Aline Stamford Henrique da Silva Guerra · 2019. 10. 25. · Apesar do avanço no conhecimento da fisiopatologia da inflamação, os medicamentos atuais ainda apresentam sérios efeitos

Universidade Federal de Pernambuco

Centro de Ciências Biológicas

Programa de Pós-graduação em Inovação Terapêutica/PPGIT

Aline Stamford Henrique da Silva Guerra

Estudo das Atividades Anti-inflamatória e Antinociceptiva dos Derivados

Indol-imidazolidínicos 5-(1H-Indol-3-il-metileno)-2-tioxo-imidazolidin-4-

ona (LPSF/NN-56) e 3-(4-Bromo-benzil)-5-(1H-indol-3-il-metileno)-2-

tioxo-imidazolidin-4-ona(LPSF/NN-52)

UFPE – Recife

2011



Indol-imidazolidínicos 5-(1H-Indol-3-ilmetileno)-2-tioxo-imidazolidin-4-


tioxo-imidazolidin-4-ona(LPSF/NN-52).

Dissertação apresentada ao programa de Pós-

Graduação em Inovação Terapêutica da

Universidade Federal de Pernambuco, como

requisito para obtenção do título de Mestre em

Inovação Terapêutica. Área de concentração:

Desenvolvimento Pré-clínico de Produtos

Bioativos.

ORIENTADORA:

Profa. Dra. Teresinha Gonçalves da Silva

UFPE – Recife

2011


Indol-imidazolidínicos 5-(1H-Indol-3-ilmetileno)-2-tioxo-imidazolidin-4-


tioxo-imidazolidin-4-ona(LPSF/NN-52).


Aprovada em: 18/03/2011

Banca examinadora:

____________________________________________________

Profª Drª. Teresinha Gonçalves da Silva – UFPE

Orientadora – Membro interno

____________________________________________________

Profª Dra. Vláudia Maria Assis Costa – UFPE

Membro externo

____________________________________________________

Profª Dra. Leônia Maria Batista – UFPB

Membro externo

RECIFE

2011

DEDICATÓRIA

A minha mãe, Darlyx, que foi minha primeira mestra, guiou

e orientou meus passos. Despertou em mim a curiosidade para

aprender, a perseverança para lutar e o incansável desejo de

perpetuar meus conhecimentos. Obrigada mainha por seu amor

e dedicação, pela paciência e confiança e por me ajudar a

realizar meus sonhos me incentivando e apoiando.

AGRADECIMENTOS

A Deus, por me proporcionar a vida e todas as experiências maravilhosas que passei,

por me iluminar e abençoar minhas escolhas e por me dar força através da minha fé para

sempre seguir em frente e obter sucesso.

À minha orientadora, Profa. Drª Teresinha Gonçalves da Silva, pela oportunidade que

me foi dada, pela dedicação, orientação e amizade. Seus valiosos conhecimentos

contribuem para minha formação e futuro.

Aos meus pais, Walter e Darlyx, pelo amor, carinho e educação que me prestaram.

Obrigada pelo incentivo e palavras de consolo. Por vocês eu cheguei até aqui e para

vocês que continuarei a seguir.

As minhas irmãs lindas, que por muitas vezes pude recorrer e sempre tive amparo.

Muito obrigada Alix, Amanda e Andreza, pelo carinho e companhia.

Aos meus familiares por apoiarem, por falarem de mim com orgulho e carinho. Vocês

também são responsáveis por minhas conquistas, pois nunca deixaram me faltar nada.

Ao meu amigo, amor e companheiro Philipe, por sempre demonstrar interesse pelos

meus planos, acompanhar minhas conquistas e alimentar meus sonhos.

As amigas Cecília Brito e Ana Patrícia por fazerem parte da minha história e pelo

carinho e amizade. Vocês fazem parte do meu alicerce.

A minha amiga e orientadora de iniciação científica Maria do Carmo de Caldas Dias

Costa, pelas horas de dedicação e carinho, por me transmitir conhecimentos valiosos e

por me inserir no Departamento de Antibióticos da UFPE.

A Técnica em Laboratório Suzete Mendonça, pelo seu carinho, companheirismo, por

está sempre disposta a ajudar.

A Técnica em Laboratório Maria Rodrigues, pela paciência e disposição para me

ensinar as técnicas de ensaio in vitro com cultura de Células

A Professora Silene Carneiro, pela amizade, carinho e por me inserir no Departamento

de Antibióticos da UFPE.

A minha amiga e companheira de Laboratório Diana Malta, por ser solícita, por dividir

experimentos, material de estudo, por me ajudar na execução das minhas tarefas no

laboratório e, por estar presente nos momentos de descontração, sorrir comigo e me

passar conhecimento valiosos.

Aos doutorandos do LBPF André Barros, Jaciana Aguiar e Thiago Lins, pela paciência,

amizade, colaboração nos experimentos, consultoria de informática e horas de muitas

risadas.

Aos Mestrandos do LBPF, em especial Larissa Corrêa, Fernanda Mota, Sandrine

Arruda e Tatiana Bezerra pela amizade, colaboração nos experimentos e análise dos

resultados.

Aos alunos de iniciação científica do LBPF Carlson Carvalho, Luana Laranjeira e

Adamares Santana, pela colaboração no desenvolvimento deste trabalho, pela amizade,

apoio e incentivo, pela companhia e ajuda nos finais de semana e feriados, pelos

almoços, jantares, lanches, horas e horas de convívio.

Ao veterinário e amigo Eryvelton Franco, por me ajudar a implantar uma nova

metodologia de atividade anti-inflamatória que contribuirá para a pesquisa dos alunos

do LBPF.

Aos Professores Ivan da Rocha Pitta, Suely Lins Galdino e Maria do Carmo Alves de

Lima, do Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos/ Grupo de Pesquisa e

Inovação Terapêutica – LPSF/GPIT, Departamento de Antibióticos, da Universidade

Federal de Pernambuco, por fornecer as moléculas de estudo deste trabalho.

A todos que fazem parte do Departamento de Antibióticos, por ceder o espaço para minha

pesquisa.

Aos meus colegas PPGITeanos, pelo convívio agradável, por compartilhar conhecimentos e

por fazerem parte da minha formação acadêmica.

A todos que fazem parte do Programa de Pós-graduação em Inovação Terapêutica pelo

convívio e disponibilidade em atender minhas solicitações.

À Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE),

pelo incentivo e apoio financeiro.

A todos, muito obrigada!

"Mestre não é quem sempre ensina, mas

quem de repente aprende."

João Guimarães Rosa

RESUMO

A inflamação é uma resposta vital provocada por patógenos, danos físicos, isquemia,

injúrias tóxicas ou auto-imunes com o objetivo de proteger o organismo. É um processo

complexo, incluindo atividades de vários tipos de células e dezenas de mediadores

protéicos e lipídicos. A fase inicial da inflamação inclui mudanças no fluxo sanguíneo

local e acumulação de várias células inflamatórias (neutrófilos, células dendríticas,

monócitos, mastócitos e linfócitos). Posteriormente, patógenos, debris celulares e

células inflamatórias precisam ser removidas e a integridade e funcionamento normal do

tecido restaurado. Apesar do avanço no conhecimento da fisiopatologia da inflamação,

os medicamentos atuais ainda apresentam sérios efeitos adversos. Neste estudo, nos

propomos a avaliar a atividade anti-inflamatória e antinociceptiva de derivados indol-

imidazolidínicos (LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56) e determinar as concentrações do TNF-

α e IL-1β no exsudato inflamatório de animais tratados com os compostos em estudo.

Para a avaliação da atividade anti-inflamatória, foram utilizados testes da fase aguda

como, bolsão de ar subcutâneo, peritonite e pleurisia induzidos por carragenina e

permeabilidade vascular induzida por ácido acético. Para avaliação do efeito

antinociceptivo foram realizados os ensaios da nocicepção induzida por ácido acético,

formalina e placa quente. No teste do bolsão de ar os melhores resultados foram obtidos

com o LPSF/NN-52 (10mg/kg) e LPSF/NN-56 (3mg/Kg) com inibição da migração

leucocitária de 72 e 81%, respectivamente em relação ao grupo controle. A

indometacina (10mg/kg; 87% de inibição) foi usada como fármaco de referência. Na

peritonite, os compostos LPSF/NN-52 (10mg/kg) e LPSF/NN-56 (3mg/kg) inibiram a

migração leucocitária em 56 e 55%, respectivamente, em relação ao controle. O

fármaco padrão indometacina apresentou inibição de 58%. Em relação à avaliação das

citocinas pró-inflamatórias em ambos os testes, as substâncias em estudo diminuíram a

concentração de TNF-α e IL-1β. No teste da pleurisia, as substâncias também inibiram a

migração leucocitária LPSF/NN-52 (49%) e LPSF/NN-56 (39%) em relação ao grupo

controle, porém sua inibição foi inferior aos padrões dexametasona (71%) e

indometacina (65%). Os compostos testados diminuíram a permeabilidade vascular

induzida por ácido acético. Na nocicepção induzida por ácido acético, as substâncias

apresentaram diminuição no número de contorções abdominais em relação ao grupo

controle, onde o LPSF/NN-52 inibiu a nocicepção em 52% e LPSF/NN-56 inibiu 63%.

O padrão para este teste foi o diclofenano (68%). No teste da formalina, os compostos

testados apresentaram efeitos apenas na segunda fase. No teste da Placa quente nenhum

dos derivados apresentou inibição da nocicepção. Desta forma, os resultados indicam

que os derivados indol-imidazolidínicos testados apresentaram atividade anti-

inflamatória e antinociceptiva promissoras, provavelmente através da modulação do

sistema imune. Sugere-se que a atividade antinociceptiva dos derivados indol-

imidazolidínicos seja decorrente de mecanismos periféricos, atuando apenas na dor

inflamatória.

Palavras-chave: Atividade Anti-inflamatória, Atividade Antinociceptiva,

Imidazolidinas.

ABSTRACT

Inflammation is a vital response caused by pathogens, physical damage, ischemia, or

toxic insults autoimmune diseases in order to protect the body. It is a complex process,

including activities of various kinds of cells and dozens of protein and lipid mediators.

The initial phase of inflammation include changes in the flow local blood cells and

accumulation of several inflammatory (neutrophils, dendritic cells, monocytes,

lymphocytes and mast cells). Subsequently, pathogens, cellular debris and inflammatory

cells need to be removed and the integrity and functioning restored normal

tissue. Despite the advances in knowledge of the pathophysiology of inflammation,

current drugs also have serious effects adverse. In this study, we propose to evaluate the

anti-inflammatory activity and antinociceptive of derived indole-imidazolidine

(LPSF/NN-52 and LPSF/NN- 56) and determine the concentrations of TNF-α and IL-1β

in exudates of animals treated with compounds. To evaluate the anti- inflammatory

activity, were used air pouch, peritonitis and pleurisy induced by carrageenin and

vascular permeability induced by acetic acid. For evaluation of the antinociceptive,

assays performed were the nociception induced by acetic acid, formalin and hot plate. In

test air pocket the best results were obtained with the LPSF/NN-52 (10mg/kg) and

LPSF/NN-56 (3 mg / kg) with inhibition leukocyte migration of 72 and 81%,

respectively compared to control group. Indomethacin (10mg/kg; 87% inhibition) was

used as reference drug. In peritonitis, the compounds LPSF/NN-52 (10mg/kg) and

LPSF/NN-56 (3mg/kg) inhibited leukocyte migration in 56 and 55% respectively,

compared to control. The standard drug indomethacin showed inhibition of

58%. Regarding the assessment of pro-inflammatory cytokines in both tests,

the substances under study decreased the concentration of TNF-α and IL-1β. In the test

of pleurisy, the substances also inhibited leukocyte migration LPSF/NN-52 (49%) and

LPSF/NN-56 (39%) compared to control group, but was inferior to its

inhibition patterns dexamethasone (71%) and indomethacin (65%). The compounds

tested decreased vascular permeability induced by acetic acid. In nociception

induced acetic acid, substances decreased the writhing in relation to group control,

where the LPSF/NN-52 inhibited nociception in 52% and LPSF/NN-56 inhibited

63%. The standard for this test was diclofenac (68%). In the formalin test, the

compounds presented effects only in the second phase of inflammation. In the hot

plate test, the derivatives did not inhibit nociception. Thus, the results indicate that the

indole-imidazolidine derivatives tested showed anti-inflammatory and antinociceptive

activity promising, probably through modulation of the immune system. It is suggested

that the activity antinociceptive of indole-imidazolidine derivatives is due to peripheral

mechanisms, acting in only inflammatory pain.

Keywords: Anti-inflammatory activity, antinociceptive activity, indol-imidazolidines.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Mecanismo específico da dor nociceptiva (A) e dor inflamatória

(B) adaptado (WOOLF, 2004).

31

Figura 2 : Cascata da inflamação e atuação dos antiinflamatórios

32

Figura 3: Hidantoína (imidazolidina-2,4-diona).

34

Figura 4: Estrutura básica dos derivados 5-benzilideno-2-tioxo

imidazolidin-4-ona.

35

Figura 5: Estrutura geral dos derivados 3-(3-alkil-2,6-diarilpiperina-4

ilidena)-2-tioxoimidazolidina-4-onas.

36

Figura 6: 2,4-dioxi-1,3-difenil-7,8-benzo-6-etil-9-(2-feniletil)-1,3,6,9-

tetrazaspiro[4.4]nonano.

36

Figura 7: Esquema de síntese dos derivados 5-arilideno hidantoína.

38

Figura 8: (Z)-3-(4-cloro-benzil)-5-(4-nitro-benzilideno)-imidazolidina-

2,4-diona.

38

Figura 9: (1) (Z)-5-((1-Benzil-5-metil-1H-indol-3-yl)metileno)imidazo-

lidina-2,4-diona e (2) (Z)-5-((1-Benzil-5-metil-1H-indol-3-yl)metileno)

imidazolidina-2,4-diona.

39

Figura 10: (1) 1-[4-oxo-8-(3-clorofenil)-4,6,7,8-tetrahidroimidazol[2,1-

c][1,2,4]triazin-3-il] ; (2) 1-[4-oxo-8-(3,4-diclorofenil)-4,6,7,8-

tetrahidroimidazol[2,1 c][1,2,4]triazin-3-il].

39

Figura 11: Esquema reacional dos derivados indol-imidazolidínicos

LPSF/NN-52 e LPFS/NN-56.

44

Figura 12: Concentração de TNF-α (A) e IL-1β (B) em exsudato no teste

de Bolsão de Ar.

56

Figura 13: Concentração de TNF-α (A) e IL-1β (B) em exsudato no teste

de peritonite induzida por carragenina.

58

Figura 14: Efeito dos compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 no teste da

permeabilidade vascular induzida por ácido acético.

60

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Nome químico e características físico-químicas dos derivados

indol-imidazolidínicos LPSF/NN-56 e LPSF/NN-52

45

Tabela 2: Evolução do peso corporal, consumo de ração, água e índice

dos órgãos dos animais tratados com os derivados indol-imidazolidínicos

LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 em relação ao grupo controle.

54

Tabela 3: Total de Leucócitos polimorfonucleares - PMNL (média

desvio padrão) e percentual de inibição da inflamação dos grupos controle e

tratados com os derivados indol-imidazolidínicos LPSF/NN-52 e

LPSF/NN-56.

55

Tabela 4: Número de PMNL e percentual de inibição da inflamação pelos

derivados indol-imidazolidínicos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 no teste da

peritonite induzida por carragenina.

57

Tabela 5: Avaliação do total de Leucócitos polimorfonucleares - PMNL e

percentual de inibição da inflamação dos grupos controle e tratados com

NN-52 e NN-56 no teste de Pleurisia induzida por carragenina.

59

Tabela 6: Número de contorções abdominais e percentual de inibição dos

derivados indol-imidazolidínicos no teste de contorções abdominais

induzidas por ácido acético.

60

Tabela 7: Tempo de latência ao estímulo térmico no teste da placa quente

após tratamento oral com os compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56.

61

Tabela 8: Efeito dos derivados indol-imidazolidínicos LPSF/NN-52 e

LPFS/NN-56 no teste de nocicepção induzida por formalina.

62

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

A549 Adenocarcinoma de células alveolar humana

AINES Anti-inflamatórios não Esteroidais

ANVISA Agencia Nacional de Vigilância Sanitária

CCR5 Receptor do tipo 5 para quimiocinas

CD4 “Cluster” de diferenciação 4

CI50 Concentração que produz 50 % de inibição no crescimento celular

COX Cicloxigenase

DL50 Dose letal (50%)

DMSO Dimetil sulfóxido

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

H 460 Linhagem celular de adenocarcinoma de efusões pleurais

HIV Vírus da imunodeficiência Humana

HSF Células fibroblásticas epitelial humana

IASP Associação Internacional do Estudo da Dor

IFN- γ Interferon γ

IL Interleucina

L 1210 Células de leucemia murina

LPS Lipopolissacarídeo

LS 180 Linhagem celular de adenocarcinoma de cólon

MCF-7 Linhagem celular de adenocarcinoma de mama humano

MDA-231 Linhagem celular de adenocarcinoma de mama humano

MIC Concentração Inibitória Mínima

MTT ([brometo de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazólio])

NK Células Natural Killer

NKA Neurocina A

NO Óxido nítrico

OECD Organization for Economic Cooperation and Development

PBS Solução tampão fosfato

PGE2 Prostaglandina E2

PGG2 Prostaglandina G2

PGH2 Prostaglandina H2

PGI2 Prostaciclina

PMNLs Leucócitos Polimorfonucleares

PPARr Receptores Ativados Por Proliferadores De Peroxissomos

Pt Platina

RDC 48 Resolução da Diretoria Colegiada de número 48

SiHa Linhagem celular de câncer de útero

scPTZ Pentilenotetrazol subcutâneo

T 470 Linhagem celular de carcinoma de mama

TGF Fator Transformador de Crescimento

TNF-α Fator de Necrose Tumoral alfa

TXA2 Tromboxano A2

TZDs Tiazolidinadionas

SUMÁRIO

RESUMO

ABSTRACT

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

1 INTRODUÇÃO 20

2 JUSTIFICATIVA 23

3 REVISÃO DA LITERATURA 24

3.1 Fisiopatologia da Inflamação 25

3.1.1 Inflamação Aguda 25

3.1.2 Inflamação Crônica 26

3.1.3 Resposta Imune e Inflamação 27

3.1.4 Citocinas 28

3.2 Fisiopatologia da Dor 28

3.2.1 Dor inflamatória 30

3.3 Anti-inflamatórios esteroidais e não-esteroidais 31

3.4 Propriedades Biológicas das Imidazolidinas 34

3.4.1 Atividades Anti-inflamatórias 34

3.4.2 Atividade Antifúngica 35

3.4.3 Atividade antibacteriana 36

3.4.4 Atividade esquistossomicida 37

3.4.5 Atividade Citotóxica 38

3.5 Propriedades Biológicas dos derivados indólicos 40

4 OBJETIVOS 42

4.1 Geral 42

4.2 Específicos 42

5 MATERIAIS 44

5.1 As Substâncias 44

5.2 Equipamentos 45

5.3 Material de Consumo 45

5.4 Animais Experimentais 46

6 MÉTODOS 46

6.1 Procedimentos Éticos 47

6.2 Toxicidade 47

6.3 Atividade Anti-inflamatória 47

6.3.1 Método do Bolsão de Ar Subcutâneo 48

6.3.2 Peritonite Induzida por Carragenina 48

6.3.3 Pleurisia Induzida por Carragenina 49

6.3.4 Determinação dos Níveis de Citocinas (TNF-α e IL-1β) 49

6.3.5 Permeabilidade Vascular Induzida por Ácido Acético 49

6.4 Atividade Antinociceptiva 50

6.4.1 Nocicepção Induzida por Ácido Acético 50

6.4.2 Método da Placa Quente 50

6.4.3 Nocicepção induzida por formalina 51

6.5 Variáveis Analisadas 51

6.6 Análise dos Dados 52

7 RESULTADOS 54

7.1 Toxicidade Aguda 54

7.2 Método do Bolsão de Ar Subcutâneo 54

7.2.1 Dosagem das Citocinas TNF-α e IL-1β (Método do Bolsão de Ar) 55

7.3 Peritonite Induzida por Carragenina 57

7.3.1 Dosagem das Citocinas TNF-α e IL-1β (Método da Peritonite) 57

7.4 Pleurisia Induzida por Carragenina 58

7.5 Permeabilidade Vascular Induzida por Ácido Acético 59

7.6 Nocicepção Induzida por Ácido Acético 60

7.7 Teste da Placa Quente 61

7.8 Nocicepção induzida pela formalina 61

8 DISCUSSÃO 64

9 CONCLUSÕES 71

REFERÊNCIAS

ANEXOS

APÊNDICES

INTRODUÇÃO

20

1. INTRODUÇÃO

A inflamação pode ser classificada na dinâmica de sua resposta como aguda ou

crônica. Cada fase tem um perfil celular característico: neutrófilos, células dendríticas e

macrófagos na fase aguda, e na fase crônica, mononucleares tais como macrófagos,

linfócitos e mastócitos são predominantes. Inflamações como hepatite aguda, mordida

de insetos ou reações na pele são caracterizadas por uma resposta inicial imediata, onde

após a detecção de antígenos e/ou danos, neutrófilos são imediatamente recrutados para

o sítio por sinais quimioatraentes, seguido pela invasão de monócitos/macrófagos que se

torna o principal tipo de células após 48 horas (GARCIA-PASTOR et al.,1999;

FRÖDE; MEDEIROS, 2001; KIRVESKARI et al., 2003; RANKIN, 2004).

O papel dos neutrófilos é fagocitose de antígenos que são degradados dentro das

células através de processos enzimáticos. A ativação de neutrófilos leva a secreção de

citocinas que amplifica a resposta inflamatória e resulta num infiltrado linfocitário e

também em mudanças vasculares, edema e destruição enzimática. O objetivo da fase

aguda é a eliminação total dos antígenos. Entretanto, a definição começa já durante a

fase inicial da resposta inflamatória. Granulócitos migram no sítio inflamado e

promovem a ativação do ácido araquidônico e metabólitos dos leucotrienos pela

lipoxina. Outros mediadores lipídicos tais como as resolvinas e protectinas iniciam a

apoptose dos neutrófilos. Macrófagos que eliminam neutrófilos apoptóticos também

estimulam a resolução pela liberação de citocinas anti-inflamatórias, tais como o TGF-

beta. Se o balanço entre inflamação e resolução é quebrado, pode levar a inflamação

crônica (FRÖDE; MEDERIROS, 2001; BERGER; MOLLER, 2002; SZÉLES;

TÖRÖCSIK; NAGY, 2007).

No processo inflamatório, células como leucócitos, plaquetas, células do

endotélio vascular, mastócitos e células do sistema nervoso periférico produzem uma

série de substâncias endógenas, também denominadas de mediadores químicos da

inflamação: serotonina, produtos da cascata do ácido araquidônico, adenosina,

histamina, neuropeptídios como a susbstância P e citocinas. Estes mediadores

promovem uma alteração no mecanismo de transdução periférica do estímulo

nociceptivo, que por sua vez, aumenta a sensibilidade de transdução dos nociceptores,

com conseqüente redução no limiar de percepção do estímulo doloroso e aumento da

21

sensibilidade a dor (CARVALHO; LEMÔNICA, 1998; BONICA; YAKSH;

LIEBESKIND, 1990; MEYER; CAMPBELL; RAJA, 1994).

Os compostos hidantoínicos (que possuem o anel imidazolidínico) despertam

grande interesse devido, sobretudo, à sua ocorrência na natureza, por sua reatividade

química, tendo consequente afinidade por biomacromoléculas e por apresentar inúmeras

propriedades biológicas importantes para o desenvolvimento de fármacos. Modificações

estruturais no anel imidazolidínico, conferem a molécula uma variedade de atividades

farmacológicas tais como: anti-inflamatória, antifúngica, antibacteriana, hipoglicêmica,

esquistomicida, citotóxica entre outras (OLIVEIRA, et al., 2008; MALTA, 2005;

REDDY et al., 2010).

Apesar da eficácia clínica dos anti-inflamatórios não esteroidais (AINES), os

seus efeitos colaterais como intolerância gástrica, toxicidade renal e aumento da

incidência de doenças cardiovasculares representam um grande obstáculo na terapêutica

(SIMONS; WAGNER; WESTOVER, 2000; VOGIAGIS et al., 2001; PATRONO;

ROCA, 2009). Encontrar substâncias eficazes e com baixa toxicidade levam os

pesquisadores a uma busca incansável por novos fármacos. Entre os métodos de

pesquisa, os processos de modificação molecular são os mais promissores (BARREIRO

et al., 2002; AMARAL; MONTANARI, 2002).

Portanto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o potencial anti-

inflamatório a antinociceptivo de derivados indol-imidazolidinicos como novos

protótipos para o desenvolvimento de fármacos anti-inflamatórios a analgésicos.

JUSTIFICATIVA

23

2. JUSTIFICATIVA

Os anti-inflamatórios são fármacos utilizados no tratamento e alívio dos

sintomas de uma série de doenças inflamatórias, tais como artrite reumatóide, febre

reumática, osteoartrite, artrite psoriática, lúpus eritomatoso, dentre outras. O mal que as

doenças inflamatórias crônico-degenerativas causam a população e os relatos na

literatura que atribuem efeitos adversos a alguns anti-inflamatórios não esteroidais

justificam a importância de buscar novos fármacos anti-inflamatórios.

O desenvolvimento na área da síntese orgânica proporcionou o aumento de

substâncias sintéticas que são utilizadas na terapêutica no combate, prevenção e controle

de doenças, infecciosas, e crônico-degenerativas, prevenindo assim seu agravamento, e

proporcionando o aumento do tempo da sobrevida em caso de doenças terminais

(GORDON et al., 1994).

Os compostos que possuem o anel imidazolidínico despertaram interesse por

apresentar grande reatividade química e afinidade por biomacromoléculas. Estas

características lhes conferem uma gama de propriedades que inclui: atividade anti-

inflamatória, antinociceptiva, atividade antifúngica, antibacteriana e esquistomicida

(OLIVEIRA et al., 2008).

Por outro lado, o núcleo indol faz parte de uma classe importante de fármacos

anti-inflamatórios não-esteroidais que tem como protótipo a indometacina, que é

potente e eficaz no combate a inflamação, entretanto apresenta vários efeitos colaterais,

dentre eles a intolerância gástrica.

Neste contexto podemos ressaltar a importância da síntese de compostos

híbridos, tendo como base o núcleo indol-imidazolidínico como candidato a protótipo

para desenvolvimento de fármacos para o alívio ou tratamento dos sintomas da

inflamação e da dor.

REVISÃO DE

25

LITERATURA

3. REVISÃO DE LITERATURA

3.1. Fisiopatologia da Inflamação

O processo inflamatório é um dos mecanismos mais antigos que existe no organismo

animal para sua defesa quando há uma invasão de microrganismos patogênicos. Celsius (30

a.C. – 38 d.C.) propôs os quatro sinais clássicos da inflamação: rubor, tumor, calor e dor.

Muitos anos depois, Virchow (1821-1902), descreveu o quinto sinal clássico da inflamação,

que é a perda de função do órgão ou tecido inflamado (WEISSMAN, 1992; HEIDLAND et

al., 2006).

A resposta inflamatória é uma propriedade essencial para a sobrevivência de um

organismo. Esta capacidade dos seres vivos em responder defensivamente a estímulos lesivos

ocorre de forma cada vez mais complexa, à medida que aumenta a especialização biológica

(CUZZOCREA, 2005). Uma inflamação pode ocorrer a partir de diversas injúrias: traumas no

tecido, invasão de bactérias, vírus ou parasitos, presença de complexos imunes, entre outros

(CUNHA et al., 2003). Para que haja resposta do organismo lesionado a estas diversas

injúrias, mediadores bioquímicos são sintetizados, como: histamina, serotonina, enzimas

lisossomais, prostaglandinas, leucotrienos, fatores ativadores de plaquetas, citocininas, óxido

nítrico, o sistema complemento, bradicininas, os fatores de coagulação e fibrinólise)

(CUZZOCREA, 2005; WANG; ALJAROUDI; NEWBY, 2005; SARKAR; FISHER, 2006).

A inflamação poderá ser aguda ou crônica dependendo do tempo de permanência do processo

inflamatório no organismo.

3.1.1. Inflamação Aguda

A inflamação aguda é a reação imediata do organismo frente a um estimulo físico,

químico ou biológico, onde mediadores de defesa são sintetizados e direcionados ao local da

lesão. Essa resposta geralmente é breve, podendo durar alguns minutos, horas, ou até mesmo

26

alguns dias. O principal objetivo da reação inflamatória é possibilitar ao tecido lesado o

acesso de células, proteínas e outros elementos originários do sangue para que haja reparação

do tecido lesionado. Segundo Contran et al. (2005), o processo inflamatório agudo pode ser

dividido em uma sequência de eventos. Primeiramente há uma lesão em um organismo,

fazendo com que este produza mediadores inflamatórios. Depois há um aumento do fluxo

sanguíneo local, devido à retração de células endoteliais, promovendo a vasodilatação. Assim

estes mediadores inflamatórios podem ter acesso à região inflamada. Posteriormente o

extravasamento de macromoléculas plasmáticas, devido o aumento da pressão oncótica local,

promovendo a evasão de água e levando a formação do edema. Por ultimo a quimiotaxia de

leucócitos, caracterizando o processo inflamatório. (MAJNO, PALACE, 1961; SUFFREDINI

et al., 1999; MCDONALD; THURSTON; BALUK, 1999; COLLINS, 1999).

3.1.2. Inflamação Crônica

Algumas doenças crônicas se originam de inflamações agudas que evoluem em seus

sintomas, como por exemplo, infecções por microrganismos, tais como o Mycobacterium

tuberculosis, agentes de baixo grau de toxicidade, como sílica, algumas viroses e reações

auto-imunes. Uma inflamação é denominada crônica quando ocorre a persistência do estimulo

agressor, ocasionando uma destruição contínua dos tecidos e há tentativas de cicatrização por

reparo fibroso além de respostas auto-imunes (RODRIGUEZ-VITA; LAWRENCE, 2010;

COSSEUNS; WERB, 2002; DE MARZO et al., 2007).

Outro importante exemplo de inflamação crônica é o reumatismo, conjunto que

compreende mais de 150 doenças e síndromes que são em geral progressivas e associadas

com a dor. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), estima-se que no Brasil

existam mais de 15 milhões de pessoas acometidas por diversos tipos de doenças reumáticas.

A artrite reumatóide é uma doença que afeta as juntas, tendões, músculos e tecidos fibrosos,

ocasionando dores. Sua incidência é maior entre as mulheres com faixa etária de 20 a 40 anos

de idade (WHO, 2010).

A inflamação crônica se prolonga por períodos bem mais extensos que a inflamação

aguda e está associada com alguns processos específicos de alteração histológica como

fibrose e necrose do tecido afetado, proliferação de vasos sanguíneos e, principalmente, a

participação de linfócitos e macrófagos (FERREIRA; LORENZETTI; POOLE, 1993).

27

3.1.3. Resposta Imune e Inflamação

O sistema imune é responsável pelos processos de reparo tecidual como também pela

defesa do organismo. Os leucócitos atuam em momentos distintos da reposta imune. A

resposta imune pode ser classificada em imunidade não-específica (inata) e a específica

(adquirida) onde estes dois tipos de imunidade atuam de maneira independente. Na imunidade

inata as células atuantes são principalmente células fagocitárias mononucleares

(macrófagos/monócitos) e os granulócitos (ex. neutrófilos). No caso da imunidade adquirida,

além das células efetoras, há atuação dos linfócitos (linfócitos T e linfócitos B)

(KIRVESKARI et al., 2003).

Na imunidade inata, os macrófagos entram em ação secretando diversos mediadores,

tais como óxido nítrico (NO), citocinas (IL-1, IL-6, IL-12, TNF-α), quimiocinas (IL-8) entre

outros (KONSMAN et al., 2002). A indução para a ativação dos macrófagos pode ser tanto

pelo estímulo lesivo, agente infectante ou pela ação de outras citocinas, principalmente

interferon gama (IFN-γ) que são liberadas por linfócitos (WALKER et al., 1999; MARTÍN-

FONTECHA et al., 2004). Dentre estes mediadores que atuam como vasodilatadores e

contribuem para a migração leucocitária está a bradicinina. Esta também estimula a produção

de uma cascata de citocinas pró-inflamatorias (TNF-α, IL-8, IL-6 e IL-1β) como também a

liberação de prostaglandinas e aminas simpaticomiméticas que induzem a hipernocicepção e a

dor (CUNHA et al., 1992; VERRI et. al, 2007).

Na imunidade adquirida as células em atuação são os linfócitos. Estas células são

primeiramente produzidas no timo ou na medula óssea, depois sofrem amadurecimento nos

órgãos linfóides periféricos (baço, linfonodos e amigdalas), para então serem liberadas

durante a resposta imune (WALKER et al., 1999; MARTÍN-FONTECHA et al., 2004). Os

linfócitos T efetores (maduros), quando chegam ao local da injúria liberam diversas citocinas

(IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, TNF-α) e quimiocinas. Estas são responsáveis pela ativação de células

B, quimiotaxia de leucócitos, ativação dos macrófagos, deposição de fibrina e dor

(WATKINS et al., 1995).

28

3.1.4. Citocinas

As citocinas são um imenso grupo de moléculas que atuam regulando a resposta

inflamatória e imunológica, entre outros processos. São produzidas principalmente por

macrófagos após estimulação, por toxinas, lesão mecânica ou mediadores inflamatórios

(ZHANG, 2008).

Existem interleucinas anti-inflamatórias e pró-inflamatórias: as interleucinas IL-4, IL-

10, IL-13, IL-1ra (antagonista da interleucina-1) e o TGF-β1 (fator transformador de

crescimento-β1) são anti-inflamatórias, pois inibem a liberação de citocinas pró-inflamatórias

e reduzem a expressão da COX-2 (CUNHA, 2003). Já as interleucinas IL-6, IL-8, TNF-α e

IL-1β são pró-inflamatórias, migram e atuam na área lesionada, sinalizando a inflamação.

Estas interleucinas também estão associadas com a indução e manutenção da dor aguda e

crônica (CUNHA, et al., 2000; VALE et al., 2003)

Um dos principais papéis da IL-1β é aumentar a expressão das ciclooxigenases (COX-

1 e COX-2), induzindo a produção de prostaglandinas. Estas sensibilizam os nociceptores,

resultando em hipernocicepção/dor (VERRI et al., 2006). O uso de inibidores da

ciclooxigenase como a indometacina inibe o seu efeito álgico (DINARELLO et al., 1999).

O TNF-α é sintetizado e liberado no local da lesão a partir de diversas células, como:

macrófagos, linfócitos Th1, mastócitos, neutrófilos, eosinófilos, astrócitos, células natural

killers (NK) e células do sistema nervoso (MEYERS; ALBITAR; ESTEY, 2005). Além de

estar envolvido com o processo inflamatório e hipernocicepcao/dor, o TNF-α está relacionado

com a anorexia e outros sintomas (OMOIGUI, 2007; SACHS et al., 2002).

3.2. Fisiologia da Dor

Em 1996, a Associação Internacional para o Estudo da dor (IASP) definiu a dor como

"uma experiência sensorial e emocional desagradável associada a dano tecidual real ou

potencial, ou descrito nos termos de tal dano". A dor é uma experiência subjetiva, que não

pode ser facilmente medida. Ao descrever a dor como uma "experiência", podemos

29

diferenciá-la de nocicepção uma vez que a nocicepção é um processo neural que envolve a

transdução e transmissão de um estímulo nocivo para o cérebro, enquanto a dor é o resultado

de uma complexa interação entre sistemas de sinalização e a percepção única do indivíduo a

um estímulo (STEEDS, 2009).

A dor é o resultado de uma resposta física e psicológica a uma lesão. Um conjunto

complexo de vias transmite mensagens de dor a partir da periferia, através das fibras aferentes

primárias, para o sistema nervoso central (STEEDS, 2009). Os receptores nociceptivos são

representados pelas terminações nervosas livres presentes nas fibras mielínicas A-δ e

amelínicas C. A atividade dos nociceptores é modulada pela ação de substâncias algiogênicas

(SMIDERLE, 2008). Estas são responsáveis pela hiperalgesia termomecânica e pela

vasodilatação observada em lesões mecânicas, inflamatórias e isquêmicas.

Existem três mecanismos básicos para a percepção da dor: 1 ) transdução, que é o

processo de ativação dos nociceptores através da transformação de um estímulo nóxico

mecânico, térmico ou químico; 2) transmissão, conjunto de vias que permitem a propagação

do impulso nervoso, gerado ao nível de nociceptor, ao sistema nervoso central; 3) A

modulação, que é o processo de supressão da dor ativadas pelas próprias vias nociceptivas

(VANDERMEULEN, 2000)

Entre os receptores periféricos e o cérebro, existem duas vias mediadoras dos

estímulos dolorosos: a via neoespinotalâmica e a via paleoespinotalâmica (LÜLLMANN et

al., 2000). Através da via neoespinotalâmica, as sensações térmicas e dolorosas são trazidas

dos membros e do tronco do lado oposto ao do estímulo. Esta via medeia a sensação de dor

rápida e localizada (somatotropia) (ROCHA et al., 2007). Ao contrário da via

neoespinotalâmico, a via paleoespinotalâmico não tem organização somatotrópica, assim ela é

responsável pela dor profunda do tipo crônica, correspondendo à chamada dor em queimação

(LÜLLMANN et al., 2000).

A dor nociceptiva está relacionada à lesão de tecidos ósseos, musculares ou

ligamentares e ocorre por ativação fisiológica de receptores ou da via dolorosa (Figura 1 A).

Já a dor neuropática é o resultado da ativação anormal da via nociceptiva. É iniciada por uma

lesão ou disfunção do sistema nervoso. As principais doenças relacionadas a dor neuropática

são: diabetes mellitus, neuralgia pós-herpética, neuralgia trigeminal, dor regional complexa,

acidente vascular encefálico, esclerose múltipla, lesão medular, entre outros (BENETT et al.,

2006). As dores nociceptiva e neuropática muitas vezes podem coexistir, contudo, a dor

neuropática requer abordagens analgésicas específicas, diferentes das abordagens analgésicas

destinadas às dores nociceptivas (SMIDERLE, 2008).

30

3.2.1. Dor inflamatória

As células envolvidas no processo inflamatório produzem uma série de mediadores

químicos como bradicinina, serotonina, histamina; mediadores lipídicos como os produtos da

cascata do ácido araquidônico, além de citocinas. Estes mediadores promovem a

sensibilização dos nociceptores e consequentemente há diminuição no limiar de percepção do

estímulo doloroso (Figura 1 B) (CARVALHO; LEMÔNICA, 1998; BONICA; YAKSH;

LIEBESKIND, 1990; MEYER; CAMPBELL; RAJA, 1994)

A estimulação de nociceptores produz um reflexo axônico local, resultando na

liberação de neuropeptídios (substância P (SP) e neurocinina A (NKA), o que contribui para o

aumento do processo inflamatório e da hiperalgesia. Os neuropeptídeos liberados provocam a

vasodilatação, aumento da produção de enzimas lisossômicas, liberação de prostaglandinas e

interleucinas além da síntese do óxido nítrico (NO), estimulando e sensibilizando os

nociceptores (RANG et al., 2007).

Analgésicos periféricos também podem apresentar propriedades anti-inflamatória,

antipirética e antiagregante plaquetária, sendo denominados como agentes anti-inflamatórios,

uma vez que inibirem a liberação de prostaglandinas (RANG et al., 2007). Os anti-

iflamatórios não esteroidais, inibem o sistema enzimático COX, responsável pela síntese

de alguns eicosanóides (PGD2, PGE2, PGI2, TXA2), que medeiam o processo inflamatório

(BRUM-JÚNIOR, 2006).

31

Figura 1: Mecanismo específico da dor nociceptiva (A) e dor inflamatória (B) adaptado (WOOLF, 2004).

3.3. Anti-inflamatórios esteroidais e não-esteroidais

Os anti-inflamatórios esteroidais, também denominados de glicocorticóides ou

corticosteróides, fazem parte de um grupo de hormônios cujo mecanismo clássico de ação

envolve a interação com um receptor de glicocorticóides e a regulação da expressão de

proteínas (CASTRO; GODINHO, 2003). As drogas anti-inflamatórias esteroidais bloqueiam

a liberação de prostaglandinas pela inibição da atividade de fosfolipase A2, que interfere na

cascata do ácido araquidônico. Assim, indivíduos que utilizam este tipo de anti-inflamatório

por períodos prolongados ficam predispostos a infecções por seus efeitos imunossupressores

(MILLER, STANTON; DERERY, 2001). Segundo Castro e Godinho (2003) o uso

prolongado de derivados da cortisona também promove o aumento da pressão arterial devido

à retenção de sódio além de está relacionado com úlceras gástricas devido à inibição da

produção de prostaglandinas. As principais drogas desta classe são a dexametasona,

hidrocortisona, predinisolona e predinisona.

A. Dor Nociceptiva

B. Dor Inflamatória

Estímulos nociceptivos

Calor

Frio

Mecânica

Força

Química

Irritantes

Dor

Resposta autonômica

Reflexo de retirada

Cérebro

Cérebro

Inflamação

Macrófagos

Mastócitos

Neutrófilos

Granulócitos

Medula espinhal

Medula espinhal

Dano Tecidual Nociceptor

sensorial

Nociceptor

sensorial

Dores expontâneas

Dor hipersensitiva

Reduzir o limiar: alodinia

Aumento da resposta

32

Os anti-iflamatórios não esteroidais (AINES) estão entre os mais utilizados dentre

todos os agentes terapêuticos, devido a suas três principais ações farmacológicas: anti-

inflamatória, analgésica e antipirética. Na atualidade, já existem mais de 50 AINES diferentes

no mercado, contudo, nenhum deles se apresenta como fármaco ideal no controle e/ou na

modificação dos sinais e sintomas do processo inflamatório, principalmente aqueles que

ocorrem nas doenças articulares inflamatórias comuns (BOVILL, 2002; RANG et al., 2007).

Os AINES clássicos são aqueles que tratam o processo inflamatório através da inibição

não seletiva da enzima COX e tem mecanismo de ação além de estruturas químicas

completamente diferentes dos fármacos anti-inflamatórios esteroidais (Figura 2). Nesta classe

estão inclusos diversos grupos: salicilatos (está incluída a aspirina, o primeiro e mais popular

dos antiinflamatórios); derivados indolacéticos (indometacina e diclofenaco); derivados do

ácido propiônico (ibuprofeno e naxoprofeno); os fenamatos (ácido flufenâmico); alcanonas

(nabumetona); pirazolonas (fenilbutazona); oxicans (piroxican e meloxican); entre outros

(PALASKA et al., 2002).

Figura 2 : Cascata da inflamação e atuação dos antiinflamatórios

Estímulo

traumático

Corticóides

Ácido araquidônico

Fosfolipase A2

Lipoxigenase Cicloxigenase

Leucotrienos COX-1 COX-2

Prostaglandinas

Prostaciclinas

Tromboxanos

AINES

COXIB’s

Fosfolipídeos

33

Entretanto, estudos apontam uma série de reações adversas para os AINES, como por

exemplo: toxicidade gastrintestinal, alterações na função renal, “rashes” cutâneos, efeitos no

sistema nervoso central e infiltrados pulmonares (HAWKEY, 2001). Inicialmente pensou-se

que essas reações fossem apenas devido a efeitos locais e diretos dos AINES na mucosa

gatrointestinal, uma vez que o ácido aracdônico produz a desestabilização nos fosfolipídios de

membrana promovendo lesões gástricas por retrodifusão. Posteriormente observou-se efeitos

indiretos sob a cadeia da inibição da síntese das prostaglandinas (PGs) pelos AINES que

promove a diminuição na produção de PGE pela mucosa gastrintestinal, tendo como resultado

o aumento da secreção gástrica e a diminuição da produção de fatores protetores na barreira

mucosa superficial, gerando o processo de ulceração. Estudos apontam que 80 % das úlceras

gástricas estão associadas à infecção crônica com o Helicobacter pilori ou uso de AINES,

com ambos prejudicando as defesa gastrointestinais e persiste a acidez e outros fatores

nocivos que causem danos à mucosa (PÉREZ et al., 2002; MINCIS, 2003; CHAN;

GRAHAM, 2004).

Os efeitos adversos dos AINES, tanto os gástricos como os extragástricos, ocorrem

provavelmente devido às mesmas ações biológicas que os tornam anti-inflamatórios, ou seja,

a inibição da COX. Investimentos feitos na última década relacionados à elucidação das duas

isoformas COX-1 e COX-2, com a presença da COX-1, envolvida nos processos fisiológicos,

e COX-2 mais relacionada à produção induzida e exagerada de PGs, contribuiu de forma

efetiva para o desenvolvimento de novos alvos terapêuticos em doenças inflamatórias e

degenerativas, aumentando o interesse da indústria farmacêutica na busca de novos fármacos

antiinflamatórios (TURINI; DUBOIS, 2002).

O meloxican, AINE não específico, possui a habilidade de inibir a COX-2 dez vezes

mais que a COX-1, quando comparamos com o diclofenaco, piroxicam e naproxeno. Esse

AINE apresentou boa atividade analgésica e anti-inflamatória, alem de maior tolerabilidade

gástrica (RIOJA et al., 2002). A partir de estudos com este fármaco, surgiram os coxibs,

AINEs seletivos para a COX-2. Estes foram desenvolvidos com o intuito de prevenir os

efeitos adversos gastrintestinais dos AINEs clássicos, uma vez não há redução total de

prostaglandinas gastroprotetoras oriundas da COX-1, mantendo-se a eficácia anti-inflamatória

(SINGH et al., 2004).

Entre os coxibs, encontram-se os celecoxibe, rofecoxibe, eterocoxibe, lumiracoxibe,

paraminofenol, glicosaminoglicano, entre outros. Apesar da eficácia anti-inflamatória e da

baixa toxicidade gastrintestinal, estudos demonstraram que os inibidores seletivos da COX-2

podem induzir ou agravar hipertensão arterial, uma vez que promovem retenção de sais como

34

o sódio. O rofecoxibe, celecoxibe e valdecoxibe foram recolhidos do mercado por aumentar

os riscos cardiovasculares através de enfarte do miocárdio (RAO, CHEN; KNAUS, 2006;).

3.4. Propriedades Biológicas das Imidazolidinas

Os compostos que possuem o anel imidazolidínico são denominados quimicamente de

imidazolidina-2,4-diona ou apenas hidantoína. Esta molécula despertou grande interesse,

devido, sobretudo à sua ocorrência na natureza (DUTCHER, JOHNSON, BRUCE, 1945;

OLIVEIRA et al, 2008). A imidazolidina-2,4-diona sintetizada pela primeira vez por Klason

em 1890 está estruturalmente associada a 2-tioxo-imidazolidina-4-ona, sendo consideradas

bioisósteras, ou seja, ambas possuem atividade biologia semelhantes (Figura 3). As

hidantoínas e seus derivados estão sendo amplamente pesquisados desde sua descoberta por

Bayer, em 1861, (BATEMAN,1980) pois, apresentam inúmeras propriedades farmacológicas

importantes o que os coloca como potenciais novos fármacos.

N NH

X

Y H

H

H 12

3

4 5

(a) X= O, Y=O

Figura 3: Hidantoína (imidazolidina-2,4-diona).

Por sua reatividade química e consequente afinidade por biomacromoléculas, são

atribuídas ao núcleo hidantoínico diversas atividades biológicas. Os efeitos biológicos dos

derivados hidantoínicos, produzidos pelas modificações estruturais no anel imidazolidínico,

possuem uma enorme diversidade tais como, anti-inflamatória (UNANGST et. al., 1993;

MALTA et. al., 2005), antifúngica (CARVALHO et al., 1989), antibacteriana (LEACH et al.,

1947; COURVALIN et al., 1990; LIMA et al., 1992), regulador seletivo dos receptores

androgênicos (ZANGH, et al, 2006), esquistomicida (PITTA, et al., 2006; OLIVEIRA, et al.,

2004), hipoglicêmica (ROY et al., 1960), herbicida (CEGAN; VECERA, 1984), citotóxica

(REDDY et al., 2010), tuberculostática (KIEC-KONONOWICZ; SZYMANSKA, 2002)

entre outras. O núcleo imidazolidínico também está presente em medicamentos que fazem

parte da relação de Medicamentos Essenciais da Organização Mundial de Saúde (World

35

Health Organization, 1999) e também da Relação Nacional de Medicamentos Essenciais

(BRASIL, 1999), como hipnóticos e anticonvulsivantes, pois estes possuem o análogo

estrutural fenitoína (5-etil-5-fenil-3-metil-imidazolidina-2,4-diona), amplamente utilizado na

terapêutica por suas propriedades antiepilépticas, conhecido comercialmente como Nirvanol®,

(OZKIRIMLI; HAMALI, 1995).

Serão apresentados a seguir alguns estudos recentes que relatam os efeitos

farmacológicos das hidantoínas destacando seu potencial como núcleo base para o

desenvolvimento de novos fármacos.

3.4.1. Atividades Anti-inflamatórias

Malta, em 2005, avaliou a atividade biológica de novos derivados bioisósteros das

séries 3-(4-bromo-benzil)-5-benzilideno-2-tioxo-imidazolidin-4-ona e 5-benzilideno-3-[2-

oxo-2-(4-bromo-fenil)-etil]-2-tioxo-imidazolidina-4-ona (Figura 4). Foram realizados testes

para a avaliação da atividade anti-inflamatória através das metodologias de edema de pata

induzido por carragenina e bolsão inflamatório, além da atividade antinociceptiva realizada

utilizando os testes de contorções abdominais induzidas por ácido acético, formalina e placa

quente. Os resultados obtidos mostraram que as moléculas testadas apresentam significativa

atividade anti-inflamatória e antinoceciptiva.

N

NO

S

CH

H

HR

Figura 4: Estrutura básica dos derivados 5-benzilideno-2-tioxo-imidazolidin-4-ona (MALTA, 2005)

3.4.2. Atividade Antifúngica

Thanusu et al. (2010), desenvolveram uma nova série de bi-hidridos heterocíclicos a

partir da junção dos núcleos piperidina e tioidantoina, 3-(3-alquil-2,6-diarilpiperina-4-il-

idena)-2-tioxoimidazolidina-4-onas (Figura 5), e sua atividade antifúngica foi avaliada frente

36

aos microrganismos Aspergillus flavus, Candida albicans, Candida 6 e Candida 51. Os

compostos sintetizados apresentaram resposta antifúngica efetiva em comparação ao

fluconazol (50 µg/mL) que foi utilizada como fármaco padrão. A concentração inibitória

mínima (MIC) em µg/mL, apresentou valores distintos para cada produto, estando a variação

de concentração das substâncias entre 6.25 e 100 µg/mL.

HNN

N

N

H

O

S

X

X

R1

R2

Figura 5: Estrutura geral dos derivados 3-(3-alkil-2,6-diarilpiperina-4-ilidena)-2-tioxoimidazolidina-4-onas

(THANUSU, 2010).

Uma nova série de derivados benzimidazol foi sintetizada por Küçükbay et al., (2003).

Os compostos foram avaliados quanto à atividade antifúngica in vitro frente à cepas de

Candida albicans e Candida tropicalis. Nove dentre os dezessete novos compostos

sintetizados indicaram inibição no crescimento das cepas. Entre os compostos testados, a 2,4-

dioxi-1,3-difenil-7,8-benzo-6-etil-9-(2-feniletil)-1,3,6,9-tetrazaspiro[4.4]nonano (Figura 6) foi

o composto mais eficaz com MIC = 50 µg/mL frente à C.albicanis e C. tropicalis.

N

N N

N

O

O

Ph

PhPhCH2CH2

PhCH2CH2

Figura 6: 2,4-dioxi-1,3-difenil-7,8-benzo-6-etil-9-(2-feniletil)-1,3,6,9-tetrazaspiro[4.4]nonano (KÜÇÜKBAY et

al., 2003)

3.4.3. Atividade antibacteriana

Szymanska et al. (2002), sintetizaram uma série de derivados 5-arilideno

hidantoína (Figura 7) com diversas substituções 5-cloroarilideno-2-amino e seu potencial

37

antimicrobiano foi avaliado. Estes pesquisadores obtiveram seus melhores resultados frente as

bactérias: Mycobacterium tuberculosis, Moraxella catarrhalis e Streptococcus pneumoniae .

Os derivados 2-Cloro- e 2,4-diclorobenzilideno mostraram-se inibidores do M. tuberculosis

(100% e 96%, respectivamente). O derivado hidantoínico 2,6-diclorobenzilideno apresentou

atividade significativa contra o M. catarrhalis com MIC = 20 µg/mL em comparação ao ácido

nalidíxico, que obteve MIC = 39 µg/mL. Os derivados hidantoínicos 2,6-dicloroarilideno

obtiveram resultados positivos frente ao S. pneumoniae. Observou-se que as moléculas

sintetizadas que não possuiam um substituinte amina houve uma redução de atividade

antibacteriana frente as cepas testadas.

CH

HNNH

O

S

CH3 J

Na, EtOH

CH

HNNH

O

SCH3

12

CH

NNH

O

HN

R1R1

R1

R2

(CH2)n

3a- y

Figura 7: Esquema de síntese dos derivados 5-arilideno hidantoina (SZYMANSKA et al., 2002).

3.4.4. Atividade esquistossomicida

Pitta et al. (2006) avaliaram a atividade esquistossomicida de derivados

imidazolidínicos. Os resultados in vitro com o S. mansoni mostram que os vermes foram mais

sensíveis aos derivados 3-benzil-5-(4-cloro-arilazol) -4-tioxo-imidazolidina-2-ona, numa

concentração de 58µM, que matou 100% dos vermes após 24 h de contato, causando

alterações na superfície do tegumento dos vermes com a formação de bolhas e “peeling”.

38

Na procura de novos compostos esquistossomicidas, Oliveira et al. (2004),

sintetizaram uma série de quimioterápicos derivados imidazolidínicos: (Z)-3-benzil-5-

benzilideno-imidazolidin-2,4-dionas, (Z)-3-benzil-5-benzilideno-2-tioxo-imidazolidin-4-onas

e (Z)-5-benzilideno-3-(2-oxo-2-fenil-etil)-2-tioxo-imidazolidin-4-onas, que possuem

substituintes diferentes na posição para dos anéis aromáticos. Este estudo mostrou que entre

os derivados testados o composto (Z)-3-(4-cloro-benzil)-5-(4-nitro-benzilideno)-

imidazolidina-2,4-diona (Figura 8), que contém um substituinte nitro no anel benzilideno foi a

molécula o que obteve a melhor atividade esquistossomicida in vitro.

N

NCH2 Cl

O

O

CH

NO2

H

Figura 8: (Z)-3-(4-cloro-benzil)-5-(4-nitro-benzilideno)-imidazolidina-2,4-diona (OLIVEIRA, et al., 2004).

3.4.5. Atividade Citotóxica

Reddy e colaboradores, em 2010, sintetizaram uma série de compostos hidantoínicos

com substituição (Z) -5 - (N-3-benzilindol ilmetileno) imidazolidina-2,4-diona (Figura 9), que

é um análogo estrutural da aplisinopsina, e que incorporam uma variedade de substituintes

indol e N-benzil. A aplisinopsina é um derivado indol proviniente de algas marinhas e é um

potente agente citotóxico frente a diversas linhagens de células. Estes análogos foram

avaliados quanto à sua atividade anti-proliferativa frente a MCF-7 e MDA-231, que são

linhagens de células cancerígenas da mama, como também frente a A549 e H460, que são

linhagens celulares cancerígenas de pulmão. Dentre os análogos, (Z)-5-((1-(2-Bromobenzil)-

1H-indol-3-yl)metileno)-imidazolidina-2,4-dione e (Z)-5-((1-Benzil-5-metil-1H-indol-3-

yl)metileno) imidazolidina-2,4-diona apresentaram valores IC50 de 4,4 e 5,2 µM,

respectivamente, em comparação com 5-fluorouracil (IC50 = 15,2 µg/lm) frente a linhagem

célular MCF-7. O que caracteriza os novos derivados hidântoínicos como candidato a drogas

anti-neoplásicas.

39

N

HN

NH

O

O

CH3

H

H

N

HN

NH

O

O

CH3

H

Br

1 2

Figura 9: (1) (Z)-5-((1-Benzil-5-metil-1H-indol-3-yl)metileno) imidazolidina-2,4-diona e (2) (Z)-5-((1-Benzil-

5-metil-1H-indol-3-yl)metileno) imidazolidina-2,4-diona (REDDY, et al., 2010)

Sztanke, et al. (2006), sintetizaram compostos hidantoínicos a partir do 1-(4-oxo-8-

aril-4,6,7,8-tetrahidroimidazol[2,1-c][1,2,4]triazin-3-il] (Figura 10). Foram avaliados em

relação a sua atividade antitumoral frente às linhagens LS180 (células de adenocarcinoma de

cólon), SiHa (células de câncer de útero) e T47D (células de carcinoma de mama). O

composto 1-[4-oxo-8-(3-clorofenil)-4,6,7,8-tetrahidroimidazol[2,1-c][1,2,4]triazin-3-il] foi o

que obteve melhor resultado frente a linhagem SiHa, com inibição do crescimento equivalente

a 41 e 52%, nas concentrações de 10 e 50 μgmL–1

, respectivamente. Já o composto 1-[4-oxo-

8-(3,4-diclorofenil)-4,6,7,8-tetrahidroimidazol[2,1 c][1,2,4]triazin-3-il] apresentou o maior

potencial para reduzir o crescimento das linhagens LS180 e SiHa apenas na dose mais elevada

(50 mg/ mL-1

). Foi observado que a razão de inibição de células cancerígenas é duas vezes

maior em relação à inibição de linhagens normais HSF (células fibrobláticas epitelial humana)

e Vero, (células do epitélio renal do macaco verde africano).

N

NN

N

COOC2H5O

Cl

N

NN

N

COOC2H5O

Cl

Cl

( 1 )( 2 )

Figura 10: (1) 1-[4-oxo-8-(3-clorofenil)-4,6,7,8-tetrahidroimidazol[2,1-c][1,2,4]triazin-3-il] ; (2) 1-[4-oxo-8-

(3,4-diclorofenil)-4,6,7,8-tetrahidroimidazol[2,1 c][1,2,4]triazin-3-il] (KRZYSZTEF, et al., 2006).

40

3.5. Propriedades Biológicas dos derivados indólicos

Moléculas que possuem o núcleo indol tem sido amplamente estudadas por

apresentarem propriedades biológicas como: anti-inflamatória (MOHAMAD et al., 1994;

MISRA et al., 1996; UCHÖA et al., 2004), anticonvulsivante (EL-GENDY et al, 1993),

cardiovascular (KUMAR, 1986), antibacteriano (DANDIA; SEHGAL; SING, 1993) entre

outras. O núcleo indol também está presente na Indometacina, medicamentos amplamente

utilizados na terapêutica por suas propriedades anti-inflamatória e antinociceptiva

reconhecidas.

OBJETIVOS

42

4. OBJETIVOS

4.1. Geral

Avaliar as atividades anti-inflamatória e antinociceptiva dos derivados indol-

imidazolidínicos 5-(1H-Indol-3-il-metileno)-2-tioxo-imidazolidin-4-ona (LPSF/NN-56) e 3-

(4-Bromo-benzil)-5-(1H-indol-3-il-metileno)-2-tioxo-imidazolidin-4-ona (LPSF/NN-52)

comonovos protótipos para o desenvolvimento de fármacos anti-inflamatórios e analgésicos.

4.2. Específicos

Realizar uma triagem farmacológica comportamental e determinação da DL50 dos

compostos LPSF/NN-52 e LSPF/NN-56.

Avaliar a atividade anti-inflamatória dos derivados imidazolidínicos LPSF/NN-52 e

LPSF/NN-56, utilizando modelos experimentais de inflamação aguda como bolsão de

ar, peritonite e pleurisia induzidas por carragenina e permeabilidade vascular induzida

por ácido acético;

Determinar as concentrações do TNF alfa e IL-1β no exsudato inflamatório de animais

tratados com os compostos em estudo nos modelos experimentais de bolsão de ar e

peritonite induzida por carragenina;

Avaliar a atividade antinociceptiva dos derivados imidazolidínicos LPSF/NN-52 e

LPSF/NN-56 nos modelos experimentais de nocicepção induzida por ácido acético,

nocicepção induzida por formalina e teste da placa quente.

MATERIAL E MÉTODOS

44

5. MATERIAL

5.1. Substâncias

Os derivados indol-imidazolidínicos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 foram fornecidos

pelos colaboradores do Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos da UFPE. Os

compostos foram obtidos através do esquema reacional mostrado na figura 11. As

características físico-químicas dos compostos estão descritas na tabela 1.

Figura 11: Esquema reacional dos derivados indol-imidazolidínicos LPSF/NN-52 e LPFS/NN-56

N

NH

S

O

CH

HN

H

CH C C

CN

O

OCH2CH3

N

H

N

NH

S

O

H

CH2Br Cl

N

NCH2

S

O

CH

HN

H

Br

NN-56

NN-52

45

Tabela 1: Nome químico e características físico-químicas dos derivados indol-imidazolidínicos LPSF/NN-56 e

LPSF/NN-52.

Fonte: BRANDÃO et al., 2007

5.2. Equipamentos

Balança analítica, câmara de fluxo laminar, câmara de CO2, centrífuga, analisador

hematológico, aparelho de ELISA e placa quente (INSIGHT).

5.3. Material de consumo

Kit de citocinas: Kit Mouse TNF-α Elisa (eBioscience) e Kit Mouse IL-1β Elisa

(eBioscience); Reagentes: éter etílico (Reagente Analítico Dinâmica), ácido acético glacial

C2H4O2 (VETEC), citrato de fentanila (Cristália), heparina sódica 5.000 ul/ml (Cristália),

evans blue (Sigma), HEMSTAB EDTA 15gl/dl (Labtest), cloridrato de ketamina (Vetbrands),

cloridrato de xilazina (Vetbrands); álcool iodado, álcool 70%, solução salina 9%, PBS, placas

de 96 poços; vidraria; seringas; agulhas; bisturis; luvas; máscaras; óculos de proteção.

Código Nome Químico Massa Ponto de

fusão

Índice de

Retenção

Rendimento

(%)

LSPF

NN-56

5-(1H-indol-3-il-

metileno)-4-tioxo-

imidazolidin-2-ona

243

285-287ºC 0,46 sistema

de eluição n-

hexano/AcOet

(7:3)

96%

LSPF

NN-52

3-(4- bromo-benzil)-

5-(1H-indol-3-il-

metileno)-4-tioxo-

imidazolidin-2-ona

410,02

217-218ºC 0,51 sistema

de eluição

CHCl3/MeOH

(95/05)

89%

46

5.4. Animais Experimentais

Foram utilizados camunongos albinos swiss (Mus musculus), pesando entre 20 e 25g -

provenientes do Biotério do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de

Pernambuco. Os animais foram acondicionados em gaiolas de polietileno com grades de aço

inoxidável e maravalha como cobertura, tendo acesso livre à água e ração balanceada,

mantidos num ambiente com temperatura de 22°C 2 e luminosidade controlada,

proporcionando um ciclo claro-escuro de 12 horas. Todos os animais foram submetidos a

jejum, com a retirada da ração cerca de 4 horas antes do início do experimento. Durante o

experimento os animais tiveram livre acesso à ingestão de água. Os animais forão mantidos de

acordo com as normas internacionais do Conselho de Laboratório de Animais Experimentais

(ICLAS).

6. MÉTODOS

6.1. Procedimentos éticos

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as normas sugeridas pelo

Colégio Brasileiro para Experimentação Animal (COBEA) e com as normas estabelecidas

pelo National Institute of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals. Este projeto

foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de

Pernambuco (CEUA-UFPE), sob protocolo de número 23076.017928/2010-25. Este projeto

encontra-se em concordância com as normas vigentes no Brasil, especialmente a Lei 9.605-

art. 32 e decreto 3.179- art. 17, de 21/09/1999, que trata da questão do uso de animais para

fins científicos.

47

6.2. Toxicidade

Para a avaliação da toxicidade dos derivados LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 foi utilizada

a metodologia recomendada pela Organisation for Economic Cooperation and Development

(OECD, 2001).

O teste de toxicidade aguda consistiu na administração da dose de 2000 mg/kg dos

derivados em estudo. Foram utilizados 3 grupos, cada um contendo três animais (fêmeas),

totalizando 9 animais para o experimento. Este procedimento foi realizado em duplicata. Não

havendo morte dos animais, a amostra não será considerada tóxica. Os derivados indol-

imidazolidínicos foram solubilizados em uma mistura de solução salina e Cremophor numa

concentração de 5% da solução e um grupo recebeu apenas o veículo. Após a administração

os animais foram observados continuamente nas primeiras duas horas e depois a cada 24

horas diariamente durante 14 dias, para a verificação de qualquer alteração comportamental

ou nas atividades fisiológicas. Os animais foram avaliados pelo método de screening

hipocrático, o qual verifica qualquer comprometimento do animal como: o estado de

consciência, disposição, atividade e coordenação do sistema motor e tônus muscular,

atividade do sistema nervoso central e autônomo do animal. Também foram observados o

consumo de água, ração e o peso dos órgãos (Fígado, Rim e Baço).

6.3. Atividade Anti-inflamatória

Para a avaliação da atividade antiinflamatória dos derivados indol-imidazolidínicos

LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 foram utilizados os ensaios de Bolsão de ar subcutâneo,

peritonite e pleurisia induzidos por carragenina. Os parâmetro avaliados foram a migração

celular e a concentração de citocinas no exsudato inflamatório. O teste da permeabilidade

vascular foi feito para determinar a exsudação plasmática.

48

6.3.1. Método do Bolsão de Ar Subcutâneo.

Inicialmente foi feita a indução de uma bolsa de ar no dorso dos animais através da

injeção de ar estéril. No primeiro dia, injetou-se 2,5 mL de ar estéril no dorso do animal,

repetindo-se o procedimento após 72 horas. No sétimo dia do ensaio os animais receberam,

por via oral, os derivados imidazolidínicos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 na, dose de 3mg/kg,

10mg/kg e 30mg/kg, estad doses foram determinada por Carmino e colaboradores, em 2008.

Foi administrado também por via oral indometacina (10mg/Kg) e um grupo controle recebeu

veículo (salina contendo 5% de cremophor). Após sessenta minutos, 1mL de uma solução de

carragenina a 1% foi injetado dentro da bolsa de ar. Decorridas 6 horas após a aplicação do

agente flogístico, os animais foram eutanasiados em câmara de CO2 e as bolsas lavadas com 3

mL de solução salina contendo EDTA como líquido de arraste. A contagem de leucócitos

totais foi realizada em analisador hematológico ABX micros 60 (KIM et al., 2006). Os

exsudatos foram centrifugados e uma alíquota do sobrenadante guardado a -20ºC para análise

das citocinas.

6.3.2. Peritonite Induzida por Carragenina

Os animais receberam os derivados imidazolidínicos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 nas

doses de 10mg/kg e 3mg/kg, respectivamente. Estas doses foram escolhidas de acordo com

ensaios prévios. A indometacina, droga anti-inflamatória não esteroidal, foi administrada via

oral na dose de 10mg/Kg. O grupo controle recebeu veículo (salina contendo 5% de

cremophor). Uma hora após o tratamento, a inflamação foi induzida por aplicação

intraperitoneal de 0,1 mL/10 g do agente flogístico carragenina (1% em salina). Quatro horas

após a indução da inflamação os animais foram eutanasiados em câmara de CO2, sendo

injetado na cavidade peritoneal 2 mL de solução salina contendo EDTA. A contagem de

leucócitos totais foi realizada em analisador hematológico micros 60 (PRASAD e GUPTA,

2005). Os exsudatos foram centrifugados e uma alíquota do sobrenadante guardado a - 20ºC

para análise das citocinas

49

6.3.3. Pleurisia Induzida por Carragenina

Os animais foram pré-tratados por via oral com LPSF/NN-52 (10mg/kg), LPSF/NN-

56 (3mg/kg), dexametasona (0,5mg/kg), indometacina (10mg/kg) ou veículo. Após uma hora,

os animais foram anestesiados com uma solução associada de Cloridrato de Ketamina e

Cloridrato de Xilazina, numa proporção de 1:1. A pleurisia foi induzida pela injeção

intrapleural de 0.1 mL de carragenina (1%) como previamente descrito (FRÖDE;

MEDEIROS, 2001). Após 4 h os animais foram sacrificados, o tórax aberto e a cavidade

pleural foi lavada com 1.0 mL de uma solução tampão fosfato estéril contendo heparina (20

IU/mL). A contagem total de leucócitos foi feita em analisador hematológico ABX micros 60.

6.3.4. Determinação dos Níveis de Citocinas (TNF-α e IL-1β)

Os exsudatos recolhidos do bolsão de ar subcutâneo e peritonite foram armazenados

em um freezer -20ºC para a determinação dos níveis de citocinas. A quantificação de IL-1β e

TNF-α desses exsudatos foi determinada pela técnica de ELISA sanduíche, utilizando Kits

específicos para camundongos, de acordo com as instruções do fabricante (eBioscience, San

Diego, Califórnia, EUA).

6.3.5. Permeabilidade Vascular Induzida por Ácido Acético.

Os efeitos das substâncias testes no aumento da permeabilidade vascular induzida por

ácido acético em camundongos foram determinados de acordo com o método descrito por

Whittle, 1964. Cada amostra em estudo foi administrada por via oral. Para os animais

pertencentes ao grupo controle, foi administrado o veículo. Uma hora após, cada animal foi

anestesiado com uma solução associada de ketamina e xilazina, numa concentração de 8:2,

por via intraperitoenal. Imediatamente foi injetado no plexo retro-orbital 0,2mL/camundongo

do corante Azul de Evans a 1% (Sigma, St. Louis, Missouri, USA). Em seguida, administrou-

se 0,5mL da solução de ácido acético (1%) na cavidade peritoneal. Após um intervalo de 30

50

minutos, os camundongos foram eutanasiados em câmara de CO2, a cavidade peritoneal foi

lavada com 2mL de salina, o exsudato foi coletado e centrifugado a 2000rpm durante 10min.

A absorbância do sobrenadante foi lida em filtro de 610nm com um leitor de ELISA (thermo

plate).

6.4. Atividade Antinociceptiva

Para a avaliação da atividade antinociceptiva dos derivados imidazolidínicos

LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 foram utilizados os ensaios de nocicepção induzida por ácido

acético, nocicepção induzida por formalina e placa quente.

6.4.1. Nocicepção induzida por ácido acético

Os animais receberam o tratamento via oral com os derivados imidazolidínicos

LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 nas doses de 10mg/Kg e 3mg/Kg, respectivamente; diclofenaco

na dose de 30 mg/Kg (substância padrão) e o grupo controle recebeu o veículo. Após uma

hora, o ácido acético 1% foi injetado (0,1mL/10g do peso do animal) na cavidade peritoneal

dos animais para induzir contrações da musculatura abdominal e/ou alongamento dos

membros posteriores. Dez minutos após a aplicação do ácido, os camundongos foram

colocados em gaiolas de polietileno transparentes, onde foram observados e registrou-se o

número de contorções abdominais durante 20 minutos. A porcentagem de inibição das

contorções abdominais foi calculada comparando a média de contorções do grupo tratado com

o a média de grupo controle (KOSTER, 1959).

6.4.2. Método da placa quente.

Vinte e quatro horas antes de se iniciar o teste, os animais foram submetidos ao

estímulo, sendo colocados sobre uma placa de alumínio aquecida à temperatura fixa (55±1°C)

para se determinar o cut-off. Os animais selecionados para o experimento foram aqueles que

levaram até 20s para manifestar resposta ao estímulo térmico. Esta resposta corresponde ao

51

ato de lamber as patas, pular ou sapatear. Os camundongos aptos a avaliação da atividade

antinociceptiva foram tratados, por via oral, com veículo ou com os derivados LPSF/NN-52 e

LPSF/NN-56 (nas doses de 10 mg/kg e 3mg/kg, respectivamente). O fentanil, escolhido como

padrão, foi administrado por via subcutânea no dorso dos animais. Uma hora após a

administração das substâncias, os animais foram submetidos ao estímulo térmico. As medidas

de latência foram realizadas nos tempos de 0, 60, 120 e 180 minutos após o tratamento oral

(IRWIN, 1968).

6.4.3. Nocicepção induzida por formalina

Para a avaliação da nocicepção induzida pela formalina os animais receberam por via

oral os compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 nas doses de 10 mg/kg e 3 mg/kg,

respectivamente, por via oral. Um grupo controle recebeu o veículo. O fentanil, utilizado

como padrão, foi administrado por via subcutânea no dorso dos animais. Quinze minutos após

a administração das subtâncias, foi injetado 20µL de formalina a 2,5% (formaldeído 0,92%

diluído em salina) na área subplantar da pata traseira direita dos animais. O tempo acumulado

em segundos que os animais permaneceram lambendo a pata foi medido em duas fases

distintas, sendo de 0 a 5 min (primeira fase) e 15 a 30 min (segunda fase), após a injeção de

formalina (VAZ et al, 1996; HUNSKAAR; HOLE, 1987).

6.5. Variáveis Analisadas

Neste estudo, foi analisada a migração de leucócitos polimorfonucleares (PMNL) e a

produção de citocinas pró-inflamatórias nos testes de avaliação da atividade anti-iflamatória.

Nos testes de atividade antinociceptiva, os animais foram submetidos a estímulos químicos e

térmicos no teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético e no teste da placa

quente, respectivamente. Para a atividade antinociceptiva, foi analisado o número de

contorções abdominais, o tempo de latência e de lambida na pata do animal.

52

6.6. Análise dos Dados

Os dados experimentais foram estatisticamente avaliados por meio da análise de

variância (ANOVA) de uma via, seguido pelo teste de Bonferroni com intervalo de confiança

de 95%, utilizando-se o software Graph Pad prism. 5.0. Valores de “p” menores que 0,05

(p<0,05) foram considerados como indicativos de significância.

RESULTADOS

54

7. RESULTADOS

7.1. Toxicidade aguda.

Neste experimento os animais receberam doses de 2000 mg/kg (v.o.) dos

derivados indol-imidazolidínicos. Durante a avaliação do screening hipocrático, os

grupos que receberam o tratamento apresentaram piloereção, ptose e sonolência, logo

após a gavagem, (na primeira hora de observação), entretanto, nenhum animal veio a

óbito em 24 horas. Não foi observada nenhuma variação significativa no peso, consumo

de ração e água em relação aos animais dos grupos controles durante 14 dias de

observação. Não houve diferença no peso dos órgãos e na análise macroscópica dos

mesmos. Os resultados indicam que os derivados em estudo apresentaram baixa

toxicidade, tendo o valor da DL50 estimado em 2500 mg/kg, sendo considerada segura.

Os resultados deste teste estão representados na tabela 2.

Tabela 2: Evolução do peso corporal, consumo de ração, água e índice dos órgãos (média ± desvio

padrão), dos animais tratados com os derivados indol-imidazolidínicos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 em

relação ao grupo controle.

Grupos Dose

(mg/Kg)

Consumo

de ração (g)

Consumo de

água (mL)

Peso dos Animais

Inicial/Final (g)

Índice dos órgãos

Baço Fígado Rim

LPSF/NN-52 2.000 12,5 ± 1,3 29 ± 2,9 20,13 - 25,6 0,007 0,060 0,006

LPSF/NN-56 2.000 15,0 ± 1,6 31 ± 4,7 21,03 - 30,6 0,011 0,069 0,006

Controle - 17,7 ± 1,1 30 ± 8,3 20,60 - 29,0 0,006 0,061 0,006

*p < 0,05. Significativos após análise de variância (ANOVA) de uma via seguida pelo teste de Bonferroni com

intervalo de confiança de 95%, quando comparados ao grupo controle (salina + cremophor 5%).

7.2. Bolsão de Ar Subcutâneo

Para a avaliação da atividade anti-inflamatória pelo método do bolsão de ar

subcutâneo, os compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 foram administrados, por via

oral, nas doses de 3, 10 e 30 mg/kg para ambas as substâncias com finalidade de definir

qual seria a melhor dose para a avaliação das demais metodologias. Os resultados da

atividade anti-inflamatória para este teste encontram-se na tabela 3. Todos os compostos

apresentaram atividade anti-inflamatória indicada por uma diminuição significativa na

migração celular quando comparados ao controle. Os resultados mostraram que para o

55

composto LPSF/NN-56 a melhor dose foi 3mg/kg inibindo 80,8% da migração celular.

Este composto não apresentou diferença significativa em relação ao fármaco utilizado

como padrão, indometacina (86,7% de inibição). O LPSF/NN-52 na dose de 10mg/kg

(72,1%), também apresentou inibição significativa da migração, contudo, foi inferior em

relação à inibição da indometacina (86,7%).

Tabela 3: Total de Leucócitos polimorfonucleares - PMNL (média desvio padrão) e

percentual de inibição da inflamação dos grupos controle e tratados com os derivados

imidazolidínicos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56.



7.2.1. Dosagem das citocinas TNF-α e IL-1β (Bolsão de ar)

A dosagem de citocinas TNF-α e IL-1β do exsudato inflamatório do teste do

bolsão de ar foi realizada através da técnica do ELISA sanduíche. Ambos os compostos

apresentaram uma diminuição significativa da produção de TNF-α, LPSF/NN-52

(488,32 pg/mL) e LPSF/NN-56 (218,70 pg/mL), quando comparados ao controle

(1096,47 pg/mL). O fármaco utilizado como padrão, indometacina, apresentou uma

concentração de TNF-α de 575,43 pg/mL. O exsudato do grupo tratado com o

LPSF/NN-56 (3mg/Kg) apresentou maior atividade na diminuição da concentração de

Tratamento Dose (mg/kg) N° de PMNL/mL (x106) Inibição %

LPSF/NN-52 3 6,88 ± 1,30* 56

10 4,36 ± 0,77* 72

30 6,24 ± 0,55* 60

LPSF/NN-56 3 3,00 ± 0,71* 81

10 5,36 ± 0,66* 66

30 6,70 ± 1,32 57

Indometacina 10 2,08 ± 0,46* 87

Controle - 15,64 ± 1,9 -

56

TNF-α em relação ao fármaco padrão utilizado neste estudo (Figura 12A). O LPSF/NN-

56 foi mais eficaz na redução do TNF-α que a indometacina.

Com relação à produção de IL-1β, ambos os compostos também diminuíram

a produção desta citocina quando comparados ao controle (870,96 pg/mL), onde o

LPSF/NN-52 apresentou concentração de 619,33 pg/mL e LPSF/NN-56 apresentou

concentração de 402,32 pg/mL. O fármaco utilizado como padrão, indometacina,

apresentou uma concentração de IL-1β de 134,89 pg/mL. O LPSF/NN-56 apresentou-se

mais ativo na diminuição da produção de ambas as citocinas do que o LPSF/NN-52

(Figura12B).

0

200

400

600

800

1000

1200Controle

Indometacina 10mg/Kg

LPSF/NN-52 10mg/Kg

LPSF/NN-56 3mg/Kg **

*

A

Grupos

TN

F-

(pg/m

L)

0

200

400

600

800

1000Controle

Indometacina 10mg/Kg

LPSF/NN-52 10mg/Kg

LPSF/NN-56 3mg/Kg

*

*

*

B

Groups

IL-1

(pg/m

L)

Figura 18: Concentração de TNF-α (A) e IL-1β (B) em exsudato no teste de Bolsão de Ar. *p < 0,05.

Significativos após análise de variância (ANOVA) de uma via seguida pelo teste de Bonferroni com intervalo

de confiança de 95%, quando comparados ao grupo controle (salina + cremophor 5%).

57

7.3. Peritonite Induzida por Carragenina

Para avaliar a possível participação de magrófagos residentes na resposta

mediada pelos derivados indol-imidazolidínicos foi feito o teste da peritonite induzida

por carragenina. Os resultados obtidos no teste da peritonite induzida por carragenina

estão representados na tabela 4. A análise dos dados demonstra que os compostos

LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 nas doses de 10mg/kg e 3mg/kg, respectivamente,

causaram uma redução significativa na migração de leucócitos polimorfonucleares. Não

houve diferença estatísticamente significante entre os dois derivados testados. O

fármaco de referência, indometacina inibiu a migração celular em 58%. A análise

estatística demonstra que os derivados indol-imidazolidínicos avaliados seguiram um

perfil semelhante ao da indometacina, não havendo diferença significativa na inibição

da migração celular entre eles.

Tabela 4: Número de PMNL (média desvio padrão) e percentual de inibição da inflamação pelos

derivados imidazolidínicos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 no teste da peritonite induzida por carragenina.

Tratamento Dose (mg/kg) N° of PMNL/mL

(x106)

Inibição %

LPSF/NN-52 10 4.80 ± 0.7 * 56

LPSF/NN-56 3 4.96 ± 0.9* 57

Indomethacina 10 4.62± 0.3* 58

Controle - 10.93± 1.6 -

*p < 0,005. Significativos após análise de variância (ANOVA) de uma via seguido pelo teste de Bonferroni

com intervalo de confiança de 95%, quando comparados ao grupo controle (salina + cremophor 5%).

7.3.1. Dosagem das citocinas TNF-α e IL-1β (Peritonite induzida pela carragenina)

A dosagem de citocinas TNF-α e IL-1β do exsudato inflamatório do teste da

peritonite foi realizada através da técnica do ELISA sanduíche. Ambos os compostos

apresentaram uma diminuição significativa da produção de TNF-α LPSF/NN-52 (91,1

pg/mL) e LPSF/NN-56 (144,3 pg/mL) quando comparados ao controle (794,3 pg/mL).

O fármaco padrão, indometacina, apresentou uma concentração de TNF-α de 1122.01

pg/mL, não inibindo a produção em relação ao controle (Figura 19A).

Com relação à produção de IL-1β, ambos os compostos também diminuíram a

produção desta citocina quando comparados ao controle (870,96 pg/mL), onde o

58

LPSF/NN-52 apresentou concentração de 274,15 pg/mL e LPSF/NN-56 apresentou

concentração de 167,49 pg/mL. O LPSF/NN-56 apresentou-se mais ativo na diminuição

da produção da citocina IL-1β do que o LPSF/NN-52 (Figura 19B).

0

200

400

600

800

1000

1200Control

Indometacin

LPSF/NN-52 10mg/Kg

LPSF/NN-56 3mg/Kg

*

**

A

Groups

TN

F-

(pg/m

L)

0

200

400

600

800

1000

1200Control

Indometacin 10mg/Kg

LPSF/NN-52 10mg/Kg

LPSF/NN-56 3mg/Kg

*

**

B

Groups

IL-1

(pg/m

L)

Figura 13: Concentração de TNF-α (A) e IL-1β (B) em exsudato no teste de peritonite induzida por

carragenina. *p < 0,05. Significativos após análise de variância (ANOVA) de uma via seguida pelo teste de

Bonferroni com intervalo de confiança de 95%, quando comparados ao grupo controle (salina +

cremophor 5%).

7.4. Pleurisia Induzida por Carragenina

Os resultados da atividade anti-inflamatória pelo método da pleurisia induzida

por carragenina encontram-se na tabela 5. Todos os compostos apresentaram atividade

anti-inflamatória indicada por uma diminuição significativa na migração celular quando

comparados ao controle negativo. Não há diferença significante entre os dois derivados

imidazolidínicos. Os compostos LPSF/NN-52 na dose de 10mg/kg (49% de inibição) e

59

LPSF/NN-56 na dose de 3mg/kg (39% de inibição) apresentaram atividade inferior ao

padrão utilizado (indometacina na dose de 10mg/kg; 65% de inibição).

Tabela 5: Total de Leucócitos polimorfonucleares - PMNL (média desvio padrão) e

percentual de inibição da inflamação dos grupos controle e tratados com NN-52 e NN-56 no

teste de Pleurisia induzida por carragenina.



7.5. Permeabilidade Vascular Induzida por Ácido Acético

Com o intuito de avaliar a participação de aminas vasoativas na resposta anti-

inflamatória dos derivados foi feito o teste de permeabilidade vascular. Os compostos

LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 produziram uma significativa inibição da permeabilidade

vascular induzida por ácido acético em relação ao grupo controle. Os derivados não

apresentaram diferença significativa entre si, porém apresentaram inibição da

permeabilidade inferior a da indometacina (Figura 14).

Tratamento Dose (mg/kg) N° de PMNL/mL (x106) Inibição %

LPSF/NN-52 10 4,34 ± 0,8* 49

LPSF/NN-56 3 5,22 ± 0,4* 39

Indometacina 10 3,02 ± 0,6* 65

Dexametasona 0,5 2,52 ± 0,5* 71

Controle - 8,57 ± 0,7 -

60

1

0

200

400

600

800

1000control

Indometacina (10mg/Kg)

LPSF/NN-52 (10mg/Kg)

LPSF/NN-56 (3mg/Kg)

*

* *

Groups

Absorb

ance (

nm

)

Figura 14: Efeito dos compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 no teste da permeabilidade vascular

induzida por ácido acético. *p < 0,005. Significativos após análise de variância (ANOVA) de uma via seguido

pelo teste de Bonferroni com intervalo de confiança de 95%, quando comparados ao grupo controle.

7.6. Nocicepção induzida por ácido acético

O teste do ácido acético é muito utilizado como triagem na avaliação de

compostos com atividade antinociceptiva. Os resultados da atividade antinociceptiva

dos derivados indol-imidazolidínicos no teste de nocicepção induzida por ácido acético

estão demonstrados na tabela 6. As substâncias testadas, LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56,

nas doses de 10mg/kg e 3mg/kg, respectivamente, promoveram redução significativa no

número de contorções abdominais em comparação ao grupo controle.

Tabela 6: Número de contorções abdominais (média desvio padrão) e percentual de inibição dos

derivados indol-imidazolidínicos no teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético.

*p < 0,005. Significativos após análise de variância (ANOVA) de uma via seguido pelo teste de Bonferroni com

intervalo de confiança de 95%, quando comparados ao grupo controle.

Tratamento Dose (mg/kg) Contorções abdominais

(nº/20min)

Inibição

%

LPSF/NN-52 10 40.0 3.5* 52

LPSF/NN-56 3 30.8 5.9* 63

Diclofenaco 30 26.8 4.9* 68

Controle - 83.54.8 -

61

7.7. Teste da placa quente.

Para verificar a participação de efeitos centrais na antinocicepção apresentada

pelos derivados indol-imidazolidínicos, foi feito o ensaio da placa quente. Os resultados

expressos na tabela 7 demonstram que apenas os compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-

56 nas doses testadas não apresentaram efeito antinociceptivo neste experimento.

Tabela 7: Tempo de latência (média desvio padrão) ao estímulo térmico no teste da placa quente após

tratamento oral com os compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56.



7.8. Nocicepção induzida pela formalina

Para confirmar os resultados anteriores, foi feito o teste da formalina, que

evidencia 2 fases: 0-5 mim (dor de origem central) e 15-30 mim (dor de origem

inflamatória). Os resultados expressos na tabela 8 indicam que os animais que

receberam tratamento oral com os compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56

apresentaram redução significativa do tempo de lamber a pata quando comparados ao

grupo controle.

Tempo de Latência (Minutos)

Compostos Dose(mg/Kg) 0 60 120 180

LPSF/NN-52 3 9,2 ±1,83 10,7±0,7 7,12 ±1,17 8,26±0,51

LPSF/NN-56 3 9,14 ± 0,65 10,66±1,75 11,28 ±01,69 10,88± 0,58*

Fentanil 0,2 9,54 ± 1,72 18,1±0,6* 11,3±0,9* 8,8±1,1

Controle (salina) - 9,30 ± 0,49 9,7 ± 1,42 8,84 ± 1,31 8,58 ± 1,48

62

Tabela 8: Efeito dos derivados imidazolidínicos LPSF/NN-52 e LPFS/NN-56 no teste de nocicepção

induzida por formalina.

Grupo Dose Tempo de Lambida (s)

(media ± desvio padrão) Inibição %

(mg/Kg) 0–5 min 15–30 min 0–5 min 15–30 min

LPSF/NN-52 10 46,5 ± 7,4 6,65 ± 3,9* 19,5 96

LPSF/NN-56 3 38,9 ± 5,6* 22,60 ± 14,2* 32,6 87

Fentanil 0,2 4,1±0,4* 5,8±0,5* 93,0% 97%

Controle ___ 57,8±4,1 177,9±13,9 ____ ____



DISCUSSÃO

64

8. DISCUSSÃO

Nos últimos anos, moléculas contendo os núcleos imidazolidínico e indol foram

apontadas como drogas promissoras para o tratamento da inflamação e da dor (MALTA,

2005; UCHÔA et al., 2009). Neste trabalho, os derivados indol-imidazolidínicos

LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 mostraram atividades anti-inflamatória e antinociceptiva

promissoras. No testes da toxicidade aguda, utilizando uma dose de 2.000 mg/kg, não

houve óbito dos animais. Os animais foram avaliados pelo método de screening

hipocrático, onde foi observado ptose, piloereção e sonolência na primeira hora de

observação dos animais. Não houve alteração significativa no consumo de água,

alimento, peso corporal e peso dos órgãos dos animais em relação ao grupo controle.

Este resultado sugere que as subtâncias em estudo possuem baixa toxicidade.

Nossos resultados estão de acordo com os estudos realizados por Malta (2005)

na avaliação da toxicidade aguda de uma série de derivados imidazolidínicos 5-

benzilideno-3-(4-bromo-benzil)- e 5-benzilideno-3-(4-bromo-fenacil)-2-tioxoimidazoli

din-4-onas na dose de 1000 mg/kg. Os animais apresentaram alguns sinais de

toxicidade, entretanto nenhum animal veio a óbito. De acordo com o Guia 423 (OECD,

2001), quando não ocorre óbito de nenhum animal ao ser administrada a dose de 2000

mg/kg, o valor da DL50 (dose suficiente para matar 50% dos animais) é dito acima de

2000 mg/kg ou entre 2000 e 5000 mg/kg, sendo considerada praticamente atóxica. O

mesmo protocolo não aconselha a realização do teste de toxicidade aguda utilizando a

dose de 5000 mg/kg, uma vez que é difícil a solubilização da substância e

administração, protegendo assim a vida do animal. Deve-se utilizar a dose de 5000

mg/kg, caso seja necessário em um estudo para garantir a qualidade da saúde humana.

Litchfield e Wilcoxon (1949) sugeriram que a DL50 para substâncias puras, seja

determinada quando a dose letal aproximada (DLA) for inferior a 2000 mg/kg.

A carragenina, agente flogístico utilizado em todos os modelos de atividade anti-

inflamatória destes estudo, é um polissacarídeo sulfatado, derivado de algumas espécies

de algas. Esta substância é amplamente utilizada em diversos estudos experimentais por

induzir a migração de neutrófilos e por ter uma intensa ação quimiotática (SZABÓ;

BECHARA; CUNHA et al., 2005). Ela desencadeia uma inflamação aguda associada à

hiperalgesia envolvendo liberação sequencial de vários mediadores inflamatórios, como

por exemplo a histamina, serotonina, cininas, prostaglandinas e tromboxanos

(OLIVEIRA, 2002; CARVALHO, 2008; DAMAS et al., 1990). Testes realizados em

65

ratos comprovam que a sensibilização das articulações com carragenina aumentou a

nocicepção, o edema e a resposta inflamatória celular, indicando que a esta substância

ativa um mecanismo endotelinérgico (DAHER, 2004).

O experimento do bolsão de ar subcutâneo é o modelo animal que mimetiza a

artrite reumatóide. Este teste é utilizado como triagem para potenciais candidatos a

fármacos no tratamento da artrite. A bolsa de ar previamente inoculada no dorso do

animal forma uma membrana com características semelhantes à membrana sinovial

inflamada de pacientes com artrite reumatóide (SEDGWICK; LEES, 1986). Os

compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56, apresentaram atividade anti-inflamatória

significativa neste ensaio, e esta atividade não foi dose-dependente. Com base neste

resultados, sugere-se que estas substâncias podem ser potencias candidatas a fármacos

anti-artríticos. A indometacina, fármaco padrão deste teste, é um anti-inflamatório não

esteroidal (AINES) derivado do ácido indolacético, que inibe a atividade da enzima

cicloxigenase, diminuindo também a síntese de prostaglandinas e tromboxanos a partir

do ácido araquidônico (JURNAR; BRUNE, 1990). Experimentos de bolsão de ar

realizados por Sayar e Melli (2005) comprovam que a indometacina é capaz de diminuir

a migração leucocitária.

O teste da peritonite tem por finalidade avaliar a migração leucocitária por meio

da contagem total de leucócitos que são liberados durante o processo da inflamação

aguda. Esse processo ocorre após a inoculação do agente flogístico via administração

intraperitoneal. Vários mediadores pró-inflamatórios estão envolvidos neste tipo de

inflamação aguda, como neuropeptídeos, prostaglandinas, NO e citocinas (DE

CASTRO FRANCA et al., 2007). As citocinas pró-inflamatórias atuantes neste modelo

são IL-1β, IL-6, IL-8 e TNF-α (PEREIRA, MEDEIROS, FRODE, 2006). A análise dos

dados neste experimento demonstra que os compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 nas

doses de 10mg/kg e 3mg/kg provocaram uma redução significativa na migração de

leucócitos polimorfonucleares. Segundo Szabó e colaboradores (2005), dentre os

modelos utilizados em estudos experimentais, a indução na migração de neutrófilos com

uso de carragenina por via intraperitoneal é modelo consagrado na investigação do

processo inflamatório agudo, por utilizar uma substância com intensa ação quimiotática.

Sabe-se que os AINES, como a indometacina, ao inibir a síntese de prostaglandinas, que

são substâncias vasodilatadoras, acarretam a redução de fluxo sanguíneo de forma a

comprometer a migração de PMNL para a região da inflamação.

66

A avaliação dos níveis de citocina foi realizada nos exsudatos obtidos nos testes

de bolsão de ar e peritonite induzida por carragenina. Os compostos em estudo

diminuíram a concentração de TNF-α e IL-1ß nos exutados inflamatórios. A IL-1ß

promove a expressão de moléculas de adesão, migração de leucócitos e aumento da

permeabilidade vascular, indicando que IL-1ß é um importante mediador pró-

inflamatório (HALLEGUA; WEISMAN, 2002). O TNF- α é uma citocina chave para a

resposta imune inata. O aumento da concentração desta citocina no organismo está

vinculada a uma série de doenças auto-imunes, como a artrite reumatóide. Com base

nos resultados obtidos podemos sugerir uma relação entre a diminuição da migração

celular e a redução na liberação destas citocinas pró-inflamatórias. Estudos descritos por

Yu et al. (2010), indicam que compostos hidantoínicos associados ao Zinco são potentes

inibidores da enzima precursora do TNF- α, o que torna o núcleo imidazolidínico um

alvo de pesquisa para novos anti-inflamatórios orais.

Estudos realizados por Das et al. (1998), descrevem a diferença entre os métodos

de bolsão de ar e peritonite induzida por carragenina. No método do bolsão de ar, os

neutrófilos são o tipo de célula em maior abundância. Estes são responsáveis pela

quimiotaxia. Na peritonite induzida pela carragenina existe uma quantidade elevada de

macrófagos e mastócitos. Estas células são atraídas ao local da inflamação pelas

citocinas pró-inflamatórias, principalmente IL-1β e TNF-α. Os resultados deste estudo

corroboram a utilização dos dois métodos distintos para avaliação da inflamação aguda;

podemos inferi que os compostos em estudo inibem a produção de mediadores por

neutrófilos e macrófagos, uma vez que apresentou ação nos testes do bolsão e peritonite,

respectivamente.

O modelo da pleurisia induzida por carragenina e caracterizado por duas fases

inflamatórias, uma aguda (4h) e uma crônica (48h), com diferentes mediadores

envolvidos. Ambas as fases estão associadas a uma acentuada reação inflamatória, nas

vias respiratórias, semelhante a que ocorre na asma humana (DALMARCO e FRÖDE,

2007). Estudos realizados por Frode, em 2000, comprovam que neste modelo

experimental existe a participação de citocinas com efeitos pró-inflamatórios (TNF-α,

IL-1β, IL-8) e anti-inflamatórios (IL-6, IL-10), com base nos resultados de que tanto

anticorpos-policlonais como citocinas-recombinantes, administrados diretamente na

cavidade pleural juntamente com a carragenina, reproduziram parcialmente seus efeitos

pró-inflamatórios ou antiinflamatórios. O influxo de leucócitos do sangue ao local da

inflamação desempenha um importante papel na modulação da resposta inflamatória

67

(SALEH, et. al., 1996; PENIDO, et al., 2006). Os resultados obtidos neste trabalho

mostraram que os compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 apresentaram efeito anti-

inflamatório na fase aguda da pleurisia induzida por carragenina, inibindo a migração

leucocitária. Os derivados imidazolidínicos apresentaram atividade inferior à

Dexametasona, substância conhecida por seu efeito imunossupressor e fármaco padrão

relatado na literatura como eficaz para este tipo de experimento como também inferiores

a indometacina. (PERREIRA et al., 2006; DALMARCO, et al., 2009; FRÖDE, et al.,

2009).

Com a finalidade de avaliar a ação dos derivados imidazolidínicos deste estudo

na liberação de aminas vasoativas (histamina, bradicinina, serotonina) e formação de

edema, utilizou-se o teste de permeabilidade vascular induzida por ácido acético. Os

derivados indol-imidazolidínicos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 produziram uma

significativa inibição da permeabilidade vascular. Este efeito provavelmente envolve a

diminuição na liberação de aminas vasoativas, com conseqüente redução do edema. A

indometacina, que também contém o núcleo indol, é eficaz em reduzir a permeabilidade

vascular e liberação de aminas vasoativas.

O ácido acético age liberando mediadores endógenos que estimulam os

neurônios nociceptivos. Em camundongos provoca, em nível peritoneal, um aumento

nos níveis de PGE2 e PGF2á, serotonina, histamina (DERAEDT et. al., 1980), liberação

de bradicinina e citocinas, como TNF-α e IL-8 (RIBEIRO et al., 2000). Deste modo

provoca comportamentos estereotipados que são caracterizados por contorções

abdominais, redução e incoordenação da atividade motora (LE BARS; GOZARIU;

CADDEN, 2001). Os resultados indicam que os derivados indol-imidazolidínicos deste

estudo reduziram significativamente o número de contorções abdominais em

comparação ao grupo controle. Ambas as susbtâncias apresentaram efeito semelhante ao

diclofenaco, fármaco de referência. Segundo Daher (2004) os AINES como

indometacina, diclofenaco e ibuprofeno são capazes de diminuir as respostas sensoriais

do sistema nociceptivo por uma ação central. Pode-se então sugerir que o mecanismo de

ação dos compostos utilizados neste estudo pode estar ligado à inibição da liberação de

aminas, prostaglandinas e consequentemente da cicloxigenase e inibição da liberação de

citocinas pró-inflamatórias como o TNF-á e IL-1â. Malta (2005), avaliou o potencial

anti-nociceptivo do derivado imidazolidínico 3-(4-bromo-fenacil)-5-(4-dimetilamina-

benzilideno)-2-tioxo-imidazolidin-4-ona (LPSF/NN-165), pelo método de contorções

abdominais induzidas pelo ácido acético. Os resultados indicam que a substância inibiu

68

de maneira eficaz as contorções em relação ao grupo controle com percentual de inibição

de 52 % na dose de 10 mg/kg.

O teste de contorções abdominais pelo ácido acético, apesar de ser um ensaio

bastante utilizado para triagem de drogas analgésicas, não distingue fármacos que atuam

por mecanismo central ou periférico. Para ter indícios do mecanismo de ação, foi

realizado o teste da placa quente. Este teste é um modelo animal para avaliação do perfil

de atuação de fármacos com atividade antinociceptiva de ação central. As respostas

comportamentais exibidas pelos animais neste ensaio como lamber as patas e pular, são

de nível supra-espinhal, sendo, portanto utilizado para verificação do efeito

antinociceptivo central (LE BARS; GOZARIU; CADDEN, 2001; RINALDI et al.,

2009).

Na avaliação da atividade antinociceptiva pelo método da placa quente, os

resultados demonstram que nos tempos de análise nenhum dos derivados testados

apresentou ação quando comparados ao controle. O fentanil não apresentou efeito

antinociceptivo no tempo de 180 minutos após o tratamento, pelo fato de este fármaco

ser um anestésico de curta duração (HONET et al., 1992). Este experimento

complementa os resultados obtidos no teste das contorções abdominais induzidas por

ácido acético, o que nos permitem concluir que o mecanismo de ação dos derivados

testados não está relacionado à ação central, estando provavelmente relacionado com a

capacidade das substâncias testadas de reduzir os níveis de TNF-α e IL-1, assim como

com a provável inibição da produção de prostaglandinas.

Na indução do estimulo doloroso pela formalina se distingue duas fases, onde a

primeira fase é indicativa de dor neurogênica (primeiros 5 minutos) e a segunda fase é

indicativa de dor inflamatória (15 a 30 minutos) depois da administração da formalina.

O composto LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 não apresentaram inibição da dor na primeira

fase do teste, entretanto, na segunda fase que é indicativa de dor inflamatória, houve a

inibição eficaz da dor inflamatória. Segunda García et al. (2004), os fármacos que agem

na primeira fase têm ação central como os narcóticos. A inibição ocorrida na segunda

fase do teste da formalina indica uma ação periférica semelhante aos AINES e os anti-

inflamatórios esteroidais. Os dados obtidos neste experimento reforçam os achados no

teste da placa quente, confirmando que estes compostos atuam por mecanismo

periférico. Malta, em 2005, ao avaliar o potencial antinociceptivo utilizando a mesma

metodologia para a substância 3-(4-bromo-fenacil)-5-(4-dimetilamina-benzilideno)-2-

69

tioxo-imidazolidin-4-ona (LPSF/NN-165), obteve resultados apenas na segunda fase, o

que caracteriza uma ação dos derivados imidazolidínicos na dor inflamatória.

Em conjunto, os dados obtidos nos experimentos mostram que os compostos

indol-imidazolidínicos testados apresentam propriedades anti-inflamatórias e

antinociceptiva promissoras. A atividade anti-inflamatória foi evidenciada pela

diminuição da migração celular em vários modelos experimentais, e esta diminuição

provavelmente se deve a uma modulação do sistema imune, através da diminuição de

TNF-α e IL-1β. O efeito antinociceptivo apresentado pelo composto parece envolver

mecanismos periféricos, atuando na dor inflamatória.

CONCLUSÕES

71

9. CONCLUSÕES

De acordo com os resultados obtidos neste estudo podemos concluir que:

Os derivados indol-imidazolidínicos em estudo apresentaram baixa toxicidade,

tendo o valor da DL50 estimado em 2500 mg/kg, sendo considerada segura;

Os compostos o LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56, apresentaram atividade anti-

inflamatória frente aos experimentos de bolsão de ar subcutâneo, peritonite e

pleurisia induzidos por carragenina, com redução significativa da migração

leucocitária;

Na avaliação dos níveis de citocinas, os compostos em estudo diminuíram a

concentração de TNF-α e IL-1ß nos exutados inflamatórios;

Os derivados indol-imidazolidínicos em estudo também inibiram

significativamente a permeabilidade vascular induzida por ácido acético.

Os resultados nos testes de ácido acético e placa quente indicam que os

compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 possuem atividade antinociceptiva;

Os resultados obtidos nos testes da placa quente e formalina sugerem que os

compostos em estudo atuam por mecanismos periféricos, atuando na dor

inflamatória.

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ANEXOS

APÊNDICES

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Aline Stamford Henrique da Silva Guerra · 2019. 10. 25. · Apesar do avanço no conhecimento da fisiopatologia da inflamação, os medicamentos atuais ainda apresentam sérios efeitos