UNIVERSIDADE FEDERAL DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DE PORTO ALEGRE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

ALTERAÇÕES NAS ENZIMAS ÁCIDO GLUTÂMICO

DESCARBOXILASE (GAD65 E GAD67) NO ESTRIADO E

CÓRTEX PRÉ-FRONTAL DE RATAS APÓS

ADMINISTRAÇÃO REPETIDA DE COCAÍNA

Autor: Marilise Fraga de Souza Orientador: Profa. Dra. Helena Maria Tannhauser Barros

Dissertação de Mestrado

Porto Alegre, 2009

Livros Grátis

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Dedico esta dissertação aos meus exemplos de vida, Antônio Carlos Cypriano de Souza e Marli Rejane Fraga de Souza, que me ensinaram que a educação é a única forma de se alcançar os objetivos e que foram os grandes responsáveis por mais este passo. Estas duas pessoas, com muita sabedoria, discernimento, bom senso e dedicação, estiveram ao meu lado me encorajando nas horas difíceis e me aplaudindo nos momentos de glória. Obrigada por serem meus pais, profissionais corretos e competentes, fonte de inspiração, apoio e ensino diário.

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AGRADECIMENTO ESPECIAL

Ao meu marido, confidente e companheiro Jeferson Evangelista da

Silveira, agradeço pelo apoio, amor e compreensão nestes anos de

convivência. Estando ao meu lado em todos os momentos, compreendendo

minhas ausências e me incentivando a alcançar meus sonhos.

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AGRADECIMENTOS

À Profa. Dra. Helena Maria Tannhauser Barros, minha orientadora, por

todo empenho, sabedoria, exigência e compreensão. Agradeço pela confiança

e por ter apostado em mim e acreditado na minha capacidade.

Às minhas irmãs e irmão por estarem sempre ao meu lado, em todos os

momentos, torcendo por mim.

Às minhas sobrinhas e sobrinho simplesmente por existirem e fazerem a

minha vida mais feliz.

Aos meus amados avós, que onde quer que estejam, tenho a certeza de

que olharam por mim todo este tempo.

À minha grande família (tios, primos, sogros, cunhados) pelos momentos

prazerosos e por me ensinarem o valor da família.

À amiga Natividade de Sá Couto Pereira pelas risadas, conversas e por

ter me acompanhado diariamente nesta jornada.

Aos colegas de laboratório Eduardo, Lucas e Maurício por fazerem as

longas tardes de experimentos mais divertidas.

Às amigas Nice e Sharon pela convivência agradável e por dividirem

comigo as angústias desta fase da vida.

Às amigas supervisoras, aos consultores e ao pessoal administrativo do

Serviço VIVAVOZ, por me ensinarem que uma equipe unida pode mudar, se

não o mundo, ao menos a vida de algumas pessoas.

Às doutoras Ana Paula Guedes Frazzon, Maristela Ferigolo, Rosane

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Gomez e Denise Dantas pelos exemplos de mulheres, pesquisadoras e

amigas.

A todos os amigos, funcionários, professores e colaboradores da

UFCSPA, que acompanharam o meu trajeto dentro desta Universidade.

Aos amigos, colegas e professores do curso de Enfermagem da UFRGS,

pelos quatro anos e meio de companheirismo e amizade.

A todos vocês, muito obrigada!

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SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS E TABELAS

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

RESUMO

ABSTRACT

1. INTRODUÇÃO

1.1. Cocaína

1.1.1. Histórico

1.1.2 Epidemiologia

1.1.3 Farmacologia

1.1.3.1. Farmacocinética

1.1.3.2. Farmacodinâmica

1.1.4. Efeitos da cocaína

1.1.4.1. Efeitos agudos

1.1.4.2. Efeitos crônicos

1.1.5. Influência dos hormônios sexuais femininos nos efeitos da

cocaína

1.2. Ácido Gama-aminobutírico (GABA)

1.2.1. Isoenzimas Ácido Glutâmico Descarboxilase (GAD)

1.2.2. Receptores GABA

1.3. Cocaína e Sistema GABAérgico

1.4. Sensibilização comportamental

1.4.1. Vias neurais envolvidas na sensibilização à cocaína

VIII

IX

X

XI

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23

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37

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52

7

2. JUSTIFICATIVA

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo geral

3.2. Objetivos específicos

4. REFERÊNCIAS

5. ARTIGO CIENTÍFICO

57

59

59

59

60

78

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LISTA DE FIGURAS E TABELAS

Figuras:

Figura 1. Arbusto de Erytroxylon coca

Figura 2. Formas de uso da cocaína

Figura 3. Estrutura química da cocaína e seus principais metabólitos

Figura 4. Esquema representativo do mecanismo de ação da cocaína no SNC

Figura 5. Diagrama esquemático da síntese, transporte e metabolização de

GABA na sinapse

Figura 6. Representação esquemática dos receptores GABAA e GABAC

Figura 7. Representação esquemática dos receptores GABABR1 e GABABR2

Figura 8. Representação esquemática do cérebro de rato e alterações de

GAD65 e GAD67

Figura 9. Topografia do circuito motivacional e as neurotransmissões

associadas com a expressão da sensibilização comportamental

Tabelas:

Tabela 1. Farmacocinética da cocaína de acordo com a via de administração

Tabela 2. Complicações relacionadas ao consumo de cocaína e a via de

administração escolhida

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LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

ATP Adenosina tri-fosfato

ATV Área Tegmentar Ventral

BZ Benzodiazepínicos

Cpf Córtex Pré-Frontal

DA Dopamina

GABA Ácido Gama-aminobutírico

GABABR Receptor GABAB

GAD Ácido Glutâmico Descarboxilase

K+ Íon Potássio

Ca2+ Íon Cálcio

Cl- Íon Cloreto

NAc Núcleo accumbens

RNAm Ácido Ribonucléico Mensageiro

SNC Sistema Nervoso Central

ONU Organização das Nações Unidas

PLP Piridoxal-5'-fosfato

VP Ventral pallidum

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RESUMO

Este estudo objetivou comparar os níveis de sensibilização à cocaína a

modificações nas enzimas ácido glutâmico descarboxilase (GAD) no córtex

pré-frontal e estriado de ratas. Ratas ovariectomizadas receberam salina ou

cocaína repetidamente e, após uma dose desafio de cocaína, atividade

locomotora e estereotipia foram monitoradas. Nem todos os animais

apresentaram sensibilização após administração repetida de cocaína. Uma

única exposição à cocaína não alterou a expressão de RNAm das isoenzimas

GAD em ambas regiões cerebrais. O RNAm de GAD65 e GAD67 foi

significativamente menor no estriado das ratas tratadas repetidamente com

cocaína, independentemente se estas apresentaram sensibilização ou não.

Apenas as ratas sensibilizadas tiveram significativa redução do RNAm de

GAD65 no córtex pré-frontal. A expressão do GAD67 no córtex pré-frontal foi

reduzida nos animais sensibilizados que mostraram estereotipia. Estes

resultados sugerem que apenas o tratamento repetido com cocaína afeta a

expressão das isoenzimas GAD no estriado e córtex pré-frontal de ratas

fêmeas. No córtex pré-frontal, administração repetida de cocaína por si própria

não leva a mudanças no GAD. Sensibilização está associada à menores níveis

de RNAm de GAD65 no córtex pré-frontal em fêmeas, enquanto que a

regulação da expressão de GAD67 no córtex pré-frontal parece ser alterada

apenas após intensa sensibilização ser alcançada.

Palavras-chave: cocaína, sensibilização, isoenzimas GAD, estriado, córtex

pré-frontal.

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ABSTRACT

This study furthered compares the repeated cocaine sensitization to the

modifications in glutamic acid decarboxylase isoenzymes (GAD) in the

prefrontal cortex and striatum of female rats. Ovariectomized female rats

received saline or cocaine repeatedly and after a challenge cocaine dose,

locomotion and stereotypies were monitored. Not all animals presented

sensitization after repeated cocaine. A single exposure to cocaine did not

change the expression of GAD mRNA in brain areas. GAD65 and GAD67 mRNA

were significantly lowered in the striatum of repeatedly-treated animals

irrespective of rats showing sensitization or not. Only sensitized animals

presented significant reduction of prefrontal cortex GAD65 mRNA. GAD67 in the

prefrontal cortex was reduced only in sensitized animals showing stereotypies.

Present results suggest that only repeatedly administered cocaine affects GAD

isoenzymes expression in the striatum and prefrontal cortex of female rats. In

the prefrontal cortex repeated cocaine by itself does not lead to GAD changes.

Sensitization is associated with decreased GAD65 mRNA expression in the

prefrontal cortex of females, while regulation of GAD67 expression in the

prefrontal cortex appears to be changed only after highest sensitization is

achieved.

Keywords: cocaine, sensitization, GAD isoenzymes, striatum, prefrontal cortex.

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1. INTRODUÇÃO

1.1 Cocaína

1.1.1 Histórico

A cocaína (benzoilmetilecgonina) é um alcalóide tropano extraído das

folhas do arbusto Erythroxylon coca (figura 1), pertencente à família das

eritroxiláceas, que é encontrado ao leste dos Andes e acima da Bacia

Amazônica (Leite, 1999). É cultivada em clima tropical em altitudes que variam

entre 450 e 1800 metros acima do nível do mar (Ferreira e Martini, 2001).

Figura 1. Arbusto de Erythroxylon coca.

O abuso de cocaína tem suas raízes nas grandes civilizações pré-

colombianas dos Andes, há mais de 4500 anos. A civilização Inca cultivou e

estabeleceu o consumo da coca para suportar a fadiga e a fome, prática que

ainda é reconhecida (Ferreira e Martini, 2001; Leite, 1999; Gold, 1993). Os

indígenas acreditavam na origem divina deste arbusto, tradição esta observada

ainda hoje, em contextos religiosos destas populações no Peru, Bolívia,

Colômbia e Equador (Weiss et al., 1994).

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Após a conquista da América pelos espanhóis, no século XVI, as folhas

de coca chegaram ao continente europeu, porém não ocorreu a difusão e o

consumo na Europa neste período (Weiss et al., 1994). Somente em 1855, o

químico alemão Friedrich Gaedecke conseguiu o extrato das folhas de coca, o

erythroxylene e, em 1859, outro químico alemão, Albert Niemann, isolou os

alcalóides da folha, sendo a cocaína o principal deles (80% do total) (Ferreira e

Martini, 2001).

A popularização da cocaína iniciou-se em 1863, quando Ângelo Mariani

criou uma mistura de vinhos e folhas de coca, o qual denominou de Vin

Mariani, bastante utilizado por personalidades importantes como Papas e Reis

(Weiss et al., 1994). Freud contribuiu de maneira decisiva para a divulgação da

nova droga. Em 1884, publicou um livro chamado “Uber coca”, no qual

defendeu o uso terapêutico da cocaína na depressão. Após ser duramente

criticado pela comunidade científica da época e reconhecer os efeitos maléficos

da cocaína, como a dependência, Freud publicou, em 1892, uma atualização

de “Uber coca”, retratando tudo o que havia dito anteriormente (Bahls e Bahls,

2002).

Em 1884, Karl Koller descobriu que o uso da cocaína tornava o olho

insensível à dor, tornando-se o pai da anestesia local. Wiliam Halsted, que

seria conhecido como um dos pais da cirurgia moderna, por volta de 1880,

tentou estabelecer o uso da droga como anestésico local, não ficando restrito à

oftalmologia, obtendo sucesso no bloqueio da dor, iniciando a era das cirurgias

oculares, entre outras (Ferreira e Martini, 2001).

Após a produção de cocaína semi-refinada, em 1885, o armazenamento

e o transporte das folhas de coca foram simplificados, os preços caíram, e o

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consumo de cocaína semi-refinada aumentou substancialmente. Dessa forma,

houve uma rápida criação de novas fábricas de medicações, utilizando a

cocaína em diversos produtos (Karch, 1999).

Em 1886, John Styth Peberton criou um refrigerante isento de álcool,

que utilizava na composição noz de cola e folhas de cocaína. Assim nasceu a

Coca-Cola, que era consumida pelas classes menos favorecidas para

problemas gástricos, dores de cabeça, cansaço, entre outros. Somente em

1906, as folhas de coca da formulação foram substituídas por folhas

descocainizadas e cafeína (Ferreira e Martini, 2001).

Em 1898, a fórmula exata da estrutura química da cocaína foi

descoberta e, em 1902, Willstatt (prêmio Nobel) produziu cocaína sintética em

laboratório que, sob a forma de cloridrato de cocaína, apresenta-se como um

pó branco cristalino (Ferreira e Martini, 2001).

A partir da primeira guerra mundial, os efeitos do consumo de cocaína

começaram a tornar-se mais evidentes. Em 1914, os Estados Unidos publica a

Lei Harrison Act, proibindo o uso da cocaína pela população. Episódios de

toxicidade, tolerância, dependência e até mesmo morte pelo uso de tais

produtos passaram a ser relatados em revistas médicas no início dos anos 20

(Karch, 1999). No Brasil, o Decreto-Lei Federal n°4.292, de 06 de julho de

1921, restringiu o uso de cocaína. Entretanto, observou-se o ressurgimento da

disponibilidade e do consumo da cocaína no início de 1970 nos Estados Unidos

e ao final de 1980 e início de 1990, no Brasil. Com o advento do crack a partir

da metade dos anos 80, tem-se observado uma tendência de queda no uso do

cloridrato de cocaína e um aumento do uso desta outra preparação. Assim, o

mundo testemunha uma nova fase da história da cocaína, pelo menos com

15

relação ao potencial de toxicidade, pois o crack é muito mais barato e fácil de

consumir, porém, com capacidade de causar danos ainda maiores que a

cocaína pura (Bahls e Bahls, 2002; Ferreira e Martini, 2001).

1.1.2. Epidemiologia

Segundo o relatório mundial sobre drogas da Organização das Nações

Unidas (ONU), realizado em 2008, o uso de cocaína aumentou no Brasil, que

passou a ser o segundo maior mercado de cocaína das Américas (cerca de

870 mil usuários), depois dos Estados Unidos (cerca de 6 milhões de

consumidores de cocaína). O relatório também expõe o Sudeste e o Sul do

Brasil como as áreas mais afetadas pelo consumo de cocaína. O uso na vida

de cocaína no Sudeste do Brasil é de 3,7% da população entre 12 e 65 anos.

No Sul, o uso na vida é de 3,1% enquanto no Nordeste e no Norte chega a

1,2% e 1,3%, respectivamente (UNODC, 2008).

De acordo com o último Levantamento Domiciliar brasileiro, realizado em

2005 nas 108 maiores cidades do país (Carlini et al., 2007), a cocaína é a

segunda droga ilícita mais utilizada, sendo superada apenas pela maconha. A

pesquisa aponta que 2,9% da população já usou cocaína ao menos uma vez

na vida. Estes resultados mostram um consumo próximo ao da Alemanha

(3,2%), porém bem inferior aos Estados Unidos, com 14,2%, e Chile com 5,3%.

O uso iniciou-se na faixa etária de 12 a 17 anos (0,5%) e atingiu um máximo na

faixa dos 25 aos 34 anos (5,2%). Em comparação ao I Levantamento Domiciliar

(Carlini et al., 2002), este último Levantamento (Carlini et al., 2007) mostra um

aumento na prevalência anual do uso de cocaína de 0,4% da população entre

12 e 65 anos, em 2001, para 0,7%, em 2005. Entre estudantes brasileiros do

16

ensino fundamental e médio, dados de levantamento sobre o uso de drogas,

realizado em 2004, apontam o uso na vida de cocaína de 2,0% (Galduróz et al.,

2005).

O último Levantamento Domiciliar (Carlini et al., 2007) revela grande

predomínio de uso de cocaína por indivíduos do sexo masculino. No entanto, a

porcentagem de mulheres jovens (de 12 a 17 anos) que fizeram uso na vida de

cocaína é igual à encontrada entre os homens desta mesma faixa etária

(0,4%). Esta constatação pode já estar refletindo a mudança cultural com mais

aceitação em relação ao uso de drogas mais “pesadas” pelas mulheres. Nos

Estados Unidos, cerca de 30% dos usuários de cocaína são mulheres

(SAMHSA, 2007). Portanto, o número de mulheres que fazem uso de

psicoestimulantes como a cocaína tem aumentado nos últimos anos, e há

diferenças nas respostas comportamentais entre indivíduos de sexos

diferentes, tanto em humanos quanto em modelos experimentais, sendo o sexo

feminino mais sensível aos efeitos dos psicoestimulantes do que o masculino.

Justifica-se a menor incidência de uso de drogas pelas mulheres por fatores

culturais. Assim sendo, é importante estudar as diferenças biológicas porque

há cada vez mais a aceitação cultural da semelhança entre sexos.

Em relação ao crack, dados do II Levantamento domiciliar revelam a

prevalência de uso na vida de 0,7%, sendo a maior porcentagem para o sexo

masculino (3,2%), na faixa etária de 25 a 34 anos, o que equivale a uma

população de 193.000 pessoas (Carlini et al., 2007). No estudo entre os

estudantes, o uso na vida de crack também foi de 0,7% (Galduróz et al., 2005),

revelando o uso precoce desta preparação.

17

1.1.3. Farmacologia

Antes de se conhecer e de se isolar a cocaína da planta, as folhas de

coca eram muito usadas sob forma de chá (figura 2A). A cocaína é purificada

das folhas de coca (que contém entre 0,6% e 1,8% do alcalóide cocaína)

através de um método relativamente simples, pelo qual esta é extraída das

folhas utilizando um solvente orgânico, resultando em uma pasta de coca

contendo aproximadamente 80% de cocaína (Dickerson e Janda, 2005). Esta

forma intermediária da droga, especialmente perigosa devido à sua impureza,

também é conhecida como basuco (figura 2B), que é fumada em alguns países

(Figlie et al., 2004). No entanto, a cocaína é geralmente disponível sob a forma

de cloridrato (figura 2C) ou base livre (figura 2D). O cloridrato de cocaína é

preparado por dissolução do alcalóide no ácido clorídrico formando um pó

hidrossolúvel ou em grânulos que se decompõem quando aquecidos e que

podem ser ingeridos via oral, por inalação, ou via intravenosa. A base livre é

elaborada pela transformação da cocaína com amônia ou bicarbonato de sódio,

neutralizando o bicarbonato ou a parte ácida. Trata-se de uma forma estável a

altas temperaturas, permitindo-lhe ser fumado, e é conhecida como crack,

devido ao som que faz quando aquecido (Egred e Davis, 2005; Dickerson e

Janda, 2005; Figlie et al., 2004).

Figura 2. Formas de uso da cocaína. A. Chá de folhas de coca. B. Pasta de coca: basuco. C. Cloridrato de cocaína: pó. D. Base livre: crack.

A B DC

18

1.1.3.1. Farmacocinética

A cocaína é absorvida, nas diferentes formas, por todos os órgãos com

membranas mucosas. Quando a cocaína é ingerida por via oral, sua absorção

é lenta e incompleta, requer mais de 1 hora e somente 25% da droga ingerida

alcançam o cérebro. Por isso, nessa forma de administração não existe o

sentimento de rush, caracterizado por uma intensa sensação de bem estar,

comum às outras formas de uso. Em relação à cocaína aspirada, cerca de 20%

a 30% da droga são absorvidos, isto porque apenas uma pequena quantidade

da droga atravessa a mucosa nasal. Além disso, a vasoconstrição gerada pela

cocaína acaba limitando a sua absorção. Quando injetada, a cocaína cruza

todas as barreiras de absorção e alcança a corrente sanguínea imediatamente.

Produz um rápido, poderoso e breve efeito. Por essa razão, foi uma das formas

de uso preferidas entre os usuários compulsivos. Entretanto, consumidores

ainda mais compulsivos utilizam a via pulmonar, já que a absorção da cocaína

vaporizada e fumada é rápida e quase completa (Figlie et al., 2004). O início, o

pico e a duração dos efeitos da cocaína também variam de acordo com a via

de administração (tabela 1).

Tabela 1. Farmacocinética da cocaína de acordo com a via de administração.

Via de administração Início da ação Pico do efeito Duração da ação

Inalada/fumada 3-5 segundos 1-3 minutos 5-15 minutos

Intravenosa 10-60 segundos 3-5 minutos 20-60 minutos

Intranasal ou mucosal 1-5 minutos 15-20 minutos 60-90 minutos

Gastrointestinal (oral) > 20 minutos > 90 minutos > 180 minutos

Fonte: Egred e Davis, 2005.

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Enfim, os efeitos psicoestimulantes da cocaína dependem da rota de

administração utilizada. Quanto mais rápida a absorção, e sua entrada no

cérebro, mais intenso será seu efeito. Em contrapartida, menor será seu tempo

de ação com maiores riscos de dependência. Em vista disso, o crack é

considerado a mais potente e viciante forma de uso desta substância (Egred e

Davis, 2005).

Depois que a cocaína penetra no cérebro, é rapidamente redistribuída

para outros tecidos e se concentra no baço, rins e cérebro. Durante a gravidez,

a cocaína cruza a placenta e alcança, no bebê, níveis semelhantes aos da mãe

(Figlie et al., 2004).

Cerca de 80% a 90% da cocaína (figura 3A) é transformada em

metabólicos inativos hidrossolúveis. O metabolismo ocorre inicialmente no

plasma por hidrólise do radical éster. O primeiro metabólito é metil éster de

ecgonina (figura 3B), que sofre degradação para benzoilecgonina (figura 3C), o

principal metabólito urinário. Por último, a desmetilação de cocaína para

norcocaína (figura 3D) é realizada através da enzima oxidase no sistema

hepático (Carrera et al., 2004). Na presença de álcool, outro metabólito ativo

tóxico é formado, o cocaetileno, cuja potência é semelhante à da cocaína,

aumentando, assim, a toxicidade da cocaína quando esta é ingerida

juntamente com o álcool (Figlie et al., 2004).

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Figura 3. Estrutura química da cocaína (A) e seus principais metabólitos: metil éster de ecgonina (B), benzoilecgonina (C), e norcocaína (D).

Em geral, a cocaína é rapidamente eliminada pela urina e possui tempo

de meia-vida de aproximadamente 1 hora (Figlie et al., 2004). Cerca de 1 a 5%

da substância fica inalterada e os metabólitos hidrossolúveis da cocaína podem

permanecer na urina por até 72 horas, fornecendo um indicador do uso recente

da cocaína (Egred e Davis, 2005). Em usuários crônicos, a urina pode

permanecer positiva por até 22 dias (Figlie et al., 2004). O consumo de

cocaína também pode ser detectado pela análise do cabelo, que é um

marcador sensível e fornece informações sobre o consumo nas últimas

semanas ou meses, dependendo do comprimento do cabelo analisado (Egred

e Davis, 2005).

1.1.3.2. Farmacodinâmica

A cocaína atua como um poderoso agente simpaticomimético com

capacidade de, simultaneamente, bloquear a recaptação e aumentar os níveis

de catecolaminas (dopamina, serotonina, norepinefrina e noradrenalina),

produzindo ação de altas concentrações destas catecolaminas nos receptores

A B

C D

21

pós-sinápticos, o que explica o seu efeito estimulante do Sistema Nervoso

Central (SNC) (Dackis e O’Brien, 2001; Egred e Davis, 2005).

No entanto, o bloqueio da recaptação de dopamina (DA) na via

mesocorticolímbica é o principal mecanismo de ação da cocaína (Figura 4)

(Goldstein e Volkow, 2002; Koob, 2006). Esta via origina-se nos corpos

celulares dopaminérgicos na área tegmentar ventral (ATV) e projeta-se para

várias áreas do sistema límbico, incluindo córtex pré-frontal (Cpf), hipocampo,

amígdala e núcleo accumbens (NAc) (Anderson e Pierce, 2005). Ao ligar-se

aos transportadores que fazem a recaptação de DA situados na membrana

pré-sináptica dos neurônios dopaminérgicos, a cocaína inibe a remoção da DA

da fenda sináptica e sua subseqüente degradação pela monoamina oxidase no

nervo terminal. A DA permanece na fenda sináptica e liga-se livremente aos

seus receptores sobre a membrana pós-sináptica, produzindo mais impulsos

nervosos. Esse bloqueio aumenta a concentração de DA na fenda sináptica no

NAc em até 15 vezes (Grimm, 2007). O aumento da ativação da DA na via

mesocorticolímbica é o principal responsável pelos efeitos reforçadores e pelo

sentimento de extrema euforia induzidos pela cocaína (Goldstein e Volkow,

2002; Koob, 2006).

22

Figura 4. Esquema representativo do mecanismo de ação da cocaína no SNC, através do bloqueio da recaptação de DA pelo receptor pré-sináptico. A. Ação da DA em condições normais. B. Ação da DA na presença de cocaína. Fonte: NEAD, 2008.

Neste sentido, a DA tem um papel crucial na mediação dos efeitos

reforçadores da cocaína (Aarão et al., 2008; Cannon e Bseikri, 2004). O

sistema de recompensa tem participação fundamental na busca de estímulos

causadores de prazer, tais como alimentos, sexo, relaxamento, sendo um

importante mecanismo de autopreservação. Por meio do reforço positivo da

recompensa, obtida durante essas experiências, o organismo é impelido a

buscá-las repetidas vezes. O reforço e a motivação, portanto, podem ser

considerados componentes naturais do comportamento e fundamentais na sua

organização (Stefano et al., 2007). A cocaína, através da estimulação

dopaminérgica, mimetiza os sentimentos e a busca de prazer naturais do

organismo.

Apesar de a cocaína atuar diretamente sobre o sistema dopaminérgico,

outros sistemas também sofrem influências de sua utilização, podendo

acarretar profundas alterações em receptores, síntese de neurotransmissores

bem como a níveis moleculares (Johanson e Schuster, 2000; Perrotti et al.,

2000). Com isso, buscando equilibrar a atividade do SNC após a estimulação

A B

23

produzida pelas altas concentrações de catecolaminas decorrentes do uso de

cocaína, ocorre a mobilização de sistemas inibitórios cerebrais. Estudos

demonstram que o Ácido Gama-aminobutírico (GABA), principal

neurotransmissor inibitório do SNC, está envolvido na modulação dos efeitos

produzidos pela administração aguda ou crônica de cocaína no cérebro

(Backes e Hemby, 2008; Jayaram e Steketee, 2004). No entanto, ainda existem

lacunas no conhecimento quanto à forma com que este sistema inibitório atua

na resposta ao uso de psicoestimulantes, necessitando de estudos adicionais

que revelem os mecanismos pelos quais esta regulação é feita. O sistema

GABAérgico e sua influência nos efeitos dos psicoestimulantes será abordado

no item 1.2.

1.1.4. Efeitos da cocaína

Os efeitos da cocaína já estão bem estabelecidos na literatura. Vários

livros texto de farmacologia apontam que a cocaína possui múltiplas ações,

tanto periféricas, quanto centrais. Esta substância é um potente anestésico

local com propriedades vasoconstritoras e também um estimulante do SNC,

com ação inibitória sobre os transportadores de DA (Hardmann et al., 2005;

Laranjeira et al., 2003; Stahl, 1998).

1.1.4.1. Efeitos agudos

A intoxicação aguda com cocaína produz vários efeitos clínicos,

dependendo da dose, sendo mediada pela inibição do transportador de DA e,

conseqüentemente, pelos efeitos da excessiva atividade dopaminérgica nas

sinapses (Stahl, 1998).

24

O efeito agudo predominante e mais esperado após o uso de cocaína é

uma intensa euforia e sensação de bem estar (Leite, 1999). Outros sintomas

psíquicos decorrentes do uso da cocaína são o aumento do estado de vigília,

autoconfiança elevada, aceleração do pensamento e aumento das capacidades

físicas, intelectuais e sexuais (Laranjeira et al., 2003).

Em doses maiores, a cocaína pode produzir efeitos físicos e psíquicos

indesejáveis. Os principais sintomas físicos são o aumento da freqüência

cardíaca e respiratória, da temperatura corpórea, sudorese, tremor leve de

extremidades, espasmos musculares (especialmente língua e mandíbula),

midríase e comportamento estereotipado repetitivo (Laranjeira et al., 2003). Os

sintomas psíquicos incluem labilidade emocional, inquietação, irritabilidade,

paranóia e pânico. Com doses ainda mais elevadas, pode produzir intensa

ansiedade e alucinações (Stahl, 1998). Estes efeitos indesejáveis aumentam a

necessidade de repetir o uso, isto porque os efeitos da cocaína aparecem

imediatamente após única dose e desaparecem dentro de poucos minutos ou

horas (Leite,1999).

As consequências relacionadas ao consumo de cocaína são

habitualmente agudas e a via de administração escolhida pode apresentar

manifestações específicas, conforme exposto na tabela 2.

Tabela 2. Complicações relacionadas ao consumo de cocaína e a via de

administração escolhida

Sistema Nervoso Central Qualquer via: cefaléias, convulsões, acidente vascular cerebral,

hemorragia intracraniana, hemorragia subaracnóidea. As complicações

psiquiátricas compreendem confusão mental, estimulação intelectual,

25

mania, agitação, ansiedade, irritabilidade, euforia, depressão, ideação

suicida, alucinações visuais, paranóia, medo irracional, mania de

perseguição, destruição da personalidade, anorexia, tolerância,

sensibilização e dependência.

Via endovenosa: aneurismas micóticos

Aparelho cardiovascular Qualquer via: hipertensão, arritmias cardíacas, isquemia do miocárdio,

infarto agudo do miocárdio, cardiomiopatias, dissecção ou rupturas de

aorta

Via endovenosa: endocardite bacteriana

Aparelho Respiratório Via intranasal: broncopneumonias

Via inalatória: broncopneumonias, hemorragia pulmonar, edema

pulmonar, pneumomediastino, pneumotórax, asma, bronquite, bronquiolite

obliterante, depósito de resíduos, corpo estranho, lesões térmicas

Via endovenosa: embolia pulmonar

Aparelho Digestivo Qualquer via: isquemia mesentérica

Via inalatória: esofagite

Aparelho Excretor e Distúrbios Metabólicos Qualquer via: insuficiência renal aguda secundária à rabdomiólise,

hipertermia, hipoglicemia, acidose láctica, hipocalemia, hipercalemia

Olhos, Ouvidos, Nariz e Garganta Via intranasal: necrose de septo nasal, rinite, sinusite, laringite

Via inalatória: lesões térmicas

Doenças Infecciosas Via endovenosa e via inalatória: AIDS, hepatite B e C

Fonte: Laranjeira et al., 2003

As complicações psiquiátricas são as que mais levam os usuários de

cocaína à atenção médica. Quadros agudos de pânico, os transtornos

depressivos e os psicóticos agudos são os mais relatados (Laranjeira et al.,

26

2003). As complicações cardiovasculares decorrentes do uso de cocaína são

as mais freqüentes entre as complicações não-psiquiátricas. Juntamente com o

aumento de diferentes neurotransmissores, o aumento dos níveis de adrenalina

pela cocaína provoca efeitos como vasoconstrição e decorrente hipertensão

arterial e taquicardia. O músculo cardíaco, que está sendo estimulado pelo uso

de cocaína, também sofre os efeitos da vasoconstrição, que o priva do sangue

necessário. Esta combinação pode causar grave arritmia ou ataque cardíaco,

inclusive em jovens usuários (Figlie et al., 2004).

1.1.4.2. Efeitos Crônicos

Os efeitos cumulativos do uso crônico ou até mesmo os efeitos agudos

de grandes doses podem deixar importantes seqüelas, tanto cardiovasculares

quanto gastrointestinais, renais, endócrinas, respiratórias, reprodutivas,

infecciosas e até mesmo a morte (overdose) (Figlie et al., 2004). A overdose é

a mais conhecida complicação aguda relacionada ao consumo de cocaína.

Pode ser definida como a falência de um ou mais órgãos decorrentes do uso

excessivo da substância. Seu mecanismo de ação está relacionado ao excesso

de estimulação central e simpática (Laranjeira et al., 2003). Além disso, pode

desenvolver desordens psiquiátricas como psicose e paranóia, que são

freqüentemente confundidas com a doença psiquiátrica esquizofrenia (Anthony

e Petronis, 1991).

Ao nível de sistema nervoso central, o uso prolongado promove várias

modificações. Os principais fenômenos que podem ser observados são:

tolerância, sensibilização e dependência.

Tolerância é a necessidade de doses cada vez maiores da substância

para se obter o mesmo efeito inicial. Este fenômeno é caracterizado por um

27

desvio à direita na curva dose-resposta e resulta de adaptações

neurofuncionais à ação prolongada da cocaína (figura 5) (Hardmann et al.,

2005; Laviola et al., 1995; Figlie et al., 2004). A tolerância é, portanto, uma

alteração quantitativa na sensibilidade do corpo à droga, e é causada por

mecanismos farmacocinéticos e farmacodinâmicos. Entre as alterações na

farmacocinética da droga destaca-se a tolerância metabólica, quando a droga é

capaz de estimular o seu próprio metabolismo ou o metabolismo de outras

drogas. Outro mecanismo possível é a tolerância comportamental, uma

capacidade de compensar os efeitos da droga. A tolerância funcional, que pode

constituir o tipo mais comum, decorre de alterações compensatórias nos

receptores, nas enzimas efetoras ou nas ações da droga sobre as membranas.

Os mecanismos farmacodinâmicos estão associados ao nível dos receptores

ou ao nível dos múltiplos processos de acoplamento e regulação que existem

entre a ativação dos receptores e seus sistemas efetores (Aarão, 2007). O

aumento da DA na fenda sináptica, decorrente do bloqueio dos transportadores

da recaptação dopaminérgica, leva a uma diminuição dos disparos neuronais.

O resultado é a depleção da concentração de DA extracelular e o aumento do

limiar de auto-estimulação (Figlie et al., 2004).

A sensibilização ou tolerância reversa, que será aprofundada no item

1.4., é a exacerbação da atividade motora e dos comportamentos

estereotipados após a exposição a doses repetidas de cocaína, acarretando

um desvio à esquerda na curva dose-resposta (figura 5) (Hardmann et al.,

2005; Laviola et al., 1995). Um exemplo deste fenômeno pode ser o que

acontece com alguns indivíduos, após intoxicação repetida com cocaína, em

doses que anteriormente induziam apenas euforia, passam a tomar forma de

28

psicose paranóide aguda (Stahl, 1998). A depleção dopaminérgica resultante

do uso crônico de cocaína provoca alterações anatômicas e funcionais nos

receptores neuronais, levando a um aumento do número e da sensibilidade dos

receptores pós-sinápticos de DA. Além da maior permanência de DA na fenda

após o uso de cocaína, esta catecolamina encontrará um número maior de

receptores mais sensíveis para estimular. Adicionalmente, com a intensa

resposta neuronal decorrente do uso crônico de cocaína, o sistema límbico tem

seu funcionamento elétrico alterado e essa disfunção pode se espalhar,

causando convulsões generalizadas, fenômeno chamado de kindling (Figlie et

al., 2004).

Figura 5. Desvios em uma curva dose-resposta com tolerância e sensibilização. Adaptado de Hardmann et al., 2005.

O desenvolvimento de tolerância e/ou sensibilização tem sido

relacionado como um dos principais fatores para o estabelecimento da

toxicodependência, tanto em animais quanto em seres humanos. Neste

sentido, a dependência pode ser explicada, ao menos em parte, pela

habilidade das drogas de abuso em reorganizar regiões cerebrais envolvidas

29

no reforço e na motivação, como o estriado dorsal e ventral, e em regiões

cerebrais envolvidas no controle inibitório do comportamento, como o Cpf. A

sensibilização psicomotora pode manifestar algumas destas neuroadaptações

(Samaha e Robinson, 2005). Além disso, o potencial de abuso da cocaína é

essencialmente baseado no rápido desenvolvimento de tolerância para os

efeitos de euforia (Büttner et al., 2003). Outro fator importante se relaciona às

manifestações de abstinência, principalmente do tipo depressão, que servem

como reforço negativo, fazendo com que os indivíduos retomem o uso da droga

que foi suspensa (Dafny e Yang, 2006). Com isso, estudos indicam que a

tolerância, a retirada, e as neuroadaptações relacionadas com a sensibilização

podem desempenhar um papel importante no processo de desenvolvimento da

dependência (Ben-Shahar et al., 2004; Dafny e Yang, 2006; Wolf, 1988).

A dependência é a principal complicação crônica relacionada ao

consumo de cocaína, caracterizada por uma relação disfuncional entre um

indivíduo e seu modo de consumir uma determinada substância psicotrópica.

Fala-se em dependência quando o consumo se mostra compulsivo e destinado

à evitação de sintomas de abstinência e cuja intensidade é capaz de ocasionar

problemas sociais, físicos e/ou psicológicos (Laranjeira et al., 2003).

Segundo os critérios do Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos

Mentais (DSM-IV-TR) (APA, 2002), a dependência é indicada por preencher,

no mínimo, três dos seguintes sintomas no último ano: (1) tolerância, definida

por qualquer um dos seguintes aspectos: (a) uma necessidade de quantidades

progressivamente maiores da substância para adquirir a intoxicação ou efeito

desejado, (b) acentuada redução do efeito com o uso continuado da mesma

quantidade de substância; (2) abstinência, manifestada por qualquer dos

30

seguintes aspectos: (a) síndrome de abstinência característica para a

substância, (b) a mesma substância (ou uma substância estreitamente

relacionada) é consumida para aliviar ou evitar sintomas de abstinência; (3) a

substância é freqüentemente consumida em maiores quantidades ou por um

período mais longo do que o pretendido; (4) existe um desejo persistente ou

esforços mal-sucedidos no sentido de reduzir ou controlar o uso da substância;

(5) muito tempo é gasto em atividades necessárias para a obtenção da

substância, na utilização da substância ou na recuperação de seus efeitos; (6)

importantes atividades sociais, ocupacionais ou recreativas são abandonadas

ou reduzidas em virtude do uso da substância; (7) o uso da substância

continua, apesar da consciência de ter um problema físico ou psicológico

persistente ou recorrente que tende a ser causado ou exacerbado pela

substância.

A síndrome de abstinência é o conjunto de sintomas, que ocorre na

retirada absoluta ou relativa de uma substância, após uso repetido e

usualmente prolongado e/ou uso de altas doses daquela substância. Após

cessação do uso de cocaína ou após intoxicação aguda, a depressão pós-

intoxicação (crash) pode estar associada a sintomas de disforia, anedonia,

ansiedade, irritabilidade, fadiga, hiper/hiposonolência, agitação e até mesmo

ideações suicidas (Aarão, 2007). Os sintomas da abstinência ocorrem mais de

24 horas após cessação do uso. No uso leve ou moderado, esses sintomas

desaparecem dentro de 18 horas. Com o uso pesado, os sintomas podem

durar até uma semana, atingindo seu pico em 2 a 4 dias. Um indivíduo no

estado de abstinência pode experimentar desejo intenso por cocaína,

31

especialmente porque ela elimina os sintomas desagradáveis da abstinência

(Sadock e Sadock, 2007; Hales e Yudofsky, 2006).

1.1.5. Influência dos hormônios sexuais femininos nos efeitos da

cocaína

Tradicionalmente, o abuso de drogas tem sido considerado um problema

mais freqüente entre os indivíduos do sexo masculino. No entanto, o consumo

de cocaína por mulheres tem aumentado rapidamente nas últimas décadas.

Estima-se que cerca de 600.000 dos 2 milhões de usuários de cocaína nos

Estados Unidos sejam mulheres (SAMHSA, 2007). Com isso, nas últimas

décadas, tem havido uma preocupação maior em verificar as diferenças entre

homens e mulheres na aquisição de dependência química, sendo demonstrada

efetiva interferência dos hormônios sexuais, tanto na ação em sistemas

neuroquímicos (Perrotti et al., 2000; Saleh, 2003), quanto sobre os efeitos

comportamentais (Kouri et al., 2002; Lynch et al., 2002), em estudos em

animais e humanos.

As respostas comportamentais agudas aos psicoestimulantes são

diferentes entre animais machos e fêmeas (Perrotti et al., 2001; Quinones-

Jenab et al., 1999) e este dimorfismo sexual pode influenciar a auto-

administração da cocaína e seus efeitos. Em comparação com os homens, as

mulheres são mais propensas a usar cocaína em idade mais precoce e com

uma maior freqüência (Lynch et al., 2002). Após o primeiro uso de cocaína, as

mulheres tendem a levar menos tempo até se tornarem dependentes, elas

buscam tratamento mais cedo e normalmente seu hábito de usar cocaína é

mais grave do que é visto entre os homens que procuram tratamento (Hu e

32

Becker, 2008; Carroll et al., 2004). Além disso, utilizando-se a via intranasal

para administração de cocaína, o pico de efeito foi duas vezes maior nas

mulheres do que nos homens e, durante os 45 minutos após o uso da cocaína,

a concentração da droga nas mulheres diminuiu 18% apenas, enquanto que

nos homens a diminuição foi de 60%. Adicionalmente, mulheres relataram mais

experiências de “nervosismo” com o uso de cocaína, demoram mais tempo a

sentir os seus efeitos subjetivos, experimentam menos euforia e disforia,

consomem as formas mais severas e em quantidades maiores, e têm mais

fissura em resposta aos estímulos associados à cocaína do que os homens

(Kosten et al., 1996).

Estes resultados sugerem a hipótese que os hormônios sexuais

femininos, estrógeno e progesterona, podem ser os responsáveis pelo aumento

dos efeitos subjetivos induzidos pela cocaína em humanos (Justice e de Wit,

2000). Os hormônios gonadais regulam o sistema reprodutivo, assim como a

plasticidade e a atividade de todo SNC. Estudos em mulheres, durante as

diferentes fases do ciclo menstrual, têm mostrado que os efeitos positivos da

droga são maiores durante a fase folicular, e que o maior desejo pela droga

ocorre quando as concentrações de estrógeno e progesterona são maiores

(Sofuoglu et al., 1999; Evans et al., 2002).

Semelhante à mulher, as ratas fêmeas são mais sensíveis aos efeitos

psicomotores da cocaína do que os machos (Hu e Becker, 2008). Fêmeas

mostram uma maior sensibilização comportamental (Chin et al., 2002; Hu e

Becker, 2003), desenvolvem comportamento de auto-administração de cocaína

mais prontamente do que ratos machos (Lynch et al., 2001; Carroll et al., 2002;

Hu et al., 2004; Campbell et al., 2002) e fazem mais associação entre a

33

administração da droga e o ambiente em um período menor de tempo na

preferência condicionada de lugar (Russo et al, 2003a; Russo et al, 2003b).

Durante o ciclo estral, os níveis de estrógeno e progesterona flutuam, e as

alterações comportamentais induzidas pela cocaína são afetadas pelos

estágios do ciclo (Sell et al., 2002; Walker et al., 2002). Um aumento na

resposta comportamental está diretamente relacionado com o proestro e estro,

onde os níveis hormonais de estrógeno e progesterona estão mais elevados

(Sell et al, 2000; Quinõnes-Jenab et al., 1999; Chin et al., 2002).

Quando as ratas fêmeas são ovariectomizadas e, portanto, possuem

níveis de estrógenos ou progesterona praticamente nulos, o comportamento de

hipersensibilidade à cocaína fica reduzido e a capacidade de sensibilizar mais

rápido do que os machos e de produzir uma forte associação entre a

recompensa à cocaína e os estímulos ambientais não são mais evidenciadas

(Quiñones-Jenab, 2006). A ovariectomia também faz com que a capacidade de

auto-administração fique bastante reduzida, abolindo as diferenças

encontradas entre os machos e as fêmeas. Isto faz supor que os hormônios

sexuais femininos possam atuar nas propriedades de reforço da droga (Lynch

et al., 2001).

A reposição de estrógeno e progesterona também afeta as respostas

comportamentais da cocaína em ratas ovariectomizadas. O estrógeno parece

desempenhar um importante papel na capacidade de reforço da cocaína, pois

uma maior sensibilização está diretamente relacionada com a sua presença

(Hu and Becker, 2003; Booze et al., 1999). As fêmeas ovariectomizadas, na

presença de estrógeno, apresentam uma alteração significativa no

comportamento com metade da dose de cocaína que as ovariectomizadas que

34

não utilizam estrógeno (Hu e Becker, 2003; Sell et al., 2000). Portanto, a

diferença de sensibilização com os machos não se deveria à testosterona.

Embora os dados apóiem que o estrógeno seja o maior responsável

pelas diferenças encontradas entre machos e fêmeas em resposta ao uso da

cocaína, esta parece não ser a única influência. Enquanto o estrógeno induz

um aumento na atividade locomotora, a progesterona parece atenuar os efeitos

causados pela cocaína (Sell et al., 2000; Niyomchai et al., 2005). Estudos

clínicos com mulheres dependentes de cocaína relatam que as respostas

subjetivas após uso de cocaína e a fissura por cocaína são menores na fase

lútea, caracterizada por concentrações mais elevadas de progesterona (Evans

et al., 2002). Além disto, a administração de progesterona atenua os efeitos

subjetivos do crack em mulheres (Sofuoglu et al., 2004; Evans e Foltin, 2006).

Por outro lado, em animais do sexo feminino, o tratamento exógeno com

progesterona: a) reverte os efeitos do estrógeno sobre a aquisição da auto-

administração de cocaína (Jackson et al., 2006); b) atenua as respostas

motoras da cocaína em ratas (Russo et al., 2003a,b); c) inibe a preferência de

lugar da cocaína (Niyomchai et al., 2005); e d) a hiperatividade induzida pela

cocaína e a auto-administração de cocaína são as mais baixas na fase em que

a progesterona está mais elevada (Roberts et al., 1989; Sell et al., 2000;

Jackson et al., 2006).

Assim, entende-se que os efeitos da cocaína sobre o SNC são gênero-

dependentes e que os indivíduos do sexo feminino podem ser mais suscetíveis

à dependência de cocaína do que os do masculino, provavelmente devido à

presença dos hormônios sexuais femininos. Desta forma, é reforçada a idéia da

necessidade de estudos sobre os efeitos das variações fisiológicas dos ciclos

35

hormonais ou da reposição hormonal em fêmeas em relação aos efeitos dos

psicoestimulantes, especialmente a cocaína, bem como a utilização de

tratamentos diferenciados para homens e mulheres que buscam tratamento

para dependência química.

1.2. Ácido Gama-aminobutírico (GABA)

O Ácido Gama-aminobutírico (GABA) é o mais importante

neurotransmissor inibitório do SNC. Primeiramente, foi descoberto como um

aminoácido (Roberts e Frankel, 1950) e só mais tarde proposto como um

neurotransmissor inibitório (Curtis e Watkins, 1960; Krnjevic e Schwartz, 1967).

A identificação de vias biossintéticas e metabólicas do GABA mostraram que a

produção, liberação, recaptação e metabolismo desta substância também

ocorriam no sistema nervoso de mamíferos (Owens e Kriegstein, 2002). Nos

anos 70, o GABA foi finalmente localizado nos neurônios terminais de

mamíferos (Bloom e Iversen, 1971) e, depois de elucidado o seu papel, foi

finalmente classificado como um neurotransmissor clássico. A alta

concentração e a distribuição difusa dos neurônios GABAérgicos no SNC

dificultou ainda mais o estabelecimento da função do GABA como

neurotransmissor (Owens e Kriegstein, 2002). Além disto, a maioria dos

neurônios GABAérgicos são interneurônios, sendo, portanto, capazes de

alterar a excitabilidade de circuitos em todas regiões cerebrais (Roberts, 1986).

No cérebro de mamíferos, o GABA é sintetizado a partir do glutamato,

em uma reação catalisada por duas isoenzimas ácido glutâmico

descarboxilase, GAD65 e GAD67 (Ricci et al., 2005). O GABA sintetizado é

36

alocado em vesículas sinápticas por um transportador de neurotransmissor

vesicular e liberado para o nervo terminal por exocitose cálcio-dependente. No

entanto, formas de secreção não vesicular de GABA também são descritas e

parecem ser particularmente importantes durante o desenvolvimento (Owens e

Kriegstein, 2002). Uma vez liberado na fenda sináptica, o GABA liga-se a seu

receptor pré ou pós-sináptico, causando uma hiperpolarização celular através

do aumento da entrada de Cl- e saída de K+. Os efeitos do GABA podem ser

mediados pela ativação de receptores ionotrópicos ou metabotrópicos, que

podem estar localizados tanto pré quanto pós-sinapticamente, sendo formado

basicamente por três tipos de receptores, GABAA, GABAB e GABAC (Morris et

al., 1999), que serão descritas a seguir. A sinalização GABAérgica é finalizada

pela recaptação do neurotransmissor no nervo terminal e/ou pelo envolvimento

de células gliais por transportadores de membrana. Logo após, o GABA é

metabolizado por uma reação de transaminação, sendo catalisado pela GABA

transaminase (Owens e Kriegstein, 2002). Um esquema da síntese, transporte

e metabolização de GABA está representado na figura 6.

Figura 6. Diagrama esquemático da síntese, transporte e metabolização de GABA na sinapse. Abreviações: GAD (enzima ácido glutâmico decarboxilase); VGAT (transportador de neurotransmissor vesicular); GAT (transportadores de membrana); GABA-T (GABA transaminase). Fonte: Owens e Kriegstein, 2002.

37

Evidências pré-clínicas demonstram que o sistema GABAérgico está

envolvido com funções de modulação em termos de excitações e/ou inibições

sinápticas, interagindo com outros sistemas neuronais, como os sistemas

dopaminérgico e glutamatérgico, regulando de forma específica as interações

entre neurônios adjacentes em diferentes áreas do SNC (Gray et al., 1991). Em

vista disto, existe uma forte e crescente comprovação da associação entre a

atividade deste neurotransmissor e o mecanismo de ação da cocaína (Barrett

et al., 2004 ).

1.2.1. Isoenzimas Ácido Glutâmico Descarboxilase (GAD)

As isoenzimas ácido glutâmico descarboxilase (GAD) são responsáveis

pela produção do neurotransmissor GABA a partir do glutamato, utilizando o

piridoxal-5'-fosfato (PLP) como um cofator (Fenalti e Rowley, 2008). Por serem

responsáveis pela síntese de GABA, as duas principais isoformas, GAD65 e

GAD67, possuem um importante papel no funcionamento do SNC

(Soghomonian and Martin, 1998). Ambas isoenzimas estão presentes tanto nos

interneurônios quanto nas projeções neuronais, e apresentam diferentes tipos

de sinapses neuronais, incluindo sinapses dendrodendríticas, axosomáticas e

axodendríticas (Feldblum et al., 1993).

Cada uma destas isoformas é altamente conservada entre os

vertebrados e identificada em mais de 95% das seqüências de aminoácidos

das proteínas de gatos, ratos, camundongos e humanos. No entanto, em uma

mesma espécie, estas duas proteínas diferem substancialmente em sua

seqüência de aminoácidos (com apenas 65% de identidade no rato), seu peso

molecular, seu controle regulatório, suas localizações no interior dos neurônios,

38

sua expressão nas diferentes regiões cerebrais e em sua ligação com o cofator

PLP (Esclapez et al., 1994; Soghomonian and Martin, 1998).

As isoenzimas GAD são codificadas por genes distintos nos

cromossomos, e mostram substancial homologia em suas seqüências na maior

parte da molécula, diferindo apenas nos primeiros 100 aminoácidos N-terminais

(Fenalti e Rowley, 2008). A GAD67, localizada no cromossomo 2, é composta

por 593 amoinoácidos e possui peso molecular de 66600 dalton.

Diferentemente, a GAD65 está localizada no cromossomo 10, é composta por

585 aminoácidos e possui peso molecular de aproximadamente 65400 dalton

(Martin e Rimvall, 1993). A expressão da proteína GAD pode ser alterada por

mediação GABAérgica ou por outro mecanismo que afete a transcrição e a

tradução de GAD e/ou a estabilidade da proteína (Battaglioli et al., 2003). Por

outro lado, a regulação da síntese de GABA pode ser influenciada pelos níveis

relativos das isoenzimas GAD na forma holo- ou apo-GAD, ligada ou não ao

cofator piridoxal-5'-fosfato (PLP). Concentrações fisiológicas de GABA inativam

a enzima GAD, convertendo-a para apoenzima. Assim, entende-se que há um

mecanismo de controle de feedback direto da síntese de GABA pré-sináptico e

um apoio adicional para a regulação da GAD in vivo por um ciclo de inativação

e reativação (Porter e Martin, 1984).

A GAD65 é preferencialmente distribuída nos terminais nervosos e

encontra-se envolvida na síntese e liberação do GABA vesicular, servindo a

uma resposta rápida à demanda extra de GABA na neurotransmissão.

Diferentemente, a GAD67 é preferencialmente distribuída de maneira uniforme

no corpo neuronal. É constitutivamente ativa e responsável pela produção

basal de GABA. Tem sido implicada nas funções metabólicas e liberação do

39

GABA não vesicular e utilizada para outras funções como fator trófico de

desenvolvimento neuronal ou fonte de energia (Castañeda et al., 2005;

Soghomonian and Martin, 1998; Wei e Wu, 2008; Fenalti et al., 2007).

A GAD65, no SNC, encontra-se em maior quantidade na forma inativa de

apoGAD, isto é, não ligada ao PLP (Laprade e Soghomonian, 1995)

proporcionando, assim, um reservatório de GAD inativa, que pode ser utilizada

quando uma síntese adicional de GABA é necessária (Martin e Rimvall, 1993).

A interconversão apo e aloGAD apresenta um papel fundamental para a

regulação da atividade da enzima, pois a GAD65 consegue se ligar dez vezes

mais rapidamente ao PLP que a GAD67. Esta maior capacidade de se ligar ao

cofator sugere que a GAD65 seja a responsável pela síntese na

neurotransmissão GABAérgica (Battaglioli et al., 2003). Por outro lado, o fato

de a maioria das apoGAD neurais serem GAD65, faz com que esta forma da

enzima seja mais susceptível à regulação por fatores que afetam a associação

da apoGAD com o PLP, como concentrações de adenosina tri-fosfato (ATP) e

de fosfato inorgânico (Tillakaratne et al.,1995). A GAD67, por sua vez, é

encontrada na sua maioria na forma de aloGAD, isto é, ligada ao cofator, sendo

mais susceptível à regulação em nível transcricional, com um turnover mais

lento, sendo responsável pela manutenção dos níveis intracelulares do GABA

não sináptico (Searles et al., 2000).

As isoenzimas GAD65 e GAD67 são geralmente co-expressas em

neurônios GABAérgicos em várias regiões cerebrais (Soghomonian e Martin,

1998). Aqui, interessa-nos aprofundar a distribuição destas isoenzimas nas

regiões em estudo: estriado e Cpf.

40

A maioria dos neurônios no estriado (caudato-putamen, estriado dorsal;

NAc, estriado ventral) e nas regiões de projeção estriatal (pallidum, núcleo

entopeduncular e substância nigra reticulata) expressa as isoenzimas GAD na

síntese de GABA (Lindefors, 1993). No estriado, a distribuição destas

isoformas apresenta-se maior no NAc core e shell do que no caudato (Chen et

al., 2007). Além disso, os neurônios eferentes desta região foram mais

densamente marcados para o ácido ribonucléico mensageiro (RNAm) que

codifica GAD65 do que para o RNAm de GAD67, enquanto que o inverso foi

observado para interneurônios GABAérgicos (Mercugliano et al., 1992). Quanto

às projeções de neurônios estriatonigrais e estriatopalidais, sabe-se que estes

expressam tanto GAD67 quanto GAD65 (Yamamoto e Soghomonian, 2008). No

entanto, os neurônios do núcleo entopeduncular são muito mais densamente

marcados para RNAm de GAD65 do que para GAD67. Além disso, GAD65 é mais

expressa no núcleo entopeduncular (pallidum interno) do que no globus

pallidus (pallidum externo), uma estrutura que expressa concentrações

similares de ambos RNAm. Por outro lado, neurônios eferentes da substância

nigra reticulata expressam mais GAD67 do que a outra isoforma da enzima

(Mercugliano et al., 1992).

Evidências indicam que o Cpf está envolvido na transmissão

dopaminérgica no estriado e no NAc, assim como na atividade locomotora

(Sorg et al., 1995), o que justifica a análise dos níveis de GAD65 e GAD67 nesta

região. Embora poucos estudos que quantifiquem a expressão destas enzimas

no Cpf tenham sido realizados, sabe-se que estas isoformas apresentam

similar distribuição no Cpf medial e no caudato, embora os níveis sejam

menores do que os encontrados no NAc (Chen et al., 2007). Além disso, no

41

córtex cerebral, a população de corpos celulares imunorreativos a GAD67 são

maiores que os encontrados para GAD65 (Esclapez et al., 1994).

Por fim, a GAD65 é predominante nos sistemas visuais e

neuroendócrinos, que estão mais sujeitos às mudanças fásicas, enquanto a

GAD67 está presente em concentrações relativamente maiores em neurônios

tonicamente ativos (Feldblum et al., 1993). Assim, GAD65 e GAD67 juntas

podem proporcionar maior flexibilidade na regulação da síntese de GABA do

que se estivessem sozinhas.

1.2.2. Receptores GABA

O neurotransmissor GABA produz seus efeitos fisiológicos pela ação em

três diferentes subtipos de receptores: GABAA, GABAB e GABAC. Os

receptores GABAA e GABAC são ionotrópicos, canais iônicos, enquanto o

GABAB é metabotrópico, ou seja, acoplado a proteína G (figura 7) (Watanabe

et al., 2000).

Figura 7. Representação esquemática dos receptores GABAA, GABABR1, GABABR2 e GABAC. Fonte: Owens e Kriegstein, 2002.

Os receptores GABAA e GABAC consistem em cinco subunidades

homólogas que se unem formando um poro central seletivo a Cl- (Keramidas e

Harrison, 2008; Chebib e Johnston, 1999), produzindo rápida transmissão

42

sináptica inibitória (Balasubramanian et al., 2004). No entanto, são

bioquimicamente, farmacologicamente e fisiologicamente diferentes (Chebib e

Johnston, 1999).

Os receptores GABAA, em mamíferos, são compostos por 16

subunidades, que incluem α1–6, β1–3, γ1–3, δ, ε, π e θ (Sieghart e Sperk, 2002;

Darlison et al., 2005). Inúmeras combinações destas subunidades são

encontradas, mas a mais prevalente em mamíferos contém duas subunidades

α1, duas β2 e uma γ2 (Rudolph et al., 2001). Assim, as propriedades biofísicas e

farmacológicas dos receptores GABAA dependem da composição das

subunidades. A subunidade α, por exemplo, influencia na estrutura dos

benzodiazepínicos (BZ), que são agonistas GABAérgicos. Receptores GABAA

que expressam as subunidades α1, α2, α3 ou α5 possuem sítios de ligação

sensíveis aos BZ, enquanto os que contêm α4 ou α6 são insensíveis a estes

agonistas, mas respondem a agonistas inversos ou antagonistas GABAérgicos

(Wieland et al., 1992).

Os receptores GABAC são proteínas compostas pelas subunidades ρ1,

ρ2 e ρ3, de forma homo- ou heteropentamérica, esta última constituída por uma

combinação destas subunidades. Embora existam poucos estudos sobre este

receptor, o GABAC tem sido considerado uma variante farmacológica do

receptor GABAA (Owens e Kriegstein, 2002).

Os receptores GABAB (GABABR), por outro lado, são metabotrópicos,

compostos por sete receptores transmembrana que, através dos sistemas de

segundo mensageiro da fosfolipase C e adenilato ciclase, ativam canais iônicos

de K+ e Ca2+ via acoplamento à proteína G (Chebib e Johnston, 1999). Desta

forma, medeiam a neurotransmissão inibitória lenta de GABA pela regulação de

43

vários efetores. Estes receptores são formados por duas combinações

heterodímeras: GABABR1 e GABABR2, sendo que a subunidade GABABR1 é

subdividida em GABABR1a e GABABR1b (Marshall et al., 1999; Bowery et al.,

2002; Couve et al., 2000). O GABABR1 liga-se com baixa afinidade e com

muito menos eficiência ao GABA do que os receptores GABAB nativos e,

quando sozinho, é incapaz de realizar o tráfego até a superfície da célula de

forma eficiente. Já o GABABR2 é capaz de realizar este tráfego, embora

sozinho seja incapaz de ligar-se à proteína G. Quando GABABR1 e GABABR2

são co-expressos nas células, receptores na forma funcional são expressos na

superfície com propriedades semelhantes às de alguns receptores GABAB

nativos. No heterodímero, o GABABR1 parece vincular-se ao ligante, enquanto

que o GABABR2 parece ser o principal sítio de contato com a proteína G

(Balasubramanian et al., 2004).

1.3 Cocaína e o Sistema GABAérgico

A cocaína, assim como outros psicoestimulantes, além da conhecida

ação dopaminérgica, influencia a atividade do sistema GABAérgico. Neste

contexto, evidências apontam que o sistema GABA, através de ações pré e

pós-sinápticas, pode participar nos efeitos agudos e crônicos da cocaína.

Dependendo da região cerebral analisada, a administração de cocaína

pode: a) diminuir a liberação do GABA na ATV (Cameron e Williams, 1994;

Pierce e Kalivas, 1997); b) aumentar o GABA extracelular no Cpf (Jayaram e

Steketee, 2005); c) aumentar a imunorreatividade de GABA no cingulado

44

anterior (Little e Teyler, 1998); d) aumentar ou diminuir o turnover do GABA em

diferentes áreas cerebrais (Dworkin et al., 1995; Pierce e Kalivas, 1997); e)

reduzir a captação de cloreto induzida por GABA no estriado após tratamento

prolongado (Peris, 1996); f) aumentar a ligação dos receptores BZ no estriado

e hipocampo (Lipton et al., 1995, Goeders et al., 1990); e g) diminuir o efeito

inibitório do GABA em neurônios hipocampais (Ye et al., 1997).

O uso repetido de psicoestimulantes também influencia na atividade das

isoenzimas GAD65 e GAD67, conforme representado na figura 8. Neste sentido,

animais tratados repetidamente com cocaína mostram um aumento na

densidade de GAD65, medido por imunohistoquímica, no hipotálamo anterior e

no núcleo amidalóide central e medial, além de diminuição no septo lateral

(Ricci et al., 2005). Por outro lado, administração repetida de cocaína não

alterou a imunorreatividade do GAD65 no ventral pallidum (VP) (De Leon et al.,

2000), nem a expressão protéica desta isoenzima no NAc core, shell e caudato

(Chen et al., 2007). Em relação à GAD67, administração repetida de cocaína

diminui os níveis protéicos desta isoenzima no NAc core e shell (Chen et al.,

2007) e metanfetamina repetida acarretou diminuição da expressão do RNAm

de GAD67 no NAc medial (Lindefors et al., 1992). Por outro lado, os níveis de

RNAm de GAD67 não sofreram alterações após administração repetida de

cocaína no Cpf medial, estriado dorsolateral, NAc core e shell (Sorg et al.,

1995). Além disso, tratamento repetido com cocaína aumentou os níveis

protéicos de GAD67 no caudato (Chen et al., 2007) e anfetamina repetida

elevou os níveis de RNAm de GAD67 na amígdala central (Carta et al., 2008).

45

Figura 8. Representação esquemática do cérebro de rato e alterações em GAD65 (rosa) e GAD67 (azul) após exposição repetida à psicoestimulantes. Legenda: = indica não haver alteração, diminuição e aumento nos níveis das isoenzimas nas diferentes regiões cerebrais. Abreviações: AMI (amígdala), CAU (caudato), Cpf (córtex pré-frontal), HIPt (hipotálamo), SL (septo lateral), STR (estriado), NAc (núcleo accumbens) e VP (ventral pallidum).

Quando se leva em conta a retirada da cocaína após tratamento

repetido, há uma elevação nos níveis protéicos de GAD no hipotálamo após 1 e

8 dias de retirada, retornando aos níveis basais após 14 dias (Ma et al., 2008).

Adicionalmente, observou-se diminuição no RNAm de GAD67 após 30 dias de

retirada de anfetamina no estriado dorsal e no NAc core e shell, mas não na

amígdala central (Carta et al., 2008).

Quando os animais são expostos agudamente aos psicoestimulantes,

vê-se que os níveis de GAD estão alterados após seis horas da administração

de cocaína no NAc shell (Sorg et al., 1995), mas não após quatro horas da

administração aguda de anfetamina no NAc medial (Lindefors et al., 1992),

nem após uma hora da administração aguda de anfetamina no estriado dorsal,

no NAc core e shell, na amígdala central e basolateral (Carta et al, 2008).

As subunidades dos receptores GABAérgicos também são alteradas

pelo uso de psicoestimulantes. Estas alterações ocorrem principalmente em

regiões ricas em DA, sugerindo a hipótese de que os efeitos possam, também,

estar sendo mediados pelo sistema dopaminérgico, além de outros (Shumsky

46

et al., 2002). O estado funcional de receptores GABAA parece ser inversamente

proporcional à magnitude do efeito comportamental da cocaína. A injeção, no

estriado, de oligodeoxi-nucleotideos antisense de RNAm para subunidades

α2 e β3 diminui a expressão e função dos receptores e aumenta os efeitos no

comportamento rotatório induzido pela cocaína (Peris, 1998).

A sensibilização à cocaína está associada a uma diminuição na

expressão da subunidade α2 no NAc (Chen et al., 2007) e a depleção desta

subunidade em camundongos aboliu a sensibilização (Morris et al., 2008).

Injeções simples de cocaína alteram os níveis de RNAm da subunidade β2 no

córtex cingulado e da subunidade β3 no estriado e giro dentado, retornando ao

normal após um período de tempo (Yamaguchi et al., 2000). As subunidades β3

mostraram participar da indução da resposta comportamental pelo uso agudo e

crônico da cocaína, bem como mediar as adaptações neuroquímicas que

ocorrem durante a sensibilização pelo seu uso repetido (Resnick et al., 1999).

Os níveis protéicos da subunidade γ estão aumentados no hipotálamo após a

retirada da cocaína (Ma et al., 2008). Adicionalmente, a expressão gênica das

subunidades dos receptores GABAB sofre upregulation na região do hipocampo

após administração de cocaína (Li et al., 2003). Na exposição pré-natal à

cocaína, ocorrem alterações na distribuição das subunidades α1, β2 e γ no

córtex cingulado anterior, que retornam ao normal após alguns dias (Shumsky

et al., 2002).

Enfim, vários são os estudos que avaliam o papel do sistema GABA nos

efeitos dos psicoestimulantes. No entanto, os mecanismos pelos quais a

cocaína modifica este sistema ainda não estão completamente estabelecidos,

necessitando de pesquisas adicionais que concernem esta questão.

47

1.4. Sensibilização comportamental

Conforme explicitado anteriormente, a sensibilização comportamental

pode ser entendida como um aumento progressivo da resposta pela

administração repetida e intermitente de drogas de abuso como a cocaína,

anfetaminas, opióides, álcool ou nicotina (Wood et al., 1998; Robinson e

Berridge, 1993; Steketee, 2003). Além disso, a sensibilização à cocaína pode

ser desencadeada pelo estresse crônico (Araujo et al., 2003). Este fenômeno

envolve efeitos das drogas na atividade psicomotora, como a sua habilidade de

aumentar a atividade locomotora, o comportamento rotatório e os padrões

motores de estereotipia (Robinson e Berridge, 2001).

A sensibilização comportamental à cocaína foi primeiramente relatada

por Downs e Eddy, em 1932 (Downs e Eddy, 1932). A partir de então,

numerosos estudos têm sido realizados para determinar os mecanismos

através dos quais a sensibilização é estabelecida. Conforme revisado por

Robinson e Berridge (2001), a sensibilização é um fenômeno muito complexo e

rico. Por exemplo, é dose-dependente, geralmente observada apenas quando

as drogas são administradas intermitentemente, muitas vezes mais evidente

após longa descontinuação do tratamento repetido do que logo após a

descontinuação da droga. A sensibilização pode persistir por vários meses ou

anos, inclusive quando esta é induzida durante a adolescência, podendo

perdurar até o início da idade adulta (Marin et al., 2008). Adicionalmente, este

fenômeno pode ser observado não apenas após a administração da droga pelo

pesquisador, mas também após a auto-administração da mesma e, por fim, a

48

susceptibilidade à sensibilização possui grande variabilidade individual

(Robinson e Berridge, 2001).

Esta variabilidade individual pode ser observada, tanto em humanos

quanto animais de experimentação, na primeira resposta às drogas ou no

desenvolvimento da dependência e da sensibilização. Vários estudos

verificaram que a implementação deste processo não ocorre, ou ocorre de

maneira diferente, em alguns indivíduos (Brady et al., 2005; Cailhol e Mormède,

1999; Elmer, 1996). Alguns mostram uma rápida e robusta sensibilização com

uma determinada dose da droga, enquanto outros sensibilizam muito pouco ou

não sensibilizam (Robinson e Berridge, 2001). Com isso, várias teorias têm

sido estudadas para explicar a variabilidade encontrada neste processo. Dentre

elas, sugere-se que o grau de sensibilização produzida pode ser determinado

pela droga, dose, hora da administração ou contexto ambiental (Elmer, 1996).

Em animais de experimentação, esta variação parece estar associada a uma

maior capacidade de resposta dos neurônios dopaminérgicos do NAc

decorrente do aumento de DA extracelular pelo uso de psicoestimulantes

(Costa et al., 2007; Chefer et al., 2003). Além disso, os fatores subjacentes às

diferenças individuais podem ser devidos, em parte, ao genótipo do indivíduo

(Elmer, 1996). Em camundongos, uma variação genótipo-dependente na

resposta comportamental aguda à cocaína e ao grau de sensibilização já foi

demonstrada (Cailhol e Mormède, 1999). Também os padrões de distúrbios

comportamentais em adolescentes toxicodependentes são diferentes entre os

grupos étnicos e entre gêneros (Dafny e Yang, 2006). No que diz respeito às

diferenças sexuais na resposta aos psicoestimulantes, ratas fêmeas costumam

mostrar uma maior sensibilidade comportamental à exposição aguda e repetida

49

quando comparadas com os machos (Cailhol e Mormède, 1999). Em relação à

idade, se percebe diferente resposta à sensibilização comportamental. Ratos

jovens apresentam uma atenuação, enquanto ratos adultos exibem um

aumento da resposta a psicoestimulantes (Dafny e Yang, 2006; Bowman e

Kuhn, 1996). Portanto, embora a variabilidade entre os grupos seja

consideravelmente menor na pesquisa experimental, verificar a sensibilização

comportamental em modelos animais de dependência é complicado, uma vez

que este processo é muito complexo e depende de vários fatores associados.

Estudos que verifiquem os mecanismos cerebrais envolvidos neste processo

são necessários para que se possa elucidar de que forma as drogas

psicoestimulantes atuam no desenvolvimento da sensibilização

comportamental.

A sensibilização comportamental exibe dois perfis temporais distintos:

(1) indução/iniciação e (2) expressão, que envolvem diferentes mecanismos

anatômicos e fisiológicos (Dafny e Yang, 2006; Vanderschuren e Kalivas,

2000). A indução/iniciação é definida como a seqüência de acontecimentos

celulares e moleculares induzidos pelos psicoestimulantes que podem levar a

mudanças duradouras na função neuronal responsável pelo comportamento

sensibilizado, provavelmente mediada pelos neurônios dopaminérgicos da

ATV. A expressão é definida como uma alteração neural decorrente do

processo de iniciação que medeia a resposta comportamental aumentada por

um período prolongado de tempo, na presença da droga após um período de

abstinência, sendo mediada pelo NAc (Dafny e Yang, 2006).

Outra importante característica da sensibilização é que esta não é uma

conseqüência inevitável do uso repetido de drogas. Ela é poderosamente

50

modulada pelo aprendizado e por circunstâncias envolvidas durante o uso da

droga. O aprendizado pode modular a sensibilização de duas maneiras: 1)

quando a modulação da expressão da sensibilização neural já foi previamente

induzida, conhecida como modulação contexto-específica. Esta ocorre quando

os animais recebem um desafio da droga em um ambiente diferente daquele

em que anteriormente receberam o tratamento. Neste contexto, a

sensibilização comportamental pode não ser expressa, embora se saiba que a

sensibilização neural realmente tenha ocorrido. Esta modulação contextual

pode contribuir para o papel fundamental que a sensibilização desempenha na

recaída, quando o indivíduo retorna ao local onde costumava receber a droga;

e 2) quando a sensibilização neural é induzida em ambiente reconhecido pelo

indivíduo há menor efetividade na indução da sensibilização pela droga (ou, ao

menos, a velocidade e o grau de sensibilização produzida por uma

determinada dose da droga). Por exemplo, quando doses baixas a moderadas

da droga, administradas no ambiente onde o animal vive, mostram-se menos

eficazes na indução da sensibilização do que se as mesmas doses fossem

dadas em um ambiente desconhecido (Robinson e Berridge, 2001).

Neste contexto, a sensibilização comportamental pode ser atribuída não

somente à ação farmacológica direta das drogas, como também aos

conhecimentos associados com o uso destas (Pierce e Kalivas, 1997). A

sensibilização pode estar envolvida no desenvolvimento e na manutenção da

dependência, desempenhando um papel importante na procura e no uso

compulsivo de drogas, servindo como modelo de comportamento de

dependência (Robinson e Berridge, 1993; Dafny e Yang 2006). Segundo Wise

e Bozarth (1987), o estabelecimento da dependência está relacionado à

51

capacidade da droga em ativar as vias de recompensa cerebrais e induzir

estimulação psicomotora. Em alguns indivíduos, o uso repetido de drogas pode

produzir adaptações permanentes no sistema neural de recompensa, tornando-

o cada vez mais sensibilizado à droga e aos estímulos associados (Robinson e

Berridge, 1993). Assim, a sensibilização das vias motivacionais e estimulantes

das drogas poderia contribuir para um aumento da busca pela droga e,

conseqüentemente, para o estabelecimento da dependência (Robinson e

Berridge, 1993; Stewart e Badiani, 1993).

Em animais de laboratório, segundo Vanderschuren e Kalivas (2000), a

sensibilização é induzida pela administração repetida da droga, podendo ser

comprovada por meio de testes comportamentais. Após um período de

abstinência, uma dose-desafio da droga é administrada para que haja a

expressão da sensibilização. A expressão pode ser a curto prazo, quando o

desafio com a droga ocorre logo após o tratamento, ou a longo prazo, quando

este é realizado algum tempo depois. Embora bastante relatados, os efeitos da

sensibilização a psicoestimulantes na atividade locomotora de ratos é de difícil

interpretação, uma vez que, dependendo da dose utilizada, pode-se observar

tanto aumento quanto uma diminuição na locomoção, provavelmente

decorrente do aparecimento de comportamento estereotipado (Flagel e

Robinson, 2007; Wood et al., 1998). Desta forma, em baixas doses, drogas

psicoestimulantes produzem hiperatividade locomotora. Com o aumento da

dose, entretanto, é observada uma transição a um comportamento

progressivamente dominado por ações de estereotipia, como movimentos

circulares e repetitivos com a cabeça, ataxia das patas traseiras, cheirar de

52

forma exacerbada e conseqüente diminuição da atividade locomotora (Brady,

2005; Becker et al., 2001).

Estudo realizado em humanos revelou que a sensibilização à anfetamina

aumentou significativamente a atividade/energia, humor, fala e piscar de olhos

em usuários desta droga (Strakowski et al., 1996). Gasior et al. (1999),

observaram que a ocorrência de sensibilização à cocaína em humanos pode

ser percebida pelo aumento da ansiedade, da atividade locomotora, ocorrência

de delírios e convulsões e, em último caso, morte. Outro estudo mostra que

usuários sensibilizados à cocaína possuem maiores taxas de recaída (Bartlett

et al., 1997). Portanto, embora poucos estudos clínicos tenham sido realizados

e apesar das limitações das técnicas, as evidências sugerem que a exposição

repetida de psicoestimulantes pode sensibilizar vários efeitos das drogas em

humanos.

1.4.1. Vias neurais envolvidas na sensibilização à cocaína

As vias dopaminérgicas mesocorticolímbicas, essenciais para o fluxo de

informações entre o sistema límbico e o motor, além de estarem envolvidas nos

mecanismos de recompensa das drogas, também fazem parte do processo de

sensibilização comportamental (Dafny e Yang, 2006). Além da ATV e do NAc, o

Cpf e o estriado também possuem um importante papel na sensibilização

comportamental aos psicoestimulantes, uma vez que estes formam

coletivamente o “circuito motivacional” (Pierce e Kalivas, 1997). Portanto, este

circuito está envolvido na tradução dos estímulos ambientais e farmacológicos

na resposta motora adaptativa ao processo de sensibilização aos

psicoestimulantes.

53

O sistema GABAérgico também está envolvido neste processo. O NAc

modula o funcionamento da ATV por meio de neurônios que contém GABA

(Pierce e Kalivas, 1997) e agentes GABAérgicos têm mostrado modificar a

expressão de sensibilização comportamental produzida por psicoestimulantes.

A injeção sistêmica de clonazepam preveniu o desenvolvimento de

sensibilização à metanfetamina (Ito et al., 1997), e o valproato de sódio

atenuou os efeitos locomotores agudos do metilfenidato e bloqueou o

desenvolvimento da sensibilização após administração repetida deste

psicoestimulante (Eckermann et al., 2001).

Há algum tempo já se discute as vias neurais envolvidas no processo de

sensibilização comportamental. Conforme revisado por Pierce e Kalivas (1997),

além do NAc, a expressão da sensibilização envolve o engajamento de outros

três núcleos do circuito motivacional, representado na figura 9: 1) Na ATV, as

mudanças incluem um aumento na transmissão de glutamato e diminuição na

transmissão de GABA. Ambas as modificações podem estimular a freqüência

de disparos e/ou a atividade dos neurônios dopaminérgicos, que irá promover

um aumento da DA no NAc e conseqüente aumento da atividade locomotora,

em contrapartida, a estimulação dos receptores GABAB nesta região inibe a

atividade motora induzida pelos psicoestimulantes. 2) A administração repetida

de cocaína reduz a transmissão dopaminérgica no Cpf. O bloqueio dos

receptores de DA nesta região aumenta a transmissão dopaminérgica no NAc

e a resposta locomotora aos psicoestimulantes. Estes efeitos parecem resultar

na desinibição dos neurônios corticais excitatórios. Deste modo, a transmissão

de DA reduzida no Cpf pode ocorrer, em parte, pelo aumento da transmissão

glutamatérgica na ATV e NAc observadas em conjunto com a expressão da

54

sensibilização. 3) A liberação de GABA no VP é aumentada durante a

expressão da sensibilização comportamental à cocaína com diminuição da

atividade das vias inibitórias GABAérgicas eferentes para a ATV e tálamo

médio dorsal. No entanto, o fato da injeção de um agonista GABA no VP inibir

a atividade motora induzida pelos psicoestimulantes indica que o aumento da

transmissão GABAérgica no VP pode agir para limitar a resposta motora

sensibilizada.

GLU

GABA

GABA

GABAGABA

DADA

DADIN

CPF

NA

ATV

VP

MDTal

GLU

GLUGLU

GABA

GABA

GABAGABA

DADA

DADIN

CPF

NA

ATV

VP

MDTal

GLU

GLU

Figura 9. Topografia do circuito motivacional e as neurotransmissões associadas com a expressão da sensibilização comportamental. As linhas grossas indicam aumento, enquanto que as linhas cortadas diminuição na neurotransmissão. DA, dopamina; DIN, dinorfina; GABA; GLU, glutamato; MD Tal, tálamo mediodorsal; NA, núcleo accumbens; CPF, córtex pré-frontal; VP, ventral pallidum; ATV, área tegmentar ventral. Adaptado de Pierce e Kalivas (1997).

Levando em conta as inúmeras regiões cerebrais envolvidas no

processo de sensibilização à cocaína, apresentaremos algumas informações

referentes às regiões cerebrais por nós analisadas. Com isso, pretendemos

elucidar a participação do Cpf e do estriado nas alterações GABAérgicas e

comportamentais induzidas pelo uso de psicoestimulantes.

55

Neste sentido, vale ressaltar que os receptores dos neurônios GABA e

dopaminérgicos se co-localizam no estriado, Cpf e hipocampo, regiões

cerebrais relacionadas aos efeitos da cocaína no sistema GABAérgico

(Yamaguchi et al., 2000). O estriado é uma região distinta no complexo

estriatal, sendo sítio de ação para os efeitos motores das drogas de abuso e

associado a neuroadaptações a estas drogas (Robinson e Berridge, 1993).

Esta estrutura neural contém neurônios GABAérgicos, e a vasta maioria de

seus neurônios (90-95%) contém GABA (Zahm e Heimer 1990; Churchill e

Kalivas, 1994). Está envolvido na indução e expressão da sensibilização

comportamental (Pierce e Kalivas, 1997) e medeia as facetas do reforço à

cocaína (Hubner e Koob, 1990).

Por outro lado, estudos recentes têm implicado um importante papel do

Cpf no desenvolvimento do comportamento de dependência (Huang et al.,

2007). Evidências apontam alterações de múltiplos sistemas de

neurotransmissores no Cpf, incluindo GABA, DA, serotonina, glutamato,

noradrenalina, acetilcolina e peptídeos, sendo que a sinalização de receptores

ativada por estes neurotransmissores pode contribuir para o desenvolvimento

da sensibilização comportamental e adição a psicoestimulantes (Steketee,

2003).

Neurônios de circuitos locais são a principal fonte de GABA no Cpf

medial (Retaux et al., 1992; 1993) e os neurônios GABAérgicos na ATV

também projetam-se para esta região (Carr e Sesack, 2000). Além disso, as

projeções corticais pré-frontais ao complexo estriatal podem contribuir para o

papel modulador do Cpf, associado à inibição de atividades motoras e

56

comportamentais, e podem ser afetadas pela exposição a longo prazo a drogas

de abuso (Jentsch e Taylor, 1999).

O controle cortical inibitório do estriado também parece envolver a

atividade GABA, já que a injeção local de bicuculina, um antagonista GABA,

resulta em aumento da DA extracelular recuperada por microdiálise no

estriado (Karler et al., 1998; Karreman e Moghaddam, 1996). Já o aumento da

DA induzido por psicoestimulantes ativa receptores D2, e pode diminuir o

estímulo excitatório por inibir neurônios piramidais glutamatérgicos, através da

liberação de GABA (Steketee e Beyer, 2005).

Adaptações a longo prazo nas células piramidais do Cpf por exposição

repetida a cocaína (Trantham et al., 2002) estão associadas a aumento

transitório na transmissão GABA pré-frontal (Jayaram e Steketee, 2005) e

diminuição da função dopaminérgica no Cpf (Beyer e Steketee, 2002).

Portanto, o GABA regula os processos excitatórios do Cpf e serve como

intermediário na modulação DA nestes neurônios piramidais (Jayaram e

Steketee, 2005). A resposta motora excitatória característica dos

psicoestimulantes pode depender de inibição de vias inibitórias no estriado,

resultantes da excitação no córtex (Karler et al., 1995).

Com isso, entende-se que as vias neurais envolvidas no processo de

sensibilização à cocaína fazem parte de um complexo mecanismo, envolvendo

inúmeros neurotrasmissores e regiões cerebrais, que necessitam de estudos

adicionais para serem completamente elucidados.

57

2. JUSTIFICATIVA

As neuroadaptações resultantes do processo de sensibilização

comportamental desempenham um importante papel no desenvolvimento da

dependência à cocaína. Este processo está relacionado com um aumento do

número e da sensibilidade dos receptores dopaminérgicos no sistema

mesocorticolímbico. Adicionalmente, além da alteração no sistema GABAérgico

decorrente da ativação do sistema dopaminérgico, a sensibilização

comportamental também pode influenciar diretamente a atividade dos

neurônios GABAérgicos.

O desenvolvimento da sensibilização comportamental à cocaína é

diferente entre os sexos, com indivíduos do sexo feminino experimentando

efeitos comportamentais mais intensos do que os machos. Os hormônios

sexuais femininos têm um importante papel nestas diferenças.

O uso repetido de psicoestimulantes, como a cocaína, também influencia

na atividade das isoenzimas ácido glutâmico descarboxilase (GAD65 e GAD67),

responsáveis pela síntese de GABA, aumentando ou diminuindo sua

expressão, de acordo com a região cerebral analisada. No entanto, não

existem estudos que avaliem alterações na expressão de GAD65 e GAD67 após

tratamento repetido com cocaína em fêmeas.

Portanto, a neurobiologia da dependência à cocaína ainda possui

inúmeras lacunas que necessitam ser desvendadas. O estudo dos mecanismos

pelos quais o uso repetido desta substância desenvolve suas propriedades de

reforço e recaída é de fundamental importância para o tratamento dos usuários

58

de cocaína, uma vez que estes poderão trazer subsídios para o

desenvolvimento de novos fármacos.

Embora as mulheres sejam mais sensíveis aos efeitos das drogas de

abuso, raros são os estudos que avaliam os efeitos destas substâncias em

indivíduos do sexo feminino. O desenvolvimento de pesquisas voltadas para

este público visando o direcionamento de ações de tratamento e de diminuição

dos efeitos das drogas nestes indivíduos é indispensável.

Portanto, este trabalho justifica-se pela relevância do estudo dos

mecanismos GABAérgicos envolvidos nos efeitos da cocaína em indivíduos do

sexo feminino.

59

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

Comparar os níveis de sensibilização à cocaína a modificações nas

enzimas ácido glutâmico descarboxilase (GAD65 e GAD67) no córtex pré-frontal

e estriado de ratas.

3.2. Objetivos Secundários

3.2.1. Sensibilização comportamental

Avaliar a sensibilização comportamental em ratas fêmeas após

administração repetida de cocaína.

3.2.2. Expressão gênica das isoenzimas GAD65 e GAD67

Analisar a expressão gênica das isoenzimas ácido glutâmico

descarboxilase (GAD65 e GAD67) no estriado e córtex pré-frontal de ratas

tratadas aguda e repetidamente com cocaína.

60

4. REFERÊNCIAS

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APA (American Psychiatric Association). DSM-IV-TR, Diagnostic and statistical manual of mental disorders. Washingon, DC: APA. 2002.

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5. ARTIGO CIENTÍFICO

REVISTA: Behavioural Pharmacology

79

Repetitive cocaine administration differentially decreased GAD65 and

GAD67 mRNA expression in the striatum and prefrontal cortex in female

rats

Marilise Fraga de Souzaa, Viviane Maria Toniazoa, Ana Paula Guedes

Frazzonb, Helena Maria Tannhauser Barrosa,*.

a Laboratory of Psychopharmacology, Department of Physiology, Federal

University of Health Sciences of Porto Alegre - UFSCPA, Porto Alegre, Brazil.

b Medical Sciences Postgraduate Program, Federal University of Health

Sciences of Porto Alegre - UFSCPA, Porto Alegre, Brazil.

ABSTRACT

Dopaminergic and glutamatergic pathways are central to the sensitized

behavioral responses to cocaine, which are opposed by the inhibitory

GABAergic system. This study further investigated the correlations between

cocaine sensitization and modifications in GABA synthesis isoenzymes in the

prefrontal cortex and striatum of rats. Ovariectomized female rats received

saline or cocaine repeatedly and after a challenge cocaine dose, locomotion

and stereotypies were monitored. Not all animals presented sensitization after

repeated cocaine. A single exposure to cocaine did not change the expression

of GAD mRNA in brain areas. GAD65 and GAD67 mRNA were significantly

lowered in the striatum of repeatedly-treated animals irrespective of rats

showing sensitization or not. Only sensitized animals presented significant

80

reduction of prefrontal cortex GAD65 mRNA. GAD67 in the prefrontal cortex was

reduced only in sensitized animals showing stereotypies. Present results

suggest that only repeatedly administered cocaine affects GAD isoenzymes

expression in the striatum and prefrontal cortex of female rats. In the prefrontal

cortex repeated cocaine by itself does not lead to GAD changes. Sensitization

is associated with decreased GAD65 mRNA expression in the prefrontal cortex

of females, while regulation of GAD67 expression in the prefrontal cortex

appears to be changed only after highest sensitization is achieved.

Keywords: cocaine, sensitization, GAD isoenzymes, striatum, prefrontal cortex.

Introduction

Chronic intermittent administration of a psychomotor stimulants typically

produces a phenomenon known as behavioral sensitization (Wood et al. 1998;

Brady et al. 2005; Kikusui et al. 2005; Robinson and Camp 1987). Locomotor

hyperactivity is exhibited after acute exposure to psychostimulant drugs. Higher

cocaine doses and repeated drug treatment, behavior changes in complex

ways, in part because motor behaviors are progressively dominated by more

stereotyped actions (Flagel and Robinson 2007). Behavioral sensitization is

thought to be based on neural processes that are relevant to addictive

behaviors (Robinson and Berridge 1993; Brady et al. 2005). Dopaminergic and

glutamatergic pathways are considered central to the sensitized behavioral

responses to cocaine (Brady et al. 2005; Stephens 1995). The glutamatergic

81

excitatory influence is opposed by the GABAergic, inhibitory system, which

appears also to be relevant in psychostimulant sensitization (Stephens 1995;

Allison and Pratt 2003). Psychostimulants also appear to influence directly the

activity of GABAergic neurons. Chronic cocaine administration has been shown

to: a) both increase or decrease GABA turnover in different brain areas

(Dworkin et al. 1995; Pierce and Kalivas 1997; Smith et al. 2003), b) decrease

the release of GABA in the ventral tegmental area (Cameron and Williams

1994; Pierce and Kalivas 1997), and c) increase extracellular GABA in the

prefrontal cortex (Jayaram and Steketee 2005). Concomitantly, repeated

cocaine-treated animals show an increase or decrease in the density of GAD65-

immunoreactivity puncta in different brain areas (Ricci et al. 2005) and

decreased GAD67 mRNA in the medial nucleus accumbens (Lindefors et al.

1992) and increased GAD67 mRNA in the hippocampus (Di Chiara et al. 1980).

Thus there is supporting evidence that repeated cocaine may alter GABA

activity, the direction of change depends on the brain area under study.

Gamma-AminoButyric Acid (GABA) is the main inhibitory

neurotransmitter in the central nervous system (Laprade and Soghomonian

1995). It is produced in the brain by two isoforms of glutamic acid

decarboxylase, GAD65 and GAD67 (Ricci et al. 2005) that differ in their

contributions to the synaptic and non-synaptic pools of GABA (Lindefors 1993;

Soghomonian and Martin 1998; Sheikh et al. 1999). Recent studies have

implicated an important role for the prefrontal cortex (PFC) in the development

of addictive behaviors (Huang et al. 2007). Evidence is accumulating that the

alterations of multiple medial PFC neurotransmitter systems, including GABA,

dopamine, serotonin, glutamate, noradrenalin, acetylcholine and peptides, and

82

signaling by receptors activated by these neurotransmitters may contribute to

the development of psychostimulant-induced behavioral sensitization and

addiction (Steketee 2003). Local circuit neurons in the medial PFC are thought

to be the main source of GABA in this region (Retaux et al. 1992; 1993) and

GABAergic neurons in the VTA also project to the medial PFC (Carr and

Sesack 2000). The striatum (STR) is a putative site of action for the motor

activating effects of drugs of abuse and associated neuroadaptations (Robinson

and Berridge 1993). It may be involved in the induction and expression phases

of psychostimulant sensitization (Pierce and Kalivas 1997) and may mediate

facets of cocaine reinforcement (Hubner and Koob 1990). The STR contains

GABAergic medium sized spiny projection neurons and the vast majority of its

neurons (90-95%) contain GABA (Zahm and Heimer 1990; Churchill e Kalivas

1994).

As recently reviewed, human females, also seen in animal models, are

more prone to drugs effects and begin regular self-administration of cocaine at

lower doses than do males, escalate drug use more rapidly to addiction, and

females are at greater risk for relapse following abstinence (Becker and Hu

2008).

Although interference with GABA and GAD may be expected after

cocaine treatment particularly in females, no information exists on the relevance

of changes in GAD expression in rats after acute or repeated cocaine treatment.

Therefore, the objective of this study is to investigate the effects of sensitization

to cocaine or a single cocaine challenge on the expression of GAD65 and GAD67

mRNA in the PFC and STR of female ovariectomized rats.

Methods

83

Animals and experimental design

Female Wistar rats 250-350g (n=70) were obtained from the Animal

House of UFCSPA. Rats were housed with access to food and water ad libitum,

and were maintained in a temperature controlled room (22±2°C) under

light/dark cycle with lights on from 7:00 a.m. – 7:00 p.m. All experiments

followed the Guidelines of the International Council for Laboratory Animal

Science (ICLAS) and were approved by the Ethical Committee for Animal

Experimentation of UFCSPA.

Procedures

Rats were randomly assigned to one of the drug treatment groups. The

controls (CTR) received saline daily during the sensitization phase and a saline

challenge; animals assigned to the acute cocaine group (ACT) received saline

daily during the sensitization phase and a 30 mg/kg cocaine (ENILA, Brazil)

challenge dose. Animals in the repeated cocaine group (RPT) received 30

mg/kg cocaine daily during the sensitization phase and a 30 mg/kg cocaine

challenge dose. The CTR group was composed of 10 animals and ACT and

RPT groups of 30 animals each.

Because female sex hormones influence cocaine effects, bilateral

ovariectomy under 10 mg/kg xylazine plus 50 mg/kg ketamine hydrochloride i.p.

(Ribeiro et al. 2000; Sotiriadou et al. 2003) was performed in all rats two weeks

before starting the sensitization protocol. On the first experimental day, as may

be seen in the time line (Figure 1), two weeks after ovariectomy, the rats were

introduced for 60 min in an infrared photocell apparatus (80 cm long, 26 cm

wide, 22 cm high) with three photocells to monitor horizontal motor activity

(Alsbarsch, Brazil). This procedure also had the purpose of habituating the rats

84

to the activity monitors and to reduce the variability of the baseline locomotor

activity. After this habituation period, rats from the CTR and ACT groups

received saline 1 ml/kg i.p. and rats from the RPT group received 30 mg/kg

cocaine hydrochloride i.p. Motor activity was monitored again for another 60

minutes post-injection, in consecutive 15-minute intervals. Over the course of

five consecutive days, the animals were administered either saline or cocaine

30 mg/kg once daily, as scheduled. Because expression of cocaine

sensitization is more robust following a drug-free interval (Crombag et al. 2002),

injections were discontinued for 5 days. On day 12, rats were again placed into

the photocell chamber for the 60-minute adaptation period, and thereafter

animals from the CTR were administered saline and those from the ACT and

RPT groups received 30 mg/kg cocaine. Motor activity was monitored in 15

minute intervals for 60 minutes after the challenge doses. These motor activity

data were used to evaluate sensitization along with the behaviors occurring

inside the locomotion chamber that were videotaped for ethological analysis of

stereotypies. One hour after the behavioral observation of the cocaine

challenge, the animals were decapitated, the dorsal striatum and prefrontal

cortex were then dissected, frozen in liquid nitrogen and stored at -80ºC for

further mRNA analysis.

Ethological behavioral analysis

Videotapes of the animals were later analyzed for behavioral stereotypy

by two trained observers blind to the animal treatment groups. Stereotyped

behaviors were measured for 60 min after injections. Observational data were

collected using a time-sampling procedure in which behaviors of each animal

were observed for 30 sec once every 3-min test block and checked off of a

85

predetermined checklist. The behaviors measured included rearing

(unsupported or supported body in vertical position), grooming (mouth or paws

on body), stereotyped sniffing (exacerbated and repetitive sniffing movements,

which may or may not be continuous, mostly with the nose directed to a corner

of the chamber), stereotyped head scanning (repetitive movements of the head,

either up-and-down and directed toward one wall or corner of the chamber or

side-to-side motions in which the nose usually contacted the floor), pivoting and

splayed hind limbs (Becker et al. 2001).

RNA extraction and RT-PCR analysis

A semi-quantitative RT-PCR technique was used to determine the levels

of GAD65 and GAD67 mRNA. Total RNA was isolated from 70-90 mg of STR

and PFC using a Trizol® Isolation Reagent Kit (InvitrogenTM Life Technologies

Inc., NY, USA), according to the instructions of the manufacturer. Total RNA

purity was assessed by UV spectrophotometry (Gen Quant II®, Amersham

Pharmacia Biotech). A 3 μg aliquot of total RNA was reverse transcribed using

the SuperScriptTM First-Strand Synthesis System for RT-PCR (InvitrogenTM Life

Technologies Inc., NY, USA), according to the instructions of the manufacturer.

Specific oligonucleotides derived from the coding region of published

sequences of GAD65 (5’ GCTCTACGGAGACTCTGAGAAG 3’ and 5’

CGGTTGGTCTGACAATTCCC 3’) and GAD67 (5’

TGTGGCGTAGCCCATGGATG 3’ and 5’ ACTGGTGTGGGTGGTGGAAG 3’),

genes were used to prime target cDNA, resulting in predicted 318 and 330 bp

sequence, respectively. The β-actin primer set (5’

TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG 3’ and 5’ TTGATGTCACGCACGATTTCC

3’) that generated a 515 bp product was used as an internal control. β-actin was

86

co-amplified within the same reaction in order to evaluate inter-sample variation

in cDNA contents and PCR efficiency.

The PCR reaction included 2 μl of the RT product, and was carried out

with Taq DNA polymerase (InvitrogenTM Life Technologies Inc., NY, USA) in a

final volume of 25 μl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 μM of specific primer, and 200 μM

dNTPs. PCR was performed in a Mastercycler® Personal thermal cycler

(Eppendorf, Hamburg, Germany). The amplification profile was an initial

denaturation step at 94°C for 3 min, followed by 94ºC for 1 min, annealing at

60°C, extension at 72ºC for 1 min, and final extension at 72°C for 5 min.

The β-actin primers were included after the fifth cycle for both GAD65 and

GAD67. RT-PCR reactions without cDNA samples were carried out as negative

controls. All reactions were performed in duplicate. After amplification, 10 μl of

PCR products were analyzed on a 1.5% ethidium bromide agarose gel. The

intensity of each band was determined by optical densitometry (ImageMaster®

VDS, Amersham Pharmacia Biotech). DNA band intensity was normalized

against the corresponding values of the β-actin band intensity. The GAD65/β-

actin and GAD67/β-actin ratios were used for statistical analysis.

Statistical analysis

Locomotion and the stereotypy data (sniffing, pivoting, head bobbing,

splayed hind limbs or total stereotypy) from the cocaine challenge day (day 12)

were analyzed with a One Way ANOVA, considering the treatment groups

(CTR, ACT and RPT). An additional analysis of the motor data considering the

different cocaine treatment groups (CTR, ACT and RPT) and the four periods of

observation within one hour was performed with a Two-Way Repeated

Measures Analysis of Variance was used for this analysis.

87

Motor data of the RPT group were used to compare the behaviors on

days 1 and 12 of observation considering the sensitization criteria (eliminated,

non-sensitized or sensitized animals) according to Brady et al., (2005), with a

Two Way Repeated Measures ANOVA. The degree of sensitization was

estimated as percent change of motor behavior from baseline. Based on this

percent change, animals were classified as hyper- or hypolocomotion-sensitized

(SENS) when locomotion showed ≥50% change from baseline or as non-

sensitized (N-SENS) when locomotion changed ≤25% from baseline. Data from

animals exhibiting a change between 25 and 50% from the baseline locomotion

were not taken into account.

Analysis of the mRNA optical density data was performed via a Three

Way ANOVA, considering the GAD isoenzyme measured (GAD65 and GAD67),

treatment with cocaine (CTR, ACT and RPT) and brain region (STR or PFC).

Because there was a significant difference between isoenzymes, a One Way

ANOVA was performed to each cerebral structure to analyze of GAD65 and

GAD67 expression separately, considering drug treatment (CTR, ACT and RPT).

The Student-Newman-Keuls test was used for post-hoc comparisons

when appropriate. All data are presented as means ± SEM. A p value of less

than 0.05 was considered significant.

Results

Behavioral changes

The analysis of the 60-min motor activity from the cocaine challenge day

revealed an overall increased locomotor activity in rats that received cocaine in

comparison to controls. Diminished locomotion was seen in RPT rats when

compared to ACT treated cocaine rats (F(2,74)=56.235; p<0.001) due to

88

stereotyped behaviors in the RPT animals. This significantly lower increment in

locomotion on the RPT cocaine treated animals (Finteraction (6,180)=2.510; p=0.023)

was seen during the periods between 15 to 30 minutes and 30 to 45 minutes of

observation after the cocaine challenge (data not showed).

The locomotor response during the cocaine challenge of individual

animals of the RPT treatment was compared to their behaviors during day 1, to

estimate the degree of sensitization as percent change from baseline, as

explained above (Brady et al. 2005). Given these criteria, 56.7% (n=17) of the

animals treated repeatedly with cocaine showed behavioral sensitization to a

challenge dose of cocaine (≥50% change of behavior from baseline), 26.7%

(n=8) did not develop sensitization to cocaine (≤25% change of behavior from

baseline) and 16.6% (n=5) were in between the two values and were excluded.

Of the sensitized animals, 6 presented hyperlocomotion, the other 11 sensitized

animals showed hypolocomotion and intense stereotypy. Locomotion data after

the cocaine challenge for the RPT animals classified according to the

sensitization criteria are presented in figure 2. Motor activity on the drug

challenge day increased 3-fold in comparison to day 1 in animals classified as

hyperlocomotion. The animals who showed most stereotypies presented a 4-

fold decrease in locomotion in comparison to day 1, when receiving the first

cocaine dose (Finteraction(3,26)=26.176; p<0.001).

The analysis of the videotapes during the cocaine administration of the

animals did not detect differences in head scanning or sniffing between ACT

and RPT treatments. On the other hand, grooming was less frequent in the RPT

group (F(1,52)=34.838; P<0.001) and hindlimb splaying (F(1,52)=34.838; P<0.001)

89

and stereotypy (F(1,52)=34.838; P<0.001) were more frequent in the RPT group

when compared to the ACT group (figure 3).

RT-PCR analysis

GAD65 mRNA had higher expression than GAD67 mRNA in the striatum

area of female rats (F(1,128)=27.365; p<0.001) and data from each isoenzyme

was then analyzed separately. RPT cocaine treatment induced a significant

reduction in levels of GAD65 mRNA (F(3,55)=5.603; p=0.002) and in levels of

GAD67 mRNA (F(3,67)=5.117; p=0.003) both in SENS and N-SENS animals when

compared to CTR or ACT cocaine, as seen in figure 4.

Different from the STR, in the PFC the ratios of GAD65 mRNA and GAD67

mRNA expression are similar. The other differences are connected to the

different reactions to RPT cocaine in the PFC. GAD65 mRNA was significantly

less expressed in SENS animals when compared to CTR and ACT treatment

with cocaine (F(3,32)=4.213; p=0.013). GAD67 mRNA was also lower in SENS

animals, although this decrease did not reach statistical significance. N-SENS

animals GAD67 mRNA did not show significant differences from CTR or ACT

treatments (see figure 5).

Considering the important individual behavioral differences seen in the

SENS group of animals, GAD65 mRNA or GAD67 mRNA levels in the brain areas

of those presenting hyperlocomotion were compared to those with increased

stereotypies and hindlimb splaying. The comparison of either one of GADs

mRNA in the STR (figure 6a) in rats with stereotypy or hyperlocomotion did not

show significant differences. In the PFC of animals with sensitization and

stereotypies (figure 6b) lower GAD67 mRNA expression was shown in

comparison to animals showing increased locomotion (F(1,16)=5.563; p=0.016),

90

showing that for this isoenzyme more intense behavioral response is necessary

to convey the neurochemical outcome.

Discussion

This study aimed to determine the sensitization to high doses of cocaine

and demonstrate how the behavioral changes relate to the expression of mRNA

of the GABA synthesizing enzymes in specific brain areas involved in drug

addiction. In rodents, behavioral sensitization to cocaine is manifest by

increases in both frequency and duration of many psychostimulant motor

effects. We observed that repeated treatment of ovariectomized female rats

with a high dose of cocaine induced a classical dopaminergic syndrome with

two phases of behavioral changes, characterized by increased locomotion

followed by the behavioral display of stereotypies and hindlimb splaying

accompanied by less intense hyperlocomotion effects (Barros et al. 1989;

Flagel and Robinson, 2007; Cooper and Dourish 1990; Lyon and Robbins

1975). Rats may show increased amounts of stereotyped behaviors after a

challenge dose of cocaine following repeated cocaine treatment suggesting the

development or induction of behavioral sensitization (Flagel and Robinson

2007; Yamaguchi et al. 2005). In fact, hyperlocomotion (Jayaram and Steketee

2005) or stereotypies such as rotational behavior, stereotyped grooming, head

bobbing, and forelimb movements (Becker et al. 2001) may characterize the

sensitized motor activation.

However, sensitized behaviors differs substantially among individuals.

As in our study, other authors have seen that only around 60% of male animals

presented intense sensitized responses to psychostimulants after a specific

protocol (Brady et al. 2005). We also found that 56.7% of the female rats

91

showed significant changes in motor behaviors after repeated treatment with

cocaine. Interestingly, with these high doses of cocaine, some sensitized

animals responded with further increase in the number of locomotor counts

without engaging in significant amounts of stereotyped routines while others

presented intense stereotypic responses, which partially interfered with the

hyperlocomotion response. These individual effects to repeated cocaine, which

apparently oppose each other in a group of animals treated similarly, may

explain the great variability seen in our study when only locomotion was

considered, preventing statistical group differences when individuality was not

considered. Additionally, at a specific cocaine dose, increased drug effect is

reflected in some individuals by an increase in locomotion and in others by its

decrease in comparison to previous locomotor effects with the same dose,

making the interpretation of changes in locomotor activity difficult (Flagel and

Robinson 2007). These findings are also consistent with reports that locomotion

is sometimes a relatively insensitive indicator of behavioral sensitization

(Ferrario et al. 2005).

The most interesting results of this study refer to the changes in the

GABAergic system in the STR and PFC of females treated with repeated

cocaine. Despite a constitutive difference, with higher striatal GAD65 mRNA

levels than those for GAD67, replicating other studies (Sheikh et al. 1999), the

same is not true with the PFC. Acute cocaine treatment did not induce changes

in GAD mRNA expression. In fact it was already reported that GAD levels

changes in specific brain areas only after four to six hours (Lindefors et al.

1992; Sorg et al. 1995) of acute psychostimulant administration. The time lag

between cocaine dosing and the GAD expression changes denote the

92

adaptation that occurs in the GABA system. Sensitization after RPT cocaine

may accelerate the challenge cocaine dose effects on GAD expression.

In the STR, both GAD isoenzyme mRNAs showed decreased expression

after repeated cocaine, regardless of animals presenting or not sensitization.

The reduction of GAD65 and GAD67 mRNA in the striatum may be due to the

extensive initial GABA release from its presynaptic stores prompted by cocaine

(Tang et al. 2005) and this initial GABA release may lead to a subsequent

diminished synthesis of vesicular and cytoplasmic GABA in brain regions with

consequent long-term reduction of inhibitory capacity of the CNS (Lindefors et

al. 1992). This shift in GABA activity may potentiate the excitatory effects of

psychostimulants, which could explain the gradually developing behavioral

sensitization in these animals. In fact, cocaine induces a decrease of pallidal

extracellular GABA and this decrease is more important in animals which had

already self-administered the drug (Tang et al. 2005) which may be reflecting

the lower GAD expression in STR and PFC from were GABAergic spiny cells

project to the ventral pallidum (Zahm et al. 1985). In the PFC, GAD mRNA

expression is reduced in SENS, but not in the N-SENS animals. Therefore one

may consider that sensitization is connected to a GABA imbalance with

decrease in GABA synthesis enzymes in the prefrontal cortex associated to the

reported dopaminergic and glutamatergic imbalances (Brady et al. 2005;

Stephens 1995). Further studies need to be conducted to verify if GABA levels

are in fact changed in the PFC of these sensitized females. Through this study it

may be concluded that GABA neurotransmission in diverse brain areas is

differentially affected whether cocaine is repeatedly used and whether this use

induces or not behaviors expressing sensitization in female rats.

93

Acknowledgment: This study received support from FAPERGS (MFS:

03/50473.6), CNPQ (HMTB: 478988/2004-4) and CAPES (APGF: PRODOC

00150/03-7).

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98

Legends Figure 1. Time line of the sensitization protocol of ovariectomized females

(OVX). Control animals (CTR) received saline throughout the experiment. Acute

(ACT) treatment received saline during the sensitization induction phase and a

cocaine (30 mg/kg) challenge dose during the sensitization expression phase.

Repeated (RPT) treatment received cocaine (30 mg/kg) throughout the

experiment.

Figure 2. Horizontal locomotion of rats (mean ± s.e.m) submitted to repeated

cocaine in the first treatment day (day 1) and in the cocaine challenge (day 12).

The rats were classified as sensitized (Sens) with hyperactivity (Hyper) when

locomotion on day 12 was > 50% than on day 1 or with stereotypy (Ster) when

locomotion on day 12 was ≤50% than on day 1 due to stereotyped behaviors;

not sensitized animals (N-Sens) and rats that did not fulfill the sensitization

criteria (Elim). * represents differences from day 1.

Figure 3. Average frequency of stereotyped behaviors (mean ± s.e.m) on 20

observations in 60min on the challenge day of rats after acute (ACT) or

repeated (RPT) cocaine (30 mg/kg) administration. * represents differences

from the ACT group.

Figure 4. Ratio (mean ± s.e.m) of GAD65 and GAD67 mRNA in the striatum of

control (CTR), acute (ACT) and repeatedly treated sensitized (SENS) or non-

sensitized (N-SENS) subgroups. * represents differences from CTR and ACT.

Figure 5. Ratio (mean ± s.e.m) of GAD65 and GAD67 mRNA in the prefrontal

cortex (PFC) of control (CTR), acute (ACT) and repeatedly treated sensitized

(SENS) or non-sensitized (N-SENS) subgroups. * represents differences from

CTR and ACT.

Figure 6. Comparison between animals sensitized to cocaine presenting

stereotypy (Ster) or with hyperlocomotion (Hyper) of GAD65 and GAD67 mRNA

99

expression (mean±s.e.m) in a) striatum or b) prefrontal cortex. * represents

differences from Hyper.

100

Figures

Cocaine 30 mg/kg i.p. (RPT) or saline i.p. (CTR and ACT)

Locomotion

Drug free period

Cocaine 30 mg/kg i.p.(ACT and RPT)

or saline i.p. (CTR)

OVX

2 weeks

-SENSITIZATION PHASE- -CHALLENGE PHASE-

LocomotionVideo-tape

Day

1

Day

2

Day

3

Day

4

Day

5

Day

6

Day

12

Cocaine 30 mg/kg i.p. (RPT) or saline i.p. (CTR and ACT)

Locomotion

Drug free period

Cocaine 30 mg/kg i.p.(ACT and RPT)

or saline i.p. (CTR)

OVX

2 weeks

-SENSITIZATION PHASE- -CHALLENGE PHASE-

LocomotionVideo-tape

Day

1

Day

2

Day

3

Day

4

Day

5

Day

6

Day

12

Figure 1

0

500

1000

1500

2000

2500

Sens-Hyper (n=6) Sens-Ster (n=11) N-Sens (n=8) Elim (n=5)

Repeated group

Loco

mot

ion

- 60m

in

Day 1Day 12

*

Figure 2

*

101

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

GROOMING

Ave

rage

freq

uenc

e on

20

obse

rvat

ions

8.75

8.8

8.85

8.9

8.95

9

9.05

HINDLIMB SPLAYING15.5

16

16.5

17

17.5

18

18.5

STEREOTYPY

ACT

RPT

**

*

Figure 3

0

0.5

1

1.5

2

2.5

GAD65 GAD67

Ratio

mR

NA

Stria

tum

CTRACTSENSN-SENS

* *

Figure 4

* *

0

0.5

1

1.5

2

2.5

GAD65 GAD67

Ratio

mR

NA

Stria

tum

CTRACTSENSN-SENS

* *

Figure 4

* *

102

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

GAD65 GAD67

STR

mRN

A ex

pres

sion

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

GAD65 GAD67

PFC

mRN

A ex

pres

sion

SterHyper

*

Figure 6

a b

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

GAD65 GAD67

Ratio

mR

NA

PFC

CTRACTSENSN-SENS

*

Figure 5

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

GAD65 GAD67

Ratio

mR

NA

PFC

CTRACTSENSN-SENS

*

Figure 5

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