ii

Agradecimentos

Em primeiro lugar gostava de agradecer à Doutora Paula Alvito, orientadora externa, por ter aceite o meu convite para ser minha orientadora externa, numa prestigiada instituição, como o Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge. A sua simpatia, boa disposição, ajuda e tempo disponibilizado na elaboração e desenvolvimento desta tese, é algo que não esquecerei.

À Carla Martins e ao Doutor Ricardo Assunção, pela vossa disponibilidade para ajudar do ínicio ao fim, para esclarecimento de dúvidas, apoio técnico no laboratório, no tratamento de resultados, e podia continuar a escrever muito mais... Sem dúvida que sem o vosso apoio próximo, esta tese não seria possível. São pessoas fantásticas e desejo-vos todo o sucesso. Obrigado pela vossa simpatia!

À Dra. Maria Antónia Calhau, coordenadora do Departamento de Alimentação e Nutrição do INSA, por me ter recebido amavelmente no departamento para o desenvolvimento do meu trabalho, sempre com muito boa disposição!

À Doutora Ana Maria Crespo, por ter aceitado ter sido a minha orientadora interna, pela sua disposição em poder ajudar na revisão e no esclarecimento de dúvidas.

À Maria João Pires, Fernanda Vilarinho, Susana Santiago e Ana Cláudia Nascimento pela simpatia com que me receberam todos os dias no gabinete de trabalho.

Às minhas queridas INSA Girls, Mariana, Mafalda, Inês, Ana, e Daniela, que além da boa companhia aos almoços, durante o trabalho e fora dele, se tornaram (espero eu!) amigas para a vida. Sem vocês isto não teria sido a mesma coisa. Enorme obrigado!

Estendo também os meus agradecimentos a todos os colaboradores do DAN que de algum modo tornaram este período que passei no Instituto, um bocadinho melhor. Uma palavra especial à Rute, Dona Laura e à Doutora Anabela Coelho pela vossa energia contagiante.

Aos meus colegas de mestrado, Zohra Lohdia, Inês Oliveira, Pedro de Sá Guimarães e Sara Bento, pela vossa amizade e cooperação nos trabalhos e exames durante o primeiro ano da nossa caminhada até mestres.

Aos amigos que me acompanharam de perto nesta fase, pela vossa amizade, boa disposição e por me mostrarem que até nas horas mais negras, há uma luz ao fundo do túnel, por ajudarem a superar aqueles momentos em que uma pessoa se vê confrontada com a “montanha” que é acabar uma tese de mestrado.

Obrigado pela vossa pequena grande ajuda. Uma palavra especial para a Catarina Miranda, João Santos, Pedro Alves, Miguel Azevedo, Daniel Real, Gonçalo Fabião, Margarida Gamas, Valter Teixeira e João Henriques.

Aos meus afilhados, aos meus padrinhos, e a todos aqueles que deram cor à minha vida académica na Faculdade de Ciências, e me fizeram acreditar que ter ido para o curso de Biologia foi uma escolha acertada, por todos os momentos lá passados, e que recordarei sempre com saudade.

Aos grandes Adriana Borges, Abdul Rahim Gani, Pedro Fernandes de Almeida, Pedro Ferreira e Patrícia Gomes. Sempre lá para o bom e para o mau, para os orgulhos e para as vergonhas. Antes, agora e depois, o que começou no #GD e acabará quando formos velhinhos. Vocês são gigantes amigos!

Aos meus pais Jorge e Maria José, que sempre me incentivaram a seguir os meus sonhos, a cumprir as minhas tarefas, a chegar mais longe. Obrigado pela paciência que tiveram e têm comigo, sei o quanto este caminho foi também difícil para vocês. Só vos posso dizer que vocês são dois pais que qualquer um se pode orgulhar de dizer que são seus. Este trabalho é principalmente por vocês e para vocês.

iii

À minha maninha mais nova Beatriz, que se está a tornar uma mulher e peras. Obrigado por ouvires os meus disparates e por vezes os meus desabafos. Tenho muito orgulho em ti.

E aos meus avós, Esperança, Maria Eduarda, Joaquim e António que tudo sempre deram para que eu fosse o melhor homem possível. Não há palavras para vos agradecer todos os ensinamentos e carinho que me deram ao longo da vida. Em especial às minhas estrelinhas, que de alguma forma estão a ver a o seu neto a concluir mais uma etapa.

iv

Resumo

Os alimentos podem ser contaminados com compostos químicos como as micotoxinas. Estes metabolitos secundários são produzidos por fungos e podem provocar problemas de saúde graves se não forem monitorizados. A patulina é uma micotoxina com efeitos imunossupressores, genotóxicos, mutagênicos e nefrotóxicos, e está presente principalmente em maçãs e alimentos à base de maçã, incluíndo aqueles que são frequentemente consumidos por crianças, como purés ou sumos de frutas. Uma vez que a via mais frequente de exposição a contaminantes dos alimentos é a ingestão, será importante caracterizar o impacto do processo de digestão sobre a disponibilidade e absorção destes compostos.

O presente estudo teve como objetivo determinar a variação de bioacessibilidade (fração de um composto que é libertado a partir da matriz alimentar, no trato gastrointestinal, durante a digestão) da patulina em sumos de fruta à base de maçã (turvos e límpidos) ao longo das diferentes fases do processo digestivo, utilizando para isso o método harmonizado de digestão in vitro. Este método apresenta como principal vantagem, relativamente aos descritos na literatura, o facto de ser harmonizado e de incluir um processo prévio de determinação das atividades das enzimas utilizadas durante a digestão in vitro. Neste estudo foram avaliados os valores médios de bioacessibilidade em 4 amostras de sumo de fruta à base de maçã, nas fases oral, gástrica e intestinal. Para avaliar o impacto do processo de digestão sobre a bioacessibilidade da patulina, utilizaram-se sumos de maçã artificialmente contaminados com esta micotoxina. A identificação e quantificação de patulina nas amostras foram realizadas por cromatografia líquida de alta eficiência com deteção por ultravioleta e extração em fase sólida (SPE- HPLC-UV). Segundo o conhecimento do autor, este é o primeiro estudo que descreve resultados de bioacessibilidade de patulina em sumos à base de maçã, ao longo das três fases do processo de digestão, aplicando o método harmonizado de digestão in vitro.

Os resultados de bioacessibilidade de patulina revelaram valores que variaram entre os 56,8% e 94,1% na fase oral, 62,6% e 98,0% na fase gástrica, e 5,4% e 51,2% na fase intestinal. A fase gástrica é a que apresenta valores médios de bioacessibilidade mais elevados (79,3 ± 9,6), próximos dos determinados na fase oral (77,8 ± 11,8%). A fase intestinal apresenta, por outro lado, valores médios de bioacessibilidade mais reduzidos (21,6 ± 16,2%). Não foram verificadas diferenças estatisticamente significativas entre os valores médios de bioacessibildade das fases oral e gástrica (p value = 0,828). Contudo, foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre as fases oral e gástrica em relação à fase intestinal (p value < 0,05), sugerindo assim que a maior redução de bioacessibilidade ao longo do processo digestivo da patulina ocorre durante a fase intestinal.

A comparação entre diferentes matrizes alimentares, turvas e límpidas, revelaram valores de bioacessibilidade semelhantes nas duas primeiras fases do processo digestivo, ou seja, na fase oral (límpido: 77,2 ± 18,0 %; turvo: 78,4 ± 9,7 %) e gástrica (límpido: 79,9 ± 16,3 %; turvo: 78,6 ± 3,3 %). Já na fase intestinal, os resultados obtidos revelam diferenças entre os sumos de matriz límpida (18,0 ± 4,7%) e os sumos de matriz turva (25,7 ± 26,8). Não se verificam, contudo, diferenças significativas na comparação entre matrizes, considerando cada fase do processo digestivo (p values obtidos nas diferentes fases - Oral: 0,939; Gástrico: 0,821; Intestinal: 1).

Face aos resultados obtidos neste estudo que revelaram valores elevados de bioacessibilidade de patulina na fase gástrica, e porque as crianças são consumidoras frequentes de alimentos à base de maçã, considera-se de extrema importância avaliar o risco associado à exposição das crianças a estes produtos. No futuro, sugere-se aumentar o número de estudos de bioacessibilidade de patulina usando o método harmonizado de digestão in vitro, em produtos à base de maçã e outros frutos consumidos por crianças.

v

Deverá ser ainda avaliada a possibilidade de aplicar novos métodos de digestão in vitro que permitam simular a digestão infantil, dado que este processo apresenta diferenças da digestão num adulto.

Palavras-chave: Patulina, bioacessibilidade, digestão in vitro, processo digestivo, crianças

vi

Abstract

Food can be contaminated with chemical compounds as mycotoxins. These secondary metabolites produced by fungi can produce serious health problems if not adequately controlled. Patulin, a mycotoxin that can promote health problems such as immunosuppressive, genotoxic, mutageneic and nephrotoxic effects, is present mainly in apples and apple-based foods, including those commonly consumed by children, such as baby purees or fruit juices. Since the most frequent exposure route for food contaminants is ingestion, the impact of the digestion process on the availability and absorption of these compounds should be well characterized.

The present study aimed to determine the patulin bioaccessibility(fraction of a compound that is released from the alimentary matrix in the gastrointestinal tract during digestion) variation throughout the different stages of the digestive process of apple-based fruit juices, using the harmonized in vitro digestion method. This method differs from other digestion methods because it is based on harmonized conditions and it includes a previous step for the determination of enzymatic activities. The mean bioaccessibility values were evaluated in 4 samples of apple juice in the oral, gastric and intestinal phases. To evaluate the impact of the digestion process on the bioaccessibility of patulin, artificially contaminated apple were used. The identification and quantification of patulin were performed by liquid chromatography with ultraviolet detection and solid phase extraction (SPE-HPLC-UV). According to the author's knowledge, this is the first study describing the bioaccessibility of patulin in apple based juices, during the three phases of the digestion process, applying the harmonized in vitro digestion method.

The bioacessibility results of patulin revealed values ranging from 56.8% to 94.1 in the oral phase, 62.6% and 98.0% in the gastric phase, and 5.4% and 51.2% in the intestinal phase. The gastric phase shows the highest average bioaccessibility values (79.3 ± 9.6), close to those determined in the oral phase (77.8 ± 11.8%). On the other hand, intestinal phase, presents the lowest average bioaccessibility values determined (21.6 ± 16.2%). There were no statistically significant differences between mean values of bioaccessibility of oral and gastric phases (p value = 0.828). However, statistically significant differences were found between oral - gastric and intestinal phases (p value <0.05), thus suggesting that most of the bioacessibility reduction of patulin occurs during the intestinal phase.

The comparison between different food matrices, cloudy and clear, shows very similar values of bioaccessibility in the first two phases of the digestive process, namely oral (clear: 77.2 ± 18.0 %; cloudy: 78.4 ± 9.7 %) and gastric (clear: 79.9 ± 16.3 %; cloudy: 78.6 ± 3.3 %). In the intestinal phase, the results show differences between the clear matrix juices (18.0 ± 4.7%) and the cloudy ones (25.6 ± 26.7). There were no significant differences between different matrices, considering each phase of the digestive process (p values obtained - Oral: 0.939; Gastric: 0.821; Intestinal: 1).

Due the obtained results in this study, that revealed high levels of bioaccessibility of patulin in the gastric phase, and considering that children are frequent consumers of apple-based foods, it is considered extremely important to assess the risk associated with children's exposure to these products. In the future, it is suggested to increase the number of patulin’s bioaccessibility studies using the harmonized method of in vitro digestion, in apple products and other fruits consumed by children.

The possibility of applying new in vitro digestion methods to simulate infant digestion should be further evaluated, as this process presents differences in digestion in an adult.

Particular importance should be given to the new in vitro infant digestion methods, which have been recently developed and will contribute to perform a more detailed risk assessment of child exposure to patulin through ingestion of fruit-based food.

vii

Key words: Patulin, bioaccessibility, in vitro digestion, digestive process, children

viii

Índice

Agradecimentos ................................................................................................................... ii

Resumo ............................................................................................................................... iv

Abstract .............................................................................................................................. vi

Lista de Tabelas e Figuras .................................................................................................. x

Lista de abreviaturas ........................................................................................................ xii

1 Introdução .................................................................................................................... 1

1.1 Caracterização geral de micotoxinas ............................................................................... 1 Micotoxinas e vias de exposição ................................................................................. 1 Principais grupos: estrutura química, fungos produtores e alimentos suscetíveis de

contaminação ............................................................................................................................. 2 Ocorrência, co-ocorrência e estudos em Portugal ........................................................ 7 Legislação Europeia ................................................................................................... 9 Determinação analítica em alimentos ........................................................................ 11

1.2 Efeitos das micotoxinas na saúde e biodisponibilidade ................................................. 13 Micotoxicoses e efeitos na saúde humana ................................................................. 13 Digestão humana e biodisponibilidade ...................................................................... 16 Biodisponibilidade e bioacessibilidade ...................................................................... 18 Modelos de digestão in vitro ..................................................................................... 19

2 Objetivos..................................................................................................................... 23

3 Material e métodos ..................................................................................................... 24

3.1 Caracterização das amostras ......................................................................................... 24 3.2 Determinação da atividade enzimática .......................................................................... 24

α-amilase .................................................................................................................. 24 Pepsina ..................................................................................................................... 27 Tripsina .................................................................................................................... 28

3.3 Método de digestão ......................................................................................................... 29 Preparação das soluções dos Fluídos Digestivos Simulados (FDS) ............................ 29 Alterações ao protocolo e justificação ....................................................................... 30 Preparação dos tubos teste ........................................................................................ 30 Preparação final dos FDS (Fluídos Digestivos Simulados) ........................................ 31 Protocolo de digestão in vitro ................................................................................... 31

3.4 Análise quantitativa de pautina por SPE-HPCL-UV .................................................... 33 Reagentes e soluções necessários .............................................................................. 33 Extração e purificação por SPE ................................................................................. 34 Determinação de patulina por análise cromatográfica ................................................ 35 Bioacessibilidade de patulina em sumos de maçã ...................................................... 36

4 Resultados e Discussão ............................................................................................... 38

4.1 Determinação da atividade enzimática .......................................................................... 38 4.2 Bioacessibilidade de patulina em sumos de maçã em diferentes fases da digestão....... 38

ix

4.3 Influência da matriz alimentar nos valores de bioacessibilidade .................................. 41

5 Conclusões e perspetivas futuras ............................................................................... 44

6 Referências bibliográficas .......................................................................................... 46

7 Anexos ........................................................................................................................ 56

x

Lista de Tabelas e Figuras

Tabelas

Tabela 1.1 - Principais micotoxinas, a sua estrutura química e respetivos fungos produtores.

Tabela 1.2 - Presença de micotoxinas em alimentos comercializados em Portugal

Tabela 1.3 – Teores máximos de micotoxinas em alimentos comercializados na União Europeia, presentes no Regulamento Nº1881/2006.

Tabela 1.4 - Classificação de micotoxinas quanto à sua carcinogenecidade.

Tabela 1.5 - Modelos de digestão in vitro aplicados ao estudo de micotoxinas e as suas principais características.

Tabela 3.1 - Composição e caracterização dos sumos de fruta à base de maçã utilizados para os estudos de bioacessibilidade de patulina.

Tabela 3.2 – Condições para a preparação da curva de calibração para a determinação da atividade enzimática da α-amilase.

Tabela 3.3 - Condições para a preparação dos tubos teste para o ensaio de determinação de atividade da α-amilase. Tabela 3.4 - Condições para a preparação dos tubos teste para o ensaio de determinação da atividade enzimática da pepsina.

Tabela 3.5 - Composição de cada um dos FDS (Fluídos Digestivos Simulados) utilizados para a realização das digestões in vitro.

Tabela 3.6 - Condições cromatográficas para a deteção de patulina.

Tabela 4.1 - Atividades enzimáticas utilizadas no modelo de digestão in vitro. (n=3 para cada uma das enzimas testadas)

Tabela 4.2 - Valores médios de bioacessibilidade (%) de patulina em sumos à base de maçã contaminados artificialmente, nas diferentes fases do processo digestivo (n= 5 – número de testes realizados em cada sumo para cada fase).

Tabela 4.3 - Valores de bioacessibilidade médios para as diferentes fases do processo digestivo, tendo em conta diferentes matrizes alimentares (Límpido e Turvo).

Figuras

Figura 1.1 - Bolor azul característico produzido por Peninsilum expansum. Ampliação (3x)

Figura 1.2 - Distribuição mundial da ocorrência de micotoxinas, segundo dados recolhidos em 2013 pelo BYOMIN Mycotoxin Survey.

Figura 1.3 - Bioacessibilidade vs Biodisponibilidade. Note-se que os valores de biodisponibilidade são apenas uma fração dos valores totais de bioacessibilidade.

Figura 1.4 – Comparação do modelo de digestão adulto e infantil in vitro.

Figura 3.1 - Cuvetes utilizadas para a determinação dos pontos da curva de calibração da α-amilase.

xi

Figura 3.2 - Imagem esquemática relativa à digestão in vitro nas diferentes fases do processo digestivo.

Figura 4.1 - Representação gráfica da bioacessibilidade média de patulina em sumos de fruta à base de maçã obtidas nas diferentes fases do processo digestivo (n=20, para cada fase do processo digestivo).

Figura 4.2 - Influência da matriz na bioacessibilidade da patulina em sumos límpidos e turvos à base de maçã.

xii

Lista de abreviaturas

µg - microgramas

µg/Kg - micrograma por kilograma

µL – microlitros

% - Percentagem

ΔAbs – variação de absorvância

Ax – Absorvância a determinado comprimento de onda em nanómetros

Abs - Absorvância

AFM1- Aflatoxina M1

AFTs - Aflatoxinas

CAST – Concelho para Ciência e Tecnologia Agrícola (Council for Agriculture Science and Technology)

CE - Comissão Europeia

Conc. - Concentração

CV- Coeficiente de variação

CVm – Coeficiente de variação do método

DAD – ensaio com díodo

DAN - Departamento de Alimentação e Nutrição

DP – Desvio Padrão

DON - Desoxinivalenol

DNA – Ácido Desoxirribonucleico

EFSA – Agência Europeia De Segurança Alimentar (European Food Safety Agency)

ELSD – Detetor evaporativo de espalhamento de luz (Evaporative light scattering detector)

FAO – Organização das Nações Unidas para a Agricultura e Alimentação (Food and Agriculture Organization)

FBx – Fumunisina B

FDA – Agência Americana de Controlo da Qualidade de Produtos Alimentares e Farmacêuticos (Food and Drug Administration)

FDS – Fluídos Digestivos Simulados

FGS – Fluído Gástrico Simulado

FIS – Fluído Intestinal Simulado

FLD – fluorescência (em relação ao método de deteção de micotoxinas)

FP - Fungo Produtor

FSA – Agência de Standards dos Alimentos (Food Standards Agency)

xiii

FSS – Fluído Salivar Simulado

FUM - Fumonisina

G – Gástrico (fase)

g - Grama

g/mol – Grama por mole

GC – Cromatografia gasosa

GC-FID – Cromatografia gasosa acoplada a ionização de chama

GC-ECD – Cromatografia gasosa acoplada a captura eletrónica

GLC - cromatografia gás-líquido

h - Hora

HPLC - Cromatografia Líquida de alta eficiência/pressão (High performance liquid chromatography)

HPLC-UV – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detetor UV

I – Intestinal (fase)

IAC – colunas de imunoafinidade

IARC – Agência Internacional de Investigação em Cancro (International Agency for Research on Cancer)

INSA - Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge

IUPAC - União Internacional de Química Pura e Aplicada (International Union of Pure and Applied Chemistry)

Kg - Kilograma

LC - cromatografia liquida

LLE - extração líquido-líquido

M –Mole

mM -milimole

m/v- relação massa-volume

min - minuto

mg/Kg – miligrama por kilo

mL - mililitro

MS – Espectrofotometria de massa

m/z – relação massa/carga

nm- nanómetros

NOAEL – Nível onde não se observam efeitos adversos (No Observed-Adverse-EffectLevel)

O – Oral(fase)

OMS – Organização Mundial de Saúde

xiv

OTA - Ocratoxina A

PAT – Patulina

PMTDI – Dose máxima diária tolerável (Provisional maximum tolerable daily intake)

PTDI – Dose diária tolerável (Provisional Tolerable Daily Intake)

PTWI -Dose semanal tolerável (Provisional Tolerable Weekly Intake)

ROS – Espécies Reativas de Oxigénio

RNA – Ácido Ribonucleico

SFE – Super Critic Fluid Extraction

Sol. - solução

SPE – Extração em fase sólida (Solid Phase Extraction)

SPSS - Statistical Package for the Social Sciences

TAME - p-toluene-sulfonyl-l-arginine methyl ester

TCA – Acido Triclosacético

UPLC - Cromatografia de ultra eficiência/pressão (Ultra performance liquid chromatography)

UV - ultra-violeta

v/v – relação volume/volume

vs - versus

WHO – Organização Mundial de Saúde (World Health Organization)

ZEN – Zearalenona

1

1 Introdução

1.1 Caracterização geral de micotoxinas

Micotoxinas e vias de exposição

Os humanos têm estabelecido uma interação com os fungos desde a antiguidade, aproveitando as suas potencialidades em beneficio das atividades humanas nomeadamente a nível alimentar como na produção de queijo, cerveja e pão, e na saúde aproveitando compostos fúngicos de utilização industrial como as acetonas, os álcoois, e outras substâncias fisiologicamente ativas na produção de enzimas e de antibióticos (Bhat et al., 2010; Köppen et al., 2010). Para além dos efeitos benéficos, ocorrem algumas espécies de fungos, capazes de produzir substâncias com efeitos negativos na saúde humana, através da produção de metabolitos secundários com alta capacidade toxicológica, as micotoxinas (Alvito, 2014).

Considerados compostos de baixo peso molecular, as micotoxinas apresentam grande diversidade a nível estrutural, o que lhes confere propriedades químicas e fisiológicas bastante distintas, podendo desenvolver-se numa vasta gama de condições climatéricas. Atualmente, as micotoxinas aparentam não ter qualquer função ao nível do metabolismo dos fungos que as produzem, sendo produzidas, maioritariamente, quando estes atingem a maturidade (Rocha et al., 2014).

O termo micotoxina, que deriva da palavra grega “mykes” (fungos) e do latim “toxicum”, foi pela

primeira vez utilizado no início dos anos 60, quando uma grave crise veterinária levou à morte de cerca de 100.000 perús no Reino Unido. A doença ficou então conhecida como “doença X dos perús”.

Posteriormente descobriu-se que o problema residiu na ingestão de rações à base de amendoim contaminadas com aflatoxinas. A partir deste evento, a investigação científica sobre estes metabolitos tem registado um aumento crescente (Bennett & Klich, 2003; Köppen et al., 2010) sendo atualmente um tópico de relevância no domínio da segurança alimentar segundo a Autoridade Europeia de Segurança Alimentar (EFSA) devido os efeitos que podem provocar na saúde relacionado com as alterações climáticas (https://www.youtube.com/watch?v=yi46ZQLjMYw).

A FAO estima que 25% dos cereais produzidos mundialmente estejam contaminados com micotoxinas (Rice & Ross, 1994). Mas não só os cereais são alvos de contaminação. As micotoxinas estão também presentes em nozes, amendoins, especiarias, frutas e seus derivados, entre outros. (Marin, et al., 2013). A produção de micotoxinas nas culturas agrícolas pode ocorrer em diversas períodos: na pré-colheita, durante a colheita e secagem, ou no armazenamento. Deficientes práticas agrícolas, tanto ao nível da plantação como na colheita, secagens incorretas e um mau manuseamento, acondicionamento, armazenamento e transporte da matéria-prima, promovem o crescimento de fungos, aumentando o risco de produção de micotoxinas (Bhat et al., 2010). A contaminação com micotoxinas é por isso responsável por grandes perdas económicas a nível da indústria alimentar. Estima-se que ocorram perdas na ordem dos 5-10% da produção agrícola global, devido à contaminação com micotoxinas. Nos Estados Unidos, os dados existentes revelam que as micotoxinas sejam responsáveis por perdas diretas de aproximadamente de 932 milhões de dólares por ano e por perdas indiretas (custos decorrentes da implementação e aplicação de regulamentação e de medidas de controlo) de mais de 466 milhões (CAST, 2003). As micotoxinas podem também ser responsáveis por perdas da indústria pecuária, caso se verifique que a alimentação fornecida aos animais está contaminada. Rações alimentares animais contaminadas com micotoxinas, podem levar à recusa da alimentação por parte do animal, resultando diretamente numa diminuição de ganho de peso, e por conseguinte potenciação de casos de má-nutrição, que em casos mais graves podem gerar casos de imunossupressão (diminuição da resistência dos

2

animais a infeções), deficiência das capacidades reprodutivas, ou mesmo levar à morte dos animais (Abrunhosa et al., 2014).

A exposição às micotoxinas pode ocorrer por três vias: alimentar direta (através do consumo de alimentos de origem vegetal contaminados, geralmente cereais); alimentar indireta (consumo de produtos animais ou de origem animal, que estiveram expostos a micotoxinas) ou pela via respiratória e dérmica (inalação de ar contaminado; ou contacto com esporos de fungos patogénicos) (Marin et al., 2013; Rocha et al., 2014).

Relativamente à exposição por via respiratória, é possível recordar um episódio ocorrido com o fungo Stachybotrys chartarum, responsável nos Estados Unidos da América, durante o início dos anos 90, por um surto de hemorragia pulmonar aguda em crianças. Numa avaliação posterior, foi detetada a presença deste fungo no pó e nas superfícies das habitações das crianças afetadas por esta doença, presumindo-se assim que a inalação de esporos de S. chartarum tenha estado na origem deste surto (Shephard, 2006; Nelson, 2001).

Outra importante via exposição, a via dérmica, está também associada a diversos efeitos nocivos para a saúde, resultantes da exposição a micotoxinas. Estes efeitos podem ser mais frequentes para os trabalhadores da indústria alimentar, que durante o manuseamento de géneros alimentícios contaminados com fungos, podem contactar com micotoxinas. Para averiguar quais os efeitos da exposição dérmica durante o manuseamento de maçãs contaminadas com patulina, Saxena e colaboradores realizaram um estudo em pele de rato para avaliar os efeitos genótoxicos dessa exposição. Os investigadores concluíram que um valor de exposição de 160 µg de patulina foi suficiente para provocar lesões no DNA, conduzindo também a paragem do ciclo celular e apoptose (Saxena, et al., 2009).

Contudo, a principal via de exposição humana a micotoxinas é a ingestão de alimentos contaminados. Sendo produzidas por uma grande variedade de espécies de fungos, as micotoxinas são maioritariamente encontradas nos seguintes géneros alimentícios: cereais, nozes, fruta seca, café, cacau, especiarias, sementes, ervilhas secas, leguminosas e em fruta fresca, onde se destaca nesta última categoria, as maçãs. Como consequência da utilização de matéria-prima contaminada, as micotoxinas podem também estar presentes na cerveja ou vinho, e outros alimentos processados (Turner et al. 2009).

Principais grupos: estrutura química, fungos produtores e alimentos suscetíveis de contaminação

Apesar de terem sido descritas até à data mais de 500 micotoxinas diferentes (Rocha et al., 2014), consideram-se como mais relevantes do ponto de vista da saúde humana: as aflatoxinas (AFTs), a ocratoxina A (OTA), os tricotecenos (por exemplo o desoxinivalenol e a toxina T-2) as fumonisinas (FUM), a zearalenona (ZEN), os alcaloides de Ergot e a patulina (PAT) (Bhat et al., 2010). As micotoxinas apresentam grande diversidade a nível estrutural, resultando na existência de diferentes propriedades químicas e físico-químicas entre elas. Contudo, na generalidade, estas aparentam ser compostos estáveis a nível químico e térmico, tendo assim capacidade de sobreviver à maioria dos processos de armazenamento e de produção (Köppen et al., 2010).

A estrutura química das principais micotoxinas com efeitos relevantes na saúde humana, bem como os fungos associados à sua produção e alimentos suscetíveis de contaminação por estes compostos, podem ser encontrados na Tabela 1.1.

3

Tabela 1.1 - Principais micotoxinas, estrutura química e fungos produtores (adaptado de Koppen et al. 2010; Etzel el al. 2006; Shepard 2008).

Aflatoxinas

Aflatoxina B1

Aflatoxina B2

Aflatoxina G1

Aflatoxina G2

Aflatoxina M1

Aflatoxina M2

FP: Aspergillus flavus; Aspergillus parasiticus A: Cereais (milho, arroz, trigo, sorgo), especiarias, frutos secos (nozes, amendoins, amêndoas), leite de origem animal e respetivos derivados, ovos, carne

Fumonisinas

Fumonisina B1

Fumonisina B2

Fumonisina B3

FP: Fusarium verticilloides; Fusarium proliferatum; Aspergillus ochraceus

A: Milho, produtos à base de milho, sorgo, espargos, arroz, leite de origem animal

Alcaloides de Ergot

Ergocornina

Ergocristina

Ergocriptina

Ergometina

Ergotamina

4

FP: Claviceps purpurea

A: Centeio, trigo e triticale

Tricotecenos

DON

T-2

FP: Fusarium culmorum; Fusarium graminearum; Fusarium cerealis; Fusarium sporotrichiodes

A: Cereais e produtos à base de cereais

Ocratoxina A Patulina Zearanelona

FP: Aspergillus ochraceus; Aspergillus niger;

Aspergillus carbonarius

A: Cereais, café, vinho, passas, aveia, especiarias, centeio

FP: Penicillium expansum;

Aspergillus sp.

A: Maçãs e derivados, pera, pêssego, cereja, uvas, mirtilos

FP: Fusarium graminearum;

Fusarium culmorum

A: Cevada, aveia, arroz de trigo, sorgo, sésamo, soja, produtos à base de cereais

FP: Fungo Produtor; A: Alimentos suscetíveis de contaminação

De seguida será apresentada uma breve descrição dos grupos de micotoxinas descritos.

Aflatoxinas

As aflatoxinas são derivadas das difuranocumarinas produzidas por algumas estirpes de Aspergillus

flavus e Aspergillus parasiticus, presentes em muitas culturas agrícolas. Os fungos produtores de aflatoxinas são maioritariamente encontrados em climas quentes e temperaturas, onde as temperaturas variam entre os 24ºC e os 35ºC. Os países em desenvolvimento, principalmente os que apresentam climas quentes e temperados, estão identificados como sendo bastante suscetiveis à exposição a esta micotoxina. Existem 6 aflatoxinas principais, sendo elas: aflatoxina B1 (AFB1), aflatoxina B2 (AFB2), aflatoxina G1 (AFG1), aflatoxina G2 (AFG2), aflatoxina M1 (AFM1) e a aflatoxina M2 (AFM2) (De Ruyck et al., 2015). A nomenclatura das primeiras quatro aflatoxinas referidas foi estabelecida com base na sua fluorescência sob luz ultravioleta (azul (blue B) ou verde (green G)) e com base no seu comportamento em cromatografia em camada fina. Relativamente às aflatoxinas M1 e M2, estas correspondem, respetivamente, aos metabolitos principais das aflatoxinas B1 e B2, comummente detetados no leite (Bennett & Klich, 2003).

As aflatoxinas podem estar presentes em diversos alimentos incluindo amendoins, frutos de casca rija, frutos secos e cereais (em particular milho) e especiarias. Alguns dos alimentos referidos são muito utilizados na confeção de produtos destinados à alimentação infantil (por exemplo, cereais e frutos de

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casca rija). Além disso, esta micotoxina é também muito estável, o que lhe confere elevada resistência aos métodos de processamento por aquecimento, sendo assim também consideradas como toxina de risco em alimentos processados (Marin et al., 2013).

Fumonisinas

As fumonisinas são micotoxinas produzidas principalmente pelos fungos Fusarium verticillioides e Fusarium proliferatum (Wu, 2006). Foram identificadas pelo menos 15 fumonisinas diferentes, onde se destacam as fumonisinas do grupo B, devido aos seus efeitos tóxicos. A fumonisina B1 (FB1) é a mais frequententemente encontrada em produtos alimentares (Zollner et al., 2006), no entanto os seus isómeros fumonisina B2 (FB2), fumonisina B3 (FB3), fumonisina B4 (FB4) são também regularmente encontrados.

Contaminantes regulares do milho e de outros cereiais de grão, estas micotoxinas encontram-se disseminadas um pouco por todo o mundo, principalmente em regiões de temperaturas elevadas e climas húmidos (Bryla et al., 2013).

Alcaloides de Ergot

Os fungos do género Claviceps são conhecidos pela sua produção de alcaloides de Ergot, que podem crescer como fungos parasíticos na relva ou em grãos de cereais. Recentemente, outros fungos da família Ascomycota, tais como Aspergillus, Penicillium e Epichloë, foram identificados como sendo também produtores de alcaloides de Ergot (Chen et al., 2017).

Tricotecenos

Os tricotecenos constituem uma família de cerca de 170 compostos. Estas micotoxinas são produzidas por um número alargado de géneros de fungos, tais como Fusarium, Myrothecium, Phomopsis,

Stachybotrys, Trichoderma e Trichothecium.

São considerados compostos bastante estáveis, resistindo às condições de armazenamento e processamento, não sendo degradados após exposição a altas temperaturas. Os cereais mais comummente infetados com tricotecenos são o milho e o trigo, sendo mais raramente encontrados em aveia, arroz, centeio e sorgo (Bennett&Klich, 2003; Pestka, 2010; Raiola et al., 2015).

Ocratoxina A

A ocratoxina A (OTA) é uma micotoxina produzida por diversas espécies de Aspergillus e de Penicillium, incluindo Aspergillus ochraceus e Penicillium verrucosum (Turner et al., 2009, Zinedine et al., 2009) em climas semitropicais e temperados (Zollner et al., 2006). Esta micotoxina é das mais frequentemente encontradas em países europeus, e os fungos produtores desta micotoxina podem desenvolver numa vasta gama de temperatura e humidade, podendo variar entre os 20 ºC e 37ºC, e entre 0.77 e 0.99 de humidade relativa (De Ruyck et al., 2015; Marin et al., 2013; Sherif et al., 2009).

Sendo encontrada em diferentes partes do mundo, esta micotoxina foi já encontrada numa vasta gama de alimentos, entre eles cereais de grão, café, cacau, vinho, cerveja e em algumas amostras de carne de porco (Marroquín-Cardona et al., 2014; Rocha et al., 2014; Sherif et al., 2009). É conhecida por ser um composto bastante estável, tal como outras micotoxinas com possível impacto na saúde humana, pelo que as técnicas de processamento alimentar têm pouco ou nenhum efeito na redução da sua presença em alimentos contaminados (Bui-Klimke&Wu, 2014hus; Marin et al., 2013).

Zearelenona

A zearalenona (ZEN) é uma micotoxina produzida por várias espécies de Fusarium, particularmente F.

graminearum e também F. culmorum, F. equiseti e F. verticillioides. A ZEN é uma micotoxina comum

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nas regiões temperadas e níveis elevados desta micotoxina são normalmente detetados em climas temperados e húmidos, sendo também detetada quando os alimentos são armazenados inadequadamente em condições de alta humidade (Marroquín-Cardona et al., 2014).

Esta micotoxina é encontrada maioritariamente no milho, no entanto pode ser encontrada noutras culturas de cereais, como o trigo, cevada, sorgo e centeio (EFSA, 2011a, Marin et al., 2013).

Patulina

A patulina (4-hydroxy-4H-furo[3,2-c]pyran-2(6H)-one – definição IUPAC) faz parte do grupo das lactonas tóxicas e é descrita como sendo resistente ao calor, estável em ambiente ácido, instável em ambiente básico e solúvel em água. É uma substância de cor branca cristalina com um ponto de fusão de 110.5 º C, peso molecular de 154 Dalton e de absorção máxima em UV no comprimento de onda 276 nm (Azizi and Rouhi, 2013). É descrita como tendo uma forte afinidade pelos grupos sulfidrilo, estando o seu efeito tóxico relacionado não só com a ligação covalente que estabelece com os grupos reativos de sulfidrilo de proteínas celulares, como também pela depleção de glutationa, gerando danos oxidativos que, por conseguinte, levam à formação de espécies reativas de oxigénio (ROS) (Azizi and Rouhi, 2013; Marin et al., 2013).

A patulina foi pela primeira vez isolada em 1943 por Birkinshaw e colaboradores, a partir Penicillium

griseofulvum e Penicillium expansum. Esta descoberta veio no seguimento do esforço feito pela comunidade científica, para encontrar outros metabolitos fúngicos com propriedades antibióticas, após a descoberta da penicilina Este metabolito foi testado em diversos estudos clínicos após a sua descoberta, contudo o seu interesse médico rapidamente se desvaneceu, quando se descobriu a sua toxicidade para humanos e animais (Puel et al., 2010; Zbyňovská et al., 2016).

A sua produção ocorre principalmente em frutos danificados tais como a pera, o pêssego, cerejas, uvas, cereais, hortícolas, entre outros. Contudo, a maioria das contaminações ocorrem sobretudo na maçã e nos produtos à base de maçã (Beretta et al., 2000).

Figura 1.1 -Bolor azul característico produzido por Peninsilum expansum. Ampliação (3x) (Retirado de Tannous et al.2017)

Em Portugal, a patulina tem sido alvo de diversos estudos de ocorrência e consequente risco de exposição da população, principalmente nos grupos mais vulneráveis. Num dos estudos realizados sobre sumos e purés de maçã destinados a crianças, foi possível verificar que os níveis de patulina se encontram abaixo dos níveis regulamentados para alimentos à base de maçã destinados a lactentes e crianças jovens, demonstrando alguma segurança nos produtos comercializados no nosso país (Barreira et al., 2010). Outros estudos realizados em Portugal irão ser referidos mais detalhadamente no subcapítulo Estudos e Projetos em Portugal.

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Ocorrência, co-ocorrência e estudos em Portugal

Distribuição geográfica mundial

Existem zonas do globo mais suscetíveis à exposição a micotoxinas que outras, sendo que o risco de exposição às micotoxinas é menor nos países desenvolvidos comparativamente aos países em desenvolvimento. A grande variedade da dieta nos países desenvolvidos e o controlo rigoroso exercido pelas autoridades competentes na fiscalização dos alimentos, garantindo assim o cumprimento dos valores máximos fixados, são dois fatores que influenciam a menor exposição verificada. Nos países em desenvolvimento, onde o clima tropical propicia o desenvolvimento de fungos (África Subsariana e Sudeste Asiático), as dietas são menos variadas, e muitas vezes assentes em agricultura de subsistência; as aquisições de alimentos são efetuadas em mercados locais onde é dada pouca importância aos padrões de qualidade dos mesmos. A escassez alimentar verificada nestes países contribui também para um menor critério na seleção dos alimentos adquiridos por estas populações. Além disso, a legislação nestes países é inexistente ou quando existe, é muitas vezes negligenciada pelas autoridades reguladoras (Shephard, 2008b). A atual prática dos países desenvolvidos consiste no controlo e rejeição de alimentos que apresentam contaminações e que excedem os valores máximos permitidos. Esta atuação deveria contudo apoiar a prevenção da contaminação e a monotorização de micotoxinas em alimentos bem como a implementação de boas práticas agrícolas nos países menos desenvolvidos (Zain, 2011).

Figura 1.2 - Distribuição mundial da ocorrência de micotoxinas, segundo dados recolhidos em 2013 pelo BYOMIN Mycotoxin Survey. (Retirado de Nährer & Kovalsky, 2014). Legenda: North America: América do Norte; South America: América do Sul; Central Europe: Europa Central; Northern Europe: Norte da Europa; Eastern Europe:

Europa de Leste; Southern Europe: Europa do Sul; Middle East: Médio Oriente; South Africa: África do Sul; South Asia: Sul Asiático; South-East Asia: Sudeste Asiático; North Asia: Norte da Ásia.

Apesar da sua menor ocorrência no continente europeu comparativamente a outras zonas do globo, existem estudos que descrevem a ocorrência de micotoxinas um pouco por todo o globo, como se verifica na Figura 1.2. Os resultados descritos na Figura 1.2, resultantes de um estudo, que se dedicou a avaliar, em mais de 4200 amostras, a ocorrência de AFT, DON, ZEN, FUM e OTA, realizado em 2013, é descrita a presença de AFT em 30% das amostras, ZEN em 37%, DON em 59%, FUM em 59% e OTA em 23%. Contudo apenas uma percentagem destas amostras mostravam contaminação igual ou superior ao legalmente legislado pelo Regulamento 1881/2006 da CE. Os resultados deste estudo

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demonstraram ainda que de todas as amostras analisadas, 42,5% mostraram contaminações com DON acima dos 200 µg/kg. Relativamente às amostras de alimentação animal analisadas, foi possível verificar que 12,5% apresentavam concentrações desta mesma micotoxina acima dos 900 µg/kg, o que ultrapassa os limites estabelecidos pelas diretivas europeias (Nährer & Kovalsky, 2014).

Co-ocorrência

Os estudos internacionais efetuados referem um aumento crescente de co-ocorrência de micotoxinas em alimentos, sendo por isso, cada vez mais um tema de interesse para a comunidade científica (Alvito et al., 2010, Grenier & Oswald, 2011, Pereira et al., 2014, Assunção et al., 2015 ; Stoev, 2015). A presença de múltiplas micotoxinas nos alimentos aumenta a probabilidade de ocorrência de quadros de toxicidade e carcinogenecidade, comparativamente à exposição a apenas uma micotoxina (Grenier & Oswald, 2011). A co-ocorrência de micotoxinas em cereais, pode ser explicada pelo facto da maioria dos fungos ser capaz de produzir diferentes micotoxinas simultaneamente, os alimentos poderem ser contaminados por mais do que um fungo ao mesmo tempo, e as dietas serem geralmente efetuadas tendo por base múltiplas fontes de cereais (Smith et al., 2016). Um estudo realizado durante três anos, a nível mundial indica que 48% das 7049 amostras analisadas estavam contaminadas com duas ou mais micotoxinas (Rodrigues et al., 2012). Neste domínio encontram-se disponíveis os resumos da 1ª Conferencia Internacional sobre contaminantes químicos em Alimentos (ICFC2015) dedicada especificamente aos desafios sobre as misturas em alimentos, nomeadamente micotoxinas

Estudos e projetos em Portugal

A presença de micotoxinas nos alimentos comercializados em Portugal é normalmente semelhante à encontrada noutros países da União Europeia (Abrunhosa et al., 2016). A caracterização da ocorrência de micotoxinas nos alimentos comercializados em Portugal pode ser encontrada sumarizada na Tabela 1.2, onde foram analisados diversos alimentos suscetíveis de contaminação.

Tabela 1.2 – Presença de micotoxinas em alimentos comercializados em Portugal (adaptado de Assunção et al., 2017)

Micotoxinas Alimentos Autores

AFT Alimentos infantis, leite, iogurte, queijo e outros produtos lácteos; Amendoim, milho, figos secos e especiarias

(Alvito et al., 2010; Martins et al., 2007, 2005, 2001; Martins, 2004; Martins et al., 2000; Peito e Venâncio, 2004)

OTA Alimentos infantis e infantis; Cereais e produtos à base de cereais; Café; Especiarias; Vinho

(Alvito et al., 2010; Assunção et al., 2016b; Bento et al., 2009; Duarte et al., 2010; Juan et al., 2008a, 2008b, 2007; Lino et al., 2006; Martins et al., 2003; Miraglia e Brera 2002, Paíga et al., 2013; Peito e Venâncio, 2004, Pena et al., 2010, 2005, Serra et al., 2006a, 2006b, 2004)

PAT Maçãs e produtos à base de maçã, outras frutas frescas

(Assunção et al., 2016a; Barreira et al., 2010; Cunha et al., 2009; Majerus e Kapp, 2002; Martins et al., 2002)

FUM Produtos à base de cereais, especialmente produtos à base de milho e baseados em milho

(Lino et al., 2006; Lino et al., 2007; Martins et al., 2008)

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DON Produtos à base de cereais (Cunha e Fernandes, 2010; Marques et al., 2008; Martins et al., 2008; Martins e Martins, 2001; Peito e Venâncio, 2004)

ZEN Produtos à base de cereais (Cunha e Fernandes, 2010; Marques et al., 2008; Peito e Venâncio, 2004)

No âmbito dos estudos de ocorrência de micotoxinas desenvolvidos em Portugal, é de realçar os trabalhos efetuados sobre alimentação infantil, dado que as crianças constituem um grupo vulnerável da população e a sua exposição a compostos tóxicos no presente poderá estar associada a problemas futuros de saúde.

Os dados recolhidos em Portugal, inicialmente descritos por Alvito e colaboradores (Alvito et al. 2010), destacaram a presença de aflatoxinas e ocratoxina A, em alimentos para bebés e salientaram os potenciais problemas de saúde associados, resultante da ingestão de alimentos contaminados. Posteriormente, no âmbito do projeto MYCOMIX (https://www.youtube.com/watch?v=CsKaz3mt2J4), os investigadores propuseram-se avaliar o risco de exposição das crianças portuguesas às micotoxinas, bem como determinar a probabilidade de co-ocorrência destes metabolitos secundários na alimentação destinada a este grupo populacional e o seu impacto na saúde humana. Os dados de frequência alimentar das crianças foram recolhidos através de inquérito numa Unidade de Saúde Primária de Lisboa (Leal et al.,2015), e posteriormente, os alimentos mais frequentemente descritos nos inquéritos foram sujeitos a análises químicas para determinação de micotoxinas. Os estudos subsequentes detetaram a presença de misturas de várias micotoxinas, revelando que 94% das amostras analisadas apresentavam contaminação com pelo menos uma micotoxina, contudo, em concentrações abaixo dos limites legislados (Assunção et al., 2015). Relativamente à co-contaminação, esta foi verificada em 75% das amostras avaliadas Também se verificou que a exposição a aflatoxinas pode constituir um perigo para as crianaças com um percentil igual ou inferior a 50, tendo em conta os dados recolhidos (Assunção et al., 2015). Um estudo mais recente focado em, avaliar a co-ocorrência de micotoxinas e seus metabolitos presentes nos cereais de pequeno-almoço destinados a crianças, revelou que em 96% das amostras analisadas estavam presentes várias micotoxinas (Martins et al., 2018).

Neste projeto para além da ocorrência e avaliação da exposição a micotoxinas, foram ainda efetuados estudos sobre os seus potenciais efeitos na saúde, usando métodos in vitro, nomeadamente, estudos de citotoxicidade, genotoxicidade e bioacessibilidade destes compostos, individuais e em mistura (Assunção et al., 2017). Foi ainda disponibilizado o primeiro livro escrito em língua portuguesa integrando uma revisão das principais áreas de pesquisa no domínio das micotoxinas (Alvito, 2014). Este livro teve como objetivo a divulgação e sensibilização da população sobre os potenciais perigos das micotoxinas na alimentação

Legislação Europeia

Devido à necessidade de proteger a saúde dos consumidores dos efeitos provocados pela ingestão de alimentos contaminados com micotoxinas, houve a necessidade de criar legislação que permitisse regular os teores máximos de micotoxinas presentes nos alimentos e rações para animais. Organizações como a Comissão Europeia (CE), a Agência Americana para o Controlo de Alimentos e Produtos Farmacêuticos (FDA), a Organização Mundial da Saúde (OMS), a Organização das Nações Unidas para a Agricultura e Alimentação (FAO), entre outras, tem-se dedicado a essa área de estudo. Os limites para regulamentação são normalmente estabelecidos através de estudos dose-resposta realizados em animais,

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onde se determina a dose mais elevada que não produz efeitos adversos para a saúde, denominado de NOAEL (No-Observed-Adverse-Effect-Level), que é multiplicado por um fator de 100 (originado por dois factores de 10, um relacionado com a extrapolação dos dados dos animais para o Homem (variação inter-espécie) e o outro com a variação de sensibilidade entre diferentes indivíduos (variação intra-espécie)). Este valor permite-nos calcular o PTDI (Provisional Tolerable Daily Intake) ou o PTWI (Provisional Tolerable Weekly Intake), que são estimativas das doses toleráveis para consumo humano diário ou semanal, respetivamente, expressas em miligramas de composto por kilograma de peso corporal do individuo (mg/Kg) e que à luz do conhecimento médico e cientifico atual não apresentam riscos consideráveis para a saúde (WHO, 1995; FSA, 2014). Na União Europeia, o Regulamento Nº1881/2006 estabelece os limites máximos para as principais micotoxinas. Os valores estabelecidos têm em consideração os grupos de riscos e mais vulneráveis, como é o caso dos lactentes e crianças jovens (Comissão Europeia, 2006) como se ilusta na Tabela 1.5.

Tabela 1.3 – Teores máximos de micotoxinas permitidos em alimentos comercializados na União Europeia, presentes no Regulamento Nº1881/2006.

Micotoxina Alimentos Teor máx.

(µg/kg)

Teor máx. p/crianças

(µg/kg)

AFT Cereais, frutos secos, leite de origem

animal, entre outros 15 0,025

OTA Cereais, café e vinho 10 0,5

DON Cereais 1750 200

FUM Culturas de milho e sorgo 2000 200

ZEN Cereais, banana e tomate 200 20

PAT Maçãs e derivados, pera, pessego,

cereja, uvas 50 10

As crianças são consideradas como mais suscetíveis aos efeitos das micotoxinas, do que os adultos, devido ao seu baixo peso corporal, alta taxa metabólica, baixa capacidade de destoxificação e pelo ainda imaturo desenvolvimento de tecidos, órgãos e do sistema nervoso e imunológico (Sherif et al., 2009; WHO, 2011). É importante recordar que, atualmente, a exposição crónica a micotoxinas é aquela que reúne maior atenção da comunidade científica, devido à exposição a pequenas quantidades durante longos períodos de tempo (Bennett & Klich, 2003; De Ruyck et al., 2015). Este facto reúne especial importância se considerarmos que as crianças têm um maior espaço temporal para desenvolver doenças crónicas, sendo que é expectável que tenham mais anos de vida comparativamente aos adultos e consequentemente, quaisquer efeitos adversos observados numa idade jovem podem ter um impacto significativo na sua vida adulta (Assunção et al., 2014).

A exposição das crianças a compostos tóxicos, comparativamente com a dos adultos, apresenta particular relevância já que: i) as crianças consomem maior quantidade de alimentos e água comparativamente aos adultos, se considerarmos a relação massa (de alimentos consumidos) por peso

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corporal, resultando assim numa maior exposição a certos compostos; ii) as dietas infantis podem ser geralmente baseadas em certos tipos de alimentos com maior potencial de contaminação por micotoxinas (por exemplo frutas e cereais); iii) num contexto de exposição, o metabolismo das crianças tem menor capacidade de destoxificação, existindo também diferenças na interação composto/organismo infantil, considerando a sua menor área corporal e o seu imaturo desenvolvimento (Boon et al., 2009; Raiola et al., 2015; Sherif et al., 2009).

Determinação analítica em alimentos

As micotoxinas são compostos com diferentes estruturas químicas pelo que foi necessário desenvolver métodos analíticos seletivos e sensíveis para a sua deteção e quantificação.

A determinação dos níveis de micotoxinas em alimentos é usualmente realizada por métodos que incluem várias etapas comuns: amostragem, homogeneização, extração seguida de purificação, e por fim deteção e quantificação (Koppen et al.2010). Atualmente existe uma grande variedade de métodos laboratoriais que nos permitem separar as toxinas da matriz alimentar. Existem três fatores principais a ter em atenção para a seleção de um eficiente método de extração e purificação de micotoxinas: as propriedades químicas das micotoxinas, a natureza da matriz alimentar e o método de deteção a ser usado (Alshannaq & Yu, 2017).

Extração e purificação

A maioria dos alimentos líquidos são normalmente sujeitos a uma extração liquido-liquido para uma separação preliminar das micotoxinas. A maioria das micotoxinas é altamente solúvel em solventes orgânicos, tais como o metano, acetonitrilo, acetona, clorofórmio, diclorometano, ou acetato de etilo (Pereira et al., 2014; Alshannaq & Yu, 2017).

O processo de purificação das amostras é um passo muito importante para eliminar substâncias que possam interferir com o processo de deteção. Purificando o extrato, a especificidade e a sensibilidade aumentam, resultando numa maior precisão e exatidão. Vários métodos de purificação de amostras têm sido desenvolvidos ao longo dos anos, entre os quais se destacam: separação liquido-liquido (LLE), extração em fase sólida (SPE), colunas de imunoafinidade (IAC), extração com fluido supercrítico (SFE-SuperCritical Fluid Extraction,), cromatografia em coluna, colunas de troca iónica, entre outros. No entanto os métodos mais utilizados são os métodos SPE e IAC já que são métodos de aplicação rápida, eficientes, reproduzíveis, seguros e com uma alta taxa de seletividade (Koppen et al., 2010; Shephard et al., 2016; Alshannaq & Yu, 2017).

A extração em fase sólida (SPE), inclui uma variação de técnicas cromatográficas baseadas em cartuchos descartáveis de sílica gel, onde a amostra é introduzida na coluna de separação juntamente com um solvente - fase móvel - que flui através da coluna a baixa pressão. A conjugação entre a fase móvel e a fase estacionária, transporta os componentes da amostra q passem através da coluna (silica gel) ou fiquem retidos na mesma. Normalmente as colunas SPE têm uma alta capacidade de ligação a moléculas de pequenas dimensões. Embora a técnica de SPE seja, atualmente, a mais utilizada para a análise de micotoxinas, não deixam de existir algumas desvantagens no seu uso, já que atualmente ainda não existe nenhum cartucho/coluna de separação transversal a todas as micotoxinas, havendo necessidade de uma pré-seleção, aumento assim a especificidade para a toxina em estudo (Sigma, 2014; Turner et al., 2015).

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Determinação analítica (cromatografia e técnicas derivadas)

As técnicas de cromatografia incluem um conjunto de métodos que permitem separar e identificar componentes de uma determinada solução em mistura. A separação dos componentes é resultante das diferenças nas velocidades de eluição dos componentes na fase móvel, motivadas pelas diferentes interações com a fase estacionária.

O método cromatográfico é o mais utilizado para a determinação analítica de micotoxinas em alimentos, e tem sido a base de avaliação dos últimos 50 anos. Atualmente, existe uma grande variedade de técnicas cromatográficas, e a maioria tem sido desenvolvida para que sejam rápidas, simples e de baixo custo, garantindo ao mesmo tempo uma elevada sensibilidade e seletividade. Uma dessas técnicas é a cromatografia líquida de alta performance (HPLC) acoplada com detetor de ultravioletas (UV), díodos (DAD) e fluorescência (FLD) e espetrofotometria de massa (MS), Além dos métodos de cromatografia líquida, existem alternativamente os métodos de cromatografia gasosa (GC), que usualmente estão acoplados a vários detetores tais como o de ionização de chama (GC – FID), de captura electrónica (GC – ECD) ou de massa (GC-MS) (Koppen et al., 2010; Pereira et al., 2014; Shephard et al., 2016).

A técnica de HPLC é das ferramentas mais utilizadas na química analítica pois tem a capacidade de separar, identificar e quantificar componentes com concentrações vestigiais, permitindo a separação de componentes de uma amostra com elevada resolução em tempos relativamente curtos (Songsermsakul et al., 2008; Koppen et al., 2010). Neste método, uma bomba aplica uma alta pressão sob a fase móvel líquida, forçando-a a migrar através da coluna. Ao mesmo tempo, um injetor vai injetando a amostra num fluxo contínuo da fase móvel, transportando-o até ao interior da coluna de HPLC. A coluna de HPLC contém uma fase estacionária, que é essencial para uma eficiente separação dos componentes da amostra. De forma a otimizar o processo, pode recorrer-se a uma pré-coluna, que irá reter compostos indesejáveis, atuando como um filtro. Para a deteção de compostos, é essencial a existência de um detetor, constituído por uma célula de fluxo que pode ser ultravioleta, fluorescente, ou universal como o ELSD (da sigla inglesa evaporative-light-scattering detector). A escolha do detetor é feita consoante o tipo de composto a analisar (Koppen et al., 2010; Shephard et al, 2016).

A separação por HPLC baseia-se, tal como nas outras técnicas cromatográficas, nas características químicas dos compostos presentes. As principais características para a separação de compostos são a polaridade, a carga elétrica e o tamanho molecular (Barreira et al., 2009; Waters, 2013).

O resultado de um processo de cromatografia é um cromatograma, que nos indica a separação química dos compostos em estudo. Normalmente a sua representação, tem em conta uma linha base ao longo de um eixo temporal, onde surgem uma série de picos representativos da deteção de um composto diferente. Cada eluente tem uma representação específica e o qual se consegue identificar por comparação com picos semelhantes, observados numa solução padrão. Assim, os dados fornecidos pelo detetor, permitem-nos não só identificar um componente, mas também calcular a sua concentração. Quanto maior for a área de um pico no cromatograma, maior a sua concentração (Waters, 2013).

A cromatografia líquida ou gasosa acoplada à deteção por espectrometria de massa (LC-MS/GC-MS) tem tido uma utilização crescente nos últimos anos e permitiu um avanço significativo na análise de micotoxinas. Estes métodos permitem não só identificar inequivocamente os compostos em análise, mas também, determinar em simultâneo várias micotoxinas presentes numa mesma matriz. Devido à sua elevada seletividade e sensibilidade, é possível por vezes, simplificar o passo de purificação, injetando-se extratos diretamente no sistema (Krska et al., 2008).

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Apesar das vantagens anteriormente descritas da aplicação das técnicas convencionais de HPLC, o método de espectrometria de massa (MS) oferece outros benefícios em relação aos outros métodos de cromatografia líquida na análise de micotoxinas em alimentos. Resumidamente, o método de funcionamento do espectrómetro de massa é baseado na ionização das moléculas, classificando-as e identificando-as posteriormente, com base na sua relação massa / carga (m / z) (Spanjer et al, 2008). Esta técnica oferece maior sensibilidade e seletividade, bem como informações relativas à estrutura química dos compostos, através da identificação molecular do analito com base na relação m / z (Liao et al., 2011; Li et al., 2013).

Através desta técnica é possível quantificar simultaneamente mais de 100 micotoxinas numa única corrida, tornando-se atualmente o método de excelência para a deteção de múltiplas micotoxinas numa grande variedade de alimentos (Alshannaq & Yu, 2017).

1.2 Efeitos das micotoxinas na saúde e biodisponibilidade

Micotoxicoses e efeitos na saúde humana

Os quadros clínicos associados às micotoxinas denominam-se por micotoxicoses (van Egmond, et al., 2007) podendo ser classificadas como agudas ou crónicas. A toxicidade aguda está associada aos efeitos adversos verificados após a exposição a elevados níveis de micotoxina num curto período de tempo. Este tipo de toxicidade foi responsável pelos episódios mais conhecidos de exposição a micotoxinas, dos quais se destacam o surto da doença X dos perús, o ergotismo humano e as contaminações com Stachybotrys chartarum (Bennett & Klich, 2003). A toxicidade crónica, por outro lado, caracteriza-se pela exposição prolongada a doses reduzidas de toxina, podendo estar associada ao desenvolvimento de alguns tipos de cancro e outras doenças graves e irreversíveis. Atualmente, a comunidade científica tem mostrado crescente interesse sobre os graves problemas de saúde associados às micotoxinas relacionados com a exposição crónica (Bennett & Klich, 2003; De Ruyck et al., 2015). As micotoxicoses são descritas como sendo doenças: não transmissíveis; de elevada resistência ao tratamento com fármacos; de surtos sazonais esporádicos, associados a alimentos específicos (que quando examinados apresentam normalmente sinais de atividade fúngica) (Marin et al., 2013). Os sintomas associados a uma micotoxicose dependem do tipo de micotoxina; da quantidade e duração da exposição; da idade, saúde e sexo do individuo exposto; e de outros elementos que não são tão facilmente quantificáveis tais como o património genético, o estado nutricional e a coocorrência com outros compostos tóxicos.

A grande variedade de sintomas derivados da exposição das crianças a micotoxinas e o facto de poderem ser facilmente confundidos com os de outras doenças, levou a que alguns autores denominassem as doenças associadas a micotoxinas como a “Great Masquerader” ou a doença mascarada do século XXI.

Estas doenças podem apresentar uma variedade de sintomas pouco específicos, tais como erupção cutânea, conjuntivite, epistaxis, apneia, tosse, sibilos, náuseas e vómitos. Outros quadros mais graves relatam insuficiência da medula óssea, hemorragia pulmonar aguda, apneia recorrente e/ou pneumonia. Encontram-se ainda documentados outros efeitos verificados em crianças, associados ao consumo de alimentos contaminados com micotoxinas, incluindo cancro hepático, cancro esofágico e defeitos do tubo neural (Etzel, 2006). As micotoxinas podem ser também responsáveis pelo agravamento de quadros de deficiente nutrição e pela interação sinérgica com outras toxinas, onde se incluem as micotoxinas (Bennett & Klich, 2003; Marin et al., 2013).

A exposição crónica a micotoxinas pode causar efeitos carcinogénicos, mutagénicos, nefrotóxicos, estrogénicos, imunotóxicos, entre outros. Os problemas imunotóxicos são particularmente graves visto que tornam o individuo exposto, suscetível a outras doenças infeciosas (Patterson et al., 2010).Em

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virtude dos potenciais efeitos cancerígenos, grande parte das micotoxinas, encontram-se integradas na classificação da IARC (International Agency for Research on Cancer) tal como se evidencia na Tabela 1.4.

Tabela 1.4 - Classificação de micotoxinas quanto à sua carcinogenecidade (IARC, 1998)

Grupo Risco Micotoxinas

1 Carcinogénico AFT B1,B2,G1 e G2

2A Provável Carcinogénico -

2B Possível Carcinogénico AFT M1; FUM B1,B2 e B3; OTA

3 Não classificável quanto à sua carcinogenecidade

Tricotecenos, Alcaloides de Ergot, PAT, ZEN

4 Não é provável que seja carcinogénico

-

De acordo com os diferentes grupos de micotoxinas referidos na Tabela 1.1, descrevem-se, de seguida, os surtos ocorridos efeitos na saúde decorrentes da exposição aos principais grupos de micotoxinas.

Aflatoxinas

O primeiro episódio de intoxicação com esta micotoxina, aconteceu no já referido caso da “doença X”

dos perús, verificado nos anos 60, e que levou à morte de 100.000 animais. A partir deste evento, outros casos de intoxicação aguda na indústria pecuária com aflatoxinas foram relatados (Bennett & Klich, 2003). Existem já alguns casos registados de eventos de toxicidade aguda em humanos. Um desses casos ocorreu na Índia, no ano de 1974, levando à morte de 100 indivíduos, ao que tudo indica, após a ingestão de milho contaminado com esta micotoxina. Mais recentemente, no Quénia, em 2014, registou-se um surto de aflatoxinas que afetou 317 pessoas, levando à morte de 125 pessoas afetadas, uma grande percentagem das mesmas, crianças com idade inferior a 5 anos (CDC, 2004; Shephard et al., 2006).

Os efeitos tóxicos associado a este grupo de micotoxinas podem ser verificados após intoxicações agudas ou resultantes de exposição prolongada às mesmas, sendo que o fígado é o principal órgão afetado após a exposição. Esta micotoxina foi identificada como tendo efeitos imunossupressores, carcinogénicos, mutagénicos e teratogénicos. A aflatoxina B1 é considerada atualmente o carcinogénico de original natural mais potente, sendo que as aflatoxina B2, aflatoxina G1, aflatoxina G2, conservam respetivamente 20, 50 e 10% do potencial tóxico da aflatoxina B1 (Hussein and Brasel, 2001). Alguns estudos revelam a existência de sinergismo entre o vírus da hepatite B e a aflatoxina B1, indicando que indivíduos com hepatite e que sejam expostos a aflatoxinas têm 30 vezes mais probabilidade de desenvolver cancro hepático (Shephard, 2006).

Fumonisinas

Em 1977, na Índia, foi descrito um surto de distúrbios gastroinstestinais, associado à elevada presença de fumonisinas em milho contaminado. Na Africa do Sul, foi demonstrada a relação entre a elevada incidência de cancro do esófago nas populações, com a existência de elevados níveis de contaminação por fumonisinas nas culturas de milho (Shephard, 2006).

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A fumonisina B1 é conhecida pela sua capacidade nefrotóxica (o seu principal efeito) e hepatotóxica, sendo por isso considerado um composto com potencial capacidade carcinogénica. Além disso, as fumonisinas estão também associadas a casos de cancro do fígado e esófago em populações suscetíveis (Alizadeh et al., 2012). Esta micotoxina foi também descrita como sendo potenciadora de defeitos no tubo neural, devido à sua interferência no metabolismo de ácido fólico (Qiaomei et al., 2006).

Alcaloides do Ergot

Foram já descritos episódios de ergotismo gangrenoso na Etiópia, associados ao consumo de cevada contaminada. Hoje em dia, estes episódios têm sido cada vez menos frequentes, sendo hoje considerada uma doença humana praticamente extinta, embora se reconheçam alguns episódios de contaminações em animais (Bennett&Klich, 2003).

As intoxicações induzidas por Claviceps purpurea são conhecidas na Europa há muitos séculos, principalmente por episódios decorridos durante a Idade Média. Os efeitos mais graves associados a este grupo de micotoxinas são conhecidos como “Fogo de Santo António” ou “Fogo Sagrado”, devido

à dor intensa resultante da vasoconstrição e gangrena subsequentes, com relatos de perda de dedos, mãos, pés e até membros inteiros. Reconhecem-se a existência de duas formas de ergotismo, a convulsiva e a gangrenosa. A forma convulsiva afeta o sistema nervoso central enquanto a forma gangrenosa afeta o fornecimento de sangue às extremidades. Outros sintomas da intoxicação por alcaloides de Ergot incluem dores abdominais, vómitos, sensações de ardor na pele, insónias e alucinações (Krska et al., 2008).

Tricotecenos

Os tricotecenos são potentes inibidores da síntese proteica em eucariotas, sendo por isso considerados compostos neurotóxicos, imunossupressores e nefrotóxicos (Bennett & Klich, 2003; Raiola et al., 2015; Sherif et al., 2009). A toxina T-2 é conhecida como sendo o tricoteceno mais tóxico, contudo é menos frequente que outros, tais como o desoxinivalenol (DON). A toxina T-2 está associada a sintomas de perda de apetite em animais, decréscimo de glóbulos vermelhos e brancos, redução da glucose no plasma sanguíneo, bem como alterações fisiológicas no fígado e estomago. Além disso, outros estudos apontam também para a sua relação com aumentos de taxa de infeção, aleuquia, danos no ADN e indução de apoptose (Li et al., 2011). Já o DON, uma das micotoxinas mais frequentemente encontradas em alimentos para humanos e animais, é conhecido como “vomitotoxina” pelo quadro sintomático

gerado, e perda de apetite nos indivíduos expostos. O DON foi identificado como tendo capacidade de disrupção da síntese macromolecular, sinalização, diferenciação e proliferação celular, regulação génica e morte celular programada, em testes realizados em animais (Antonissen et al., 2014; Zain, et al., 2011).

Ocratoxina A

A OTA tem sido identificada como responsável da Nefropatia Endémica dos Balcãs, uma doença renal crónica que pode ser fatal para o Homem (Shephard, 2006). Foi também indicada como possível promotora do desenvolvimento de cancro testicular em indivíduos expostos, quer na fase gestacional quer nos primeiros anos de vida (Etzel, 2006).

A ocratoxina A é associada a efeitos nefrotóxicos, hepatotoxicos, embriotóxicos, teratogénicos, neurotóxicos, imunotóxicos, genotóxicos e carcinogénicos. O rim é principal alvo dos efeitos tóxicos desta micotoxina, tendo sido encontradas evidências nefrotóxicas em todos os modelos animais testados até hoje (Bennett&Klich, 2003). Outros efeitos da exposição a ocratoxina A incluem inibição da síntese macromolecular, aumento da peroxidação lipídica e inibição da respiração mitocondrial. De referir, que o seu tempo de semivida é também bastante alargado, sendo que demora cerca de 30 dias a ser

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metabolizada no organismo humano, o que aumenta a probabilidade da sua acumulação nos rins e fígado (Zollner et al., 2006).

Zearalenona

Devido à sua capacidade de desregulador endócrino, esta micotoxina foi associada a um caso de hiperestrogenismo, ocorrido no Porto Rico, caracterizado pela ocorrência de um surto de puberdade precoce em crianças. Na África do Sul a ocorrência de ginecomastia com atrofia testicular foi também associada ao consumo de milho contaminado com ZEA (Shephard, 2006).

Atualmente a ZEA está classificada no Grupo 3 da IARC, embora tenham sido já descritas as suas propriedades cancerígenas, hepatotóxicas, genotóxicas e imunossupressoras (Hueza et al., 2014; Lee e Ryu, 2015).

Apesar da baixa toxicidade aguda da zearalenona, foi já demonstrado a sua capacidade hepatotóxica, imunotóxica e cancerígena para várias espécies de mamíferos. Alguns dos seus metabolitos (α-zearalenol e β-zearalenol) podem atuar como disruptores endócrinos, devido à sua capacidade competitiva com os recetores de estrogénio, podendo ser responsáveis por quadros de hiperestrogenismo e infertilidade em animais (Ferrigo et al., 2016).

Patulina

A maioria dos estudos sobre os efeitos de exposição a patulina foram realizados em animais, e até à data não foram registados casos de toxicidade aguda com patulina em humanos. Os efeitos descritos pela exposição a altas doses de patulina incluem agitação, convulsões, edema, ulceração, vómitos, inflamação intestinal, diarreia, hemorragias alveolares, fraqueza muscular, taquipneia, atelectasia (colapso pulmonar), entre outros (Barreira et al., 2010; Puel et al., 2010; Tannous et al., 2017). Quanto a efeitos crónicos, alguns estudos referem que a patulina pode ter efeitos mutagénicos, genotóxicos, imunossupressores, imunotóxicos, neurotóxicos, teratogénicos e gastrointestinais (Marin et al., 2013). A nível celular há descrições de rutura da membrana plasmática, inibição da síntese proteica e inibição da síntese de DNA/RNA (Mahfoud et al., 2002).

Esta micotoxina é particularmente reconhecida pelos seus efeitos no sistema digestivo. Alguns estudos relatam, que após exposição aguda a esta micotoxina, são verificados os seguintes efeitos: destruição e inibição de proteínas das junções de oclusão no tecido gastrointestinal (Mahfoud et al., 2002); interferência com a resistência transepitelial (Assunção et al. 2014); indução apoptótica de células cancerígenas do cólon (Katsuyama et al., 2014). Um estudo elaborado por Assunção e colaboradores (Assunção et al., 2016a), refere que uma dose de 50 µM de patulina afeta a integridade da barreira intestinal, considerando um período de exposição de 2 horas. O mesmo estudo aponta também que a viabilidade e proliferação de células Caco-2 são também diminuídas, nestas condições. Os fenómenos relatados são associados a um aumento de permeabilidade intestinal. Sabendo que diversas doenças são causadas por perturbações na integridade da membrana intestinal, tornando o organismo do individuo mais vulnerável a componentes externos, os efeitos negativos conhecidos da exposição a patulina levantam a hipótese de que esta possa estar ligada a outras perturbações, especialmente a nível hepático, gastrointestinal, carcinogénico e teratogénico (Maresca et al., 2013).

Digestão humana e biodisponibilidade

Tal como referido anteriormente, a ingestão de alimentos é a principal fonte de exposição a contaminantes alimentares, onde se incluem as micotoxinas. Para exercer os seus efeitos tóxicos no organismo, as micotoxinas são inicialmente ingeridas nos alimentos contaminados, transportadas e metabolizadas ao longo do sistema digestivo até chegarem ao intestino, onde são absorvidas para a

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corrente sanguínea. Desta forma, a compreensão do funcionamento do processo digestivo, nomeadamente dos processos de digestão e absorção de compostos é essencial para compreender a extensão real da exposição a micotoxinas. A digestão é o processo fisiológico que permite que um alimento seja transformado ao longo do trato gastrointestinal tornando-o passível de ser absorvido na forma de nutrientes. A digestão é um processo catabólico, onde uma variedade de processos físicos (mecânicos) e químicos (ação dos sucos digestivos juntamente com enzimas) permitem que os macronutrientes sejam transformados em moléculas mais pequenas, permitindo a sua absorção e passagem para o plasma sanguíneo. A digestão é um processo essencial para que os compostos presentes nos alimentos sejam transformados e possam exercer efeitos benéficos e/ou nocivos no nosso organismo (Tortorra & Derrickson, 2009).

No entanto o processo digestivo apresenta grande variabilidade entre indivíduos e pode ser influenciado por uma grande variedade de fatores, desde a idade, à condição de saúde individual, tipo e quantidade de alimento ingeridas, entre outros (Gonzalez-Arias et al., 2013).

Quando um alimento entra no trato gastrointestinal, uma série de reações são desencadeadas, desde logo ao nível das secreções efetuadas ao longo do tubo digestivo. Por norma, cerca de 6 litros de secreções são necessários por dia para a normal digestão num adulto saudável: 1 litro de saliva, 2 litros de suco gástrico, 2 litros de suco pancreático e 1 litro de bílis (Tortora & Derrickson, 2009). Além dos supracitados, o complexo intestinal secreta ainda um máximo de 2 litros de muco protetor das células epiteliais, melhorando o contacto entre o produto digestivo e as células epiteliais, resultando numa absorção mais eficaz (Versantvoort et al., 2004).

É possível dividir a digestão em 3 importantes fases: Fase Oral, Fase Gástrica e Fase Intestinal.

Fase Oral

Durante a fase oral, o alimento ingerido é parcialmente triturado pelos dentes, auxiliado pelos movimentos realizados pela língua, e misturado com a saliva, num processo conhecido por mastigação. A amílase é uma das enzimas presentes na saliva e a de maior relevância, tendo a capacidade de hidrolisar o amido de forma a produzir glucose. Neste processo a temperatura do alimento é também próxima da temperatura corporal (≈37ºC). Após a trituração, o alimento é misturado com a saliva o alimento é então engolido e este processo fica completo (Boland, 2016). O valor do pH no interior da boca é aproximadamente 6.8 (o que indica que este processo ocorre num ambiente praticamente neutro) e demora não mais que 2 a 3 minutos, o que faz dela a fase mais rápida do processo digestivo (Versantvoort et al., 2005).

Fase Gástrica

O bolo alimentar passa do esófago até ao estomago através de movimentos peristálticos (executados pela musculatura lisa ao redor deste canal) onde se acumula. O ambiente estomacal é considerado extremamente ácido (tipicamente com valores entre 1,5-2 de pH em condições de jejum, e 3-7 pH quando em contacto com alimento), como consequência da secreção de ácido hidroclórico pelas paredes estomacais desencadeado pela entrada do bolo alimentar no estomago. A digestão neste compartimento é executada a nível químico, pela ação do ácido supracitado que auxilia na digestão de triglicéridos, e pela ação da pepsina, uma enzima responsável pela quebra de ligações peptídicas. Geralmente um alimento fluido, tem uma digestão de 10 a 60 mins, enquanto um alimento solido e dependendo da sua constituição calórica demora entre 60 a 277 mins. No fim desta fase, o bolo alimentar dá lugar ao quimo (Versantvoort et al., 2005; Boland, 2016).

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Fase Intestinal

A entrada do quimo para o duodeno desencadeia uma série de reações fisiológicas. Estimulada pela presença de lípidos no duodeno, a bílis é excretada pelo fígado e a sua produção é regulada pela quantidade e tipo de gorduras presentes no quimo. A sua concentração diminui proporcionalmente à quantidade de lípidos ainda presentes por lisar. Também o pâncreas é estimulado pela presença de quimo no duodeno, libertando suco pancreático. Comitantemente, ocorre a secreção de bicarbonato de sódio de forma a neutralizar o pH do quimo proveniente do estomago, aumentando–o para valores a rondar pH 7, enquanto se dá continuidade à digestão de macronutrientes. (Versantvoort et al., 2004; Boland 2016). Geralmente 3 horas são suficientes para que o recém-formado quilo, passe pelo intestino delgado. Após este período, cerca de 90% de todos os produtos da digestão dos nutrientes foram já absorvidos pelo nosso organismo, seguindo o quilo para o intestino grosso, onde ocorre essencialmente reabsorção de água. Como consequência dessa reabsorção de água o quilo vai se tornando mais compacto, culminando na produção de fezes que são posteriormente evacuadas através do ânus (Boland, 2016).

Biodisponibilidade e bioacessibilidade

Dado que a quantidade total de um composto ingerido nem sempre reflete a quantidade que fica disponível para ser absorvido foram desenvolvidos estudos com vista a estudar a biodisponibilidade e bioacessibilidade dos nutrientes e contaminantes, ilustradas na figura 1.3. O termo biodisponibilidade é utilizado para definir a quantidade de composto que chega até ao sistema circulatório e exerce o seu efeito junto das células e tecidos do organismo. A biodisponibilidade pode variar consoante o tipo de alimento considerado (Versantvoort et al., 2005). Considerando dois alimentos que passam pelas mesmas condições digestivas e tenham a mesma concentração inicial de contaminante, terão no final do processo digestivo diferentes concentrações, sendo possível que um dos alimentos possa estar disponível em quantidade suficiente para produzir toxicidade no organismo, enquanto o outro não.

Para que um determinado composto fique biodisponível, é necessário que primeiro fique bioacessível. A bioacessibilidade corresponde assim à fração de contaminante/nutriente libertada da matriz alimentar, passível de ser absorvida no trato gastrointestinal. A determinação da bioacessibilidade assume particular relevância já que representa a quantidade máxima de contaminante que pode chegar ao nosso sistema circulatório após absorção intestinal. É importante reforçar que após a libertação da matriz alimentar, a quantidade bioacessível passa ainda por processos de absorção e metabolização no organismo antes de se transformar na quantidade biodisponível. Assim, a bioacessibilidade pode ser considerada como um indicador da biodisponibilidade máxima de um contaminante alimentar (González-Arias et al., 2013; Versantvoort et al., 2005; Raiola et al., 2012).

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Figura 1.3 – Esquema comparativo da relação entre bioacessibilidade e biodisponibilidade. Note-se que os valores de biodisponibilidade são apenas uma fração dos valores totais de bioacessibilidade.

Sendo considerada uma ferramenta útil para o estudo do risco de exposição a diferentes compostos tóxicos (onde se incluem as micotoxinas) no sistema digestivo, diferentes grupos de investigação têm-se dedicado a estudos sobre bioacessibilidade. Em Portugal, o Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, através do seu Departamento de Alimentação e Nutrição (DAN), tem sido particularmente ativo neste tipo de trabalhos. Nesse sentido, destacam-se os trabalhos levados a cabo por Paula Alvito, Ricardo Assunção e Carla Martins, que se têm dedicado ao estudo das micotoxinas através da sua bioacessibilidade.

Modelos de digestão in vitro

Na impossibilidade da utilização de modelos de digestão in vivo para o estudo da digestão humana, têm sido desenvolvidos métodos alternativos de digestão in vitro, que tentam ultrapassar os constrangimentos financeiros, técnicos e éticos, além da grande variabilidade entre indivíduos, encontrada na utilização de modelos in vivo. Os métodos de digestão in vitro apresentam-se assim, como alternativa eficaz ao estudo da digestão in vivo (Ménard et al., 2014; Assunção et al., 2014).

Uma grande variedade de métodos de digestão in vitro têm sido propostos ao longo dos anos, onde se distinguem dois grandes grupos: os modelos estáticos e os modelos dinâmicos. Os modelos estáticos, mais frequentemente aplicados que os modelos dinâmicos, tentam simular o trânsito digestivo nos diferentes compartimentos digestivos, ou seja simulando as condições existentes na boca, estômago e intestino delgado, tentando realizar uma aproximação à composição química dos fluídos digestivos, às condições de pH e aos períodos de incubação em cada fase ignorando, no entanto, a simulação dos movimentos peristálticos e da microbiota intestinal. Estas duas últimas desvantagens associadas aos modelos estáticos, impedem que se possam mimetizar inteiramente todas as condições gastrointestinais, apesar de permitirem a análise rápida de um grande número de amostras (Guerra et al., 2012). Por outro lado, os modelos dinâmicos simulam o trânsito digestivo de forma mais gradual, dando uma perspetiva mais aproximada do contexto in vivo. Nestes modelos, as condições fisiológicas sucessivas que ocorrem no estomago e no intestino delgado, são aproximadas o mais possível ao contexto real. Os modelos dinâmicos têm em consideração os padrões de esvaziamento gástrico, as variações de pH, as variações

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de concentrações de eletrólitos, de enzimas e de sais biliares, bem como a absorção de água e, em alguns casos também a atividade da microbiota intestinal (González-Arias et al., 2013; Guerra et al., 2012).

A grande diversidade de modelos de digestão in vitro desenvolvidos impediu a comparação de resultados entre diversos grupos de investigação, já que os resultados eram muito variáveis entre si. A grande variedade de enzimas, provenientes de diferentes fontes e com diferentes atividades enzimáticas, diferenças no pH, no tipo de minerais utilizados, na força iónica e no tempo de digestão, constituem alguns fatores que alteram a atividade enzimática, e como consequência os resultados obtidos (Minekus et al., 2014). De forma a contornar estes obstáculos, a INFOGEST (COST ACTION INFOGEST FA 1005), através de uma rede europeia internacional dedicada aos problemas da digestão humana dos alimentos que decorreu entre 2011 e 2015, reuniu diversos investigadores, que tinham como principais objetivos: i) identificar os benefícios dos componentes alimentares libertados no sistema digestivo durante o processo gástrico; ii) caracterizar os efeitos dos componentes alimentares na saúde humana; e iii) promover o desenvolvimento de um modelo digestivo harmonizado entre diferentes grupos de investigação (https://www.cost-infogest.eu/). Pretendia-se que o modelo desenvolvido fosse de fácil aplicação e com uma ampla margem de aplicação em diversos estudos, permitindo a comparação de resultados dos mesmos (Egger et al., 2016). O método harmonizado propunha três passos principais, nomeadamente a fase oral, gástrica e intestinal, mantendo a semelhança com outros métodos de digestão in vitro desenvolvidos anteriormente. Contudo, uma das principais razões para a discrepância de resultados entre grupos de investigação, mesmo quando aplicado o mesmo método, residia nas diferenças entre as atividades enzimáticas das soluções utilizadas para a simulação da digestão. Na maioria dos casos, as enzimas digestivas eram adicionadas considerando apenas a sua massa, ou as suas atividades enzimáticas não padronizadas. Nesse sentido, o modelo de digestão in vitro proposto pela COST ACTION INFOGEST FA 1005 propôs um ensaio complementar para a determinação das atividades enzimáticas das enzimas a utilizar, esperando assim aumentar a comparabilidade entre os resultados obtidos em diferentes laboratórios (Egger et al., 2016). Outros importantes aspetos sobre este método incluem a harmonização da constituição química dos fluidos digestivos utilizados (salivar, gástrico e intestinal) e dos tempos de digestão das fases digestivas acima mencionadas. Os resultados desse estudo consenso culminaram na publicação de um artigo consenso a nível europeu (Minekus et al., 2014). No âmbito do projeto MYCOMIX e em colaboração com a rede INFOGEST, o DAN elaborou ainda 6 vídeos para apoio nas metodologias de determinação enzimática e digestão (https://www.youtube.com/channel/UCdc-NPx9kTDGyH_kZCgpQWg). Nos anos seguintes à publicação deste artigo de consenso, diversos grupos de investigação pertencentes à comunidade INFOGEST, dedicaram-se à validação do mesmo, aplicando este método de digestão in vitro em comparação com os que existiam anteriormente. O alimento escolhido para esse efeito foi o leite em pó, já que é um alimento acessível, estável e com matriz alimentar complexa. Apesar deste estudo se ter focado em grande parte à hidrólise proteica, ou seja, à análise de proteínas e dos seus monómeros, não deixa de salientar duas conclusões importantes: i) uma das chaves de todo o processo é a determinação da atividade da pepsina; ii) a aplicação deste método harmonizado contribuiu para uma maior consistência nos resultados entre grupos, resultando numa maior comparabilidade entre estudos de digestão in vitro (Egger et al., 2016).

A utilização de modelos de digestão in vitro tem sido uma importante ferramenta para estudos de bioacessibilidade de micotoxinas, apesar de não serem consideradas alguns importantes fatores fisiológicos, desenvolvidos em casos de exposição a agentes externos, tais como a ação barreira da mucosa intestinal, da atuação do sistema imunológico ou do ciclo enterofágico (González-Arias et al., 2013). A tabela 1.5 apresenta alguns dos estudos de bioacessibilidade em micotoxinas, propostos por alguns investigadores ou grupos de investigadores, aplicando diversos modelos de digestão in vitro com diferentes características.

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Tabela 1.5 - Modelos de digestão in vitro aplicados no estudo de micotoxinas e as suas principais características (Retirado de Assunção et al., 2017).

TIM-1 Döll RIVM Gil-

Izquierdo INFOGEST

Tipo de modelo Dinâmico Estático Estático Estático Estático

Fisiologia simulada

Porco Porco Humano Humano Humano

Compartimento digestivo simulado

Boca Não Sim Sim Sim Sim

Estomâgo Sim Sim Sim Sim Sim

Intestino delgado Sim Sim Sim Sim Sim

Intestino grosso Não Sim Não Não Não

Micotoxinas avaliadas

ZEA, AFB1, DON, OTA, FB

DON, ZEA AFB1, OTA, PAT

PAT, DON OTA, PAT

Legenda: RIVM: Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu; TIM-1: TNO Gastro-Intestinal Model 1 (Minekus et. al, 2015)

Apesar da publicação de um trabalho consenso sobre um modelo de digestão harmonizada in vitro para adultos (Minekus et al., 2014), não existia até recentemente um modelo fisiologicamente relevante que mimetizasse as condições encontradas na digestão infantil. Alguns autores (Abrahamse et al., 2012; Bourlieu et al., 2014) evidenciaram com os seus trabalhos, algumas diferenças entre a digestão adulta e infantil, realçando que existem diferenças significativas não só a nível enzimático, ou seja, no tipo de enzimas produzidas e respetivo nível de atividade, como também a nível não enzimático (dieta pouco variada, frequência da alimentação e concentrações dos sais biliares). Num trabalho recente foi proposto um modelo de digestão infantil in vitro considerando as condições de digestão infantil descritas na literatura disponível, conforme se ilustra na Figura 1.4.

Os resultados deste trabalho, indicam que a proteólise (digestão proteica) infantil é mais lenta e apenas 15% das proteínas de soro de leite foram degradadas, ao contrário dos 90% de hidrólise obtidos no modelo adulto. No entanto, o mesmo estudo revela que os níveis de lipólise se mantiveram semelhantes: 7,2 ± 0,8% (infantil) contra 10 ± 2,6% (adulto) (Ménard et al., 2018).

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Figura 1.4 – Comparação do modelo de digestão adulto e infantil in vitro segundo Ménard (2018).

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2 Objetivos

Em Portugal, a patulina tem sido alvo de diversos estudos de ocorrência e consequente risco de exposição da população, principalmente nos grupos mais vulneráveis. Trabalhos anteriores sobre esta micotoxina sugerem que esta possa sofrer alterações durante o processo digestivo, tendo sido obtidos valores de bioacessibilidade reduzidos durante a fase intestinal (Assunção et al., 2016b). Neste sentido considerou-se importante estudar as alterações ocorridas ao longo de todo o processo digestivo, tentando compreender o seu comportamento na fase oral, gástrica e intestinal, através da avaliação da sua bioacessibilidade em cada uma das fases, sendo esse um dos objetivos desta dissertação de mestrado.

Este trabalho é pioneiro já que, pela primeira vez, foi realizado o estudo da bioacessibilidade de patulina em sumos de fruta ao longo das diferentes fases do processo digestivo, utilizando o método harmonizado descrito por Minekus e colaboradores (2014). Para o efeito, foram avaliados os valores de bioacessibilidade em 4 amostras de sumo de fruta à base de maçã, nas fases oral, gástrica e intestinal. Este estudo teve como principais objetivos i) avaliar a variabilidade da bioacessibilidade da patulina ao longo da digestão e ii) estudar a influência da matriz alimentar neste processo.

A determinação da bioacessibilidade nas diferentes fases do processo digestivo, permitirá compreender quais os níveis de exposição a esta micotoxina nos diferentes compartimentos do sistema digestivo. Além disso será possível também obter mais dados relativos à exposição a esta toxina. Este estudo pretendeu não só determinar os valores de exposição nos diferentes compartimentos digestivos, mas também compreender se os níveis de exposição decorrentes, avaliados através dos valores de bioacessibilidade obtidos, são suficientes para causar potenciais danos ao organismo.

Os estudos sobre a influência da matriz alimentar na bioacessibilidade de patulina contribuirão para clarificar quais as matrizes alimentares mais sensíveis ao processo de digestão. Para esse fim, foram consideradas amostras alimentares que apresentam alguma probabilidade de contaminação com patulina, neste caso, sumos de fruta à base de maçã. Pretendeu-se assim, estabelecer uma comparação entre sumos de diferentes naturezas (polpa e refrigerante, doravante designados como matriz turva e matriz límpida, respetivamente) e os seus valores de bioacessibilidade.

Pretendeu-se discutir também os potenciais efeitos nocivos dos valores de patulina encontrados ao longo do processo digestivo em populações vulneráveis como as crianças, tendo em conta que o seu sistema digestivo está ainda em desenvolvimento, sendo por isso mais suscetível à exposição a micotoxinas

Por fim, procurou-se elaborar uma pequena reflexão sobre o impacto das alterações climáticas e a consequente potencialização do crescimento fúngico. Maior desenvolvimento de fungos irá subsequentemente estar relacionado com maior desenvolvimento de micotoxinas, e desse modo, previsivelmente, maior será risco de exposição das populações a estes compostos. Desta forma, pretendeu-se discutir qual o impacto que as alterações climáticas poderão ter no desenvolvimento de doenças relacionadas com micotoxinas e quais as possíveis estratégias para o diminuir.

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3 Material e métodos

3.1 Caracterização das amostras

Para a realização deste estudo foram utilizadas quatro amostras de sumo de fruta à base de maçã adquiridas em supermercados da região de Lisboa. As amostras incluíam 2 sumos turvos (néctares) e 2 sumos límpidos (refrigerantes). As amostras selecionadas apresentavam um conteúdo mínimo de 50% de sumo à base de maçã. Para facilitar as referências ao longo do trabalho laboratorial e doravante ao longo do texto, cada um dos sumos foi denominado com a letra S, e atribuído um número (de 1 até 4) para cada um deles. Esta informação apresenta-se sumarizada na Tabela 3.1, onde são encontradas informações mais detalhadas sobre a composição das amostras.

As amostras de sumos à base de maçã utilizados foram artificialmente contaminadas antes do processo digestivo, devido à sua baixa contaminação natural.

Tabela 3.1 - Composição e caracterização dos sumos de fruta à base de maçã utilizados para os estudos de bioacessibilidade de patulina.

3.2 Determinação da atividade enzimática

Uma vez que o método aplicado neste estudo pressupõe uma atividade enzimática padronizada, foi necessário determinar previamente a atividade enzimática de cada uma das enzimas necessárias para o método digestivo: α-amilase (de origem bacteriana), pepsina, tripsina e pancreatina.

Simultaneamente, preparou-se uma solução de pefabloc, um inibidor enzimático da pancreatina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).

Foi determinada a atividade enzimática da tripsina, considerando a atividade enzimática da mesma, no reagente pancreatina aplicado no modelo de digestão in vitro. A atividade enzimática da pancreatina foi determinada com base nos valores obtidos de atividade da tripsina, daí existir a necessidade de se determinar a atividade de tripsina no reagente pancreatina utilizado.

Relativamente ao reagente bílis, a sua atividade enzimática não foi determinada no âmbito desta dissertação. Para este trabalho foram considerados os valores de atividade enzimática determinados anteriormente em estudos do laboratório do Departamento de Alimentação e Nutrição.

α-amilase

A determinação da atividade enzimática da α-amilase baseou-se na avaliação espetrofotométrica a 540 nm, da redução do ácido 3,5-dinitrosalicilico, como equivalente da libertação dos açúcares reduzidos

Denominação Tipo Composição

S1 Límpido Sumo de maçã a partir de concentrado. 100% sumo de maçã.

S2 Turvo Sumo de maçã a partir de concentrado (50%), polme de marmelo (5%), açúcar, acidificante (E330), antioxidante (E300), edulcorantes (E995).

S3 Turvo Sumo e polpa de maçã, água, açúcar, regulador de acidez: ácido cítrico e antioxidante: ácido ascórbico. Teor mínimo de sumo:50%.

S4 Límpido Maçã (50%), laranja (50%), antioxidantes (ácido ascórbico)

25

libertados do amido. Uma unidade enzimática liberta 1,0 mg de maltose do amido em 3 minutos, em condições de pH 6,9 e a 20ºC. Estas condições foram retiradas do material suplementar do protocolo proposto por Minekus e colaboradores (Minekus et al., 2014).

Soluções necessárias:

· Tampão sódio fosfato a 20 mM, com cloreto de sódio 6,7 mM, pH 6,9 a 20ºC: adicionaram-se a 0,24 g NaH2PO4 (M=120 g/mol) dissolvidos em 90 mL de água ultrapura, 0,04 g NaCl (M=58,4 g/mol) e misturou-se bem. Ajustou-se o pH para 6,9 com uma solução de NaOH 1 M (M=40 g/mol).

· Amido de batata solúvel (substrato): 1,0% m/v de amido de batata solúvel em tampão sódio fosfato: dissolveram-se 0,25 g de amido de batata solúvel num volume inicial de 20 mL de tampão. Para facilitar a solubilização, aqueceu-se a solução numa placa térmica com agitação constante, levando à ebulição (aproximadamente 90ºC) e mantendo a esta temperatura durante 15 minutos. A solução arrefeceu até à temperatura ambiente sempre com constante agitação. Adicionaram-se 5 mL de água ultrapura para perfazer um volume final de 25 mL.

· Reagente corante: Ácido 3,5-Dinitrosalicilico (DNSA) a 96 mM com solução de tartarato de sódio e potássio: dissolveram-se lentamente 2,18 g de DNSA (M=228,1 g/mol) em 80 mL de NaOH a 0,5M a 80ºC, com auxílio de uma placa térmica e com agitação constante. Adicionaram-se 30 g de tartarato de sódio potássio (M=282,2 g/mol), misturando-o até se dissolver. Deixou-se arrefecer até à temperatura ambiente e perfez-se o volume até 100 mL com água ultrapura.

· Solução de maltose standard a 0,2 % m/v: dissolveram-se 0,02 g de solução standard de maltose em 10 mL de tampão sódio fosfato.

· α-amilase: preparou-se no momento uma solução contendo aproximadamente 1-3 U/mL de α-amilase dissolvida em tampão sódio fosfato, mantida em gelo.

A curva de calibração foi preparada através da diluição da solução de maltose (0,2 % m/v) em tampão, nas condições apresentadas na Tabela 3.2.

Tabela 3.2 – Condições para a preparação da curva de calibração para a determinação da atividade enzimática da α-amilase.

Tubos Volume da sol. padrão maltose

(mL)

Volume de tampão pH 6,9

(mL)

Sol. padrão de maltose (mg/mL)

Concentração da sol. padrão

maltose (%)

1 0,025 0,975 0,05 0,005

2 0,1 0,9 0,2 0,02

3 0,2 0,8 0,4 0,04

4 0,3 0,7 0,6 0,06

5 0,4 0,6 0,8 0,08

6 0,5 0,5 1 0,1

7 1 0 2 0,2

A cada 200 µL de solução padrão maltose adicionou-se 100 µL de solução de reagente corante. As soluções foram incubadas a 100º C por 15 minutos, deixando-se arrefecer de seguida até à temperatura

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ambiente. Adicionaram-se 900 µL de água ultrapura a cada solução padrão e misturou-se por inversão. Registou-se a absorvância a 540 nm de cada um dos tubos de solução padrão.

Figura 3.1 – Cuvetes utilizadas para a determinação dos pontos da curva de calibração da α-amilase.

Para a determinação da atividade enzimática foram preparados 4 tubos (3 concentrações de α-amilase e 1 branco). A estes foram adicionados 100 µL de solução de amido de batata (substrato) a cada tubo e as amostras foram incubadas a 20ºC, com agitação constante, até se atingir equilíbrio térmico. Adicionaram-se 50 µL, 70 µL e 100 µL a cada tubo teste, e de seguida foram incubados a 20º C durante 3 minutos (1ª adição de enzima). Após 3 minutos, a reação foi parada, com a adição de 100 µL de solução de reagente corante a cada tubo. Realizou-se a 2ª adição de enzima, como descrito na Tabela 3.3 e deixou-se ferver a 100ºC durante 15 minutos. Adicionaram-se 900 µL de água ultrapura a cada tubo e os mesmos foram misturados por inversão. Por fim, registou-se a absorvância a 540 nm da solução final.

Tabela 3.3 - Condições para a preparação dos tubos teste para o ensaio de determinação de atividade da α-amilase.

1a

Concentração de enzima

2ª Concentração

de enzima

3ª Concentração

de enzima Branco

Substrato: Sol. amido de batata (mL)

0,10 0,10 0,10 0,10

1a adição de α-amilase (mL)

0,05 0,07 0,10 (-)

Reagente corante (mL)

0,10 0,10 0,10 0,10

2a adição de α-amilase (mL)

0,05 0,03 (-) 0,10

Água ultrapura (mL)

0,90 0,90 0,90 0,90

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Cálculos:

Curva de calibração

ΔA540Standard = A540 Std. - A540 Std. Branco

O gráfico ΔA540nm, referente à variação padrão vs. quantidade de maltose [mg], foi traçado usando somente a parte linear da curva, segundo a seguinte fórmula:

ΔA540 Standard = a * [maltose]

Determinação da atividade enzimática

ΔA540 Amostra = A540 Teste - A540 Branco

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'()#%)%!*"'$=[+,540)-%&.% / ,540)12$!367 / 8]

$ 9 ):

)a: Declive da regressão linear estabelecida pela razão ΔA540nm Standards vs. Quantidade de Maltose [mg]

b: Ponto de intersecção da regressão linear estabelecida pela razão ΔA540nm Standards vs. quantidade de maltose [mg]

X: Quantidade de pó de amílase [mg] adicionado antes da paragem da reação

Pepsina

Para determinar a atividade enzimática da pepsina recorreu-se à determinação dos péptidos solúveis em ácido tricloroacético (TCA), libertados da hemoglobina, detetados espetrofotometricamente a 280 nm:

Hemoglobina + H2O pepsina > Péptidos solúveis em TCA

É considerada uma unidade enzimática de pepsina, a quantidade de enzima que produz uma ΔA280 de 0,001 por minuto, a um pH 2,0 e a 37° C, medidos como produtos solúveis em TCA.

Soluções:

· HCl 10 mM e 300 mM · Solução tampão Tris-NaCl: Tris 10 mM + NaCl 150 mM (ajustando-se o pH para 6)

· NaOH 100 mM · Solução de ácido tricloroacético (TCA) a 5 %: adicionou-se 5 mL de TCA e perfez-se o

volume de 100 mL, juntando água ultrapura.

· Solução de hemoglobina 2 % (m/v): pesou-se 0,5 g de hemoglobina e dissolveu-se em 20 mL de água ultrapura. Ajustou-se o pH para 2, com solução de HCl 300 mM e perfez-se o volume para 25 mL, com água ultrapura.

· Solução de pepsina de origem suína 15-40 µg/mL: preparou-se uma solução stock de pepsina (1 mg/mL) dissolvida em tampão Tris-NaCl, que se diluiu posteriormente 10x, de forma a obter uma solução 100 µg/mL. Por fim diluiu-se a enzima nas concentrações 15, 20, 25, 35 e 40 µg/mL em HCl 10 mM, nas condições descritas na Tabela 3.4.

28

Tabela 3.4 - Condições para a preparação dos tubos teste para o ensaio de determinação da atividade enzimática da pepsina.

[pepsina] µg/mL 15 20 25 30 35 40

HCl 10 mM (µL) 850 800 750 700 650 600

Pepsina 100 µg/mL (µL) 150 200 250 300 350 400

Procedimento:

Prepararam-se 2 tubos eppendorff para cada concentração de enzima, em conjunto com os respetivos brancos (6 tubos para as enzimas + 6 brancos). Pipetaram-se de seguida 500 μL da solução de hemoglobina para cada tubo, incluindo brancos. Incubaram-se os tubos a 37 °C durante 3-4 minutos, até se alcançar equilíbrio térmico. Adicionaram-se 100 μL de cada concentração de enzima ao tubo correspondente (exceto brancos) e incubou-se durante 10 minutos. A reação foi parada, com a adição de 1 mL de TCA 5% a cada tubo (brancos incluídos). Adicionou-se 100 μL de cada concentração de enzima ao respetivo tubo em branco para igualar a composição da solução aquando da leitura no espectrofotómetro. Centrifugaram-se os tubos a 6000 g, durante 30 minutos, para precipitar a hemoglobina. Por fim transferiu-se o sobrenadante transparente para uma cuvete de quartzo e procedeu-se à leitura da absorvância a 280 nm.

Cálculos:

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()*$&*&"+#(%=[,280*-&'.& / ,280*13%"45] 6 7000

9:. 6 ;<

Λt: duração da reação, i.e. 10 minutos

X: concentração da solução de pepsina em teste (mg/mL)

Tripsina

A atividade enzimática da tripsina foi testada através da determinação de p-tolueno-sulfonil-l-arginina por espetrofotometria continua a 247 nm a pH 8,1.

TAME + H2O tripsina > p-tolueno-sulfonil-l-arginina + metanol

TAME: p-toluene-sulfonyl-l-arginine methyl ester

Considera-se uma unidade enzimática de tripsina, a quantidade de enzima necessária para hidrolisar 1 µmol de TAME por minuto, a 25ºC e pH 8,1.

Soluções:

· HCl 1 mM: Solução utilizada a 4° C.

· Tampão Tris-HCl 0,046 M + CaCl2 0.0115 M (pH 8,1): adicionaram-se 250 mL de solução Tris 0,046 M (1,39 g) a uma solução CaCl2 0.0115 M (0,32 g), ajustando-se o pH a 8,1, com a adição de 5,82 mL HCl 1 M.

· TAME (substrato): 10 mM: pesou-se 18,9 mg de TAME e solubilizou-se em 5 mL de água ultrapura.

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· Tripsina (enzima): preparou-se uma solução 1 mg/mL, em HCl 1 mM. Foram preparadas 3 diluições desta solução (10, 15 e 20 µg/mL).

· Pancreatina (enzima): preparou-se uma solução de 5mg/mL em HCl 1mM. Prepararam-se 3 diluições desta solução (0,25, 0.5 e 1,0 mg/mL).

Procedimento:

Prepararam-se 2 cuvettes (teste e branco), às quais se adicionaram 1,3 mL de tampão Tris-HCl (pH 8,1) e 150 µL de substrato (10 mM TAME). Adicionaram-se 50 µL da solução de tripsina (cuvete teste) e 50 µL de HCl 1mM (cuvete branco). A absorvância foi registada a 247 nm durante 10 minutos, recolhendo dados a cada variação de 0,1 Hz. Estes passos foram repetidos para todas as concentrações de tripsina e pancreatina (incluindo brancos). Traçou-se um gráfico “absorção (y) vs tempo (x)”,

determinando-se o declive (ΔA247) na parte linear inicial da curva.

Cálculos:

Os cálculos tiveram em conta os declives ΔA247 [unidade de absorvância / minuto] para os brancos e ensaios teste, utilizando a taxa linear máxima:

!"#$#%&

'()#%)%!*"'$= [ A247!Teste " ! A247!Branco) # 1000 # 1,5]/(540 # $)

ΛA247: declive da parte linear inicial da curva, [unidade de absorvância/minuto] tanto para a solução teste (com enzima), como para o branco.

540: coeficiente de extinção molar do TAME a 247 nm.

1,5: volume (em mL) da reação mistura (Tris-HCl + TAME + Enzima)

X: quantidade de tripsina na mistura final presente na cuvette [mg]

3.3 Método de digestão

Como referido anteriormente, neste estudo foi testado o método digestivo in vitro que simula as condições fisiológicas de digestão em adultos, previamente estabelecidas por Minekus e colaboradores (2014) (Minekus et al., 2014) com ligeiras modificações ao protocolo inicial, que passarão a ser explicadas ao longo deste capítulo.

Preparação das soluções dos Fluídos Digestivos Simulados (FDS)

Para a preparação dos FDS foram necessárias soluções stock de eletrólitos, enzimas, CaCl2 e água ultrapura. As soluções stock de eletrólitos foram preparadas para um fator de concentração de 1,25x, uma vez que durante o protocolo de digestão in vitro a constituição final dos fluídos digestivos será obtida através de 4 partes de solução de stock de eletrólitos adicionada de 1 parte de água. Os volumes foram calculados para a preparação de soluções de 250 mL, 500 mL e 1000 mL, respetivamente para a fase oral, gástrica e intestinal. Os seguintes reagentes foram necessários para a elaboração dos FDS:

CaCl2(H2O), KCl, NaHCO3, NaCl, MgCl2(H2O)6, NaOH (Merck, Darmstadt, Germany), (NH4)2CO3 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), KH2PO4 e HCl (J. T. Baker, Center Valley, PA, USA). A composição final de cada FDS está apresentada na Tabela 3.5. Após a preparação os FDS 1,25x foram guardados a -20ºC numa arca frigorífica para posterior utilização.

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Tabela 3.5 - Composição de cada um dos FDS (Fluídos Digestivos Simulados) utilizados para a realização das digestões in vitro. (Adaptado de Minekus et al., 2014). Nota: A solução de CaCl2(H2O)2 é apenas adicionada posteriormente, juntamente com a mistura formada pelos FDS e a amostra de sumo, de forma a prevenir a sua prévia precipitação.

FSS (pH 7) FGS (pH 3) FIS (pH 7)

Sol. de sais adicionadas

Conc. soluções stock

mL de sol. stock adicionados para preparar

1 L (1,25x)

Conc. final de sais no FSS

mL de sol. stock adicionados para preparar

0,5 L (1,25x)

Conc. final de sais no FGS

mL de sol. stock adicionados para preparar

0,5 L (1,25x)

Conc. final de sais no FIS

g/L mol/L Ml mmol/L

mL mmol/L mL mmol/L

KCl 7,3 0,5 37,6 15,1 8,6 6,9 8,5 6,8

KH2PO4 8 0,5 9,2 3,7 1,1 0,9 1 0,8

NaHCO3 4 1 17,2 13,6 15,6 25 53,15 85

NaCl 17 2 - - 14,8 47,2 12 38,4

MgCl2(H2O)

6 0,5

0,15 1,24 0,15 0,5 0,12 2,8 0,33

(NH4)2CO3 8 0,5 0,16 0,06 0,6 0,5 - -

CaCl2(H2O)2 4,1 0,3 1,5 0,15 0,6

HCl 6 1,2 1,1 9,8 15,6 5,25 8,4

FSS: Fluído Salivar Simulado; FGS: Fluído Gástrico Simulado; FIS: Fluído Intestinal Simulado

Alterações ao protocolo e justificação

De forma a avaliar a bioacessibilidade nas diferentes fases do processo digestivo, foi necessário modificar o protocolo de digestão publicado por Minekus 2014 relativamente às tomas de amostra utilizadas.

O método publicado prevê a utilização de tomas de amostra de 1 g ou 5 g, contudo Assunção e colaboradores (2016b) utilizaram uma toma de amostra de 2 g tendo obtido coeficientes de variação satisfatórios. É por isso possível alterar as tomas de amostra iniciais sem comprometer os resultados finais, desde que sejam mantidas as proporções (50:50) entre fluídos e amostra. Assim, neste estudo foram utilizadas tomas de amostra de 6 g, 3 g, e 2 g, para a avaliação de bioacessibilidade da patulina na fase oral, gástrica e intestinal, respetivamente. Esta modificação justifica-se pela necessidade de obter um volume final superior ao mínimo necessário (10 mL) para aplicação do método de extração SPE-UV. Para cada uma das amostras de sumo, foram realizados 5 ensaios para avaliação da bioacessibilidade em cada fase do processo digestivo (nº total de ensaios em cada sumo = 15).

Preparação dos tubos teste

A utilização dos tubos teste é fundamental neste protocolo porque permite determinar, previamente e para cada matriz alimentar (neste caso, sumo turvo e sumo límpido), os volumes de soluções de NaOH

31

1 M ou HCl 1 M necessários para ajustar o pH de cada tubo de ensaio ao exigido no protocolo (fase gástrica, pH=3; fase intestinal, pH=7). Permite ainda otimizar o tempo de realização do ensaio de bioacessibilidade porque elimina a necessidade de leitura e ajuste de pH em cada tubo de ensaio. Os ensaios dos tubos teste foram efetuados uma vez, antes de se iniciar a determinação de bioacessibilidade nas amostras de sumos. Nesse sentido, foram preparados 2 tubos teste para cada uma das amostras de sumo de fruta à base de maçã (n = 8). Em cada tubo teste, foram recriadas as condições aplicadas durante o processo digestivo (exceto a adição de enzimas), utilizadas para a avaliação da bioacessibilidade. O procedimento de digestão in vitro encontra-se detalhado no capítulo 3.3.5. Os volumes determinados de HCl 1 M e NaOH 1 M foram anotados e utilizados posteriormente para a preparação final dos sucos digestivos.

Preparação final dos FDS (Fluídos Digestivos Simulados)

Para a preparação final dos sucos digestivos num fator de concentração 1.0x, foram considerados os seguintes dados:

- Resultados da atividade enzimática determinados anteriormente, para se calcular a massa de enzima a adicionar para garantir a atividade enzimática em cada etapa do método de digestão;

- Volumes de HCl e NaOH necessários para o ajuste de pH nas fases gástrica e intestinal, determinados na realização dos tubos teste;

- Volume de CaCl2 – adicionado apenas no momento de preparação do fluído

- Volume de H2O necessário para perfazer a solução de fluído digestivo.

A preparação dos fluídos efetua-se antes da sua utilização no protocolo de digestão in vitro, sendo importante assegurar a completa dissolução dos enzimas e sais biliares para garantir a homogeneidade na composição dos tubos de ensaio. A constituição final dos FDS pode ser encontrada no separador Anexos.

Protocolo de digestão in vitro

Número de amostras utilizadas e comparação de matrizes alimentares

Para cada uma das amostras analisadas foram considerados 5 replicados para cada fase, perfazendo um total de 20 replicados para cada fase do processo digestivo. Paralelamente, realizou-se uma avaliação conjunta dos sumos turvos e sumos límpidos, em todas as fases do processo digestivo, de forma a avaliar a influência das matrizes alimentares nas bioacessibilidades obtidas, tal como se poderá verificar no separador resultados.

Contaminação artificial das amostras

Devido à baixa contaminação natural das amostras utilizadas, verificada após a determinação analítica de patulina, foi necessário proceder à sua contaminação artificial com uma solução de patulina, com intuito de obter amostras com concentrações de patulina incluídas na gama da curva de calibração, e desta forma em condições ótimas de quantificação. As condições de contaminação artificial assim como a descrição das fases do processo digestivo estão referidas em seguida. As amostras de sumo utilizadas nos ensaios de digestão e como controlos foram fortificadas com uma solução de patulina 5 µg/mL para uma concentração de 40 µg/kg.

Controlos de contaminação

Concomitantemente à realização das digestões in vitro, foi realizado um controlo de contaminação com 640 µl de solução de patulina 5 µg/mL e 10 g de amostra de sumo de fruta, para cada uma das amostras

32

de sumo analisadas. A preparação destes controlos permitiu determinar os valores de bioacessibilidade da amostra digerida e não digerida, usados no cálculo da bioacessibilidade. Os controlos de contaminação foram colocados a -80ºC, numa câmara frigórica, para posterior avaliação.

Fase oral: proporção final de amostra para FSS (Fluído Salivar Simulado) de 1:1 (v / v)

Para avaliação da bioacessibilidade durante a fase oral, foram adicionadas a 6 g de amostra contaminada artificialmente com 96 µl de solução de patulina 5 µg/mL, 6 mL de FSS 1x (α-amilase 150 U/mL), seguida de incubação em estufa a 37º C, durante 2 minutos e agitação constante. Findos os 2 mins, os tubos são imediatamente colocados a -80º C em ultracongelador para posterior avaliação de bioacessibilidade.

Fase gástrica: proporção final de amostra para FGS (Fluído Gástrico Simulado) de 1:4 (v / v)

A avaliação de bioacessibilidade na fase gástrica iniciou-se com a contaminação artificial de 3 g de amostra, com 96 µl de solução de patulina 5 µg/mL, às quais se adicionaram 3 mL de FSS 1x (α-amilase 150 U/mL). Esta amostra foi de seguida incubada em estufa a 37º C, durante 2 minutos e agitação constante. A esta solução, foram adicionados 6 mL FGS 1x (pepsina 4000 U/mL, pH 3) seguido de incubação em estufa a 37º C, durante 2 horas, e agitação constante. Terminada esta etapa, as amostras foram colocadas a -80º C em ultracongelador, para posterior análise. Para se obter a bioacessibilidade para fase oral, o procedimento teve de ser parado no fim desta fase.

Fase intestinal: proporção final de amostra para FIS (Fluído Intestinal Simulado) de 1:8 (v / v)

Na fase intestinal, para a avaliação de bioacessibilidade, foram considerados 2 g de amostra artificialmente contaminadas com 128 µL de solução de patulina 5 µg/mL. A esta toma de amostra foram adicionados 2 mL de FSS 1x (α-amilase 150 U/mL), e realizada incubação a 37º C em estufa, durante 2 minutos e agitação constante. De seguida, foram adicionados a esta solução, 4 mL de FGS 1x (Pepsina 4000 U, pH 3), seguida de incubação em estufa a 37º C, durante 2 horas e agitação constante. No final das 2 horas, foram adicionados 8 mL de FIS 1x (pancreatina com atividade de tripsina 200 U/mL, bílis 10 mM, pH 7), seguida de incubação durante 2 horas, numa estufa a 37º C e com agitação constante. Por fim, foram adicionados 32 µL de pefabloc (500mM) e imediatamente a seguir, as amostras foram imersas em azoto líquido. As amostras foram então guardadas a -80ºC em ultracongelador, até posterior avaliação. Para se obter a bioacessibilidade para fase gástrica, o procedimento teve de ser parado no fim desta fase. Para se obter a bioacessibilidade para fase intestinal, o procedimento teve de ser parado no fim desta fase.

33

Oral Gástrica

Figura 3.2 – Imagem esquemática relativa à digestão in vitro nas diferentes fases do processo digestivo.

3.4 Análise quantitativa de pautina por SPE-HPCL-UV

O procedimento de extração e determinação de patulina está otimizado e validado para a aplicação em produtos à base de maçã.

Reagentes e soluções necessários

A determinação analítica de patulina incluiu a extração e a análise das amostras, sendo necessários os seguintes reagentes: acetato de etilo, n-Hexano e acetonitrilo próprios para HPLC; etanol absoluto, hidrogenocabonato de sódio anidro, ácido acético glacial 100%, p.a.; ácido perclórico 60%, sulfato de sódio anidro p.a., areia do mar purificada com ácido e calcinada (Merck (VWR, Portugal)). A água ultrapura utilizada tinha resistividade 18MΩ.cm-1 (Milli-Q da Millipore, Interface, Portugal).

O padrão de patulina (4-hidroxi-4H-furo (3,2-c) pirano-2(6H)-ona), ≥ 98% (TLC), foi adquirido à

Sigma-Aldrich.

Intestinal

+32µL de pefabloc (500mM)

34

Foram utilizadas diferentes soluções: soluções de uso geral, soluções de extração, soluções para a fase móvel e soluções padrão de micotoxinas.

Soluções gerais:

· Solução NaOH 0,01 M: 4 g de NaOH diluídas em 100 mL de água ultrapura. Diluição de 1:100 desta solução em água ultrapura.

· Ácido acético em acetato de etilo: 3 mL de ácido acético glacial 100% e 97 mL de acetato de etilo.

· Ácido acético 0,2 %: 0,5 mL de ácido acético glacial diluído em água ultrapura até 250 mL.

· Água pH=4: água ultrapura ajustada para pH=4 com ácido acético 0,2% (armazenada a 5 ± 3ºC).

· Solução de hipoclorito de sódio a 1,3%: 2 L de hipoclorito de sódio a 2% adicionados a 1 L de água da torneira.

Solução de extração:

Solução de extração acetato de etilo-n-hexano (60+40, v/v): 180 mL de acetato etilo com 120 mL de n-hexano (armazenada em frasco de vidro rolhado).

Fase móvel:

Foram adicionados a 940 mL de água ultrapura, 60 mL de acetonitrilo e 1 mL de ácido perclórico a 60%. De seguida a solução foi filtrada através de uma membrana filtrante para soluções aquosas (tipo HV), 47 mm de diâmetro, poro 0,45 µm, usando o sistema de filtração ligado a uma bomba de vácuo. Por fim, a solução foi desgaseificada em banho ultrassons.

Soluções de contaminação e padrão de patulina

· Patulina 200 µg/mL: reconstitui-se 5 mg de patulina em 25 mL de acetato de etilo.

· Solução de contaminação (5 µg/mL): evapora-se 1 mL da solução mãe de patulina em corrente de azoto e reconstitui-se o resíduo em 40 mL de acetato de etilo.

· Solução stock intermédia (10 µg/mL): evaporam-se 2 mL da solução mãe de patulina em corrente de azoto e reconstitui-se o resíduo em 40 mL de acetato de etilo

· Solução padrão de calibração 8 µg/L: mede-se 40 µL de solução patulina 10 mg/L para um balão de 50 mL e perfaz-se com água pH=4.

· Solução padrão de calibração 16 µg/L: mede-se 80 µL de solução patulina 10 mg/L para um balão de 50 mL e perfaz-se com água pH=4.

· Solução padrão de calibração 25 µg/L: mede-se 125 µL de solução patulina 10 mg/L para um balão de 50 mL e perfaz-se com água pH=4.

· Solução padrão de calibração 50 µg/L: mede-se 250 µL de solução patulina 10 mg/L para um balão de 50 mL e perfaz-se com água pH=4.

· Solução padrão de calibração 100 µg/L: mede-se 500 µL de solução patulina 10 mg/L para um balão de 50 mL e perfaz-se com água pH=4

Extração e purificação por SPE

A cada uma das amostras (10 mL) foram adicionados 2 g areia, 15 g de Na2SO4, 2 g de NaHCO3 e 10 mL de solvente de extração, agitando-se vigorosamente manualmente e em seguida num agitador mecânico, durante 5 min. A mistura foi depois centrifugada a baixa velocidade (valor indicativo – 1850 rpm ou 300-400 g), durante 1 min, após a qual foram transferidos 2,5 mL do sobrenadante para um cartucho de extração em fase sólida (Strata SI – 1,55 µm, 70A, 500 mg/ 3 mL Phenomenex ®). O

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sobrenadante eluiu gota-a-gota (por ação da gravidade) para um tubo de vidro contendo 50 µL de ácido acético em acetato de etilo. A patulina foi eluída do cartucho de SPE com 3 mL de solvente de extração, e de forma a facilitar a remoção de todo o conteúdo, recorreu-se a uma bomba de vácuo. O eluído foi posteriormente evaporado no evaporador de corrente de azoto com banho de água Caliper ®, Turbovap LV, a 20 psi e 38 ± 2ºC, durante 20 min. O resíduo obtido foi diluído em 1 mL de água pH=4, com agitação constante em vortex durante 3 min, assegurando assim a completa dissolução de patulina.

O extrato de patulina foi filtrado através de filtros de seringa PVDF (13 mm de diâmetro, poro 0,45 µm).

Determinação de patulina por análise cromatográfica

A análise por HPLC foi realizada num equipamento Waters® Alliance modelo 2695 com detetor ultravioleta (Waters® 2998). O software utilizado para o processamento de dados cromatográficos foi o Empower® 2. Durante o processo, foi utilizada uma coluna analítica de HPLC, 250x4.6 mm, 5 µm, Synergi Hydro-RP C18 com uma pré-coluna de 4x3 mm i.d. Hydro-RP C18 (Phenomenex® Torrence, CA).

A fase móvel era constituída, como referido, por água ultrapura, acetonitrilo e ácido perclórico. As condições cromatográficas encontram-se apresentadas na Tabela 3.6, tendo sido elaboradas de acordo com as condições descritas por Barreira e colaboradores (Barreira, et al., 2010).

Tabela 3.6 - Condições cromatográficas para a deteção de patulina.

Parâmetro Condições cromatográficas

Pré-coluna C18, Phenomenex

Coluna cromatográfica Fase reversa, Synergi RP C18, Phenomenex

Composição da fase móvel Água:Acetonitrilo:Ácido perclórico (94:6:1)

Modo Isocrático

Fluxo do eluente 1 mL/min

Temperatura da coluna 25ºC

Temperatura do amostrador 10ºC

Detetor de díodos (UV)

Volume de injeção

Comprimento de onda fixo, a 276 mm

200 µL

A curva de calibração foi preparada a partir das soluções padrão de calibração de 8, 16, 25, 50 e 100 µg/L de patulina. Na curva de calibração foram avaliados os coeficientes de determinação (r) e de variação do método (CVm). Aceitou-se a curva de calibração sempre que o coeficiente de determinação foi ≥ 0,995 e o CVm ≥ 10%.

A identificação de patulina foi feita por comparação do tempo de retenção de patulina obtido na amostra, com o obtido nos padrões da curva de calibração. Esta identificação foi feita com recurso ao software Empower 2. A quantificação de patulina presente nas amostras foi feita uma interpolação da curva de calibração. A concentração de patulina nas amostras foi expressa em µg/L.

36

O cálculo da concentração final em µg/L presente na amostra é feito através da equação:

)(m (mL)v

)( v (mL)v g/L)( C g/kg)(

12

13

g

mLPatulina

´

´´= mm

Se não houver alteração na massa da amostra, volume de solvente de extração e alíquota de extrato, a equação pode ser expressa de forma abreviada:

,40 g/L)( C g/kg)( ´= mmPatulina

Em que:

C: concentração da solução de ensaio calculada a partir da curva de calibração

m1: massa da amostra utilizada para análise (10 g)

v1: volume de solvente de extração (10 mL)

v2: alíquota para SPE (2,5 mL)

v3: volume de solução de água a pH=4 usada para dissolver o extrato (1 mL)

Bioacessibilidade de patulina em sumos de maçã

A determinação da bioacessibilidade nas diferentes fases foi expressa em percentagem e determinada pelas fórmulas:

Fase Oral:

!"#$%&&!'!(!)#)% (%) = !"#$ & ' & *

+!,-" x 100

Fase Gástrica:

Fase Intestinal:

Onde:

C oral: Concentração do contaminante na amostra digerida na fase oral (µg/Kg)

C gast: Concentração do contaminante na amostra digerida na fase gástrica (µg/Kg)

C int: Concentração do contaminante na amostra digerida na fase intestinal (µg/Kg)

C contr: concentração total inicial do contaminante no controlo de contaminação (µg/Kg)

Análise estatística

Para avaliar a variação de bioacessibilidade entre as diferentes fases do processo digestivo, compararam-se os valores médios de bioacessibilidade das fases oral, gástrica e intestinal, considerando para cada fase, os dados recolhidos de todas as amostras de sumo utilizadas. Foram também

./012344/5/6/7173 (%) = !"#$ & 8 & 9:;

+!,-" x 100

./012344/5/6/7173 (%) = !"#$ & <

+!,-" x 100

>1?@6/A1(BCDEF)G=GHG(BgDL)GxG9&9I

':; & 9I

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considerados os respetivos desvios-padrão(DP) e coeficientes de variação(CV), e os seus significados estatísticos serão abordados posteriormente no capítulo Resultados e Discussão.

Os resultados obtidos foram analisados com recurso ao programa SPSS - Statistical Package for Social

Sciences – o que permitiu analisar estatisticamente as características dos dados obtidos e realizar uma análise inferencial dos mesmos. Considerando que a amostragem era inferior a 30 replicados em cada fase (n=20) o teste não paramétrico Kruskal-Wallis foi usado para avaliar as diferenças estatisticamente significativas, entre os valores de bioacessibilidade das diferentes fases do processo digestivo.

38

4 Resultados e Discussão

4.1 Determinação da atividade enzimática

A tabela 4.1 apresenta os valores das atividades enzimáticas determinadas a partir dos métodos anteriormente descritos no capítulo anterior. As médias das atividades enzimáticas determinadas foram 25,8, 2425,0, 117,5 e 3,7, para a α-amilase, pepsina, tripsina e tripsina-pancreatina, respetivamente. Estes resultados estão de acordo com os valores anteriormente determinados pelo laboratório.

Tabela 4.1 - Atividades enzimáticas utilizadas no modelo de digestão in vitro. (n=3 para cada uma das enzimas testadas)

α-amilase Pepsina Tripsina

Tripsina-Pancreatina

Atividade enzimática (U/mg)

25,8 2425,0 117,5 3,7

4.2 Bioacessibilidade de patulina em sumos de maçã em diferentes fases da digestão

Os resultados de bioacessibilidade nas diferentes fases do processo digestivo, obtidos nas 4 amostras de sumos utilizados (2 límpidos + 2 turvos), apresentam-se na Tabela 4.2.

Relativamente à fase oral (O), foram determinados, valores que variaram entre os 56,8%, em S4 (macã + laranja) e 94,1% em S2 (maçã + marmelo)., Os valores médios de bioacessibilidade obtidos para cada uma das amostras foram 89,9 ± 2,7%, 85,3 ± 8,3%, 71,6 ± 7,7%, 64,5 ± 5,9%, correspondendo aos sumos S1, S2, S3 e S4, respetivamente.

Considerando os resultados de bioacessibilidade da fase gástrica (G), estes variaram entre 62,2% em S4 (maçã + laranja) e 98,0% em S1 (maçã) com valores médios de 91,4 ± 6,1%, 80,9 ± 2,4%, 76,3 ±7,2%, 68,4 ± 5,7%, correspondendo nas amostras S1, S2, S3 e S4, respetivamente.

Na fase intestinal (I), os resultados de bioacessibilidade variaram entre 5,4% em S3 (maçã) e 51,2% em S2 (maçã + marmelo), com valores médios de 21,4 ± 2,5%, 44,0 ± 8,6%, 6,1 ± 0,9% e 14,7 ± 3,5% nas amostras S1, S2, S3 e S4, respetivamente.

Os coeficientes de variação (CV) associados às amostras variaram entre 3% e 24%, sendo que para as fases oral e gástrica foram menores (entre 3% e 11%) e a fase intestinal superiores aos restantes (entre 12% e 24%).

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Tabela 4.2 - Valores médios de bioacessibilidade (%) de patulina em sumos à base de maçã contaminados artificialmente, nas diferentes fases do processo digestivo (n= 5 – número de testes realizados em cada sumo para cada fase).

DP = Desvio padrão; CV = Coeficiente de variação; O = Fase Oral; G = Fase Gástrica; I = Fase Intestinal

A Figura 4.1 representa graficamente, os dados referentes às médias de bioacessibilidade das fases oral, gástrica e intestinal. Analisando os valores de bioacessibilidade médios para cada uma das fases para sumos de fruta à base de maçã, verifica-se que a fase gástrica é a que apresenta maiores valores médios de bioacessibilidade (79,3 ± 9,6), próximos dos determinados para a fase oral (77,8 ± 11,8%). A fase intestinal apresenta, no entanto, valores de bioacessibilidade média mais reduzidos que as fases anteriormente referidas, com valores de 21,6 ± 16,2%.

Figura 4.1 – Representação gráfica da bioacessibilidade média de patulina em sumos de fruta à base de maçã obtidas nas diferentes fases do processo digestivo (n=20, para cada fase do processo digestivo).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Bio

aces

sbil

idad

e (%

)

Oral Gástrica Intestinal

40

Não foram verificadas diferenças estatisticamente significativas entre os valores médios de bioacessibildade das fases oral e gástrica (p value = 0,828). Contudo, fazendo a mesma comparação entre as fases oral e gástrica com a fase intestinal, os p values obtidos foram inferiores a 0,05. Neste caso, assume-se assim, que existem diferenças significativas nas médias de bioacessibilidade das fases oral e intestinal, e gástrica e intestinal,

Estudos anteriores demonstraram que a bioacessbilidade de um determinado composto, depende fortemente do tipo alimento em que se encontra, afetando a solubilidade e/ou libertação do mesmo da matriz alimentar (Sengul, et al. 2014; Rodríguez-Roque, et al. 2015). A bioacessibilidade de micotoxinas é, por isso, também afetada pela matriz alimentar onde se encontra (Kabak, et al. 2009). A presença de frutos na matriz alimentar, pode constituir um fator capaz de influenciar os valores de bioacessibilidade de micotoxinas (Assunção et al., 2016b).

Neste trabalho, os valores médios de bioacessibilidade mais baixos, na fase oral (64,5 ± 5,9%) e gástrica (68,4 ± 5,7%), foram registados na amostra S4 (maçã + laranja). Alguns autores referem que a fortificação com ácido ascórbico, ou com a sua forma ionizada ascorbato, mostrou ser um método eficaz na redução dos níveis de patulina em sumos de fruta (Ioi, et al. 2017; Nunes da Silva et al., 2007). Assim a presença de vitamina C (proveniente do sumo de laranja) na amostra S4, pode explicar a redução dos valores de bioacessibilidade de patulina nesta amostra. Por outro lado, a amostra S1 (sumo límpido de maça) é a que apresenta os maiores valores de bioacessibilidade nas fases oral (89,9 ± 2,7%) e gástrica (91,4 ± 6,1%). A composição e natureza da amostra poderá ter contribuído para estes resultados, já que a existência de uma matriz menos complexa e maioritariamente constituída por água, pode ter permitido que a patulina não se tenha associado a outros componentes da matriz, ficando livre para ser detetada pelos métodos cromatográficos.

Os resultados obtidos neste estudo sugerem que a grande redução da bioacessibilidade de patulina ocorre durante a fase intestinal. Num trabalho desenvolvido por Assunção e colaboradores (Assunção et al., 2014), são descritas bioacessibilidades médias na fase intestinal de 27,7 ± 13,5%, semelhantes aos descritos neste trabalho (21,6 ± 15,1%), em amostras de sumo artificialmente contaminadas com patulina. O método utilizado para esse estudo baseou-se, contudo, noutro modelo de digestão in vitro, descrito por Versantvoort e colaboradores (Versantvoort et al., 2005). Resumidamente, este método consistia na aplicação de um modelo IVD que realizava a simulação da digestão na boca, no estômago e no intestino delgado, propondo em simultâneo, a análise da bioacessibilidade da amostra combinada com uma refeição padrão. Este estudo, contudo, não teve em consideração os valores de atividade enzimática nos sucos digestivos. Já num estudo realizado por Brandon e colaboradores (Brandon et al., 2012), utilizando o mesmo modelo de digestão in vitro acima descrito, foi avaliada a bioacessibilidade de patulina em amostras à alimentação infantil), com a adição de uma refeição padrão holandesa (alho porro, presunto, cenoura e cogumelos). Este estudo revelou valores de bioacessibilidade entre 55 e 100% em alimentos contaminados, superiores aos determinados neste trabalho. O facto dos resultados obtidos serem inferiores aos obtidos no trabalho de Brandon e colaboradores poderá ser atribuído às diferenças entre as matrizes utilizadas. Noutro trabalho posterior de Assunção e colaboradores (Assunção et al., 2016b) aplicando o método harmonizado, são descritos valores médios de bioacessibilidade superiores aos referidos (52,0 ± 4,2%). Embora os valores de bioacessibilidade referidos sejam diferentes, todos revelam uma redução da bioacessibilidade na fase intestinal. A variação de pH resultante da adição do suco intestinal, alterando o pH para 7, pode ter sido um dos fatores para a redução de patulina verificada, já que a patulina é descrita como sendo estável em soluções acídicas, mas instável em gamas de pH superiores (Flieghe & Metzler, 2000). Outros fatores como o tempo e a ação enzimática são também referidos como possíveis responsáveis pela degradação de patulina (Baert et al., 2007). Estes fatores poderão contribuir para que, ao longo do

41

tempo, a patulina vá interagindo com as proteínas existentes na matriz e com as enzimas presentes durante o processo digestivo, formando compostos (toxina-proteína e/ou toxina-enzima) que podem não ser detetáveis na deteção cromatográfica, o que pode também, possivelmente, explicar os baixos valores de bioacessibilidade intestinal. Esta é uma área que necessita ser clarificada em estudos futuros.

Em contraste com a reduzida bioacessibilidade intestinal destacam-se, neste estudo, elevados valores de bioacessibilidade na fase oral e gástrica. Estes dados vêm revelar potenciais novos perigos para a saúde, consequentes da exposição a patulina. Em virtude de as amostras digeridas serem líquidas, o período de exposição do alimento à ação dos fluidos digestivos durante a fase oral é bastante reduzido. O mesmo não acontece durante a fase gástrica, em que os alimentos permanecem um maior período de tempo no estômago, expostos a diferentes condições (Boland, 2016). O estômago é também o primeiro órgão a ficar em contacto mais prolongado após a ingestão de alimentos contaminados com patulina. Alguns autores referem nos seus trabalhos problemas decorrentes da exposição gástrica a patulina. Num estudo desenvolvido por Speijers e colaboradores (Speijers et al., 1998), é descrito o aparecimento de úlceras gástricas em modelo murino adulto, resultantes da exposição a doses elevadas de patulina (84 mg/L e 295 mg/L). Num outro estudo (Rychlik et al., 2004), que teve como objetivo avaliar a absorção de patulina através do estômago, é referido que mesmo pequenas doses de patulina são passíveis de ser absorvidas através da mucosa gástrica, e, por conseguinte, atingir a circulação sistémica. Além disso, neste estudo é ainda referido que parte da patulina que atinge o compartimento gástrico pode interagir com as proteínas da membrana gástrica, modificando a estrutura das mesmas e resultando na sua degradação e/ou conversão da patulina em metabolitos secundários. Um documento recentemente elaborado pela EFSA refere que crianças com menos de 16 semanas são mais vulneráveis a contaminantes alimentares. Segundo o mesmo estudo, as funções gástricas, pancreáticas e biliares não estão totalmente desenvolvidas em crianças desta idade (Hardy et al., 2017). Além disso, é conhecida a maior probabilidade de exposição a patulina em crianças, já que consomem produtos à base de maçã (sumos, farinhas lácteas e purés) com maior regularidade, comparativamente aos indivíduos adultos (Barreira et al., 2010; Ioi et al., 2017).

A membrana intestinal constitui a primeira defesa física, química e biológica do organismo humano, contra agentes externos, atuando como um filtro seletivo à entrada de compostos para a corrente sanguínea e regulando a homeostasia intestinal (Turner et al., 2009; Robert et al., 2017). Alguns trabalhos têm-se dedicado a estudar os efeitos de toxicidade de patulina na membrana intestinal. Assunção e colaboradores reportam que a exposição a doses 50 µM de patulinaafectam a integridade do epitélio intestinal e a viabilidade de linhas celulares Caco-2 (Assunção et al., 2016a). Tannous e colaboradores, reportam também redução em número e viabilidade de linhas celulares Caco-2 em proliferação, após exposição durante 24h a patulina (3-100 µL) (Tannous et al. 2017). Um estudo de 2016, da autoria de Maidana e colegas, revelou que a exposição a 100 µL patulina gerou uma redução de células goblet, nos villi e nas criptas intestinais (Maidana, et al., 2016). Apesar dos baixos valores de bioacessibilidade intestinal obtidos no presente estudo registarem uma redução de patulina decorrente do processo digestivo, esta pode não ser suficiente para que os seus efeitos sejam inócuos na membrana intestinal. Assim sendo, é expectável que após o processo digestivo, chegue ainda ao complexo intestinal, uma quantidade de patulina suficiente para gerar toxicidade.

4.3 Influência da matriz alimentar nos valores de bioacessibilidade

A Figura 4.2 ilustra graficamente a comparação entre valores de bioacessibilidade obtidos em diferentes matrizes alimentares, neste caso, sumos límpidos e turvos de acordo com os valores da Tabela 4.3. Os dados revelam valores de bioacessibilidade muito semelhantes nas duas primeiras fases do processo digestivo (fase oral e fase gástrica) para os dois géneros de amostras ensaiadas (sumos límpidos e

42

turvos). Já na fase intestinal, os valores apresentaram diferenças entre os sumos de matriz límpida (18,0 ± 4,7%) e os sumos de matriz turva (25,6 ± 26,8). Verifica-se que não existem diferenças significativas quando as matrizes são comparadas entre si. Para os sumos considerados, os p values obtidos (fase oral: 0,939; fase gástrica: 0,821; fase intestinal: 1) são todos superiores a 0,05.

Tabela 4.3 - Valores de bioacessibilidade médios para as diferentes fases do processo digestivo, tendo em conta diferentes matrizes alimentares (Límpido e Turvo).

Oral Gástrica Intestinal

Límpido 77,2 ± 18,0 % 79,9 ± 16,3 % 18,0 ± 4,7 %

Turvo 78,4 ± 9,7 % 78,6 ± 3,3 % 25,7 ± 26,8 %

Figura 4.2- Influência da matriz na bioacessibilidade da patulina em sumos límpidos e turvos à base de maçã. Nota: Os valores apresentados nas colunas correspondem à média ± DP.

Nos valores de bioacessibilidade da fase intestinal dos sumos turvos, é possível destacar-se um elevado desvio padrão (26,8%), resultante da grande variabilidade de bioacessibilidades intestinais entre as amostras S2 (44,0 ± 8,6%) e S3 (6,1 ± 0,9%).

A razão para esta variabilidade de resultados nos diferentes estudos de bioacessibilidade de patulina em sumos de fruta poderá estar relacionada, para além da matriz, com a natureza da contaminação. Devemos recordar, que no presente estudo não foi considerado um quadro de contaminação natural, mas sim de contaminação artificial. Apesar de a contaminação artificial (40 µg/Kg) realizada, ser próxima de valores relatados de contaminação natural em estudos de ocorrência de patulina (Barreira et al., 2010; Martins et al., 2015), o comportamento de um composto numa matriz natural ou uma contaminação artificial são processos diferentes. Num contexto de contaminação natural, a patulina tem maior capacidade de ligação com a matriz alimentar, formando complexos mais resistentes à redução durante o processo digestivo (González-Arias et al., 2013). Por conseguinte, é expectável que num quadro de contaminação artificial, a patulina esteja mais exposta a componentes externos e por isso mais facilmente se dissociará da matriz alimentar. Outro fator que pode influenciar a variabilidade de valores de bioacessibilidade, prende-se com os elevados coeficientes de variação (CV) obtidos para as

0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

100.0

120.0

O G I

Límpido Turvo

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amostras durante a fase intestinal. O coeficiente de variação é considerado como medida de dispersão para estimar a precisão dos resultados e representa o desvio-padrão expresso como percentagem da média. Elevados CV poderão indicar a necessidade de incluir um maior número de análises, de forma a diminuir a dispersão dos resultados obtidos, para esta fase do processo digestivo.

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5 Conclusões e perspetivas futuras

Neste trabalho é realizada, pela primeira vez, a comparação dos valores de bioacessibilidade da patulina (micotoxina) ao longo das diferentes fases do processo digestivo, aplicando o método de digestão in

vitro harmonizado. Os resultados revelam elevados valores de bioacessibilidade oral e gástrica (O:77,8 ± 11,8%; G: 79,3 ± 9,6), comparativamente aos obtidos durante a fase intestinal (21,6 ± 16,2%.). Os elevados valores de bioacessibilidade obtidos, principalmente os relativos à fase gástrica, sugerem que deve ser dada particular atenção aos efeitos da exposição de patulina no compartimento gástrico, sendo por isso recomendado o reforço do número de estudos dedicados a compreender os efeitos da exposição de patulina neste compartimento digestivo. A compreensão dos problemas associados à exposição a patulina no compartimento gástrico ganha ainda maior relevância, se considerarmos populações mais vulneráveis, como as crianças. Como se conhece, o sistema digestivo deste grupo populacional não é ainda totalmente desenvolvido a nível fisiológico, tornando-as mais vulneráveis a contaminantes alimentares. Adicionalmente, a sua dieta é menos diversificada que a dos adultos, cingindo-se a uma restrita lista de alimentos, como o leite materno, fórmulas infantis, entre outros. Assim, a conjugação destes dois fatores: imaturo desenvolvimento do sistema digestivo e dietas pouco diversificadas, resulta numa maior exposição das crianças a contaminantes alimentares, como as micotoxinas. Logo após o nascimento, os compartimentos digestivos, juntamente com o lúmen intestinal das crianças recém-nascidas, são expostos pela primeira vez a componentes externos. É consensual, que uma digestão eficiente dos nutrientes é essencial para que o recém-nascido possa garantir um crescimento e desenvolvimento normais e saudáveis. Será importante por isso, no futuro, o desenvolvimento de estudos sobre digestão humana, recorrendo ao modelo de digestão infantil recentemente proposto, para que melhor se possa compreender a bioacessibilidade de micotoxinas e, por conseguinte, os seus possíveis impactos na saúde, em particular da patulina, neste grupo populacional. Os resultados obtidos nesta dissertação constituem certamente uma ferramenta importante para avaliar a real exposição das crianças a micotoxinas através da alimentação contribuindo para a proteção da saúde infantil.

Os resultados obtidos neste trabalho indicam que não existem diferenças significativas relativamente a matrizes de natureza diferente, sugerindo assim que as mesmas não têm influência na bioacessibilidade de patulina em sumos de fruta (Oral - límpido: 77,2 ± 18,0 %; turvo: 78,4 ± 9,7 %; Gástrico - límpido: 79,9 ± 16,3 %; turvo: 78,6 ± 3,3 %; Intestinal - límpido: 18,0 ± 4,7 %; turvo: 25,7 ± 26,8 %). Apesar de trabalhos anteriores indicarem que a matriz alimentar poderia influenciar os valores de bioacessibilidade de micotoxinas, o mesmo não se verifica neste trabalho e isso pode ser explicado pela contaminação artificial das amostras, resultando numa ligação entre composto e matriz diferente do que ocorreria num contexto de contaminação natural. A maioria dos estudos de bioacessibilidade realizados atualmente, assenta em amostragem geralmente contaminada artificialmente. Neste estudo, o mesmo método de contaminação artificial foi aplicado, e apesar de se ter tido em conta a aproximação a um quadro de contaminação natural, será importante reforçar o número de estudos de bioacessibilidade em amostras naturalmente contaminadas com patulina, de forma a ser possível uma comparação eficaz com os resultados obtidos em amostras artificialmente contaminadas.

No futuro prevê-se que possam ocorrer novas preocupações relativamente às micotoxinas, nas quais se incluem as alterações climáticas. As alterações climáticas constituem uma importante questão para o desenvolvimento sustentável das sociedades humanas e o funcionamento dos ecossistemas na Terra. Estima-se que estas irão influenciar os sistemas agrícolas primários, incluindo a produção animal e vegetal. Os estudos sobre alterações climáticas preveem um aumento da temperatura global do ar, alterações no nível de precipitação, aumentos dos períodos de seca e a acumulação de dióxido de carbono atmosférico, fatores estes que geram dentro da comunidade científica, preocupações relacionadas com a agricultura e consequentemente ao nível da segurança alimentar. Considerando que

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o clima representa um fator crucial para os ecossistemas agrícolas, prevê-se que as alterações climáticas possam potencializar o crescimento de fungos, sendo que vários autores referem nos seus trabalhos que o aumento das temperaturas beneficia a proliferação de diversas espécies de fungos com potencial toxicogénico. Como consequência de maior desenvolvimento fúngico, prevê-se que aumente também o potencial desenvolvimento de micotoxinas em culturas agrícolas. A literatura refere que os países europeus com climas temperados, nos quais se incluem Portugal, têm maior risco de exposição à carga fúngica, compreendendo fungos e micotoxinas. Supõe-se que os impactos das alterações climáticas em Portugal possam resultar em menor precipitação anual e, no aumento de situações climatéricas extremas e de maior intensidade (por exemplo, ondas de calor e secas). Portugal é, por isso, considerado atualmente um país altamente vulnerável aos impactos das alterações climáticas, considerando a exposição a micotoxinas, devido à sua localização geográfica. Desta forma, será importante que futuramente, a comunidade política, os órgãos de decisão e de controlo alimentar a nível europeu, consigam implementar soluções eficazes relativamente às micotoxinas. Estas soluções podem passar, por exemplo pelo aumento do controlo sobre as culturas agrícolas expostas ao desenvolvimento fúngico ou pelo reforço do número de estudos sobre micotoxinas, incluíndo estudos de bioacessibilidade, tais como os realizados no âmbito desta dissertação, já que estes constituem uma importante ferramenta para a avaliação do impacto das micotoxinas na saúde da população.

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6 Referências bibliográficas

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7 Anexos

Conteúdos

Anexo I – Publicação em revista científica internacional

Anexo II – Publicação em revista científica nacional

Anexo III – Comunicação em forma de poster apresentado em evento científico

Anexo IV – Dados experimentais suplementares

i. Constituição final dos sucos digestivos a. Fluído Salivar Simulado b. Fluído Gástrico Simulado c. Fluído Intestinal Simulado

ii. Quantificação de patulina em sumos de fruta artificialmente contaminados (exemplo)

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Anexo I – Publicação em revista científica internacional

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Anexo II – Publicação em revista científica nacional

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Anexo III – Comunicação em forma de poster apresentado em evento científico

O seguinte poster científico foi apresentado no âmbito de uma conferência internacional sobre contaminantes alimentares, ICFC (Internacional Conference of Food Contaminants), que se realizou em Braga, Portugal, em julho de 2017.

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Anexo IV – Dados experimentais

i. Constituição final dos sucos digestivos

a) Fluído Salivar Simulado

Na tabela 2.7 está apresentada a constituição final de FSS para cada uma das fases do processo digestivo (oral, gástrica e intestinal) e respetivos volumes necessários. A composição final do FSS para cada uma das fases do processo digestivo teve em conta a quantidade inicial de amostra (em gramas). Relembrando que a atividade enzimática necessária de amilase é de 150U para 1 mL de FSS, e considerando que a atividade enzimática determinada da amílase utilizada neste trabalho é 26 U/mg, podemos aferir que 150U = 5,77 mg para cada mL de FSS.

Tabela A.a - Constituição final do FSS para as diferentes fases do processo digestivo

Quantidade inicial de amostra

FSS 1.0x 2g (FI) 3g (FG) 6g (FS)

FSS 1,25x (mL) 1,6 2,4 4,8

Amilase 150 U (mg) 11,54 17,31 34,62

CaCl2 300 mM (µL) 10 15 30

H2O (mL) 0,39 0,585 1,17

Volume final de FSS 2 mL 3 mL 6 mL

b) Fluído Gástrico Simulado

A Tabela 2.8 apresenta a constituição final de FGS utilizado para este trabalho, considerando os volumes finais necessários. Nesta tabela também se encontram os resultados obtidos na preparação dos test tube, estão descritos os volumes de HCl 1M necessários para se atingir pH=3 e respetivo volume de água a adicionar para se atingir o volume final pretendido (4 mL para a FI e 6 mL para a FG). Tal como na preparação do FSS, foi considerada a quantidade inicial de amostra (em gramas). Para a realização da fase gástrica pretende-se que a atividade enzimática necessária de pepsina seja 4000U, deste modo, e considerando que a atividade enzimática determinada foi de 2425U/mg, aferimos que 4000U = 1,65 mg para mL de FGS.

Tabela A.b - Constiuição final do FGS para as fases gástrica e intestinal

Quantidade inicial de amostra

FGS 1.0x 2g (FI) 3g (FG)

FGS 1,25x (mL) 3,2 4,8

Pepsina 4000 U (mg) 6,6 9,9

CaCl2 300 mM (µL) 2 3

S1 S2 S3 S4 S1 S2 S3 S4

HCl 1M(µL) 70 60 55 85 105 90 83 128

H2O (mL) 0,728 0,738 0,743 0,713 1,092 1,107 1,114 1,069

Volume final de FGS 4 mL 6 mL

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c) Fluido Intestinal Simulado

Na tabela 2.9 podemos verificar a constituição final de FIS utilizado para o desenvolvimento deste trabalho, considerando o volume final pretendido de 8 mL. Na mesma tabela podemos encontrar os dados relativos aos resultados dos test tube para a fase intestinal, descrevendo assim o volume necessário de NaOH 1 M necessário para se ajustar o pH a 7, bem como do volume de água necessário para se perfazer o volume final (8 mL). Assim como na preparação dos outros sucos digestivos, foi considerada a quantidade inicial de amostra (em gramas). Pretendia-se que a atividade enzimática de pancreatina fosse 200U, e assim sendo, considerando que a atividade enzimática da pancreatina determinada foi de 3,7 U/mg, constatamos que 200U = 54,05 mg por 1 mL de FIS.

Tabela A.c - Constituição final do FIS para a fase intestinal

Quantidade inicial de amostra

FIS 1.0x 2g (FI)

FIS 1,25x (mL) 6,4

Pancreatina 200 U (mg) 432,4

CaCl2 300 mM (µL) 16

Bílis 20 mM (mL) 0,864

S1 S2 S3 S4

NaOH (µL) 25 5 10 55

H2O (mL) 0,695 0,715 0,71 0,665

Volume final de FIS 8 mL

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ii. Quantificação de patulina em sumos de fruta artificialmente contaminados (exemplo)

As seguintes imagens apresentadas correspondem a exemplos de cromatogramas gerados pelo software Empower, neste caso referentes à amostra S1, e respetiva tabela de cálculos de quantificação de patulina em cada uma das fases do processo digestivo.

Registos de bioacessibilidade da Fase Salivar

Registo de bioacessibilidade da Fase Gástrica

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Registo de bioacessibilidade da Fase Intestinal

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Registo de bioacessibilidade de um Controlo de Contaminação

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Tabela A.d - Exemplo de folha de cálculo para quantificação de bioacessilidade na amostra S1. Os campos a sombreado correspondem aos campos a preencher, com os dados obtidos a partir dos cromatogramas, sendo referentes à área do pico.

Ensaio Bioacessib. (Data) Amostras

2/9/2017 P11 S1 P11 G1 P11 I1 P11 CONT. CONTAM.

Toma 10 10 10 10

Solvente extracção (mL) 10 10 10 10

Volume obtido SPE (mL) 2.5 2.5 2.5 2.5

Água redissolução (mL) 1 1 1 1

Conc. (μg/L) 62.85 65.43 11.254 90.281

Conc. (μg/kg) 25.1 26.2 4.5 36.1

Factor diluição amostra (1:x)

1 1 1 5

Conc.c/diluição (μg/kg) 25.14 26.17 4.50 180.56