doutor Sebastião Piato, por seus ensinamentos desde o
início de minha vida acadêmica até hoje, e, principalmente, por ter me acolhido como
discípula;
Minha querida colega Silvia Regina Piza Ferreira Jorge, por dividir seus conhecimentos
comigo.
Meus sinceros agradecimentos para:
A Profa. Dra. Maria Irma Seixas Duarte, responsável pelo Laboratório de Moléstias
Transmissíveis da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, pela presteza e
cuidados na realização das reações de imunoistoquímica;
Os funcionários do Laboratório de Anatomia Patológica pela contribuição na parte
tecnológica do trabalho;
A estatística Érica Tiemi Fukunaga, mestre em estatística, por seus esclarecimentos e
ajuda na análise deste trabalho;
A Secretaria da Pós-Graduação, especialmente aos Srs Daniel e Mirtes, pela paciência e
consideração;
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes), pela
concessão de bolsa para a pesquisa;
A Biblioteca da Faculdade, pelo seu auxílio quanto à bibliografia;
A todos meus colegas de trabalho do Centro Obstétrico do Hospital Geral de Guarulhos
que me auxiliaram na coleta do material;
As pacientes envolvidas neste estudo, que depositaram confiança em minha pessoa;
Ao amor, por construiur uma família e por sempre mantê-la unida.
Abreviaturas
IL - interleucina
INF - interferon
ISCMSP - Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo
kD - quilo-Dalton
LP - lipopolissacarídeos
PBS - solução salina tamponada com fosfatos
PG - prostaglandina
TNF - fator de necrose tumoral
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO----------------------------------------------------------------------1
1.1. Tabagismo e fragilização das membranas-------------------------- 3
1.2 Tabagismo e Inflamação------------------------------------------------3
1.3 Resposta Inflamatória---------------------------------------------------4
1.3.1Fator de necrose tumoral--------------------------------------------------6
1.4 Histologia das membranas----------------------------------------------8
1.5 Revisão da literatura-----------------------------------------------------9
2. OBJETIVO--------------------------------------------------------------------------10
3. CASUÍSTICA E MÉTODO.------------------------------------------------------12
3.1. Casuística----------------------------------------------------------------13
3.2. Método-------------------------------------------------------------------14
3.2.1. Preparo do material--------------------------------------------14
3.2.2. Pesquisa do TNF-α por imunoistoquímica----------------15
3.3. Análise estatística-------------------------------------------------------18
4. RESULTADOS-----------------------------------------------------------------------19
4.1. Características dos Grupos--------------------------------------------20
4.2. Imunoexpressão do TNF-α no Grupo Estudo----------------------20
4.3. Imunoexpressão do TNF-α no Grupo Controle--------------------21
5. DISCUSSÃO.-----------------------------------------------------------------------24
6. CONCLUSÃO----------------------------------------------------------------------27
7. ANEXOS----------------------------------------------------------------------------29
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS------------------------------------------39
FONTES CONSULTADAS-----------------------------------------------------------47
RESUMO--------------------------------------------------------------------------------49
ABSTRACT-----------------------------------------------------------------------------51
LISTAS-----------------------------------------------------------------------------------53
1. INTRODUÇÃO
2
A integridade das membranas ovulares até o desencadeamento do parto tem
extrema importância , uma vez que o líquido contido na câmara amniótica desempenha,
em relação ao feto, as funções de manutenção da temperatura, favorecimento da
expansão pulmonar e de proteção quanto a traumatismos e deformidades (Sherer,
Langer, 2001).
Acresce que o líquido amniótico possui importante atividade bacteriostática e
bactericida (Galask, Snyder, 1968; Thadepalli et al., 1978). Juntamente com a barreira
mecânica exercida pelo âmnio e pelo córion, atuam como fatores de proteção contra
infecção ascendente capaz de comprometer os organismos fetal e materno.
Os reconhecidos agravos decorrentes da ruptura prematura das membranas
ovulares, particularmente nos casos em que essa complicação obstétrica ocorre em
gestações pré-termo, confirmam essas assertivas.
Nas publicações feitas no passado acerca da etiologia da ruptura antecipada das
membranas ovulares os autores eram unânimes em admitir que essa complicação tinha
como exclusivos fatores causais agentes mecânicos, especialmente contrações de
Braxton-Hicks de forte intensidade e distensão exagerada da câmara amniótica.
O clássico estudo de Meudt e Hawrilenko, realizado na Alemanha no ano de
1966, comprovou que os referidos agentes mecânicos consistem em fatores
desencadeantes da ruptura, havendo a necessidade de fator predisponente, que consiste
na fragilidade do âmnio e do córion. Gibbs e Sweet (1989) afirmam, com toda a
propriedade, que as membranas que se rompem antes do desencadeamento das
contrações do parto são, intrinsecamente, mais frágeis.
Considera-se que a deficiência inata de colágeno ou fatores capazes de degradar
o mesmo estejam intimamente relacionados com o enfraquecimento das membranas
ovulares (Artal et al, 1976). Fatores reconhecidamente responsáveis pela fragilização do
âmnio e do córion consistem em inflamação das membranas ocasionada por infecção
ascendente, infiltração do âmnio e do córion por sangue e deficiência inata do colágeno
(Naeye , Petersen, 1980; Evaldson et al., 1982; Gravett et al., 1986; Garite, 1994; Rivera
et al., 2004, Newton, 2005).
3
1.1 Tabagismo e fragilização das membranas ovulares
O cigarro é composto de quase cinco mil substâncias químicas , muitas delas
reconhecidamente maléficas à saúde do ser humano. O hábito de fumar durante o
período gestacional propicia o aparecimento de inúmeras doenças que podem se
desenvolver desde o período intra-uterino até a vida adulta. Dentre as substâncias
químicas lesivas ao feto , destacam-se a nicotina e o monóxido de carbono (Utagawa et
al., 2007).
Ensaios clínicos recentes têm evidenciado que o hábito de fumar é responsável
pelo aumento do risco para a ocorrência da ruptura das membranas ovulares antes do
início do trabalho de parto em 1 a 4,5%. (Flood, Naeye, 1984; Aleixo Neto, 1990;
Harger et al., 1990; Castles et al., 1999; Leopercio, Giglioti , 2004; Srinivas et al., 2005;
Hermanns-Lê, Piérard, 2008 ; Menon, Fortunato, 2009; Menon et al., 2011; Andres et
al., 2012).
Uma vez reconhecido o possível efeito debilitador das substâncias resultantes do
ato de fumar sobre o âmnio e o córion, surgiu o interesse em se estabelecer o
mecanismo pelo qual as mesmas atuam nessas membranas.
Ao se levantar a hipótese de que a fragilização das membranas em gestantes
tabagistas possa estar relacionada com processo inflamatório desenvolvido no âmnio e
no córion, surge o interesse em analisar os ensaios acerca da atuação das substâncias
absorvidas durante o ato de fumar no organismo humano.
1.2 Tabagismo e inflamação
Em revisão da literatura não encontramos investigações acerca da presença de
marcadores de processo inflamatório nas membranas ovulares de gestantes tabagistas.
Por tal motivo, fazemos referências a pesquisas realizadas em outros tecidos.
Estudo realizado por Clarke et al. (1981) evidenciou que a nicotina pode causar
vasoconstricção nos vasos periféricos do tecido gengival, levando à redução dos sinais
clínicos de gengivite nesse tecido.
Baseados no estudo de Arcavi e Benowitz (2004) que verificaram elevação da
contagem de leucócitos no sangue periférico de fumantes de longa data, Mcallister-
Sistilli et al. (1998), passaram a admitir que fatores liberadores de macrófagos
alveolares, tais como fator de necrose tumoral, interleucina (IL) 1 e 8 e fator
4
estimulador de granulócitos, seriam responsáveis pela estimulação da medula óssea na
produção de leucócitos.
Birtwisle (1996) e Wang et al.(2004) descreveram que a nicotina pode aumentar
a expressão de macrófagos, que liberam o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e a IL-
1 e regulam para cima a expressão de moléculas de adesão.
Alguns pesquisadores constataram que a inflamação sistêmica em indivíduos
tabagistas estimula macrófagos e linfócitos a produzir citocinas pró-inflamatórias como
IL-1β, TNF-α, interferon (INF-ɤ) e IL-6.
Esse fenômeno causa ativação das células endoteliais, com aumento da
expressão das moléculas de adesão intracelular e de adesão celular vascular, do inibidor
do ativador de plasminogênio tipo 1 e promove a produção de placas de aterosclerose
(Mac Callum, 2005; Hunninghake, 2005; Taraseviciene, Voelkel, 2008).
Em artigo de revisão, Domagala-Kulawik (2008) verificou que o hábito de
fumar causa afluxo de macrófagos pulmonares para o lúmen das vias aéreas. Outros
efeitos, como a secreção diminuída de IL-1, IL-6, IL-8 e TNF-α, bem como
comprometimento da função fagocitária desses macrófagos, levam a diminuição
importante de seu papel protetor das vias aéreas.
Baseados nesses achados podemos aventar a hipótese de que as referidas
substâncias tóxicas resultantes da queima do tabaco possam ocasionar reação
inflamatória nas membranas ovulares, que levariam à debilitação das mesmas.
Tendo em vista o papel da resposta inflamatória, fazemos na sequência
considerações sumárias acerca da mesma.
1.3 Resposta inflamatória
A resposta inflamatória ocorre mais comumente na presença de processo
infeccioso. Contudo, a mesma pode ser desencadeada pela atuação de agentes físicos,
como traumas e isquemia, e à de agressores químicos, com destaque para as substâncias
tóxicas (Kumar et al., 2005).
Qualquer resposta imune envolve primariamente o reconhecimento do patógeno
ou outro material estranho; na sequência ocorre a elaboração de reação dirigida a este
elemento, com a finalidade de eliminá-lo do organismo.
5
As respostas imunes são mediadas por variedade de células, assim como por
moléculas solúveis que estas células secretam. Embora os leucócitos sejam as células
centrais para todas as respostas imunes elaboradas, outras células nos tecidos também
participam da resposta através de sinais enviados aos linfócitos e das respostas às
citocinas liberadas pelas células T e macrófagos.
Uma vez iniciada a agressão tecidual, vários componentes do sistema
imunológico passam a envolver-se no processo inflamatório. Como consequência da
ação vasodilatadora de mediadores, como prostaglandinas, citocinas, fator de necrose
tumoral alfa (TNF-α) e interferon gama (IFN-ɤ) ocorre aumento do fluxo sanguíneo no
local atingido e aumento da permeabilidade capilar.
Em decorrência desta última alteração surge retração de células endoteliais e
expressão de moléculas de adesão nestas mesmas células e em leucócitos. Tais
alterações ocasionam passagem de mediadores solúveis para os vasos e saída de células
da circulação (migração transendotelial). Dentre os mediadores, encontram-se
leucotrienos, fator ativador de plaquetas, bradicininas, componentes do sistema
complemento e citocinas (incluindo as quimiotáticas), caracterizando-se, assim, a fase
aguda da inflamação (Harris, 1992; Lewis , Wilson, 1992; Kumar et al., 2005).
Várias células são atraídas para o local da inflamação. Os neutrófilos são os
principais elementos celulares no início da resposta inflamatória seguidos pelo afluxo de
monócitos e macrófagos e, por fim, o de linfócitos.
Paralelamente, ocorre síntese de citocinas e ativação de fibroblastos, que
promovem a restauração tecidual (Harris, 1992; Lewis, Wilson, 1992; Roitt, 1999;
Forte, 2004; Kumar et al., 2005).
O TNF-α e a IL-1 são as principais citocinas envolvidas no processo
inflamatório. São produzidos, principalmente, por macrófagos ativados e induzem
espectro variado de alterações, em particular, a síntese de eicosanoides, como a PGE2
(Steinborn et al., 1998; Demasi et al., 2003; Sato et al., 2003; Kumar et al., 2005). Os
principais estimulantes da produção do TNF-α são os lipolissacarídeos (LPS)
constituintes da membrana de bactérias, em especial das Gram-negativas.
Na figura 1 expomos o esquema da resposta inflamatória.
6
Figura 1. Representação esquemática da resposta inflamatória.
1.3.1 Fator de necrose tumoral
As citocinas são proteínas secretadas pelas células da imunidade natural e
adquirida que medeiam muitas funções dessas células. São polipeptídeos produzidos em
resposta a microorganismos e outros antígenos, que medeiam e regulam reações
imunológicas e inflamatórias.
Destaca-se, dentre as citocinas, o TNF-α, uma vez que o mesmo consiste no
principal mediador da resposta inflamatória (Beutler , Cerami, 1988; Romero et al.,
1992; Steinborn et al., 1996; Arntzen et al., 1998; Romero et al., 1998; Dudley, 1999;
Keelan et al., 1999; Mussali et al., 1999; Pomini et al., 1999; Steinborn et al., 1999;
Abbas et al., 2000; Saji et al., 2000; Demasi et al., 2003; Sato et al., 2003; Mitchell et
al., 2005; Schmitz et al., 2007).
O fator de necrose tumoral (TNF) é classificado em TNF-α, antigamente
conhecido pela denominação caquetina, e TNF-β, antes denominado linfotoxina
(Shalaby et al., 1985; Granger , Williams, 1986; Beutler , Cerami, 1988).
O TNF-α é proteína com peso molecular de 17 quilo-Daltons (kD), composta
por 157 aminoácidos. Contém ponte dissulfídica ligada a dois resíduos cisteínicos
(Shalaby et al., 1985; Beutler , Cerami, 1988).
A principal fonte celular de TNF é constituída por fagócitos mononucleares
ativados, embora células T estimuladas por antígeno , células natural killer e mastócitos
Agressão
neutrófilos
monócitos e
macrófagos
linfócitos
citocinas
Tnf-α e IL-1 Aumento do fluxo
sanguíneo
Aumento da permeabilidade capilar
7
também possam secretar essa proteína. Nos fagócitos mononucleares, o TNF é
sintetizado como proteína de membrana tipo II não-glicosilada, com uma extremidade
aminoterminal intracelular e uma grande extremidade carboxiterminal extracelular. O
TNF de membrana é expresso como homotrímero e é capaz de se ligar a um receptor de
TNF. A forma de membrana do TNF é clivada por uma metaloproteinase associada à
membrana, liberando um polipepitídeo de 17kD. Três cadeias polipepitídicas se
polimerizam para formar a proteína circulante do TNF com 51kD . O TNF secretado
assume a forma de pirâmide triangular, e cada lado da mesma é formado por uma
subunidade (Fig. 2) (Shalaby et al., 1985; Beutler, Cerami, 1988; Abbas et al., 2000).
Figura 2. Estrutura do TNF-α (Baeyens,1999).
A principal função fisiológica do TNF é estimular o recrutamento de neutrófilos
e monócitos para locais de infecção e ativar essas células para erradicar
microorganismos. O TNF faz com que células do endotélio vascular expressem
moléculas de adesão, que tornam a superfície endotelial adesiva para leucócitos,
inicialmente para neutrófilos e subsequentemente para monócitos e linfócitos. Ele
estimula células endoteliais e macrófagos a secretar quimiocinas. Atua também nos
fagócitos para estimular a secreção de IL-1. O TNF estimula as atividades microbicidas
dos neutrófilos e macrófagos. Age no hipotálamo induzindo a febre e desta forma é
conhecido como pirógeno endógeno. Nos hepatócitos promove aumento da síntese de
certas proteínas séricas. A produção prolongada de TNF causa perda de células
musculares e adiposas, chamada caquexia. Níveis circulantes elevados de TNF causam
distúrbios metabólicos graves. Uma complicação grave da infecção, o choque séptico, é
devida à produção de TNF induzida por lipopolissacárides e outras citocinas.(Forte,
2004; Roitt et al.,1999).
8
O método mais utilizado para determinar a expressão do TNF-α em tecidos
consiste na técnica da imunoistoquímica, com tratamento por anticorpos monoclonais
específicos para antígeno anti-humano (Yui et al., 1994; Steinborn et al., 1998;
Steinborn et al., 1999; Winkler et al., 2001; Sato et al., 2003).
1.4 Histologia das membranas
No sentido de facilitar a compreensão dos achados obtidos com o emprego da
imunoistoquímica expomos em A da figura 3 as camadas celulares das membranas
ovulares (de forma esquemática) e em B da mesma figura corte histológico das referidas
camadas.
Figura 4. Membranas ovulares. A. Camadas celulares das membranas
ovulares, de forma esquemática. B. Corte histológico das referidas
A B
Figura 3. Camadas celulares das membranas ovulares. A. Corte esquemático.
B. Corte histológico (adaptado de Fox, 1993).
9
1.5. Revisão de literatura
Na extensa análise das fontes, MEDLINE, PubMed, Lilacs e Scielo, por nós
realizada não encontramos publicações de estudos relacionados com a expressão da
citocina TNF-α nas membranas ovulares de gestantes tabagistas.
Por tal motivo, nos decidimos pela realização da presente investigação, cujo
objetivo é exposto a seguir.
2. OBJETIVO
11
O presente estudo transversal teve como propósito avaliar a imunoexpressão do
fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) em membranas ovulares provenientes de partos
pré-termo de gestantes tabagistas e não tabagistas.
3. CASUÍSTICA E MÉTODO
13
3.1. Casuística
Foram selecionadas para o estudo 100 grávidas com idade superior a 18 anos e
com idade gestacional inferior a 37 semanas. Outros critérios de inclusão consistiram
em ausência de infecções do trato genital inferior, cultura negativa para estreptococos
do grupo B, ausência de exposição passiva ao cigarro e ausência de uso prévio de
corticosteroide.
Foram excluídos do ensaio os materiais de estudo que não apresentaram as
propriedades necessárias para a adequada avaliação do TNF-α pela técnica da
imunoistoquímica.
Para afastar processos infecciosos foram realizados exames de urina tipo I,
hemograma completo, cultura de secreção anal/vaginal para pesquisa de estreptococos
do grupo B, exame clínico geral e ginecológico.
Obedecendo esses critérios obteve-se material constituído por
membranas ovulares provenientes de 75 partos. Desse total, 25 espécimes de
membranas, que constituíram o Grupo Estudo, pertenceram a gestantes tabagistas e os
demais 50 espécimes, que formaram o Grupo Controle, originaram-se de não tabagistas.
Em todas as grávidas a idade gestacional foi calculada por ultrassonografia transvaginal
de primeiro trimestre.
Todas as parturientes foram assistidas no Centro Obstétrico do Hospital Geral de
Guarulhos, parte integrante do complexo hospitalar da Irmandade da Santa Casa de
Misericórdia de São Paulo (ISCMSP), entre agosto de 2011 e julho de 2012.
Os dados gerais das 25 parturientes tabagistas são expostos no anexo 1 e os das
50 não tabagistas no anexo 2. As médias de idade das parturientes e da idade gestacional
são apresentadas no anexo 3 e os gráficos da idade materna e idade gestacional, nos
anexos 4 e 5, respectivamente.
O estudo teve aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos da
ISCMSP (Anexo 6) e todas as gestantes assinaram Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (Anexo 7).
14
3.2. Método
3.2.1 Preparo do material
Imediatamente após a dequitação, as placentas e membranas foram colocadas em
recipientes plásticos contendo solução de formaldeído a 10% e encaminhadas ao
Departamento de Anatomia Patológica do Hospital Central da ISCMSP.
Nesse serviço procedeu-se inicialmente a separação entre as membranas
ovulares e as placentas. Em seguida seccionou-se fita de membranas de cada caso, com
aproximadamente 3cm de largura e 10cm de comprimento. Cada fita foi enrolada sobre
si mesma, obtendo-se o chamado jelly roll, cujo corte transversal é exposto na figura 4.
Figura 4. Corte transversal de rolo formado por tira de membranas ovulares
(jelly roll) (HE 200X).
Na sequência, os espécimes de jelly roll foram blocados em parafina. Para a
confecção dos blocos, os referidos espécimes foram inicialmente desidratados em álcool
etílico e clareados pelo xilol. No preparo das lâminas destinadas ao estudo pela técnica
imunoistoquímica, os blocos foram cortados com auxílio de micrótomo calibrado para
espessura de 3µm.
15
3.2.2 Pesquisa do TNF-α por imunoistoquímica
A técnica de imunoistoquímica para avaliação da expressão do TNF-α nas
membranas ovulares, previamente blocadas, dos grupos Estudo e Controle foi realizada
na Divisão de Anatomia Patológica do Instituto Central do Hospital das Clínicas da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Na referida técnica utilizou-se anticorpo primário anti-TNF-α (código
AS210NA, RD System®, USA) e kit de visualização contendo anticorpo secundário
conjugado a peroxidase e cromógeno (Envision®, DAKO, USA).
Foram realizados cortes histológicos com 3μm de espessura. Os mesmos foram
montados em lâminas de vidro, previamente preparadas com o adesivo poli-D-lisina,
para evitar o seu descolamento durante a imunocoloração.
Em seguida, as lâminas foram desparafinadas em xilol, à temperatura ambiente,
por 10 minutos, hidratadas em dois banhos de álcool etílico absoluto, em dois de álcool
a 95% e em um de álcool a 75%. Seguiram-se lavagens em água corrente destilada,
durante cinco minutos.
Posteriormente, os cortes histológicos foram tratados com peróxido de
hidrogênio (H2O2) a 6% (20 volumes) em cinco banhos, de cinco minutos cada, para
bloqueio da peroxidase endógena.
Em seguida, os cortes foram incubados com o anticorpo primário, em solução
previamente otimizada 1/ 500, diluída em solução de albumina a 1% e em solução
salina tamponada com fosfatos (PBS), por 18 horas, incluindo o período noturno, à
temperatura de 4°C.
No dia seguinte, após lavagens em tampão PBS (três banhos), os cortes foram
incubados com anticorpo secundário em câmara úmida, por uma hora, a 37°C. Após três
lavagens com tampão PBS, realizou-se incubação com complexo streptavidina-biotina-
peroxidase, em câmara úmida a 37°C, por 30 minutos, e três banhos com tampão PBS.
Para visualização da reação, os cortes foram tratados com substrato cromogênico
(diaminobenzidina a 60mg% em PBS associado a 1,5mL de peróxido de hidrogênio a
20 volumes), por cinco minutos, a 37°C. Em seguida, foram lavados em água corrente
destilada, por cinco minutos. Os cortes, então, foram contra-corados com hematoxilina
de Harris, com posteriores lavagens em água corrente e destilada, por cinco minutos, e
desidratação em álcool 75%, álcool 95% (dois banhos), álcool etílico absoluto (dois
16
banhos) e xilol (três banhos). Seguiu-se, por fim, montagem em Entellan®, com
lamínula e identificação das lâminas.
A positividade da reação para identificação do TNF-α foi marcada pela
coloração marrom sépia no citoplasma celular, tomando-se como controle positivo da
mesma o padrão de coloração do TNF-α presente no citoplasma de macrófagos em
cortes de amígdala humana (Fig. 5).
Figura 5. Controle positivo da reação do TNF-α (amígdala humana) HE 400X.
A expressão do TNF-α no citoplasma de células trofoblásticas da membrana
amniótica caracteriza-se pela presença de cor marrom sépia de aspecto granular. A
intensidade da reação foi graduada de 0 a 3, consoante à porcentagem de células
trofoblásticas coradas (Tab.1).
Tabela 1. Expressão do TNF-α no citoplasma de células trofoblásticas das
membranas ovulares, consoante o número de células coradas em
marrom sépia.
Grau Número de células coradas
0 Nenhuma
1 < 50%
2 60 a 90%
3 Todas
Nas figuras 6 a 9 são expostos cortes histológicos que ilustram os quatro graus
de expressão do TNF-α no citoplasma de células trofoblásticas.
17
Figura 6. Grau 0 – reação negativa para TNF-α (HE 200X).
Figura 7. Expressão de TNF-α grau 1 (HE 400X).
Figura 8. Expressão de TNF-α grau 2 (HE 400X).
Figura 9. Expressão de TNF-α grau 3 (HE 400X).
18
3.3. Análise estatística
A realização do cálculo do tamanho amostral foi realizada através da
comparação de proporção e adotou-se diferença de proporção de 20%, nível de
significância de 5%, poder de teste de 80%, sendo necessários 80 casos no total.
Na análise descritiva das variáveis quantitativas (idade, idade gestacional e
paridade) foram apresentados os dados (média e desvio padrão) e utilizado teste
estatístico T-student.
A variável qualitativa (grau de imunoexpressão de TNF-α) foi analisada por
meio do teste Qui-quadrado (Siegel, 1956), para a comparação entre os grupos Estudo e
Controle.
Em todas as análises adotou-se nível de significância de 5% (p<0,05). As
análises foram realizadas por meio do software estatístico SPSS 13 (Statistical Package
for the Social Sciences).
4. RESULTADOS
20
4.1 Características dos Grupos
A média de idade materna e de idade gestacional do Grupo Estudo foi de 27,92
anos e 32,44 semanas. A do Grupo Controle foi de 24,70 anos e 31,92 semanas,
respectivamente. Não houve diferença estatisticamente significante entre os dois grupos
com p = 0,07 para idade materna e p=0,69 para idade gestacional.
A média de cigarros fumados por dia foi de 14,56 cigarros/dia no Grupo Estudo.
Quanto ao tipo de parto, a taxa de cesárea no Grupo Estudo foi de 28% e no
Grupo Controle foi de 48%. Não foi observada diferença estatisticamente significante
entre os dois Grupos (p= 0,097).
4.2 Imunoexpressão do TNF-α no Grupo Estudo
Na tabela 2 e na figura 10 são apresentados os resultados referentes à distribuição
dos graus de imunoexpressão do TNF-α nas membranas ovulares das gestantes do Grupo
Estudo.
Tabela 2. Distribuição dos graus de expressão do TNF-α no Grupo Estudo.
Graus de
Expressão
0 1 2 3
Valores 24% 48% 20% 8%
21
Figura 10. Representação gráfica da distribuição do grau de expressão do
TNF-α em membranas ovulares do Grupo Estudo.
4.3 Imunoexpressão do TNF-α no Grupo Controle
Na tabela 3 e na figura 11 são apresentados os resultados referentes à distribuição
dos graus de imunoexpressão do TNF-α nas membranas ovulares das gestantes do Grupo
Controle.
Tabela 3. Distribuição do grau de expressão do TNF-α nas
membranas ovulares do Grupo Controle.
Graus de
Expressão
0 1 2 3
Valores 18% 54% 28% 0%
24%
48%
20%
8%
Grau 0 Grau 1 Grau 2 Grau 3
22
Figura 11. Representação gráfica da distribuição do grau de expressão do TNF-α
em membranas ovulares do Grupo Controle.
Na figura 12 expomos a relação do TNF-α nos Grupos Estudo e Controle.
Figura 12. Representação gráfica da distribuição do grau de expressão do TNF-α nas
membranas ovulares dos Grupos Estudo e Controle.
Por meio da análise descritiva observamos que os dois grupos apresentaram
distribuição semelhantes de graus de TNF-α.
Tendo em vista a inexistência de casos com expressão de grau 3 no Grupo
Controle, fato que ocasionaria instabilidade do teste estatístico, optamos por agrupar os
casos com graus 2 e 3 em ambos os grupos, conforme ilustrado na tabela 4 e figura 13.
18%
54%
28%
0%
Grau 0 Grau 1 Grau2 Grau 3
0
20
40
60
01
23
18
54
28
0
24
48
20
8
Grupo Controle Grupo Estudo
%
23
Tabela 4. Relação entre a imunoexpressão do TNF-α nos Grupos Estudo
e Controle com agrupamento dos graus 2 e 3
Graus de
expressão
0 1 2+3
Grupo Controle 18% 54% 28%
Grupo Estudo 24% 48% 28%
Figura 13. Relação entre imunoexpressão de TNF-α nos Grupos Estudo e
Controle com agrupamento dos graus 2 e 3.
Observamos pela análise descritiva e realização de testes estatísticos que os
grupos apresentaram grau de distribuição de TNF-α semelhantes, confirmado com a
realização de teste estatístico Qui-quadrado. (p=0,812).
0
20
40
60
01
2+3
18
54
28
24
48
28
Grupo Controle Grupo Estudo
%
5. DISCUSSÃO
25
Não pairam dúvidas de que as estratégias a serem utilizadas na prevenção da
ruptura prematura das membranas ovulares e do parto prematuro devem estar
fundamentadas no conhecimento das causas responsáveis pela ocorrência desta
complicação obstétrica.
No referente ao papel do tabagismo ainda são escassas as informações acerca do
mecanismo pelo qual as substâncias tóxicas resultantes da queima do tabaco ocasionam
debilitação das membranas ovulares.
As referidas investigações de Clarke et al.(1981), Birtwisle (1996), Mcallister-
Sistilli et al.(1998), Arcavi e Benowitz (2004), Wang et al. (2004), Mac Callum (2005),
Hunninghake (2005), Taraseviciene, Voelkel (2008) e a revisão de Domagala-Kulawik
(2008), relacionadas com resposta inflamatória em diferentes setores do organismo de
indivíduos tabagistas, sugerem a possibilidade de que as substâncias tóxicas resultantes
do ato de fumar possam causar efeito semelhante nas membranas ovulares.
No sentido de avaliar se o tabagismo seria fator de risco pela inflamação dessas
membranas, procuramos comparar a expressão do fator de necrose tumoral alfa em
gestantes tabagistas e não tabagistas.
Para evitar eventuais vieses, nos empenhamos na obtenção da maior
homogeneidade possível entre as características das gestantes de ambos os grupos.
No que se refere à idade gestacional das gestantes adotou-se como procedimento
de avaliação o exame ultrassonográfico realizado no primeiro trimestre da gravidez,
uma vez que o mesmo apresenta elevada acurácia.
Cercamo-nos de especial rigor na exclusão de gestantes acometidas por
processos infecciosos, sejam sistêmicos ou do trato genital inferior, utilizando
procedimentos clínicos e laboratoriais pertinentes. Essa preocupação fundamentou-se no
fato de que as gestantes tabagistas apresentam maior propensão para desenvolver
processos infecciosos, que propiciam o desenvolvimento de corioamnionite (Leopércio ,
Gigliotti, 2004).
Tendo em vista a possível interferência de corticosteroides nos resultados, foram
selecionadas para compor os Grupos Estudo e Controle gestantes que não haviam
recebido esses esteroides com o intuito de acelerar a maturidade pulmonar do feto.
Foram incluídas em ambos os grupos gestantes que chegaram para atendimento
em trabalho de parto ou com indicação de cesárea, impossibilitadas, portanto, de receber
corticosteroides para aceleração da maturidade pulmonar fetal ou tocólise.
26
Tal rigor nos critérios de seleção da casuística foi responsável pelo número
relativamente baixo de casos investigados. Cabe assinalar, contudo, que, quanto a este
último aspecto, a análise estatística revelou que o número de casos foi considerado
satisfatório.
A utilização do método jelly roll na preparação do material para a obtenção dos
cortes histológicos destinados à técnica da imunoistoquímica baseou-se no fato de que o
mesmo possibilita a feitura de cortes de boa qualidade.
No que se relaciona à técnica de imunoistoquímica para a determinação da
expressão do TNF-α nas membranas, ainda que seja método qualitativo, apresenta fácil
utilização, elevada especificidade e boa sensibilidade. Os passos dessa técnica
laboratorial foram expostos em detalhes, visando evidenciar a sua reprodutibilidade.
A análise estatística de nossos resultados evidenciou que não houve diferença
para mais da expressão do TNF-α nas membranas ovulares do Grupo Estudo, quando
feita a comparação com o Grupo Controle.
A ausência de estudos semelhantes aos que ora apresentamos, impossibilita-nos
fazer análises comparativas. De todo modo, a constatação de que a frequência de
expressão do TNF-α nas membranas ovulares não foi significativamente mais elevada
no Grupo Estudo, quando comparado com aquelas provenientes do Grupo Controle,
sugere outros mecanismos de ação do tabagismo na debilitação das membranas
ovulares.
Acreditamos que as informações relacionadas com o presente trabalho venham a
ter utilidade na realização de futuras pesquisas acerca do papel do tabagismo na ruptura
prematura das membranas ovulares.
6. CONCLUSÃO
28
O presente estudo possibilitou-nos chegar à seguinte conclusão:
A comparação entre a imunoexpressão do fator de necrose tumoral alfa nas
membranas ovulares das gestantes tabagistas e nas das não tabagistas não mostrou
diferença estatisticamente significante.
7. ANEXOS
30
Anexo 1. Dados gerais das gestantes do Grupo Estudo.
No. INICIAIS RG IDADE PN PC AB IG TP
1 JPSS 157352 26 0 0 0 26 V
2 KAS 155799 29 0 0 0 30 V
3 NMCS 95085 28 0 2 1 31 C
4 MSN 158861 31 3 0 0 34 V
5 SMS 124984 32 2 3 0 36 C
6 LFVS 66427 23 2 0 0 34 V
7 VGG 31991 24 0 1 1 34 V
8 APR 160654 18 0 0 0 24 V
9 CSS 7973 34 8 0 0 30 C
10 MRAS 92388 22 2 0 0 36 V
11 KSCC 161051 18 0 0 2 25 V
12 SMB 163086 42 3 0 0 34 V
13 MDLN 153038 40 0 3 0 34 C
14 KKOB 162350 21 1 0 1 36 V
15 MFDS 159519 35 4 1 0 30 V
16 ECSS 124637 25 1 0 0 34 V
17 GCS 163616 22 0 1 0 26 V
18 EDG 1214 32 9 0 0 36 C
19 GFS 165007 27 0 0 0 34 V
20 ECS 45262 43 2 1 1 36 C
21 TS 166258 20 1 0 0 32 V
22 LML 166466 21 0 0 0 33 V
23 ANT 166879 26 1 1 0 35 V
24 CS 47734 34 4 1 1 36 C
25 AL 100436 25 3 0 0 35 V
No - número da amostra
RG - registro hospitalar
Idade - em anos
PN - parto normal anterior
PC - cesárea anterior
AB - abortamento anterior
IG - idade gestacional em semanas
TP - tipo de parto
V - parto vaginal
C - cesárea
31
Anexo 2. Dados gerais das gestantes do Grupo Controle.
No INICIAIS RG IDADE PN PC AB IG TP
1 RSFS 8050 26 1 0 0 27 C
2 JCS 154662 18 1 0 0 28 V
3 CGMS 154573 18 0 0 0 28 V
4 GLS 143382 18 2 0 0 24 V
5 VCS 157511 38 2 0 0 36 C
6 AMM 157401 19 0 0 0 26 V
7 HDAC 157283 18 0 0 0 36 V
8 WLVL 156702 18 0 0 0 34 C
9 MJRA 154155 35 0 0 0 35 C
10 RMSS 156619 33 0 1 0 30 C
11 SSR 156523 23 0 0 1 24 C
12 FCO 133396 19 1 0 0 35 V
13 AS 60567 36 2 0 0 32 C
14 MJBL 155479 35 2 1 0 34 C
15 CCS 112221 22 0 1 0 31 C
16 VPR 32486 37 14 1 3 34 V
17 BJB 51991 34 5 0 2 30 V
18 VFA 25886 36 6 2 5 29 C
19 ELS 155502 20 0 0 1 31 V
20 MLS 6889 30 2 0 0 36 C
21 MSS 87955 27 1 0 0 35 C
22 DRSC 84243 22 2 0 1 26 V
23 MESN 156764 18 0 0 0 31 V
24 ECS 7000 30 1 0 1 35 C
25 FGS 158796 21 0 0 0 30 C
26 ASC 159341 18 0 0 0 35 C
27 MCSR 80299 38 8 0 1 30 C
28 SR 144603 18 1 0 0 36 V
29 NLM 158581 27 0 2 0 35 C
30 KCS 159155 18 0 0 0 31 V
31 NRS 159097 25 1 0 0 34 C
32 FLG 159544 22 0 0 0 28 C
33 LPS 100673 19 1 0 0 29 V
34 DSM 160446 18 0 0 0 32 C
35 GAR 99581 20 2 0 0 35 V
36 MO 10686 40 3 0 0 35 V
37 AAS 124672 34 3 0 0 36 V
38 SFAL 95121 25 2 0 0 36 C
39 FSR 160455 18 0 0 0 31 V
40 ADBR 162000 27 1 1 0 33 C
41 BTAS 162464 22 0 0 0 36 V
42 FMP 161349 18 0 0 0 34 C
43 MDSA 161807 24 0 0 0 35 C
32
44 JOS 160924 18 0 0 0 33 V
45 SPS 160862 19 0 0 0 27 V
No INICIAIS RG IDADE PN PC AB IG TP
46 VEM 164053 20 0 0 0 32 V
47 TNS 163938 22 0 0 0 35 V
48 CSR 131107 22 1 0 0 36 V
49 WMM 84066 34 3 0 1 31 V
50 KCL 99028 18 0 0 0 24 V
No
- número da amostra
RG - registro hospitalar
Idade - em anos
PN - parto normal anterior
PC - cesárea anterior
AB - abortamento anterior
IG -idade gestacional em semanas
TP - tipo de parto
V - parto vaginal
C - cesárea
33
Anexo 3. Tabela da idade materna e da idade gestacional em médias e desvio padrão.
Idade materna Desvio padrão Idade
gestacional
Desvio padrão
Grupo Estudo 27,92 7,158 32,44 3,74
Grupo
Controle
24,70 7,135 31,92 3,58
Idade materna em anos; idade gestacional em semanas
34
Anexo 4: Gráfico da idade materna dos Grupos Estudo e Controle.
35
Anexo 5: Gráfico da idade gestacional das gestantes dos Grupos Estudo e Controle.
36
Anexo 6. Aprovação da Comissão de Ética em Pesquisa da Irmandade da SantaCasa de
Misericórdia de São Paulo
37
Anexo 7. Termo de consentimento livre e esclarecido
“Imunoexpressão do fator de necrose tumoral-alfa em membranas ovulares de gestantes
tabagistas e não tabagistas”
O hábito de fumar pode causar à grávida alterações no sistema de defesa do
organismo que pode provocar alterações na bolsa das águas que podem levar a produção
de produtos de inflamação como, por exemplo, o fator de necrose tumoral.
O fator de necrose tumoral alfa é uma substância produzida pelo sistema de
defesa do ser humano para defender nosso organismo de inflamações.
Por isso, o objetivo deste trabalho é estudar a expressão do fator de necrose
tumoral nas membranas ovulares (bolsa das águas) de parturientes tabagistas.
A expressão do fator de necrose tumoral nas membranas ovulares será realizada
no pós-parto através do estudo das membranas.
Não haverá benefício direto nem despesas pessoais para o participante em
qualquer fase do estudo, incluindo exames e consultas. Também não haverá
compensação financeira relacionada à sua participação. Se existir qualquer despesa
adicional, ela será absorvida pelo orçamento da pesquisa.
O pesquisador tem o compromisso de utilizar os dados e o material coletado somente
para essa pesquisa.
Por tratar-se de análise das membranas após o parto este estudo não trará
qualquer risco ao participante.
Em qualquer etapa do estudo, o participante terá acesso ao profissional responsável pela
pesquisa para esclarecimento de eventuais dúvidas e resultados da pesquisa, sem ser
divulgado a identificação de nenhum participante. O principal investigador é a
pesquisadora Dra. Adriana Ribeiro dos Santos Rios, que pode ser encontrada no
Hospital Geral de Guarulhos, no endereço: Alameda dos Lírios, 300 - 1º andar, Pq
Cecap, Guarulhos, CEP: 07190-012- SP- Telefone (11)3466–1674 (24h), Fax:
(11)3466-1392 e-mail: [email protected], de segunda à sexta-feira das
7:00às 16:00h.
É garantida a liberdade da retirada de consentimento a qualquer momento e
deixar de participar do estudo, sem qualquer prejuízo à Mãe e Recém-Nascido(s).
38
Acredito ter sido suficientemente informado a respeito das informações que li ou
foram explicadas para mim, descrevendo o estudo da expressão do fator de necrose
tumoral nas membranas ovularesemparturientes tabagistas.
Eu discuti com a pesquisadora Adriana Ribeiro dos Santos Riossobre a minha decisão
em participar deste estudo. Ficaram claros para mim quais são os propósitos do estudo,
os procedimentos a serem realizados, isentos de desconfortos e riscos, bem como as
garantias de confidencialidade e de esclarecimentos permanentes. Ficou claro também
que minha participação é isenta de despesas.
Concordo voluntariamente em participar desse estudo e poderei retirar meu
consentimento a qualquer momento, antes ou durante o mesmo, sem penalidades ou
prejuízo ou perda de qualquer benefício que eu possa ter adquirido, ou no meu
atendimento neste Serviço.
Nome da Mãe:.......................................................................................................
RG:.......................................................................................................................Assinatur
a:.............................................................................. Data ___/___/___
Nome do responsável:.........................................................................................
Assinatura:..............................................................................Data ___/___/___
Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e
Esclarecido deste(s) participante(s) legal para a participação nesse estudo.
.............................................................
Assinatura do responsável pelo estudo Data ___/___/___
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RESUMO
50
Rios, AR.S. Imunoexpressão do fator de necrose tumoral alfa em membranas ovulares
de partos prematuros de gestantes tabagistas. Dissertação de Mestrado: Faculdade de
Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo. São Paulo, 2013.
Objetivo: avaliar a expressão do fator de necrose tumoral alfa nas membranas ovulares
de partos prematuros em gestantes tabagistas e não tabagistas por meio da técnica da
imunoistoquímica. Método: foram estudadas as membranas ovulares de dois grupos de
gestantes com partos prematuros, sendo o Grupo Estudo formado por 25 gestantes
tabagistas e o Grupo Controle constituído por 50 não tabagistas. Para a realização da
técnica da imunoistoquímica foi empregado o anticorpo primário anti-TNF-α. A
positividade da reação para identificação do TNF-α foi marcada pela coloração sépia no
citoplasma das células trofoblásticas. A intensidade da reação foi graduada de 0 a 3, de
acordo com a porcentagem de células coradas. Resultado: não foi observada diferença
estatisticamente significante da imunoexpressão do fator de necrose tumoral alfa nas
membranas ovulares dos dois grupos. Conclusão: Demonstrou-se, neste estudo, que o
tabagismo não é capaz de aumentar o risco de reação inflamatória nas membranas
ovulares.
Palavras chaves: Fator de necrose tumoral alfa, trabalho de parto prematuro, membranas
ovulares, imunoistoquímica e tabagismo.
51
ABSTRACT
52
Rios,ARS.Immunoexpression Of Tumor Necrosis Factor Alpha In Ovular Membranes
From Premature Births In Maternal Smokers.
Purpose: to assess the expression of tumor necrosis factor alpha in ovular membranes
from premature births in maternal smokers and non-smokers using the
immunohistochemistry technique.
Method: ovular membranes from two groups of mothers with premature births,
comprising a Study Group of 25 maternal smokers and a Control Group of 50 non-
smokers, were assessed. The immunohistochemistry technique was performed using the
anti-TNF-α primary antibody. Positivity of the reaction for identification of TNF-α was
marked by sepia coloration in cytoplasm of trophoblast cells. The intensity of the
reaction was graded from 0 to 3, based on the percentage of stained cells.
Results: no statistically significant difference in immunoexpression of tumor necrosis
factor alpha was found in ovular membranes from the two groups.
Conclusion: The results of this study showed that maternal smoking was not associated
with elevated risk of inflammatory reaction in ovular membranes.
Keywords: Tumor Necrosis Factor-Alphas; Obstetric Labor, premature;
Extraembryonic Membranes; Immunohistochemistry; Smoking.
LISTAS
54
LISTA DE FIGURAS
Figura1. Representação esquemática da resposta inflamatória, 6.
Figura 2. Estrutura do TNF-α, 7.
Figura 3. Camadas celulares das membranas ovulares. A.Corte esquemático.
B. Corte histológico,8.
Figura 4. Corte transversal de rolo formado por tira de membranas ovulares.
14.
Figura 5. Controle positivo da reação do TNF-α,16.
Figura 6. Grau 0 – reação negativa para TNF-α ,17.
Figura 7. Expressão de TNF-α grau 1,17.
Figura 8. Expressão de TNF-α grau 2 ,17.
Figura 9. Expressão de TNF-α grau 3 ,17.
Figura 10. Representação gráfica da distribuição do grau de expressão
do TNF-α em membranas ovulares do Grupo Estudo,21.
Figura11. Representação gráfica da distribuição do grau de expressão
do TNF-α em membranas ovulares do Grupo Controle,22.
Figura12. Representação gráfica da distribuição do grau de expressão
do TNF-α nas membranasovulares dos Grupos Estudo e
Controle,22.
Figura 13. Relação entre imunoexpressão de TNF-α nos Grupos Estudo e
Controle com agrupamento dos graus 2 e 3, 23.
55
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Expressão do TNF-α no citoplasma de células trofoblásticas das membranas
ovulares, consoante o número de células coradas em marrom sépia,16.
Tabela 2. Distribuição dos graus de expressão do TNF-α no Grupo Estudo,
20.
Tabela 3. Distribuição do grau de expressão do TNF-α nas membranas
ovulares do Grupo Controle, 21.
Tabela 4. Relação entre a imunoexpressão do TNF-α nos Grupos Estudo e
Controle com agrupamento dos graus 2 e 3, 23.
