Alessandra Rocha Bruna Antônia Cíntia Libéria Clara Guedes Fernanda Paulino Guilherme Rezende Heitor Emílio Jennifer Fernandes Karina Roque Karine Christine

Biologia molecular

Investiga as interações entre os diversos sistemas celulares, especialmente entre DNA, RNA e proteínas.

Biologia molecularPossibilita a caracterização de

diversos genes em nível de sequência e regulação com relativa segurança;

Em microbiologia de alimentos os métodos moleculares vêm substituindo os fenotípicos, como forma de confirmar a proximidade entre cepas envolvidas em um surto.

Biologia molecular

Identificação de agentes patogênicos mais rápida, em relação aos testes microbiológicos;

Fornece resultados seguros;

Possibilita a tipificação de espécies.

Biologia molecular

Importante subsídio ao monitoramento microbiano em sistemas de APPCC PCR

Pesquisas indicam as técnicas da biologia molecular como importante recurso no controle de qualidade em estabelecimentos frigoríficos.

Biologia molecularÉ um campo ainda em

desenvolvimento em nível de pesquisa;

Técnicas vem se aperfeiçoado cada vez mais;

Desafio tornar a técnica viável à rotina laboratorial.

Imagem: http://dgp.cnpq.br/buscaoperacional

Imagem: www.cpa.vet.ufg.br/web

Métodos de análise• Reação em Cadeia da Polimerase (PCR);

• PCR em tempo real;

• Western Blot;

• Polimorfismo do Comprimento dos Fragmentos de Restrição (RFLP);

• Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE).

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

Sequências de DNA ou RNA específicos enzimaticamente ampliadas;

Altamente sensível;Alto investimento em equipamentos e

reagentes;Sem padronização e regulamentação

oficial quanto às técnicas.

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

Utiliza-se uma enzima termoestável que em presença dos primers e dos nucleotídeos que compõem uma molécula de DNA amplificam a região de interesse.

Ciclos repetidos em termocicladoras; Separação e visualização do material

genético em géis de agarose ou poliacrilamida.

PCR em Tempo RealÉ uma técnica variante do PCR

convencional que permite quantificar a expressão gênica;

• Associa o PCR a um sistema de detecção e quantificação da fluorescência produzida durante os ciclos.

PCR em Tempo RealVantagens:

Facilidade de quantificação;Maior sensibilidade,

reprodutibilidade e precisão;Rapidez;Melhor controle da qualidade no

processo;Menor risco de contaminação.

Western BlotMétodo semi-quantitativo altamente

específico;Indicado para análise de poteínas insolúveis:

Extração das proteínas;Separação eletroforética em gel em

condições desnaturantes;Eletrotransferência das proteínas;Reações imunoquímicas de detecção de

enzimas.

Western Blot

Detecção de encefalopatia enspongiforme bovina;

Proteína protease-resistente do príon PrPSc.

Polimorfismo do Comprimento dos Fragmentos de Restrição (RFLP)

• Técnica se baseia no corte do DNA por enzimas de restrição que produzem fragmentos de comprimentos diferentes;

• Os fragmentos são separados em gel de agarose por eletroforese e transferidos para uma membrana de nylon ou poliacrilamida onde é realizada a hibridização com sonda marcada com fluorocromo ou material radioativo.


As enzimas de restrição reconhecem seqüências específicas do DNA e clivam a fita em fragmentos mais curtos.


Utilização:Genotipagem;

Estudos epidemiológicos;

Identificação microorganismos ;

Diagnóstico laboratorial.


Principais limitações para o emprego da técnica:

Técnica laboriosa não é passível de automatização;

Requer alta quantidade e qualidade de DNA;

Uso de várias enzimas gerando padrões altamente complexos e de difícil interpretação.

Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE)

Muito utilizado para análises epidemiológicas de bactérias patogênicas;

É uma derivação do método convencional da eletroforese:Mudança repetida da orientação do

campo elétrico;Fragmentos maiores de DNA.

Investigação de Escherichia coli O157:H7 no Estado do Rio Grande do

Sul, BrasilObjetivo: Investigar E.coli O157:H7 em amostras de carne moída coletadas no comércio do Rio Grande do Sul.Materiais e métodos: Isolou-se a bactéria por meio de enriquecimento seletivo e depois caracterizou-se o genótipo e o fenótipo através do PCR Multiplex.

Aplicação da técnica de PCR na detecção de Yersinia enterocolitica em

suínos abatidos sem inspeçãoObjetivo: Avaliar a contaminação de carcaças e tonsilas

de suínos por Y. enterocolitica e comparar a análise microbiológica com a técnica de PCR

Resultados: Pela microbiologia não se detectou Y. enterocolitica e através de PCR detectou-se a bactéria em 40% das carcaças e em 43% das tonsilas

Aplicação da técnica de PCR na detecção de Yersinia enterocolitica em suínos abatidos sem inspeção

Conclusão:A PCR apresentou-se como técnica mais eficaz, econômica e rápida;PCR é um importante recurso para o controle de qualidade da carne suína.

Coliformes fecais, estafilococos coagulase positiva (ECP), Salmonella spp. e

Campylobacter spp. em linguiça frescal

Objetivo: Verificar a qualidade microbiológica de

linguiças frescais de carne de frango, mista e de carne suína, fabricadas artesanalmente e sob

inspeção, no município de Jaboticabal – SP, Brasil.

Coliformes fecais, estafilococos coagulase positiva (ECP), Salmonella spp. e

Campylobacter spp. em linguiça frescalResultados: As amostras positivas de E. coli analisadas

pelos testes de PCR Multiplex não revelaram presença

de E. coli O:157, O:111 e O:113Conclusão: A ausência destes microrganismos em lingüiça frescal pode ser explicada pelo pH, quantidade de sal e nitritos e erro nos meios utilizados para contagem.

Detecção de adulterações em produtos alimentares contendo leite e/ou proteínas lácteasCaracterísticas da produção de leite de cabra e

ovelhas:Flutuações sazionais quanto a presença no

mercado;Preço mais elevado comparativamente ao leite

de vaca;Alterações quanto aos teores de alguns

constituintes.

Concentacões mais elevadas de ácido capróico (C6), caprílico (C8), cáprico (C10) e láurico (C12).

Principal adulteração: adição do leite de vaca e proteínas lácteas ao leite de cabra e/ou ovelha para prerparação de queijo;

O consumo de produtos que contenham leite e este não seja declarado na rotulagem, poderá causar reações alérgicas, em indivíduos sensíveis a esse produto.

Detecção de adulterações em produtos alimentares contendo leite e/ou proteínas lácteas

Cabra, Ovelha ou

Vaca?


Métodos eletroforéticos.

Métodos imunológicos

Métodos cromatrográficos

Métodos moleculares

Espectometria em massa

Métodos cromatrográficos: Cromatografia é uma técnica de separação de

misturas e identificação de seus componentes; A eluição da s1-caseína bovina ocorre mais tarde

que a das s1 caseínas caprina e ovina.

Métodos eletroforéticos: Baseado na mobilidade das proteínas sobre a ação

de uma carga elétrica; Permitem a diferenciação das proteínas do leite de

vaca do leite de ovelha e cabra, a partir da y-caseinas bovinas.


Métodos imunológicos: Relativa simplicidade dos ensaios enzimáticos e a elevada

sensibilidade, devido à especificidade das reações antígeno-anticorpo;

Detecção qualitativa e quantitativa de componentes alimentares e contaminantes.

Métodos moleculares: Técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) baseia-

se na análise de DNA, permitindo detectar e amplificar pequenos fragmentos de DNA.

Espectometria em massa Determina a massa molecular das proteínas do leite e

identificar variantes genéticas.



Mais recentemente, com a técnica de PCR têm-se obtido resultados promissores. O

mesmo está acontecendo com a espectrometria de massa.

Máquina de PCR

Identificação molecular de peixes: o caso do Surubim (Pseudoplatystoma

spp.)O artigo trata da necessidade/importância do

desenvolvimento de meios de identificação das diferentes espécies de peixes, no caso o surubim (Pseudoplatystoma corruscans), bem como da utilização de tecnologias biomoleculares para identificação de fraudes na comercialização de híbridos de surubim como sendo este espécime puro;

A tecnologia utilizada para tal identificação foi a de Barcode Genético, que consiste na pesquisa de uma pequena sequência de DNA mitocondrial (gene COI).

Identificação molecular de peixes: o caso do Surubim (Pseudoplatystoma

spp.) Experimento realizado na Escola de Veterinária da UFMG onde

foram analisados dois grupos de indivíduos: Hibrido de surubim, o cachapinta e o outro surubim puro (P. corruscans)

Hibrido: confirmou-se sua hibridez já que foi identificado o mtDNA de cachara (Pseudoplatystoma reticulatum).

Puro: identificou-se também o mtDNA de cachara, indicando assim que estes indivíduos não eram puros, ou seja, mas sim híbridos

Conclui-se que a utilização dos métodos biomoleculares são de grande ajuda na identificação de híbridos de surubim, na identificação de modos de cruzamentos interespecíficos e na identificação de possíveis fraudes como a venda de híbridos do surubim como sendo surubim puro

Métodos diagnósticos para os patógenos alimentares: Campylobacter sp., Salmonella sp. e

Listeria monocytogenes

Os métodos moleculares são importantes para reduzir a frequência da transmissão destes patógenos aos consumidores.

As técnicas moleculares, em especial a PCR, tem melhorado a identificação dessas bactérias, reduzindo o tempo de cultivo e ampliando a confiabilidade das provas diagnósticas.

Salmonella sp.Caracterização bioquímica;Sorotipagens;Suscetibilidade a antimicrobianos;Sorologia;PCR.



Alta confiabilidadeLongo tempo

para identificação

Menor tempo de identificação

Traça perfil genético


Listeria monocytogenesCampylobacter sp.

Isolamento do agente método mais utilizado

PCR elimina o tempo de incubação, isolamento e testes bioquímicos método mais rápido


Listeria monocytogenesListeria monocytogenes:

Microbiologia tradicional diversos caldos seletivos de enriquecimento e ágares disponíveis para recuperação e multiplicação;

PCR eficiente na identificação do patógeno.

As técnicas de biologia molecular têm sido cada vez mais aplicadas na caracterização de L. monocytogenes.



Os microrganismos estudados são de grande importância quando nos referimos aos transtornos alimentares. Dessa forma fez-se necessário o uso de técnicas que apresentem um diagnóstico preciso e eficiente a fim de se evitar surtos de infecções, que envolvem grandes danos a saúde publica.

ConclusãoAs indústria são responsáveis por assegurar a

autenticidade dos produtos de origem animal, para tanto necessitam ter à sua disposição métodos que possam dar respostas precisas em tempo real. A biologia molecular vem para facilitar estas análises, assim como dar diagnósticos precisos e de forma eficiente;

Os métodos moleculares vêm aos poucos substituindo as análises tradicionais, no entanto ainda serão necessárias pesquisas a fim de tornar esta tecnologia viável à rotina laboratorial.

Referências Bibliográficas FERRARI, C. K. B.; TORRES,E. A. F. S. Perspectivas da Pesquisa em Biologia

Molecular Aplicada à Nutrição. INCI, v.27, n.11, Caracas, 2002. http://www.cpa.vet.ufg.br/web/index.php/extensao/analises TEODORO, V.a.m. et al. Aplicação da técnica de PCR na detecção de

Yersinia enterocolitica em suínos abatidos sem inspeção. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec, Ufv, v. 58, n. 1, p.9-14, 2006.

SILVEIRA, Josete Baialard et al. Investigação de Escherichia coli O157:H7 no Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. Food Control, Porto Alegre, n. , p.1-46, 2010.

CORTEZ, Ana Lígia Lordello et al. COLIFORMES FECAIS, ESTAFILOCOCOS COAGULASE POSITIVA (ECP), Salmonella SPP. E Campylobacter SPP. EM LINGÜIÇA FRESCAL. Alim. Nutr, Araraquara, v. 15, n. 3, p.215-220, 2004.

VELOSO, A.C.A; TEIXEIRA, N.; FERREIRA, I.M.P.L.V.O.; FERREIRA, M.A. Detecção de adulterações em produtos alimentares contendo leite e/ou proteínas lácteas. Química Nova, Vol. 25, n.4, 609-615, 2002.

Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.77, n.4, p.741-750, out./dez., 2010 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS PARA OS PATÓGENOS ALIMENTARES: CAMPYLOBACTER SP., SALMONELLA SP. E LISTERIA MONOCYTOGENES R.B. de Andrade, T. Gemelli, L.P. Dall Onder, K. Cristina, T. de Brito, A.A.L. Barboza, B.G. de Brito Instituto de Pesquisa Veterinária “Desidério Finamor”,

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