Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
E SAÚDE PÚBLICA
ALAINE MARIA LOPES CATÃO
Efeito da umidade relativa sobre o desenvolvimento de micélio e
conídios de microescleródios de Metarhizium anisopliae em
formulação peletizada
Goiânia
2016
i
ALAINE MARIA LOPES CATÃO
Efeito da umidade relativa sobre o desenvolvimento de micélio e
conídios de microescleródios de Metarhizium anisopliae em
formulação peletizada
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Medicina
Tropical e Saúde Pública da Universidade
Federal de Goiás para obtenção do
Título de Mestre em Medicina Tropical
e Saúde Pública.
Orientador: Dr. Wolf Christian Luz
Goiânia
2016
ii
iii
iv
“A descoberta consiste em ver o que todo mundo viu e
pensar o que ninguém pensou.”
― Jonathan Swift
v
Dedico este trabalho aos meus pais, Maria Francisca
de Faria Lopes Catão e Antonio José Catão, pelo
incentivo e apoio em todas as minhas escolhas e
decisões.
vi
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Christian Luz, Professor do Departamento de Microbiologia, Imunologia,
Parasitologia e Patologia (DMIPP), Setor de Parasitologia do Instituto de Patologia
Tropical e Saúde Pública (IPTSP) da Universidade Federal de Goiás (UFG), que me
abriu as portas do LPI e me acolheu. Só tenho a agradecer pelos seus ensinamentos,
orientação, paciência e motivação.
Ao IPTSP e ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da UFG, pela
oportunidade.
Ao CNPq pela bolsa de estudos concedida.
Aos Prof. Dr. Ricardo Neves Marreto do Laboratório Farmatec - Faculdade de
Farmácia/UFG e Dr. Éverton Kort Kamp Fernandes do Laboratório de Patologia de
Invertebrados (LPI) pela colaboração, sugestões e correções.
Ao pesquisador Dr. Gabriel Moura Mascarin (EMBRAPA) pela prontidão e
colaboração inestimável.
A todos os membros da equipe do Laboratório de Patologia de Invertebrados (LPI) pela
ajuda e companheirismo.
A todos os membros da equipe do Laboratório Farmatec – FF/UFG, em especial a
mestranda Thainá Rodrigues pelo auxílio na produção dos péletes.
A minha companheira de pesquisa Flávia Regina Santos da Paixão pela imensa ajuda,
paciência, e por me proporcionar momentos de alegria na elaboração desse trabalho.
Aos meus pais, Maria Francisca e Antonio, e meus irmãos Alvinan e Anderson, por cada
palavra de coragem e pela presença essencial que me trouxe momentos alegres e
renovadores.
Ao meu querido Gustavo, pelo incentivo, ajuda e compreensão.
.
A todos os amigos e pessoas que de uma forma ou de outra deixaram a sua contribuição
durante minha jornada.
vii
SUMÁRIO
FIGURAS E TABELAS ................................................................................... vii
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS................................................... ix
RESUMO............................................................................................................ x
ABSTRACT ....................................................................................................... xi
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 1
2 REVISÃO DA LITERATURA......................................................................... 3
2.1 Controle microbiano............................................................................................. 3
2.2 Fungos entomopatogênicos................................................................................... 4
2.2.1 Importância no controle microbiano .................................................................... 4
2.1.2 Aspectos morfológicos e mecanismos gerais de infecção..................................... 5
2.2.3 Metarhizium anisopliae......................................................................................... 7
2.3 Fatores abióticos.................................................................................................... 8
2.3.1 Umidade relativa................................................................................................... 9
2.4 Formulações de micoinseticidas............................................................................ 9
2.4.1 Péletes e Peletização.............................................................................................. 11
2.4.1.1 Mistura dos pós e malaxagem............................................................................... 12
2.4.1.2 Extrusão................................................................................................................. 13
2.4.1.3 Esferonização........................................................................................................ 13
2.4.1.4 Secagem................................................................................................................. 13
2.5 Umectantes............................................................................................................ 13
3 JUSTIFICATIVA ............................................................................................... 15
4 OBJETIVOS ....................................................................................................... 16
4.1 Objetivo geral ....................................................................................................... 16
4.2 Objetivos específicos ............................................................................................ 16
5 MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................. 17
5.1 Origem e preparo de M. anisopliae....................................................................... 17
5.2 Produção de agregados de hifas............................................................................ 17
5.3 Absorção de água em celulose microcristalina ou vermiculita............................. 18
5.4 Preparação dos péletes com ou sem umectantes................................................... 20
5.5 Simulação da umidade relativa.............................................................................. 22
5.6 Análise dos resultados........................................................................................... 24
6 RESULTADOS.................................................................................................... 25
6.1 Efeito sobre a absorção de água em celulose microcristalina ou vermiculita....... 25
viii
6.2 Acúmulo de biomassa e produção de agregados de hifas..................................... 27
6.3 Efeito da Umidade relativa em péletes de celulose ou de vermiculita.................. 28
6.4 Efeito da Umidade relativa em péletes de celulose ou vermiculita com glicerina 31
7 DISCUSSÃO........................................................................................................ 32
8 CONCLUSÕES.................................................................................................... 38
REFERÊNCIAS ................................................................................................. 39
ix
FIGURAS E TABELAS
Figuras Título Página
Figura 1 Ciclo básico da relação patógeno-hospedeiro de fungos anamórficos. Fonte
de MASCARIN, PAULI (2010). 7
Figura 2 Etapas do processo de peletização por extrusão/esferonização.
11
Figura 3 Modelo de um extrusor de rolos (A). Esquema do processo de esferonização
(B). Mecanismos de formação de péletes durante a esferonização (D).
Adaptado de SANTOS et al. (2004) e AULTON (2005).
13
Figura 4 Etapas da produção de agregados de hifas. IP 46 com 15 dias de cultivo (A);
Raspagem de conídios (B); Preparação da suspensão de conídios (C e D);
Meio líquido com a suspensão de IP 46 antes (E) e depois da fermentação
(F); Biomassa + Terra diatomácea (TD) (G); Mistura (TD + biomassa) sendo
filtrada (H).
19
Figura 5
Processo de peletização. Mistura da biomassa com os aditivos - malaxagem
(A e B); Extrusor de rolos (C); Massa extrusada (D); Esferonizador (E);
Péletes formados (F).
21
Figura 6 Recipiente de plástico usado para testes com Umidade relativa (UR). Trinta
miligramas dos péletes em cada poço da placa de cultura (A); Péletes em
forma de monocamada (B); Recipiente fechado hermeticamente com solução
NaCl (C e D).
23
Figura 7
Absorção média (± erro padrão da média) de água em celulose
microcristalina (A) ou vermiculita (B), acrescida de polietilenoglicol 400
(PEG 400), propilenoglicol, ou glicerina em proporções de 10 – 40 % com
cinco dias de exposição a 25 ± 1 oC e 86 ± 5% de umidade relativa.
26
Figura 8
Absorção de água em celulose (A) ou vermiculita (B) acrescida de glicerina
em proporções de 5 – 40% expostas a 25 ± 1 oC e 86 ± 5% de umidade
relativa até cinco dias.
27
Figura 9 Agregados de hifas (AH) produzidos após quatro dias de incubação a 250
rpm e 27 ºC. Culturas foram crescidas em meio com razão de C:N de 30:1.
AH corados com azul de algodão e visualizados com magnitude de 400 x
(A). AH com diâmetro medido em microscópio de contraste de fase com
magnitude de 400 x (B).
28
Figura 10 Péletes de celulose (40% celulose, 60% de terra diatomácea + IP 46) em
placas de cultura, expostos a 100% de UR (A) e 98,5% de UR (B) a 25 ± 1 oC após cinco dias de incubação. Presença de micélio e início da
conidiogênese.
29
Figura 11 Número médio de conídios de Metarhizium anisopliae / mg de péletes
formulados (40% celulose, 60% de terra diatomácea + IP 46) após exposição
dos péletes em umidade relativa entre 75% e 100%, fotofase de 12 horas a 25
± 1 oC até 20 dias.
29
Figura 12 Número médio de conídios de Metarhizium anisopliae / mg de péletes
formulados (20% de terra diatomácea + 78% vermiculita + 2% dióxido de
silício) após exposição dos péletes em umidade relativa entre 75% e 100%,
fotofase de 12 horas a 25 ± 1 oC
30
x
Figura 13 Péletes de celulose com 40% de glicerina expostos a 91% UR a 25 ± 1 oC
após cinco dias em placa de cultura. Note o acúmulo de líquido em volta dos
péletes.
32
Figura 14 Péletes de celulose com 10 % de glicerina expostos a 91% UR a 25 ± 1 oC
em placa de cultura. Início do desenvolvimento de micélio sobre os péletes
após cinco dias de exposição (A). Desenvolvimento de conídios sobre os
péletes após 10 dias de exposição (B).
32
Figura 15 Início da conidiogênese sobre os péletes à base de vermiculita com 10% de
glicerina, após oito dias de exposição. Péletes expostos a 91% UR a 25 ± 1 oC em placa de cultura.
33
Figura 16 Número médio de conídios (± erro padrão da média) de Metarhizium
anisopliae / mg de péletes de celulose (30% celulose, 60% de terra
diatomácea + 10 % glicerina) ou vermiculita (20% de terra diatomácea +
78% vermiculita + 2% dióxido de silício) após exposição em 91% UR,
fotofase de 12 horas a 25 ± 1 oC até 20 dias.
34
Tabelas Título Página
Tabela 1 Proporção de aditivos utilizados para confecção de péletes com celulose
microcristalina ou vermiculita. 21
Tabela 2 Relação de NaCl dissolvido em água para estabelecer umidade relativa
(UR) definida a 25º C em recipiente fechado. 22
Tabela 3
Absorção de água (% ± EM) em celulose microcristalina ou vermiculita
acrescida de umectantes polietilenoglicol 400 (PEG 400), propilenoglicol,
ou glicerina em concentrações de 10 – 60% em 24 horas a 25 ± 1 oC e 86 ±
5% de umidade relativa
26
xi
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
UR Umidade relativa
AH Agregados de hifas
FE Fungos entomopatogênicos
TD Terra diatomácea
CMC Celulose microcristalina
ºC Graus Celsius
µm Micrômetro
mL Mililitro
cm Centímetro
m/m Massa/Massa
L Litro
g Grama
UV Ultravioleta
RPM Rotações por minutos
PEG 400 Polietilenoglicol 400
EM Erro padrão da média
ANOVA Análise de variância
DDT Dicloro difenil tricloroetano
BDA Batata dextrose e ágar
xii
RESUMO
Metarhizium anisopliae chama atenção no controle microbiano devido às suas
características entomopatogênicas, infectando uma ampla gama de insetos. Umidade
relativa alta é um fator chave no desenvolvimento da micose durante as fases extra-
cuticulares. Em condições adversas, M. anisopliae consegue produzir estruturas de
resistência, denominadas agregados de hifas. Em umidade alta, esses agregados são
capazes de produzir novos conídios que, por sua vez, podem causar infecção no
hospedeiro alvo. Entretanto, nem sempre o fungo encontra circunstâncias ideais de
umidade para se desenvolver. Para contornar problemas relacionados a umidades
suboptimais, o desenvolvimento de formulações é de suma importância, e produtos
formulados contendo aditivos, tais como umectantes, apresentam grande potencial. O
objetivo deste trabalho foi desenvolver uma formulação peletizada de agregados de
hifas de M. anisopliae IP 46 com adição ou não de umectante, e avaliar o efeito que a
umidade relativa exerce sobre a produção de conídios de M. anisopliae em condições de
laboratório. Uma triagem com glicerina, propilenoglicol e PEG 400 foi realizada para
saber qual melhor umectante em relação à absorção de água. Agregados de hifas foram
produzidos em meio líquido. A biomassa foi filtrada e péletes foram preparados com
celulose microcristalina ou vermiculita com ou sem glicerina. A umidade relativa foi
avaliada através de gradiente de umidade controlada com soluções aquosas de NaCl. A
absorção de água com a glicerina foi maior quando comparada com propilenoglicol e
PEG 400. Entre os aditivos testados com glicerina, celulose microcristalina absorveu
mais água do que o aditivo vermiculita, visto que a celulose tem propriedades
umectantes aumentando a absorção de água. O maior número de conídios, tanto para
péletes com vermiculita, como para celulose foi produzido a 100% UR e a menor
produção foi com 93% UR. Em umidades < 93% não houve produção de conídios até
20 dias, evidenciando o forte efeito da umidade na produção de conídios. Um acúmulo
de água pôde ser observado em péletes com 40% de glicerina em umidade ≥ 91% e com
93% UR nos péletes com glicerina 10%. Essa concentração pode ter sido alta e impediu
o crescimento do fungo. Nos péletes com adição de glicerina 10 %, apenas péletes
expostos a 91% UR que produziram conídios, tanto para péletes de celulose, como para
péletes de vermiculita.
Palavras – chave: Fungos entomopatogênicos, umidade relativa, formulação,
péletes
xiii
ABSTRACT
Metarhizium anisopliae has a worldwide repertation in microbial control due to its
entomopathogenic characteristics, infecting a wide range of insects. High relative
humidity is a key factor in the development of mycoses during extra-cuticular phases. In
adverse conditions, M. anisopliae can produce resistance structures formed by hyphal
aggregates. Upon high humidity these aggregates are capable of producing new conidia
that can cause infection in the target host. However, the fungus not always finds suitable
conditions of humidity to develop itself. To overcome constraints related to suboptimal
humidities, formulations play a pivotal role, and formulated products containing
additives, such as humectants, have a great potential to accomplish this goal. The
objective of this study was to develop a pelletized formulation of hyphal aggregates of
M. anisopliae IP 46 with or without addition of a humectant, and further evaluate the
effect of relative humidity on conidia production of M. anisopliae in laboratory
conditions. A screening with glycerin, propylene glycol and PEG 400 was performed to
find out which humectant was best for water absorption. Hyphal aggregates were
produced in specific semi-synthetic liquid medium. The biomass was filtered and pellets
prepared with microcrystalline cellulose or vermiculite amended with or without
glycerine. The relative humidity was assessed under controlled humidity gradient
generated by aqueous solutions of NaCl. The water absorption rate with the glycerin
appeared to be greater when compared to propylene glycol and PEG 400. Among the
additives tested with glycerin, microcrystalline cellulose absorbed greater water content
than the vermiculite, since the former has humectant properties increasing water
absorption. The largest number of conidia, both for pellets with vermiculite and
cellulose, was produced at 100% RH and the lowest production was achieved at 93 %
RH. At humidities < 93% there was no conidia production up to 20 days, indicating a
strong humidity effect in the fungal sporulation. An accumulation of water could be
seen on pellets with 40% glycerin at humidity ≥ 91% and at 93% RH on pellets with
glycerin 10%. This high water content could have been prevented the fungal growth. In
pellets with addition of 10% glycerin, only pellets exposed to 91% RH produced
conidia, both for cellulose pellets, and for vermiculite pellets.
Keywords: Entomopathogenic fungi, Relative Humidity, formulation, pellets
1
1 INTRODUÇÃO
Entre os diferentes agentes de controle microbiano, fungos entomopatogênicos
têm se destacado e têm sido utilizados no controle de pragas há mais de cem anos
(GUAGLIUMI, 1968). Em geral, fungos são patógenos que infectam uma vasta gama
de artrópodes considerados pragas agrícolas e vetores que transmitem doenças ao
homem e a outros animais. Possuem características que os tornam promissores no
controle microbiano, como a grande variabilidade genética, a capacidade de invasão no
hospedeiro, podendo ser por ingestão ou por contato, principal mecanismo de ação, e
também podem infectar diferentes estágios de desenvolvimento do hospedeiro, como
ovos, larvas, pupas e adultos (BUTT, COPPING, 2000; SILVA et al., 2004).
Metarhizium anisopliae é uma espécie bem estudada com potencial de causar
infecção em um grande número de insetos e aracnídeos (ácaros e carrapatos), sua
distribuição é cosmopolita e é encontrado em diferentes climas, como o temperado,
subtropical e tropical (ZIMMERMANN, 1993, 2007). Em condições adversas, M.
anisopliae, encontrado em solo, produz, naturalmente, estruturas melanizadas e
compactadas, denominadas agregados de hifas (microescleródios). Esses agregados de
hifas são estruturas de resistência, sendo um mecanismo de sobrevivência de fungos
capazes de sobreviver a períodos secos. Quando a umidade relativa é favorável, esses
agregados produzem novos conídios e assim, infectam insetos alvos (JACKSON,
JARONSKI, 2009; BEHLE, et al., 2015).
A interação patógeno-hospedeiro é fortemente influenciada por diferentes
fatores, tais como a umidade, temperatura, e energia luminosa (luz e a radiação
ultravioleta-UV), bem como pelas condições nutricionais e suscetibilidade do
hospedeiro (WALSTAD, ANDERSON, STAMBAUGH, 1970; STEINKRAUS,
SLAYMAKER, 1994). A umidade relativa é um fator abiótico chave no
desenvolvimento dos fungos, sendo importante nas etapas de adesão: em umidade
relativa alta, os conídios iniciam a formação de tubos germinativos e de hifas; e quando
o fungo se exterioriza, dando início à conidiogênese, assim novos conídios são
formados e disseminados no ambiente para infectar insetos suscetíveis (GOETTEL et
al., 2000; HAJEK, 2004; GOBLE et al., 2016).
2
Fatores abióticos estressantes no ambiente natural como, umidade relativa
suboptimal, alta temperatura, pH desfavorável e radiação UV (BATTA, 2003), podem
afetar a persistência dos fungos no ambiente e dificultar o desenvolvimento de micoses
em insetos suscetíveis. Estes fatores limitantes podem ser contornados com novos
métodos de formulações e estratégias de aplicações específicas.
O principal objetivo de formulações à base de entomopatógenos é liberar o
ingrediente ativo de forma adequada para que tenha uma alta eficiência e mantenha-se
viável no campo (BURGUES, 1998). Além do mais, devem ter um baixo custo e ser de
fácil manuseio e aplicação. Essas formulações podem estar em formas de líquido, pó,
gel ou em forma de grânulos e péletes, sendo que o tipo de formulação a escolher,
dependerá de onde e como será aplicada (BATTA, 2003; LUZ, BATAGIN, 2005).
Formulações peletizadas imobilizam as formas infectivas dos fungos dentro de
uma matriz de polímero como a celulose, ou em matrizes inorgânicas (vermiculita).
Apresentam vantagens por serem de fácil manuseio e aplicação, já que não necessitam
de nenhum preparo prévio momento antes da aplicação, como acontece com os
formulados emulsionáveis. Também é possível acrescentar adjuvantes na formulação,
com objetivo de aumentar a virulência, proteger contra fatores abióticos e melhorar a
aplicabilidade (BURGUES, 1998).
A escolha de adjuvantes nas formulações de micoinseticidas deve ser criteriosa,
pois não devem influenciar na viabilidade dos conídios. Esses adjuvantes podem ser
umectantes, óleos, bloqueadores de UV, entre outros que podem melhorar a formulação
(FAULDE et al., 2006; LUZ et al. 2012). Umectantes são usados para aumentar a
molhabilidade, amenizando problemas com dessecação em condições de baixa UR no
campo. Glicerina, PEG 400 e propilenoglicol são usados em certas formulações de
alguns setores industriais e são interessantes em formulação exposta à baixa umidade
relativa.
A busca por novos métodos de formulação e aplicação é necessária para sucesso
de micoinseticidas, assim como uma maior clareza à respeito da ação de adjuvantes
sobre o desenvolvimento do fungo. No presente trabalho, agregados de hifas de M.
anisopliae IP 46 foram peletizados com adição ou não de umectante e expostos a
diferentes gradientes de umidade relativa para avaliar o efeito das umidades relativas
sobre a produção de conídios.
3
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Controle microbiano
O controle microbiano é um ramo do controle biológico que se baseia na
utilização racional de entomopatógenos, a fim de reduzir uma população alvo que causa
dano, podendo esta ser uma praga agrícola, florestal ou urbana. Embora o termo
entomopatogênico se refira a patogenia em insetos, sua aplicabilidade vai muito além,
sendo utilizado também como patógenos de outros animais invertebrados de
importância médica (DUARTE et al., 2015; PERINOTTO et al., 2012) e agrícola
(IGNOFFO et al., 1976; CAVALCANTI et al., 2008). Microrganismos (fungos,
bactérias, vírus) e nematódeos exercem um papel importante no controle de artrópodes
em ambientes naturais, ocupando um lugar relevante na manutenção do equilíbrio
ecológico (ALVES, 1998).
O estudo com entomopatógenos para o controle de artrópodes não é recente.
Agostino Bassi, um entomologista italiano, confirmou em 1835 que o fungo Beauveria
bassiana ocasionava a “muscardine branca”, uma doença que ataca o bicho-da-seda
(Bombyx mori) (REDAELLI, VISOCCHI, 1940; MESSIAS, 1989). Outro relato
importante foi a descoberta de Bacillus thuringiensis, isolado de um lepidópdero
(Anagasta kuehniella) por Bereiner, em 1911 (ALVES, 1998). Entretanto o estudo foi
esquecido durante anos devido ao surgimento de inseticidas químicos, como o DDT
(dicloro difenil tricloroetano) em 1944, iniciando a era do uso de inseticidas sintéticos.
O uso indiscriminado de DDT e outros inseticidas trouxe várias consequências, como à
resistência de artrópodes a tais produtos, danos aos seres humanos e outros animais e,
também, poluição do meio ambiente. Em vista da necessidade de reduzir o uso
indiscriminado de inseticidas químicos, novas alternativas de controle têm sido
desenvolvidas e intensificadas, retornando, assim, às pesquisas com microrganismos
entomopatogênicos.
As principais vantagens do uso de entomopatógenos podem ser notadas em
diferentes grupos entomopatogênicos, como a alta especificidade de bactérias da espécie
Bacillus thuringiensis israelensis em dípteros vetores de doenças humanas
(POLANCZYK, GARCIA, ALVES, 2003; KNOWLES, 1994). Também são
considerados específicos e seletivos, os baculovírus, vírus que infectam insetos pragas
4
da agricultura (MOSCARDI, 1999). Outra vantagem relevante é a produção de
entomopatógenos em meios artificias de baixo custo, tais como de fungos do gênero
Metarhizium e Beauveria, que atualmente são bastante estudados no controle de
diferentes artrópodes. Em comparação com inseticidas químicos, esses
entomopatógenos apresentam uma menor taxa de resistência, baixo impacto ambiental e
baixa toxicidade ao homem e a outros organismos não alvos. Entretanto, esses
microrganismos apresentam limitações na sua utilização, como a necessidade de se ter
condições ambientais favoráveis (umidade, temperatura, radiação UV), para que estes
causem doenças. Além do mais, o tempo de ação é geralmente menor quando se utiliza
um inseticida químico. Estudos vêm sendo realizados para aprimorar o uso em massa
desses entomopatógenos, para melhorar a estabilidade, formulação e a forma de
aplicação (BATTA, 2003; POLAR et al., 2005; JACKSON, JARONSKI, 2009;
AGARWAL, et al., 2012; RUIU, SATTA, FLORIS, 2013; SONG et al., 2014). Entre os
agentes entomopatogênicos, os fungos se destacam como sendo os principais
causadores de doenças em insetos (ALVES, 1998).
2.2 Fungos entomopatogênicos
2.2.1 Importância no controle microbiano
Fungos entomopatogênicos (FE) foram os primeiros patógenos de insetos a
serem utilizados no controle microbiano, principalmente no controle de pragas agrícolas
(HUMBER, 1981) e são os mais estudados para controle de artrópodes de importância
na saúde humana (SCHOLTE et al., 2004; LUZ, et al., 2007) e animal (MONTEIRO et
al., 1998, FERNANDES, BITTENCOURT, 2008). Isto se deve a algumas
características, tais como: a via pela qual invadem o hospedeiro, podendo ser por
ingestão ou contato; a atuação nas diferentes fases de desenvolvimento dos hospedeiros,
infectando ovos, larvas, pupas e adultos; a maior dispersão na natureza (principalmente
no solo); maior persistência na natureza devido a mecanismos de sobrevivência; e
grande variabilidade genética, que dificulta a resistência do hospedeiro (ALVES, 1998;
LEITE, et al., 2003).
O primeiro estudo de controle microbiano utilizando um fungo
entomopatogênico foi realizado pelo zoologista e patologista russo Ilya Metchnikoff
que, em conjunto com Krassilstshic, aplicou M. anisopliae sobre Cleonus punctiventris,
5
curculionídeo praga da beterraba (LATCH, 1965). No Brasil, os FE vêm sendo
estudados desde 1923, quando Pestana identificou duas espécies de cigarrinhas
(Tomaspis spp.) infectadas por M. anisopliae, que na época referiu-se a esse fungo
como Penicillium anisopliae (ALVES, 1998). Mas foi somente a partir de 1955, devido
o trabalho de laboratório e de campo do italiano Pietro Guagliumi utilizando M.
anisopliae em cigarrinhas da cana-de-açúcar e cigarrinhas das pastagens, que ampliou o
interesse de pesquisadores sobre o uso de fungos para o controle de diferentes espécies
de insetos-praga (GLAGLIUMI, 1968).
Dentro do reino Fungi, duas ordens têm sido amplamente estudadas com relação
à sua propriedade patogênica a invertebrados: Hypocreales do filo Ascomycota, e a
ordem Entomophtorales do filo Entomophthoromycota. As duas espécies de maior
interesse pertencem ao filo Ascomycota e são: M. anisopliae e B. bassiana. (HUMBER,
2008).
Estudos demonstraram eficácia ao utilizar FE no controle microbiano de
diversos artrópodes. B. bassiana, causou doença fúngica e alterou a capacidade
reprodutiva da lagarta da raiz do milho, Diabrotica virgifera virgifera (MULOCK,
CHANDLER, 2001). Isolados de M. anisopliae causaram até 100% de mortalidade de
larvas de segundo estádio de A. aegypti (SILVA et al., 2004). Em condições de
laboratório, M. anisopliae mostrou ter também atividade ovicida em A. aegypti (LUZ et
al., 2007, 2008; SANTOS et al., 2009). Triatomíneos, vetores da tripanossomíase
americana, mostraram-se muito susceptíveis à infecção por B. bassiana e M. anisopliae,
em ensaios laboratoriais (LUZ et al., 1998; LEUCONA et al. 2001; LUZ, BATAGIN,
2005). Lee et al., (2014) estudaram 12 isolados fúngicos pertencentes a cinco gêneros
(Beauveria, Cordyceps, Metarhizium, Paecilomyces e Verticillium) para o controle de A.
albopictus. M. anisopliae foi a espécie que mostrou atividade larvicida mais rápida,
cerca de 73 % de mortalidade aos dois dias de inoculação.
2.2.2 Aspectos morfológicos e mecanismos gerais de infecção
Os FE são organismos com tamanho, coloração e formas variáveis. São seres
multicelulares que formam um conjunto de hifas denominado micélio. Além das
propriedades de assimilação e fixação, as hifas podem desenvolver na superfície do
hospedeiro e propiciar a conidiogênese (STOCK et al., 2009). Fungos anamórficos
como Metarhizium e Beauveria possuem hifas septadas e produzem esporos assexuais,
6
denominados conídios, em estruturas especializadas chamadas de conidióforos (SHAH,
PELL, 2003).
Os conídios são importantes na infecção do hospedeiro e na propagação dos FE
na natureza. Os blastosporos são células vegetativas que crescem e disseminam na
hemolinfa do hospedeiro. Estruturas de resistência denominadas agregados de hifas
(AH) e também conhecidas como microescleródios constituem hifas melanizadas e
compactadas (50 a 600 µm) capazes de sobreviver em condições desfavoráveis de
umidade. Sob alta umidade produzem novos conídios que poderão infectar insetos
suscetíveis (LEITE et al., 2003; JACKSON, JAROSNKI, 2009; BEHLE, JACKSON,
FLOR-WEILER, 2013).
Fatores abióticos como temperatura, umidade, radiação solar, além de condições
nutricionais e suscetibilidade do hospedeiro, influenciam diretamente o ciclo das
relações fungo-hospedeiro (MARGOSAN, PHILLIPS, 1985; RATH et al., 1992;
DAVIES-MORLEY, MOORE, PROIR, 1995).
As fases do ciclo de um fungo ascomiceto incluem: adesão, germinação,
formação de apressório, penetração e colonização. O ciclo inicia-se com a adesão de
conídios à superfície do hospedeiro, através de mecanismos que envolvem forças
eletrostáticas, hidrofóbicas e interações fisiológicas. Após adesão, em condições
favoráveis de umidade (acima de 90 %), temperatura (23 a 30 ºC), oxigênio e nutrientes,
os conídios iniciam a formação dos tubos germinativos e hifas (WALSTAD,
ANDERSON, STAMBAUGH, 1970; STEINKRAUS, SLAYMAKER, 1994). Alguns
fungos ascomicetos formam um apressório na região apical do tubo germinativo que
auxilia na adesão e penetração da cutícula (Figura 1) (HAJEK, 2004; HUMBER, 2011).
Na penetração, estão envolvidos processos físicos, devido à pressão da hifa
terminal que rompe áreas membranosas e esclerotizadas, e processos químicos,
ocorrendo a liberação de quitinases, lipases e proteases, enzimas que facilitam a
penetração mecânica (MORAES et al., 2003; CASTRILLO, ROBERTS,
VANDEBERG, 2005). Após a penetração, que dura, em geral, de seis a 12 horas, as
hifas atingem a hemocele, e corpos hifais se ramificam iniciando a colonização do
inseto. A morte do inseto está relacionada a uma série de fatores dentre eles, danos
mecânicos produzidos pelo crescimento fúngico, desnutrição e ação de metabólitos
secundários, como toxinas (ROBERTS, St LEGER, 2004; HUMBER, 2011). Após a
morte do inseto, o micélio começa a emergir sobre o cadáver iniciando a conidiogênese.
Em seguida ocorre a disseminação de novos conídios no ambiente. Este processo pode
7
ocorrer através da chuva, do vento e de outros animais, levando a contaminação de
novos hospedeiros (GOETTEL, LACEY, 1995; ALVES, 1998; HUMBER, 2011).
2.2.3 Metarhizium anisopliae
M. anisopliae sensu lato (s.l.) é um ascomiceto pertencente à classe
Sordariomicetes, ordem Hypocreales, família Clavicipitaceae. Morfologicamente
apresenta-se como fungo filamentoso de micélio hialino e septado, conídios cilíndricos
de coloração esverdeada que medem geralmente 3 a 18 μm de comprimento que se
formam sobre conidióforos cilíndricos (BISCHOFF, REHNER, HUMBER, 2009).
Insetos infectados por M. anisopliae tornam-se rígidos e cobertos por uma camada de
conídios. No final da conidiogênese o cadáver apresenta coloração verde, que varia de
claro a escuro. Esta doença é conhecida como muscardine verde.
Atributos como: o potencial de atacar um grande número de insetos; a
distribuição global; a ocorrência em diferentes solos e diferentes climas do planeta; a
pouca exigência em relação à fonte nutritiva; fazem de M. anisopliae um importante
Figura 1 – Ciclo básico da relação patógeno-hospedeiro de fungos
anamórficos. Fonte de MASCARIN, PAULI (2010).
8
agente para o controle microbiano (ROBERTS, St LEGER, 2004; ALVES, LOPES,
2008).
A patogenicidade de M. anisopliae foi relatada em famílias de insetos,
pertencentes às ordens Orthoptera, Coleoptera, Lepdoptera, Hemiptera, Diptera. E esse
potencial biocontrolador está difundido no controle de diferentes pragas na agricultura
(FERNANDES, ALVES, 1991; DESTÉFANO, 2003; XAVIER, ÁVILA, 2006;
CHERNAKI et al., 2007); e no controle de vetores de interesse veterinário (GINDIN et
al., 2002, ONOFRE et al., 2002).
Além disso, M. anisopliae s.l mostrou atividade inseticida também em vetores
de importância em saúde pública, como triatomíneos (LUZ et al., 1998, 1999;
LAZZARINI et al., 2006) e mosquitos (SCHOLTE et al., 2003, 2005; SILVA et al.,
2004, 2005; LUZ et al., 2007) em condições laboratoriais. De fato, torna-se evidente o
amplo espectro de ação deste ascomiceto, podendo ser utilizado em vários grupos de
insetos-praga.
M. anisopliae tem sido efetivo no controle da cigarrinha da raiz da cana de
açúcar (Mahanarva fimbriolata) no estado de São Paulo, no controle das cigarrinhas das
pastagens (Mahanarva posticata) no nordeste e é comercializado de quatro formas: em
arroz inteiro, arroz triturado, em conídios puros e em formulação oleosa (MIRANDA et
al. 2004; PINTO, GARCIA, BOTELHO, 2006; FARIA, WRAIGHT, 2007).
2.3 Fatores abióticos
As condições abióticas influenciam diretamente no desenvolvimento do fungo, e
quando estas são adversas, o controle microbiano torna-se prejudicado (GOETEL et al.,
2000). Os fatores ambientais, tais como a umidade relativa, temperatura, radiação
ultravioleta, entre outros, interferem na patogenicidade (RATH et al., 1992), na
viabilidade e virulência dos conídios (DAVIES-MORLEY et al., 1995; RATH et al.,
1995), assim como em sua germinação (LUZ, FARGUES, 1997; LUZ et al., 1998).
Os fatores de importância vital sobre os fungos são a temperatura e a umidade,
sendo os fatores mais estudados. A UR é o fator determinante e essencial à ocorrência
das doenças, e a temperatura age retardando ou acelerando o processo de infecção e
reprodução do patógeno.
9
2.3.1 Umidade relativa
A UR é a razão (expressa em porcentagem) entre a quantidade de vapor d’água
em um dado volume de ar, num dado instante, e a quantidade de vapor que este volume
poderia conter se o ar estivesse saturado à mesma temperatura e pressão. Quando o ar
está saturado significa que a umidade relativa é igual a 100%. (AYOADE, 1996).
A UR não é um valor absoluto, depende diretamente da quantidade de vapor
contido numa parcela de ar e da temperatura do ar. Quando aumenta a umidade absoluta
no interior da parcela de ar, a UR aumenta e, por outro lado conforme aumenta a
temperatura do ar, a UR diminui. Soluções saturadas ou não saturadas, dependendo da
concentração do sal, podem ser usadas para manter valores particulares de umidade
relativa dentro de recintos fechados, à temperatura constante e uniforme (WINSTON,
BATES, 1960; GREENSPAN, 1976).
A umidade parece ser a mais importante limitação climática segundo estudos de
fatores abióticos sobre a reciclagem de uma linhagem fúngica altamente virulenta
isolada em cadáveres de Rhodnius prolixus (LUZ, 1998). A atividade ovicida de fungos
entomopatogênicos também foi encontrada em A.aegypti em UR > 98%, mostrando que
a UR elevada favorece o desenvolvimento fúngico na superfície do ovo. Porém em
umidades < 98%, o fungo não teve atividade ovicida (LUZ et al., 2007).
Luz e Fargues (1997) investigaram os efeitos da temperatura, UR, e atividade de
água sobre a germinação e concluíram que o processo de germinação foi adiado em
temperaturas extremas testadas (15ºC e 35ºC), porém a germinação de conídios de B.
bassiana foi fortemente afetada por condições de umidade subotimais.
2.4 Formulações de micoinseticidas
Produtos à base de fungos entomopatogênicos são chamados de micopesticidas,
e desempenham um importante papel no controle de pragas agrícolas e urbana. Esses
produtos microbianos têm, em geral, o mesmo objetivo dos inseticidas químicos, ou
seja, liberar o ingrediente ativo de forma adequada para uso; facilitar a aplicação; ter
uma alta eficiência e também um baixo custo (FENG et al., 1994). Conídios,
blastosporos, agregados de hifas, todos estes propágulos fúngicos podem ser os
10
ingredientes ativos de micopesticidas, constituindo o elemento biológico da
formulação.
Basicamente, a combinação de um agente microbiano ativo e um segundo
material é considerado uma formulação (COUCH, IGNOFFO, 1981). Entretanto,
muitas vezes é necessário acrescentar determinados compostos (aditivos) para melhorar
o desempenho do patógeno sobre o vetor alvo. Os aditivos podem ser líquidos, tais
como água, óleo puro ou emulsões óleo-água e água-óleo, ou podem ser sólidos na
forma de pós e granulados de diferentes tamanhos, manufaturados ou feitos em
equipamentos de peletizar (BURGES, 1998; FARIA, WRAIGHT, 2007).
O conhecimento da relação parasito-hospedeiro faz-se necessário para
desenvolver micoinseticidas. O tipo de formulação, quais aditivos acrescentar e a forma
de aplicação estão diretamente ligados a fatores comportamentais do inseto alvo e a
fatores abióticos, tais como, umidade, temperatura e radiação ultravioleta. Produtos
formulados, contendo materiais tais como óleos, umectantes, protetores ao UV e
nutrientes, estimulam a germinação, crescimento e auxiliam na aderência das estruturas
infectivas dos fungos no hospedeiro apresentando grande potencial para o controle
(WRAIGHT, JACKSON, DE KOCK, 2001).
A adição de óleos, além de auxiliar na proteção de conídios contra fatores
abióticos no meio ambiente, promove melhor adesão de conídios na cutícula
hidrofóbica do hospedeiro (BATTA, 2003; LUZ, BATAGIN, 2005). Além disso,
conídios dessa formulação permaneceram viáveis por mais tempo quando comparado
aos formulados aquosos (LUZ et al., 1998; MARANGA et al., 2005). Testes realizados
com formulações oleosas de conídios de B. bassiana e M. anisopliae em triatomíneos
(LUZ, BATAGIN, 2005) e em ovos de A. aegypti (ALBERNAZ, TAI, LUZ, 2009)
demonstraram que esses formulados permitiram melhor adesão por conídios causando
infecção e morte rápida dos insetos tratados.
Formulados secos de conídios podem ser usados em conjunto com materiais de
propriedades absorventes e abrasivas como a terra diatomácea, argila (caulim),
provocando um efeito sinérgico com o fungo (AKBAR et al., 2004; FAULDE et al.,
2006; BATTA, 2008). A terra diatomácea é um sedimento amorfo que se origina de
resíduos fósseis de algas diatomáceas, constituídos de dióxido de silício que provoca
danos à cutícula do inseto, sendo um produto natural que não produz resíduos tóxicos.
Formulações peletizadas imobilizam as formas infectantes dos fungos dentro de
uma matriz polimérica. A grande vantagem da formulação peletizada é a maior
11
facilidade de manuseio e aplicação. Os péletes precisam ser preparados em máquinas
especiais e secos em estufas. São fabricados de várias maneiras: geralmente são feitos
em forma de massa, mas alguns produtos requerem a absorção do ingrediente ativo
líquido na superfície do inerte peletizado (BURGUES, 1998).
2.4.1 Péletes e Peletização
Péletes são pequenos grânulos esféricos originados da aglomeração de pós finos
de substância ativa e excipientes (AULTON, 2005; PEZZINI et al., 2007). Estas
unidades esféricas apresentam vantagens tecnológicas e terapêuticas quando
comparadas com o produto obtido no processo de granulação clássica, por isso geram
grande interesse por parte das indústrias farmacêuticas (SANTOS et al., 2004).
O tamanho dos péletes tem efeito direto sobre a área superficial. Sendo assim, é
necessário o uso de partículas com distribuição homogênea de tamanho para obter um
produto final de desempenho uniforme. Os péletes produzidos na indústria farmacêutica
possuem diâmetro que variam de 500 e 1500 μm, e o método de fabricação mais
utilizado atualmente é o de extrusão/esferonização. Está técnica desenvolvida por
Nakahara e aplicada a partir da década de 1970 na indústria farmacêutica, é constituída
basicamente por cinco operações unitárias: mistura dos pós, malaxagem, extrusão,
esferonização e secagem (Figura 2; SANTOS et al., 2006; TRIVEDI et al., 2007).
2.4.1.1 Mistura dos pós e malaxagem
A mistura é uma operação unitária cujo objetivo é promover a homogeneização
por diferentes tipos de ingredientes da formulação. Os misturadores de volteadura são
aqueles que promovem a mistura enquanto giram sobre seu eixo. Essa movimentação
pode ser simulada manualmente pelo emprego de recipientes plásticos. A malaxagem
Figura 2 – Etapas do processo de peletização por extrusão/esferonização.
12
baseia-se na adição de um líquido a fim de aglomerar os pós e formar massa úmida
apropriada. O líquido de granulação deve ser compatível com todos os componentes da
mistura de pós, e a sua quantidade deve ser aquela que garanta uma massa umidificada e
plástica, ideal para o processo de extrusão (SANTOS et al. 2004).
2.4.1.2 Extrusão
Após a maxalagem, a massa úmida segue para a etapa de extrusão, quando sofre
compactação sendo modelada em forma de cilindros. Há diversos tipos de extrusores,
como: extrusor de parafuso sem fim, extrusor de cesto, extrusor de tamis e extrusor de
rolos (HICKS, FREESE, 1989). O extrusor de rolos é formado por um orifício de
alimentação, rolos de compactação e uma rede circular com perfurações, sendo o
tamanho dos péletes determinado pelo diâmetro das perfurações desta rede (figura 3-A).
A extrusão inicia-se com a introdução da massa úmida no aparelho de extrusão, seguido
pela ação dos rolos, forçando a passagem da massa para o exterior da rede através dos
seus orifícios, formando, assim, o produto de extrusão, também chamado de extrusado
(SANTOS et al. 2004).
2.4.1.3 Esferonização
Esta etapa consiste em processar uma quantidade pré-determinada de produto de
extrusão até que sejam alcançados a forma e o grau de esferonização desejados. Os
esferonizadores consistem em uma placa rotatória, contendo ranhuras perpendiculares
ou radiais, dentro de uma câmara cilíndrica (figura 3-B). O processo tem início quando,
por ação da placa de esferonização, o produto de extrusão é quebrado em comprimentos
uniformes e gradualmente moldado em forma esférica (SANTOS et al., 2004). Nesta
etapa, fatores como tempo de esferonização, velocidade e carga de materiais
influenciam nas caracterisiticas finais dos péletes (figura 3-D).
2.4.1.4 Secagem
Os péletes produzidos na etapa de esferonização seguem para a etapa de
secagem que pode ser feita tanto em temperatura ambiente como em temperatura
elevada, em leito estático (estufa) ou dinâmico (leito fluidizado). O tempo de secagem
13
varia de acordo com o método escolhido e temperatura utilizada, podendo variar de
minutos no leito fluidizado ou horas na estufa de secagem.
2.5 Umectantes
Aditivos umectantes podem ser definidos como substâncias hidrofílicas que
aumentam a molhabilidade, retendo água na formulação proveniente da atmosfera
(FARIAS, 2005). Umectantes geralmente são usados em formulações quando se deseja
manter a umidade dessas formulações e não deixá-las ressecar (VARGAS, ROMAN,
2006).
Figura 3 – Modelo de um extrusor de rolos (A). Esquema do processo de
esferonização (B). Mecanismos de formação de péletes durante a
esferonização (D). Adaptado de SANTOS et al. (2004) e AULTON (2005).
.
14
As características de um umectante ideal são baixa volatilidade, baixa toxicidade
e compatibilidade com outros componentes da formulação. Um bom umectante deve
equilibrar a umidade do substrato com o meio, de modo que a troca gasosa seja a menor
possível. Do ponto de vista químico, aditivos umectantes podem ser classificados em
iônicos ou não iônicos, de acordo com o segmento polar que é incorporado dentro da
molécula. O segmento não-polar, como regra, é representado por cadeias
hidrocarbônicas. Compostos hidroxilados, polióis e poliéteres, em geral, são excelentes
umectantes, devido ao fato destes formarem ligações de hidrogênio com a água. Dentre
os principais umectantes destacam-se a glicerina, os poliglicóis, os sacarídeos e
polissacarídeos, os derivados de ácidos carboxílicos, os aminoácidos e seus complexos,
os extratos vegetais, entre outros (DOZIER, KERR, CORZO, 2008).
O propilenoglicol (C3H8O2), o polietilenoglicol 400/ PEG 400 (CH2CH2O n) e a
glicerina (C3H8O3) são umectantes atóxicos, baratos e fáceis de encontrar, sendo de
grande interesse em diversos ramos industriais, como na indústria farmacêutica e
alimentícia que são utilizados como matéria prima para cremes, pomadas, emulsões,
agente umectante nas embalagens de queijo, carne e doces (MARQUES et al., 2011).
15
3 JUSTIFICATIVA
O uso contínuo e indiscriminado de inseticidas sintéticos acarretou problemas de
resistência de insetos a produtos químicos, contaminação do ambiente, desequilíbrio
ecológico e presença de resíduos em alimentos que podem causar prejuízos a saúde do
homem e de outros animais. Medidas de controle microbiano são mais seguras e menos
tóxicas, quando comparadas com inseticidas sintéticos.
Metarhizium anisopliae é um fungo bem estudado e possui um mecanismo de
resistência que o torna interessante como agente no controle microbiano Em condições
naturais, M. anisopliae consegue produzir agregados de hifas. Essa estrutura de
resistência já é produzida em meios líquidos artificiais e é um potencial para o controle
de insetos e outros artrópodes, principalmente para aqueles que vivem em solo. Fatores
abióticos como UR e temperatura são de extrema importância para que essas estruturas
de resistência possam produzir novos conídios. No entanto, determinados níveis de
temperatura e UR não favorecem a conidiogênese, dificultando o desenvolvimento do
fungo.
Esse problema relacionado a condições desfavoráveis pode ser solucionado
adotando tecnologias de formulação para FE. Formulações peletizadas devem proteger
o fungo de condições abióticas estressantes e são ideais para uma aplicação mais
uniforme. Agregados de hifas peletizados associados com umectantes devem manter a
umidade alta e produzir conídios infectivos em níveis elevados no local de permanência
da praga.
Esse estudo se justifica na busca de conhecer a influência da umidade relativa na
produção de conídios de M. anipoliae IP 46 formulado em péletes, com ou sem
umectantes, e contribuir para o desenvolvimento e otimização de formulações à base de
fungos.
16
4 OBJETIVOS
4.1 Objetivo geral
Contribuir para o desenvolvimento de uma formulação peletizada a base de
fungos entomopatogênicos para o controle de vetores com hábito terrestres.
4.2 Objetivos específicos
1. Produzir microescleródios de M. anisopliae IP 46 em meio líquido e formulá-los
em péletes;
Avaliar:
2. O efeito da umidade relativa sobre a conidiogênese de M. anisopliae IP 46
peletizado;
3. O efeito higroscópico de umectantes em celulose microcristalina e em vermiculita;
4. O efeito do umectante glicerina no desenvolvimento do fungo nos péletes em
umidades relativas suboptimais.
17
5 MATERIAIS E MÉTODOS
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Patologia de
Invertebrados do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP), e no
Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da FF/UFG (FARMATEC), localizados em
Goiânia, na Universidade Federal de Goiás (UFG).
5.1 Origem e preparo de M. anisopliae
M. anisopliae s.l. IP 46 foi originalmente obtido em amostra de solo no Cerrado
do Estado de Goiás, Brasil, em 2001 (ROCHA et al., 2012), e foi depositado como CG
620 no Banco de Germoplasma da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia,
Brasília-DF. Foi cultivado em placa de Petri (100 x 20 mm) com meio BDAL (batata,
dextrose, ágar: Himedia®
, Índia; e 0,1% de levedura: Bacto Tm, USA) a 25 ± 1 oC, 75 ±
5% umidade relativa (UR) e fotofase de 12 horas por 15 dias.
Os conídios foram raspados da superfície da cultura com o auxílio de uma
espátula e suspensos em 10 mL de Tween 80 estéril a 0,05%. A suspensão foi agitada
por 2 minutos com 10 pérolas de vidro em Vórtex e filtrada com algodão hidrófilo. Os
conídios da suspensão foram quantificados em câmara de Neubauer, e a concentração
ajustada a 5 x 106 conídios / mL
-1.
No início de cada experimento, a viabilidade dos conídios (> 95%) foi
confirmada através da inoculação de 100 µL da suspensão em meio SDAL (Sabouraud,
dextrose, ágar: Himedia®, Índia; e 0,1% de levedura: Bacto Tm, USA). O meio foi
incubado a 25 ± 1 ºC por 24 horas. Os conídios germinados foram contados com auxílio
de microscópio de luz. Conídios foram considerados germinados com o comprimento
do tubo germinativo maior que o diâmetro máximo dos conídios.
5.2. Produção de agregados de hifas
Agregados de hifas (AH) foram produzidos em meio líquido, contendo relação
C:N de 30:1, composto por: 73 g de glicose; 15 g de extrato de levedura; 4 g de
KH2PO4; 0,8 g de CaCl2.2 H2O; 0,6 g de MgSO4.7 H2O; 0,1 g de FeSO4.7 H2O; 0,016 g
de MnSO4.H2O; e 0,014 g de ZnSO4.7 H2O, (MASCARIN et al., 2014). Em frascos
18
Erlenmeyer (250 mL) foram colocados 90 mL do meio líquido, e inoculados 10 mL da
suspensão de conídios totalizando um volume de 100 mL em cada frasco. Os frascos
foram incubados em agitador orbital (TE-422, Tecnal®, Brasil) a 250 rpm a 27 ± 1º C
por 4 dias. Além disso, diariamente os frascos foram agitados manualmente, durante
trinta segundos de forma orbital, para soltar a biomassa aderida na parede dos frascos.
Quatro dias após a inoculação, foram colhidos 2 mL da suspensão para medir a
concentração de AH e o acúmulo da biomassa (Figura 4-F).
A concentração de AH foi determinada em 1 mL da cultura líquida total, e sua
diluição em 9 mL de solução de Tween 80 (0,05% v/v). Em seguida, uma alíquota de
100 µL foi colocada em lâmina e contado o número de AH com auxílio de microscópio
em contraste de fase em aumento de 400 x (DM2500, Leica®
Mycrosystems LTD;
Switzer
land). Apenas os agregados de hifas maiores que 50 µm de diâmetro, compactos
e com coloração escura foram contabilizados como agregados de hifas (JACKSON,
JARONSKI, 2009). O diâmetro dos agregados foi medido com auxílio de microscópio
óptico (LAZ EZ, Leica®
Mycrosystems LTD; Switzerland). Para avaliação do acúmulo
de biomassa, foi coletado 1 mL da cultura líquida total presente nos frascos e colocado
em disco de papel filtro (Whatman n.42, quantitativo, tamanho do poro 2 µm) de 70 mm
de diâmetro, com peso previamente determinado. Em seguida, o papel filtro contendo a
biomassa foi colocado em estufa de 32 ºC e umidade < 75% por dois dias até obter um
peso constante antes da pesagem definitiva em uma balança analítica qualitativa
(JACKSON, JARONSKI, 2009).
19
5.3 Absorção de água em celulose microcristalina ou vermiculita
Os testes de absorção de água foram feitos com três umectantes diferentes:
Glicerina, propilenoglicol e polietilenoglicol (PEG 400), todos nas seguintes
proporções: 5%, 10%, 20%, 30% e 40% misturados com celulose (CMC) ou vermiculita
(m/m). O controle foi feito apenas com CMC ou vermiculita (0%). As misturas dos
umectantes com a CMC ou vermiculita foram realizadas em gral e pistilo por cinco
minutos. Em seguida, cada mistura foi dividida (1,5 g em cada placa) em três placas de
petri de plástico. As placas foram pesadas em balança analítica e colocadas em
recipiente com 86% UR a 25 ºC. A umidade do recipiente foi controlada com solução
saturada de K2SO4. Diariamente as placas eram pesadas e o peso anotado durante 5 dias.
O teste foi realizado em triplicata com três repetições para cada concentração e aditivo.
O conteúdo de umidade final foi calculado pela diferença entre os pesos inicial e final
das amostras e transformado em percentual (%).
Figura 4 – Etapas da produção de agregados de hifas. IP 46 com 15 dias de cultivo (A);
Raspagem de conídios (B); Preparação da suspensão de conídios (C e D); Meio líquido com a
suspensão de IP 46 antes (E) e depois da fermentação (F); Biomassa + TD (G); Mistura (TD +
biomassa) sendo filtrada (H).
20
5.4 Preparação dos péletes com ou sem umectantes
Para confecção dos péletes, duas técnicas diferentes foram empregadas. Na
primeira técnica foram adicionados, no quarto dia de fermentação, 5 g de terra
diatomácea (TD) para cada 100 mL de meio líquido. A TD e o meio líquido foram
misturados com auxílio de um bastão de vidro e a mistura então foi filtrada em papel
filtro de 70 mm de diâmetro, sob vácuo com auxílio de funil de Buchner e frasco
Kitassato (Figura 4-G). Após filtrado, a mistura foi colocada em uma placa de Petri,
armazenado em dessecador contendo sílica gel até obter uma umidade de 20%. A
umidade dentro do dessecador foi monitorada com um termo-higrômetro (HOBO U23).
Foram preparados péletes contendo 60% do filtrado (biomassa + TD) + 40% celulose
microcristalina ou 40% do filtrado (biomassa + TD) + 40% de glicerina + 20 % de
celulose microcristalina ou 60% do filtrado (biomassa + TD) + 30 % de celulose
microcristalina + 10% de glicerina (Tabela 1).
Na segunda técnica foi adicionada, no quarto dia de fermentação, 5 g de uma
mistura contendo vermiculita, terra diatomácea, dióxido de silício em 100 mL do meio
líquido. Essa mistura foi filtrada em papel filtro de 70 mm de diâmetro, sob vácuo com
auxílio de funil de Buchner e frasco Kitassato. Depois de filtrada, a biomassa foi
misturada com o restante da mistura de pós e com ou sem glicerina a 10%. Os péletes
foram compostos (com a biomassa misturada) por 78% de vermiculita + 20% de TD +
2% de dióxido de silício ou 68% de vermiculita, + 20% de terra diatomácea, + 2% de
dióxido de silício + 10% de glicerina (Tabela 1).
A homogeneização dos pós e a umidificação foram feitas gradativamente e
manualmente por mais ou menos cinco minutos em um recipiente de aço inoxidável. A
massa úmida e homogênea foi extrusada em um extrusor de rolos (20 Extruder Cavela,
Sturminster Newton, Inglaterra) com malha de 0,5 mm a 25 rpm. Após toda malha ser
extrusada (10 minutos em média), o extrusado foi colocado em um esferonizador (Multi
Boul Spheronizer Cavela) com rotações de 1.500 rpm por três minutos para confecção
dos péletes.
Os péletes formados foram secos em dessecador por sete dias, com sílica gel a 5
ºC até atingir 5% de umidade ou em leito fluidizado (Hüttlin, Bosch, Stuttgart,
Alemanha) a 40 ºC por 30 minutos (Figura 5). Após a secagem, os péletes foram
21
analisados quanto ao seu teor de água utilizando uma balança de infravermelho
(IV2000, Gehaka, São Paulo, Brasil). Os péletes foram armazenados em tubo tipo
Falcon em freezer a -20ºC, e este era retirado 10 minutos antes para realização dos
experimentos (RODRIGUES, 2014).
Aditivos (%)
Formulação TD CMC VE DS GLI
1 60 40 - - -
2 40 20 - - 40
3 60 30 - - 10
4 20 - 78 2 -
5 20 - 68 2 10
Figura 5 – Processo de peletização. Mistura da biomassa com os aditivos - malaxagem
(A e B); Extrusor de rolos (C); Massa extrusada (D); Esferonizador (E); Péletes
formados (F).
TD = terra diatomácea
CMC = celulose microcristalina
VE = vermiculita
DS= dióxido de silício
GLI = glicerina
Tabela 1 – Proporção de aditivos utilizados na confecção de péletes com celulose
microcristalina ou vermiculita.
22
5.5 Simulação da umidade relativa
Foram testadas oito umidades relativas (UR) entre 75 – 100%. Para 75%
utilizou-se solução saturada de NaCl. Para as outras UR, utilizou-se soluções aquosas
não saturadas de NaCl baseando-se nos valores da tabela 2. O vapor de água foi
controlado por solução saturada.
Foram utilizados recipientes de plástico (200 mm de comprimento, 140 mm de
largura, 50 mm de altura) com tampa (Figura 6). Em cada recipiente, foi colocado
suporte plástico na forma de espiral (33 mm de comprimento, 33 mm de altura) ajustado
na base do recipiente. As umidades relativas foram ajustadas com NaCl conforme a
Tabela 2. Dentro de cada recipiente, foi colocada uma placa de cultura com 24 poços
(marca TPP), sendo que cada poço possuía 15,4 mm de diâmetro, 1,5 mL volume e 5
mm de profundidade (Figura 6-A). A placa foi posicionada sobre suporte plástico para
que não ficasse em contato com a solução. Trinta miligramas de péletes foram pesados e
adicionados em forma de monocamada em cada poço. Os recipientes foram fechados,
colocados em um recipiente maior (350 mm de comprimento, 200 mm de largura, 350
UR (%) g/300 mL de
H2O destilada
100 0
98,5 7,5
96,5 15
93 30
91 37,5
89 45
86 52,5
75 saturada
Tabela 2 – Relação de NaCl
dissolvido em água para estabelecer
umidade relativa (UR) definida a
25º C em recipiente fechado.
Fonte: WINSTON, BATES (1960)
23
mm de altura), e então mantidos a 25 ºC com fotofase de 12 horas. Para verificação da
umidade relativa, foi introduzida no recipiente uma sonda de medidor de umidade
(HOBO H8® Onset Computer Corporation, Bourne, MA, USA).
Diariamente, durante 15 dias, os recipientes foram retirados de forma cuidadosa
da estufa para avaliação do desenvolvimento de micélio e de conídios sobre os péletes,
utilizando uma lupa com aumento de 80 x (Leica EZ4). Todos os poços foram
examinados e apenas os péletes com crescimento de micélio foram quantificados. Para
quantificação de conídios formados sobre os péletes, foram adicionados 2 mL de Tween
80 a 0,05% em um dos poços, o líquido com os péletes foi homogeneizado com pipeta e
em seguida transferido com pipeta para um tubo de Eppendorf e esse agitado com
Vórtex durante três minutos para homogeneizar os conídios. Em seguida foi feita a
diluição com proporção 1:10 e dessa diluição foi retirado 200 µL para ser quantificado
em câmara de Neubauer com auxílio de microscópio de luz (Leica DMLS).
Figura 6 – Recipiente de plástico usado para testes com UR. Trinta
miligramas dos péletes em cada poço da placa de cultura (A); Péletes em
forma de monocamada (B); Recipiente fechado hermeticamente com solução
NaCl (C e D).
24
5.5 Análise dos resultados
Para cada ensaio, foram realizadas quatro repetições independentes, cada uma
com lote diferente de microescleródios peletizados, totalizando quatro lotes para péletes
com celulose e três lotes para péletes confeccionados com vermiculita. Resultados
foram examinados com análise de variância (ANOVA) e teste de comparação múltipla
Student-Newman-Keuls (SNK). As médias foram consideradas significativamente
diferentes com P < 0,05.
25
6 RESULTADOS
6.1 Efeito de umectantes na absorção de água em celulose microcristalina ou
vermiculita
A quantidade de água absorvida em celulose microcristalina ou vermiculita
acrescida com PEG 400, propilenoglicol ou glicerina foi crescente nas concentrações de
5 a 40% sob condições controladas (25 ± 1 C e 86 ± 5%), por cinco dias,
independentemente do umectante testado. As análises estatísticas apontam um efeito
significativo dos umectantes testados, nas diferentes concentrações, para celulose (F2,35
= 51,71; P < 0,001) ou vermiculita (F2,35 = 167,11; P < 0,001). A absorção de água no
controle (sem adição de umectantes) permaneceu inferior às demais proporções, sendo
absorvida apenas 3% de água em celulose, e nenhuma absorção em vermiculita em até
cinco dias (Figura 7).
Quando se utilizou celulose, notou-se um aumento na absorção de água em todas
as concentrações dos umectantes nas primeiras 24 horas. Não foi observado absorção de
água nas concentrações de 5 e 10% de PEG 400 com vermiculita. Independente do
aditivo fica evidente que glicerina foi o umectante que apresentou maior e mais rápida
absorção de água em todas as concentrações (Tabela 3 e Figura 7).
Houve efeito significativo entre os dois aditivos para os umectantes
propilenoglicol (F5,24 = 29,71; P < 0,001) e PEG 400 (F5,24 = 12,76; P < 0,001) e não foi
observado efeito significativo entre celulose e vermiculita para glicerina (F5,24 = 0.78; P
< 0,5712). A maior porcentagem de absorção em celulose ocorreu no quinto dia na
concentração de 40% de glicerina (23% absorvido) e a menor com 5% de PEG 400
(15% absorvido). Enquanto para vermiculita, a maior absorção também ocorreu no
quinto dia com 19% em concentração de 40% de glicerina e a menor porcentagem foi
de 2% com 5% de PEG 400.
26
Aditivo Umectante Absorção de água ( % ± EM)
5 % 10 % 20 % 30 % 40 %
PEG 400 1 ± 1,6 4 ± 0,8 5 ± 0,32 7 ± 0,09 7 ± 0,5
Celulose Propilenoglicol
3 ± 0,4 4 ± 0,1 4 ± 0,06 7 ± 0,1 7 ± 0,07
Glicerina 5 ± 0,1 5 ± 0,4 6 ± 0,9 9 ± 0,1 11 ± 0,8
PEG 400 0 ± 0,3 0 ± 0,6 2 ± 0,2 5 ± 0,05 7 ± 0,4
Vermiculita Propilenoglicol
1 ± 0,2 1 ± 0,09 2 ± 0,06 5 ± 0,06 6 ± 0,04
Glicerina 1 ± 0,2 1 ± 0,1 3 ± 0,2 6 ± 0,8 7 ± 0,53
Um aumento na absorção de água em função dos dias de exposição pôde ser
notado na Figura 8. Não houve absorção de água para o controle com vermiculita
durante os cincos dias de exposição. Houve um aumento no 2º dia de exposição na
concentração de 5% de glicerina, porém a absorção se manteve constante até o 5º dia.
Nos testes com celulose microcristalina sem glicerina, o controle conseguiu
absorver água, alcançando até 3% de absorção em cinco dias. Na proporção de 10%
Figura 7 – Absorção média (± erro padrão da média) de água em celulose microcristalina (A) ou
vermiculita (B), acrescida de polietilenoglicol 400 (PEG 400), propilenoglicol, ou glicerina em
proporções de 5 – 40% com cinco dias de exposição a 25 ± 1 oC e 86 ± 5% de umidade relativa.
Tabela 3 – Absorção de água (% ± EM) em celulose microcristalina ou vermiculita acrescida de
umectantes polietilenoglicol 400 (PEG 400), propilenoglicol, ou glicerina em concentrações de 5 –
40% em 24 horas a 25 ± 1 oC e 86 ± 5% de umidade relativa.
27
nota-se um aumento crescente com até 8% de água absorvida em cinco dias de
exposição. A maior absorção de água foi no 5º dia com 23%.
6.2 Acúmulo de biomassa e produção de agregados de hifas
A média do acúmulo de biomassa de sete lotes de M. anisopliae foi de 0,0530 ±
0,003 g/mL. A quantidade média de AH obtida na suspensão foi de 180 ± 1
microescleródios/mL. O tamanho desses agregados variou entre 61 µm a 380 µm de
comprimento. (Figura 9).
Figura 8 – Gráfico de superfície-resposta ilustrando a absorção de água em celulose (A)
ou vermiculita (B) acrescida de glicerina em proporções de 5 – 40% expostas a 25 ± 1 oC
e 86 ± 5% de umidade relativa até cinco dias.
28
6.3 Efeito da Umidade relativa em péletes de celulose ou de vermiculita
Foi observado um efeito positivo da umidade e do tempo de incubação sobre a
produção de conídios de M. anisopliae IP 46. O fungo não desenvolveu micélio nos
péletes de celulose nos primeiros três dias de exposição, independentemente da umidade
testada e até 20 dias a ≤ 89% de UR. A formação de micélio nos péletes iniciou a partir
do quarto dia de exposição na maior UR (100%) e com aumento tardio nas outras
umidades com até sete dias de atraso a 91 % de UR.
A maioria dos péletes (> 90%) apresentou micélio em toda a sua superfície
visível; entretanto, observou-se maior quantidade de micélio nos péletes expostos a
100% (> 6 dias), 98,5% (> 7 dias), 96,5% (> 11 dias) e 93% (> 14 dias) de UR, com
abundância de micélio a 98,5% e 100 % de UR após 18 dias (Figura 10).
A produção de conídios foi similar entre as repetições, ou seja, a conidiogênese
iniciou a partir do quinto dia a 100 % de UR e se prolongou até 12 dias em umidade de
93 %, e os conídios não foram produzidos em umidades ≤ 91% até 20 dias. A maior
produção de conídios aconteceu a 100% de UR (1,2 x 106 ± 7,9 x 10
4 conídios / mg)
seguindo por 98,5% de UR (9,2 x 105 ± 1,7 x 10
5 conídios / mg), 96,5% (2,4 x 10
5 ± 1,2
x 105
conídios / mg) e 93% de UR (9,8 x 104 ± 5,6 x 10
4 conídios / mg) (Figura 11).
Figura 9 – Agregados de hifas (AH) produzidos após quatro dias de incubação a 250 rpm e
27 ºC. Culturas foram crescidas em meio com razão de C:N de 30:1. AH corados com azul
de algodão e visualizados com magnitude de 400 x (A). AH com diâmetro medido em
microscópio de contraste de fase no aumento de 400 x (B).
29
Encontrou-se efeito significativo da umidade (análise dos dados obtidos de 91 %
a 100 %) no número de conídios produzidos nos péletes durante 20 dias de incubação
(F4,300 = 252; P < 0,001: 100%, 98,5%, 96,5%, 93% e 91% de UR) indicando uma
relação proporcional entre umidade e produção de conídios. A quantidade de conídios
nos péletes diminuiu significativamente com o tempo de exposição a 96,5% (F19,60 =
2,1; P < 0,04), mas não a 93% de UR (F19,60 = 1,7; P = 0,2).
Figura 10 – Péletes de celulose (40% celulose, 60% de terra diatomácea + IP 46) em placas
de cultura, expostos a 100% de UR (A) e 98,5% de UR (B) a 25 ± 1 oC após cinco dias de
incubação. Presença de micélio e início da conidiogênese.
30
O desenvolvimento de micélio sobre os péletes de vermiculita iniciou no terceiro
dia de exposição para 100% UR, no quarto dia para 98,5% e 96,5%, no quinto dia para
93% UR, e no sétimo dia para 91 % UR. Foi observada conidiogênese a partir do quinto
dia em umidade ≥ 96% e no sexto dia para 93% UR. Nas demais umidades testadas (≤
91%) não houve produção de conídios, à semelhança de péletes com celulose.
A produção de conídios foi crescente ao longo do tempo para cada umidade,
sendo que a maior produção de conídios ocorreu a 100% UR (3,3 x 106
± 3,6 x 105
conídios / mg) com 20 dias de incubação (Figura 12). Ocorreu um efeito significativo e
positivo da umidade sobre o número de conídios produzidos nos péletes de vermiculita
durante os 20 dias de incubação (F4, 10 = 40,0; P < 0,001).
Houve efeito significativo do tempo de exposição para produção de conídios nas
umidades de 100 - 93% (100%: F19, 40 = 35,3; P < 0,001; 98,5%: F19, 40 = 27,2; P <
0,001; 96%: F19, 40 = 12,4; P < 0,001; e 93 %: F19, 40 = 5,2; P < 0,001).
Figura 11 – Número médio de conídios de Metarhizium anisopliae /
mg de péletes formulados (40% celulose, 60% de terra diatomácea +
IP 46) após exposição dos péletes em umidade relativa entre 75% e
100%, fotofase de 12 horas a 25 ± 1 oC até 20 dias.
31
Houve um efeito significativo do inerte (celulose e vermiculita) na produção de
conídios sobre os péletes a 100% UR (F19, 80 = 4,9; P < 0,001), mas esta diferença não
foi detectada em 98,5% UR (F19, 80 =1,5; P = 0,8); 96,5% UR (F19, 80 =0,75; P = 0,7); e
93% UR (F19, 80 = 0,64; P = 0,8).
6.4 Efeito da Umidade relativa em péletes de celulose ou vermiculita com glicerina
Péletes de celulose formulados com 40% de glicerina quando expostos a 75%,
91%, 93% e 100% UR não formaram micélio e conídios de M. anisopliae a 25°C e
fotofase de 12 horas até 20 dias. Houve acúmulo de líquido em todos os poços de
cultura para UR ≥ 91% (Figura 13). Péletes expostos a 75% UR não apresentaram
acúmulo de água, porém os péletes ficaram aderidos no fundo dos poços da placa de
cultura, provavelmente pelo aumento da umidade nos péletes.
Figura 12 – Número médio de conídios de Metarhizium anisopliae /
mg de péletes formulados (20% de terra diatomácea + 78% vermiculita
+ 2% dióxido de silício) após exposição dos péletes em umidade
relativa entre 75% e 100%, fotofase de 12 horas a 25 ± 1 oC até 20
dias.
32
Observou-se desenvolvimento pleno de M. anisopliae IP 46 sobre os péletes
formulados com 10% de glicerina em umidade de 91%, e sem desenvolvimento em
umidades de 93%, 89% e 86%. Houve desenvolvimento de micélio e produção de
conídios nos péletes controle (sem glicerina) exposto a 93% UR, mas não nas outras
umidades (91%, 89% e 86%). As análises estatísticas apontaram um efeito significativo
do tempo na produção de conídios em péletes formulados com 10% de glicerina
expostos a 91% UR (F25,34 = 11,907; P < 0,001). O desenvolvimento de micélio sobre os
péletes com 10% glicerina expostos a 91% UR iniciou a partir do 6º dia e teve
abundância no 10º dia, onde também ocorreu a produção de conídios (Figura 14), sendo
que a maior produção de conídios aconteceu com 20 dias (1,4 x 105
± 3,7 x 103
conídios
/ mg).
Figura 13 – Péletes de celulose com 40% de glicerina expostos a 91%
UR a 25 ± 1 oC após cinco dias em placa de cultura. Note o acúmulo de
água ao redor e sobre os péletes.
33
Figura 14 – Péletes de celulose com 10% de glicerina expostos a 91% UR a 25 ± 1 oC em
placa de cultura. Início do desenvolvimento de micélio sobre os péletes após cinco dias de
exposição (A). Desenvolvimento de conídios sobre os péletes após 10 dias de exposição (B).
Figura 15 – Início da conidiogênese sobre os péletes à base
de vermiculita com 10% de glicerina, após oito dias de
exposição. Péletes expostos a 91% UR a 25 ± 1 oC em
placa de cultura.
34
Nos péletes à base de vermiculita formulados com 10% de glicerina, houve
desenvolvimento de micélio e produção de conídios a 91% UR e sem desenvolvimento
em péletes expostos a 93%, 89% e 86% UR. No grupo controle, sem glicerina, os
péletes expostos a 93% e 91% formaram micélio, mas apenas os péletes expostos a 93%
produziram conídios. O desenvolvimento de micélio sobre os péletes com 10% de
glicerina expostos a 91% UR teve início no 5º dia, e a produção de conídios no 8º dia de
exposição (Figura 15). Observou-se um efeito positivo do tempo na conidiogênese em
péletes de vermiculita formulados com 10% de glicerina expostos a 91% UR (F19, 40 =
306,68; P < 0,0001).
Houve efeito do inerte na produção de conídios sobre os péletes expostos a 91%
UR (F19, 80 = 27,595; P < 0,001). Péletes de vermiculita com 10% de glicerina tiveram
maior e mais rápida produção de conídios em relação aos péletes com celulose, sendo
no 20º dia a maior produção (1,1 x 105
± 5,2 x 103 conídios / mg) (Figura 16).
Figura 16 – Número médio de conídios (± erro padrão da média) de
Metarhizium anisopliae / mg de péletes de celulose (30% celulose, 60%
de terra diatomácea + 10% glicerina) ou vermiculita (20% de terra
diatomácea + 78% vermiculita + 2% dióxido de silício) após exposição em
91% UR, fotofase de 12 horas a 25 ± 1 oC até 20 dias.
35
7 DISCUSSÃO
Celulose microcristalina acrescida de umectantes apresentou maior
higroscopicidade quando comparada com vermiculita. A adição de umectantes causou
aumento no teor de umidade das misturas após exposição a 86% UR a 25 ºC. A
quantidade de água absorvida está diretamente relacionada com o tempo de exposição e
com a proporção de umectantes, ou seja, quanto maior a concentração, e mais longa a
incubação, maior é a absorção de água. Nos testes de higroscopicidade, a celulose teve a
capacidade de absorver mais água em relação à vermiculita.
A justificativa é baseada na alta capacidade destes umectantes em reter água
devido à formação de ligações de hidrogênio com as moléculas de água, e pela
propriedade da celulose microcristalina agir como uma “esponja”, tendo alta capacidade
de reter água dentro de sua matriz (FIELDEN, NEWTON, OBRIEN, 1988; EK,
NEWTON, 1998). O inerte vermiculita é um material inorgânico e mostrou alta
capacidade de reter água, quando misturado com umectantes, porém teve desempenho
inferior em relação à celulose.
Todos os umectantes testados conseguiram capturar umidade do ar em ambiente
com 86% de umidade relativa, entretanto, glicerina foi o mais higroscópico de todos,
em todas as concentrações testadas, independente do inerte (celulose ou vermiculita),
seguindo de propilenoglicol e PEG 400. A glicerina apresentou um efeito sinérgico
entre os inertes. A glicerina é um coproduto do biodiesel, sendo um insumo renovável,
abundante e economicamente viável. É bem utilizada em diferentes setores industriais,
tais como em fármacos, cosméticos, alimentos e tabacos (MOTA, SILVA,
GONÇALVES, 2009), e por esta razão, foi escolhida e usada nos testes seguintes.
O desenvolvimento de conídios de microescleródios de M. anisopliae nos
péletes de celulose ou vermiculita foi totalmente dependente da umidade relativa. O
crescimento micelial foi impedido e nenhum conídio produzido a ≤ 89% de UR a 25 ºC
e fotofase de 12 horas. M. anisopliae exposto a 100% UR necessitou no mínimo de três
e cinco dias para produzir micélio e conídios, e de quatro e seis dias para 98,5 %,
respectivamente.
Umidades tais como 91%, 93% e 96,5% podem ser consideradas como críticas
para o crescimento do fungo, devido à pouca presença (93%, 96,5% UR) ou ausência
total de conídios (91% UR) nos péletes. Isto pode ser confirmado no trabalho de Liu,
36
Lin, Shiau (1989), que observaram um decréscimo na conidiogênese de M. anisopliae
MA-1 em umidades relativas abaixo de 90,2%, sendo a umidade relativa um importante
fator na esporulação do fungo. Pode ser confirmado também no trabalho de Luz,
Fargues (1997), onde o limiar para infecção por Beauveria bassiana em Rhodnius
prolixus foi de 96% UR. Assim como Ignoffo (1992), que destacou a umidade como um
requisito fundamental para a produção de conídios e sobrevivência de fungos
entomopatogênicos no ambiente.
Observou-se uma abundante esporulação a partir do 16º dia para umidades mais
altas, o que está de acordo com o crescimento de M. anisopliae IP 46 em condições de
laboratório. Em geral, o número de conídios aumentou com o tempo de exposição,
principalmente onde a UR era mais elevada (≥ 93%). Este resultado está de acordo com
o que foi observado para o fungo do arroz Magnaporthe grisea, cuja produção de
conídios foi aumentada em umidades relativas entre 95 e 100% (ALVES,
FERNANDES, 2006).
A produção de conídios caiu drasticamente entre 96,5% e 98,5% UR, sendo um
limiar inferior de UR para a produção de conídios, independente do aditivo. O número
maior de conídios foi obtido com 20 dias de exposição a 25 ºC para umidades ≥ 93%,
mostrando que a formulação peletizada com agregados de hifas mantém a
conidiogênese in situ em condições apropriadas.
Não houve produção de conídios sobre os péletes confeccionados com celulose
microcristalina e 40% de glicerina. Os péletes se mostraram ineficientes ao
desenvolvimento de M. anisopliae em umidades ≥ 91% e em 75%. Um acúmulo de
líquido em volta dos péletes foi observado, ou seja, a concentração do umectante
glicerina foi muito alta, absorvendo muita água sobre os péletes, o que impediu o
desenvolvimento de M. anisopliae. Porcentagens elevadas de umidade podem ter
bloqueado a respiração do fungo pela ausência de O2, e também podem favorecer o
crescimento de fungos saprófitas, que necessitam de maiores quantidades de água para
se desenvolverem. O substrato (placa de cultura) onde foram colocados os péletes
influenciou no aumento do líquido em volta dos péletes. O modelo do substrato era de
plástico o que dificultou o escoamento desse líquido, fazendo com o que o mesmo se
acumulasse nos poços da placa de cultura, e assim, impedindo o desenvolvimento do
fungo.
Micélio e conídios de M. anisopliae se desenvolveram apenas nos péletes
preparados com celulose e 10% glicerina e nos péletes com vermiculita e 10% glicerina
37
expostos a 91% UR, sendo que péletes com vermiculita e glicerina 10% tiveram maior
produção de conídios em relação aos péletes com celulose. Alguns poços da placa de
cultura com péletes de celulose expostos a 93%, apresentaram acúmulo de líquido, e
umidades < 91% não desenvolveram micélio e nem produziram conídios. Umidade
relativa de 91% foi o limiar para a produção de conídios. Apenas os péletes de celulose
acumularam água. Isso pode ser explicado com o primeiro experimento, no qual a
mistura de celulose e glicerina absorveu mais água que vermiculita e glicerina. A
celulose microcristalina já tem propriedade de umectar, aglutinar e é o excipiente base
mais usado na elaboração de péletes (DOELKER et al., 1995; PASQUALOTO et al.
2005).
Os resultados da produção e tamanho dos agregados de hifas, e o acúmulo de
biomassa mostraram-se semelhantes aos resultados obtidos por Jackson, Jaronski (2009)
e Behle, Jackson, Lina B. (2013), onde também produziram agregados de hifas em meio
com baixa concentração de nutrientes (30:1).
Péletes são fáceis de manusear e possuem uma distribuição homogênea, por isso
a busca para otimizar formulações é importante. Formulação peletizada de AH acrescida
de glicerina teve capacidade de produzir novos conídios em umidades de 91%. E
formulação peletizada sem glicerina teve capacidade para produzir em umidades ≥ 93%.
E essa capacidade de AH produzir conídios no local da aplicação pode ser um potencial
para o controle microbiano de pragas.
38
8 CONCLUSÕES
Entre os três umectantes testados, glicerina parece ser o umectante mais
higroscópico em relação à propilenoglicol e PEG 400.
A esporulação de M. anisopliae IP 46 foi altamente influenciada pela umidade
relativa.
O umectante glicerina a 10% não foi tóxico para Metarhizium anisopliae.
O desempenho de M. anisopliae IP 46 sobre os péletes foi melhor com adição de
glicerina 10% em umidade subotimal.
O modelo do substrato usado não foi eficiente para a conidiogênese do fungo em
péletes com 40% de glicerina.
Microescleródios de M. anisopliae IP 46 formulados em péletes podem ser usados
como micoinseticidas em um programa de controle biológico.
Embora a absorção de água em celulose acrescida de umectantes tenha sido
melhor, a produção de conídios sobre os péletes de vermiculita foi maior do que
os péletes de celulose.
O aditivo inorgânico vermiculita, foi o melhor aditivo para a formulação
granulada, pois favoreceu o desenvolvimento do fungo, sendo menor a chance de
contaminação por outros microrganismos.
39
REFERÊNCIAS
AKBAR, W. et al. Diatomaceous earth increases the efficacy of Beauveria bassiana
against Tribolium castaneum larvae and increases conidia attachment. Journal of
Economic Entomology,v. 97, p. 273-280, 2004.
ALBERNAZ, D.A.S.; TAI, M.H.H.; LUZ, C. Enhanced ovicidal activity of an oil
formulation of the fungus Metarhizium anisopliae on the mosquito Aedes aegypti.
Medical and Veterinary Entomology, v. 23, p. 141-147, 2009.
ALMEIDA, J.E.M.; BATISTA FILHO, A. Controle da cigarrinha-da-raiz, Mahanarva
fimbriolata (Hemiptera: Cercopidae), com Metarhizium anisopliae e óleo de nim, em
cana-de açúcar sob cultivo orgânico. In: SIMPÓSIO DE CONTROLE BIOLÓGICO, 8,
2003, São Pedro, Resumos. p. 65, 2003.
ALVES, S.B. Fungos entomopatogênicos. In: ALVES, S.B. (Ed.). Controle
microbiano de insetos. Piracicaba: FEALQ, p. 289-380, 1998.
ALVES, K.J.P; FERNANDES, J.M.C. Influência da temperatura e da umidade relativa
do ar na esporulação de Magnaporthe grisea em trigo. Fitopatologia brasileira, v. 31,
p. 579-584, 2006
ALVES, S. B.; LOPES, R. B. Controle microbiano de pragas na América Latina
avanços e desafios. Piracicaba FEALQ, p. 414, 2008.
ARRUDA, P. V.; RODRIGUES, R. C. L. B.; FELIPE, M. G. A. Glicerol: um
subproduto com grande capacidade industrial e metabólica. Revista Analytica, v. 26, p.
56-62, 2007.
AYOADE, J. O. Umidade atmosférica. In: A climatologia para a introdução os
trópicos. Rio de Janeiro: Beltrand Brasil, p. 128-154, 1996.
AULTON, M. E. Delineamento de formas farmacêuticas. 2. ed., Porto Alegre:
Artmed, p. 369-401, 2005.
BATTA, Y.A. Production and testing of novel formulations of the entomopathogenic
fungus Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin (Deuteromycotina:
Hyphomycetes). Crop Protection, v. 22, p. 415-422, 2003.
BEHLE, R.W.; JACKSON, M. A.; LINA B. Efficacy of a granular formulation
containing Metarhizium brunneum F52 (Hypocreales: Clavicipitaceae) microsclerotia
against nymphs of Ixodes scapularis (Acari: Ixoididae). Journal of Economic
Entomology, v.1, p. 75-63, 2013.
BISCHOFF, J.F.; REHNER, S.A.; HUMBER, R.A. A multilocus phylogeny of the
Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia, v. 101, p. 512-530, 2009.
BOCK, C. H. et al. Effect of dew point temperature and conidium age on germination,
germ tube growth and infection of maize and sorghum by Peronoscleros porasorghi.
Mycological Research, v. 103, p. 859-864, 1999.
40
BURGES, H.D. Formulation of Microbial Biopesticides: Beneficial
microorganisms, Nematodes and Seed Treatments. Dordrecht, Netherlands. Kluwer
Academic Press. p. 412 1998.
BUTT, T.M.; COPPING, L. Fungal biological control agents. Pesticide outlook. v.11,
p. 186-191, 1992.
CASTRILLO, L.A.; ROBERTS, D.W.; VANDENBERG, J.D. The fungal past, present,
and future: germination, ramification, and reproduction. Journal of Invertebrate
Pathology, v. 89, p. 46-56, 2005.
CAVALCANTI, R. S. et al. Patogenicidade de fungos entomopatogênicos a três
espécies de ácaros em cafeeiro. Coffee Science, v. 3, p. 68-75, 2008.
CHERNAKI, A. M.; SOSA-GOMEZ, D. R.; ALMEIDA, L. M. Selection for
entomopathogenic fungi and LD50 of Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. for the
lesser mealworm Alphitobius diaperinus (Panzer) (Coleoptera: Tenebrionidae).
Brazilian Journal of Poultry Science,v. 9, p. 187-191, 2007.
COUCH, T. C.; IGNOFFO, C. M. Formulation of insect pathogens. In BURGES, H. D.
Microbiology Control and Pests Disease, London, Academic Press, p. 621-634, 1981.
DAVIES-MORLEY, J.; MOORE, D. E.; PROIR, C. Screening of Metarhizium
anisopliae and Beauveria spp. Conidia with exposure to simulated sun light and a range
of temperetures. Mycological Research, v. 100, p. 31-38, 1995.
DESTÉFANO, R. H. R. Detecção e identificação de Metarhizium anisopliae em
larvas de Diatraea saccharalis por primers específicos. 72 f. Tese de Doutorado,
Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", Piracicaba-SP: p. 87, 2003.
DOELKER, E. et al. Morphological, packing, flow and tableting properties of new
avicel type. Drug Development and Industrial Pharmacy, v. 21, p. 643-661, 1995.
DOZIER, W.A.; KERR, B.J.; CORZO, A.N. Apparent metabolizable energy of glycerin
for broiler chickens. Poultry Science, v. 87, p. 317–322, 2008.
DUARTE, G.F. et al. New insights into the amphibious life of Biomphalaria glabrata
and susceptibility of its egg masses to fungal infection. Resultados da pesquisa
Journal of Invertebrate Pathology, v. 125, p. 31-36, 2015.
EK, R.; NEWTON, J. M. Microcrystalline cellulose as a sponge as an alternative
concept to the crystallite-gel model for extrusion and spheronization. Pharmaceutical
Research, v. 15, p. 509-511, 1988.
FARGUES, J. et al. Étude immunologique comparée de souches de Metarhizium
anisopliae champignon hyphomycète entomopathogène. Comptes Rendus
Hebdomadaires de Séance de l’Académie des Sciences,v. 281, p. 1781-1784, 1975.
41
FARIA, M.R; WRAIGHT, S.P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A
comprehensive list with worldwide coverage and international classification of
formulation types. Biological Control, v. 43, p. 237-256, 2007.
FARIAS, K. V. Influência de umectante aniônico na reologia e espessura do reboco
de fluidos hidroargilosos. Dissertação de Mestrado Campina Grande – Paraíba-
Campina Grande, 2005.
FAULDE, M. K.; TISCH, E. M.; SCHARNINGHAUSEN, J. J. Efficacy of modified
diatomaceous earth on different cockroach species (Orthoptera, Blattellidae) and
silverfish (Thysanura, Lepismatidae). Journal of Pest Science, v. 79, p. 155-161,
2006.
FENG, M. G.; POPRAWISKI, T. J.; KHACHATOURIONS, G. G. Production,
formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for
insect control: Current status. Biocontrol Science and Technology, v. 4, p. 3-34. 1994.
FERNANDES, É. K. K.; BITTENCOURT, V. R. E. P .Entomopathogenic fungi against
South American tick species. Experimental and Applied Acarology, v. 46, p. 71-93,
2008.
FRENCH-CONSTANT, R. H. Something old, something transgenic, or something
fungal for mosquito control?. Ecology and Evolution, v. 20, p. 577-579, 2005.
FIELDEN, K. E. et al. Thermal studies on the interaction of water and microcrystalline
cellulose. Journal of Pharmacy and Pharmacology. v.40, p. 674-678, 1988.
GUAGLIUMI, P. As cigarrinhas dos canaviais no Brasil. Brasil Açucareiro, v. 72, p.
34-43, 1968.
GINDIN, G. et al. The susceptibility of different species and stages of ticks to
entomopathogenic fungi. Experimental and Applied Acarology, v. 28, p. 283-288,
2002.
GOBLEL, T. A. et al. Conidial production, persistence and pathogenicity of
hydromulch formulations of Metarhizium brunneum F52 microsclerotia under forest
conditions. Biological Control, v. 16. 2016.
GOETTEL, M.S.; INGLIS, G.D.; WRAIGHT, S.P. Fungi. In: Field manual of
techniques in invertebrate pathology. Netherlands: Kluver Academic Publishers, p. 255-
282, 2000.
GOETTEL, M. S.; LACEY, L. A. Current developments in microbial control of insect
pests and prospects for the early 21st century. Entomophaga, v. 40, p. 3-27, 1995.
GREENSPAN, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solut. Journal
Research. v. 81A, p. 90-96, 1976.
GUACLIUMI, P. As cigarrinhas dos canaviais no Brasil. Brasil Açucareiro, Rio de
Janeiro, v. 72, n. 3, p. 34-43, set. 1968.
42
HAJEK, A. E. Natural enemies. An introduction to biological control. Cambrigde
University Press, New York, p. 396, 2004.
HICKS, D. C; FREESE, H. L. Extrusion and spheronizing equipment -
pharmaceutical pelletization echnology, New York, Basel: Marcel Dekker Inc., p. 71-
100, 1989.
HUMBER, R.A.; MORAES, G.J.; SANTOS. J.M. Natural infection of Tetranychus
evansi (Acarina: Tetranychidae) by a Triplosporium sp. (Zygomycetes:
Entomophthorales) in northeastern Brazil. Entomophaga. v. 26, p. 421-425, 1981
HUMBER, R.A.; MORAES, G.J.; SANTOS, J.M. Natural infection of Tetranychus
evansi (Acarina Tetranychidae) by a Triplosporium sp (Zygomycetes:
Entomophthorales) in Northeastern Brazil. Entomophaga, v. 26, p. 421-425, 1989.
HUMBER, R. A. Evolution of entomopathogenicity in fungi. Journal of Invertebrate
Pathology,v. 98, p. 262–266, 2008.
HUMBER, R. A. Entomogenous fungi. In:Schaechter, M. Eukariotic microbes,
Elsevier, San Diego, p. 127-140, 2011.
IGNOFFO, C.M. et al. Susceptibility of the cabbage looper, Trichoplusia ni and the
vevet bean caterpillar, Anticarsia gemmatalis, to serveral isolates of the
entomopathogenic fungus Nomuraea rileyi. Journal of Invertebrate pathology, v. 28,
p. 259-262, 1976.
IGNOFFO, C.M. Environmental factors affecting persistence of entomopathogens. The
Florida Entomologist, v.75, p.516-525, 1992.
JACKSON, M. A.; JARONSKI, S. T.. Production of microsclerotia of the fungal
entomopathogen Metarhizium anisopliae and their potential for use as a biocontrol
agent for soil-inhabiting insects. Mycological Research. v. 113, p. 842-850, 2009.
JONES, K. A.; BURGES, H. D. Technology of formulation and application. In:
BURGES, H.D. (Ed.). Formulation of microbial pesticides – Beneficial
microorganisms, nematodes and Seed treatments. Dordrecht: Kluwer Academic, p.
7-30, 1998.
KNOWLES, B.H. Mechanism of Action of Bacillus thuringiensis Insecticidal δ-
Endotoxins. In Advances in Insect Physiology, v. 24, p. 275-308, 1994.
LATCH, G. C. M. Metarhizium anisopliae strains in New Zealand and their possible
use for controlling pasture-inhabiting insects, Journal of agricultural research, v. 8, p.
384-396, 1965.
LAZZARINI, G. M. J.; L. F. N. ROCHA; LUZ, C. Impact of moisture on in vitro
germination of Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana and their activity in
Triatoma infestans. Mycological Research, v. 110, p. 458-492, 2006.
43
LEITE, L.G. et al. Produção de fungos entomopatogênicos. Ribeirão Preto: Alexandre
de Sene Pinto, p. 92, 2003.
LEE, S. J.; KIM, S.; YU, J. S.; KIM, J. C.; NAI, Y.-S.; KIM, J. S.Biological control of
Asian tiger mosquito, Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) using Metarhizium
anisopliae JEF-003 millet grain. Journal Asia-Pacific Entomology, v. 18, p. 217-221,
2015.
LIU, S. D.; LIN, S. C. SHIAU, J. F. Microbial control of coconut leaf beetle
(Brontispalongissima) with Green Muscardine Fungus, Metarhizium anisopliae var.
anisopliae. Journal Invertebrate Pathology, v.53, p. 307-314, 1989.
LUZ, C. et al. Ovicidal activity of entomopathogenic Hyphomyceteson Aedes aegypti
(L.) (Diptera: Culicidae) under laboratory conditions. Journal Medical Entomology, v.
44, p. 799-804, 2007.
LUZ, C.; BATAGIN, I. Potential of oil based formulations of Beauveria bassiana to
control Triatoma infestans. Mycopathology, v.160, p. 51-62, 2005.
LUZ, C.; FARGUES, J. Temperature and moisture requirements for conidial
germination of an isolate of Beauveria bassiana, pathogenic to Rhodnius prolixus.
Mycopathologia, v. 138, p. 117-125, 1997.
LUZ, C. et al. Selection of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae isolates to
control Triatoma infestans. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 93, p. 839-846,
1998.
LUZ, C.; RODRIGUES, J.; ROCHA, L.F.N. Diatomaceous earth and oil enhance
effectiveness of Metarhizium anisopliae against Triatoma infestans. Acta Tropica, v.
122, p. 29-35, 2012.
MARANGA, R. O. et al. A.Effects of combining the fungi Beauveria bassiana and
Metarhizium anisopliae on the mortality of the tick Amblyomma variegatum (Ixodidae)
in relation to seasonal changes. Mycopathologia, v. 159, p. 527-532, 2005.
MARGOSAN, D. A.; PHILLIPS, D. J. Effect of two temperatures on nuclear number of
conidia of Monilinia fructicola. Mycologia, v. 77, p. 835-837, 1985.
MARQUES, E.P. et al. Metodologia analítica para glicerol em biodiesel: cenário atual
Cadernos de Pesquisa. v. 18, p. 71-79, 2011.
MASCARIN, G. M. ; PAULI, G. Bioprodutos à base de fungos entomopatogênicos. In:
Madelaine Venzon; Trazilbo José de Paula Júnior; Angelo Pallini. (Org.). Controle
alternativo de pragas e doenças na agricultura orgânica. 1ed.Viçosa: U.R. EPAMIG
ZM, 2010, v. 4, p. 169-195.
MASCARIN, G.M. et al. Production of microsclerotia by Brazilian strains of Metarhizium
spp. using submerged liquid culture fermentation. World Journal of Microbiology and
Biotechnology, v. 30, p. 1583-1590, 2014.
44
MENDONÇA FILHO, A.; WILLIAM, R.; SILVA, M. Controle biológico da cigarrinha
da raiz Mahanarva fimbriolata (Hem.:Cercopidae) em áreas de corte mecanizado de
cana crua. In: SIMPÓSIO DE CONTROLE BIOLÓGICO, Poços de Caldas. Resumos.
Poços de Caldas, p.131, 2001.
MIRANDA, L.L.D. et al. Eficiência de Metarhizium anisopliae (Metsch.) no controle
de Mahanarva fimbriolata (Stål) (Hemiptera: Cercopidae) em Cana-de-Açúcar.
Neotropica Entomology, v.33, p.743-749, 2004.
MONTEIRO, S. G. et al. Efeito dos fungos entomopatogenicos Metarhizium anisopliae
e Beauveria bassiana em ovos de Rhipicephalus sanguineus (acarlixodidae). Ciência
Rural, v. 28, p. 461-466, 1998.
MORAES, C.; SCHRANK, A.; VAINSTEIN M. H. Regulation of extracellular
chitinases and proteases in the entomopathogen and acaricide Metarhizium anisopliae.
Current Microbiology., v. 46, p. 205-210, 2003.
MOSCARDI, F. Assessment of the application of baculoviruses for control of
lepidoptera. Annual Review of Entomology, v.44, p. 257-289. 1999.
MOTA, C.J.A.; SILVA, C.X.A; GONÇALVES, V.L.C. Gliceroquímica: novos
produtos e processos a partir da glicerina de produção de biodiesel. Química nova, v.
32, p. 639-648, 2009.
ONOFRE, S. B. et al. Controle biológico de pragas na agropecuária por meio de
fungos entomopatogênicos. In: Biotecnologia: Avanços na agricultura e
agroindústria. Caxias do Sul, p. 295-328, 2002.
PASQUALOTO, K.F.M. Utilização de probitos como instrumento estatístico simples à
avaliação da distribuição de tamanho de partículas de dois tipos de celulose
microcristalina. Revista Brasileira de Farmácia, v.86, p. 31-34, 2005.
PERINOTTO, W. M. S. et al. .Nomuraea rileyi as biological controlagents of
Rhipicephalus microplus tick. Parasitology Research, v. 111, p. 1743-1748. 2012.
PEZZINI, B. R.; SILVA, M. A. S.; FERRAZ, H. G. Formas farmacêuticas sólidas orais
de liberação prolongada: sistemas monolíticos e multiparticulados. Revista Brasileira
Ciências Farmaceutica, v. 43, p. 491-502, 2007.
PINTO, A.D.S.; GARCIA, J.F.; BOTELHO, P.S.M. Controle biológico de pragas da
cana-de-açúcar. In: (Eds.) PINTO, A.N.; NAVA, D.E.; ROSSI, M.M.; MALERBO-
SOUZA, D.T.Controle Biológico de Pragas, Piracicaba, p. 65-74, 2006.
POLANCZYK, R.A.; GARCIA, M.O.; ALVES, S.B. Potencial de Bacillus
thuringiensis israelensis Berliner no controle de Aedes aegypti. Revista Saúde Pública,
v. 37, p. 813-816, 2003.
POLAR, P. et al. Comparison of water, oils and emulsifiable adjuvant oils as
formulating agents for Metarhizium anisopliae for use in control of Boophilus
microplus. Mycopathology, v. 160, p. 151-157, 2005.
45
RATH, A. C.; KOEN, T. B.; YPI, H. Y. The influence of abiotic factors on the
distribution and abundance of Metarhizium anisopliae in Tasmanian pasture soils.
Mycological Research, v. 96, 378-384, 1992.
REDAELLI, P.; VISOCCHI, V. Agostino Bassi precursor of comparative
mycopathology. Mycopathologia, v. 2, p. 37-42, 1940.
ROBERTS, D. W. Metarhizium spp., cosmopolitan insect pathogenic fungi:
mycological aspects. Advances in Applied Microbiology, v. 54, p. 1-51, 2004.
ROCHA, L. F. N. et al. Occurrence of invertebrate-pathogenic fungi in a Cerrado
ecosystem in Central Brazil. Biocontrol Science and Technology, v. 19, p. 547-53, 2009.
RODRIGUES, J. Formulação de Culicinomyces clavisporus para controle de Aedes
aegypti. Dissertação de Mestrado Goiânia, Goiás, 2014.
RUIU, L.; SATTA, A.; FLORIS, I. Emerging entomopathogenic bacteria for insect pest
management. Bulletin of insectology, v. 66, p. 181-186, 2013.
SANTOS H. M. M. et al. Obtenção de pellets por extrusão e esferonização
farmacêutica. Parte II. Avaliação das características física de pellets. Brazilian Journal
of Pharmaceutical Sciences, v. 42, p. 309-318, 2006.
SCHOLTE, E. et al. Entomopatho-Entomopathogenic fungi for mosquito control: a
review. Journal of Insect Science, v. 4, p. 1-19, 2004.
SHAH, P.A.; PELL, J.K. Entomopathogenic fungi as biological control agents. Applied
Microbiology Biotechnology, v. 61, p. 413-423, 2003.
SILVA, R. O.; SILVA, H. H. G.; LUZ, C. Effect of Metarhizium anisopliae isolated
from soil samples of the central Brazilian cerrado against Aedes aegypti larvae under
laboratory conditions. Revista Patologia Tropical, v. 33, p. 207-216, 2004.
SONG, Z. et al. Optimization of culture medium for microsclerotia production by
Nomuraea rileyi and analysis of their viability for use as a mycoinsecticide. Biological
Control, v. 59, p. 597-605, 2014.
STEINKRAUS, D. C.; SLAYMAKER, P. H. Effect of temperature and humidity of
formation, germination and infectivity of conidia of Neozygites fresenni (Zygomycetes:
Neozygitaceae) from Sphisgrossiui (Homoptera: Aphididae). Journal Invertebrate
Pathology, v. 54, p. 130-137, 1994.
STOCK, S.P. et al. Insect Pathogens: Molecular approaches and techniques.
Massachussets: Cambridge, p. 50-56, 2009.
TRIVEDI, N. R. et al. Pharmaceutical Approaches to Preparing Pelletized Dosage
Forms Using the Extrusion-Spheronization Process. Therapeutic Drug Carrier
Systems, v. 24, p. 1-40, 2007.
46
XAVIER, L.M.S.; ÁVILA, C.J. Patogenicidade de isolados de Metarhizium anisopliae
(Metsch.) Sorokin e de Beauveria bassiana (Bals.) Vuillemin a Scaptocoris carvalhoi
Becker (Hemiptera, Cydnidae). Revista Brasileira Entomologia, v. 50, p.540-546,
2006.
WALSTAD, J. D.; ANDERSON, R. J.; STAMBAUGH, J. Effect of environmental
conditions on two species of muscardine fungi (Beauveria bassiana and Metarhizium
anisopliae).Journal Invertebrate Pathology,v.16, p. 221-226, 1970.
WINSTON, P.W.; BATES, D.H. Saturated solutions for the control of humidity in
biological research. Ecology, v. 41, p. 232-237, 1960.
WRAIGHT, S.P.; JACKSON, M.A.; DE KOCK, S.L. Production, stabilization and
formulation of fungal biocontrol agents. In: BUTT, T. M.; JACKSON, C.; MAGAN,
N. (Eds.), Fungi as Biocontrol Agents. CAB International, Wallingford, UK, p. 253,
2001.
ZIMMERMANN, G. The entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae ans its
potencial as a biocontrol agent. Journal of Pest Science, v. 37, p.375-379, 1993.
ZIMMERMANN, G. Review on safety of the entomopathogenic fungus Metarhizium
anisopliae. Biocontrol Science and Technology, v. 17, p. 879-920, 2007.
