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Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-graduação
em Toxinologia do Instituto
Butantan, para obtenção do
título de Mestre em
Toxinologia.
São Paulo 2014
Amanda Pereira de Freitas
“Estudo do potencial regulador da crotoxina e suas subunidades isoladas do veneno de Crotalus durissus terrificus sobre a atividade
funcional de células dendríticas”
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Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-graduação
em Toxinologia do Instituto
Butantan, para obtenção do
título de Mestre em
Toxinologia.
Orientadora: Dra. Eliana
Faquim de Lima Mauro
São Paulo 2014
Amanda Pereira de Freitas
“Estudo do potencial regulador da crotoxina e suas subunidades isoladas do veneno de Crotalus durissus terrificus sobre a atividade
funcional de células dendríticas”
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FICHA CATALOGRÁFICA
Elaborada com instruções fornecidas pela Biblioteca do Instituto Butantan
Freitas, Amanda Pereira
Estudo do potencial regulador da crotoxina e suas subunidades isoladas do veneno de Crotalus durissus terrificus sobre a atividade funcional de células dendríticas/ Amanda Pereira de Freitas; orientadora: Eliana Faquim de Lima Mauro. – São Paulo, 2014.
139 folhas. : il. color. ; 30 cm. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Toxinologia, Instituto Butantan, 2014. 1. Crotalus durissus terrificus. 2. Células dendríticas.
3. Toxinas ofídicas. 4. Citocinas. 5. Imunomodulação. I. Orientador (Faquim- Mauro, Eliana, orient.). II. Programa de Pós- Graduação em Toxinologia. Instituto Butantan. III. Título
CDD 615.9
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PÓS-GRADUAÇÃO EM TOXINOLOGIA
INSTITUTO BUTANTAN
RESULTADO DA DEFESA DE DISSERTAÇÃO
MESTRADO
NOME DA ALUNA: Amanda Pereira de Freitas DATA DO EXAME:.............../................ /................. BANCA EXAMINADORA: Profs. Drs.
NOME Assinatura Aprovada Reprovada ________________________ ______________________ ( ) ( ) (Presidente) ________________________ ______________________ ( ) ( ) ________________________ ______________________ ( ) ( ) DECISÃO FINAL: APROVADA ( ) REPROVADA ( ) Comentários da Banca (opcional):
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O alicerce de minha vida: meus pais Alide e João, os quais
amo muito. Obrigada pelo carinho, paciência e incentivo,
principais responsáveis pela minha vida e a quem devo
meu caráter. Mais do que isso, as vozes que me
tranquilizam o coração, os sorrisos que me alegram a
vida, o apoio que me ajuda a percorrer os meus objetivos.
Sem os senhores nunca teria sido possível chegar até aqui.
Obrigada pelo eterno cuidado, dedicação, amor, apoio
nos momentos difíceis de inquietações e decisões, por
estarem ao meu lado a cada passo, a cada pequena
conquista e grandes realizações, pois estes não teriam
valor se os senhores não estivessem comigo.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por me amparar nos momentos difíceis, me dar
força interior para superar as dificuldades, mostrar os caminhos nas horas incertas e
me suprir em todas as minhas necessidades. Sua presença, luz e força sempre me
abençoam e capacitam para tudo aquilo que Ele me destina.
A minha irmã gêmea Aline Pereira de Freitas, que por palavras não será nunca
possível descrever a sua importância na minha vida. Obrigada pelos seus 29 anos
de vida ao meu lado e tentar sempre me ajudar. Obrigada por existir, e por sempre
me defender. Agradeço a você, pela mulher que hoje desabrocha, pelos momentos
de orgulho e pelo companheirismo e amizade. A você, exemplo de garra, coragem e
esperança, a quem tenho a honra de chamar de irmã.
Alguém uma vez me disse que “a gratidão é a lembrança do coração.” Faz sentido.
Ao longo de nossas vidas sempre “aparecem anjos da guarda”, que nos ajudam sem
ao menos nos conhecer, e sem os quais nossos objetivos seriam muito difíceis de
alcançar perdendo muitas vezes até mesmo as esperanças. Agradeço eternamente
a minha querida orientadora Dra. Eliana Faquim de Lima Mauro por acreditar em
mim, me mostrar o caminho da ciência, por ser exemplo de profissional e de ser
humano, por sua ajuda nos momentos mais críticos, por acreditar no futuro deste
projeto e contribuir para o meu crescimento profissional e por ser também um
exemplo a ser seguido. A esta devo a confiança em minha capacidade como
pesquisadora além da paciência e tranquilidade para me transmitir os ensinamentos.
Eu gostaria de deixar um agradecimento mais que especial por me ter dado a
oportunidade de integrar o seu extraordinário grupo de trabalho, por me ter sempre
recebido com um sorriso contagiante, por estar sempre pronta para ajudar e por ter
acreditado em mim aceitando-me como sua orientanda.
A minha “migaaaa” Bruna Favoretto pelo estímulo no desenvolvimento desta tese e
fundamentais ensinamentos técnicos que contribuíram de forma significativa.
Obrigada pela disponibilidade, colaboração, conhecimentos transmitidos e
capacidade de estímulo ao longo de todo o trabalho. Sua participação foi
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fundamental para a realização deste trabalho. Obrigada por fazer parte, sem dúvida
alguma, dos melhores momentos desta jornada. E também quero agradecer os
ótimos momentos que passamos juntas no laboratório, a partilha de ansiedades, por
um lado, e de gargalhadas, por outro.
As “Elianets” Carolzinha e Pri, amigas que fizeram parte desses momentos sempre
me ajudando e incentivando, pelo companheirismo e agradáveis momentos de
convivência. Obrigada pela receptividade, amizade, companheirismo e ajuda, fatores
muito importantes na realização desta tese e que me permitiram que cada dia fosse
encarado com particular motivação. Também uma referência especial à Jéssica,
pela enorme amizade que criamos. Agradeço-lhe a partilha de bons momentos, as
risadas, as confissões e os estímulos nas alturas de desânimo.
Algumas vezes na vida, você encontra uma amiga especial. Alguém que muda sua
vida simplesmente por estar nela. Alguém que te faz rir até você não poder mais
parar. Alguém que faz você acreditar que realmente tem algo bom no
mundo. Agradeço a Roberta da Rocha Trombeta aquela que riu e sofreu comigo, e
que foi o meu maior apoio quando mais precisei na pior fase de minha vida.
A minha querida amiga Isa Lima pelo apoio incondicional, força, incentivo e amizade
sem igual. Intermináveis desabafos no telefone e pela partilha dos bons e mals
momentos.
Ao amigo Guilherme Rabello por estar sempre ao meu lado, mesmo quando
separados pela distância e pela correria da vida diária. Obrigada pelas palavras
doces e pela transmissão de confiança e de força, em todos os momentos. Por tudo,
a minha enorme gratidão!
A Dra. Juciane de Castro pela amizade, pelo exemplo de persistência,
determinação, coragem e competência. Muito obrigada pelos conselhos, pela
simpatia, pela disponibilidade e pela amabilidade. É um prazer conhecê-la.
As pesquisadoras do Instituto Pasteur, Dra. Graciane Maria Medeiros Caporale,
Karin Scheffer e Andréa de Cássia Rodrigues da Silva por me encorajarem a não
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desistir do meu mestrado, meu sonho, as pessoas especiais que no meu percurso
de vida pessoal e profissional ajudaram no meu crescimento, e nos momentos de
desânimo estiveram comigo incentivando-me a continuar o caminho.
Às irmãs “Jonhns” Rafinha e Iara não só pela amizade, carinho mas, principalmente,
pelo sorriso, as saidinhas e o bom humor constantes.
A técnica do laboratório Juçara minha colega de trabalho, minha amiga, pelo carinho
maternal, por ser um grande exemplo de mulher e de mãe a ser seguido.
A Nicole agradeço a ajuda prestada nas purificações dos venenos e também pela
receptividade e carinho que sempre teve por mim.
As colegas de laboratórios Cris Caporrino, Bianca, Raquel, Ane e Cleusita por me
acolherem e me integrarem no laboratório. Obrigada pela amizade, companhia e
afeto.
A coordenadora da Pós Graduação, Dra. Norma Yamanouye, pela persistência de
me manter no mestrado e por me ter dado uma “luz” no momento que precisei.
Obrigada pela oportunidade!
A Patrícia Bianca pelos ensinamentos de PCR-RT e ao Jorge pela ajuda com a
leitura de minhas amostras no citômetro de fluxo.
Este trabalho teve o apoio financeiro da CAPES e FAPESP n° 2011/23735-0.
A realização desta dissertação marca o fim de uma importante etapa da minha vida.
Gostaria de agradecer a todos aqueles que contribuíram de forma decisiva para a
sua concretização. A todos meu carinho e muito obrigada!
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Porque o Homem quer subir a montanha mais alta do mundo? Ora, a resposta é a mais simples possível, porque ela esta lá. Ou seja, o desafio é uma virtude inerente ao ser humano e foi exatamente assim que me senti diante da proposta de realizar esse trabalho. “Bom mesmo é ir à luta com determinação, Abraçar a vida com paixão, Perder com classe e vencer com ousadia, Porque o mundo pertence a quem se atreve E a vida é “muito” para ser insignificante.”
Charles Chaplin
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RESUMO
Freitas, Amanda, Pereira. Estudo do potencial regulador da crotoxina e suas subunidades isoladas do veneno de Crotalus durissus terrificus sobre a atividade funcional de células dendríticas. 2014. 139 f. Dissertação (Toxinologia). Instituto Butantan, São Paulo, 2014. Agentes patogênicos, assim como moléculas com potencial patogênico são capazes de ativar/modular o sistema imune. O veneno da cascavel Crotalus durissus terrificus, crotoxina (CTX-principal toxina) e suas subunidades CA (crotapotina) ou CB (fosfolipase A2) apresentam efeito supressor sobre o sistema imune. Células dendríticas (DCs) são potentes células da imunidade inata responsáveis pela apresentação dos antígenos para os linfócitos T e, portanto estão envolvidas diretamente na geração da resposta imune adaptativa ou tolerância imunológica. Portanto, no presente estudo, foi investigado o efeito modulador da CTX, bem como da CA e CB sobre a atividade funcional das DCs in vitro. CTX, CA e CB foram purificadas, analisadas por SDS-PAGE e o conteúdo de endotoxina (LPS) eliminado. DCs imaturas (iDCs) foram diferenciadas a partir da medula óssea de camundongos BALB/c com GM-CSF ou GM-CSF/IL-4 por 7 dias. A análise por citometria de fluxo da expressão de CD11c revelou que o protocolo de utilização do GM-CSF/IL-4 foi mais eficiente em gerar DCs in vitro. Além disso, estas células imaturas (CD11c+) expressam receptores do tipo Toll 1, 2, 4 e de lectina tipo C (DC-SIGN e MR). DCs imaturas foram incubadas com CTX, CA ou CB na presença ou não de LPS e analisadas quanto à expressão das moléculas de MHC de classe II (MHC-II), CD40, CD80 e CD86, bem como a secreção de citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-12, IL-6, TNF-α). A CTX, CA e CB não induziram aumento da expressão das moléculas MHC-II e coestimuladoras nas DCs in vitro, enquanto que o LPS induziu alta expressão dessas moléculas nas DCs. Além disso, CTX e CB inibiram a expressão de CD40, CD80, CD86 e MHC-II em DCs incubadas com LPS, sendo esse efeito mais acentuado com a CTX. Tanto a CTX como CB inibiram a secreção das citocinas pró-inflamatórias pelas DCs estimuladas com LPS. Por outro lado, a subunidade CA não foi capaz de modular a maturação de DCs induzida pelo LPS. Pôde ser observado ainda, que receptor formil peptídeo está envolvido nesse efeito da CTX e CB sobre a maturação das DCs induzida pelo LPS. A análise da secreção IL-10 e expressão gênica de TGF-β e IL-10 pelas DCs incubadas com CTX, CA, CB na presença ou não de LPS mostraram que a CTX e, em menor intensidade, a CB induzem aumento dessas citocinas pelas DCs incubadas somente com as toxinas ou juntamente com LPS. Além disso, foi observada maior produção de prostaglandina E2 e lipoxina A4 pelas DCs incubadas com CTX ou CB, e em menor intensidade com CA, na presença ou não de LPS. O ensaio de proliferação de linfócitos CD3+ co-cultivados com DCs previamente incubadas com CTX ou CB na presença ou não de LPS mostrou que a CTX e CB em associação com LPS inibiram a proliferação celular quando comparada à induzida somente pelo LPS. Estes resultados demonstraram que a CTX e CB, mas não CA, exercem efeito modulador sobre a atividade funcional das DCs e sugerem a participação dos mediadores anti-inflamatórios nesse processo. Palavras- chave: Crotalus durissus terrificus, Células dendríticas, toxinas ofídicas,
citocinas e imunomodulação.
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ABSTRACT
Freitas, Amanda, Pereira. Modulatory potential of crotoxin and its subunits isolated from Crotalus durissus terrificus venom on dendritic cells. 2014. 139 p. Master thesis (Toxinology). Butantan Institute, São Paulo, 2014.
Pathogens as well as pathogenic molecules are able to activate or modulate the immune system. The Crotalus durissus terrificus rattlesnake venom, its main toxin, crotoxin (CTX) and the CA (crotapotin) or CB (phospholipase A2) subunits have suppressive effect on the immune system. Dendritic cells (DCs) are potent cells from innate immunity responsible by antigen presentation to T lymphocytes and, thus are directly involved in the generation of the adaptive immune response or tolerance. Therefore, we evaluated the modulatory effect of CTX as well as its subunits on functional activity of DCs in vitro. The CTX, CA and CB were purified, analyzed by SDS-PAGE and the endotoxin (LPS) content removed. The cytometric analysis of CD11c expression by cells showed that the protocol using GM- CSF/IL-4 was more efficient in generating DCs in vitro than GM-CSF. Furthermore, these immature CD11c+ cells expressed Toll like receptors 1, 2, 4 and C-type lectin receptors (DC-SIGN and MR). DCs were incubated with CTX, CA, CB with or without LPS for 7 days and then analyzed for the expression of class II MHC (MHC-II), CD40, CD80 e CD86 molecules as well as the secretion of proinflammatory cytokines (IL-1β, IL-12, IL-6, TNF-α). CTX, CA or CB did not induce increased expression of costimulatory and MHC-II molecules by DCs, whereas LPS induced high expression of these molecules on DCs. Furthermore, CTX and CB inhibited the expression of CD40, CD80, CD86 and MHC-II molecules by DCs incubated with LPS. Both CTX and CB inhibited the secretion of proinflammatory cytokines by DC stimulated with LPS. However, CA was not able to inhibit the DC maturation induced by LPS. It was also verified that formyl peptide receptor is involved in this effect of CTX and CB on DC maturation induced by LPS. Analysis of IL-10 secretion and gene expression of TGF-β and IL-10 showed that CTX and, at lower intensity the CB, induced high amounts of these anti-inflammatory cytokines by DCs incubated only with the toxins or with LPS. In addition, it was verified increased secretion of prostaglandin E2 and lipoxin A4 by DCs incubated with CTX and CB and, at lower intensity with CA, in the presence or not of LPS. Proliferation assay of CD3+ lymphocytes co-cultured with DCs previoulsy incubated with CTX or CB with or without LPS showed that CTX and CB inhibited the cellular proliferation induced by LPS. These results demonstrate that CTX and CB subunit, but not CA, exert modulatory effect on functional activity of DCs and suggest the involviment of anti-inflammatory mediators in this process. Key words: Crotalus durissus terrificus, Dendritic cells, ophidian toxins, cytokines
and immunomodulation
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 01. Distribuição geográfica de subespécies Crotalus no Brasil......................23
Figura 02. Ação da crotoxina na microcirculação, sistema linfático e tecido
intersticial....................................................................................................................31
Figura 03. Células dendríticas e geração de LTs antígeno-específicos..................35
Figura 04. Perfil cromatográfico do veneno de C.d.terrificus submetido à
cromatografia de troca aniônica em coluna MONO-Q...............................................59
Figura 05. Perfil cromatográfico da CTX submetida à cromatografia de troca
catiônica em coluna MONO-S....................................................................................60
Figura 06. Perfil proteico do veneno de C.d. terrificus e dos picos obtidos em
cromatografia de troca aniônica e catiônica em gel de poliacrilamida 12,5% e gel de
16% de poliacrilamida na presença de tricina sob condições redutoras....................61
Figura 07. Análises de culturas de células de medula óssea de camundongos
BALB/c incubadas por 7 dias com GM-CSF ou GM-CSF e IL-4, por citometria de
fluxo............................................................................................................................62
Figura 08. Fenótipo de DCs imaturas diferenciadas in vitro com GM-CSF na
presença ou não de IL- 4............................................................................................63
Figura 09. Análise da expressão de moléculas coestimuladoras e de MHC de classe
II em DCs diferenciadas com GM-CSF na presença ou não de IL-
4..................................................................................................................................65
Figura 10. Análise da expressão de moléculas coestimuladoras e MHC-II em DCs
diferenciadas in vitro e incubadas com LPS em diferentes
concentrações............................................................................................................66
13
Figura 11. Produção de citocinas pró e anti-inflamatórias em sobrenadantes das
culturas de DCs diferenciadas e estimuladas in vitro com
LPS.............................................................................................................................67
Figura 12. Efeito da CTX, CA, CB e/ou LPS sobre a viabilidade de DCs in
vitro.............................................................................................................................69
Figura 13. Efeito da CTX na expressão de moléculas coestimuladoras e MHC de
classe II em DCs diferenciadas in vitro e estimuladas com LPS................................70
Figura 14. Efeito da CTX sobre a expressão de moléculas coestimuladoras e MHC
de classe II em DCs diferenciadas in vitro estimuladas ou não com
LPS.............................................................................................................................71
Figura 15. Efeito das concentrações de CTX sobre a expressão de moléculas
coestimuladoras e MHC de classe II em DCs diferenciadas in vitro e estimuladas
com LPS.....................................................................................................................72
Figura 16. Produção de IL-10, IL-12, TNFα, IL-1β e IL-6 nas culturas de células
dendritícas diferenciadas e estimuladas in vitro com CTX ou LPS............................73
Figura 17. Efeito da pré-incubação com a CTX sobre a expressão de moléculas
coestimuladoras e MHC de classe II em DCs posteriormente incubadas com
LPS.............................................................................................................................75
Figura 18. Porcentagem de células CD11c+/IL10+ ou CD11c+/IL12+ em culturas de
DCs previamente incubadas ou não com CTX seguida de incubação com
LPS.............................................................................................................................76
Figura 19. Análise por ELISA da produção de IL-10, IL- 12, TNF-α, IL-1β e IL-6 em
sobrenadantes das culturas de DCs pré-incubadascom CTX por 2 e 3 horas seguida
da adição do LPS.......................................................................................................77
14
Figura 20. Efeito da CTX sobre a expressão de moléculas coestimuladoras e MHC
de classe II em DCs pré-incubadas com o LPS.........................................................79
Figura 21. Porcentagem de células CD11c+/IL10+ ou CD11c+/IL12+ em culturas de
DCs previamente incubadas ou não com LPS seguida de incubação com
CTX............................................................................................................................80
Figura 22. Análise por ELISA da produção de IL-10, IL- 12, TNF-α, IL-1β e IL-6 em
sobrenadantes das culturas de DCs pré-incubadas com CTX por 2 e 3 horas seguida
da adição do LPS..........................................................................................81
Figura 23. Envolvimento de receptor formil peptídeo no efeito da CTX sobre a
expressão de moléculas coestimuladoras e MHC-II em DCs incubadas com
LPS.............................................................................................................................83
Figura 24. Produção de IL-10, IL-12, TNF-α, IL-1β e IL-6 em sobrenadantes das
culturas de DCs diferenciadas e pré-incubadas ou não com Boc-2 seguida de
incubação com LPS ou LPS+CTX.............................................................................84
Figura 25. Avaliação do efeito da crotapotina (CA) na expressão de moléculas MHC-
II e coestimuladoras em DCs incubadas ou não com LPS........................................86
Figura 26. Efeito da fosfolipase A2 (CB) na expressão de moléculas MHC-II e
coestimuladoras em DCs incubadas ou não com LPS..............................................87
Figura 27. Produção de IL-10, IL-12, TNFα, IL-1β e IL-6 nas culturas de DCs
diferenciadas e estimuladas in vitro com diferentes toxinas ou LPS.........................88
Figura 28. Efeito da fosfolipase A2 (CB) sobre a expressão de moléculas MHC-II e
coestimuladoras em células dendríticas.....................................................................89
Figura 29. Efeito da pré-incubação com CB sobre a expressão de moléculas
coestimuladoras e MHC de classe II em DCs posteriormente incubadas com
LPS.............................................................................................................................91
15
Figura 30. Análise por ELISA da produção de IL-10, IL- 12, TNF-α, IL-1β e IL-6 em
sobrenadantes das culturas de DCs pré-incubadas com CB por 2 e 3 horas seguida
da adição do LPS.......................................................................................................92
Figura 31. Efeito da CB sobre a expressão das moléculas coestimuladoras e MHC
de classe II em DCs pré-incubadas in vitro com LPS................................................93
Figura 32. Produção de IL-10, IL-12, TNF-α, IL-1β e IL-6 em sobrenadantes das
culturas de DCs em pré-incubadas com LPS seguida de adição do CB...................94
Figura 33. Efeito do bloqueio de receptor formil peptídeo sobre a ação do CB na
expressão de moléculas coestimuladoras e MHC-II em DCs estimuladas com
LPS.............................................................................................................................96
Figura 34. Produção de IL-10, IL- 12, TNF-α, IL-1β e IL-6 em sobrenadantes das
culturas de DCs pré-incubadas ou não com Boc-2 seguida de incubação com LPS e
CB...............................................................................................................................97
Figura 35. Efeito da CTX e CB sobre a expressão de moléculas MHC-II e
coestimuladoras em DCs estimuladas com LPS........................................................99
Figura 36. Produção de PGE2 e LXA4 nas culturas de DCs estimuladas in vitro com
CTX, CA, CB na presença ou não do LPS...............................................................100
Figura 37. Análise comparativa da expressão de β-actina nos grupos experimentais
de DCs tratadas com CTX, CB, CA na presença ou não do LPS............................101
Figura 38. Expressão gênica de IL-10 e TGF-β em DCs incubadas in vitro com CTX,
CB, CA em associação ou não com o LPS..............................................................102
Figura 39. Resposta proliferativa dos linfócitos CD3+ co-cultivados com DCs pré-
incubadas com CTX e CB na presença ou não de
LPS...........................................................................................................................103
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AA- Ácido araquidônico
APC- Célula apresentadora de antígeno (Antigen-presenting cell)
Asc- Ascaris suum
AST- Aspartase aminotransferase
BCG- Mycobacterium bovis
BrdU- Bromodeoxiuridina (Bromodeoxyuridine)
BSA- Soro albumina bovina (Bovine albumin serum)
CA- Crotapotina (Crotapotin)
CB- Fosfolipase A2 (Phospholipase A2)
C.d.cascavella- Crotalus durissus cascavella
C.d.collilineatus- Crotalus durissus collilineatus
C.d.ruruima- Crotalus durissus ruruima
C.d.marajoensis- Crotalus durissus marajoensis
C.d. terrificus- Crotalus durissus terrificus
C.d.trigonicus- Crotalus durissus trigonicus
cDCs- Células dendríticas clássicas
CD40L- Ligante CD40
CK- Creatina quinase (Kinase creatine)
CLRs - Receptores de lectinas tipo C (C-type lectin receptors)
ConA- Concanavalina A
COX-2- Ciclooxigenase-2
CpGs- Guanina oligodeoxinucleotideos fosforotioato
CTX- Crotoxina (Crotoxin)
DCs- Células dendríticas (Dendritic cells)
DCsMB- Células dendríticas murinas derivadas de medula óssea
DXM- Dextrometorfano
EDTA- Ácido etilodiaminotetracético (Ethylenediaminetetraacetic acid)
ELISA- Ensaio imunoenzimático (Enzyme linked immunosorbent assay)
FBS- Soro fetal bovino (Fetal bovine serum)
Fh Teg- Fasciola hepatica tegumental
FPRs- Receptores pertencentes a família do formíl peptídeo
17
FSC- Tamanho das células
FITC- Isotiocianato de fluoresceína (Fluorescein isothiocyanate)
Flk2- Quinase hepática fetal 2
Flt3L- Ligante tirosina quinase 3
FPLC- Cromatografia liquida de alta performance (Fast- Performance Liquid
Chromatography)
GM- CSF- Fator estimulador de colônias- granulócitos e monócitos (Granulocyte
macrophage colony- stimulating fator)
HEV- Vênulas endoteliais altas
IFN- y- Interferon-y
IgG- Imunoglobulina
IL- 4- Interleucina 4
IL-6- Interleucina 6
IL-10- Interleucina 10
IL-12- Interleucina 12
IL-17- Interleucina 17
kDa- Unidade de massa atômica (Atomic mass unit)
LAL- Limulus Amoebocyte Lysate
LDH- Desidrogenase láctica (Lactate dehydrogenase)
LPS- Lipopolissacarídeo (Lipopolysaccharid)
LTs- Linfócitos T
LXs- Lipoxinas
LXA4- Lipoxina A4
MHC- Complexo de histocompatibilidade principal (Major Histocompatibility
Complex)
MLR- Reação mista leucocitária
MyD88- Gene mielóide 88
NaCl- Cloreto de sódio (Sodium chloride)
NF-κB- Factor nuclear kappa B
NK- Células natural Killer (Natural Killer Cell)
OVA- Ovalbumina (Ovalbumin)
PAMPs- Padrões moleculares associados a patógenos
PBS- Solução salina tamponada com fosfato (Phosphate buffered saline)
18
PBS-T- Solução salina tamponada com fosfato + Tween 20 (Phosphate buffered
saline tween)
PCR- RT- Reação de transcriptase reversa em tempo real
pDCs- Células dendríticas plasmocitóides
PE- Ficoeritrina (Phycoerythrin)
PGE2- Prostaglandina E2
PI- Pico I (Componentes de alta massa molecular do Asc)
PLA2- Fosfolipase A2 (Phospholipase A2)
PRRs- Receptores de reconhecimento de padrões
RPMI- Meio de cultura RPMI 1640
RPMI-S- Meio de cultura RPMI 1640 suplementado
RT- Transcrição reversa
SDS-PAGE- Dodecil-sulfato de sódio de poliacrilamida
SEA- Antígenos solúveis dos ovos de Shistossoma mansoni (Shistosoma mansoni
soluble egg antigen)
SPS- Produtos solúveis de Trichuris suis
SSC- Granulosidade
TA- Temperatura ambiente
TCR/CD3- Receptor de antígeno associado ao complexo CD3
TGF-β- Fator de transformação de crescimento (Transforming Growth Factor-β)
Th- Células T auxiliares (cells T helper)
TIR- Domínio IL-1R
TLRs- Receptores do tipo Toll (Toll like receptors)
TMB- Tetrametilbenzidina (Tetramethylbenzidine)
TNF- Fator de necrose tumoral
Tp- Tripomastigotas de Tripanossoma cruzi
Treg- Célula T reguladora
TRIS- Hidroximetil amino metano (Tris- hydroxymethyl- aminomethane)
TRP- Aminoácido triptofano
TNF-α- Fator de necrose tumoral (Tumor Necrosis Factor)
TRIS- Hidroximetil aminometano (Tris- hydroxymethyl- aminomethane)
VCdt- Veneno total de C.d.terrificus
19
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.....................................................................................................22
1.1. Distribuição geográfica do gênero Crotalus...................................................23
1.2. Veneno crotálico e manifestações clínicas ....................................................24
1.2.1. Crotoxina e suas subunidades........................................................................26
1.3. Veneno crotálico e sistema imune..................................................................27
1.4. Células dendríticas e indução da resposta imune adaptativa......................31
2. OBJETIVOS.........................................................................................................41
2.1. Objetivos específicos.......................................................................................41
3. MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................42
3.1. Animais...............................................................................................................42
3.2. Veneno................................................................................................................42
3.3. Purificação da CTX do veneno de C.d. terrificus............................................42
3.4. Purificação das subunidades CA e CB a partir da CTX isolada do veneno
de C.d. terrificus.......................................................................................................43
3.5. Análise por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) na
presença ou não de tricina......................................................................................43
3.6. Eliminação de endotoxinas na CTX, CA e CB................................................44
3.7. Determinação da concentração de proteínas das amostras........................44
3.8. Diferenciação de DCs in vitro com GM-CSF na presença ou não de IL-4 a
partir de medula óssea de camundongos..............................................................45
3.9. Fenotipagem das DCs imaturas por citometria de fluxo...............................46
3.10. Ensaio de viabilidade celular por azul de tripan.........................................46
3.11. Estimulação das DCs in vitro e análise da expressão de moléculas
envolvidas na apresentação antigênica por citometria de fluxo.........................47
3.11.1. DCs diferenciadas in vitro estimuladas com LPS, CTX, CA ou CB...............47
3.11.2. Análise da expressão das moléculas de MHC de classe II e
coestimuladoras.........................................................................................................48
3.12. Produção de citocinas e eicosanoides secretados nas culturas de DCs
por ELISA..................................................................................................................49
3.12.1. Determinação de IL-10 e IL- 12 nos sobrenadantes das culturas...............49
3.12.2. Determinação de TNFα, IL-1β e IL-6 nos sobrenadantes das culturas de
DCs.............................................................................................................................50
20
3.12.3. Extração e quantificação de eicosanoides..................................................51
3.13. Análise da expressão gênica de IL-10 e TGF- β em amostras de células
por PCR em tempo real (PCR- RT) .........................................................................52
3.13.1. Extração de RNA total.................................................................................52
3.13.2. Reação de Transcrição Reversa (RT).........................................................53
3.13.3. PCR em tempo real em sistema Syber Green............................................53
3.14. Ensaio de reação mista leucocitária (MLR)............................................54
3.14.1. Geração de DCs obtidas a partir de medula óssea de camundongos
BALB/c e estimulação com diferentes antígenos na presença ou não de
LPS.............................................................................................................................54
3.14.2. Obtenção de linfócitos T a partir de órgãos linfoides de camundongos
C57BL/6......................................................................................................................55
3.14.3. Co-cultura de células CD3+ com DCs e avaliação da proliferação
celular.........................................................................................................................56
3.15. Análise dos resultados...............................................................................56
4. RESULTADOS....................................................................................................58
4.1. Purificação da CTX, suas subunidades (CA e CB) e análise por
eletroforese em gel de poliacrilamida....................................................................58
4.2. Caracterização das DCs diferenciadas com GM-CSF ou com GM-CSF/ IL-
4 in vitro ....................................................................................................................61
4.2.1. Fenótipo das DCs diferenciadas in vitro na presença somente de GM-CSF ou
com GM-CSF/ IL-4.....................................................................................................61
4.2.2. Análise da maturação das DCs diferenciadas in vitro com GM-CSF ou GM-
CSF+IL-4....................................................................................................................63
4.2.3. Avaliação da expressão de moléculas coestimuladoras e MHC-II em DCs e
secreção de citocinas em resposta à estimulação com diferentes concentrações de
LPS.............................................................................................................................65
4.3. Avaliação da viabilidade celular das DCs incubadas com CTX, CA, CB
e/ou LPS....................................................................................................................68
4.4. Efeito da CTX e LPS sobre a expressão de moléculas coestimuladoras e
MHC-II em DCs e secreção de citocinas................................................................69
4.5. Efeito da CTX e LPS sobre a secreção de citocinas e expressão das
moléculas de MHC-II e coestimuladoras por DCs em diferentes condições
experimentais...........................................................................................................74
21
4.6. Envolvimento do receptor de formil peptídeo na atividade moduladora da
CTX em DCs..............................................................................................................82
4.7. Efeito das subunidades CA, CB e LPS sobre a expressão de moléculas
coestimuladoras e MHC-II em secreção de citocinas pelas DCs.........................85
4.8. Efeito da subunidade CB e LPS sobre a expressão das moléculas de
MHC-II e coestimuladoras por DCs e secreção de citocinas quando em
diferentes condições experimentais......................................................................90
4.9. Envolvimento de receptor peptídeo formil na atividade moduladora da
CB em DCs................................................................................................................95
4.10. Análise comparativa da expressão das moléculas coestimuladoras e
MHC-II em DCs estimuladas com CTX ou CB........................................................98
4.11. Efeito da CTX, CA e CB sobre a produção de mediadores anti-
inflamatórios por DCs incubadas ou não com LPS..............................................99
4.12. Ensaio de proliferação celular dos linfócitos TCD3+ em resposta as DCs
estimuladas com CTX e CB com LPS...................................................................102
5. DISCUSSÃO......................................................................................................105
6. CONCLUSÕES..................................................................................................115
REFERÊNCIAS………………….………...…………………………...…………………117
22
1. INTRODUÇÃO
Em países tropicais, acidentes ofídicos representam um sério problema de
saúde publica devido à frequência com que ocorrem, bem como a mortalidade que
ocasionam. Atualmente existem aproximadamente 3.000 espécies de serpentes
sendo que 410 são consideradas peçonhentas. No Brasil, estão catalogadas 256
espécies de serpentes, dentre elas, 69 são peçonhentas (FEITOSA et al., 1997;
PINHO et al., 2000).
Os acidentes causados por serpentes vêm atingindo aproximadamente
420.000 mil a 2.280.000 milhões de pessoas por ano, sendo que desses casos,
cerca de 20.000 a 125.000 evoluem para o óbito (HUANCAHIRE et al., 2011). A
maioria desses acidentes ocorre nos países localizados em regiões tropicais e
subtropicais (KASTURIRATNE et al., 2008; ADUKAUSKIENÉ et al., 2011).
O Brasil é o país com maior número de casos de acidentes ofídicos na
América do Sul, sendo que as regiões Centro-Oeste e Norte são as mais notificadas
em número de casos (LIMA et al., 2009; NADUR-ANDRADE et al., 2012). Registra-
se por volta de 30.000 casos de envenenamentos ofídicos por ano decorrentes da
atividade fisiológica das serpentes como defesa, busca de alimento e reprodução
(BRASIL, 1998; CARDOSO et al., 2003).
Dentre os acidentes ofídicos observados, quatro tipos estão em destaque pela
sua frequência e/ou quadro clínico: botrópico, crotálico, laquético e elapídico.
Portanto, as serpentes cujos envenenamentos desencadeiam quadros de interesse
clínico no Brasil pertencem à família Viperidae, subfamília Crotalinae, gêneros
Bothrops, Crotalus e Lachesis (conhecidas vulgarmente como jararaca e/ou urutu,
cascavel e surucucu, respectivamente) e à família Elapidae da espécie Micrurus,
conhecida popularmente como coral verdadeira (NOGUEIRA, 2004).
A epidemiologia dos acidentes ofídicos aponta para um perfil que se mantém
inalterado ao longo dos últimos 100 anos no Brasil, sendo a maioria deles atribuída
ao gênero Bothrops, entretanto na ausência de soroterapia a maior letalidade
observada é resultante dos acidentes com serpentes do gênero Crotalus
(BARRAVIERA, 1993; CARDOSO et al., 2003).
23
1.1. Distribuição geográfica do gênero Crotalus
A incidência de acidentes por picadas de Crotalus perfaz cerca de 6 % dos
casos registrados no Brasil com taxa de mortalida estimada de 1,8 % por ano
(GUIDOLIN et.al., 2013). Segundo o Sinan, no ano de 2013, foram notificados 1578
casos de indivíduos acidentados por serpertes do gênero Crotalus e 15 casos de
pacientes que foram a óbito.
As serpentes desse gênero compreendem uma única espécie, Crotalus
durissus (C.d.), que pode ser subdividida em seis subespécies de acordo com a sua
coloração e distribuição geográfica (PINHO, 2001; CARDOSO et al., 2003). Essas
serpentes são robustas, pouco ágeis e apresentam como característica mais
evidente a presença de chocalho ou guizo na extremidade caudal (CARDOSO et al.,
2003).
As serpentes Crotalus estão distribuídas em regiões áridas e rochosas, de
baixa vegetação, sendo raramente encontradas em floresta, como está representado
na figura1.
Figura 1- Distribuição geográfica de subespécies Crotalus no Brasil Fonte: Guidolin et al., 2013.
A Crotalus durissus terrificus (C.d.terrificus/Cdt), denominada popularmente
como cascavel ou bioquira é encontrada nas zonas altas e secas do Brasil, também
é comum nos estados de São Paulo, Minas Gerais, Paraná, Rio Grande do Sul,
24
áreas de Mato Grosso, Rondônia, Amazonas, Pará a oeste, incluindo Paraguai,
Uruguai e Argentina (GUIDOLIN et al., 2013).
As serpentes C.d.collilineatus, por sua vez, estão distribuídas nas regiões
mais secas do centro-oeste do Brasil onde recebem denominações populares de
cascavéis ou maracabóias. C.d. cascavella é encontrada em áreas de caatinga da
região nordeste do Brasil e é conhecida como cascavel de quatro ventas. Destacam-
se também outras subespécies como a C.d.ruruima distribuída entre os estados do
Amapá, Pará, Amazonas, Rondônia e algumas regiões do território de Roraima; a
C.d.marajoensis que está presente na Ilha de Marajó e estado do Pará e a
C.d.trigonicus observada no território de Roraima (BARRAVIERA, 1993; PINHO,
2001; MARTINS et al., 2003).
1.2. Veneno crotálico e manifestações clínicas
Há relatos da literatura de que a toxicidade bem como a letalidade observada
nos envenenamentos por serpentes do gênero Crotalus variam de acordo com a
idade (JIMENEZ-PORRAS, 1964), localização geográfica (RODRIGUES et al., 1998;
FRANCISCHETTI et al., 2000), o sexo (MARSH; GLATSTON, 1974) e hábitos
alimentares (DALTRY et al.,1996). Magro e colaboradores (2001) descrevem ainda
que a toxicidade do veneno de C.d.terrificus não está relacionada somente à
distribuição geográfica, mas também quanto sua sazonalidade.
Do grupo das Crotalus a serpente mais estudada é a C.d.terrificus, pois
apresenta o veneno com maior toxicidade (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008). Os
envenenamentos por C.d.terrificus não provocam reações graves no local da picada.
Em modelos experimentais foi mostrado ainda, que este veneno inibe sinais
inflamatórios como dor e edema (SOUSA-E-SILVA et. al., 1996). Entretanto,
sistemicamente apresenta efeito neurotóxico, miotóxico e alterações da coagulação
sanguínea. Em casos moderados ou graves, observam-se desordens hemostáticas,
paralisia respiratória, hipotensão e falência renal aguda (AZEVEDO-MARQUES et
al., 1985, 1987 e 2003; SANO-MARTINS et al., 2001; HERNANDEZ CRUZ et al.,
2008).
O veneno crotálico é uma mistura complexa de substâncias biologicamente
ativas, como toxinas (crotamina, crotoxina, giroxina, convulxina) enzimas (5-
25
nucleotidase, fosfodiesterase, trombina, Lamino-oxidase) e peptídeos (BERCOVICI
et al., 1987).
A crotamina é uma proteína que representa cerca de 17% do veneno de
C.d.terrificus com massa molecular de 4,8 kDa, constituída por 42 resíduos de
aminoácidos (LAURE et al., 1975). Essa toxina age sobre a fibra muscular ativando
canais de sódio causando assim paralisia muscular e respiratória (CHANG et al.,
1978; MOURA-GONÇALVES; VIEIRA, 1950), além de apresentar efeito analgésico
(MANCIN et al., 1998) e ativar proteases e fosfolipases A2 presentes na peçonha
(MANCIN et al., 1997).
A giroxina é uma glicoproteína com massa molecular de 35 kDa
(ALEXANDER et al., 1988). Esta toxina é uma enzima trombina-símile com
atividades amidásica, esterásica e fibrinogenolítica (BARRIO, 1961). Além disso, foi
eivdenciado que a giroxina é responsável pelo movimento giratório ao longo do eixo
longitudinal da cauda de ratos e camundongos, característico de ação neurotóxica
(ALEXANDER et al., 1988; SEKI et al., 1980).
Bercovici e colaboradores (1987) demonstraram que a convulxina é uma
glicoproteína de 72 kDa que representa 5% do veneno total e, quando injetada por
via intravenosa é tóxica e capaz de promover a agregação plaquetária através de
mecanismos dependentes de difosfato, adenosina e cálcio (PRADO-
FRANSCESCHI; VITAL BRASIL, 1981; VARGAFTIG et al., 1983; SANO-MARTINS,
et al., 1992).
Dentre os vários componentes do veneno, a crotoxina (CTX) é a responsável
pela ação tóxica observada (JIMÉNES- PORRAS, 1964; BERCOVICI et al., 1987;
MAKLAND, 1998; TOYAMA et al., 2000; AMORA, 2006; CRUZ et al., 2005). Esta
toxina representa cerca de 60 % do veneno (VITAL BRASIL et al., 1966).
Estudos utilizando soros anti-veneno crotálico, anti-CTX ou anti-fração da
CTX bem como anticorpo monoclonal contra fração da CTX mostraram que toxina é
responsável pela letalidade (CHOUMET et al., 1998; RODRIGUEZ et al., 2006;
GUIDOLIN et al., 2013) e neurotoxicidade (BEGHINI et al., 2005) observadas nos
envenenamentos pelas subespécies C. durissus.
A CTX exerce ação neurotóxica, bloqueando a transmissão neuromuscular e
estes efeitos são pré-sinápticos, provocando uma modificação no neurotransmissor
liberado a partir de terminais nervosos ou ainda, pós-sinápticos via bloqueio da
resposta à acetilcolina (FAURE; BON, 1988).
26
Os efeitos neurotóxicos incluem paralisia dos músculos faciais, especialmente
ao redor da boca, visão turva, ptose palpebral e progressiva paralisia muscular e
respiratória. Além disso, há evidências de que a CTX apresenta ação cardiotóxica e
nefrotóxica (HERNANDEZ et al., 2007; MARTINS et al., 2002; AMORA et al., 2006;
SALVINI et al., 2001; MELO et al., 2004).
Análises histopatológicas de fragmentos do músculo recolhidos a partir do
local da picada mostraram mionecrose com lise dos miofilamentos, e este efeito foi
causado pelas subunidades da CTX (KOUYOUMDJIAN et al., 1986).
1.2.1. Crotoxina e suas subunidades
Como citado, a CTX é responsável pelo efeito tóxico observado no
envenenamento por C.durissus e representa a fração majoritária do veneno (VITAL
BRASIL et al., 1966).
Esta toxina é um complexo hetero-dimérico com massa molecular de
aproximadamente 30 kDa (FRANKEL CONRAT et. al., 1971) composto por duas
subunidades associadas de forma não covalente (NEUMANN; HABERMANN, 1955;
FRAENKEL-CONRAT e SINGER, 1971) denominadas: crotoxina A ou crotapotina
(CA) que é ácida, não tóxica e enzimaticamente inativa e a crotoxina B (CB) ou
fosfolipase A2 (PLA2), que por sua vez é básica, tóxica e apresenta atividade
enzimática (RUBSAMEN et al., 1971; AIRD et al., 1986; FAURE et al., 1994;
BERCHOVICI et al., 2004; SAMPAIO et al., 2010). Além disso, variações de CTX
inter e intra-espécies têm sido descritas nos venenos de C. durissus sugerindo a
presença de isoformas de CA e CB (PEREAÑEZ et al., 2012).
As subunidades CA e CB são importantes para a atividade da CTX, sendo a
primeira considerada como molécula carreadora, ou seja, chaperona dirigindo a
subunidade CB para o seu receptor na membrana celular, o que potencializa a
toxicidade da PLA2 (BON, 1988). A CTX circula como um complexo até que
reconheça o sítio específico da membrana alvo. Após a ligação da subunidade CB
em seu receptor de membrana a subunidade CA é liberada no meio (RADVANYI et
al., 1989; CHANG et al., 1981).
A subunidade CA apresenta massa molecular de 9,5 kDa (AIRD et al., 1986)
e consiste de três cadeias polipeptídicas (α, β eϒ) ligadas por pontes de dissulfeto
(PEREAÑEZ et al., 2012) geradas através da quebra proteolítica do precursor da
27
crotapotina. Foram isoladas de C.d.terrificus quatro isoformas desse precursor
classificadas com CA1, CA2, CA3 e CA4 (DOLEY; KINI, 2009). Estes mesmos
autores relatam ainda, que a crotapotina previne interações não específicas entre a
PLA2 e fosfolipídeos da membrana na junção neuromuscular sugerindo que, quando
a CTX atinge a membrana alvo, é formado um complexo ternário transiente entre o
receptor e as subunidades da CTX.
Quanto à subunidade CB, sendo uma fosfolipase, está presente em altas
concentrações não só em venenos de serpentes, mas também nos venenos de
vespas, abelhas e no suco pancreático de mamíferos (HARRIS, 1991). A
subunidade CB (14,5 kDa) é formada por uma cadeia simples de 122 aminoácidos
ligados por sete pontes de sulfeto (AIRD et al., 1986). As PLA2 apresentam um
amplo espectro em relação as suas atividades biológicas, dentre elas: ação
neurotóxica, cardiotóxica, edematôgenica, anticoagulante, hemolítica e miotóxica
(KINI; EVANS, 1989; MONTECUCCO et al., 2008). Além disso, a CTX em altas
concentrações pode ativar plaquetas (VARGAFTIG et al., 1980; LANDUCCI et al.,
1994).
O mecanismo pelo qual a PLA2 induz lesão da célula é resultante de
alterações na membrana celular que promove aumento na concentração de CA2+
citosólico e assim a ativação de mecanismos intracelulares que culminam com a
morte celular (MONTECUCCO et al., 2008; SAMPAIO et al., 2010).
1.3. Veneno crotálico e sistema imune
Muitos estudos mostram que o veneno total de C.d.terrificus, CTX e/ou suas
subunidades possuem a capacidade de inibir o processo inflamatório assim como
outros mecanismos imunes (SAMPAIO et al., 2010).
Estudos mostraram que este veneno induz baixa produção de anticorpos
contra seus componentes quando comparado com outros venenos de animais
peçonhentos, o que sugere baixa imunogenicidade ou ação supressora sobre o
sistema imune (ROLIM- ROSA, 1980 e 1981; SOERENSEN, 1990).
O veneno crotálico também exerce efeito modulador sobre macrófagos. Neste
sentido, foi verificado que macrófagos incubados com o veneno de C.d.terrificus
apresentavam a capacidade fagocítica e de espraiamento comprometidos (SOUSA-
E-SILVA et al., 1996).
28
SAMPAIO e colaboradores (2001) mostraram que o veneno crotálico além de
inibir a capacidade fagocítica e de espraiamento dos macrófagos promove a
produção de óxido nítrico, peróxido de nitrogênio, metabolismo de glucose e
glutamina por essas células, o que sugere efeito dual desse veneno sobre as
funções dessa população celular.
Em 2003, Sampaio e colaboradores demonstraram que a CTX é o
componente do veneno crotálico responsável pela a inibição da atividade fagocítica
de macrófagos residentes ou ativados pela injeção de tioglicolato ou Mycobacterium
bovis (BCG) obtidos da cavidade peritoneal de ratos.
O efeito da CTX sobre a atividade funcional dos macrófagos foi atribuído à
subunidade CB da toxina (SAMPAIO et al., 2005). Além disso, em outro trabalho foi
mostrado que o efeito da CTX assim como do veneno total sobre as funções do
macrófago está relacionado à sua capacidade de alterar o rearranjo do
citoesqueleto, inibição da fosforilação de tirosinas e diminuição das proteínas Rho
GTPases associadas à membrana, as quais estão envolvidas na sinalização de
processos intracelulares e atividade fagocitária dessas células (NIEDERGANG;
CHAVRIER, 2005).
O efeito inibitório do veneno total, CTX e PLA2 sobre a atividade fagocítica
dos macrófagos peritoneais de rato foi evidenciado pela produção de lipoxina A4
(LXA4) e prostaglandina E2 (PGE2) (SAMPAIO et al., 2006).
Modelos experimentais in vivo e in vitro demonstraram que a CTX apresenta
também ação anti-tumoral interferindo no crescimento do tumor (RUDD et al.,1994;
DONATO et al., 1996). Costa e colaboradores (2013) relataram que o efeito da CTX
sobre o crescimento do tumor também está relacionado à sua ação sobre os
macrófagos, os quais são essenciais no microambiente tumoral.
Cardoso e colaboradores (2001) mostraram que a administração de CTX em
camundongos resulta na diminuição transitória de linfócitos e macrófagos com
aumento de neutrófilos na circulação sanguínea. Este efeito é ainda, acompanhado
pelo aumento dos níveis de IL-10, IL-6 e glucocorticóides, o que pode contribuir para
a reação no local do envenenamento. Além disso, observaram que esplenócitos de
camundongos injetados com CTX estimulados com concanavalina A (ConA)
produzem in vitro níveis menores de citocinas quando comparado ao obtido com
células de camundongos não-imunizados.
29
Em 2008, Zambelli e colaboradores evidenciaram que a CTX altera a
distribuição de leucócitos do sangue e da linfa, e ainda aumenta o número de
linfócitos B e T nos gânglios linfáticos. Essa redução do celular no sangue após a
administração da CTX é resultante do aumento da adesão de leucócitos às células
endoteliais altas dos pequenos vasos nos tecidos linfoides secundários. Em adição,
os autores verificaram que esse efeito é mediado pela subunidade CB da CTX.
Em outro trabalho foi mostrado que a CA inibe significativamente o edema da
pata de ratos induzido por carragenina tanto na fase precoce como tardia da
resposta imune (LANDUCCI et al., 1995).
Em 2004, Rangel-Santos e colaboradores mostraram que a CTX também é
capaz de inibir a proliferação de esplenócitos induzidos com ConA, e que esse efeito
imunomodulador é mediado por ambas as subunidades da CTX.
Castro e colaboradores (2007) mostraram que ratos Lewis com neurite
autoimune experimental, tratados com crotapotina tiveram menor score clínico,
poucos infiltrados inflamatórios no nervo ciático e redução da proliferação de
linfócitos quando comparados aos ratos doentes, sugerindo que esta substância
pode modificar os eventos iniciais da indução da doença, atuando provavelmente na
migração de células T auto-reativas para o sistema nervoso periférico.
Garcia e colaboradores (2003) demonstraram que a crotapotina é capaz de
inibir a proliferação de esplenócitos murinos quando estimulados com ConA, e ainda
induziram o aumento da síntese de PGE2 nestas culturas.
Em trabalho posterior, esses mesmos autores verificaram que a
administração de crotapotina in vivo em modelo de encefalomielite autoimune
experimental reduz a resposta proliferativa de linfócitos T encefalitogênicos
resultando em melhora da doença sem causar modificação na expressão de
moléculas coestimuladoras em macrófagos peritoneais murinos (GARCIA et al.,
2004).
Sobre a imunidade humoral, Cardoso e Mota (1997) mostraram que o veneno
total de C.d.terrificus e a CTX foram capazes de inibir a produção de anticorpos IgG1
contra um antígeno não-relacionado como a albumina de ovo de galinha
(ovalbumina-OVA), porém os componentes separados, CA e CB, não tiveram
influência na produção desses anticorpos murinos, o que leva a evidências que a
integridade da CTX é necessária para sua atividade imunossupressora. Esses
mesmos autores demonstraram que a administração de CTX antes da imunização
30
de camundongos com soro albumina bovina (BSA) resulta em níveis baixos de
anticorpos IgG1 anti-BSA quando comparados aos camundongos somente
imunizados com BSA.
Em outro trabalho, Rangel-Santos e Mota (2000) relataram que o efeito
supressor do veneno de C.d.terrificus e CTX sobre a produção de anticorpos contra
seus própiros antígenos assim como sobre a resposta humoral heteróloga (anti-
albumina humana SAH) é mantido mesmo após o aquecimento do veneno à 50º C e
da CTX entre 50- 75º C.
Rangel-Santos e colaboradores (2004) mostraram que o veneno e a CTX
foram também efetivos em inibir a resposta proliferativa de linfócitos T estimulados in
vitro com ConA, assim como a produção de algumas citocinas. Esses autores
demonstraram ainda, que a transferência de linfócitos T e B purificados de
camundongos injetados com o veneno total de C.d.terrificus ou CTX para
camundongos normais inibe a produção de anticorpos IgG1 em resposta à
imunização com SAH.
No contexto de avaliação do efeito da CTX sobre a imunidade adaptativa,
resultados obtidos pelo nosso grupo de pesquisa permitiram verificar que esta toxina
é capaz de modular a resposta imune efetora mesmo quando injetada três dias após
a imunização com OVA, visto que inibiu a produção de anticorpos anti-OVA e a
resposta proliferativa in vitro dos linfócitos T OVA-específicos. Verificamos ainda,
que a CTX exerce esse efeito modulador em situações de imunização com a OVA
associada a adjuvantes polarizadores de resposta Th1 ou Th2 (FAVORETTO et al.,
2011).
A figura 2 ilustra as diferentes ações da CTX como: imunomoduladora, anti-
inflamatória, anti-microbiana e analgésica além de sua atividade antitumoral.
31
Figura 2- Ação da crotoxina na microcirculação, sistema linfático e tecido intersticial. Fonte: SAMPAIO et. al., 2010
1.4. Células dendríticas e indução da resposta imune adaptativa
O sistema imune detecta a presença de agentes potencialmente patogênicos,
danos no tecido e também participa do reparo tecidual. Para tanto, componentes do
sistema imune inato e adaptativo estão presentes em todos os tecidos e órgãos do
indivíduo como na corrente sanguínea para a detecção de infecções transmissíveis
pelo sangue, nas mucosas para a resposta contra patógenos que invadem várias
superficies incluindo o trato gastrointestinal, respiratório, urinário e o trato urogenital,
e por fim o tecido cutâneo que detecta os patógenos que entram através da pele
(HU; PASARE, 2013).
Está bem estabelecido na literatura que componentes da imunidade inata são
essenciais para a geração da imunidade adaptativa contra diferentes agentes
patogênicos. Neste sentido, células da imunidade inata tais como as dendríticas
(DCs) e macrófagos são capazes de apresentar antígenos para os linfócitos T (LTs)
induzindo sua ativação e diferenciação em células efetoras (ITANO; JENKINS, 2003;
CATRON et al., 2004).
32
As DCs são, portanto consideradas uma ponte entre a imunidade inata e
adaptativa, pois são ativadas pelos antígenos e por elementos da resposta inata e
fazem a ativação dos LTs com a consequente geração da resposta imune
adaptativa. Estas células residentes em tecidos periféricos tais como pele (célula de
Langerhans), fígado, intestino dentre outros, capturam antígenos e assim se tornam
ativadas, migram para os linfonodos regionais e interagem com os LTs (CRUVINEL
et al., 2010; CHEN et al., 2013).
Células dendríticas são populações heterogêneas classificadas de acordo
com marcadores fenotípicos. Em estado estacionário, as DCs podem ser
classificadas em 2 categorias: DCs plasmocitóides (pDCs) e DCs clássicas (cDCs).
As cDCs derivam de um percursor comum, o pré-cDC, que é dependente do ligante
tirosina quinase 3 (Flt3L) e eles compartilham propriedades funcionais, tais como a
expressão de moléculas do complexo principal de histocompatibilidade de classe I e
II (MHC-I e II) e a capacidade de processar antígenos e estimular células T naive
(SEGURA; AMIGORENA, 2013).
As DCs expressam na superfície os marcadores hematopoéticas CD45, MHC-
II, CD11c e o receptor Flt3, também denominado quinase hepática fetal 2 (Flk2) ou
CD135 (MERAD et al., 2013).
Essas cDCs podem ser divididas em DCs residentes de órgaos linfoides e
DCs migratórias. DCs residentes de tecidos linfoides permanecem nesses locais
durante todo o seu ciclo de vida e são fenotipicamente imaturas exibindo baixa
expressão de moléculas coestimuladoras (CD40, CD80 e CD86). As cDCs também
podem estar presentes nos tecidos periféricos e em órgãos não linfoides como pele,
fígado, rim e pulmão. Essas cDCs migram via sistema linfático para os tecidos
linfoides com um fenótipo maduro com alta expressão de moléculas coestimuladoras
e de MHC. A migração de DCs derivadas de tecido é aumentada em resposta a
estímulos inflamatórios (ZHAN et al., 2012; HU; PASARE, 2013; SEGURA;
AMIGORENA, 2013).
Por outro lado, pDCs acumulam-se principalmente no sangue e nos tecidos
linfóides e entram nos gânglios linfáticos através da circulação sanguínea. pDCs
apresentam baixa expressão de moléculas coestimuladoras, MHC-II e a integrina
CD11c. Estas células também expressam poucos dos receptores de reconhecimento
de padrões moleculares de patógenos (PRRs) que incluem os receptores do tipo Toll
7 e 9 (TLRs, do inglês Toll like receptors). Estas células, mediante o reconhecimento
33
de ácidos nucléicos heterólogos, produzem grandes quantidades de IFN tipo I e
adquirem a capacidade de apresentar antígenos (MERAD et al., 2013).
Em 2013, Wright e colaboradores mostraram que as pDCs podem funcionar
como APCs promovendo imunidade ou ainda, mediar tolerância. Periasamy e
colaboradores (2013) relatam ainda a presença de duas populações de DCs no
baço, uma delas com fenótipo CD11clow CD11bhigh MHC-II(-) capaz de ativar somente
linfócitos TCD8+ e uma segunda população de DCs CD11chigh CD11blow MHC-II(+)
que ativa tanto as células T CD4+ como as CD8+, assim como as DCs
convencionais.
Estudos evidenciam que DCs murinas podem ser geradas a partir de medula
óssea (DCsMB) cultivadas in vitro na presença somente do fator de estimulação de
colônias de granulócitos/ macrófagos (GM-CSF) ou do GM-CSF em conjunto com a
interleucina-4 (IL-4) (MASURIER et al., 1999; SON et al, 2002; WELLS et al. 2005).
Ambos os métodos de cultura resultam na produção das populações de DCs
heterogêneas com propriedades estimuladoras e fenotípicas distintas (WELLS et al.,
2005).
Trabalhos descrevem ainda, que o GM-CSF pode ser utilizado na
diferenciação de DCs humanas (LAAR et al., 2012; BLYSZCZUK et al., 2013). Este
fator de crescimento é produzido em níveis baixos no estado de homeostasia do
sistema imune, mas a sua produção é aumenta durante a resposta inflamatória
(BLYSZCZUK et al., 2013).
Além desses fatores, outros trabalhos mostram a geração de DCs a partir da
administração in vivo ou adição in vitro do ligante do receptor de tirosina quinase Flt3
(WEIGEL et al., 2002; KARZUNKY et al., 2003).
As DCs, assim como outras APCs, reconhecem os agentes patogênicos por
meio de PRRs que distinguem padrões moleculares presentes nesses patógenos
(PAMPs) (MOLL, 2003). A interação seletiva desses receptores com os PAMPs
induz nas APCs uma cascata de ativação, maturação celular e produção de
mediadores solúveis envolvidos na geração da resposta celular adaptativa (GAUSE
et al., 1999; TAKEDA et al., 2003; VAN KOOYK; GEIJTENBEEK, 2003).
Dentre os receptores de APCs, os TLRs estão envolvidos no reconhecimento
diferencial de padrões moleculares associados à diferentes microrganismos ou
produtos secretados por eles e assim, participam da ativação celular (HIRATA et al.,
2008). Outro exemplo de receptores de superfície nas APCs são os de lectina tipo-C
34
(CLRs), como de manose (MR) e DC-SIGN que exercem papel relevante no
reconhecimento tanto de antígenos próprios como de patógenos contendo glicanos
na sua composição (ENGERING et al., 2002; GEIJTENBEEK et al., 2000;
KAWAUCHI et al., 2014).
Macrófagos e DCs são ativados pelos produtos da parede celular de bactérias
Gram-positivas (TAKEUCHI et al.,1999; MEANS et al., 2000), bactérias Gram-
negativas (QURESHI et ai, 1999), espiroquetas (BRIGHTBILL et al, 1999), leveduras
(UNDERHILL et al, 1999) e micobactérias (MEANS et al, 2000) por meio do TLR4 e
TLR2. O TLR4 interage preferencialmente com lipopolissacarídeos bacterianos
(LPS), enquanto o TLR2 reconhece lipoproteinas bacterianas e os peptidoglicanos
(TAKEDA et al., 2003).
Sato e colaboradores (2000) demonstraram que os lipopeptideos de
micoplasmas, um ligante de TLR2, atua sinergicamente com o LPS durante a
indução de fator de necrose tumoral (TNF-α) em macrófagos peritoneais murinos.
O LPS é reconhecido por TLR4 expressa em DCs induzindo a produção de
diversas citocinas (FUJIHARA et al, 2003; MILLER et al, 2005). Assim como todos
os TLRs, a cauda citoplasmática de TLR4 contém o domínio IL-1R (TIR) (IMLER;
HOFFMANN, 2003; O'NEILL; BOWIE, 2007) e após a ativação do TLR4, esse
domínio recruta eficientemente várias proteínas adaptadoras intracelulares como a
MyD88 (Myeloid Differentiation primary response gene 88) que culminam com as
transcrição de genes envolvidos com a ativação celular, produção de citocinas
dentre outros (AKIRA et al., 2001). Portanto, o reconhecimento dos patógenos pelos
receptores nas APCs influenciam na geração da resposta adaptativa com a
polarização dos linfócitos TCD4+ para Th1, Th2, Th17 ou Treg (TCD4+CD25+FoxP3+)
(MOSMANN; SAD, 1996; GAUSE et al., 1999; SCHAMARE et al., 2001; TAKEDA et
al., 2003; VAN KOOYK; GEIJTENBEEK, 2003).
Como apresentado na figura 3, as DCs em tecidos não linfoides atuam como
sentinelas do sistema imune. Após entrar em contato com agentes potencialmente
patogênicos, capturam, processam esses antígenos em peptídeos e migram para os
órgãos linfoides secundários. Esse processo é resultante de mudanças fenotípicas e
funcionais dessas células. Nos tecidos linfóides, as DCs apresentam os peptídeos
antigênicos para as células TCD4+ ou CD8+, em associação com as moléculas de
MHC e coestimuladoras. Os LTs tornam-se ativados, proliferam, diferenciam-se em
subpopulações distintas e efetoras de uma resposta imune adaptativa antigeno-
35
específica. Em outras situações, DCs ao apresentar antígenos para os linfócitos T
podem também induzir anergia dessas células ou ainda, induzir a diferenciação de
células Tregs com fenótipo CD4+CD25high Foxp3+ (WEIGEL et al., 2002; MEMPEL et
al., 2004; CHEN et al., 2009; DAVISON et al., 2013).
Figura 3- Células dendríticas e geração de LTs antígenos específicos Características das Células Dendríticas Imaturas (iDCs). (B) Ativação das DCs após a captura de patógenos via interação com os Receptores de Reconhecimento Padrão e presença de citocinas do microambiente, seguida de migração para os linfonodos. (C) Maturação das Células Dendríticas. (D) Migração das células T naive para a região paracortical do linfonodo. Entrada através das vênulas endoteliais altas (HEV) e migração orientada por quimiocinas do tecido linfoide. (E) Apresentação dos antígenos processados aos linfócitos T gerando células efetoras ativadas.
Fonte: Cruvinel, et. al., 2010
36
A ativação de células T CD4+ ocorre por meio da interação entre o receptor de
antígeno associado ao complexo CD3 (TCR/CD3) expressos na membrana celular, e
o peptídeo antigênico no contexto da molécula do complexo de histocompatibilidade
principal na superfície das células apresentadoras de antígeno. Com isso, interações
entre moléculas expressas nas APCs e nos LT fornecem a coestimulação
necessária para a ativação e diferenciação dessas células T (SCHWARTZ et al.,
1990; JUNE et al., 1994; CROFT, 2003).
Dessa forma, a interação entre a molécula CD28 expressa no LT e seus
ligantes CD80/CD86 nas APCs fornecem o sinal coestimulador necessário para a
proliferação e diferenciação das células humanas ou T murinas (DING et al., 1993).
Na superfície das APCs, a molécula CD86 é expressa em baixos níveis e
rapidamente aumentada após a ativação da célula, enquanto que a expressão de
CD80 é induzida mais tardiamente. A expressão mais rápida de CD86 pode indicar
sua maior participação como coestimuladora durante a iniciação da resposta imune
que a CD80, entretanto isto não está definido visto que ambas compartilham as
mesmas funções (DIEHL et al., 2000).
A interação entre a molécula CD40 expressa pelas APCs e seu ligante de
CD40 (CD40L-CD154) na membrana de linfócitos são importantes na ativação de
linfócitos T bem como na própria APC (PENG et al., 1996; KELSALL et al., 1996;
DIEHL et al., 2000; MACDONALD, 2002; O`SULLIVAN et al., 2003; STRAW, 2003).
Arboleda e colaboradores (2011) sugerem ainda, que a magnitude da
interação entre a DC e as células T contribiu para a ativação e diferenciação dessas
células. Neste sentido, foi verificado que um contato estável entre as células
promove a ativação do LT, enquanto contatos curtos contribuem grandemente para
a indução de tolerância dessas células.
Além das interações entre moléculas de superfície celular, citocinas presentes
no ambiente de contato entre os linfócitos e as DCs são importantes para a ativação
e diferenciação destes linfócitos (DING et al., 1993; FRUCHT et al., 2001;
WATFORD et al., 2003).
As células T auxiliares (cells T helper/Th) do subtipo 1 secretam
predominantemente interferon-y (IFN- y), células Th2 produzem interleucinas 4, 5,13,
células Th17 produzem interleucina 17, enquanto que as células Tregs secretam TGF-
β (transforming growth factor β) e Interleucina 10 (YAMAZAKI et al., 2007; WRIGHT
et al., 2013).
37
O papel das citocinas inflamatórias e anti-inflamatórias/moduladoras também
tem sido relatado. A IL-6 participa da resposta inflamatória, estimula a ativação e
proliferação de linfócitos, a diferenciação de células B e o recrutamento de
leucócitos para o foco inflamatório. O TNF-α, por sua vez, é uma citocina pró-
inflamatória bem caracterizada, é liberado principalmente a partir de invasão de
monócitos e macrófagos por diferentes agentes patogênicos e desempenha um
papel crucial na resposta inflamatória. No entanto, em alguns casos pode participar
na patogênese de doenças inflamatórias agudas e crônicas (KIEM et al., 2012).
Linfotoxina-α (LT- α) é um outro membro da família de ligandos de TNF que é
sintetizado principalmente por linfócitos T e B ativados (KLEEMANN et al., 2008).
Essa citocina é produzida por fagócitos mononucleares ativados, células naturais
Killer (NK) e mastócitos em resposta a antígenos bacterianos como o LPS (CHEN et
al, 2013). O TNF ativa as células T, células B e macrófagos e induz a expressão de
outras citocinas e moléculas de adesão celular, através da interação com o receptor
de TNF-R55 (PAEPE et al., 2012).
Outra citocina pró-inflamatória, a IL-12, desempenha papel central na
iniciação e regulação da resposta imune celular promovendo a diferenciação dos
linfócitos T para o fenótipo Th1. Além disso, está envolvida na inflamação
promovendo ativação celular contra diferentes patógenos assim como na
participação em doenças inflamatórias crônicas tais como artrite reumatóide, asma,
psoríase e doença de Crohn (GATELY et al., 1998; MANNON et al., 2004).
A IL-12 não é somente um indutor do tipo Th1, mas também é secretada por
células NK bem como outras citocinas. Esta citocina também atua sobre as DCs
diminuindo a diferenciação de células Tregs, inibindo citocinas reguladoras, tais como
TGF-β e IL-10 (BADR et al., 2014).
IL-10 secretada por diferentes células age suprimindo as funções das DCs,
inibindo a produção de IL-2, citocinas pró-inflamatórias (IL-6, IL-12 e TNF-α) e a
sinalização intracelular via CD28 (MOORE et al., 2001). Trabalhos descrevem
também, que a presença de TGF-β, juntamente com a IL-10, está associada com a
indução de tolerância e geração de células Treg (DOETZE et al., 2000; GRUTZ,
2005).
Existem algumas evidências de que o efeito supressor da Treg é mediada
através do contato célula-célula, ou seja, da ligação do receptor CTLA4 do linfócito T
38
com os receptores CD80 ou CD86 em APC (MCCOY; LE GROS, 1999; MILLS,
2004).
Patógenos como bactérias e protozoários promovem a ativação e maturação
das DCs bem como a secreção de citocinas, como a IL-12 por essas células que,
em conjunto, resultam na diferenciação dos linfócitos para o subtipo Th1. Por outro
lado, antígenos de helmintos ou alérgenos parecem ser reconhecidos pelas DCs em
contexto pouco inflamatório e, quando na presença de IL-4, direcionam os linfócitos
para o subtipo Th2 (MACDONALD et al., 2002).
LTs diferenciados em Th1 secretam IL-2, IL-12, IFN γ, TNF-α enquanto que
os linfócitos Th2 produzem IL-4, IL-5, IL-10, e IL-13 e podem neutralizar a atividade
de citocinas Th1 (KLEEMANN et al., 2008).
DCs podem ser também ativadas por sinais a partir de células do sistema
imune como as NK e as células T. Os linfócitos T CD4 + humanos como murinos
ativados e de memória via expressão de CD40L podem interagir com o CD40 nas
DCs e induzir a sua ativação. Citocinas produzidas pelos linfócitos T, tais como IL-4
e IFN-y, também desempenham um papel importante na ativação de DCs (HIVROZ
et al., 2012).
O LPS e o TNF-α são agentes eficazes para a maturação DCs, no entanto,
quando em altas concentrações podem ser citotóxico in vivo. Por outro lado,
sequências guanina oligodeoxinucleotideos fosforotioato (CpGs) não são tóxicas e
funcionam como potentes ativadores na maturação de DCs em modelos in vitro e in
vivo (WEIGEL et. al., 2002). CpGs ativam as DCs aumentando a expressão das
moléculas coestimuladoras necessárias para a ativação das células T e a secreção
de citocinas pró-inflamatórias, principalmente IFN-ϒ, IL-12, IL-6 e TNF-α, necessárias
para respostas imunes potentes (WEIGEL et al., 2002).
Outros autores descrevem ainda, que o LPS é capaz de induzir as DCs a
produzir tanto citocinas anti-inflamatórias (IL-10) como as pró-inflamatórias incluindo
IL-12, TNFα, IL-6 e IL-1β (HIRATA et al., 2008).
Há também descrições na literatura que patógenos ou seus produtos exercem
efeito inibitório sobre as DCs mantendo-as imaturas e/ou tolerogênicas. Além da
ação direta dos patógenos sobre as DCs, citocinas como IL-10 e TGF-β podem
induzir DCs imaturas a se tornarem tolerogênicas (DUGAST; VANHOVE, 2009).
Neste contexto, há baixa expressão de moléculas coestimuladoras pelas DCs
39
durante as interações com os linfócitos T resultanto na anergia destes ou ainda, a
geração de células Treg produtoras de IL-10 (COOLS et al., 2007).
Em 2003, Schartz relatou que estas DCs tolerogênicas podem suprimir a
ativação e proliferação de linfócitos T via secreção de TGF-β e IL-10, além de induzir
a paralisação do ciclo celular nas fases G0/G1 tornando a célula anérgica. PGE2
secretada pelas DCs também está diretamente relacionada com a atividade
supressora destas células.
Além das citocinas, agentes supressores como corticosteroides e mediadores
lipídicos podem influenciar na resposta inflamatória e imunidade adaptativa (DE
JONG et al., 1999; STEINBRINK et al., 2002; MULLER et al., 2002; KUBACH et al.,
2005).
Lipoxinas (LXs) são eicosanoides produzidos através do metabolismo do
ácido araquidônico, cuja biossíntese é detectável após a resposta pró-inflamatória
inicial (SCANNELL et al., 2007; SORDI et al., 2013). Estes eicosanoides apresentam
numerosas funções relacionadas à reprodução, hemostasia, controle da inflamação
aguda, alergia e dor (RODRÍGUEZ et al., 2014).
Estudos evidenciam que as LXs, em particular a LXA4, são eicosanoides anti-
inflamatórios e mediadores pró-resolução da inflamação. Este mediador lipídico é
gerado pela lipoxigenação de ácido araquidônico pela ação da 15-LO em células
epiteliais e monócitos, ou pela ação da 5-LO em neutrófilos (SERHAN et al., 1984).
Zhang e colaboradores (2007) observaram que a LXA4 é capaz de suprimir a
expressão de marcadores de superfície celular e a atividade de células RAW2647
estimuladas com LPS.
Em outro trabalho, Aliberti e colaboradores (2002) mostraram que a produção
de LXA4 in vivo esteve acompanhada pela inibição da produção de IL-12 por DCs
esplênicas estimuladas in vitro com extrato de Toxoplasma gondii. Além disso,
observaram que a pré-incubação de DCs in vitro com LXA4 torna essas células
refratárias à produção de IL-12 após estimulação com antígenos microbianos. Esses
resultados indicam, portanto que a síntese de LXA4 gerada em resposta a antígenos
microbianos pode ser um potente mecanismo de regulação da atividade funcional
das DCs e consequente geração da resposta imune adaptativa.
]A PGE2, por sua vez, é o eicosanoide mais abundante no ambiente
inflamatório e sintetizado a partir da ação das enzimas cicloxigenases (COX-1 e 2)
sobre o acido araquidônico. PGE2 também estabiliza a função efetora de células
40
supressoras de origem mieloide, inibe a liberação de IL-12 p70 em macrófagos e
DCs, e pode aumentar a produção de IL-23 (RODRÍGUEZ et al., 2014). Kuroda e
Yamashita (2003) mostraram que este eicosanoide produzido por macrófagos inibe
a secreção de IL-12 e IFN-γ por linfócitos Th1. Além disto, foi observado que PGE2
suprime a expressão do fator de transcrição RORγt, a secreção de IL-17 e a
diferenciação de células Th17 (CHEN et al., 2009). Em outro trabalho Baratelli e
colaboradores (2005) demonstraram que a PGE2 está relacionada com a indução da
expressão gênica do fator de transcrição FOXP3 e o aumento da atividade
moduladora das células TCD4+CD25+.
A funcionalidade das DCs está, portanto relacionada ao tipo de
interação/reconhecimento dos diversos patógenos ou seus produtos, ao seu estágio
de ativação e maturação e às condições do microambiente, como presença de
citocinas ou agentes imunomoduladores (MULLER et al., 2002; KUBACH et al.,
2005; KABELITZ et al., 2006).
Além disso, em virtude de suas funções fisiológicas, as DCs desempenham
papel importante na resposta imune contra patógenos e ainda, em reações adversas
como, por exemplo, as doenças auto-imunes e processos inflamatórios crônicos
(LLOBERAS et al., 2013). Assim, a modulação da atividade funcional das DCs pode
ser uma estratégia promissora no tratamento e prevenção de desordens
imunológicas.
41
2. OBJETIVOS
Considerando o efeito imunomodulador da CTX in vivo sobre as respostas
humoral e celular e o papel crucial das DCs na indução da resposta imune
adaptativa, o objetivo do presente trabalho foi estudar a capacidade da CTX e suas
subunidades CA e CB de modular diretamente a atividade funcional das DCs in vitro.
2.1. Objetivos específicos
Caracterizar a população de DCs diferenciadas in vitro somente com GM-
CSF ou com GM-CSF + IL- 4;
Avaliar o efeito da crotoxina, crotapotina e fosfolipase A2 sobre a expressão
das moléculas de MHC-II e coestimuladoras nas DCs incubadas somente com as
toxinas in vitro ou em associação com o LPS em diferentes protocolos;
Analisar a participação do receptor peptídeo formil na atividade da CTX e CB
sobre as DCs in vitro incubadas com LPS;
Analisar o padrão de secreção de citocinas pró-inflamatórias, anti-
inflamatórias e produção de PGE2 e LXA4 em culturas de DCs incubadas in vitro com
a CTX, CA, CB e/ou LPS;
Avaliar a expressão gênica do TGFβ e IL-10 em DCs diferenciadas in vitro e
incubadas com CTX, CA, CB e/ou LPS.
Estudar o efeito da CTX e CB sobre a capacidade das DCs estimuladas in
vitro com LPS de induzir reação leucocitária mista (Mixed Lymphocyte reaction-
MLR).
42
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Animais
Camundongos machos da linhagem BALB/c com 7-8 semanas foram
utilizados nos protocolos experimentais. O projeto foi aprovado pela Comissão de
Ética no Uso de Animais do Instituto Butantan (CEUAIB) n°1005/13.
Os animais fornecidos pelo Instituto Butantan foram mantidos em condições
padronizadas do biotério em relação à temperatura e umidade e com livre acesso a
água e ração, até o momento da realização dos experimentos.
3.2. Veneno
O pool de veneno liofilizado foi obtido de espécimes adultos de serpentes
Crotalus durissus terrificus fornecido pelo laboratório de Herpetologia do Instituto
Butantan. O veneno foi estocado a -20º C até a sua utilização.
3.3. Purificação da CTX do veneno de C.d. terrificus
A crotoxina do veneno total de C.d.terrificus (VCdt) foi purificada de acordo
com o método adotado por Faure e Bom (1987) com algumas modificações.
Uma alíquota contendo o veneno liofilizado (15 mg) de cascavel foi
ressuspensa em 1,0 mL de solução Tris- HCL (50mM, pH 7,0) e posteriormente,
submetida à cromatografia de troca aniônica em coluna MONO-Q HR 5/5 em
sistema FPLC (Fast- Performance Liquid Chromatography, Pharmacia) previamente
equilibrada no mesma solução.
As proteínas ligadas à resina foram eluídas por gradiente linear de solução de
NaCl 0-1 M em solução de 50 mM Tris- HCl; pH7,0 (RANGEL-SANTOS et al., 2004).
Após esse procedimento, as frações contendo a CTX foram reunidas e dialisadas
em PBS e analisadas quanto a sua pureza e homogeneidade em gel de
poliacrilamida.
43
3.4. Purificação das subunidades CA e CB a partir da CTX isolada do veneno
de C.d. terrificus
Amostra de CTX foi dialisada em solução Tris- HCL pH 7,2 e em seguida, foi
acrescentado 0,72 g de uréia para cada 2,0 mL de toxina. As amostras foram
incubadas por 18 horas a 4º C. As subunidades CA e CB, foram fracionadas por
cromatografia catiônica utilizando uma coluna MONO-S HR 5/5 em sistema FPLC
(RANGEL-SANTOS et al., 2004). O material foi eluído da coluna utilizando um
gradiente linear de 2,0 M de NaCl e 6,0 M de uréia, tamponado com o Tris/ HCL 50
mM, pH7,2. As frações CA e CB foram reunidas e dialisadas contra PBS para
remover os sais e a uréia.
3.5. Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) na presença ou não
de tricina
A CTX bem como a subunidade CB foram submetidas à eletroforese em gel
de poliacrilamida 12,5 % com agente desnaturante SDS (dodecil-sulfato de sódio),
conforme citado por Laemmli (1970). O procedimento foi realizado em condições
redutoras na presença de 2-mercaptoetanol. Para identificar a presença da CTX e
da subunidade CB foi feito o gel de empilhamento preparado na concentração de 4%
de bisacrilamida/acrilamida em Tris-HCl 0,5M (pH 6,8) e 1 % SDS e um gel de
separação contendo 12,5% de bisacrilamida/acrilamida em Tris-HCl 2,0M pH 8,8 e
1% SDS.
A subunidade CA foi submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida
contendo SDS – tricina. Para tanto, foi preparado um gel de empilhamento de 1% de
bisacrilamida/acrilamida em Tris-HCl 0,5M (pH 6,8), 1% de SDS, APS (10%) e um
gel de resolução na concentração de 16% de bisacrilamida/acrilamida em Tris-HCl
3M (pH 8,45), 0,3% de SDS, glicerol (25%) e APS 10%.
As amostras foram diluídas em tampão (Tris-HCl 0,625 mM pH 6,8; 10%
glicerol (v/v); 5% -mercaptoetanol (v/v); 2 % de SDS e 0,001 % de azul de
bromofenol na proporção de 1:5 e, em seguida, foram aquecidas a 95ºC/ 5 min.
As frações de CTX (pico 1- 0,685 mg/mL; pico 2- 0,932 mg/mL e pico 3- 0,874
mg/mL), subunidade CB (0,53 mg/mL), amostra de veneno total (1,4 mg/mL) de
C.d.terrificus e o padrão de massa molecular (Trail Mixtm- Novagen) foram aplicados
44
no gel de poliacrilamida 12,5%. O tampão de corrida utilizado foi constituído por Tris-
HCl 0,25 mM, glicina 0,19 M e SDS a 0,1 %, pH 8,3. Em seguida, o gel foi submetido
a uma corrente elétrica de 110 V e 55 mA por 2 horas em cuba SE 245 Mighty Small
II (Hoefer, Amersham Pharmacia Biotech) acoplada a fonte EPS 3500 (Amersham
Pharmacia Biotech).
Amostra da subunidade CA e o padrão de massa molecular Fast ruller
(Thermo Scientific) foram aplicados no gel de 16% de poliacrilamida. A corrida
eletroforética foi realizada com dois tampões, sendo um tampão para o catodo (0,1M
Tris, 0,1M Tricina e 0,1% SDS) e o outro para o anodo (0,2M Tris-Cl, pH8,9) em uma
voltagem constante de 30 V a 40mA por aproximadamente 1h. Após esse período, a
corrida foi mantida por mais 5 horas em corrente de 90 V.
No término das corridas, ambos os géis foram imersos em solução de 0,2 %
(m/v) de Coomassie Blue R-250 em água e metanol na proporção de 1:1 (v/v) para a
visualização do padrão de bandeamento das proteínas presentes nas amostras. Em
seguida, o excesso de corante foi retirado mergulhando o gel em solução de 30% de
metanol, 10% de ácido acético em água destilada.
3.6. Eliminação de endotoxinas na CTX, CA e CB
A CTX e suas subunidades CA e CB foram submetidas à coluna de polimixina
para a remoção de possíveis endotoxinas bacterianas (LPS), conforme o protocolo
estabelecido pelo fabricante (Thermo Scientific Rockford, USA). Posteriormente,
essas amostras foram analisadas quanto ao conteúdo de endotoxina em ensaio
imunoenzimático de Limulus amoebocyte lysate (LAL) (Cambrex/ Lonza) realizado
no Laboratório de Microbiologia do controle de qualidade da Divisão de Produção do
Instituto Butantan.
O laudo técnico notificou que as amostras apresentaram níveis inferiores ao
limite de detecção do ensaio de 0, 125 VE/mL, o que permitiu a sua utilização nos
diferentes protocolos experimentais.
3.7. Determinação da concentração de proteínas nas amostras
A concentração proteica das amostras de venenos, CTX, CA e CB foi
determinada utilizando-se o método de Bradford (1976). As amostras foram diluídas
45
em PBS e assim distribuídas em placas de 96 poços (Costar) em volume de 50 L.
A solução de soro albumina bovina (BSA) foi utilizada como curva padrão na
concentração de 500 g/mL diluída na razão 1:2 (50 L/poço). Após esses
procedimentos foram acrescentados 150 L/poço do reagente de Bradford
previamente diluído em água destilada (1:5).
A placa foi lida em espectrofotômetro no comprimento de onda de 595 nm e o
cálculo da concentração de proteínas foi realizado com o auxílio do programa
INSTAT. Como referência as densidades ópticas obtidas nas amostras foram
comparadas com a curva-padrão de BSA.
3.8. Diferenciação de DCs in vitro com GM-CSF na presença ou não de IL-4 a
partir de medula óssea de camundongos
Para a diferenciação de DCs in vitro foram seguidos os protocolos de cultura
celular descritos por Son e colaboradores (2002) e Chen e colaboradores (2013)
com algumas modificações. Grupos de camundongos foram eutanasiados em
câmara de CO2 e posteriormente, ambas as extremidades da medula óssea dos
animais foram cortadas e acondicionadas em placas de Petri contendo meio de
cultura RPMI1640 (Invitrogen).
Em seguida, com o auxílio de uma seringa e uma agulha de calibre 25
introduzda em uma das extremidades do fêmur, a medula óssea foi lavada com meio
RPMI1640. A suspensão celular obtida foi centrifugada por 10 minutos a 1.000 g por
4°C e ressuspensa em meio RPMI-1640 suplementado (RPMI-s) com 5% de SFB
inativado, 0,5% de 2-Mercaptoetanol, 1% de L- glutamina (200mM), vitamina
(100mM) e antibiótico (10mg/mL) (RPMI-S). A concentração e a viabilidade celular
foram determinadas em câmera de Neubauer utilizando Azul de Tripan 0,1%.
As células obtidas foram distribuídas em placas contendo 6 orifícios na
concentração de 10x106 céls/mL e incubadas somente com 10 ng/mL de GM-CSF
ou com GM-CSF (10 ng/mL) e IL-4 (5ng/mL).
No 4º dia de cultivo, o sobrenadante da cultura das células foi removido,
centrifugado novamente por 10 minutos a 1.000 g por 4°C e adicionado um novo
meio RPMI-S (contendo GM-CSF + IL-4 ou somente GM-CSF).
46
As culturas de células foram mantidas por mais 3 dias em estufa com 5% de
CO2/37oC. Após esse período, as células não aderentes foram coletadas e
novamente contadas em câmara de Neubauer para determinar sua concentração.
3.9. Fenotipagem das DCs imaturas por citometria de fluxo
A fenotipagem das DCs diferenciadas in vitro foi realizada por citometria de
fluxo. Para tanto, suspensões celulares foram incubadas com anticorpo anti-
FcγRII/III (1 µg/106 cels) por 20 min/4º C. Em seguida, as células foram
centrifugadas, ressuspensas em meio RPMI. Suspensões de 1x106 células foram
distribuídas em placas de fundo em U e incubadas com anticorpos anti-CD11c (2
μg), anti-CD83 (1 μg) anti-DC-SIGN (0,5 μg) e anti-TLR 1, 2 ou 4 (1μg) (BD
Biosciences) marcados com ficoeritrina (PE) por 30 min/4o C. Em seguida foi
acrescentado PBS contendo 1% de SFB em todos os poços e a placa foi novamente
submetida à centrifugação. As células foram ressuspensas com PBS + 0,1% de
paraformaldeído (Merck). Todas as amostras foram feitas em duplicata e analisadas
em citômetro de fluxo (104 eventos foram adquiridos por amostra em FACS Canto,
Becton Dickinson).
3.10. Ensaio de viabilidade celular por azul de tripan
A análise da viabilidade das DCs incubadas com as diferentes toxinas e/ou
LPS foi realizada segundo o método de exclusão de azul de tripan. Esse método
permite detectar células em necrose, cuja membrana, por apresentar danos, permite
a incorporação do corante no citoplasma, enquanto que as células viáveis ficam
transparentes devido à integridade da membrana celular (MCATEER; DAVIES,
1994).
DCs imaturas foram obtidas após 7 dias de cultura na presença de GM-CSF e
IL-4 e centrifugadas a 1500 g por 5 minutos a 4°C. Em seguida, as células foram
ressuspensas com meio RPMI-S e a concentração e viabilidade determinadas em
câmara de neubauer e azul de tripan 0,1%. Suspensões de 5 x 106 foram mantidas
em meio de cultura ou incubadas com LPS (0,5 μg/mL), CTX (20 μg/mL), CB (20
μg/mL), CA (20 μg/mL), CTX + LPS, CB + LPS ou CA + LPS por 18 h/37º C em
estufa de CO2 umidificada. Ao final dessa incubação, as células foram centrifugadas,
47
os sobrenadantes coletados e realizada a avaliação da viabilidade celular com o
auxílio do tripan 0,01% em câmara de neubauer. Os resultados foram expressos em
porcentagens das células vivas, calculadas a partir do número de células vivas e
mortas antes e após os estímulos.
3.11. Estimulação das DCs in vitro e análise da expressão de moléculas
envolvidas na apresentação antigênica por citometria de fluxo
3.11.1. DCs diferenciadas in vitro estimuladas com LPS, CTX, CA ou CB
Com o intuito de avaliar a ação da CTX bem como suas subunidades sobre a
funcionalidade das DCs, foram realizados vários protocolos experimentais assim
como descrito abaixo:
Para determinar a concentração de LPS capaz de induzir a maturação das
DCs in vitro, 5x106 células foram incubadas in vitro com diferentes
concentrações de LPS (0,5, 1, 2, 5 ou 10 µg/mL) por 18 h/37º C em estufa de
5% CO2 umidificada;
Células dendríticas imaturas foram estimuladas in vitro com CTX (10 ou 20
µg/mL); CA (20 µg/mL); CB (10 ou 20 µg/mL) ou LPS (0,5 µg/mL); LPS+CTX,
LPS+CA ou LPS+CB por 18 h/37º C em estufa de 5% de CO2 umidificada;
Suspensões de DCs (5X106) foram pré-incubadas com CTX (20 µg/mL) ou
CB (20 µg/mL) por 2 ou 3 horas. Em seguida, as células foram lavadas com
meio RPMI-S e posteriormente foi adicionado o LPS (0,5 µg/mL) e as culturas
mantidas por 18 h/37º C em estufa de 5% de CO2 umidificada;
DCs imaturas (5X106) também foram pré- incubadas com LPS (0,5 µg/mL) por
2 e 3h, lavadas com meio RPMI-S e posteriormente adicionada a CTX (20
µg/mL) ou CB (20 µg/mL) por 18 h/37º C em estufa de 5% de CO2
umidificada;
Em outro experimento, DCs foram incubadas ou não com antagonista do
receptor de peptídeo-formil (Boc-2-100 mM) por 15 min/37º C e após esse
48
período, as células foram lavadas com meio RPMI e então estimuladas com
CTX + LPS, CB + LPS (20 ou 0,5 µg/mL) ou somente com LPS por 18 h/37º C
em estufa de 5% de CO2 umidificada.
Em todos os experimentos, após o período de incubação das células com os
diferentes estímulos, as culturas foram centrifugadas, os sobrenadantes coletados e
as células utilizadas para análise da expressão das moléculas de MHC de classe II,
CD40, CD80 e CD86 por citometria de fluxo. Os sobrenadantes das culturas foram
utilizados para determinação da secreção das diferentes citocinas por ELISA.
3.11.2. Análise da expressão das moléculas de MHC de classe II e coestimuladoras
As culturas de DCs incubadas com os diferentes estímulos foram
centrifugadas, as células ressuspensas em 1mL de meio RPMI e incubadas com
anticorpo anti-receptor FcγRII/RIII por 15 min/4oC. Em seguida, as DCs foram
novamente centrifugadas por 5min a 4oC/1500 g. As células foram ressuspensas em
meio RPMI e distribuídas em placas de 96 orifícios na concentração de 1 x 106
células.
A expressão das moléculas envolvidas na apresentação antigênica nas DCs
foi analisada utilizando a incubação com anticorpos monoclonais marcados com PE
anti- MHC de classe II (0,5 μg/mL); anti-CD80 (0,5 μg/mL); anti-CD40 (0,5 μg/mL) e
anti-CD86 (1 μg/mL) de camundongo, por 30 min/4oC. Como controle negativo
utilizamos a incubação das células por 30 min/4º C com anticorpo controle isotípico
IgG1 conjugado a PE (0,25 μg/mL) e como calibrador do citômetro, as DCs foram
incubadas com anticorpo anti-CD11c-PE (2 µg/mL).
Nos ensaios de dupla marcação foi utilizado anticorpo anti- CD11c de
camundongo marcado com isotiocianato de fluoresceína- FITC (1 μg/mL) por 30
min/4º C. Após a marcação de superfície, as células foram adicionados 100 µL de
tampão de lavagem-Perme WashTMsolution 1x (BD Bioscience) em todos os poços,
e em seguida realizada centrifugação por 5 min a 4°C/500 g. O sobrenadante foi
descartadado e as células foram fixadas e permeabilizadas, adicionando-se 100μL/
poço de solução fixadora e permeabilizadora (Fixation and Permeabilization
Solution), e incubadas por 30 min/TA. As DCs foram lavadas novamente com o
tampão de lavagem (Derme Wash), centrifugadas e o sobrenadante foi removido.
49
Com o término da etapa de fixação, foi realizada a marcação intracitoplasmática com
anticorpos anti-IL10 e IL-12-PE (0,5 μg/mL) e incubadas por 30 min/4°C. Como
controle isotípico, as células foram incubadas com anticorpos IgG1 marcados com
FITC ou PE (0,5 e 0,25 µg/mL, respectivamente).
Após esse período, as amostras de células marcadas via superfície ou
intracelular foram adicionados 100 µL de PBS + 1% de SFB, centrifugadas por
5min/4oC/500 g e ressuspensas com PBS contendo 0,1% de paraformaldeído.
Como estratégias para a análise das populações celulares, utilizamos como
parâmetros iniciais a avaliação de tamanho das células (FSC) e a complexidade
interna ou granulosidade (SSC), excluindo células potencialmente mortas e debris
celulares que estão representadas na região inferior esquerda dos “dot plots”. Em
seguida, analisamos as populações positivamente marcadas com PE e
apresentamos os resultados em histogramas considerando a média da intensidade
de fluorescência (MIF). No caso das células duplamente marcadas, os resultados
foram expressos como a porcentagem de células positivamente marcadas para a IL-
10 ou IL-12- PE na população de células CD11c+ - FITC.
Todas as amostras de células foram feitas em duplicatas e analisadas em
citometria de fluxo (10.000 eventos foram adquiridos por amostra em FACS Canto,-
BD). Os dados foram analisados utilizando o programa FlowJo 7.5.
3.12. Produção de citocinas e eicosanoides secretados nas culturas de DCs
por ELISA
3.12.1. Determinação de IL-10 e IL- 12 nos sobrenadantes das culturas
As citocinas e mediadores lipídicos secretados nas culturas de DCs
estimuladas por 18 horas com os diferentes antígenos foram detectados nos
sobrenadantes utilizando Kits de ELISA (E-Bioscience).
As placas de ELISA foram sensibilizadas com anticorpos anti- IL-10 (1:1.000)
ou anti-IL-12 em tampão Coating Buffer (100µL/poço) e incubados por 18 h/4°C. Em
seguida, as placas foram lavadas com PBS+0,05% Tween 20 (PBS-T) e bloqueadas
com 200 µL/ poço com tampão Assay Diluent por 1 h/temperatura ambiente (TA).
Após esse período, as placas foram lavadas com PBS-T e posteriormente,
foram adicionados 50 µL/poço das amostras bem como das citocinas recombinantes
50
IL- 10 (4 ng/mL) e IL-12 (2 ng/mL) diluídas na razão 1:2 em Assay Diluent. Em
seguida, as placas foram incubadas por 2 h/TA. Outras lavagens foram feitas em
PBS-T e adicionados 100µL/poço de anticorpos de detecção anti-IL-10 diluídos na
razão 1:1000 e anti-IL-12 diluídos na razão 1:250 em Assay Diluent. As placas foram
incubadas por 1 h/TA, seguida de novas lavagens com PBS-T.
Posteriormente, foram acrescentados 100μL/poço de estreptoavidina (1:250)
diluída em tampão Assay Diluent, e a placa incubada por 30 min/TA. O conjugado foi
removido com lavagem e a solução tetrametilbenzidina (TMB) foi acrescentada para
ocorrer a revelação. A reação foi interrompida pela adição de 50 µL/poço de ácido
sulfúrico (H2SO4 2M). Os resultados foram obtidos pela leitura da densidade ótica
em leitor de Elisa utilizando o filtro de 450 nm. As concentrações de IL-10 e IL-12
nos sobrenadantes foram calculadas e a partir das curvas-padrões construídas com
as concentrações crescentes das citocinas recombinantes.
3.12.2. Determinação de TNFα, IL-1β e IL-6 nos sobrenadantes das culturas de DCs
A etapa de sensibilização das placas para dosagem das citocinas foi realizada
com a adição de 100μL/poço dos anticorpos anti-IL-1β (720 μg/ mL), IL-6 (360 μg/
mL) e TNFα (144 μg/ mL) diluídos em solução salina tamponada com fosfato (PBS).
A placa foi incubada 18h/TA e, em seguida lavada 3 vezes com PBS-T. A etapa de
bloqueio para a IL-1β ocorreu com a adição de 200 μL/poço do Reagent Diluent-
solução PBS contendo Tris (20 mM) 0,1% BSA, 0,05% Tween 20 e NaCl (150 mM)
pH 7,4. Para a IL-6 e TNFα a solução bloqueio utilizada foi PBS + 1% BSA. As
placas foram incubadas por 1 h/TA seguida de novo ciclo de lavagem (3x).
Posteriormente, foram adicionados 50 μL/poço das citocinas recombinantes
IL-1β e IL-6 (1 ng/mL) e TNFα (2 ng/mL) em seus respectivos tampões, e realizada
uma nova incubação de 2h/TA. Ao final, as placas foram lavadas com PBS-T e
adicionados 100μL/poço dos anticorpos de detecção anti- IL-1β (108 μg/ mL), anti-
IL-6 e anti- TNFα (36 μg/ mL) seguida de incubação por 2 h/TA.
Em seguida, foram realizadas 3 lavagens, e adicionado 100μL/poço de
estreptoavidina-peroxidase diluída em tampão (1:200). As placas foram incubadas
por 20 min/TA e um novo ciclo de lavagem foi realizado. A revelação foi realizada
pela adição de 100μL/poço da solução A (H2O2) e solução B (TMB) na razão 1:1 e a
mesma reação foi bloqueada com ácido sulfurico 0,2M para posterior leitura em
51
leitor de Elisa a 450 nm. A concentração das citocinas foi determinada a partir de
curvas-padrões das citocinas recombinantes de acordo com as orientações do
fabricante (R&D Systems).
3.12.3. Extração e quantificação de eicosanoides
A produção de PGE2 e LXA4 foi determinada nos sobrenadantes das culturas
de DCs in vitro. Para tanto, os eicosanoides presentes nos sobrenadantes foram
extraídos utilizando uma coluna C18 (Sep-Pak light coluna Waters Corporation, EUA).
Inicialmente, a coluna foi lavada com 10 mL etanol absoluto (P.A.) seguida de
aplicação de água ultrapura (20 mL).
Os sobrenadantes isentos de células foram acidificados com HCl 0,1 N até pH
3,5 e aplicados na coluna C18. Em seguida, foram aplicados 10 mL de água
ultrapura e 1 mL de etanol (35%) para remover as impurezas e substâncias que não
apresentaram afinidade com a coluna. A extração dos eicosanoides foi realizada
pela aplicação de 1 mL de etanol absoluto na coluna. As amostras foram coletadas
através do sistema MANIFOLD e secas à vácuo em banho de nitrogênio sob uma
corrente de azoto. Posteriormente, essas amostras foram ressuspensas com 250 µL
de reagente diluente específico para cada kit de ELISA.
As concentrações de PGE2 e LXA4 foram determinadas por ELISA do tipo
competitivo (R&D Systems e Neogen, respectivamente). Para isso, em placas de 96
poços pré-sensibilizada com anticorpos IgG anti-PGE2 ou anti-LXA4. Em seguida,
foram adicionadas as amostras ou os padrões contendo PGE2 ou LXA4
(50 mL/poço) e incubadas por 1 h/TA. Após o período de incubação, as placas
foram lavadas com o tampão de lavagem (200L/poço) adequado para cada kit de
acordo com as especificações do fabricante.
Posteriormente, foi acrescentado o anticorpo primário anti- PGE2
(50 mL/poço), seguido do conjugado de PGE2-estreptoavidina-peroxidase de igual
volume exceto em uma fileira (branco da reação). No caso da LXA4 foi adicionado
50 L/poço do conjugado de LXA4-peroxidase de acordo com as instruções do
fabricante, e ambas as placas foram incubadas durante 2h/TA.
Em seguida, as placas foram lavadas 4 vezes com o tampão de lavagem
específico de cada Kit de ELISA (300L/poço). Posteriormente, foram adicionados
150L/poço do substrato contendo a mistura dos reagentes A e B (vol/vol),
52
fornecidos em ambos os Kits, e as placas foram incubadas por 30min./TA. Para
interromper a reação foi adicionada a solução stop (50L/poço) proveniente dos Kits
e as placas foram lidas em leitor de ELISA a 450 nm.
O cálculo da concentração de PGE2 e LXA4 presentes nos sobrenadantes das
DCs foi realizado a partir das curvas-padrões desses eicosanoides (1.250 a 19,5
pg/mL e 2.000 a 20 pg/mL, respectivamente) através do programa Bio Instat.
3.13. Análise da expressão gênica de IL-10 e TGF- β em amostras de células
por PCR em tempo real (PCR- RT)
As PCRs em tempo real foram realizadas em termociclador da marca BioEr
Line Gene K. Para tanto, pares de primers específicos para os genes da lL-10 e
TGF-β foram desenhados e sintetizados especificamente para a reação de PCR-
RT.
3.13.1. Extração de RNA total
Culturas de DCs (5x106) foram estimuladas com os diferentes antígenos e
LPS (descrito no item 3.11.1) e após 18 h/37° C foram submetidas a centrifugação
por 5 min/1500 RPM/4ºC. Em seguida, as células foram ressuspensas em 1,0 mL do
reagente Trizol (Invitrogen), transferidas para um eppendorf livre de RNAse e
armazenadas a -20˚C até seu uso.
Para a realização da extração de RNA total, foram adicionados 200 µL de
clorofórmio para cada 1,0 mL de reagente Trizol contendo as células, seguida de
agitação por 15 segundos e mantidas por 10 min/TA. Posteriormente, as amostras
foram centrifugadas por 10 min/12.000 g e o sobrenadante resultante (fase aquosa)
foi transferido para um novo eppendorf, no qual foram acrescentados 500 µL de
isopropanol. As amostras foram agitadas por 15 segundos, mantidas por 10 min/TA,
centrifugadas por 10 min/12.000 g e em seguida o sobrenadante foi descartado.
O precipitado (RNA) foi lavado com 1,0 mL de etanol 75%, centrifugado
novamente por 5 min/12.000 g e o sobrenadante foi removido. Os tubo contendo os
precipitados (amostras) foram mantidos abertos em fluxo laminar por
aproximadamente 15 minutos para secagem e, posteriormente, os RNAs foram
53
ressuspensos em 30 µL de água livre de RNAse (Promega). A concentração de RNA
foi quantificada no NanoDrop seguindo o procedimento descrito por SAMBROOK e
colaboradores (1989), onde a absorbância em 260nm = 1, significa uma solução
contendo 40 µg de RNA. A pureza do RNA foi determinada através da razão entre
as absorbâncias obtidas em 260 e 280 nm (razão entre 260/280 maior que 1,7).
3.13.2. Reação de Transcrição Reversa (RT)
O RNA mensageiro foi convertido em DNA complementar (cDNA) utilizando o
kit Superscript III Reverse Transcriptase (Invitrogen) de acordo com as
especificações do fabricante. Para cada reação foi feita uma mistura dos seguintes
reagentes: 2 g de RNA, 1L de oligo (dT)20 50M, 1L de dNTP Mix (10mM) e
completado o volume final para 13L com água livre de RNAse.
Esta mistura foi aquecida por 5 min/65°C e após esse tempo resfriada em
banho de gelo por mais 5 min. Posteriormente, ao conteúdo do tubo foram
acrescentados os seguintes componentes: 4 μL de tampão da reação [5X], 1μL de
RiboLock RNase inhibitor [20U/μL], 2μL de dNTP mix [10mM], 2μL de Transcriptase
[20u/μL] para o volume total de 20 μL por amostra. A mistura foi incubada por 50°C
durante 60 minutos e depois a 70°C por 15 minutos para inativar a reação. Após a
reação de transcrição reversa, o cDNA obtido foi estocado em freezer -80ºC.
3.13.3. PCR em tempo real em sistema Syber Green
Para o PCR em tempo real pelo sistema Syber Green, o RNA foi amplificado
usando um kit “qPCR – Sybr Green Rox Plus – Invitrogen) seguindo as
recomendações do fabricante. Dessa maneira foi avaliada a expressão RNAm de IL-
10 e TGF-β comparando a amplificação com o gene constitutivo β-actina, pois já
mostrou-se um eficiente “housekeeping” gene.
Para tanto, as reações foram realizadas em volume total de 12 µL contendo:
6,5µL de solução Syber Green Super Mix combinado com 1µL do primer sense
(5pM), 1µL primer anti-sense (5pM), 0,25µL de ROX Reference Dye; 2,25 µL água
livre de RNase e 1µL de cDNA (500ng). As condições de corrida foram: 50ºC por 15
minutos (temperatura de ativação da enzima TaqStart- DNA Polimerase), 95º C por
15 segundos (temperatura de desnaturação), 58º C por 30 segundos (temperatura
54
de anelamento), 72º C por 30 segundos (temperatura de extensão), seguida por um
ciclo para detecção da Curva de Melting de cada produto amplificado, de 65º C a 95º
C diminuindo 0,5º C a cada 20 segundos.
A técnica de PCR- RT possibilita a quantificação do produto durante a fase
exponencial da reação. O ponto que detecta o ciclo na qual a reação atinge o limiar
da fase exponencial é denominado Cycle Threshold (Ct). Este ponto permite a
quantificação exata e reprodutível baseada na fluorescência. Para quantificar os
resultados obtidos por PCR em tempo real, 2 métodos diferentes têm sido descrito
na literatura: o método da curva padrão e o método de comparação do Ct pela
equação: 2 -Ct , onde -Ct = Ct (amostra) - Ct (calibrador ou controle), e Ct é o
Ct do gene alvo subtraído do Ct do gene constitutivo (LIVAK et al., 2001) nas
mesmas condições experimentais.
A quantificação relativa da expressão do gene foi realizada através da
comparação da amplificação com um controle endógeno (β-actina). A partir dos
resultados de amplificação deste gene, foi realizada a normalização para minimizar
os erros nas variações da quantidade de RNA e eficiência da transcrição reversa
(GIULIETTI et al., 2001). Os resultados foram expressos em “Expressão Relativa de
mRNA”, que significa o número de vezes a mais que um determinado gene foi
expresso em relação às respectivas amostras controles.
3.14. Ensaio de reação mista leucocitária (MLR)
3.14.1. Geração de DCs obtidas a partir de medula óssea de camundongos BALB/c
e estimulação com diferentes antígenos na presença ou não de LPS
Células dendríticas foram diferenciadas in vitro com GM-CSF + IL-4 durante 7
dias. Após esse período, as células (0,6x105) foram coletadas e incubadas com LPS
(0,5 μg/mL), CTX (20 μg/mL), CA (20 μg/mL), CB (20 μg/mL), CTX + LPS, CA +
LPS, CB + LPS por 18 h/37º C em estufa de 5% de CO2 umifidicada. Ao final, as
DCs foram centrifugadas por 5 min/4oC/1200 g, o sobrenadante da cultura celular foi
removido, acrescentado um novo meio RPMI-S e mantidas em estufa de CO2 até o
momento de uso.
55
3.14.2. Obtenção de linfócitos T a partir de órgãos linfoides de camundongos
C57BL/6
Para obtenção de células T, camundongos da linhagem C57BL/6 foram
eutanasiados e os linfonodos periaórticos e inguinais retirados de maneira asséptica
dentro do fluxo laminar e acondicionados em placa de Petri contendo meio RPMI
não suplementado. Com o auxílio de homogeneizador estéril os linfonodos foram
macerados em meio RPMI e transferidos para um tubo Falcon de 50 mL. Em
seguida, o número e viabilidade das células foram determinados em câmara de
neubauer utilizando azul de tripan 0,01%. Posteriormente, as células foram
submetidas à centrifugação por 5min/10°C/1200 g, o sobrenadante foi descartado e
as células (16,2 x 106) foram ressuspensas em PBS contendo 0,5% BSA e EDTA
(2mM).
As células TCD3+ presentes na suspensão foram purificadas utilizando o
sistema MidiMACS segundo o protocolo de Sudowe e colaboradores (2000). No tubo
contendo as células, foi acrescentado o anticorpo anti-CD3+ na concentração de 2
µg/106 células e realizada incubação por 30 min/4o C. Em seguida, foram
acrescentados 5 mL de PBS contendo BSA e EDTA e realizada nova centrifugação
por 5 min/10°C/ 1000 g. O sobrenadante foi descartado, as células ressuspensas em
PBS contendo BSA e EDTA e adicionado o conjugado estreptoavidina-microesferas
magnéticas (20µL/107 células) seguida de incubação por 30 min/4º C. Ao final, foram
adicionados 2 mL de PBS + EDTA + BSA e a suspensão centrifugada assim como
descrito anteriormente.
Após remoção do sobrenadante resultante, as células foram ressuspensas
em 800 µL de tampão e aplicadas na coluna MidiMACS (Miltenyi Biotec) acoplada
em campo magnético previamente equilibrada com 8 mL de PBS contendo 0,5%
BSA e 2mM EDTA. Após a aplicação da suspensão celular foram realizadas 5
lavagens com 5 mL do tampão permitindo com que as células não ligadas à coluna
fossem eluídas da coluna. Posteriormente, a coluna foi removida do suporte
magnético e os linfócitos T CD3+ foram eluídos com 5 mL de tampão e coletados em
um tubo de 15 mL.
56
3.14.3. Co-cultura de células TCD3+ com DCs e avaliação da proliferação celular
As células CD3+ foram distribuídas (3x105) em placas de 96 orificios na
presença das DCs (0,6x105) previamente estimuladas com os diferentes antígenos.
As co-culturas foram feitas em quadruplicata e mantidas por 72 ou 96 horas em
estufa de 5% CO2 umidificada. A resposta proliferativa dos linfócitos foi avaliada
utilizando-se o Kit Cell proliferation ELISA Biotrak System version 2 (Armersham GE
Gealthcare).
Para tanto, nas co-culturas de DCs com linfócitos CD3+ foram adicionados 10
µL de BrdU/poço diluído na razão 1:10 em meio RPMI- S. Após 72 ou 96 horas, as
co- culturas foram centrifugadas por 10 min/10°C/ 1000 g. O meio foi removido e
posteriormente foram acrescentados 200 µL de solução fixadora seguida de
incubação por 30 min/TA. Após o período, o meio foi removido e acrescentada a
solução B-bloqueio (200 µL/poço) diluída 1/10 em solução Tris (50mM) contendo
150 mM de NaCL com incubação de 30 min/TA. Novamente o sobrenadante foi
descartado e as células foram incubadas com 100 µL/poço de anticorpo anti-BrdU-
peroxidase (1:100) diluido em solução D (antibody dilution solution) por 90 min/TA. O
conjugado foi removido e as células foram lavadas com Wash buffer e incubadas por
15 min/TA por 3 vezes.
A revelação foi realizada com a adição do substrato TMB (100 µL/poço) e a
reação foi interrompida com 25 µL/poço de ácido sulfúrico 0,2M. As placas foram
lidas em leitor de ELISA utilizando o filtro de 450 nm. Os resultados foram expressos
como a média de densidade óptica obtida das amostras em quadruplicatas ± desvio
padrão. Quanto as análises estatísticas, os resultados obtidos foram submetidos a
análise de variância seguida de comparações múltiplas entre os grupos pelo método
de Tukey.
3.15. Análise dos resultados
Os resultados de citometria de fluxo foram apresentados como a média da
intensidade de fluorescência das amostras em duplicata ± desvio padrão ou ainda,
em porcentagem de células positivamente marcadas. A produção das citocinas foi
expressa como a média ± desvio padrão das concentrações obtidas das amostras
em duplicata. A análise estatística adotada foi o método de Tukey, utilizando a
57
análise de variância (ANOVA) e de comparação múltipla entre os grupos
experimentais no software GraphPad Prisma 5. As diferenças com o p < 0,05 foram
consideradas estatisticamente significantes.
58
4. RESULTADOS
4.1. Purificação da CTX, suas subunidades (CA e CB) e análise por eletroforese
em gel de poliacrilamida
Com o objetivo de obter a CTX, amostras do veneno total da Crotalus
durissus terrificus foram submetidas à cromatografia de troca aniônica em coluna
MONO-Q. Em seguida, parte da CTX obtida foi submetida à cromatografia de troca
catiônica em coluna MONO-S para a obtenção da crotapotina e da fosfolipase A2
(CA e CB), de acordo com a metodologia descrita em material e métodos. Após as
purificações, todos os componentes obtidos do fracionamento foram analisados
quanto ao seu perfil eletroforético.
A figura 4 representa o perfil cromatográfico da amostra de C.d.terrificus,
onde podemos verificar a presença de vários picos. Em destaque os picos 2, 3, 4
foram eluídos na faixa de gradiente correspondente à CTX, conforme descrito na
literatura (FRAENKEL-CONRAT et al., 1971; SLOTTA; FRAENKEL, 1980). Após a
obtenção desses picos, estes foram submetidos à eletroforese para análise da
pureza e identificação da massa molecular da toxina. Várias cromatografias foram
realizadas para a obtenção de material suficiente para utilização nos experimentos
propostos.
59
Figura 4- Perfil cromatográfico do veneno de C.d.terrificus submetido à cromatografia de troca aniônica em coluna MONO-Q. O veneno total de C. d. terrificus (15mg) foi submetido à cromatografia de troca aniônica em coluna MONO- Q HR 5/5 por sistema FPLC. O gráfico representa a eluição dos componentes do veneno quando submetidos a um gradiente linear de NaCl (0 a 1M) em tampão Tris- HCL 50 mM em fluxo de 1,0 ml/minuto. As frações obtidas foram monitoradas em espectrofotômetro a 280 nm.
As subunidades CA e CB foram obtidas a partir da CTX submetida à
cromatografia de troca catiônica em coluna MONO-S, utilizando o procedimento
adotado por Faure e Bon (1988) e Faure e colaboradores (1991) com algumas
modificações. Como pode ser observado na figura 5, as subunidades CA e CB foram
eluídas em picos distintos, como previamente descrito por Rangel-Santos e
colaboradores (2004).
Assim como para a CTX, várias cromatografias foram realizadas, os picos
dialisadas contra PBS, analisados em eletroforese e em seguida estocados para
utilização nos experimentos.
Mono Q CTX002:10_UV Mono Q CTX002:10_Conc Mono Q CTX002:10_Fractions Mono Q CTX002:10_Inject Mono Q CTX002:10_Logbook
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
mAU
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819 2123252729313335373941434547495153555759616365676971737577798183858789919395 97
Ab
sorb
ân
cia (
mA
U)
1
4
3
2
60
Figura 5- Perfil cromatográfico da CTX submetida à cromatografia de troca catiônica em coluna MONO-S. Amostras de CTX diluídas em solução Tris- HCL pH 7,2 contendo uréia 6 M foram submetidas à cromatografia de troca catiônica em coluna MONO-S HR 5/5 por sistema FPLC. As subunidades CA e CB foram eluidas em gradiente linear de 2,- 6M de uréia em solução de NaCl 2M tamponada com Tris/ HCL 50mM, em fluxo de 1,0 mL/minuto. As frações obtidas foram monitoradas em espectrofotômetro a 280 nm.
As amostras contendo CTX e CB foram submetidas à eletroforese em gel de
poliacrilamida 12,5% para análise da pureza e determinação da massa molecular,
enquanto que a CA foi analisada em gel de 16% de poliacrilamida na presença de
tricina.
A figura 6A mostra o perfil de migração do veneno total de C.d.terrificus, dos
três picos correspondentes a CTX (picos 2, 3 e 4) e a subunidade CB em condições
desnaturantes, onde pudemos observar a presença de várias bandas com massas
moleculares distintas na amostra do veneno total (posição 1) correspondentes aos
seus diferentes componentes. Além disso, verificamos uma única banda com massa
molecular entre 15 e 20 kDa nos picos correpondentes à CTX e CB. No gel de tricina
(figura 6-B), observamos uma banda com massa molecular de aproximadamente 10
kDa correspondente à subunidade CA.
Os resultados obtidos permitiram evidenciar a eficiência na metodologia de
purificação e integridade das frações. A concentração das proteínas foi determinada
CA e CB (CTX ultrapura) 30 01 13 (1mg)001:10_UV CA e CB (CTX ultrapura) 30 01 13 (1mg)001:10_Conc CA e CB (CTX ultrapura) 30 01 13 (1mg)001:10_Fractions CA e CB (CTX ultrapura) 30 01 13 (1mg)001:10_Inject CA e CB (CTX ultrapura) 30 01 13 (1mg)001:10_Logbook
0
200
400
600
800
mAU
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Waste
85 mAu
930 mAu
Abso
rbâ
ncia
(m
AU)
CA
CB
61
de acordo com a metodologia adotada por Bradford (1976) e posteriormente as
proteínas foram submetidas à coluna de polimixina para eliminação de endotoxinas.
Figura 6- Perfil proteico do veneno de C.d. terrificus e dos picos obtidos em cromatografia de troca aniônica e catiônica em gel de poliacrilamida 12,5% e gel de 16% de poliacrilamida na presença de tricina sob condições redutoras. A-perfil eletroforético do veneno total (1,4 mg/mL) e as amostras (pico 1 da CTX- 0,685 mg/mL; pico 2 da CTX- 0,932 mg/mL; pico 3 da CTX- 0,874 mg/mL e CB- 0,53 mg/mL) em gel poliacrilamida 12,5% em condições redutoras. As amostras foram diluidas em
tampão Tris-HCl 0,625 mM pH 6,8; 10% glicerol (v/v); 5% -mercaptoetanol (v/v); 2 % de SDS e 0,001 % de azul de bromofenol na proporção de 1:5 e aquecidas por 5min/ 95°C. Em seguida, foram aplicadas no gel e submetidas a uma corrente elétrica de 110 V e 55 mA por 2 horas. P - Padrão de massa Molecular ((Trail Mix
tm- Novagen 10-255 kDa); 1-
veneno total de C.d. terrificus; 2-4 picos 2, 3 e 4 da CTX, respectivamente; 5- subunidade CB. B- perfil eletroforético da subunidade CA (0,32 mg/mL) em gel de 16% poliacrilamida na presença de tricina sob condições redutoras. Após a aplicação das amostras a corrida eletroforética foi realizada sob voltagem constante de 30 V a 40 mA por 1h seguida de corrente de 90 V com por durante 5 horas. 1- Padrão de massa molecular Fast ruller (Thermo Scientific); Ambos os geis foram corados com solução de 0,2 % (m/v) de Coomassie Blue R-250 (Bio-Rad).
4.2. Caracterização das DCs diferenciadas com GM-CSF ou com GM-CSF/ IL-4
in vitro
4.2.1. Fenótipo das DCs diferenciadas in vitro na presença somente de GM-CSF ou
com GM-CSF/ IL-4
P
A BkDa
200
120
85
70
50
40
30
25
20
15
10
P CA
kDa
255
150
100
75
50
35
20
15
10
1 2 543
62
Para a realização dos experimentos propostos, inicialmente analisamos a
melhor metodologia de diferenciação das DCs in vitro. Para tanto, utilizamos dois
protocolos de diferenciação das DCs a partir da medula óssea de camundongos
sendo um deles somente com GM-CSF e o outro com GM-CSF e IL-4.
A análise das células por citometria de fluxo permitiu observar uma população
bem definida quanto ao tamanho/granulosidade em ambos os protocolos de
diferenciação in vitro (Figura 7A). No entanto, verificamos que a cultura de células de
medula óssea incubada com GM-CSF e IL-4 resultou em 86,17% de células que
expressam CD11c+, enquanto que a metodologia de diferenciação somente com
GM- CSF promoveu a diferenciação de 35,3 % de células DCs, como mostra a figura
7B.
Figura 7- Análises de culturas de células de medula óssea de camundongos BALB/c incubadas
por 7 dias com GM-CSF ou GM-CSF e IL-4, por citometria de fluxo. A-Análise de tamanho e granulosidade (dot plots) das culturas de células diferenciadas in vitro com GM-CSF ou GM-CSF por 7 dias em estufa de 5% de CO2 umidificada. B-Histogramas das células diferenciadas in vitro e incubadas com anticorpo anti-CD11c-PE (linha azul) ou controle isotípico IgG1-PE (linha preta). Os histogramas referem-se às análises das células selecionadas no gate nos gráficos de dot plots Os resultados
A
GM-CSF + IL4 GM-CSF
DCs
86,17
DCs
35,31
A
B
GM-CSF + IL4 GM-CSF
DCs
86,17
DCs
35,31
A
B
GM-CSF + IL-4 GM-CSF
B
A
GM-CSF + IL4 GM-CSF
DCs
86,17
DCs
35,31
A
B
GM-CSF + IL4 GM-CSF
DCs
86,17
DCs
35,31
A
B
GM-CSF + IL-4 GM-CSF
B
A
B
63
obtidos foram expressos em porcentagem de células positivamente marcadas a paritr do obtido em células incubadas com anticorpo controle isotípico-PE.
Além da determinação da porcentagem de células CD11c+ geradas na
presença de GM-CSF ou GM-CSF e IL-4, analisamos nesta população alguns
receptores de superfície envolvidos no reconhecimento de patógenos. Para tanto, as
culturas de células foram incubadas com anticorpos anti-TLR 1, 2, 4, DC- SIGN e
MR.
Os resultados obtidos mostram que ambas as metodologias de diferenciação
de DCs geram células que expressam os diferentes receptores estudados, como
mostra a figura 8. No entanto, a expressão desses receptores é maior nas DCs
diferenciadas in vitro com GM-CSF e IL-4.
Figura 8- Fenótipo de DCs imaturas diferenciadas in vitro com GM-CSF na presença ou não de IL-
4. Células de medula óssea de camundongos BALB/c foram incubadas com GM- CSF + IL-4 (10 ng/mL e 5 ng/mL, respectivamente) ou somente com GM-CSF por 7 dias em estufa de 5% de CO2 umidificada. As suspensões celulares (1x10
6) foram incubadas com
anticorpos anti-TLR1, anti-TLR2, anti-TLR4, anti-DC-SIGN, anti-MR marcados com PE ou controle isotípico-PE e analisadas em citômetro de fluxo. Os resultados obtidos foram expressos como média da intensidade de fluorescência (MIF) das amostras em duplicata ± DP. Resultados representativos de 2 experimentos. *p < 0,05- células marcadas com anti-TLR1, TLR2, TLR4, DC- SIGN e MR em relação ao controle isotípico.
4.2.2. Análise da maturação das DCs diferenciadas in vitro com GM-CSF ou GM-
CSF+IL-4
Além da caracterização fenotípica dessas DCs imaturas diferenciadas com
GM-CSF ou GM-CSF+IL-4, tivemos o objetivo de estudar a expressão das
GM-CSF + IL-4
Contr
ole is
otípic
o
TLR1
TLR2
TLR4
DC-S
IGN
MR
0
200
400
600
800*
*
*
**
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e d
e
Flu
ore
scên
cia
(M
IF)
GM-CSF
Contr
ole is
otípic
o
TLR1
TLR2
TLR4
DC-S
IGN
MR
0
200
400
600
800
*
*
*
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e d
e
Flu
ore
scên
cia
(M
IF)
64
moléculas coestimuladoras e de MHC de classe II antes e após a incubação com um
ligante de TLR4, como o LPS por 18 horas.
A figura 9A representa os histogramas obtidos com as células mantidas em
meio de cultura (DCs imaturas) ou células incubadas por 18 horas com LPS seguida
de incubação com os anticorpos monoclonais anti- CD40, CD80, CD86 e MHC-II. A
figura 9B representa os resultados comparativos das médias de intensidade de
fluorescência das células obtidas nas duas metodologias realizadas.
Nesta figura podemos observar que a incubação das células com LPS
resultou na maturação das DCs, visto que induziu aumento da expressão de todas
as moléculas avaliadas tanto nas células diferencidas in vitro com GM-CSF+IL-4
como somente com GM-CSF. Entretanto, comparando os resultados obtidos,
pudemos verificar que esse aumento da expressão das moléculas envolvidas na
apresentação antigênica foi maior nas DCs diferenciadas com GM-CSF e IL-4
(Figura 9A e B).
GM- CSF + IL-4
G M- CSF
A
Controle
isotípico
CD40
CD40
CD80
CD80
CD86
CD86
MHC-II
MHC-IIGM- CSF + IL-4
G M- CSF
A
65
Figura 9- Análise da expressão de moléculas coestimuladoras e de MHC de classe II em DCs
diferenciadas com GM-CSF na presença ou não de IL-4. Células dendriticas imaturas foram diferenciadas com GM-CSF + IL- 4 ou GM-CSF. Após 7 dias, DCs foram estimuladas com LPS (2 μg/mL) por 18 horas. Em seguida, as células (1x10
6) foram marcadas com anticorpos monoclonais anti-CD40, CD80, CD86 e MHC-II-
PE e analisadas por citometria de fluxo. Os resultados obtidos foram expressos em (A) histogramas (a linha azul representa as células incubadas com LPS e a linha preta as células mantidas em meio de cultura ou controle isotípico; (B) média da intensidade de fluorescência- (MIF) das amostras em duplicata ± DP. Controle isotípico-PE MIF = 80,5. Resultados representativos de 2 experimentos. * p < 0,05- grupo LPS (GM-CSF + IL-4) em relação ao grupo meio. # p < 0,05- grupo LPS (GM-CSF) em relação ao grupo meio.
4.2.3. Avaliação da expressão de moléculas coestimuladoras e MHC-II em DCs e
secreção de citocinas em resposta à estimulação com diferentes
concentrações de LPS
Considerando os resultados acima obtidos, todos os demais experimentos
foram realizados em DCs diferenciadas in vitro com GM-CSF+IL-4. Como forma
ainda, de padronizar os experimentos de indução de maturação das DCs, foi
CD40
Mei
oLP
SM
eio
LPS
0
500
1000
1500
2000*
#
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e d
e
Flu
ore
scên
cia
(M
IF)
CD80
Mei
oLP
SM
eio
LPS
0
500
1000
1500 *
#
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e d
e
Flu
ore
scên
cia
(M
IF)
CD86
Mei
oLP
SM
eio
LPS
0
500
1000
1500
*
#
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e d
e
Flu
ore
scên
cia
(M
IF)
MHC-II
Mei
oLP
SM
eio
LPS
0
1000
2000
3000
*
#
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e d
e
Flu
ore
scên
cia
(M
IF)
GM-CSF + IL-4 GM-CSFB
66
avaliada a capacidade de diferentes concentrações de LPS de induzir aumento da
expressão das moléculas coestimuladoras e MHC-II em DCs imaturas e secreção de
citocinas. Para tanto, as DCs foram incubadas por 18 horas com LPS (0,5; 1; 2; 5 ou
10 µg/mL) por 18 horas. Em seguida as células foram incubadas com anticorpos
anti-CD40, CD80, CD86 e MHC-II e analisadas por citometria de fluxo. Os
sobrenadantes destas culturas foram utilizados para determinação da secreção das
diferentes citocinas por ELISA.
Podemos verificar na figura 10 que as diferentes concentrações de LPS
induziram aumento da expressão das moléculas de MHC de classe II, CD40, CD80
e CD86 em relação ao obtido com as células mantidas em meio de cultura, sendo
este efeito maior na concentração de 0,5, 1 e 2 µg/mL e menor com a concentração
de 10 µg/mL de LPS em relação as células mantidas em meio de cultura.
Figura 10- Análise da expressão de moléculas coestimuladoras e MHC-II em DCs diferenciadas in vitro e incubadas com LPS em diferentes concentrações. Células dendríticas imaturas foram estimuladas com LPS (0,5, 1, 2, 5 e 10 μg/mL) por 18 horas e posteriormente as células (1x10
6) foram marcadas com anticorpos monoclonais
anti-CD40-PE, CD80-PE, CD86-PE e MHC-II-PE e analisadas em citometria de fluxo. Os resultados obtidos foram expressos como média da intensidade de fluorescência das células (MIF) das amostras em duplicata ± DP. Resultados representativos de 2 experimentos. * p < 0,05- grupos LPS comparado ao grupo de células mantidas em meio de cultura.
CD40
0
500
1000
1500
* *
**
*
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e d
e
Flu
ore
scên
cia
(M
IF)
CD80
0
500
1000
1500
2000
**
**
*
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e d
e
Flu
ore
scên
cia
(M
IF)
CD86
0
200
400
600
800
1000
****
*
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e d
e
Flu
ore
scên
cia
(M
IF)
MHC-II
0
1000
2000
3000
****
*
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e d
e
Flu
ore
scên
cia
(M
IF)
Meio LPS (0.5g) LPS (1g) LPS (5g)LPS (2g) LPS (10g)
67
A figura 11 representa os resultados de detecção de citocinas presente nos
sobrenadantes de DCs estimuladas com LPS. É possível verificar aumento da
produção de todas as citocinas avaliadas quando as células foram estimuladas com
as diferentes concentrações de LPS. Assim como verificado nos resultados de
citometria de fluxo, a secreção das citocinas foi menor nas culturas de células
estimuladas com 10 µg/mL de LPS quando comparado ao obtido com outras
concentrações de LPS. Em virtude deste resultado, os experimentos seguintes
foram realizados com LPS na concentração de 0,5 μg/mL.
Figura 11- Produção de citocinas pró e anti- inflamatórias presentes em sobrenadantes das culturas de DCs diferenciadas e estimuladas in vitro com LPS Células obtidas da medula óssea de camundongos BALB/c diferenciadas in vitro com GM-CSF e IL-4 durante sete dias foram estimuladas com LPS (0,5, 1, 2, 5 ou 10 μg/ mL). Após 18 horas, os sobrenadantes das culturas de células foram coletados e a concentração de todas essas citocinas foi determinada por ELISA a partir da curva-padrão de cada citocina recombinante. Todas as amostras foram feitas em duplicatas e
IL-10
Mei
o g)
LPS (0
.5g)
LPS (1
g)
LPS (2
g)
LPS (5
g)
LPS (1
0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*
*
***
ng
/mL
IL-12
Meio g)
LPS (0
.5g)
LPS (1
g)
LPS (2
g)
LPS (5
g)
LPS (1
0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
****
*
ng
/mL
IL-6
Meio g)
LPS (0
.5g)
LPS (1
g)
LPS (2
g)
LPS (5
g)
LPS (1
0
0
500
1000
1500
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*****
ng
/mL
TNF-
Mei
o g)
LPS (0
.5g)
LPS (1
g)
LPS (2
g)
LPS (5
g)
LPS (1
0
0.0
0.5
1.0
1.5
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*
****
ng
/mL
IL-1
Mei
o
LPS (0
.5m
g)
LPS (1
mg)
LPS (2
mg)
LPS (5
mg)
LPS (1
0mg)
0
500
1000
1500
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*
****
ng
/mL
68
os resultados foram expressos com a média da concentração de cada citocina ± DP. Resultados representativos de 2 experimentos.A linha pontilhada representa o limite de detecção de cada citocina considerando a curva-padrão.
* p < 0,05- grupos LPS comparado ao grupo de células mantidas em meio de cultura
4.3. Avaliação da viabilidade celular das DCs incubadas com CTX, CA, CB
e/ou LPS
Considerando os resultados obtidos e para dar continuidade ao objetivo do
trabalho, avaliamos o efeito da CTX, CA, CB sobre a viabilidade das DCs in vitro.
Neste ensaio utilizamos a concentração de CTX previamente estabelecida em outros
protocolos desenvolvidos no laboratório e a mesma concentração foi utilizada de CA
e CB. Para tanto, DCs diferenciadas in vitro foram coletadas e determinada a
viabilidade celular em câmara de Neubauer utilizando solução de Azul de Tripan. Em
seguida, as DCs foram mantidas em meio de cultura ou incubadas com LPS (0,5
µg/mL), CTX (20 µg/mL), CB (20 µg/mL), CA (20 µg/mL), CTX + LPS, CB + LPS e
CA + LPS por 18h em estufa a 37ºC. Após esse período, amostras dessas culturas
foram coletadas e analisadas quanto sua viabilidade celular utilizando Azul de Tripan
em câmara de Neubauer.
A figura 12 representa a viabilidade das culturas de DCs incubadas com os
diferentes componentes. Os resultados mostram que não houve redução na
viabilidade das culturas de DCs incubadas com CTX, CA, CB e/ou LPS quando
comparada à obtida na cultura mantida em meio RPMI-S.
69
Figura 12- Efeito da CTX, CA, CB e/ou LPS sobre a viabilidade de DCs in vitro.
DCs diferenciadas in vitro com GM-CSF e IL-4 foram coletadas e divididas em 8 grupos na concentração de 5x10
6 seguida de uma contagem inicial de células viáveis através da
câmara de Neubauer. Posteriormente, as células foram estimuladas com LPS (0,5 μg/mL); CA (20 μg/mL); LPS + CA (0,5 + 20 μg/mL); CB (20 μg/mL), LPS + CB (0,5 + 20 μg/mL), CTX (20 μg/mL) e LPS + CTX (0,5 + 20 μg/mL). Após 18 horas de incubação em estufa a 37°C, amostras das culturas foram coletadas e determinada a viabilidade utilizando azul de tripan e contagem em câmara de Neubauer.
4.4. Efeito da CTX e LPS sobre a expressão de moléculas coestimuladoras e
MHC-II em DCs e secreção de citocinas
Baseados nesses resultados que o LPS é um forte indutor na maturação de
DCs, o próximo passo foi investigar se a CTX seria capaz de induzir ou modular a
maturação das DCs in vitro.
Para tanto, DCs foram incubadas com LPS (0,5 µg/mL), CTX (10 ou 20
μg/mL) ou LPS+CTX em estufa de 5% de CO2 umidificada por 18h. Posteriormente,
essas células foram marcadas com anticorpos anti-CD40, CD80, CD86 e MHC- II e
os resultados foram analisados por citometria de fluxo.
Observamos na figura 13 aumento da expressão das moléculas de MHC-II e
coestimuladoras nas DCs incubadas com LPS em comparação ao obtido nas DCs
mantidas em meio RPMI-S. A CTX não induziu aumento de moléculas CD40, CD80,
CD86 nas DCs, exceto de MHC-II quando comparado ao obtido nas células
mantidas em RPMI-S. Além disso, pudemos verificar que a CTX foi capaz de inibir a
ação do LPS sobre a expressão dessas moléculas nas DCs in vitro.
Células dendríticas
Mei
o
Mei
oLP
SCA
CA +
LPS
CB
CB +
LPS
CTX
CTX
+ L
PS
0
20
40
60
80
100
Estímulo por 18 horas
Via
bil
idad
e c
elu
lar
%
70
Figura 13- Efeito da CTX na expressão de moléculas coestimuladoras e MHC de classe II em DCs diferenciadas in vitro e estimuladas com LPS. DCs imaturas foram estimuladas com LPS (0,5 μg/mL); CTX (20 μg/mL); LPS + CTX (0,5 + 20 μg/mL) por 18 horas. Após esse período, as suspensões dessas células (1x10
6)
foram marcadas com anti-CD40, CD80, CD86 e MHC-II (PE) e analisadas em citômetro de fluxo. Os resultados obtidos foram expressos como média da intensidade de fluorescência (MIF) em células dendriticas ± DP das duplicatas. Resultados representativos de 2 experimentos. *p < 0,05- grupos de células incubadas com LPS, CTX ou LPS + CTX comparados ao grupo de células mantidas em meio de cultura. #p < 0,05- grupos LPS + CTX comparado ao grupo LPS.
A figura 14 mostra os resultados obtidos com as DCs incubadas com a
concentração de 20 µgmL de CTX, LPS (0,5 µg/mL) ou CTX+LPS. Os resultados
permitem verificar que o aumento da concentração da CTX in vitro não induziu
aumento da expressão das moléculas coestimuladoras nas DCs exceto de MHC-II
em relação ao observado nas DCs mantidas em meio RPMI-S. Além disso,
verificamos na figura 15 que a maior concentração de CTX resultou em maior
inibição da expressão das mesmas moléculas avaliadas nas DCs incubadas com
LPS.
CD40
0
200
400
600
800
1000
*#*
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e d
e
Flu
ore
scên
cia
(M
IF)
CD80
0
500
1000
1500
* #*
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e
de F
luo
rescên
cia
(M
IF)
CD86
0
500
1000
1500
*#*
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e
de F
luo
rescên
cia
(M
IF)
MHC-II
0
1000
2000
3000
*
#
**
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e d
e
Flu
ore
scên
cia
(M
IF)
Meio LPS CTX(10g) LPS + CTX (10g)
71
Figura 14- Efeito da CTX sobre a expressão de moléculas coestimuladoras e MHC de classe II em DCs diferenciadas in vitro estimuladas ou não com LPS. DCs imaturas foram estimuladas com LPS (0,5 μg/ mL); CTX (20 μg/mL); LPS + CTX (0,5 + 20 μg/mL); por 18 horas. Após esse período, as suspensões dessas células (1x10
6) foram marcadas com anticorpos anti-CD40, CD80, CD86 e MHC-II (PE) e
analisadas em citometria de fluxo. Os resultados obtidos foram expressos como média da intensidade de fluorescência (MIF) em células dendríticas ± DP das duplicatas. Resultados representativos de 5 experimentos. *p < 0,05- grupos de células incubadas com LPS, CTX ou LPS + CTX comparados ao grupo de células mantidas em meio de cultura. #p < 0,05- grupos LPS + CTX comparado ao grupo LPS.
Como pode ser visto na figura 15, as duas doses de CTX inibiram a
maturação das DCs induzida pelo LPS sendo esse efeito mais acentuado com a
maior concentração da toxina.
CD40
0
200
400
600
800
1000
*
#*
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e d
e
Flu
ore
scên
cia
(M
IF)
CD80
0
500
1000
1500
*#
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e
de F
luo
rescên
cia
(M
IF)
CD86
0
500
1000
1500
* #
*
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e
de F
luo
rescên
cia
(M
IF)
MHC-II
0
1000
2000
3000
*
## *
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e d
e
Flu
ore
scên
cia
(M
IF)
Meio LPS CTX(20g) LPS + CTX (20g)
72
Figura 15- Efeito das concentrações de CTX sobre a expressão de moléculas coestimuladoras e MHC de classe II em DCs diferenciadas in vitro e estimuladas com LPS. DCs imaturas foram estimuladas com LPS (0,5μg/ mL); grupos LPS + CTX (0,5μg/mL + 10μg/mL); LPS + CTX (0,5μg/ mL + 20μg/ mL) por 18 horas e posteriormente suspensões dessas células (1x10
6) foram marcadas com anticorpos anti-CD40, CD80,
CD86 e MHC-II (PE) e analisadas em citometria de fluxo. Os resultados obtidos foram expressos como média da intensidade de fluorescência (MIF) em células dendríticas das duplicatas.Resultados representativos de 2 experimentos. * p < 0,05- grupos LPS + CTX (10μg/ mL) comparado ao grupo LPS. #p < 0,05- grupos LPS + CTX (20μg/ mL) comparado ao grupo LPS.
Considerando que a incubação da CTX juntamente com o LPS resulta na
inibição da expressão de moléculas coestimuladoras e MHC-II pelas DCs, o próximo
passo desse estudo foi avaliar a secreção de IL-10 e citocinas pró- inflamatórias
pelas DCs diferenciadas in vitro.
Ao analisar a figura 16, podemos perceber que o LPS induziu alta secreção
de IL-12, TNFα, IL-1β e IL-6 e IL-10 pelas DCs quando comparada à produção
obtida na cultura de DC mantida em meio RPMI-S. Por outro lado, a CTX quando
CD40
LPSCTX
CTX
+ L
PS
LPSCTX
CTX
+ L
PS
0
200
400
600
800
1000
#
*
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e d
e
Flu
ore
scên
cia
(M
IF)
CD80
LPSCTX
CTX
+ L
PS
LPSCTX
CTX
+ L
PS
0
500
1000
1500
* #
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e d
e
Flu
ore
scên
cia
(M
IF)
CD86
LPSCTX
CTX
+ L
PS
LPSCTX
CTX
+ L
PS
0
500
1000
1500
*#
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e d
e
Flu
ore
scên
cia
(M
IF)
MHC-II
LPSCTX
CTX
+ L
PS
LPSCTX
CTX
+ L
PS
0
1000
2000
3000
* #
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e d
e
Flu
ore
scên
cia
(M
IF)
CTX (10 g) CTX (20g)
73
adicionada juntamente com o LPS, promoveu menor secreção de citocinas pró-
inflamatórias e maior produção de IL-10 em relação ao obtido em DCs estimuladas
somente com LPS.
Figura 16- Produção de IL-10, IL-12, TNFα, IL-1β e IL-6 nas culturas de células dendritícas diferenciadas e estimuladas in vitro com CTX ou LPS. Células de medula óssea de camundongos foram diferenciadas in vitro com GM-CSF + IL-4 durante 7 dias. As DCs foram estimuladas com CTX (20 μg/mL), LPS (0,5 μg/mL), ou LPS + CTX (0,5 + 20 μg/mL) e após 18 horas foram coletados os sobrenadantes para a análise das citocinas por ELISA, a partir da curvas-padrão das citocinas recombinantes. Todas as amostras foram feitas em duplicatas, onde os resultados foram expressos com a média da concentração de cada citocina ± desvio padrão. A linha
IL-10
Mei
oCTX
LPS
CTX
+ L
PS
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
#
**
*
ng
/ m
L
IL-12
Mei
oCTX
LPS
CTX
+ L
PS
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*
#*
ng
/ m
L
TNF-
Mei
oCTX
LPS
CTX
+ L
PS
0.0
0.5
1.0
1.5
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*#*
ng
/ m
L
IL-1
Mei
oCTX
LPS
CTX
+ L
PS
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*
#*
ng
/ m
L
IL-6
Mei
oCTX
LPS
CTX
+ L
PS
0.0
0.2
0.4
0.6
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*
#*
ng
/ m
L
74
pontilhada representa o limite de detecção pelo ensaio. Resultados representativos de 2 experimentos. *p < 0,05- grupos de células incubadas com LPS ou CTX + LPS comparado ao grupo de células mantidas em meio de cultura. #p < 0,05- grupos LPS + CTX comparado ao grupo LPS.
4.5. Efeito da CTX e LPS sobre a secreção de citocinas e expressão das
moléculas de MHC-II e coestimuladoras por DCs em diferentes
condições experimentais
Visto que a adição simultânea da CTX com o LPS resultou na inibição da
maturação das DCs in vitro, avaliamos se esse efeito seria decorrente da interação
da toxina com o LPS.
Para tanto, as culturas de DCs foram pré-incubadas por 2 ou 3 horas com
CTX (20 µg/mL), em seguida foram centrifugadas removido o sobrenadante e
adicionado novo meio de cultura e o LPS (0,5 µg/mL) e realizada incubação por 18
horas em estufa de 5% de CO2 umidificada. Após esse período, os sobrenadantes
foram coletados para dosagem de citocinas e as células marcadas com anticorpos
monoclonais anti-CD40, CD80, CD86 e MHC- II ou ainda, duplamente incubadas
com anticorpos anti-CD11c-FITC e anti-IL-10-PE ou anti-CD11c-FITC e anti-IL12-PE
para análise em citômetro de fluxo.
Os resultados obtidos mostram que a pré-incubação das DCs com CTX foi
capaz de inibir o efeito do LPS sobre a expressão das moléculas MHC-II, CD40,
CD80 e CD86 nas células, sendo esse efeito mais acentuado na pré-incubação das
células com a toxina por 3 horas (figura 17).
75
Figura 17- Efeito da pré- incubação com a CTX sobre a expressão de moléculas coestimuladoras e
MHC de classe II em DCs posteriormente incubadas com LPS DCs imaturas foram pré- incubadas por 2 ou 3 horas com a CTX (20 μg/mL), centrifugadas, removido o meio, e em seguida estimuladas com o LPS (0,5 μg/mL) por 18 horas. Após esse período, as suspensões dessas células (1x10
6) foram marcadas
com anti-CD40, CD80, CD86 e MHC-II (PE) e analisadas em citômetro de fluxo. Os resultados obtidos foram expressos como média da intensidade de fluorescência (MIF) em células dendriticas ± DP das duplicatas. Resultados representativos de 2 experimentos. *p < 0,05- grupos de células incubadas somente com LPS, pré- incubadas com CTX por 2h e 3h + LPS comparado ao grupo de células mantidas em meio de cultura #p < 0,05- grupos de células pré- incubadas com CTX por 2h e 3h + LPS comparados ao
grupo LPS
Na figura 18 observamos maior porcentagem de células CD11c+/IL12+ na
cultura de DCs incubada com LPS em relação à mantida com meio RPMI-S. No
entanto, constatamos que a população de células CD11c+/IL-12+ foi menor nas
culturas incubadas com CTX e LPS em relação à cultura incubada somente com o
LPS. Além disso, pudemos verificar maior porcentagem de células duplamente
positivas para CD11c/IL-10 nas culturas incubadas com CTX e LPS em relação às
culturas mantidas com meio ou incubadas com LPS.
CD40
0
1000
2000
3000
*
*
##
**
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e
de F
luo
rescên
cia
(M
IF)
CD80
0
1000
2000
3000
4000
5000*
*#
#**
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e
de F
luo
rescên
cia
(M
IF)
CD86
0
2000
4000
6000 *##* *
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e
de F
luo
rescên
cia
(M
IF)
MHC-II
0
2000
4000
6000
8000
*
* ##* *
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e
de F
luo
rescên
cia
(M
IF)
Meio LPS CTX (2h) + LPS CTX (3h) + LPS
76
Figura 18- Porcentagem de células CD11c+/IL10
+ ou CD11c
+/IL12
+ em culturas de DCs previamente
incubadas ou não com CTX seguida de incubação com LPS. DCs diferenciadas in vitro com GM-CSF e IL-4 por 7 dias foram pré-incubadas por 2 ou 3 horas com CTX (20 μg/mL), centrifugadas, ressuspensas em novo meio de cultura e adicionado LPS (0,5 μg/mL). Após 18 horas de cultura, as células (10
6) foram incubadas
por 30 minutos a 4°C com anticorpo anti-CD11c-FITC seguida de marcação intracelular com anticorpos anti-IL-10-PE ou anti-IL-12-PE. Todas as incubações foram feitas em duplicatas e analisadas por citometria de fluxo. Amostras de células foram também incubadas com anticorpos controles isotípicos marcados com FITC ou PE. Os resultados foram expressos com a porcentagem de células positivas marcadas para CD11c e IL-10 ou CD11c e IL-12 nas amostras em duplicata ± DP. Resultados representativos de 2 experimentos. *p < 0,05- grupos de células incubadas somente com LPS ou pré-incubadas com CTX por 2 ou 3 horas + LPS comparado ao grupo de células mantidas em meio de cultura. #p < 0,05- Células pré-incubadas com CTX por 2 ou 3 horas + LPS comparadas às DCs
incubadas somente com LPS.
Considerando que a maturação das DCs inclui tanto o aumento da expressão
das moléculas envolvidas com a apresentação antigênica como a secreção de
citocinas, estudamos a presença de IL-10, IL-12, TNF-α, IL-6 e IL-1β, nos
sobrenadantes das culturas de DCs pré- tratadas com CTX (20 μg/mL) por 2 e 3
horas seguida da adição de LPS.
Na figura 19 está representada a produção de citocinas pró- inflamatórias
onde podemos observar que o LPS induziu a produção pelas DCs de todas as
citocinas analisadas em relação ao obtido com as DCs mantidas em meio RPMI-S.
Além disso, foi possível verificar que as DCs pré-incubadas com a toxina por 2h e
principalmente por 3 h seguida da adição de LPS secretaram níveis menores de IL-
12, TNF-α, IL-1β e IL-6 em relação ao grupo de DCs incubadas somente com LPS.
Em contrapartida, no caso da IL-10, houve maior produção dessa citocina no grupo
de células estimuladas com a CTX + LPS em ambos períodos de tempos quando
CD11c+/ IL-10
0
10
20
30
40
50
*
##
**
% C
élu
las m
arc
ad
as
CD11c+/ IL-12
0
20
40
60
80
*
*
##
% C
élu
las m
arc
ad
as
Meio LPS CTX (2h) + LPS CTX (3h) + LPS
77
comparado ao grupo de células estimuladas somente com LPS ou mantidas em
meio de cultura. Vale ressaltar que a inibição da secreção das citocinas pela ação da
CTX não foi total uma vez que os níveis observados nestas culturas de DCs foram
superiores ao observado na cultura mantida em meio RPMI-S.
Figura 19- Análise por ELISA da produção de IL-10, IL- 12, TNF-α, IL-1β e IL-6 em sobrenadantes das culturas de DCs pré- tratadas com CTX por 2 e 3 horas seguida da adição do LPS. Células obtidas da medula óssea de camundongos BALB/c diferenciadas in vitro com GM-CSF e IL-4 durante sete dias foram estimuladas somente com LPS (0,5 μg/mL); pré-incubadas com CTX (20 μg/mL) por 2 e 3 horas e posterior adição do LPS. Após esse
IL-10
Mei
oLPS
CTX
(2h) +
LPS
CTX
(3h) +
LPS
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
#
#*
*
ng
/ m
L
IL-12
Mei
oLPS
CTX
(2h) +
LPS
CTX
(3h) +
LPS
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*#
#* *
ng
/ m
L
TNF-
Mei
oLPS
CTX
(2h
) + L
PS
CTX
(3h) +
LPS
0.0
0.5
1.0
1.5
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*
##*
*
ng
/ m
L
IL-1
Mei
oLPS
CTX
(2h
) + L
PS
CTX
(3h) +
LPS
0.0
0.2
0.4
0.6
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*# #* *
ng
/ m
L
IL-6
Mei
oLPS
CTX
(2h) +
LPS
CTX
(3h) +
LPS
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*#
#
*
*
ng
/ m
L
78
período de tempo, os sobrenadantes das culturas de células foram coletados e a concentração de IL-10 e citocinas pró- inflamatórias foram analisadas por ELISA, a partir da curvas-padrão das citocinas recombinantes. Todas as amostras foram feitas em duplicatas, onde os resultados foram expressos com a média da concentração de cada citocina ± DP. A linha pontilhada representa o limite de detecção pelo ensaio. Resultados representativos de 2 experimentos.
*p < 0,05- grupos de células incubadas somente com LPS ou pré-incubadas com CTX por 2 ou 3 horas + LPS comparado ao grupo de células mantidas em meio de cultura. #p < 0,05- células pré-incubadas com CTX por 2 ou 3 horas + LPS comparadas às DCs
incubadas somente com LPS.
Em outro experimento avaliamos se a CTX seria capaz de modular a ativação
das DCs pré-incubadas com LPS. Assim, as DCs foram inicialmente incubadas com
o LPS (0,5 µg/mL) e após 2 ou 3 horas foi adicionada ou não a CTX (20 µg/mL).
Após o período de 18 horas, os sobrenadantes foram coletados para determinação
da secreção de citocinas e as células foram incubadas com anticorpos monoclonais
anti-CD40, CD80, CD86 e MHC- II. As suspensões celulares foram ainda,
duplamente marcadas com anticorpos anti-CD11c-FITC e anti-IL-10-PE ou anti-
CD11c-FITC e anti-IL12-PE para análise em citômetro de fluxo.
Podemos observar na figura 20 que o LPS foi capaz de induzir aumento da
expressão das moléculas coestimuladoras e MHC-II nas DCs em relação ao
observado nas DCs mantidas em meio de cultura. Além disso, verificamos que a
CTX foi capaz de inibir esse efeito ativador do LPS sobre as DCs.
79
Figura 20- Efeito da CTX sobre a expressão de moléculas coestimuladoras e MHC de classe II em DCs pré-incubadas com o LPS. DCs imaturas foram estimuladas somente com LPS (0,5 μg/mL) ou pré- incubadas com LPS (0.5 μg/mL) por 2h e/ou 3h, lavadas e em seguida adicionado a CTX (20 μg/mL) por 18 horas. Após esse período, as suspensões dessas células (1x10
6) foram incubadas
com anti-CD40, CD80, CD86 e MHC-II-PE e analisadas em citômetro de fluxo. Amostras de DCs foram também incubadas com anticorpo anti-CD11c-PE ou anticorpo controle isotípico-PE. Os resultados obtidos foram expressos como a média da intensidade de fluorescência (MIF) em células dendriticas em duplicata ± DP. Resultados representativos de 2 experimentos.
*p < 0,05- grupos de células incubadas somente com LPS ou pré- incubadas com LPS por 2h e 3h + CTX comparado ao grupo de células mantidas em meio de cultura. #p < 0,05- grupos de células pré- incubadas com LPS por 2h e 3h + CTX comparados ao
grupo LPS.
A análise das populações de células duplamente marcadas mostrou que a
incubação das células com LPS resultou em aumento da população CD11c+/IL-12+
em relação à cultura mantida em meio RPMI-S. Em contrapartida, a presença da
CTX nas culturas incubadas com o LPS promoveu aumento da população
CD11c+/IL-10+ e diminuição de CD11c+/IL12+ em relação ao observado na cultura
estimulada somente com o LPS (figura 21).
CD40
0
1000
2000
3000
*
*
##*
*
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e
de F
luo
rescên
cia
(M
IF)
CD80
0
1000
2000
3000
4000
5000 *
*
##* *
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e
de F
luo
rescên
cia
(M
IF)
CD86
0
2000
4000
6000 *
##* *
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e
de F
luo
rescên
cia
(M
IF)
MHC-II
0
2000
4000
6000
8000
*
*# #* *
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e
de F
luo
rescên
cia
(M
IF)
Meio LPS LPS (2h)+ CTX LPS (3h)+ CTX
80
Figura 21- Porcentagem de células CD11c+/IL10
+ ou CD11c
+/IL12
+ em culturas de DCs previamente
incubadas ou não com LPS seguida de incubação com CTX. DCs diferenciadas in vitro com GM-CSF e IL-4 por 7 dias foram pré-incubadas com LPS por 2 ou 3 horas, centrifugadas, ressuspensas em novo meio de cultura e adicionado CTX (20 μg/mL). Após 18 horas de cultura, as células (10
6) foram incubadas por 30
minutos a 4°C com anticorpo anti-CD11c-FITC seguida de marcação intracelular com anticorpos anti-IL-10-PE ou anti-IL-12-PE. Todas as incubações foram feitas em duplicatas e analisadas por citometria de fluxo. Amostras de células foram também incubadas com anticorpos controles isotípicos marcados com FITC ou PE. Os resultados foram expressos com a porcentagem de células positivas marcadas para CD11c e IL-10 ou CD11c e IL-12 nas amostras em duplicata ± DP. Resultados representativos de 2 experimentos. *p < 0,05- grupos de células incubadas somente com LPS ou pré-incubadas com LPS por 2 ou 3 horas + CTX comparado ao grupo de células mantidas em meio de cultura. #p < 0,05- células pré-incubadas com LPS por 2 ou 3 horas + CTX comparadas às DCs
incubadas somente com LPS.
A figura A figura 22 demonstra as análises das citocinas secretadas in vitro
pelas DCs, na qual observamos novamente alta secreção das citocinas pró-
inflamatórias pelas DCs incubadas somente com LPS e comparativamente menor
secreção dessas citocinas por DCs pré- incubadas com LPS por 2 ou 3 horas
seguida da adição de CTX. Em contradição, podemos observar maior produção de
IL-10 nas células pré-incubadas com o LPS por 2 ou 3 horas em comparação as
DCs estimuladas somente com o LPS.
CD11c+/ IL-10
0
20
40
60
80
##*
*
% C
élu
las m
arc
ad
as
CD11c+/ IL-12
0
20
40
60
80
*
*
##
% C
élu
las m
arc
ad
as
Meio LPS LPS (2h) + CTX LPS (3h)+ CTX
81
Figura 22- Análise por ELISA da produção de citocinas IL-10, IL- 12, TNF-α, IL-1β e IL-6 em sobrenadantes das culturas de DCs pré- tratadas com CTX por 2 e 3 horas seguida da adição do LPS. Células obtidas da medula óssea de camundongos BALB/c diferenciadas in vitro com GM-CSF e IL-4 durante sete dias foram estimuladas somente com LPS (0,5 μg/mL); pré-incubadas com LPS (0,5 μg/mL) por 2 e 3 horas, centrifugadas, ressuspensas em novo meio de cultura e adicionado a CTX. Após esse período de tempo, os sobrenadantes das culturas de células foram coletados e a concentração de IL-10 e citocinas pró- inflamatórias foram analisadas por ELISA, a partir da curvas-padrão das citocinas recombinantes. Todas as amostras foram feitas em duplicatas, onde os resultados foram expressos com a média da concentração de cada citocina ± DP. A linha pontilhada
IL-10
Mei
oLP
S
LPS (2
h) + C
TX
LPS (3
h) + C
TX
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
#
#**
*
ng
/ m
L
IL-12
Mei
oLPS
LPS (2
h) + C
TX
LPS (3
h) + C
TX
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*
##*
*
ng
/ m
L
TNF-
Mei
oLPS
LPS (
2h) +
CTX
LPS (3
h) + C
TX
0.0
0.5
1.0
1.5
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*
##* *n
g/
mL
IL-1
Mei
oLPS
LPS (2
h) + C
TX
LPS (3
h) + C
TX
0.0
0.2
0.4
0.6
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*
##* *
ng
/ m
L
IL-6
Mei
oLPS
LPS (2
h) + C
TX
LPS (3
h) + C
TX
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*
#
#*
*
ng
/ m
L
82
representa o limite de detecção pelo ensaio. Resultados representativos de 2 experimentos. *p < 0,05- grupos de células incubadas somente com LPS ou pré-incubadas com LPS por 2 ou 3 horas + CTX comparado ao grupo de células mantidas em meio de cultura #p < 0,05- células pré-incubadas com LPS por 2 ou 3 horas + CTX comparadas às DCs
incubadas somente com LPS.
4.6. Envolvimento do receptor de formil peptídeo na atividade moduladora
da CTX em DCs
Tendo em vista os resultados mostrando o efeito modulador da CTX sobre a
maturação das DCs induzida pelo LPS, o próximo objetivo foi avaliar a participação
do receptor formil peptídeo nesse processo. Para tanto, as DCs foram pré-incubadas
ou não com o antagonista seletivo do receptor peptídeo formil (Boc-2 - 100 μM) por
15 minutos (COSTA et. al., 2013). Em seguida, foram centrifugadas e estimuladas
somente com LPS ou com CTX juntamente com LPS por 18 horas. Após esse
período de incubação, as culturas foram centrifugadas os sobrenadantes coletados
para dosagem das citocinas e as células marcadas com os anticorpos anti-MHC-II e
coestimuladoras para análise por citometria de fluxo.
Nossos resultados mostram novamente que o LPS induziu aumento na
expressão das moléculas MHC-II e coestimuladoras nas DCs incubadas ou não com
Boc-2, enquanto que a CTX inibiu essas moléculas nas DCs incubadas com LPS.
Em contrapartida, a CTX não foi capaz de modular a expressão dessas moléculas
nas DCs pré-incubadas com Boc-2 e estimuladas com o LPS (figura 23).
83
Figura 23- Envolvimento do receptor formil peptídeo no efeito da CTX sobre a expressão de
moléculas coestimuladoras e MHC-II em DCs incubadas com LPS. DCs diferenciadas com GM-CSF + IL-4 por 7 dias foram incubadas na presença ou não de Boc-2 (100 μM) por 15 minutos. Após esse período, as células foram centrifugadas e estimuladas com LPS (0,5 µg/mL) ou CTX + LPS (20 + 0,5 μg/mL) por 18 horas. Em seguida, as suspensões dessas células (10
6) foram marcadas com anticorpos anti-CD40,
CD80, CD86 e MHC-II (PE) e analisadas em citômetro de fluxo. Amostras de DCs foram também incubadas com anticorpo anti-CD11c-PE ou anticorpo controle isotípico-PE. Os resultados obtidos foram expressos como média da intensidade de fluorescência (MIF) das DCs ± DP das duplicatas. Resultados representativos de 2 experimentos. *p < 0,05- células incubadas somente com LPS ou com CTX + LPS comparado ao grupo de células mantidas em meio de cultura. #p < 0,05- células incubadas com CTX + LPS comparadas às DCs incubadas somente
com LPS.
Na figura 24 estão representados os resultados de produção das citocinas
pró-inflamatórias (IL-12, TNF-α, IL-6 e IL-1β) e anti-inflamatória (IL-10) nos
sobrenadantes das culturas de DCs. Podemos observar maior produção das
citocinas pró-inflamatórias nas culturas de DCs pré-incubadas ou não com Boc-2 e
estimuladas com LPS em relação à obtida na cultura de DCs mantidas com meio
RPMI-S. Somado a isso, verificamos inibição da secreção dessas citocinas na
cultura de DCs incubadas com LPS e CTX. No entanto, esse efeito inibitório da CTX
foi abolido quando as DCs foram pré-incubadas com Boc- 2, seguida da adição de
CD40
0
200
400
600
800
Boc-2
*
#
**
Méd
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e I
nte
nsid
ad
e
de F
luo
rescên
cia
(M
IF)
CD80
0
500
1000
1500
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Boc-2
*
#
**
Méd
ia d
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nte
nsid
ad
e
de F
luo
rescên
cia
(M
IF)
CD86
0
500
1000
1500
2000
Boc-2
*
#*
* *
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e
de F
luo
rescên
cia
(M
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MHC-II
0
1000
2000
3000
4000
Boc-2
*
#*
* *
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e d
e
Flu
ore
scên
cia
(M
IF)
Meio LPS CTX + LPS CTX + LPSLPS LPS
84
CTX + LPS. Com relação à secreção de IL-10, pudemos verificar níveis semelhantes
desta citocina nas culturas de DCs incubadas ou não com Boc-2 e estimuladas com
LPS ou LPS+CTX. Os resultados em conjunto mostram, portanto que o receptor
formil peptídeo está envolvido no efeito da CTX sobre a maturação das DCs
incubadas com LPS.
IL-10
Mei
oLP
S
CTX
+ L
PS
LPS
CTX
+ L
PS
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Boc-2
**
**
ng
/ m
L
IL-12
Mei
oLPS
CTX
+ L
PS
LPS
CTX
+ L
PS
0.0
0.5
1.0
1.5
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Boc-2
*
#*
* *
ng
/ m
L
TNF-
Mei
oLPS
CTX
+ L
PS
LPS
CTX
+ L
PS
0.0
0.5
1.0
1.5
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Boc-2
*
#*
* *
ng
/ m
L
IL-1
Mei
oLPS
CTX
+ L
PS
LPS
CTX
+ L
PS
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Boc-2
*
#*
* *
ng
/ m
L
IL-6
Mei
oLPS
CTX
+ L
PS
LPS
CTX
+ L
PS
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Boc-2
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*
#*
* *
ng
/ m
L
85
Figura 24- Produção de IL-10, IL-12, TNF-α, IL-1β e IL-6 em sobrenadantes das culturas de DCs diferenciadas e pré- incubadas ou não com Boc-2 seguida de incubação com LPS ou LPS+CTX. DCs diferenciadas in vitro com GM-CSF e IL-4 durante sete dias foram incubads ou não com Boc-2 (100 μM) por 15 minutos. Em seguida, as células foram centrifugadas, os sobrenadantes coletados e adicionado novo meio de cultura contendo LPS (0,5 μg/mL) ou LPS + CTX (0,5 + 20 μg/mL) com posterior incubação por 18 horas. Ao final desse período, os sobrenadantes das culturas celulares foram coletados e determinada a produção das citocinas em ensaio de ELISA. A concentração das citocinas presentes nos sobrenadantes foi calculada a partir da curva-padrão de cada citocina recombinante. Os resultados foram expressos como a média da concentração de cada citocina das amostras em duplicata ou diluídas na razão 1:2 ± DP. A linha pontilhada representa o limite de detecção pelo ensaio. *p < 0,05- grupos de células incubadas com LPS ou com CTX + LPS comparadas aos grupos de DCs mantidas em meio de cultura. #p < 0,05- grupos de células incubadas com CTX + LPS comparados aos grupos de DCs
incubadas somente com LPS.
4.7. Efeito das subunidades CA, CB e LPS sobre a expressão de moléculas
coestimuladoras e MHC-II em secreção de citocinas pelas DCs
Considerando os resultados obtidos mostrando que a CTX exerce potente
efeito modulador negativo sobre a maturação das DCs incubadas com LPS, tivemos
como objetivo seguinte avaliar o efeito das subunidades CA e CB obtidas da CTX
sobre as DCs. Portanto, em um primeiro experimento, as culturas de DCs foram
incubadas com LPS (0,5 μg/mL); CA (20 μg/mL) ou LPS + CA (0,5 + 20 μg/mL) por
18 horas. Em outro experimento, as DCs foram incubadas com LPS (0,5 μg/mL); CB
(10/20 μg/mL) ou LPS + CB (0,5 + 10/20 μg/mL) por 18 horas. Após esse período,
analisamos a secreção das citocinas nos sobrenadantes das culturas e a expressão
das moléculas envolvidas na apresentação antigênica pelas DCs, conforme já
descrito.
Como mostra a figura 25, a expressão das moléculas de MHC-II e
coestimuladoras esteve aumentada nas DCs incubadas com LPS ou LPS+CA
quando comparada à obtida nas DCs mantidas em meio RPMI-S. Além disso,
verificamos que a subunidade CA não induziu aumento da expressão dessas
moléculas nas DCs.
86
Figura 25- Avaliação do efeito da crotapotina (CA) na expressão de moléculas MHC-II e
coestimuladoras em DCs incubadas ou não com LPS. DCs diferenciadas in vitro foram estimuladas com LPS (0,5 μg/mL); CA (20μg/mL) e LPS + CA (0,5 + 20μg/mL) por 18 horas. Após esse período, 1x10
6 células foram incubadas
com anticorpos monoclonais anti-CD40, CD80, CD86 e MHC-II marcados com PE e analisadas por citometria de fluxo. Amostras de DCs foram também incubadas com anticorpo anti-CD11c-PE ou anticorpo controle isotípico-PE. Os resultados obtidos foram expressos como média da intensidade de fluorescência (MIF) em células dendríticas ± DP das duplicatas. Resultados representativos de 5 experimentos. *p < 0,05- grupos de células incubadas com LPS ou LPS + CA comparadas aos grupos de DCs mantidas em meio de cultura.
Com relação ao efeito da subunidade CB sobre as DCs, as análises de
citometria de fluxo permitiram verificar que esta fração da CTX não induziu aumento
da expressão das moléculas MHC-II, CD40, CD80, CD86 nas DCs e ainda, foi capaz
de inibir a expressão dessas moléculas nas DCs incubadas com LPS (figura 26).
CD40
0
100
200
300
400
* *
Méd
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* *
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(M
IF)
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0
200
400
600
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* *
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(M
IF)
MHC-II
0
500
1000
1500
2000
**
Méd
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luo
rescên
cia
(M
IF)
Meio LPS CA(20g) LPS + CA (20g)
87
Figura 26- Efeito da fosfolipase A2 (CB) na expressão de moléculas MHC-II e coestimuladoras em DCs incubadas ou não com LPS. DCs imaturas diferenciadas in vitro foram estimuladas com LPS (0,5 μg/mL); CB (20 μg/mL) e LPS + CB (0,5 + 20 μg/mL) por 18 horas. Após esse período, 1x10
6 células
foram incubadas com anticorpos monoclonais anti-CD40, CD80, CD86 e MHC-II conjugados ao PE e analisadas em citometria de fluxo. Amostras de DCs foram também incubadas com anticorpo anti-CD11c-PE ou anticorpo controle isotípico-PE. Os resultados obtidos foram expressos como média da intensidade de fluorescência (MIF) nas células dendríticas ± DP das duplicatas. Resultados representativos de 5 experimentos. *p < 0,05- grupo LPS ou LPS + CB comparado ao grupo de DCs mantidas em meio de cultura. #p < 0,05- grupo LPS + CB comparado ao grupo LPS.
Considerando que incubação das DCs com as toxinas e LPS pode também
induzir a secreção de citocinas distintas, analisamos por ELISA a presença de IL-1β,
IL-6, TNF-α, IL-12 e IL10 nos sobrenadantes dessas culturas.
Ao analisar a figura 27, pudemos verificar que o LPS induziu maior secreção
das citocinas pró-inflamatórias pelas DCs comparada à obtida nas culturas
CD40
0
100
200
300
400
*#*
Méd
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luo
rescên
cia
(M
IF)
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0
200
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600
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*#*
Méd
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nsid
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e
de F
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(M
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CD86
0
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400
600
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*
#*
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ad
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(M
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MHC-II
0
500
1000
1500
2000
*
#*
Méd
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luo
rescên
cia
(M
IF)
Meio LPS CB(20g) LPS + CB (20g)
88
estimuladas com CB, CA ou mantidas em meio RPMI-S. Por outro lado, subunidade
CB quando adicionada juntamente com o LPS inibiu a secreção de IL-12, TNFα, IL-
1β e IL-6 em relação às DCs incubadas com LPS ou LPS+CA.
Quanto à secreção de IL-10, verificamos aumento dessa citocina nas culturas
de DCs incubadas com a CB ou LPS quando comparada às DCs mantidas em meio
RPMI-S ou incubadas com CA. Além disso, verificamos efeito potencializador da CB
e CA sobre a secreção de IL-10 nas culturas de DCs incubadas com LPS.
Figura 27- Produção de IL-10, IL-12, TNFα, IL-1β e IL-6 nas culturas de DCs diferenciadas e
estimuladas in vitro com diferentes toxinas ou LPS.
IL-10
Mei
oCB
CA
LPS
CB +
LPS
CA +
LPS
0.0
0.2
0.4
0.6
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
#
#
**
*
*
ng
/ m
L
IL-12
Mei
oCB
CA
LPS
CB +
LPS
CA +
LPS
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*#*
*
ng
/ m
L
TNF-
Mei
oCB
CA
LPS
CB +
LPS
CA +
LPS
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0.5
1.0
1.5
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*#
**
ng
/ m
L
IL-1
Mei
oCB
CA
LPS
CB +
LPS
CA +
LPS
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*
#*
*
ng
/ m
L
IL-6
Mei
oCB
CA
LPS
CB +
LPS
CA +
LPS
0.0
0.2
0.4
0.6
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*
#*
*
ng
/ m
L
89
Células de medula óssea de camundongos foram diferenciadas in vitro com GM-CSF + IL-4 durante 7 dias. As DCs foram estimuladas com CB (20 μg/mL); CA (20 μg/mL), LPS (0,5 μg/mL) CB + LPS (20 + 0,5 μg/mL) e CA + LPS (20 + 0,5 μg/mL) e após 18 horas foram coletados os sobrenadantes para a análise das citocinas por ELISA, a partir da curvas-padrão das citocinas recombinantes. Todas as amostras foram feitas em duplicatas e os resultados expressos com a média da concentração de cada citocina ± DP. A linha pontilhada representa o limite de detecção de cada citocina determinado a partir da curva-padrão. A linha pontilhada representa o limite de detecção pelo ensaio. Resultados representativos de 2 experimentos. *p < 0,05- grupos de células incubadas somente com LPS ou CB em associação ou não com o LPS comparados ao grupo de DCs mantidas em meio de cultura. #p < 0,05- grupos CB + LPS ou CA + LPS comparado ao grupo LPS.
Visto que somente a subunidade CB foi capaz de inibir a expressão das
moléculas envolvidas na apresentação antigênica pelas DCs incubadas com LPS e
ainda, que a CTX é formada pela associação de CA e CB, avaliamos o efeito de
uma concentração menor de CB (10 µg/mL) sobre a atividade das DCs incubadas
com LPS (0,5 µg/mL).
A figura 28 demonstra que não houve redução da expressão dessas
moléculas quando foi adicionado CB (10 μg/mL) juntamente com o LPS na cultura
das DCs.
Figura 28- Efeito da fosfolipase A2 (CB) sobre a expressão de moléculas MHC-II e coestimuladoras em células dendríticas.
CD40
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100
200
300
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* *
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* *
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(M
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CD86
0
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400
600
800
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(M
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MHC-II
0
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1500
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Méd
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luo
rescên
cia
(M
IF)
Meio LPS CB (10g) LPS + CB (10g)
90
DCs imaturas diferenciadas in vitro foram estimuladas com LPS (0,5 μg/mL); CB (10 μg/mL) e LPS + CB (0,5 + 10 μg/mL) por 18 horas. Após esse período 1x10
6 células
foram incubadas com anticorpos monoclonais anti-CD40, CD80, CD86 e MHC-II conjugados ao PE e analisadas em citometria de fluxo. Amostras de DCs foram também incubadas com anticorpo anti-CD11c-PE ou anticorpo controle isotípico-PE. Os resultados obtidos foram expressos como média da intensidade de fluorescência (MIF) em células dendríticas em duplicata ± DP. Resultados representativos de 3 experimentos. *p < 0,05- grupos de células incubadas somente com LPS ou LPS + CB comparados ao grupo de DCs mantidas em meio de cultura.
4.8. Efeito da subunidade CB e LPS sobre a expressão das moléculas de
MHC-II e coestimuladoras por DCs e secreção de citocinas quando em
diferentes condições experimentais
Sabendo que a incubação simultânea da CB com LPS resultou na inibição da
expressão das moléculas coestimuladoras e de MHC-II nas DCs quando comparada
às DCs incubadas somente com LPS, realizamos um novo ensaio para analisar o
efeito da pré-incubação das DCs com CB (20 µg/mL) por 2 ou 3 horas seguida de
incubação com LPS (0,5 µg/mL) por 18 horas. Em outro experimento, avaliamos o
efeito da CB (20 µg/mL) sobre a DCs previamente incubadas com LPS (0,5 µg/mL)
por 2 ou 3 horas. Em ambos os experimentos, analisamos por citometria de fluxo a
expressão das moléculas de MHC-II e coestimuladoras nas culturas de DCs e a
dosagem de diferentes citocinas obtidas dos sobrenadantes das culturas celulares.
Os resultados apresentados na figura 29 permitem observar que o LPS
induziu aumento na expressão de todas as moléculas nas DCs em relação ao
observado nas DCs mantidas em meio RPMI-S. Além disso, permitem concluir que a
pré- incubação das DCs com a CB também foi capaz de modular a ativação dessas
células quando estimuladas com LPS.
91
Figura 29- Efeito da pré-incubação com o CB sobre a expressão de moléculas coestimuladoras e MHC de classe II em DCs posteriormente incubadas com LPS. DCs imaturas foram pré- incubadas por 2 ou 3 horas com a CB (20 μg/mL), centrifugadas, removido o meio, e em seguida estimuladas com o LPS (0,5 μg/mL) por 18 horas. Após esse período, as suspensões dessas células (1x10
6) foram marcadas
com anti-CD40, CD80, CD86 e MHC-II (PE) e analisadas em citômetro de fluxo. Os resultados obtidos foram expressos como média da intensidade de fluorescência (MIF) em células dendriticas ± DP das duplicatas. Resultados representativos de 2 experimentos. *p < 0,05- células incubadas somente com LPS ou pré- incubadas com CB por 2h e 3h + LPS comparados ao grupo de células mantidas em meio de cultura. #p < 0,05- células pré- incubada com CB por 2h e 3h + LPS comparados ao grupo LPS.
A determinação das citocinas nos sobrenadantes das culturas mostrou que
houve aumento da secreção de IL-10 na cultura de DCs pré-incubadas com CB por
2 e 3 horas com posterior incubação com LPS em relação às culturas mantidas em
meio RPMI-S ou estimuladas com LPS. Por outro lado, houve menor produção de
IL-12, TNF-α, IL-1β e IL-6 nas culturas de DCs pré-incubadas com CB por 3 horas
com posterior incubação do LPS em relação ao resultado obtido nas DCs
estimuladas somente com o LPS (figura 30).
CD40
0
1000
2000
3000 * #
#**
Méd
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#* #* *
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Flu
ore
scên
cia
(M
IF)
CD86
0
2000
4000
6000# #
***
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e d
e
Flu
ore
scên
cia
(M
IF)
MHC-II
0
2000
4000
6000
8000
##
**
*M
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Flu
ore
scên
cia
(M
IF)
Meio LPS CB (2h) + LPS CB (3h) + LPS
92
Figura 30- Análise por ELISA da produção de citocinas IL-10, IL- 12, TNF-α, IL-1β e IL-6 em sobrenadantes das culturas de DCs pré-incubadas com CB por 2 e 3 horas seguida da adição do LPS. Células obtidas da medula óssea de camundongos BALB/c diferenciadas in vitro com GM-CSF e IL-4 durante sete dias foram estimuladas somente com LPS (0,5 μg/mL); pré-incubadas com CB (20 μg/mL) por 2 e 3 horas e posterior adição do LPS. Após esse período de tempo, os sobrenadantes das culturas de células foram coletados e a concentração de IL-10 e citocinas pró- inflamatórias foram analisadas por ELISA, a partir da curvas-padrão das citocinas recombinantes. Todas as amostras foram feitas em duplicatas, onde os resultados foram expressos com a média da concentração de cada citocina ± DP. A linha pontilhada representa o limite de detecção pelo ensaio. Resultados representativos de 2 experimentos.
*p < 0,05- grupos de células incubadas somente com LPS ou com CB por 2 ou 3 horas + LPS comparado ao grupo de células mantidas em meio de cultura #p < 0,05- células pré-incubadas com CB por 2 ou 3 horas + LPS comparadas às DCs
incubadas somente com LPS.
IL-10
Mei
oLPS
CB (2
h) + L
PS
CB (3
h) + L
PS
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
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*
##
**
ng
/ m
L
IL-12
Mei
oLPS
CB (2
h) + L
PS
CB (3
h) + L
PS
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
**
#**
ng
/ m
L
TNF-
Mei
oLPS
CB (2
h) + L
PS
CB (3
h) + L
PS
0.0
0.5
1.0
1.5
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*#**
ng
/ m
L
IL-1
Mei
oLPS
CB (2
h) + L
PS
CB (3
h) + L
PS
0.0
0.2
0.4
0.6
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*#*
*
ng
/ m
L
IL-6
Mei
oLPS
CB (2
h) + L
PS
CB (3
h) + L
PS
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
* #**
ng
/ m
L
93
A adição de CB nas culturas de DCs pré-incubadas com LPS por 2 ou 3 horas
resultou em inibição da expressão das moléculas de MHC-II e coestimuladoras
quando comparado ao obtido nas culturas de DCs somente estimuladas com LPS,
como mostra a figura 31.
Figura 31- Efeito da CB sobre a expressão das moléculas coestimuladoras e MHC de classe II em DCs pré-incubadas in vitro com LPS. DCs imaturas foram incubadas com LPS (0,5 µg/mL) e após 2 ou 3 horas foi adicionada ou não a CB (20 μg/mL). Após incubação de 18 horas, as suspensões celulares (1x10
6)
foram marcadas com anticorpos anti-CD40, CD80, CD86 e MHC-II (PE) e analisadas em citômetro de fluxo. Amostras de células foram também incubadas com anticorpo controle isotípico conjugado ao PE. Os resultados obtidos foram expressos como média da intensidade de fluorescência (MIF) em células dendriticas em duplicata ± DP. Resultados representativos de 2 experimentos.
*p < 0,05- grupos de células incubadas somente com LPS ou pré- incubadas com LPS por 2h e 3h + CB comparados ao grupo de células mantidas em meio de cultura. #p < 0,05- grupos de células pré- incubadas com LPS por 2h e 3h + CB comparados ao
grupo LPS.
Ainda como forma de comprovar que a expressão das moléculas
coestimuladoras e MHC-II esta relacionado com a ativação das células e
consequentemente com a secreção de citocinas, resolvemos analisar a produção
das mesmas.
CD40
0
1000
2000
3000 *
##
**
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e d
e
Flu
ore
scên
cia
(M
IF)
CD80
0
1000
2000
3000
4000
5000*
##*
*
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e d
e
Flu
ore
scên
cia
(M
IF)
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0
2000
4000
6000 *
##*
*
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e d
e
Flu
ore
scên
cia
(M
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MHC-II
0
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4000
6000
8000
*#
#**
Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e d
e
Flu
ore
scên
cia
(M
IF)
Meio LPS LPS (2h) + CB LPS (3h) + CB
94
Como verificado na figura 32, nas culturas de DCs podemos verificar que o
LPS induziu aumento de IL- 12, TNF-α, IL-1β e IL-6 quando comparado ao obtido
nas DCs mantidas em meio RPMI-S. Por outro lado, a adição da CB após 2 ou 3
horas da incubação com LPS resultou em menor secreção das mesmas citocinas em
comparação com o grupo LPS. Quanto à IL-10, esta por sua vez, podemos verificar
aumento da secreção desta citocina nas cultura de células estimuladas com LPS por
2 e 3 horas, seguido da adição de CB, em relação à cultura de DCs mantidas em
meio RPMI-S ou as células estimuladas somente com o LPS (figura 31).
IL-10
Mei
oLPS
LPS (2
h) + C
B
LPS (3
h) + C
B
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
#
#
*
**
ng
/ m
L
IL-12
Mei
oLPS
LPS (2
h) + C
B
LPS (3
h) + C
B
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
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- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*#
#**
ng
/ m
L
TNF-
Mei
oLPS
LPS (2
h) + C
B
LPS (3
h) + C
B
0.0
0.5
1.0
1.5
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*# #* *
ng
/ m
L
IL-1
Mei
oLPS
LPS (2
h) + C
B
LPS (3
h) + C
B
0.0
0.2
0.4
0.6
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*
# #* *
ng
/ m
L
IL-6
Mei
oLPS
LPS (2
h) + C
B
LPS (3
h) + C
B
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*#
#* *
ng
/ m
L
95
Figura 32- Produção de IL-10, IL-12, TNF-α, IL-1β e IL-6 em sobrenadantes das culturas de DCs em pré-incubadas com LPS seguida de adição do CB. DCs diferenciadas in vitro foram incubadas com LPS (0,5 µg/mL) por 2 ou 3 horas centrifugadas, ressuspensas em novo meio de cultura e em seguida foi adicionado o CB (20 μg/mL). Após 18 horas de cultura, as células foram centrifugadas e os sobrenadantes coletados para detecção das citocinas por ELISA, conforme descrito em material e métodos. A concentração das citocinas foi determinada de acordo com as curvas-padrões das citocinas recombinantes. Todas as amostras foram feitas em duplicata e os resultados expressos com a média da concentração de cada citocina ± DP. A linha pontilhada representa o limite de detecção pelo ensaio. Resultados representativos de 2 experimentos. *p < 0,05- grupos de células incubadas somente com LPS ou pré-incubadas com LPS por 2 ou 3 horas + CB comparados ao grupo de células mantidas em meio de cultura. #p < 0,05- células pré-incubadas com LPS por 2 ou 3 horas + CB comparadas às DCs
incubadas somente com LPS.
4.9. Envolvimento do receptor peptídeo formil na atividade moduladora da
CB em DCs
Os resultados anteriores mostraram que a subunidade CB assim como a CTX
são capazes de modular a ativação das DCs pelo LPS. Portanto, o próximo passo foi
analisar se o receptor peptídeo formil está envolvido na ação moduladora da CB.
Assim como o experimento realizado com a CTX, as DCs obtidas in vitro foram pré-
incubadas ou não com Boc-2 (100 μM) por 15 minutos, lavadas, e então estimuladas
somente com LPS ou com CB em conjunto com o LPS. Após 18 horas, as células
foram marcadas com anticorpos anti- MHC-II, CD40, CD80 e CD86 e analisadas em
citômetro de fluxo.
A figura 33 mostra que independente da pré-incubação com Boc-2 o LPS
induziu maior expressão das moléculas coestimuladoras e MHC-II nas DCs quando
comparado ao grupo de DCs mantidas em meio RPMI-S. Verificamos ainda, menor
expressão dessas mesmas moléculas na população de células incubadas somente
com CB + LPS. Por outro lado, assim como no caso da CTX, não observamos
diminuição na expressão dessas moléculas quando a cultura de DCs foi pré-
incubada com Boc-2, e posteriormente acrescentado o CB + LPS mostrando,
portanto o envolvimento do receptor formil peptideo no efeito da CB sobre as DCs.
96
Figura 33- Efeito do bloqueio do receptor formil peptídeo sobre a ação do CB na expressão de moléculas coestimuladoras e MHC-II em DCs estimuladas com LPS. DCs diferenciadas com GM-CSF + IL-4 por 7 dias foram incubadas na presença ou não de Boc-2 (100 μM) por 15 minutos. Após esse período, as células foram centrifugadas e o novo meio de cultura foi adicionado com LPS (0,5 µg/mL) ou CB + LPS (20 + 0,5 μg/mL). Após 18 horas de cultura, as suspensões celulares (1x10
6) foram marcadas com
anticorpos anti-CD40, CD80, CD86 e MHC-II (PE) e analisadas em citômetro de fluxo. Amostras de células foram também incubadas com anticorpo controle isotípico conjugado ao PE. Os resultados obtidos foram expressos como média da intensidade de fluorescência (MIF) das células dendriticas ± desvio padrão das duplicatas. Resultados representativos de 2 experimentos. *p < 0,05- células incubadas somente com LPS ou com CB + LPS comparados ao grupo de células mantidas em meio de cultura. #p < 0,05- células incubadas com CB + LPS comparadas às DCs incubadas somente
com LPS.
As dosagens das diferentes citocinas nos sobrenadantes das culturas de
células permitiram verificar que as DCs estimuladas com LPS pré-incubadas ou não
com Boc-2 secretaram altos níveis de IL-1β, TNF-α, IL-12 e IL-6 em relação ao
obtido nas células mantidas com meio RPMI-S. Menor secreção delas foi observada
na cultura de DCs incubadas com LPS e CB. Em contrapartida, essa inibição das
citocinas induzida pela CB não foi observada na cultura de DCs pré-incubadas com
CD40
0
200
400
600
800
Boc-2
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#
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Méd
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(M
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#
* *
Méd
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nsid
ad
e
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luo
rescên
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1500
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Boc-2
*
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Méd
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nsid
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rescên
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(M
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#
* *M
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nsid
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e
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luo
rescên
cia
(M
IF)
Meio CB + LPS CB + LPSLPS LPS
97
Boc- 2, o que demonstra o envolvimento do receptor formil peptídeo na ação da
subunidade CB sobre as DCs (figura 34).
Figura 34- Produção de IL-10, IL- 12, TNF-α, IL-1β e IL-6 em sobrenadantes das culturas de DCs pré-incubadas ou não com Boc-2 seguida de incubação com LPS e CB. Células diferenciadas in vitro com GM-CSF e IL-4 durante sete dias foram incubadas ou não com Boc-2 (100 μM) por 15 minutos. Após esse período, as células foram centrifugadas, o meio removido e novo meio de cultura foi adicionado com LPS (0,5
IL-10
Mei
oLPS
CB +
LPS
LPS
CB +
LPS
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
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Boc-2
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/ m
L
IL-12
Mei
oLPS
CB +
LPS
LPS
CB +
LPS
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- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Boc-2
*
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* *
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/ m
L
TNF-
Mei
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CB +
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LPS
CB +
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0.0
0.5
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Boc-2
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* *
ng
/ m
L
IL-1
Mei
oLPS
CB +
LPS
LPS
CB +
LPS
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0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Boc-2
*
#*
* *
ng
/ m
L
IL-6
Mei
oLPS
CB +
LPS
LPS
CB +
LPS
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Boc-2
*
#*
* *
ng
/ m
L
98
µg/mL) ou CB + LPS (20 + 0,5 μg/mL). Após 18 horas, os sobrenadantes das culturas foram coletados e a concentração das citocinas determinada por ELISA, conforme descrito em material e métodos, a partir da curva-padrão de cada citocina recombinante. Todas as amostras foram feitas em duplicata e os resultados foram expressos com a média da concentração de cada citocina ± desvio padrão. A linha pontilhada representa o limite de detecção pelo ensaio. *p < 0,05- células incubadas somente com LPS ou com CB + LPS comparados ao grupo de células mantidas em meio de cultura #p < 0,05- células incubadas com CB + LPS comparadas às DCs incubadas somente
com LPS.
4.10. Análise comparativa da expressão das moléculas coestimuladoras e
MHC-II em DCs estimuladas com CTX ou CB
Considerando os resultados obtidos, tivemos o objetivo de comparar o
potencial modulador da CTX e de sua subunidade CB sobre as DCs incubadas com
LPS. Portanto, as DCs foram incubadas com LPS (0,5 µg/mL), LPS + CTX (0,5 e 20
µg/mL) e LPS + CB (0,5 e 20 µg/mL) por 18 horas. Em seguida as células foram
marcadas como já descrito e analisadas em citômetro de fluxo.
Os resultados obtidos mostram que o LPS induziu aumento da expressão das
moléculas de MHC-II e coestimuladoras nas DCs. No entanto, a adição da CTX ou
CB nas DCs resultou em inibição do efeito do LPS sobre a expressão dessas
moléculas, sendo esse efeito inibitório mais acentuado com a CTX em relação ao
obtido com sua subunidade CB (figura 35).
99
Figura 35- Efeito da CTX e CB sobre a expressão de moléculas MHC-II e coestimuladoras em DCs estimuladas com LPS. Células dendríticas diferenciadas in vitro foram estimuladas com LPS (0,5μg/mL), LPS + CTX (0,5 + 20 μg/mL) ou LPS + CB (0,5 + 20 μg/mL) por 18 horas. Após esse período, 1x10
6 células foram incubadas com anticorpos monoclonais anti-CD40, CD80, CD86 e
MHC-II (PE) e analisadas em citometria de fluxo. Amostras de DCs foram incubadas com anticorpo controle isotípico conjugado ao PE. Os resultados foram expressos como média da intensidade de fluorescência (MIF) das células dendríticas ± DP das duplicatas. *p < 0,05- células incubadas somente com LPS, LPS + CTX ou LPS + CB comparadas ao grupo de células mantidas em meio de cultura. #p < 0,05- células incubadas com LPS + CTX ou LPS + CB comparados ao grupo LPS.
4.11. Efeito da CTX, CA e CB sobre a produção de mediadores anti-
inflamatórios por DCs incubadas ou não com LPS
Tendo em vista que a CTX e CB promovem potente efeito modulador negativo
sobre a maturação das DCs incubadas com LPS, analisamos a produção de PGE2 e
LXA4 nos sobrenadantes das diferentes culturas de DCs incubadas com 20 µg/mL
de CTX, CA, CB e 0,5 µg/mL de LPS ou ainda, CTX+LPS, CA+LPS ou CB+LPS por
18 horas. As dosagens desses eicosanoides foram realizadas por ELISA de acordo
com a metodologia descrita em detalhes em material e métodos. Além disso, as
0
500
1000
1500
2000 *
#
#
**
Méd
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*
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Méd
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nte
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e d
e
Flu
ore
scên
cia
(M
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0
500
1000
1500
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*
Méd
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e I
nte
nsid
ad
e d
e
Flu
ore
scên
cia
(M
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0
2000
4000
6000
#
#
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Méd
ia d
e I
nte
nsid
ad
e d
e
Flu
ore
scên
cia
(M
IF)
Meio LPS LPS + CTX LPS + CB
100
células dessas culturas foram utilizadas para a análise da expressão de RNAm para
IL10 e TGF-β por PCR em tempo real em sistema Syber Green.
A figura 36 permite verificar que a CTX e CB induziram maior produção de
PGE2 e LXA4 pelas DCs em relação ao observado na cultura de DCs incubadas com
CA. Células incubadas somente com LPS secretaram baixos níveis desses
eicosanoides quando comparado ao obtido nas células incubadas com CTX e CB.
No entanto, houve aumento da secreção tanto de PGE2 como de LXA4 nas culturas
de DCs incubadas com LPS+CTX, LPS+CB ou LPS+CA. No entanto, esse aumento
foi mais acentuado nas culturas de DCs incubadas com LPS + CTX.
Figura 36- Produção de PGE2 e LXA4 nas culturas de DCs estimuladas in vitro com CTX, CA, CB na presença ou não do LPS. Células de medula óssea de camundongos foram diferenciadas in vitro com GM-CSF + IL-4 durante 7 dias. As DCs foram estimuladas com CTX (20 μg/mL), CB (20 μg/mL), CA (20 μg/mL), LPS (0,5 μg/mL), CTX + LPS (20 + 0,5 μg/mL), CB + LPS (20 + 0,5 μg/mL), ou CA + LPS (20 + 0,5 μg/mL) e após 18 horas foram coletados os sobrenadantes. As concentrações desses eicosanoides foram determinadas por ELISA do tipo competitivo a partir das curvas-padrões para PGE2 e LXA4 (1250 a 19,5 pg/mL e 2000 a 20 pg/mL, respectivamente). Todas as amostras foram feitas em duplicatas e os resultados expressos com a média da concentração de cada eicosanoide ± DP. A linha pontilhada representa o limite de detecção pelo ensaio. *p < 0,05- células incubadas com CTX, CB, CA em associação ou não com o LPS comparados ao grupo de células mantidas em meio de cultura. #p < 0,05- células incubadas com CTX + LPS, CB + LPS ou CA + LPS comparadas às
DCs incubadas somente com LPS.
Além da determinação da secreção dos eiocisanoides que exercem efeito
anti-inflamatório, estudamos a expressão de RNAm para TGF-β pelas DCs
incubadas em diferentes condições, uma vez que os níveis desta citocina foram
inferiores ao limite de detecção no ELISA. Em conjunto ao TGF-β, analisamos a
expressão de RNAm para IL-10. As PCRs foram padronizadas utilizando cDNAs
PGE2
Mei
oCTX C
BCA
LPS
CTX
+ L
PS
CB +
LPS
CA +
LPS
0
1000
2000
3000
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*#
#
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L
LXA4
Mei
oCTX C
BCA
LPS
CTX
+ L
PS
CB +
LPS
CA +
LPS
0
500
1000
1500
2000
2500
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
#
##*
**
*
* *
ng
/ m
L
101
sintetizados a partir de RNA das DCs. Inicialmente as reações foram padronizadas
avaliando a expressão da β-actina e verificamos que não houve variação na
expressão desse gene nos diferentes grupos experimentais o que permitiu a sua
utilização como “housekeeping” para as análises da expressão das citocinas (figura
37).
Figura 37- Análise comparativa da expressão de β-actina nos grupos experimentais de DCs tratadas com CTX, CB, CA na presença ou não do LPS. DCs diferenciadas in vitro foram incubadas por 18 horas com CTX, CB, CA, LPS ou CTX + LPS, CB + LPS e CA + LPS. Em seguida, células (1x10
7) foram coletadas,
centrifugadas e utilizadas para a extração de RNA e síntese de cDNA. A partir desse material foi realizada a análise da expressão da β-actina por PCR em tempo real. Os resultados foram expressos em quantidade relativa de cDNA das amostras em triplicatas.
Podemos verificar na figura 38 que houve aumento na expressão de IL-10 nas
culturas de DCs incubadas principalmente com CTX, pouca com CB e não com CA.
Além disso, verificamos que o LPS induziu baixa expressão desta citocina pelas DCs
comparada à obtida com a CTX. Somado a isso, observamos alta expressão de IL-
10 nas culturas de DCs incubadas principalmente com CTX + LPS, seguida de
incubação com CB + LPS e em menor proporção na incubação com CA + LPS.
Quanto ao TGF-β, verificamos que a CTX promoveu alta expressão dessa citocina
pelas DCs e menor expressão com a incubação com CB, CA ou LPS. Alta
expressão de TGF-β também foi induzida nas DCs incubadas com CTX + LPS e em
menor proporção pelas DCs incubadas com CB + LPS.
-actina
0
10
20
30
CTX
CB
Meio
LPS
CA
CTX + LPS
CB + LPS
CA + LPSEx
pre
ss
ão
re
lati
va
cD
NA
102
Figura 38- Expressão gênica de IL-10 e TGF-β em DCs incubadas in vitro com CTX, CB, CA em associação ou não com o LPS. DCs diferenciadas in vitro foram incubadas por 18 horas com CTX, CB, CA, CTX + LPS, CB + LPS ou CA + LPS. Em seguida, 1x10
7 células foram separadas, centrifugadas e
utilizadas para a extração de RNA e síntese de cDNA. A partir desse material foi realizada a análise da expressão de ambas citocinas por PCR em tempo real utilizando como controle endógeno a β-Actina. Os resultados foram expressos em quantidade relativa de cDNA calculada a partir do método de 2
-ΔΔCt ± desvio padrão, como descrito
em material e métodos.A linha pontilhada representa o limite de detecção pelo ensaio. Resultados representativos de 2 experimentos das amostras em triplicatas. *p < 0,05- células incubadas com CTX, CTX + LPS, CB + LPS ou CA + LPS comparados aos grupo de células mantidas em meio de cultura. #p < 0,05- células incubadas com CTX + LPS, CB + LPS ou CA + LPS comparadas às
DCs incubadas somente com LPS.
Esses resultados em conjunto demonstraram que a subunidade CB e
principalmente a CTX promovem a secreção de mediadores anti-inflamatórios pelas
DCs e também potencializam a produção desses fatores em DCs incubadas com
LPS.
4.12. Ensaio de proliferação celular dos linfócitos TCD3+ em resposta as DCs
estimuladas com CTX e CB com LPS
Nos resultados anteriores pudemos observar que a CTX e CB foram capazes
de inibir a maturação das DCs estimuladas com o LPS, ou seja, parecem modular a
capacidade dessas células de apresentar antígenos e induzir a resposta adaptativa.
Considerando essas observações, o próximo objetivo foi analisar se esse efeito da
CTX e CB sobre as DCs se refletia na sua capacidade de induzir a ativação e
proliferação de linfócitos T.
IL-10
Mei
oCTX
CB
CA
LPS
CTX
+ L
PS
CB +
LPS
CA +
LPS
0
5
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15
20
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
*
#
#
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*
*
*
Ex
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TGF-
Mei
oCTX
CB
CA
LPS
CTX
+ L
PS
CB +
LPS
CA +
LPS
0
5
10
15
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
#
*
#*
*
Ex
pre
ss
ão
re
lati
va
cD
NA
103
Para tanto, realizamos o ensaio de reação mista linfocitária utilizando a
análise da proliferação de LTs obtidos de camundongos C57BL/6 quando incubados
com as DCs diferenciadas de camundongos BALB/c e previamente incubadas ou
não com CTX e CB em associação ou não com o LPS por 18 horas. Após esse
período, foi adicionado meio RPMI-S as culturas de DCs seguida de centrifugação e
adição de novo meio RPMI-S. Os linfócitos CD3+ foram purificados a partir da
suspensão celular de linfonodos inguinais e periaórticos de camundongos não-
imunizados utilizando o sistema de seleção positiva. A resposta proliferativa dos
linfócitos CD3+ nas co-culturas com as DCs foi avaliada após 72 e 96 horas de
incubação em estufa de 5% de CO2 umidificada.
Podemos observar na figura 39 baixa proliferação nas culturas de LTCD3+ na
presença de DCs mantidas em meio RPMI-S ou incubadas com CTX e CB. Por outro
lado, verificamos que houve elevada proliferação de LT quando incubados com DCs
previamente estimuladas com LPS, com maior pico no período de 72 horas. Em
contraste, assim, como observado anteriormente na secreção de citocinas pró-
inflamatórias e expressão de moléculas coestimuladoras e MHC-II, podemos
observar baixa resposta proliferativa de LT co-cultivados com DCs previamente
incubadas com CTX ou CB em conjunto com o LPS, sendo esse efeito modulador
mais evidente no período de tempo de 72 horas.
Figura 39- Resposta proliferativa dos linfócitos CD3+ co-cultivados com DCs pré-incubadas com
CTX e CB na presença ou não de LPS. DCs diferenciadas in vitro a partir de medula óssea de camundongos BALB/c foram incubadas por 18 horas com CTX (20 µg), CB (20 µg), LPS (0,5 µg), CTX + LPS (20 + 0,5 µg) ou CB + LPS (20 + 0,5 µg). Em seguida, essas células (0,6 x 10
5) foram co-
cultivadas com linfocitos CD3+ (3 x 10
5) purificados de camundongos C57BL/6. Como
controles do ensaio, as células mantidas em meio de cultura foram distribuídas em placas da seguinte maneira: DCs + LT, somente DCs ou LT. Após o período de 72 e 96
72 horas
DC +
LT
DC LT
CTX
CB
LPS
CTX
+ L
PS
CB +
LPS
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 *
##
Pro
life
ração
de L
T
96 horas
DC +
LT
DC LT
CTX
CB
LPS
CTX
+ L
PS
CB +
LPS
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
**
*
*#
#
Pro
life
ração
de L
T
104
horas, foi analisada a resposta proliferativa dos LT utilizando-se o Kit “Cell proliferation ELISA Biotrak System version 2”, segundo descrição em material e métodos. Os resultados foram expressos como a média de densidade óptica obtida das amostras em quadruplicatas ± DP. Resultados representativos de 2 experimentos. *p < 0,05- grupos de células incubadas com CTX e CB em associação ou não com LPS comparados ao grupo de DCs mantidas em meio de cultura. #p < 0,05- células incubadas com CTX + LPS ou CB + LPS comparadas às DCs
incubadas somente com LPS.
105
4. DISCUSSÃO
Está relatado na literatura que os envenenamentos por serpentes do gênero
Crotalus não induzem reações locais intensas como a resposta inflamatória
(SOUSA; SILVA, et al., 1996; SAMPAIO et al., 2010). Além disso, estudos
evidenciaram que o veneno crotálico se destaca dos demais por induzir baixos
níveis de anticorpos específicos contra seus componentes quando comparado a
outros venenos ofídicos (ROLIM-ROSA, 1980 e 1981; SOERENSEN, 1990;
RANGEL SANTOS; MOTA, 2000).
Sabe-se que a CTX, principal toxina encontrada no veneno de C.d.terrificus,
além de apresentar atividades biológicas clássicas é responsável pela potente
atividade imunomoduladora e anti-inflamatória (SAMPAIO et al., 2010; LI et al.,
2013). Somado a isso, outros trabalhos ressaltam que essa atividade da CTX sobre
o sistema imune pode ser mediada pelas suas subunidades CA ou CB (LANDUCCI
et al., 1995; GARCIA et al., 2003; SAMPAIO et al., 2005; ZAMBELLI et al., 2008).
O sistema imune é responsável por manter a homeostasia do organismo e
portanto, eliminar agentes potencialmente patogênicos. Mecanismos mediados por
componentes da imunidade inata e adaptativa são desencadeados por esses
patógenos com o intuito de restabelecer as condições fisiológicas do indivíduo. A
resposta imune inata é inicialmente desencadeada pela presença de um antígeno e
importante no desenvolvimento da imunidade adaptativa (BOOM et al., 1987;
STREET et al., 1990; UNDERHILL, 1999; CATRON et al., 2004; ITANO; JENKIS,
2003; GRUTZ, 2005). Neste contexto, as DCs são fundamentais para a ativação dos
linfócitos T efetores.
Resultados obtidos pelo nosso grupo de pesquisa mostraram que a CTX inibe
a geração da imunidade humoral e celular adaptativa in vivo atuando sobre as
APCs, como as DCs (RICARDI et al., 2010; FAVORETTO et al., 2011). Portanto,
esses resultados indicam que a CTX pode modular a atividade funcional da principal
célula envolvida na ativação dos linfócitos T que são as DCs.
Em vista dessas observações estudamos neste projeto o potencial modulador
da CTX e suas subunidades CA e CB sobre a atividade funcional das DCs.
Com este objetivo, a metodologia de cromatografia de troca iônica foi
empregada para a obtenção da CTX a partir do veneno de C.d.terrificus e
106
posteriormente das subunidades CA e CB a partir da CTX. A separação da CTX e
posterior de CA e CB por cromatografia de troca aniônica e catiônica,
respectivamente, se mantiveram constantes em todas as coletas, o que indicou a
reprodutividade da metodologia.
A CTX é formada pela associação de duas subunidades que podem
apresentar-se como isoformas distintas e, portanto pode ser eluída em picos
distintos ao longo do perfil cromatográfico (RANGEL-SANTOS et al., 2004). Assim
como descrito, verificamos em nossas purificações a presença de três picos
correspondentes à toxina.
O complexo CTX é formado pela associação 1:1 das subunidades A e B, as
quais podem ser dissociadas em tampão contendo alta concentração de uréia ou
com pH inferior a 2 (FAURE; BON, 1987). Considerando o exposto, utilizamos o
tampão com uréia 6M como método para a obtenção das subunidades CA e CB
seguida de cromatografia de troca catiônica e obtivemos dois picos distintos
referentes à CA e CB.
Na análise das frações em gel de eletroforese foi possível observar bandas
livres de contaminantes evidenciando eficiência no método de purificação quanto à
pureza e integridade das amostras obtidas. O perfil eletroforético da subunidade CA
permitiu verificar uma unica banda com massa molecular estimada de 10 kDa como
previamente descrito (BREITHAUPT et al, 1974; AIRD et al., 1986).
Os perfis de migração eletroforética mostraram similaridade entre a CTX,
fração CB e uma banda majoritária no veneno total. Além disso, verificamos que a
massa molecular esperada da CB, tanto na amostra de CTX e de CB purificada,
esteve acima do esperado (14,5 kDa). Esses resultados foram também verificados
no estudo comparativo da CTX e subunidades CA e CB obtidas dos venenos de
C.d.terrificus, C.d.cascavella e C.d. collilineatus desenvolvido por Rangel-Santos
(2004). Somado a isso, não visualizamos a banda referente à subunidade CA na
amostra de CTX purificada.
Em continuidade ao proposto no projeto e considerando que as DCs
representam de 5-8 % das células dos tecidos linfoides secundários e que podem
ser geradas na forma imatura in vitro (WEIGEL et al., 2002; KARZUNKY et al., 2003;
WELLS, et al., 2005; BLYSZCZUK et al., 2013), decidimos avaliar 2 metodologias de
diferenciação destas células em cultura. Para tanto, avaliamos a diferenciação de
107
DCs a partir de medula óssea de camundongos utilizando somente o GM-CSF ou
GM-CSF e IL-4.
Os nossos resultados mostraram que a utilização do GM-CSF juntamente
com a IL-4 resultou em maior porcentagem de células CD11c+ em relação ao
protocolo realizado somente do GM-CSF.
Tal resultado também foi evidenciado por Son e colabordores (2002) quando
compararam o rendimento, fenótipo e função das DCs geradas somente com GM-
CSF ou com GM-CSF e IL-4. Os autores mostraram que a incubação das células de
medula óssea de camundongos com GM-CSF/IL-4 resultou maior porcentagem de
DCs em relação à cultura diferenciada somente com GM-CSF e que essas células
foram mais responsivas à estimulação e maturação com o LPS.
DCs imaturas expressando moléculas de superficie como, CD83, CD11c
dentre outras, migram desde a medula óssea até os tecidos periféricos onde
encontram o antígeno e são ativadas (MERAD et al., 2013). A alta capacidade
endocitica destas células é resultante da expressão de uma variedade de receptores
(PRRs) envolvidos no reconhecimento de antígenos/patógenos como os TLRs e os
CLRs como: MR e DC-SIGN (MOLL, 2003; ARBOLEDA et al., 2011).
No caso dos CLRs, foi mostrado que subpopulações de DCs e outras APCs
podem expressar diferencialmente esses receptores. Em murinos e humanos, o DC-
SIGN é altamente expresso em DCs derivadas de monócitos, mas não em
macrófagos, e está também presente em subpopulaçõe de DC imaturas e nos
tecidos linfoides (KAWAUCHI et al., 2014). DC-SIGN é um receptor imune inato
específico para DCs (GEIJTENBEEK et al., 2000).
Como mencionado, os TLRs são responsáveis pelo reconhecimento de
componentes específicos de micróbios, incluindo LPS de bactérias gram-negativas,
DNA CpG, flagelina dentre outros (UNDERHILL, 1999). No caso do TLR4, quando
este interage com LPS, ativa vias de sinalização como a dependente da proteína
MyD88 que promove a ativação de fatores de transcrição gênica, como NF-kB,
culminando com a ativação celular, regulação positiva de moléculas
coestimuladoras, MHC e liberação de citocinas pró-inflamatórias (XIANG et al.,
2013).
Em nossos resultados também verificamos que as DCs difererenciadas in
vitro com GM-CSF e IL-4 expressaram vários destes receptores como TLR1, 2, 4,
MR e DC-SIGN em maior intensidade que as células diferenciadas somente com
108
GM-CSF. Além disso, verificamos nas DCs diferenciadas com GM-CSF/IL-4
aumentou a expressão de moléculas de MHC de classe II e coestimuladoras após a
incubação dessas células com o LPS, demonstrando a maior capacidade de
ativação e maturação dessas células em relação às diferenciadas com GM-CSF.
Somado à esses resultados, verificamos que as DCs incubadas com LPS secretam
altos níveis de IL-12, TNF-α, IL-1β e IL-6, comprovando a sua ativação e maturação
celular que foi acompanhada pela indução de níveis menores de IL-10.
Labeur e colaboradores (1999) demonstram que DCs geradas somente com
GM-CSF apresentam um processo mais tardio de maturação em relação ao obtido
com DCs geradas com a combinação de GM-CSF e IL-4. Nesse mesmo trabalho, os
autores relatam que a produção de citocinas também foi maior pelas DCs
diferenciadas com GM-CSF/IL-4.
Em 2000, Hinkel e colaboradores mostraram que DCs diferenciadas com GM-
CSF/IL-4 secretaram grandes quantidades de IL-6, GM-CSF, IFN-ү e TNFα quando
estimuladas com lisado de carcinoma renal.
Os nossos resultados estão, portanto de acordo com outros estudos
evidenciando que a combinação de IL-4 e GM-CSF induz a geração de DCs com
maior potencial de maturação do que células geradas somente com GM-CSF. Como
mencionado, produtos microbianos podem ativar as DCs ou ainda, quando
adicionados juntamente com um antígeno pouco imunogênico podem promover a
ativação de DCs e a secreção de citocinas pró-inflamatórias (SHIBAKI; KATZ, 2002;
PETROVSKY; AGUILAR, 2004; LI et al., 2013). No entanto, outros antígenos
derivados de patógenos podem inibir a ativação das DCs como os secretados por
helmintos, bactérias, dentre outros (BABU et al., 2005 e 2006; BRATTIG et al., 2004;
VAN DER KLEIJ et al., 2002; VAN VLIET et al., 2008).
Neste contexto, analisamos inicialmente o efeito da CTX, CA e CB sobre a
viabilidade das DCs e verificamos que estas toxinas (nas concentrações estudadas),
assim como o LPS, não promoveram morte dessa população celular. Além disso,
verificamos que a adição das toxinas na cultura juntamente com o LPS também não
alterou a viabilidade das células. Estes resultados permitem concluir que qualquer
efeito observado nas DCs pela ação das toxinas não é resultante da indução de
morte celular.
As incubações das DCs somente com a CTX, CA ou CB mostram ainda, que
estas proteínas não são capazes de induzir a maturação das DCs in vitro quando
109
avaliada a expressão de moléculas coestimuladoras, MHC-II e a secreção de
citocinas pró-inflamatórias comparado ao observado com o LPS, o que pode indicar
baixa imunogenicidade ou efeito inibitório sobre essas células. É importante ressaltar
que a CTX promoveu aumento da expressão de moléculas de MHC-II em relação ao
obtido nas células mantidas em meio de cultura.
Considerando essas possibilidades, analisamos o efeito da CTX sobre a
maturação das DCs incubadas com o LPS. Pudemos verificar que a adição
simultânea da CTX (duas concentrações) com o LPS nas culturas de DCs resultou
na inibição da expressão das moléculas de MHC-II e coestimuladoras pelas células.
Além disso, esse efeito inibitório da CTX se extendeu à secreção das citocinas pró-
inflamatórias, o que sugere efeito modulador da toxina sobre processo de maturação
das DCs. Além disso, o conjunto de resultados permitiu verificar que esse efeito da
CTX foi dose-dependente.
Efeito inibitório também foi verificado em culturas de DCs incubadas com a
fração CB (maior dose testada) e LPS. Por outro lado, a subunidade CA não exerceu
qualquer efeito sobre as DCs incubadas in vitro com o LPS.
Resultados semelhantes foram publicados em uma série de trabalhos de
Sampaio e colaboradores (2003, 2005 e 2006). Nestes estudos também ficou
evidente que a CTX e a subunidade CB, mas não a CA, exercem potente efeito
modulador sobre as funções biológicas de macrófagos.
No entanto, vale ressaltar que diferentemente do observado em nossos
resultados, outros estudos descrevem que a administração da fração CA in vivo é
capaz de modular negativamente o desenvolvimento de doenças autoimunes em
modelo murino via inibição da migração celular ou ainda, inibir a proliferação de
linfócitos T in vitro cultivados com macrófagos (GARCIA et al., 2003; CASTRO et al.,
2007).
Considerando que CTX e CB adicionadas juntamente com o LPS nas culturas
de DCs foram capazes de inibir a maturação dessas células, avaliamos se a pré-
incubação das DCs com CTX e CB seria suficiente para modular a maturação das
células incubadas com o ligante de TLR4. Os resultados mostraram que o prévio
contato das DCs imaturas com a CTX ou CB foi capaz de inibir o efeito do LPS
sobre essas células, quando analisamos a expressão de moléculas de MHC-II e
coestimuladoras bem como a secreção de IL-6, TNF-α, IL-1β e IL-12. Além disso,
esse efeito foi mais acentuado nas culturas mantidas por mais tempo com as
110
proteínas. Verificamos ainda, que esse efeito modulador sobre as DCs incubadas
com LPS foi maior com a CTX. Portanto, esses resultados demonstram que o efeito
da CTX e CB sobre as DCs não é devido à alguma interação entre o LPS e as
proteínas.
Além desses resultados, observamos que a CTX e CB foram também
capazes de inibir o processo de maturação de DCs pré-incubadas com LPS. Assim
sendo, podemos sugerir que a CTX e CB desencadeiam nas DCs imaturas sinais
intracelulares que podem modular negativamente a ativação dessas células por um
potente ligante de TLR4, como o LPS.
Com relação à ligação da CTX em membranas celulares, Costa e
colaboradores (2013) demonstraram que esta toxina exerce efeito modulador em
macrófragos co-cultivados com células tumorais do tipo LLC-WRC 256 via
receptores peptídeo-formil e secreção de LXA4. Estes autores mostraram ainda, que
macrófagos pré-incubados com CTX inibem a proliferação de células tumorais LLC-
WRC 256, além de citocinas pró-inflamatórias como IL-6, IL-1β e TNFα.
Como descrito anteriormente, os receptores peptídeo formil (FPRs)
compreendem um pequeno grupo de proteínas que apresentam sete domínios
transmembranares acoplados à proteína G e que são expressos principalmente por
leucócitos fagocíticos de mamíferos. Os FPRs estão envolvidos na ativação celular e
na migração de leucócitos para o sítio inflamatório.
Esses receptores se ligam a diversos grupos de ligantes que apresentam em
sua composição peptídeos N-formil e não formil incluindo LXs, anexina-1 e
peptídeos liberados por neutrófilos. Os três principais FPRs são: FPR1, FPR2/ALX, e
FPR3 (YE et al., 2009; DEVCHAND et al., 2003; MADDOX et. al., 1997). Boc-2 é um
antagonista de FPR2/ALX e FPR1 e é utilizado para bloquear a ligação de LXs
assim como outros ligantes (MACHADO et al., 2006; STENFELDT et al., 2007;
SCANNELL et al., 2007).
Portanto, avaliamos o papel dos receptores formil peptídeo na modulação da
CTX e CB sobre as DCs utilizando o Boc-2. Os nossos resultados demonstraram
que a pré-incubação das DCs com o Boc-2 bloqueou o efeito inibitório da CTX e CB
sobre a expressão das moléculas coestimuladoras e de MHC de classe II em DCs
estimuladas com o LPS. Além disso, o Boc-2 bloqueou o efeito da CTX e CB sobre a
secreção das citocinas pró-inflamatórias. No entanto, não houve alteração na
produção de IL-10 na presença ou ausência da pré-incubação das DCs com o Boc-
111
2. Esses resultados mostram, portanto a participação dos FPRs no efeito da CTX e
CB sobre as DCs, assim como o descrito por Costa e colaboradores (2013).
A comparação entre os resultados obtidos com CTX e CB permitiram verificar
também, que o efeito da CTX sobre as DCs é mais potente do que o observado com
a subunidade CB isolada.
Essa observação pode ser explicada considerando os trabalhos que
descrevem que no complexo CTX, a subunidade CA atua como chaperona
direcionando a subunidade CB para seu alvo celular e impedindo que ocorra
interação inespecífica. O complexo CA:CB dissocia-se no momento da interação da
subunidade CB com membranas celulares e assim a CA é liberada para o meio
(CHANG et al., 1981; BON et al., 1988; RADVANYI et al., 1989; FAURE et al., 1993).
O papel da CA para a atividade fosfolipásica da CTX foi também confirmado
por Santos e colaboradores (2005). Os autores verificaram que uma glicoproteina
(CNF) presente no soro da serpente C.d.terrificus é capaz de neutralizar a atividade
enzimática da CTX. A afinidade da CNF pela subunidade CB no complexo CTX
promove o deslocamento da CA e assim, a formação de um novo complexo CNF-
CB, o qual impede a interação da CB com seu alvo na membrana celular.
Considerando que citocinas anti-inflamatórias (IL-10 e TGF-β) e mediadores
lipídicos como a LXA4 e PGE2 apresentam relevância como reguladores da ativação
celular e consequente geração da imunidade adaptativa, analisamos em nossos
experimentos a secreção desses fatores por DCs cultivadas com LPS, CTX, CB, CA.
Além disso, avaliamos a presença de DCs com expressão intracelular de IL-12 ou
IL-10 em culturas estimuladas com LPS, LPS e CTX ou LPS e CB.
Pudemos verificar que a CTX e CB promoveram maior secreção de IL-10
pelas DCs na presença ou não de LPS. Esse efeito também foi observado na
expressão de RNAm para TGF-β e IL-10.
Nas análises das DCs verificamos ainda, que a adição de CTX ou CB nas
culturas de DCs estimuladas com LPS resultou em maior porcentagem de células
CD11c+/IL-10+ em relação às CD11c+/IL-12+. A proporção inversa foi observada nas
culturas de DCs incubadas somente com LPS, sugerindo que as DCs apresentam
atividade moduladora e não inflamatória.
As dosagens de PGE2 e LXA4 mostraram maior produção desses mediadores
nas culturas de DCs incubadas com CTX ou CB. Além disso, a adição de CTX ou
112
CB em culturas de DCs incubadas com LPS promoveu aumento da produção
desses mediadores em relação ao obtido nas DCs incubadas somente com o LPS.
Assim como observado nas culturas de DCs, alta produção de PGE2 e LXA4
foi verificada em culturas de macrófagos incubados in vitro com CTX ou CB ou por
macrófagos obtidos de animais injetados com estas proteínas (SAMPAIO et al.,
2006; ZAMBELLI et al., 2008; MOREIRA et al., 2008) sugerindo papel desses
mediadores na ação dessas moléculas.
Outras proteínas animais também exercem efeito modulador como o
observado com a CTX e CB. Em um trabalho desenvolvido pelo nosso grupo de
pesquisa foi mostrado que componentes de alta massa molecular (PI) do Ascaris
suum (Asc) exercem efeito inibidor na expressão de moléculas coestimuladoras e
MHC de classe II em DCs modulando, assim, a sua capacidade para ativar as
células T específicas a OVA. Além disso, a IL-10 está diretamente envolvida neste
efeito do PI sobre essas células (SILVA et al., 2006).
Além disso, foi possível observar que TLR2 e TLR4 não estão envolvidos no
reconhecimento do PI e consequentemente no efeito sobre a atividade das DCs in
vivo. Em culturas de DCs diferenciadas in vitro foi verificado que o PI também inibe a
ativação dessas células induzida por ligantes de TLR2, TLR3 e TLR4 bem como a
secreção de IL-10, IL-6 e IL-12 (FAVORETTO et al., 2014).
Produtos solúveis de Trichuris suis (SPS) também são capazes de inibir a
maturação de DCs induzida pelo LPS, assim como a produção de mediadores pró-
inflamatórios, tais como TNF- α, IL-6, IL-12, além da LT-α (KLAVER et al., 2013).
Resultado semelhante foi publicado em trabalho realizado com antigenos
solúveis de ovo de Shistossoma mansoni (SEA). Glicoproteinas e glicolipideos
presentes nesse SEA não induzem a maturação de DCs in vitro assim como a e
secreção de citocinas pró-inflamatórias e IL-10. No entanto, a adição de SEA
juntamente com LPS (Salmonella typhosa) resulta na inibição da produção de IL-10,
IL-12, TNF-α e IL-6, expressão das moléculas CD80, CD86 e CD83 bem como a
capacidade dessas células de ativar e induzir a diferenciação de linfócitos T para o
subtipo Th1 (VAN-LIEMPT et al., 2007).
Como demonstrado por Chen e colaboradores (2013), DCs estimuladas com
dextrometorfano (DXM) e LPS apresentam menor expressão de moléculas
coestimuladoras e MHC em relação às células somente estimuladas com LPS.
113
Em outro trabalho foi mostrado que a incubação simultânea de DCs com
tripomastigotas (Tp) de Tripanossoma cruzi e LPS de Escherichia coli resulta em
menor expressão das moléculas coestimuladoras nessas células (PONCINI et al.,
2008). Em um trabalho mais recente de Poncini e colaboradores (2010) foi
evidenciado o papel da IL-10 na modulação induzida por T. cruzi sobre a ativação de
ERK, TLR4 e NF-κB nas DC.
Nesse contexto, Hamilton e colaboradores (2009) também mostraram que a
incubação das DCs com antígeno tegumentar da Fasciola hepatica (Fh Teg) e LPS
resulta em supressão da expressão das moléculas CD40, CD80 e CD86 assim como
inibição da secreção de IL-6, IL-10, TNF-α e IL-12. Além disso, verificaram que esse
efeito foi observado na expressão de NF-κBp65 em lisados de DCs incubadas por 2
horas com Fh Teg e LPS por 15, 30 e 60 minutos.
Em outro trabalho mais recente, foi demonstrado que a pré-incubação de DCs
com Fh Teg por 2,5 h seguida da adição de LPS por 5, 15, 30 e 60 minutos também
foi capaz de suprimir a expressão de proteínas Phospho-p-38, ERK e JNK
pertencentes aos membros da via MAPKs nessas células, as quais são vias de
sinalização envolvidas com a secreção de citocinas pró-inflamatórias (VUKMAN et.
al., 2013).
Visto que as DCs, dependendo do seu estado de ativação, podem induzir a
ativação, proliferação e diferenciação dos linfocitos T (ALLAVENA et al., 2000,
STEINMAN et al., 2003), avaliamos se o efeito da CTX e CB sobre as DCs seria
suficiente para modular a sua capacidade dessas células de ativar e induzir a
proliferação dos linfócitos T in vitro.
Neste sentido, utilizamos o ensaio de MLR para analisar a resposta
proliferativa de T obtidos de camundongos C57BL/6 co-cultivados com DCs (Balb/c)
incubadas com CTX ou CB. Pudemos verificar que as DCs previamente incubadas
com LPS promoveram alta resposta proliferativa dos linfócitos T. No entanto,
observamos redução da proliferação de linfócitos T nas culturas de DCs incubadas
com a CTX ou CB juntamente com o LPS. Além disso, não houve proliferação
celular significativa nas culturas com DCs incubadas somente com CTX ou CB ao
comparar com o grupo controle (LT + DC sem estímulo).
Com esse experimento podemos concluir que o efeito da CTX e CB sobre a
expressão das moléculas MHC-II e coestimuladoras na DCs foi capaz de interferir
com capacidade dessas células em apresentar os antígenos para os linfócitos T e
114
assim induzir a sua proliferação. Vale ressaltar, que não avaliamos com esse
experimento o potencial dessas DCs de induzir a diferenciação dos linfócitos em
subpopulações distintas. Esses experimentos serão alvo de novos estudos.
Son e colaboradores (2002) observaram também correlação direta entre
maior expressão de CD86 e CD40 e a capacidade das DCs de estimular a
proliferação de células T alogênicas ou ainda, de células TCD4+ específicas para
OVA.
Além disso, Arboleda e colaboradores (2011) mostraram que DCs imaturas
expressam níveis baixos de moléculas coestimuladoras e MHC de classe II e pode
induzir tolerância nas células T, enquanto que as DCs maduras expressam níveis
elevados destas moléculas. Esses mesmo autores descrevem ainda, que DC sem
estado intermediário de maturação apresentam capacidade reduzida de secretar
citocinas pró-inflamatórias.
O modelo in vitro de MLR foi também utilizado por Curran e colaboradores
(2014) para avaliar o potencial regulador de células CD4+CD25+Foxp3+. Assim, o
efeito regulador destas células Treg foi determinado sobre a capacidade de lise
celular por células TCD8+ de camundongos BALB/c co-cultivadas com esplenocitos
obtidos de camundongos C57BL/6. Este resultado comprova portanto, que a
geração de células Tregs pode causar supressão imune in vivo e assim apresentar
potencial estratégico em doenças autoimunes.
Considerando o obtido nesse estudo podemos concluir que a CTX e sua
subunidade CB são capazes de atuar diretamente sobre as DCs modulando a sua
atividade funcional. Essas células como elo entre imunidade inata e adaptativa
exercem papel fundamental no estabelecimento da imunidade adaptativa efetora.
Portanto, essas observações sugerem que os efeitos da CTX e suas subunidades
sobre a produção de anticorpos e imunidade celular relatados, possa estar
vinculados às ações sobre as células apresentadoras de antígenos, como as DCs.
Com isso podemos concluir que a ação da CTX e do CB poderiam fornecer novas
perspectivas em relação ao desenvolvimento de substâncias com propriedades
terapêuticas.
115
5. CONCLUSÕES
Os resultados apresentados nos permitiram verificar que:
O protocolo utilizando GM-CSF e IL-4 foi mais eficiente na geração de DCs
(CD11c+) a partir de medula óssea de camundongos em relação ao protocolo
utilizando somente GM-CSF;
As DCs imaturas geradas in vitro expressam PAMPS como TLR 1, TLR 2, TLR 4,
DC- SIGN e MR;
LPS é capaz de induzir a maturação de DCs resultando no aumento da
expressão de moléculas coestimuladoras (CD40, CD80 e CD86) e de MHC-II,
principalmente quando essas células são diferenciadas com GM-CSF + IL- 4;
A CTX promove o aumento da expressão de molécula MHC-II, mas não de
moléculas coestimuladoras;
A crotapotina e fosfolipase A2 não induzem aumento da expressão de moléculas
de MHC de classe II e coestimuladoras em DCs diferenciadas in vitro;
A crotapotina não exerceu efeito inibitório na expressão de moléculas
coestimuladoras e MHC de classe II em DCs incubadas com LPS;
CTX e a subunidade fosfolipase A2 inibiram a expressão de moléculas
coestimuladoras, MHC-II e citocinas pró-inflamatórias em DCs diferenciadas in
vitro e incubadas com LPS;
A CTX e CB induziram preferencialmente a secreção de citocinas anti-
inflamatórias IL-10, TGF-β e os eicosanoides PGE2 e LPXA4 pelas DCs em
resposta à estimulação com LPS.
DCs incubadas com LPS promoveram a proliferação de linfócitos T in vitro;
116
DCs incubadas com CTX ou CB juntamente com LPS não foram capazes de
promover a proliferação de linfócitos T in vitro.
117
REFERÊNCIAS
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