Análise da estrutura-função das saponinas purificadas QS21 ...livros01.livrosgratis.com.br/cp007513.pdf · Dirlei Nico Análise da estrutura-função das saponinas purificadas

Dirlei Nico

Análise da estrutura-função das saponinas purificadas QS21 de Quillaja

saponaria Molina e CP05 de Calliandra pulcherrima Benth e dos seus

potenciais adjuvantes na vacina FML contra a leishmaniose visceral murina

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-graduação em Ciências

(Microbiologia), Instituto de Microbiologia

“Prof. Paulo de Góes”, da Universidade

Federal do Rio de Janeiro, como parte dos

requisitos necessários à obtenção do título

de Mestre em Ciências (Microbiologia).

Orientadora: Profa. Clarisa B. Palatnik de

Sousa.

Rio de Janeiro

2006

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iii

Ficha catalográfica

Nico, DirleiAnálise da estrutura-função das saponinas purificadas QS21 de

Quillaja saponaria Molina e CP05 de Calliandra pulcherrima Benth edos seus potenciais adjuvantes na vacina FML contra a leishmaniosevisceral murina/ Dirlei Nico. – Rio de Janeiro: UFRJ/IMPPG, 2006.

xi, 125 fl. Il.; 31 cm.Orientadora: Clarisa B. Palatnik de Sousa.Dissertação (mestrado) – UFRJ/IMPPG/ 2006Referências Bibliográficas: f. 63-77.

1-Adjuvantes 2- Saponina 3- Leishmania

I. Palatnik de Sousa, CB. II.Universidade Federal do Rio de Janeiro,

Instituto de Microbiologia “Prof. Paulo de Góes”. III. Título



iv

Trabalho realizado no Laboratório de

Biologia e Bioquímica de Leishmania,

Departamento de Microbiologia Geral do

Instituto de Microbiologia “Prof. Paulo de

Góes” da Universidade Federal do Rio de

Janeiro, sob a orientação da Profa. Clarisa B.

Palatnik de Sousa.



v

Aos meus queridos pais, Maria

Aparecida e Adrialino

Aos meus grandes e verdadeiros amigos



vi

Agradecimentos

A Deus pela sua presença, infinita sabedoria e iluminação sempre que pedi. Pela

oportunidade de ser sempre testada e poder vencer as lutas de cada dia.

Aos Meus pais Maria Aparecida e Adrialino, pelos afagos mesmo que à distância,

dedicação, exemplo de trabalho, caráter e honestidade.

À Profa. Clarisa pela orientação neste trabalho, pela oportunidade de aprender cada vez

mais e por sempre me ajudar a alcançar a melhor opção. Pela dedicação e confiança neste

trabalho.

Ao Prof. Parente e Profa. Bernadete pelas saponinas.

À Fernanda, se não fosse você tudo teria sido mais difícil. Muito obrigada pela amizade,

cuidados, brincadeiras, passeios e tantas outras coisas....

À Roberta, pela oportunidade e incentivo. Você deu o primeiro passo para iniciar essa

longa caminhada. Obrigada por acreditar em mim!

À Lucieri, você sempre me deu muita força e me ensinou a acreditar mais em mim.

À Gulnara pela dedicação e paciência. Pela companhia nos momentos de dificuldade e em

todos os momentos que sempre precisei de seus conhecimentos e de sua experiência

laboratorial.

À Juliana, sempre pronta a ajudar e aliviar as minhas dores físicas.

À Luciana, pela amizade e companheirismo.

Ao Sr Luiz e ao Sr Nivaldo, pela atenção e prestação de serviços de limpeza e

organização.

À todas as “meninas” do laboratório 36 pelas incontáveis horas extras e dias de intensa

agitação. Pela solidariedade nos experimentos, paciência nos tantos momentos de

sensibilidade e lágrimas. Mesmo com tanto trabalho e inquietações, acredito que sempre

nos divertimos bastante!!!!

À Carla, sua amizade tem promovido uma grande diferença. Obrigada pela companhia,

compreensão, conversas, carinho e amizade. E pela disposição em me ajudar sempre.

À Luciana Búrigo, sempre pronta para uma boa conversa, sempre amiga.

A todos os laboratórios do CCS, colegas, amigos e funcionários pelo auxílio fornecido

sempre que necessário.



vii

Ao Instituto de Microbiologia “Prof. Paulo de Góes” da UFRJ na pessoa da sua

Diretora Profa. Ângela Hampshire de Carvalho Santos.

Aos professores e secretárias do curso de Pós-graduação em Ciências (Microbiologia) na

pessoa da Coordenadora Profa. Thaís Souto-Padrón.

À Dilma, pela demonstração de educação, respeito e bom tratamento aos alunos. Pelas

palavras de incentivo e compreensão, seu trabalho foi sempre muito bem executado.

À Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (CAPES), ao Conselho

Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), ao Programa RHAE-

CNPQ (Programa de recursos humanos em áreas estratégicas), e ao Programa de Apoio a

Núcleos de Excelência (PRONEX) e Programa Cientista de Nosso Estado da Fundação de

Amparo à Pesquisa do Rio de Janeiro-(FAPERJ) pelo auxílio á pesquisa e pelas bolsas

dispensados durante a realização deste trabalho.

Recebam meu sincero MUITO OBRIGADA!



viii

RESUMOSaponinas são conjugados de triterpenos, alcalóides ou esteróides e carboidratos que

apresentam potencial adjuvante nas preparações vacinais. As saponinas QS21 de Quillaja

saponaria Molina e CP05 de Calliandra pulcherrima Benth têm açúcares ligados no C-3 e

no C-28 do triterpeno. A QS21 apresenta um grupo aldeído no C-4, e dois

normonoterpenos na cadeia de carboidrato acilada no C-28 do triterpeno. Já a saponina

CP05 carece do aldeído, porém apresenta três monoterpenos ligados ao C-28 e açúcares

ligados ao C-3 e ao C-28 do triterpeno.

Analisamos comparativamente as saponinas CP05 e QS21, íntegras ou oxidadas

com 50mM de periodato de sódio, ou alternativamente, a saponina CP05 íntegra ou, com a

fração hidrofóbica, as frações glicídicas ligadas ao C-28 e/ou ao C-3 removidas por

hidrólises químicas, com relação ao seu potencial adjuvante na vacinação contra

leishmaniose com o antígeno FML de Leishmania (L.) donovani, no modelo murino de

leishmaniose visceral americana. Os resultados obtidos permitiram identificar a relevância

das cadeias de carboidrato e parcialmente da cadeia hidrofóbica na toxicidade secundária, a

importância do carboidrato associado ao C-28 na indução global de anticorpos, do aldeído

no C-4 da QS21 na indução de IgG2a e da sapogenina na indução de IgG1. A cadeia

hidrofóbica influencia predominantemente a indução de intradermorreação (IDR) e de

proliferação de linfócitos in vitro e parcialmente na expansão de linfócitos CD4 e CD8. As

cadeias de carboidrato por outro lado, também estão envolvidas com a secreção de

interferon-ã relacionada à expansão de CD4+ e finalmente com a redução da carga

parasitária e a sobrevivência gerada pela vacinas. Finalmente, caracterizamos a saponina

CP05 de Calliandra pulcherrima Benth como um novo candidato a adjuvante para

vacinação contra a leishmaniose visceral. Estes resultados contribuirão para o futuro

desenvolvimento de adjuvantes sintéticos.



ix

SUMMARYSaponins are conjugate of triterpenes, steroidal glycolakaloid or steroids and

carbohydrates which show adjuvant potential in vaccine formulations. The QS21 saponin

from Quillaja saponaria Molina and the CP05 saponin from Calliandra pulcherrima Benth

have sugar units linked to the C-3 and C-28 triterpene nucleus. QS21 has an aldehyde group

attached to the C-4 triterpene and two normonoterpenes in the C-28 triterpene acylated

sugar chain, while the CP05 saponin lacks the aldehyde group but shows three

monoterpenes linked to the C-28 triterpene acylated hydrophobic chain.

We comparatively analyzed the CP05 and QS21 saponins, either intact or oxidized

with 50mM Na periodate, or alternatively, the intact CP05 saponin, or the saponin with the

hydrophobic chain, the glycidic fractions attached to C-28 and /or C-3 removed by

chemical hydrolysis, regarding their adjuvant potential in vaccination against visceral

leishmaniasis with the FML antigen of Leishmania (L.) donovani, in the murine

leishmaniasis model. Our results disclosed the relevance of the carbohydrates and partial

contribution of the hydrophobic moiety in the mild toxicity of CP05, of the C-28 associated

carbohydrates in the global anti-FML antibody response, of the QS21 C-4 attached

aldehyde in the IgG2a subtype induction and of the sapogenin in the IgG1 subtype increase.

The hydrophobic chain modulates the IDR induction and the in vitro splenocyte

proliferation and has also participation in the expansion of the CD4+ and CD8+

lymphocyte populations. The carbohydrate moieties, on the other hand, are involved in the

IFNã secretion by the CD4+ cells and in the reduction of parasite burden and survival

increase, due to the vaccine treatments. Our results also pointed out the CP05 saponin from

Calliandra pulcherrima Benth as a potential new adjuvant candidate for vaccination against

visceral leishmaniasis and contributed to the future development of synthetic adjuvants.



x

Lista de abreviaturas

APC – Células apresentadoras de antígenos

BCG - Bacilo de Calmette-Guérin

BHI – infusão de cérebro e coração

CHO – função química aldeído

Con A – concanavalina A

CP05 – saponina CP05 da Calliandra pulcherrima Benth

CTL – linfócitos citotóxicos

DC – célula dendrítica

DDAB - dimetil-dioctadecil-brometo de amônia

DEAE – dietil-amino-etil dextrana

DMSO – sulfóxido de dimetila

DNA – ácido desoxirribonucléico

FCA – adjuvante de Freund completo

FIA – adjuvante de Freund incompleto

FML – ligante de fucose e manose

HIV – vírus da imunodeficiência

IDR -intradermorreação

IFN-ã – interferon ã

ISCOM – complexo imunoestimulante

IL – interleucina

KDa- quilodalton

LDU -“Leishman Donovan Units of Stauber“

LPS – lipopolissacarídeo bacteriano



xi

LD1S – Leishmania donovani cepa 1S-Sudão

LV – Leishmaniose visceral

MDP - muramil dipeptídio

MHC – complexo maior de histocompatibilidade

MPL – monofosfolipídio A de Salmonella minnesota

NK – “natural Killer”

OMS – Organização Mundial de Saúde

PRRs – receptores de reconhecimento de patógenos

QS – Quillaja saponaria

Sc – subcutânea



xii

ÍNDICE PáginaI – Introdução 11.1 Adjuvantes 11.2 Tipos de adjuvantes 31.2.1 Adjuvantes imunoestimulatórios 41.2.2 Outros adjuvantes não particulados 51.2.3 Sistemas de liberação particulados para o antígeno 61.2.3.1 Patículas lipídicas 71.2.3.2 Micropartículas como adjuvantes 91.2.3.3 Outros adjuvantes particulados 91.3 A saponina de Quillaja saponaria Molina: QS21 91.4 A saponina de Calliandra pulcherrima Benth: CP05 121.5 Leishmanioses 151.5.1 A Leishmaniose visceral no Mediterrâneo e nas Américas 161.5.2 Formas de controle 181.6 Vacinação contra Leishmaniose 191.7 A vacina FML 20II- Objetivos 23III- Material e Métodos 243.1 Obtenção do antígeno FML de L.(L.) donovani (LD1S) 243.1.1 Manutenção de amostras de L. (L.) donovani (LD1S) in vitro 243.1.2 Obtenção de massa de células para extração do FML 243.1.3 Extração e purificação do complexo glicoprotéico FML depromastigotas de L.(L.) donovani

24

3.2 Obtenção da saponina CP05 de Calliandra pulcherrima 253.3 Obtenção da saponina QS21 253.4 Avaliação comparativa do efeito da degradação dos carboidratosna função adjuvante das saponinas QS21 e CP05, no modelo deleishmaniose visceral murina

25

3.4.1 Teste de toxicidade in vivo 273.5 Avaliação comparativa do efeito seletivo da remoção da cadeia demonoterpenos, ou da fração completa ligada no C-28 (monoterpenose açúcares), ou de ambas as frações ligadas ao C-3 e ao C-28 dotriterpeno, na função adjuvante da saponina CP05

27

3.5.1 Obtenção das frações da saponina CP05 e teste in vivo 273.6 Ensaios imunológicos 283.6.1 Análise dos níveis de IgG total e subtipos, IgA e IgM –Utilizando o método do FML-ELISA

28

3.6.2 Resposta de intradermorreação (IDR) ao lisado de L.(L.) 29



xiii

donovani3.6.3 Proliferação in vitro de esplenócitos totais contra antígenos deLeishmania

29

3.6.4 Dosagem de IFN-ã nos sobrenadantes de esplenócitos 313.6.5 Fenotipagem de esplenócitos por citometria de fluxo 323.7 Determinação de carga parasitária – LDU (“Leishman DonovanUnits”)

32

3.8 Análise estatística 32IV- Resultados 334.1 Avaliação comparativa do efeito da degradação dos carboidratosna fração adjuvante das saponinas QS21 e CP05, no modelo deleishmaniose visceral murina

33

4.2 Avaliação comparativa do efeito seletivo da remoção da cadeia demonoterpenos, ou da fração completa ligada no C-28 (monoterpenose açúcares), ou de ambas as frações ligadas ao C-3 e ao C-28 dotriterpeno, na função adjuvante da saponina CP05

35

V- Discussão 52VI- Conclusões 62VII- Referências Bibliográficas 63VIII- Anexos 78IX- Outras publicações no período 92



1

I – Introdução

1.1 Adjuvantes

O termo adjuvante é oriundo do latim adjuvare que significa ajudar. São substâncias

adicionadas a antígenos imunogênicos que imunopotencializam a resposta imune contra os

mesmos. Essas substâncias vem sendo usadas para melhorar a eficácia de vacinas desde a

década de 1920 (Cox & Colter, 1997). A pesquisa por novas substâncias adjuvantes tem

sido crescente nos últimos anos, uma vez que, essas substâncias promovem resultados

bastante satisfatórios no desenvolvimento de vacinas de baixa eficácia.

Originalmente os adjuvantes eram classificados de acordo com os seus mecanismos

de ação:

1) Imunomodulação, que consiste na habilidade de modificar a produção de citocinas, a

produção de anticorpos específicos e de isotipos (revisado por Cox et al., 2006).

2) Estimulação de resposta citotóxica. Para este fim, os adjuvantes geralmente necessitam

da presença do antígeno no citosol possibilitando a ligação do antígeno com a molécula de

complexo maior de hiscompatibilidade 1(MHC-1). Acredita-se que o adjuvante promova a

interação do antígeno com a membrana celular ou endossomal tornando o antígeno

disponível no citosol (revisado por Cox et al., 2006).

3) Indução de imunidade de mucosa. Os adjuvantes desta via simulam patógenos que são

reconhecidos por receptores da mucosa intestinal. Utilizam-se, por exemplo, as toxinas

coléricas ou de Escherichia coli termolábil modificadas geneticamente, de maneira que

possam ser reconhecidas pelo epitélio sem induzirem a patologia digestiva (Singh &

O’Hagan, 2003).

4) Capacidade de direcionamento (alvo), revelando a capacidade do adjuvante de

entregar o antígeno para as células efetoras do sistema imune (revisado por Cox et al.,

2006).

5) Geração de depósito, que é a capacidade que o adjuvante apresenta de reter o antígeno

no sítio de administração e, assim promover sua liberação lentamente. Desse modo, obtém-

se como resultado um estímulo mais prolongado (revisado por Cox et al., 2006).

Os adjuvantes atuam na modulação da resposta imune, agindo como intermediários

entre o sistema imune e o local de administração da vacina, promovendo sinais



2

estimulatórios mais fortes (Schijns, 2003). Durante os últimos anos, muitos outros

adjuvantes tem sido estudados e novas formulações têm sido desenvolvidas, incluindo

proteínas produzidas por tecnologias recombinantes e peptídeos sintéticos (Allison, 1998).

A classificação dos adjuvantes também pode ser baseada na sua natureza química,

propriedades químicas e físicas, capacidade de estimular a resposta Th1 ou Th2, ou ainda

pela capacidade de estimular a imunidade inata ou adaptativa (Marciani, 2003).

Mais recentemente foi considerado importante o conceito da “localização

geográfica” que implica na necessidade do contato íntimo das células do sistema imune

(revisado por Schijns, 2003). Acredita-se que os adjuvantes, no local da aplicação da

vacina, auxiliem ao antígeno no envio do sinal 1 para os órgãos linfóides secundários (baço

e linfonodos drenantes), diretamente ou através de células apresentadoras de antígeno e/ou

dendríticas sentinelas (Schijns, 2003). De acordo com o tipo de adjuvante, pode-se mudar o

tempo de contato da vacina com o sistema imune, o local de aplicação e concentração do

antígeno utilizado. Assim, os adjuvantes podem garantir uma concentração adequada de

antígeno exposta durante um período de tempo suficiente (Schijns, 2003).

Um grupo de células dendríticas (DC) imaturas que circulam pelos tecidos

periféricos funcionam como "sentinelas", captando e removendo os antígenos exógenos e

transportando-os até os linfonodos, onde já sob a forma de células dendríticas maduras,

apresentam os antígenos processados às células T. As células dendríticas são as APCs

(células apresentadoras de antígeno) mais eficazes, entretanto, macrófagos também podem

desenvolver esta função (Singh & O’Hagan, 2003; Schijns, 2003; revisado por O`Hagan &

Rappuoli, 2006).

O sistema imune deve reconhecer entre antígenos "self" e antígenos "non-self"

infecciosos. Entre os "non-self" existem antígenos conservados de microorganismos como:

LPS, lipoproteínas bacterianas, peptidoglicanas e motivos CpG, que são abundantes em

DNA de bactérias e menos em DNA eucariontes. Estas estruturas são conhecidas como

PAMPs ("pathogen associated microbial patterns"). São reconhecidos por receptores em

células do sistema imune tais como os "Toll", receptores para manose, ou receptores para

complemento, chamados coletivamente de PRRs ("Pathogen Recognition Receptors") .

Estes receptores estão presentes em várias APCs inclusive em DC. A ativação dos PRRs

pelos PAMPs induz uma ativação intracelular de citocinas pró-inflamatórias, quimiocinas e



3

o aumento da expressão de moléculas co-estimulatórias de membrana, o que resulta na

ativação subseqüente do sistema imune (Singh & O’Hagan, 2003; Schijins, 2003; O’Hagan

& Rappuoli, 2006; Cox, et al., 2006).

Sabe-se, por exemplo, que o LPS, o Lipídio A e o MPL (monofosforil lipídio A de

Salmonella minnesota) são reconhecidos através do receptor Toll 4; as seqüências de CpG

de DNA são reconhecidas através do receptor Toll 9; o RNA viral através do Toll 3; a

flagelina através do Toll 5; a peptidoglicana, lipoproteínas e zimosan através dos Toll 1-6

(Rhodes , 2002; revisado por Cox et al., 2006).

Os adjuvantes então, simulando os antígenos “non-self” infecciosos, facilitam a

geração e aumento da expressão dos sinais co-estimulatórios na superfície de APCs, como

por exemplo: as famílias de ligantes B7, os ligantes CD40 e citocinas mediadoras.

Dois sinais simultâneos são necessários para a estimulação eficiente das células T.

Ao mesmo tempo em que as APCs apresentam o antígeno processado via MHCII aos

receptores TCR dos linfócitos, os ligantes B7 se ligam aos CD28 na superfície dos

linfócitos fazendo a co-estimulação, o que resulta na ativação das células T. As células T

ativadas expressam um novo receptor, o CTLA-4, que se liga com alta afinidade ao B7

bloqueando-o, e assim regulando a ativação de células T (Rhodes, 1996; Marciani, 2003).

Alguns estudos revelam que os ligantes B7-1 promovem uma maior ativação de linfócitos

TH1 e que os ligantes B7-2 promovem a ativação de linfócitos TH2 (Marciani, 2003). A

elucidação da estrutura do ligante B7 e do mecanismo da co-estimulação promoveu o

desenvolvimento de adjuvantes e imunoterápicos que podem simular ou substituir o B7

(Rhodes, 1996).

Os adjuvantes, portanto, podem auxiliar nos mecanismos ligados à síntese dos

membros da família B7, ligantes CD40 e citocinas. Além disso, alguns adjuvantes podem

além de atuar facilitando o sinal 1 e 2, atuar no envio de um sinal 3 que influencia na

qualidade da resposta imune (Schijns, 2003).

1.2 Tipos de adjuvantes: imunoestimulatórios e particulados

Atualmente a capacidade de um adjuvante formar partículas ou não, tem sido um dos

critérios mais utilizados para agrupá-los de modo comparativo e racional.



4

1.2.1 Adjuvantes imunoestimulatórios:

•MPL - Monofosforil Lipídio A. É um derivado de LPS de Salmonella minnesota,

que por sua vez, pode ser classificado como um PAMP. Assim como LPS, age no receptor

Toll4 das células apresentadoras de antígenos profissionais, que promovem a liberação de

citocinas IL2, IFN-ã que induzem resposta TH1. Foram gerados vários derivados sintéticos

de acordo com o estudo da função-estrutura do MPL, entre eles o RC-529 (Singh &

O’Hagan, 2003).

•Motivos CpG (dinucleotídios citosina fosfodiéster guanina). Oriundos de DNA

bacteriano, se encontram ausentes em DNA de vertebrado (que é metilado). Os CpG não

metilados apresentam-se em seqüências flanqueadoras (1 a 16 nucleotídeos) que são

reconhecidas pelo sistema imune inato como se fosse DNA derivado do patógeno. As

respostas ao CpG são mediadas pelo receptor Toll9. O efeito adjuvante, indutor de resposta

Th1 do CpG, é maximizado pela conjugação com proteínas ou em formulações de sistemas

de liberação (revisado por Singh & O’Hagan, 2003 e Cox et al., 2006).

•Saponinas da Quillaja saponaria Molina. São substâncias bastante utilizadas em

vacinas veterinárias (Schetters et al., 2006; Morein et al., 2004 e Borja-Cabrera et al.,

2002) e humanas (Slovin et al., 2005; Ragupathi et al., 2003). Destacam-se pela

capacidade de induzirem potente resposta Th1, aumentarem os níveis de IgG2a, IFN-ã e

IL2. Um dos mecanismos de ação propostos é que as saponinas se intercalam nas

membranas celulares através da sua fração hidrofóbica ocasionando a formação de poros, o

que facilita a apresentação do antígeno pela via MHC-1 e assim, promovem o aumento da

resposta CTL. Também foi descrito que a presença do grupo aldeído no C-4 permite que a

saponina mimetize o ligante B7 aumentando o estímulo de APCs sobre linfócitos helper

CD4 (TH1) (revisado por Marciani, 2003; Singh & O'Hagan, 2003).

Denominam-se saponinas, moléculas complexas de alto peso molecular, que se

apresentam sob a forma de conjugados naturais de triterpenos, esteróides ou glico-

alcalóides esteroidais com uma ou mais cadeias de açúcares (Osbourn, 1996a; Osbourn,

1996b). O termo saponina faz referência à sua propriedade clássica detergente, que por sua

vez, está relacionada com a natureza anfipática da molécula (uma porção glicídica que é



5

hidrofílica e uma aglicona ou sapogenina que é hidrofóbica). Algumas funções

farmacológicas podem ser atribuídas as saponinas: atividade anti-tumoral; anti-úlceras;

forte efeito fungicida e importante atividade adjuvante (Osbourn, 1996a; Osbourn 1996b).

A Quil–A é uma mistura de saponinas da Quillaja saponaria Molina que contém: a

QS-7, QS-17, QS-18 e QS21 (Kensil et al., 1991). A saponina QS21 mostrou-se a mais

potente de todas na produção de anticorpos (IgG2b e IgG2a), sendo menos letal para

camundongos, e também como forte adjuvante em testes clínicos fase I e II em humanos,

contra HIV-1, malária e melanoma e contra pneumococos em indivíduos idosos (revisado

por Soltysik et al., 1995). A saponina QS21 promove aumento das respostas Th1, Th2 e

também da resposta CTL.

Em condições alcalinas ou em soluções aquosas, a saponina QS21 não é estável e

perde a fração ligada no C-28, que é responsável pela sua toxicidade e pela resposta CTL

(Kensil et al., 1998). Recentemente, a QS21 está sendo usada em combinação com a QS-7

que não possui os normonoterpenos e, portanto, não é hemolítica. A QS21 pode ser usada

por via intranasal, oral e sistêmica injetando-se em concentrações menores que pela via

subcutânea (Kensil et al., 1998).

1.2.2 Outros adjuvantes não particulados

• Citocinas. São glicoproteínas com peso molecular de aproximadamente 20 kDa

que desempenham várias atividades. A citocina IL-2 tem sido testada extensivamente em

humanos como um imunopotencializador, gerando ativação de resposta de células T CD8+

(Kornbluth & Stone, 2006).

As atividades de IL-12 despertaram maior interesse, pois destacam-se como indutora

precoce de IFN-γ, pela promoção da diferenciação de células T helper progenitoras para

Th1 (Handman, 2001), além de induzir (indiretamente, através do IFN-γ) a diferenciação de

células B para secretarem subtipos citofílicos de imunoglobulinas. Devido a estas

características, atualmente tem sido testado amplamente o potencial adjuvante da IL-12

para promoção da imunidade celular e humoral, principalmente no caso de patógenos

intracelulares (protozoários do gênero Leishmania, por exemplo) (Singh & O’Hagan,

1999). Adicionalmente, as citocinas podem ser tóxicas, apresentando um potencial de auto-

imunidade (Singh & O’Hagan, 1999).



6

• Polímeros de carboidratos. Os principais polímeros de carboidratos utilizados são

as mananas e glucanas. Estas são utilizadas em vacinas experimentais misturadas ou

conjugadas aos imunógenos. De modo geral, podem estimular macrófagos (via receptor

para manose e via dectina) e induzir resposta celular do tipo Th1 (Cox et al., 2006).

• Polissacarídeos derivados. São oriundos de dextranas sulfatadas de alto peso

molecular ou ainda de dietil-amino-etil dextranas (DEAE). São bastante utilizados em

vacinas veterinárias. A sua ação provável se efetua através da saturação de células de

Kuppfer e na promoção de mitogenicidade dos linfócitos T ou B (Cox et al., 2006).

• Muramil dipeptídio (MDP). O N-acetil muramil-L-alanil-D-isoglutamina é um

análogo sintético do componente ativo da parede de micobactérias. Quando administrado

com salina, aumenta a resposta humoral. Por outro lado, quando associado ao adjuvante

completo de Freund (FCA) ou lipossomas, aumenta a resposta celular. Adicionalmente,

derivados com aminoácidos hidrofílicos induzem Th2, enquanto derivados hidrofóbicos

estimulam Th1 (Cox et al., 2006).

1.2.3 Sistemas de liberação particulados para o antígeno:

Os adjuvantes particulados (emulsões, micropartículas, complexos imunoestimulantes

(ISCOMS), lipossomas, virossomas, partículas virais) possuem dimensões comparáveis aos

patógenos que são combatidos pelo sistema imune. Uma possibilidade interessante é a

inclusão de adjuvantes imunoestimulatórios em formulações particuladas, restringindo a

sua liberação sistêmica ou modulando a resposta desejada (Singh & O’Hagan, 2003).

•Sais de alumínio. Os sais de alumínio são insolúveis e formam precipitados com

tamanho que varia de 100 a 1000 çm. O imunógeno está ligado por interações eletrostáticas

ao gel pré-formado ou durante a sua formação (Cox & Coulter, 1997). Estão entre os

poucos adjuvantes licenciados para utilização em humanos (Singh & O’ Hagan, 1999) e

promovem o efeito de depósito do antígeno, estimulando a formação de granulomas, síntese

de IL-1, ativação do complemento e imunidade mediada por anticorpos (Nicklas, 1992). É

um dos adjuvantes mais utilizados, com capacidade de induzir resposta imune Th2 que está

associada à produção de IL-4 e anticorpos IgE (O`Hagan & Rappuoli, 2006). Em

camundongos, a alumina estimula principalmente IgE e IgG1 (Nicklas, 1992).



7

•BCG. O Bacilo Calmette-Guérin, cepa atenuada de Mycobacterium bovis, é

amplamente utilizado na imunização contra a tuberculose. No desenvolvimento da

resistência específica adquirida contra antígenos de micobactérias, a vacinação com o BCG

induz resposta imune modificada para antígenos heterólogos e potencialização de resposta

humoral e celular contra antígenos protéicos. Observa-se produção de anticorpos IgG2a e

indução de resposta Th1. A administração de uma vacina BCG-Leishmania demonstrou

produção de altos níveis de IFN-ã e estímulo da produção de IL-12 (revisado por Masihi,

2003). O BCG tem sido associado como imunopotencializador em vários esquemas de

vacinação. Uma infecção com o BCG induz: a ativação local ou sistêmica de macrófagos,

aumento dos níveis de IFN-ã, a formação de granuloma e estimulação de linfócitos CD4+ e

CD8+. O poder adjuvante do BCG tem sido avaliado em vacinas contra as diversas doenças,

como babesiose, malária e leishmanioses (camundongos, cães, macacos e humanos)

(revisado por Masihi, 2003).

1.2.3.1 Partículas lipídicas:

• Adjuvante completo de Freund (FCA), é uma emulsão água-óleo, bastante

potente, porém apresenta determinada toxicidade e sua formulação contém micobactérias

mortas. Já o adjuvante incompleto de Freund (FIA), é uma emulsão isenta de

micobactérias mortas. O FIA tem sido utilizado em vacinas veterinárias possuindo um forte

poder adjuvante, porém, não é utilizado em preparações vacinais para humanos. É

composto por microgotas de água que são estabilizadas por um surfactante numa fase

oleosa contínua (óleo mineral ou esqualeno). O clássico (FIA), consiste de uma emulsão

água-óleo, de óleo mineral estabilizado pelo agente emulsificante Arlacel A. A emulsão

promove a retenção do antígeno no local da injeção e, desta forma acarreta uma resposta

granulomatosa. Promove a indução de resposta imune celular e humoral (Singh &

O’Hagan, 2003).

•Emulsões óleo/água: São microgotas de óleo (esqualeno de tamanho aproximado

200ηm) estabilizadas por surfactantes (Tween 80 ou Span 85) em fase aquosa. Este

adjuvante foi avaliado como seguro e potente para vacinas humanas com os vírus HIV,

HSV e influenza (Singh & O’Hagan, 2003). Neste sentido, foram realizados testes clínicos



8

em mais de 30 mil indivíduos, sendo bem tolerado e seguro. Syntex é um adjuvante em

óleo biodegradável (esqualeno) que contém um componente de parede celular bacteriana

treonil muramil dipeptídeo e um surfactante. Por outro lado, o esqualeno em emulsão

óleo/água, o MF59, se mostrou seguro e eficaz e está sendo aplicado em vacinas

veterinárias e licenciado para uso humano na Itália. As emulsões tem sido usadas como

sistemas de liberação de QS21 e MPL (Singh & O’Hagan, 2003).

•Lipossomas. Consistem de partículas artificialmente preparadas de bicamadas

fosfolipídicas, separados por um compartimento aquoso. Originalmente, os lipossomas

foram desenvolvidos para serem utilizados como carreadores de drogas e outras substâncias

biologicamente ativas (revisado por Singh & O’Hagan, 2003). Experimentalmente, os

lipossomas têm sido utilizados como adjuvantes com vários antígenos. Os lipossomas

podem variar na dimensão, composição (diferentes fosfolipídios e conteúdo de colesterol),

carga (resultado da carga dos componentes fosfolipídios) e estrutura (uni ou multilamelar).

Eles estimulam resposta humoral e celular (revisado por Singh & O’Hagan, 2003).

•Virossomas. São lipossomas unilamelares contendo principalmente fosfatidilcolina

com hemaglutinina do vírus Influenza intercalando a membrana. Tal processo utiliza

propriedades de direcionamento e fusogenicidade das proteínas do vírus Influenza, o que

resulta numa eficaz liberação dos antígenos encapsulados dentro dos citoplasmas para

indução de CTL (revisado por Singh & O’Hagan, 2003).

•Arqueossomas. São vesículas preparadas com lipídios polares de Archaea, sendo

que em alguns estudos demonstraram que os arqueossomas apresentam maior poder

adjuvante que os lipossomas (revisado por Singh & O’Hagan, 2003).

•ISCOMs. São partículas de 40 çm compostas de colesterol, fosfolipídios e

saponinas de Quillaja saponaria Molina. Essa preparação reduz a toxicidade destas

saponinas, diminuindo sua ação hemolítica (revisado por Singh & O’Hagan, 2003 e por

Morein et al., 2004). No ISCOM a saponina encontra-se ligada ao colesterol e não interage

livremente com as membranas celulares. Está estabelecido que os ISCOMs induzem

resposta Th1 e Th2 e de citocinas pró-inflamatórias (Cox et al., 2006). Os ISCOMs têm

sido estudados em vários modelos animais e uma vacina contra Influenza eqüina, usando

ISCOMs, está licenciada na Suíça (revisado por Singh & O’Hagan, 2003; Morein et al.,

2004; Cox et al., 2006).



9

•Niossomas: São vesículas lipídicas não-iônicas que tem demonstrado potentes

respostas em modelos de animais pequenos (revisado por Singh & O’Hagan, 2003).

1.2.3.2 Micropartículas como adjuvantes:

São partículas muito pequenas e sólidas de 10-1000nm e 1-100µm formadas por

polímeros biodegradáveis. De modo geral, apresentam boa resposta imune, induzem

depósito com longo prazo de duração e constituem a melhor opção para vacinas múltiplas

com dose única (revisado por Singh & O’Hagan, 2003). Prolongam o tempo de contato do

antígeno com o sistema imune, que é necessário e importante na indução de resposta imune

celular (O’Hagan & Rappuoli, 2006). A sua preparação é difícil devido a sua alta

heterogeneidade. Entre os benefícios dos sistemas de liberação controlada, pode-se citar a

liberação em sítios específicos; proteção do antígeno contra degradação e maior eficiência,

o que pode gerar a diminuição no número de doses. Entre os sistemas mais utilizados, estão

as micro-esferas de polilactídeo co-glicolídeos (PLGA) (revisado por Singh & O’Hagan,

2003 e por O’Hagan & Rappuoli, 2006).

•Poliésteres de polilactídeo co-glicolídeos. São polímeros compostos de micro-

partículas que se usam como adjuvantes e que já são usados como sistema de liberação de

antígenos e em suturas. Induzem resposta CTL. Estas moléculas apresentam bons

resultados como adjuvantes em vacinas de DNA (revisado por Singh & O’Hagan, 2003 e

por O’Hagan & Rappuoli, 2006).

1.2.3.3 Outros adjuvantes particulados

Entre os testados, porém com menor atenção: os sais de cálcio, o estearil-tirosina, o

γ-inulina e o algamulina (hidróxido de alumínio + γinulina) (Singh et al., 2006).

1.3 A saponina de Quillaja saponaria Molina: QS21.

A espécie é uma árvore nativa das regiões de montanhas do Chile, sendo muito

utilizada pela população local como estimulante da mucosa gástrica, para combater

problemas respiratórios, no tratamento de infecções cutâneas e reumatismo crônico.

Entretanto, os efeitos tóxicos incluem irritação das mucosas, dores de cabeça, fraqueza



10

muscular, vômitos e diarréia. Portanto, a sua utilização por gestantes deve ser evitada. O

extrato das cascas é comercializado industrialmente (Cheeke, 1999).

A Quillaja saponaria Molina pertence à família botânica Rosaceae (Figuras 1 e 2).

O seu nome é derivado da palavra indígena chilena quillean, que significa “para lavar”,

uma vez que suas cascas (parte utilizada) produzem espuma abundante e persistente quando

agitadas na água (Schenkel et al., 2002).

A saponina QS21, purificada das cascas de Quillaja saponaria Molina tem sido

intensivamente investigada quanto à sua atividade imunoestimulante e potencial utilização

como adjuvante em vacinas. Ela faz parte de formulações testadas em testes clínicos em

humanos contra HIV-1 (gp 120), melanoma e malária com apoio da OMS (Kensil, 1998).

A sua estrutura química é caracterizada pela presença de um núcleo triterpênico com

um grupo aldeído em C-4 e duas cadeias de oligossacarídeos ligados ao C-3 e ao C-28 do

Figura 2. Flores de Quillaja saponaria MolinaFonte: http://pharm1.pharmazie.unigreifswald.de/gallery/gal-rosa

Figura 1. Árvore de Quillaja saponaria MolinaFonte: http://pharm1.pharmazie.unigreifswald.de/gallery/gal-rosa


http://pharm1.pharmazie.unigreifswald.de/gallery/gal-


http://pharm1.pharmazie.unigreifswald.de/gallery/gal-rosa

11

triterpeno, respectivamente (Figura 3). A cadeia ligada ao C-28 é acilada por dois

normonoterpenos através de uma ligação éster a fucose. O grupo aldeído possui extrema

relevância e confere singularidade a essa saponina (revisado por Marciani, 2003).

Figura 3. Estrutura química da saponina QS21

A exposição do aldeído em C-4 promove a formação de imina ou base de Schiff,

que é uma reação entre aldeídos e grupamentos amino (NH2) expostos por duas moléculas

(Rodhes, 1996) em vários sistemas biológicos. Em 1975, foi descrito o fenômeno de

mitogênese oxidativa resultante da geração química ou enzimática de aldeídos na superfície

celular de linfócitos, que induz a sua subseqüente ativação (Novogrodsky & Katchalsky,

1972). Este fato sugeriu que a formação de bases de Schiff fosse essencial na interação

entre células APC e células T. Alguns aldeídos formam iminas com grupamentos amino-å

na superfície de células T produzindo a co-estimulação necessária para ativação da células

T, simulando, porém de maneira independente, a ação dos ligantes B7-1 sobre os

receptores CD28. A formação da imina resulta no transporte de Na+ e K+, que juntamente

com a sinalização via receptor de célula T ativa a proteína quinase (MAPK) ERK2 e, assim

promove o aumento da mobilização de Ca2+ , favorecendo o aumento da produção de IL-2 e

IFN-ã, finalizando com a promoção de resposta Th1 (revisado por Marciani, 2003).

O trabalho de Soltysik et al. (1995) demonstrou que, impedindo a exposição do

aldeído através de conjugação do mesmo com glicina, etilamina ou etilendiamina, são

H

OO

H

HH

H

13

24 5

6 7

8

910 11

1213

14

15

16

17

18

19 20

21

22

23

2425

26

27

28

29

30

O

O OHO

O

HO

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O

HO

OHHO

HO

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O

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OO

OHO

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HO

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OH

H

O

OH HOO

HO



12

gerados derivados de QS21 que perdem a atividade indutora de anticorpos e de linfócitos

citotóxicos, confirmando a importância do grupamento aldeído no C-4. Assim mesmo, um

tratamento com Borohidreto de Sódio na saponina QS21 permite a redução do aldeído do

triterpeno a álcool (Pillion et al., 1996), alterando as suas funções biológicas.

Por outro lado, outra peculiaridade das saponinas da Quillaja saponaria Molina é a

sua cadeia lipofílica de normonoterpenos, à qual tem sido atribuída a potencialização da

resposta citotóxica CD8+ (CTL) e os efeitos de toxicidade secundária obviamente

indesejados (Marciani, 2003). Vários trabalhos realizados tentam remover a fração

composta de normonoterpenos (Marciani et al., 2001; Marciani, 2003) para diminuir

toxicidade secundária e até substituí-la por outros componentes lipofílicos de menor

toxicidade (Marciani et al., 2000). Alternativamente, a deacilação de saponinas de Quillaja

saponaria Molina ocorre espontaneamente em solução aquosa ou em condições alcalinas

(Higuchi et al., 1987; Cleland et al., 1996; Pillion et al., 1996; Guo et al., 2000; Liu et al.,

2002; Oliveira-Freitas et al., 2006).

1.4 A saponina de Calliandra pulcherrima Benth: CP05

A espécie é um arbusto nativo do Brasil bastante utilizado na região sudeste com

finalidades ornamentais (Figura 4 e 5). A planta é empregada também como forrageira,

sendo que o seu consumo provoca o aumento da produção de leite em rebanhos de caprinos

e bovinos. A população do interior utiliza as folhas da planta em infusão para combater as

febres intermitentes de malária (revisado por Tani et al., 1996).



13

A partir das folhas de Calliandra pulcherrima Benth, obtém-se uma saponina

triterpênica (Figura 6), que possui muitas semelhanças com a saponina da QS21 de

Quillaja saponaria Molina. Sua elucidação estrutural apresentou duas cadeias

oligossacarídicas grandes associadas ao C-3 e ao C-28. Semelhante à QS21, três açúcares

compõem a cadeia ligada ao C-3 e 5 açúcares, a cadeia ligada ao C-28 (Marciani, 2003;

Silva et al., 2005). Na cadeia ligada ao C-28, três monoterpenos alternados com açúcares,

em lugar dos dois apresentados pela QS21, estão ligados via fucose por meio de uma

ligação éster ao C-28. Uma diferença fundamental entre a saponina QS21 e a saponina

CP05 é que esta não apresenta nenhum grupamento aldeído no triterpeno (Silva et al.,

2005).

Figura 4. Arbusto de Calliandrapulcherrima Benth, destacando-se asfolhasFonte:http://tropicals.com/pics/garden/2004/2/2598s.jpg

Figura 5. Flores de Calliandrapulcherrima BenthFonte:http://tropicals.com/pics/garden/2004/2/2598s.jpg


http://tropicals.com/pics/garden/200

http://tropicals.com/pics/garden/2004/


14

Figura 6. Estrutura química da saponina CP05

Um estudo preliminar comparativo entre a QS21 e a CP05 como adjuvantes do

antígeno FML (Ligante de Fucose e Manose) no modelo murino revelou que o índice

hemolítico, a indução de tipos e subtipos de anticorpos e a resposta de intradermorreação

contra o lisado de Leishmania donovani foi semelhante para ambas. Porém, a resposta

induzida por QS21 foi 1,5 a 2 vezes maior que a de CP05, em IgG total, IgG2a e IgG3. Se

por um lado, a QS21 estimulou IgG2a e IgG2b, a CP05 induziu predominantemente IgG2b.

Talvez esta diferença tenha relação com a ausência de aldeído no triterpeno da CP05 (Silva

et al., 2005, Chame-Barreto, 2006). Ambas as saponinas QS21 e CP05 se destacam muito

pela complexidade e tamanho das suas cadeias glicídicas e presença de cadeias lipofílicas.

Assim mesmo, tanto os grupamentos lipofílicos como o aldeído em C-4 da QS21 são

achados inusuais e muito peculiares.

O extenso número de evidências do potencial adjuvante protetor da QS21 (Soltysik

et al., 1995; Cox & Coulter, 1997; Kensil et al., 1998; Marciani et al., 2001, Palatnik de

Sousa et al., 2004) e as suas semelhanças com a saponina CP05 da Calliandra pulcherrima

Benth, de função desconhecida, nos estimularam a iniciar o estudo do potencial adjuvante

desta última.

O O

OHO

O

NHO

O

HO H

O

O

OHO

OH

O

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2

3

4 5

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12

34

56

7

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10

1112

13

1415 16

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19 2021

22

23

24

2526

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28

29

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1

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15

1.5 Leishmanioses

As leishmanioses são enfermidades causadas por protozoários intracelulares do

gênero Leishmania. Em 1903, Sir William Leishman e Charles Donovan descreveram a

existência do agente etiológico da leishmaniose, a partir de lâminas post-mortem de baço de

pacientes da Índia, que tinham morrido com quadros febris sugestivos de malária, porém

sem demonstração dos plasmódios (Ross, 1903).

A leishmaniose tegumentar é uma doença de caráter zoonótico que acomete o

homem e diversas espécies de animais silvestres e domésticos, podendo se manifestar

através de diferentes formas clínicas e sendo considerada uma doença polimórfica e

espectral da pele e das mucosas. Já a leishmaniose visceral é uma enfermidade infecciosa

generalizada e crônica, de caráter zoonótico no Mediterrâneo e no Novo Mundo sendo

também consideradas diversas formas clínicas, podendo ocorrer desde casos de cura

espontânea até manifestações clínicas severas (revisado por Handman, 2001).

As leishmanioses são infecções endêmicas em 88 países, sendo 72 destes países em

desenvolvimento. Estima-se que exista uma prevalência de 12 milhões de casos de

leishmaniose no mundo atualmente (WHO, 2006). O número de novos casos de várias

formas de leishmanioses por ano é estimado em 1,5 milhões dos quais 500.000 são de

leishmaniose visceral. Dos casos de leishmaniose visceral, 90% encontra-se em

Bangladesh, Índia, Nepal, Sudão e Brasil, enquanto que 90% dos casos de leishmaniose

cutânea encontram-se em Afeganistão, Brasil, Irã, Peru, Arábia Saudita e Síria (WHO,

2006). No Brasil, aproximadamente 90% dos casos humanos de leishmaniose visceral se

concentravam no Nordeste até 1993. Em 2002, 64,02% dos casos correspondem ao

Nordeste sendo que a epidemia se estendeu pelo Norte (14,12%), Centro-Oeste 8,22% e

Sudeste (13,63%) do país (MS-SINAN, 2003).



16

1.5.1 A Leishmaniose visceral no Mediterrâneo e nas Américas

A leishmaniose visceral é causada por várias espécies: Leishmania (Leishmania)

donovani e a Leishmania (Leishmania) infantum no Velho Mundo e a L. (L.) chagasi nas

Américas. A leishmaniose visceral humana nas Américas e no Mediterrâneo é uma zoonose

de canídeos. Os parasitas são transmitidos de raposas e canídeos silvestres a cães

peridomiciliares e destes aos seres humanos nos ambiente domiciliares, através de picadas

de insetos flebotomíneos. No Mediterrâneo, a doença é causada por L. (L.) infantum e o

principal vetor é o Phlebotomus perniciosus. Entretanto, no Novo Mundo, a doença é

causada por L. (L.) chagasi e é transmitida pelo inseto flebotomíneo Lutzomya longipalpis

(Guarga et al., 2000). A emergência da leishmaniose visceral zoonótica (LVZ) constitui um

severo e preocupante problema de Saúde Pública.

Recentemente se reconheceu a identidade da L. (L.) infantum e da L. (L.) chagasi.

Mediante o estudo e o auxílio de técnicas enzimáticas e genéticas concluiu-se que as

diferenças entre amostras de L. (L.) infantum e de L. (L.) chagasi de diversas procedências

são muito restritas. Desse modo, L (L.) chagasi passa a ser sinônimo de L. (L.) infantum

(Maurício et al., 2000).

O ciclo biológico do parasita é heteroxênico, desse modo, durante o seu

desenvolvimento apresenta dois estágios: uma forma flagelada extracelular denominada

promastigota (móvel e alongada com 10-20 µm), que se desenvolve no hospedeiro

invertebrado do gênero Lutzomya (Novo Mundo) e Phlebotomus (Velho Mundo) e uma

forma amastigota (esférica com diâmetro de 3-7 µm de diâmetro), que prolifera dentro de

fagolisossomo de macrófagos. Os promastigotas são inoculados na pele do hospedeiro

vertebrado, juntamente com a saliva, no momento da picada do vetor e são fagocitados por

células do sistema monocítico fagocitário (macrófagos, monócitos e células dendríticas),

diferenciando-se em formas amastigotas. Os parasitas intracelulares multiplicam-se por

divisão binária e chegam a romper os macrófagos infectados. Ao romper a célula, tais

formas são liberadas para infectar outros macrófagos e outros fagócitos, assumindo uma

localização final, na pele, no baço, no fígado, na medula óssea e nos linfonodos. O ciclo se

fecha quando os flebotomíneos picam os reservatórios vertebrados e ingerem as formas

amastigotas. Finalmente, os amastigotas atingem o tubo digestivo do vetor, onde após



17

passarem por várias etapas diferenciam-se em promastigotas infectivas (Awasthi et al.,

2004).

A leishmaniose visceral é a forma mais grave da doença, sendo sua evolução

gradual e podendo atingir crianças e adultos. É uma doença crônica e freqüentemente letal

se não for tratada logo após o aparecimento dos sintomas. Também é conhecida pelas

seguintes denominações: febre de Dum-dum ou esplenomegalia tropical, na Índia; calazar

infantil ou anemia esplenomegálica, na Bacia do Mediterrâneo e calazar, leishmaniose

visceral, calazar americano ou neotropical, nas Américas. Os sintomas em humanos podem

ser caracterizados por febre prolongada, mal-estar, anasarca, anemia, linfoadenomegalia

generalizada, hepatoesplenomegalia, hipergamaglobulinemia, caquexia e progressiva

imunossupressão celular. Também pode ocorrer evolução assintomática, aguda, subaguda

ou crônica da doença. O tempo de incubação é variável, desde dias até anos (revisado por

Handman, 2001).

A co-infecção de Leishmania e HIV têm ocasionado reativação da doença em

pacientes assintomáticos ou de pacientes considerados curados de leishmaniose. Isso indica

que o parasita pode ser considerado um oportunista. Isso pode levar, geralmente, resistência

ao tratamento, assim como, aceleração no progresso da AIDS (Roberts et al., 2000).

O diagnóstico da leishmaniose visceral depende muitas vezes do histórico

epidemiológico e da clínica do paciente, sendo estes requisitos básicos no diagnóstico

diferencial. Contudo, muitas outras doenças tropicais apresentam quadros semelhantes, por

exemplo, malária e esquistossomose. A pesquisa direta dos parasitas pode definir o

resultado, para isso, pode ser realizada a punção principalmente de medula óssea ou mais

raramente, de baço, seguidas de coloração das lâminas com o corante de Giemsa e

observação ao microscópio das formas amastigotas (Herwaldt, 1999). Este método é muito

agressivo e penoso para o paciente, que pode sofrer complicações como hemorragias.

A sorologia é extremamente útil para triagem de casos e também em inquéritos

epidemiológicos (Badaró et al., 1983; Palatnik de Sousa et al., 1995; revisado por Singh,

2006). A dosagem de proteínas e a eletroforese do soro, com alteração da relação

albumina/globulina e hipergamaglobulinemia acentuada, são sugestivas. Outros exames

como hemograma acusando anemia, leucopenia, monocitose e linfocitose são auxiliares no

diagnóstico (revisado por Singh, 2006).



18

O diagnóstico precoce é de fundamental importância nos casos de calazar, pois

quanto mais precoce, melhores as perspectivas no sucesso na terapia e diminuição de casos

fatais são esperados. Outro fator importante é a existência de indivíduos na população com

infecção subclínica. Estes indivíduos podem ser doadores assintomáticos de sangue

infectado com Leishmania gerando o calazar transfusional (Palatnik de Sousa et al., 1996;

Le Fichoux et al., 1999).

O tratamento contra a leishmaniose é bastante difícil e desconfortável para o

paciente. Os antimoniais pentavalentes: antimoniato de meglumina (Glucantime) e

estibogluconato de sódio (Pentostan), foram as primeiras drogas a serem utilizadas na

terapia e continuam até os dias atuais como terapia de escolha no tratamento da

leishmaniose visceral. Tais drogas exigem hospitalização para a administração endovenosa

e promovem muitas reações adversas. Com o aumento do número de casos de leishmaniose

visceral e o aparecimento de resistência ou de recidivas da doença, os antimoniais

pentavalentes começaram a apresentar ineficácia em alguns casos, havendo necessidade de

novas estratégias terapêuticas para combater a doença. Assim, o uso de Anfotericina B e a

Pentamidina foi introduzido na terapia. Muitas novas terapias têm sido sugeridas, chegando

a mais de 60 tratamentos testados (revisado por Murray, 2004). Um aminoglicosídeo

denominado Paromomicina, também tem sido testado nas regiões do Kênia, Índia e Sudão,

e apresentado bons resultados (cerca de 95% de cura) com menor toxicidade (revisado por

Murray 2004). Atualmente, a Miltefosina (Hexadecilfosfocolina) originalmente

desenvolvida como um agente anti-neoplásico, é uma droga oral que apresenta

propriedades anti-leishmania, porém demonstra toxicidade gastrointestinal (Murray, 2004).

1.5.2 Formas de controle

Conforme recomendações da Organização Mundial da Saúde, o controle da

leishmaniose é baseado em três medidas (Tesh, 1995):

1) Detecção e tratamento de casos humanos: promove a redução de morbidade e de

mortalidade.

2) Sacrifício ou tratamento de cães infectados: Baseia-se nos aspectos clínicos e na

sorologia dos animais.



19

3) Controle do vetor e dos animais reservatórios: combate aos flebotomíneos adultos e

larvas. O uso de inseticidas no interior de residências visa reduzir o ciclo peridoméstico

e desse modo, a transmissão do parasita, porém esse efeito é apenas temporário, além

de ocorrer resistência ao inseticida com o uso prolongado (Tesh, 1995).

Com o ressurgimento da leishmaniose visceral e a sua importância evidente na

Saúde Pública, faz-se necessário o desenvolvimento de novas armas de combate à doença.

Nas áreas endêmicas do Brasil, o controle da leishmaniose visceral envolve a

detecção de cães infectados por análise sorológica usando ensaios de imunofluorescência

(IF) e sacrifício dos cães soropositivos (Borja-Cabrera et al., 1999).

O controle epidemiológico, portanto, ainda se baseia no sacrifício de cães

infectados, tendo sido criticado pela sua falta de eficácia (Costa & Furtado Vieira, 2001).

Modelos matemáticos (Dye, 1996) indicam que o desenvolvimento de uma vacina humana

e/ou canina constituiria uma forma eficiente de se controlar a doença.

1.6 Vacinação contra Leishmaniose

A pesquisa de vacinas contra a leishmaniose foi iniciada há muitos anos. O

estabelecimento das condições de crescimento de formas promastigotas em cultura, por

Nicole e Manceau em 1908, foi um ponto inicial para o desenvolvimento das primeiras

vacinas utilizando formas vivas de Leishmania (revisado por Handman, 2001). A primeira

geração de vacinas contra leishmaniose foi obtida por manipulação de parasitas mortos com

ou sem adjuvantes, tendo sido utilizadas em testes clínicos em populações humanas nas

áreas endêmicas, contra a forma cutânea da doença principalmente (Antunes et al., 1986;

Convit et al., 1987; Vélez et al., 2000) e mais recentemente contra a forma visceral (Khalil

et al., 2000). A segunda geração de vacinas pode ser dividida em três categorias de acordo

com sua composição: vacinas vivas contendo genes de Leishmania ou usando Leishmania

geneticamente modificada (Cruz, et al, 1991; Souza et al., 1994; Titus et al., 1995); vacinas

de frações ou subunidades recombinantes ou sintéticas definidas (Russo, et al., 1991;

Skeiky et al., 1995; Gurunathan et al., 1997) e vacinas com frações parcialmente

purificadas (Palatnik et al., 1989; Jaffe et al., 1990; Jardim et al., 1991;). As vacinas de 3a

geração contêm genes de antígenos clonados em um vetor de promotor eucariótico injetado

e traduzido diretamente no músculo (Xu & Liew, 1994; Handman, 2001; Ramiro et al.,



20

2003, Rafati et al., 2005; Aguilar Be et al., 2005; Gamboa-León et al 2006). Mesmo com

tantos avanços nos estudos baseados em formulações vacinais, ainda não se tem disponível

uma vacina contra a leishmaniose visceral humana utilizada na rotina clínica.

1.7 A vacina FML

O antígeno FML (Ligante de Fucose e Manose) é um complexo glicoprotéico,

isolado de promastigotas de L. (L.) donovani (obtido por extração aquosa) que inibe a

infecção in vitro de macrófagos peritoneais de camundongos por promastigotas (Palatnik et

al., 1989) e amastigotas, sendo um potente imunógeno (Palatnik de Sousa et al., 1993). A

glicoproteína de 36KDa, (gp36), pertencente ao complexo FML, é uma banda reconhecida

pelos soros de pacientes com calazar (Palatnik de Sousa et al., 1996) sendo um marcador

específico para o diagnóstico do calazar em humanos e um forte imunógeno em vacinas de

2ª (Paraguai de Souza et al., 2001) e de 3ª geração (Santana et al., 2002; Aguilar-Be et al.,

2005; Gamboa-León et al., 2006). O antígeno FML apresenta em sua composição açúcares

neutros: fucose, manose, glicose, galactose (Palatnik et al., 1989). Ensaios sorológicos

realizados com o FML-ELISA (FML como antígeno) demonstraram 100% de sensibilidade

e 96-100% de especificidade no diagnóstico do calazar humano e canino, de pacientes

infectados por L. (L.) chagasi (Palatnik de Sousa et al., 1995; Borja-Cabrera et al., 1999).

Portanto, o FML comporta-se como um antígeno específico, sendo efetivo no diagnóstico e

prognóstico da infecção humana por L. (L.) chagasi embora isolado de L. (L.) donovani

(revisado por Borja-Cabrera et al., 1999).

Os estudos de vacinação utilizando o antígeno FML começaram com a formulação

de FML e saponina Riedel de Haen em vacinação profilática no modelo de camundongo

Balb/c (Palatnik de Sousa et al., 1994a) e de hamster CB (Palatnik de Sousa et al., 1994b).

Santos et al., (1999) compararam diferentes adjuvantes (saponina, Al(OH)3, adjuvantes de

Freund) no modelo de camundongos heterocruzados Swiss Albino. Com a vacina FML-

saponina foi observada redução na carga parasitária de 85 % e aumento de IgG total,

IgG2a, e IgG2b, revelando que a saponina foi o melhor adjuvante estudado.

Recentemente, testes de fase III de eficácia foram realizados na área endêmica de São

Gonçalo do Amaranto, RN, utilizando a vacina-FML em cães, induzindo 92% (da Silva et

al., 2000) e 95% (Borja-Cabrera et al., 2002) de proteção, em cães vacinados naturalmente



21

expostos (76% e 80% de eficácia vacinal, respectivamente). Assim sendo, vacina FML-

QuilA induziu proteção por até 3,5 anos após a vacinação (Borja-Cabrera et al., 2002).

Neste período, os cães vacinados mostraram alta soropositividade e reação intradérmica

(IDR) positiva ao lisado de promastigotas de Leishmania e não foi detectado DNA de

Leishmania, nem por PCR de sangue ou medula, nem presença de parasitas na punção de

medula. Controles de salina, por outro lado, mostraram PCR positivos para DNA de

Leishmania, amastigotas em punção de medula e sorologia para FML com

intradermorreação negativa. A vacina FML-QuilA induziu proteção significante, com ação

duradoura e forte efeito protetor contra o calazar canino, no campo (Borja-Cabrera et al.,

2002). A vacina FML-saponina R foi aplicada em 31 cães naturalmente infectados, quando

soropositivos por FML-ELISA, mas ainda completamente assintomáticos (Borja-Cabrera et

al., 2004). Vinte e dois meses depois da vacinação completa, 90% dos cães permaneciam

assintomáticos, sadios, com proporções normais de linfócitos CD4+, e CD21+, indicando a

sua condição não infecciosa (Guarga et al., 2002). Estes cães se mantêm sadios, 4 anos

após a vacinação inicial (Palatnik de Sousa CB, comunicação pessoal). Também, níveis

elevados de linfócitos T CD8+ e ausência de parasitas foram evidenciados, indicando que a

vacina FML-saponina R foi efetiva também na imunoterapia contra a leishmaniose visceral

em cães infectados assintomáticos (Borja-Cabrera et al., 2004).

Recentemente a formulação FML-saponina foi licenciada para comercialização no

Brasil sob o nome de Leishmune ®. A vacinação profilática com Leishmune ® em 600

cães de área endêmica tem demonstrado 97% de proteção após 22 meses de aplicação

(Borja–Cabrera et al., 2005). O princípio ativo adjuvante de ambas as saponinas QuilA e a

saponina R da Riedel de Haen é a saponina QS21 de Quillaja saponaria Molina (Palatnik

de Sousa et al., 2004). A purificação da saponina Riedel de Haen em cromatografia de troca

iônica revelou que os princípios ativos da mesma são a saponina QS21 e saponinas

deaciladas, ambas com forte efeito adjuvante na vacinação contra o calazar murino

(Oliveira Freitas et al., 2006).

Considerando a importância atribuída pela literatura aos aldeídos e

normonoterpenos na função adjuvante da saponina QS21 da Quillaja saponaria Molina, e

as semelhanças da saponina QS21, em potência e estrutura, com a nova saponina CP05 da

Calliandra pulcherrima Benth, procederemos no presente trabalho, a tratar quimicamente



22

ambas as saponinas visando elucidar a responsabilidade de cada uma das suas frações no

efeito biológico respectivo. Utilizaremos para tal fim o modelo de vacinação profilática

com a vacina FML contra a leishmaniose visceral murina.



23

II- Objetivos:

1. Avaliar comparativamente o efeito da degradação dos carboidratos na função

adjuvante das saponinas QS21 e CP05, no modelo de leishmaniose visceral murina.

2. Avaliar comparativamente o efeito seletivo da remoção da cadeia de monoterpenos,

ou da fração completa ligada no C-28 (monoterpenos e açúcares), ou de ambas as

frações ligadas ao C-3 e ao C-28 do triterpeno, na função adjuvante da saponina

CP05, no modelo de leishmaniose visceral murina.



24

III - Material e Métodos:

3.1 Obtenção do antígeno FML de L. (L.) donovani (LD1S):

3.1.1 Manutenção de amostras de L. donovani (LD1S) in vitro

A amostra de Leishmania (L.) donovani (LD-1S/MHOM/SD/00-strain 1S) é oriunda

do laboratório do Dr. D. M. Dwyer do National Institute of Health, Bethesda, Maryland,

USA. A amostra foi mantida através de passagens semanais em tubos de vidro de 13 cm

com tampa de rosca, contendo meio BHI 37 g/L , 0,02 g/L de ácido fólico, 0,01 g/L de

hemina e 10% de soro fetal bovino inativado. As culturas foram mantidas em estufa a

temperatura de 28º C.

3.1.2 Obtenção de massa de células para extração do FML

Para obtenção da massa de células, 5 mL de culturas de promastigotas na fase

logarítmica de crescimento foram transferidos para frascos Erlenmeyer de 250 mL

contendo 70 mL de fase líquida conforme descrito acima, e incubados sob agitação (150

rpm) a 28º C por períodos de 3 dias. As culturas foram amplificadas para frascos

Erlenmeyer de 3 L contendo 1 L de fase líquida e incubadas nas mesmas condições até

atingir a fase estacionária. Em seguida, as células foram centrifugadas a 6000g x 10 min.,

lavadas três vezes em solução salina 0,9% NaCl e conservadas a -20º C até a extração

(Palatnik et al., 1989).

3.1.3 Extração e purificação do complexo glicoprotéico FML de promastigotas de L.

(L.) donovani

As células foram rapidamente descongeladas e extraídas duas vezes com água

destilada em banho de gelo, sob forte agitação (Palatnik et al., 1989). Os extratos foram

recolhidos por centrifugação a 6000g x 15 min. O sobrenadante foi removido e aquecido

até 100º C. O material desnaturado foi separado por centrifugação a 48.200g x 10 min e

descartado. O extrato aquoso obtido foi liofilizado, fracionado por cromatografia de gel

filtração em coluna de BioGel P-10 (BIO-RAD) (120 cm x 2 cm; 100-200 mesh, Bio-Rad

Laboratórios, Richmond, Calif). A eluição foi monitorada através de dosagens de



25

carboidratos, proteínas e leitura da absorbância a 220 çm e 260 çm. A fração

correspondente ao volume de exclusão, contendo o FML (Ligante de Fucose Manose) foi

separada, concentrada, liofilizada e seu perfil eletroforético foi analisado em gel de

poliacrilamida (Palatnik et al., 1989).

3.2 Obtenção da saponina CP05 de Calliandra pulcherrima

Estes foram gentilmente cedidos pelo Professor José Paz Parente e pela Professora

Bernadete Pereira da Silva do Laboratório de Química de Plantas Medicinais, do Núcleo de

Pesquisas em Produtos Naturais da UFRJ. A saponina CP05 foi obtida a partir de folhas

frescas da planta conforme descrito (Silva et al., 2005) através de extração com MeOH e

cromatografia em coluna de Sephadex LH-20 e de sílica gel. A CP05 foi revelada em

cromatografía de camada delgada pelo método do orcinol-sulfúrico (mancha azul-escura)

como uma substância homogênea com Rf 0,50 (Silva et al., 2005).

3.3 Obtenção da saponina QS21

A saponina QS21, gentilmente cedida pelo Professor José Paz Parente e pela

Professora Bernadete Pereira da Silva do Laboratório de Química de Plantas Medicinais, do

Núcleo de Pesquisas em Produtos Naturais da UFRJ, foi extraída a partir da mistura

comercial Riedel de Haen, Saponin pure (8047-15-2) EINECE (West Germany) através

de cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-celulose e cromatografia de exclusão

em coluna de Sephadex G-50 e G-25, conforme descrito por Oliveira-Freitas et al. (2006),

fornecendo uma substância (QS21) homogênea com Rf 0,45 detectada por cromatografia

em camada delgada (Silva et al., 2005).

3.4 Avaliação comparativa do efeito da degradação dos carboidratos na função


As amostras das saponinas cedidas pelo Professor José Paz Parente e pela

Professora Bernadete Pereira da Silva do Laboratório de Química de Plantas Medicinais, do

Núcleo de Pesquisas em Produtos Naturais da UFRJ foram tratadas com periodato de sódio

(NaIO4, 0,05 M) à temperatura ambiente (Mislovicová et al., 2002), no escuro. A reação foi



26

encerrada com adição de 50 µl de etileno glicol. O material de reação foi submetido à

cromatografia de exclusão em coluna de Sephadex LH-20 e as frações correspondentes as

saponinas oxidadas, reunidas e liofilizadas. A oxidação com periodato de sódio quebra a

moléculas de carboidratos nas ligações entre os carbonos em que existem hidroxilas

vicinais (Sharon, 1975) deixando estes carbonos como novos grupamentos aldeídos

expostos (Mislovicová et al., 2002).

Camundongos fêmeas Balb/c de 2,5 meses de idade (10 animais /grupo) oriundos do

Biotério Central do CCS foram imunizados com três doses de 150 µg de FML e de 25 µg

saponina QS21 ou CP05 padrão ou tratada com periodato de sódio, com intervalos de sete

dias, pela via subcutânea no dorso. Experimentos prévios demonstraram que as saponinas

na concentração de 25 µg já induziam efeito imunoprotetor (Chame-Barreto, 2006).

Animais tratados apenas com salina foram incluídos como controle. Os animais foram

infectados com 2 x 108 amastigotas de L. chagasi, obtidos a partir de baço de hamsters

(Bradley & Kirkley, 1977) diluídos em 100 µl de solução salina 0,9% por via endovenosa

caudal no dia 31 após a vacinação. Os animais foram sacrificados por eterização 30 dias

após a infecção (dia 61). Sangue, baços e fígados foram coletados e o peso do corpo, baços

e fígados determinados para cálculo da possível caquexia e hepatoesplenomegalia relativa

(percentagem do peso do órgão a respeito do peso corporal). A dosagem dos tipos e

subtipos de imunoglobulinas tipos e subtipos de imunoglobulinas anti-FML foi realizada

nos soros colhidos uma semana após a terceira dose vacinal (dia 28) e após o sacrifício (dia

61), pelo método do FML-ELISA (Santos et al., 2002). A análise de intradermorreação

(IDR) ao lisado de promastigotas de LD1S será realizado no dia 29 e no dia 58. As análises

de proliferação de esplenócitos, citometria de fluxo (FACS), dosagem de interleucinas nos

sobrenadantes e avaliação da carga parasitária – LDU (“Leishman Donovan Units”) no

fígado foram realizadas após o sacrifício (dia 61). Todos os experimentos realizados com

animais neste trabalho seguem as instruções do NIH-EEUU no sentido de tornar o

sofrimento dos animais o menor possível. O projeto está aprovado pelo Comitê de Ética em

Pesquisa com Animais do Instituto de Biofísica da UFRJ.

Os amastigotas de Leishmania (L.) chagasi usados na infecção foram obtidos de

hamsters infectados sacrificados por eterização após 90 dias de infecção (Bradley &

Kirkley, 1977). Os baços foram retirados, picados e macerados em homogeneizador de



27

Dounce, contendo solução salina. A suspensão celular foi transferida para tubo cônico de

poliestireno (Nunc), completando até um volume final de 45 mL de solução salina. Em

seguida, os tubos foram submetidos à centrifugação a 1500 rpm, por 5 min. em centrífuga

refrigerada a 4º C. O precipitado foi desprezado e o sobrenadante centrifugado novamente

(nas mesmas condições acima descritas), até o precipitado se mostrar livre de hemácias

não existir hemácias visíveis. O sobrenadante foi então desprezado e o “pellet” contendo

amastigotas separado, lavado por centrifugação em solução salina e finalmente

ressuspendido em 1 mL de solução salina gelada. Uma alíquota foi diluída 1:500 em

solução de cristal violeta para contagem em câmara de Neubauer (nos quadrantes de

hemácias) com aumento de 400 x.

3.4.1 Teste de toxicidade in vivo

Esta foi avaliada por intervalo de 7 dias após cada dose vacinal em termos da

sobrevivência, reações de dor, inchaço, letalidade, queda de pelo e lesão dos animais. Como

controle foram usados animais inoculados com salina estéril desprovida de pirogênio.

Foram consideradas reações de dor a emissão de sons, agitação, mordidas, na hora da

injeção.

3.5 Avaliação comparativa do efeito seletivo da remoção da cadeia de monoterpenos,



CP05.

3.5.1 Obtenção das frações da saponina CP05 e teste in vivo

A saponina BS foi obtida a partir da saponina CP05 purificada por remoção da

fração monoterpeno, acilada na glucopiranose ligada ao C-28 do triterpeno, usando

hidrólise alcalina branda com NaHCO3/MeOH, enquanto que a saponina HS foi obtida por

remoção da fração total ligada no C-28, contendo carboidratos e monoterpenos, usando

hidrólise alcalina drástica com NaOH 1N. Ambos procedimentos seguiram o método

descrito por Takeda et al., (1993). Finalmente, a fração sapogenina (ácido equinocístico),



28

isenta das cadeias de monoterpenos e carboidratos, foi isolada através de hidrólise ácida

drástica com SO4H2 2N conforme descrito por da Silva et al. (2005).

Camundongos fêmeas Balb/c de 2,5 meses de idade (10 animais/grupo) oriundos

do Biotério Central do CCS receberam três doses de 150 µg de FML e de 100 µg da

saponina CP05 padrão, da saponina BS, HS ou da fração sapogenina, com intervalos de

sete dias, pela via subcutânea (sc) no dorso. Um grupo de animais tratado com salina que

será incluído como controle. Foi realizado teste de toxicidade conforme descrito no item

3.4.1. Os animais foram infectados com 2x 108 amastigotas de L. chagasi diluídos em 100

µl de solução salina 0,9% por via endovenosa caudal no dia 31 após a vacinação e

sacrificados por eterização 30 dias após a infecção (dia 61). Os animais foram analisados

através de ensaios imunológicos e a respeito da sua infecção conforme descrito no item 3.6.

3.6 Ensaios imunológicos

3.6.1 Análise dos níveis de IgG total e subtipos, IgA e IgM – Utilizando o método do

FML-ELISA

Sangue dos animais, antes e depois da infecção, foi obtido e incubado a 37º C por

uma hora e “overnight” a 4º C. Os soros foram recolhidos e centrifugados a 1500 rpm por 5

min. e conservados em glicerol 1:1 no freezer. Placas Greiner (96 poços) foram

sensibilizadas com 50 µl de antígeno FML (40 µg/mL em tampão carbonato/bicarbonato

pH 9,6) por poço, e submetidas à incubação por uma hora a 37º C e “overnight” a 4º C.

Posteriormente, as placas foram submetidas a cinco lavagens com PBS* (0,018M PBS pH

7,2, leite 1% e tween 20 0,05%) e posterior incubação com as diluições dos soros também

em PBS*, por uma hora a 37º C. As placas foram então lavadas novamente cinco vezes

com PBS*, e acrescentadas de 50 µl dos anticorpos de cabra anti- IgA, IgM, IgG1, IgG2a,

IgG2b, e IgG3 de camundongo conjugados à peroxidase (Southern Biotechnology

Associates, Birmingham, AL, EEUU ) ou de 50 µl de conjugado de peroxidase-proteína-A

(Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland, EEUU), na diluição de 1:4000

em PBS*. A incubação seguiu por uma hora. Em seguida, as placas foram lavadas cinco

vezes com PBS* e a revelação feita com 50 µL/poço de solução de OPD (Orto Fenileno

Diamina Sigma) em tampão OPD pH 5,2; durante 30 minutos, ao abrigo da luz. A reação



29

foi interrompida com 10 µL/poço de ácido sulfúrico 1N e a leitura das placas realizada em

leitor de Elisa com filtro 492 çm. Foram realizadas triplicatas de cada soro (n=10/ grupo)

na diluição 1/100.

3.6.2 Resposta de intradermorreação (IDR) ao lisado de Leishmania (L.) donovani

O lisado de promastigotas foi obtido a partir de L. (L.) donovani LD1S (Santos et

al., 2002). Brevemente, após cinco dias de cultura in vitro (item 1.2), os promastigotas

foram transferidos para um Erlenmeyer de 1 L contendo 200 mL do mesmo meio e

mantidos sob agitação em estufa a 28º C durante 3 dias até atingirem a fase estacionária. As

células foram centrifugadas a 4º C 6000 g e lavadas (3 vezes) em solução de cloreto de

sódio a 0,9%. Em seguida, os parasitas foram contados em câmara de Neubauer e uma

suspensão de 1x108 promastigotas/mL de solução salina foi submetida à congelamento em

nitrogênio líquido e descongelamento sob jato d’água por cinco vezes consecutivas, para

lise celular. Para avaliação da resposta de IDR, os animais (n=10/grupo) foram inoculados

com 100 µl do lisado (107 promastigotas), no coxim plantar das patas traseiras direitas,

enquanto que 100 µl de salina foram injetados nas patas traseiras esquerdas, como controle

negativo. As medidas das patas (média de 5 medições/animal) foram efetuadas com um

paquímetro (Mitutoyo) às 0, 24 e 48h após a inoculação do lisado. A resposta de IDR foi

expressa como a diferença entre as espessuras das patas antes e depois da inoculação do

lisado. Para cada medida o valor do seu respectivo controle de salina foi subtraído.

3.6.3 Proliferação in vitro de esplenócitos totais contra antígenos de Leishmania

Após o sacrifício dos animais (n=3), foram obtidos os esplenócitos totais de baço

por maceração com auxílio de uma peneira e êmbolo de seringa (20 mL) estéreis, numa

placa de Petri. O material obtido foi transferido para tubo de poliestireno de 12 mL (Nunc)

e completado até 11 mL com ACK (cloreto de amônio 8,29g; bicarbonato de potássio 1g;

EDTA 0,037g/L de água Mili Q). Em seguida, as células foram centrifugadas a 1500 rpm

por 5 min. em centrífuga refrigerada. Os sobrenadantes foram desprezados e o “pellet”

ressuspendido em ACK, repetindo a operação anterior, até a eliminação total de hemácias.

O “pellet” foi lavado com salina 0,9% para remoção do ACK e finalmente ressuspendido

em 3mL de meio RPMI (Sigma Co, St Louis, EEUU) suplementado com 10% de soro fetal



30

bovino (Nutricell, Campinas, SP) + 1% de L-Glutamina + 5 mM/L de Mercaptoetanol. As

células obtidas foram contadas na câmara de Neubauer nos quadrantes de leucócitos e a

diluição feita em azul de tripano a 1:20. As células (2x105) foram plaqueadas em placas de

96 poços Costar, num volume de 100 µl de meio RPMI suplementado. Como estímulo,

foram adicionados: concanavalina A (ConA) (4 µg/poço) como controle positivo, antígeno

FML (25 µg/poço) eluído de nitrocelulose (Kaye et al., 1991), lisado de promastigotas de

Leishmania (L.) chagasi (IOC L-579) na concentração de 105, 106, 107 promastigotas/poço

e proteína NH36 recombinante obtida e purificada no sistema pMAL (Santana et al., 2002).

(0,4 µg/poço). Foram feitas triplicatas de cada animal. As células foram incubadas em

estufa de 5% CO2 a 37oC. No terceiro dia de proliferação foram adicionados 10 µl de MTT

(3-(4,5-dimetil tiazol 2-)-2,5 difenil tetrazolium brometo, Sigma) a 5 mg/mL em cada poço

e as placas novamente incubadas em estufa de CO2 por 4 horas. Em seguida, foram

adicionados 100 µl de SDS a 10% e as placas incubadas à temperatura ambiente e ao abrigo

da luz “overnight” (Mossman, 1983). A avaliação da proliferação foi feita no leitor de

ELISA BioRad Microplate reader Benchmark, a 540 çm.

As proteínas do FML usadas para estimular os esplenócitos foram obtidas após

separação em gel de poliacrilamida 10% usando pente único para separar volumes de 100 a

250 µl conforme o método descrito por Kaye et al. (1991). Em seguida foi feita a

transferência eletroforética para membrana de nitrocelulose (Sigma, Co.) a 250 mA por 2

horas a 4º C em cuba de Western blotting contendo tampão de transferência (Tris-base

0,025M, glicina 0,192M e metanol a 20%). Após a transferência, a membrana de

nitrocelulose contendo o FML e um padrão de peso molecular, foi corada pelo corante de

Ponceau a 0,2% em ácido acético 1% e descorada com água destilada. O FML foi

identificado e a região recortada com uma tesoura. As fitas contendo o FML ficaram 12

horas a temperatura ambiente para secarem plenamente. No dia seguinte, em condições

assépticas, foram fracionadas e adicionadas a tubos de ensaio contendo 1 mL de DMSO

(Sigma, Co) sob intensa homogeneização, com pipeta Pasteur, até a sua completa

solubilização. Este material ficou durante duas horas em repouso a temperatura ambiente.

Em seguida, foram adicionados 1 mL de tampão carbonato bicarbonato (pH 9,6) que

apresentou então um aspecto leitoso. O antígeno eluído foi recuperado por centrifugação

em centrífuga de Eppendorf a 14000g x 11 segundos e o precipitado lavado por cinco vezes



31

em tampão Fosfato de Sódio 0,018M pH 7,2 (PBS) para remoção completa do DMSO. O

material obtido foi ressuspendido em 2 mL e a presença do FML confirmada através de gel

de poliacrilamida 10%. Para avaliar o rendimento das extrações, a dosagem de proteínas do

FML isolado foi realizada através da análise do “scan” do gel pelo programa Scion Image –

Release Alpha 4.0.3.2.

3.6.4 Dosagem de IFN-ã nos sobrenadantes de esplenócitos

Sobrenadantes das culturas de esplenócitos de cada animal (n=3) estimuladas com

antígenos e controles conforme descrito em 3.6.3, foram dosadas através de ensaio de

ELISA, em triplicatas e comparadas com uma curva padrão para determinação da

concentração da citocina em questão. Foram utilizados anticorpos monoclonais de captura e

biotinilados anti-IFN-γ (MAB785, BAF485). O padrão de IFN-γ foi adquirido na

Pharmingen (San Diego, CA, USA). Foram utilizadas placas de 96 poços (NuncSorp),

sensibilizadas com 50 µL/poço de anticorpo de captura anti-IFN-ã (0.4µg), diluído em

tampão bicarbonato 0,1 M pH 8,2 e incubadas “overnight” a 4º C. No outro dia, as placas

foram lavadas 2 vezes com PBS/Tween 0,05%, bloqueadas com 200µl de PBS adicionado

de 10% de soro fetal bovino (PBS**) e incubadas durante 2 horas a 37º C. Após esta etapa,

as placas foram lavadas novamente 2 vezes com PBS/Tween 0,05%. Foram feitas diluições

seriadas dos rINF-ã, partindo de 4000 pg até 62 pg e adicionadas às placas (50 µL/poço).

Paralelamente, 50µl dos sobrenadantes dos esplenócitos foram também adicionados e as

placas incubadas a 4º C “overnight”. No dia seguinte, as placas foram lavadas 4 vezes com

PBS/Tween 0,05% e adicionadas de 50 µL/poço de anticorpos de detecção-biotinilados

diluídos a 2 µg/mL em PBS**. As placas foram incubadas durante 90 min. a temperatura

ambiente e, em seguida, lavadas 6 vezes com PBS/Tween 0,05%. Foram adicionados 100

µL/poço do conjugado de estreptoavidina conjugada a peroxidase (Dako, EEUU) diluído a

1:20000 em PBS**, e incubados durante 20 min. a temperatura ambiente. As placas foram

então lavadas 8 vezes, e adicionadas de 100 µl do substrato TMB (3,3’,5,5-

tetraMethylBenzidine Zymed laboratories Inc, EEUU) para revelação e incubadas por 30

min ou até aparecer cor, a temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Finalmente, foi feita a

leitura usando filtro 650 çm no leitor de ELISA. O limite de detecção para as citocinas é 15

pg.



32

3.6.5 Fenotipagem de esplenócitos por citometria de fluxo

Esplenócitos de cada animal (n=3) foram obtidos conforme descrito em 3.6.3,

plaqueados (2 x 106/ poço) em placas de 24 poços e incubados com FML (25 µg/poço) e

lisado de L. (L.) chagasi (106 promastigotas/poço) por cinco dias, em estufa de CO2 a 37oC.

Após este período, as células foram recolhidas, colocadas nos tubos específicos para

citometria e centrifugadas a 1500 rpm durante 10 min. O “pellet” foi ressuspendido em 1

mL de PBS e centrifugado novamente. O sobrenadante foi desprezado e 20 µl de anticorpo

anti-CD4 (FAB554F) e anti-CD8 (FAB116), da R&D System (Minneapolis, MN, USA)

foram adicionados na diluição de 1:50 em PBS** e incubados durante 30 min. ao abrigo de

luz, a 4º C. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com 1 mL de PBS a 1500 rpm

durante 10 min. O “pellet” obtido foi ressuspendido em 300 µl de PBS contendo 2,8% de

formol. Os tubos obtidos foram armazenados a 4º C e ao abrigo da luz até o momento da

leitura no FACScalibur BD. A análise dos dados foi feita usando o programa WinMDI

(Windows Multiple Document Interface Flow Cytometry Application) versão 2.8.

3.7 Determinação de carga parasitária – LDU (“Leishman Donovan Units”)

Os fígados dos animais com 30 dias de infecção (dia 61) foram retirados, pesados,

cortados, secos em papel absorvente e feitos os “imprints” nas lâminas (n=10 /grupo). As

lâminas foram fixadas com metanol P.A. por cinco min. Após estarem totalmente secas, as

lâminas foram coradas com corante Giemsa (em tampão de Sorensen 0,067M pH 7,2) por

20 min. e em seguida, lavadas com água destilada, secas ao ar e analisadas por observação

em microscópio óptico com objetiva de 100 x (imersão). A carga parasitária no fígado foi

monitorada através da contagem de LDU (“Leishman Donovan Units”) de Stauber =

número de amastigotas/1000 núcleos de células do órgão x peso do órgão em miligramas

(Bradley & Kirkley, 1977).

3.8 Análise estatística

As médias foram comparadas por análise de variância-ANOVA, teste simple

factorial (SPSS) e pelos métodos de Student-Newman-Keuls (SPSS for Windows) e/ou

Tukey´s honestly significant difference (SPSS for Windows).



33

IV. Resultados

4.1 Avaliação comparativa do efeito da degradação dos carboidratos na função


As estruturas das saponinas QS21 e CP05 tratadas com periodato de sódio e etileno-

glicol estão representadas na Figura 7. É possível observar a alteração estrutural em todas

as unidades glicídicas das saponinas que sofreram quebra das ligações entre as hidroxilas

vicinais, e o número aumentado de grupos aldeídos expostos, assinalados com asteriscos.

Durante a imunização dos camundongos com o antígeno FML e as saponinas

intactas e/ou oxidadas, a avaliação da toxicidade secundária demonstrou que enquanto as

saponinas intactas induziram apenas queda de pelo reversível no local da vacinação, o

tratamento químico com periodato de sódio aboliu este único efeito secundário indesejado

(Tabela 1). A queda de pêlos local foi transitória nos animais, voltando ao normal 7 dias

após a última dose vacinal.

Após a vacinação, os anticorpos anti-FML apresentaram variações significativas

entre os tratamentos para todos os tipos e subtipos de imunoglobulinas testadas (p< 0,0005,

ANOVA) exceto para IgA (Figura 8A). O efeito global foi o aumento significante dos

anticorpos, sobre o controle de salina, demonstrado apenas nos grupos tratados com as

saponinas intactas. O tratamento de oxidação dos carboidratos determinou, apesar do

número aumentado de aldeídos, um dramático decréscimo na indução de anticorpos,

indicando que a integridade das frações glicídicas é imprescindível para uma boa função

adjuvante das saponinas sobre a resposta humoral (Figura 8A). Diferente do observado

para os outros subtipos, as IgG1 induzidas se mantêm altas tanto nas saponinas intactas

quanto nas oxidadas. Também foi detectado um ligeiro aumento das absorbâncias do grupo

tratado com CP05 sobre o grupo tratado com QS21 (p<0,05; Student-Newman-Keuls-SPSS

for Windows). Os títulos de anticorpos gerados pelas saponinas CP05 ou QS21 são

comparáveis para todos os tipos de IgG menos para IgG2a (o subtipo ligado à proteção) no

qual, confirmando observações prévias, uma maior potência da QS21 foi observada,

provavelmente devido ao grupo aldeído ligado no C-4, presente na QS21 e ausente na

CP05.



34

Apenas o teor dos anticorpos IgA, IgM, IgG e IgG2b aumentou após o desafio (p<

0,021).

Após a infecção (Figura 8B) as diferenças entre os tratamentos são significantes

para todos os tipos e subtipos de imunoglobulinas testadas (p<0,007). Na maioria delas

observamos, assim como antes da infecção, uma maior potência da resposta induzida pelas

saponinas intactas e as respostas induzidas pelas saponinas oxidadas são significativamente

menores, confirmando a importância da integridade das cadeias glicídicas na indução da

resposta de anticorpos anti-FML. Assim como antes da infecção, a única exceção é a do

subtipo IgG1 no qual não se detectam diferenças entre os tratamentos e salina.

Surpreendentemente, a saponina QS21 oxidada é mais potente que a saponina intacta.

No que diz respeito à indução da resposta imune celular (Figura 9A e B), a IDR ao

lisado de promastigotas desaparece nas frações tratadas com periodato de sódio, tanto antes

quanto após a infecção, 24h e 48h após a injeção do antígeno. Apenas as saponinas com as

cadeias de carboidratos intactas induzem uma IDR eficaz e significativamente maior que a

do grupo controle de salina. Não houve diferenças significativas nas IDR antes ou após a

infecção indicando que a resposta era sustentável, tanto 24h (p= 0,441) como 48h (p=

0,998) após a injeção do antígeno.

Na Figura 10, a proliferação de esplenócitos in vitro contra o lisado de 106

promastigotas de L. (L.) chagasi apresentou diferenças entre os tratamentos vacinais (p=

0,000) mostrando níveis máximos, nos animais imunizados com vacina QS21FML. A

maior resposta foi notada contra o antígeno FML, porém as diferenças entre os tratamentos

vacinais não foram significantes. A proliferação contra a NH36 foi maior no grupo

imunizado com QS21 oxidada + FML (p=0.003). De forma conclusiva, as melhores

respostas foram obtidas para os grupos tratados com QS21 + FML ou QS21o + FML.

Após a infecção, na análise de fenotipagem de esplenócitos Leishmania-específicos

incubados com lisado de L. (L.) chagasi, foi possível observar um aumento de células T

CD4+ já no grupo controle salina, indicando que a infecção apesar de potente ainda não

tinha desencadeado imunossupressão celular (Figura 11). O grupo tratado com a vacina

CP05 + FML e com CP05 oxidada ainda demonstraram aumento de células T CD4+

semelhante ao controle de salina. Surpreendentemente, a saponina QS21 tratada ou não

com periodato de sódio, não induziu aumento da proliferação celular. Os níveis de células T



35

CD8+ se mantiveram normais em todos os grupos, apesar do esperado aumento nas

saponinas oxidadas, que conservaram a cadeia de normonoterpenos intacta.

Em concordância com o descrito para a resposta humoral e a resposta imune

celular, a carga parasitária no fígado está diminuída nos animais vacinados com a saponina

QS21 intacta (Figura 12). Existem diferenças significativas ente os tratamentos vacinais

(p=0,006, ANOVA). O grupo vacinado com a saponina QS21 intacta tem carga parasitária

reduzida a respeito do grupo tratado com salina, ou com QS21oxidada ou com CP05

oxidada (p<0,05; Student-Newman Keuls), confirmando a importância da integridade da

fração carboidrato das saponinas na sua função adjuvante.

4.2 Avaliação comparativa do efeito seletivo da remoção da cadeia de monoterpenos,



CP05.

A estrutura química da saponina intacta de Calliandra pulcherrima Benth (CP05),

da saponina isenta da cadeia de monoterpenos acilada na cadeia glicídica ligada no C-28

(BS), da saponina isenta de toda cadeia glicídica e também dos monoterpenos ligada no C-

28 (HS) e da saponina isenta das cadeias glicídicas ligadas no C-3 e no C-28 (sapogenina)

estão representadas na Figura 13. É possível constatar as semelhanças entre as saponinas

CP05 e QS21 (Figura 3), ambas contendo frações hidrofóbicas ligadas via açúcar no C-28

do triterpeno e ambas com cadeia longa de açúcares (4-5 unidades) associados ao C-28 e 3

açúcares associados ao C-23. Também é possível observar a presença do aldeído no C-4 do

triterpeno do ácido quiláico da QS21 (Figura 3) e a ausência de aldeído no ácido

equinocístico da CP05 (Figura 13).

Camundongos Balb/c foram vacinados com saponina CP05 intacta, BS, HS ou com

a fração sapogenina (100µg/ dose) em combinação com o antígeno FML (150µg/ dose).

A avaliação de toxicidade secundária encontra-se resumida na Tabela 2. A saponina

CP05 intacta induziu queda de pelos e lesão no local da aplicação, e um caso de letalidade

(10%) mostrando que o aumento da dosagem de 25 (Tabela 1) para 100µg (Tabela 2) está

acompanhado de um concomitante aumento da toxicidade, esperado para o uso de

saponinas. Embora estes efeitos deletéreos desapareçam com os tratamentos químicos da



36

CP05, as reações de dor na hora da aplicação inesperadamente aumentaram (50% na vacina

BS + FML, 80% na vacina HS + FML e 70% na vacina sapogenina + FML).

A Figura 14 sumariza os resultados da dosagem de anticorpos anti-FML nos

animais vacinados. Após completa imunização (Figura 14A) e também após infecção

(Figura 14B), diferenças significativas foram encontradas entre os diferentes tratamentos

para todos os tipos e subtipos de anticorpos (p= 0,0005, ANOVA). Todos os anticorpos

produzidos pela vacina CP05 + FML estavam significativamente aumentados a respeito do

controle de salina, exceto no caso das IgA, antes da infecção. A vacina BSFML também

demonstrou índices de anticorpos maiores que o controle de salina. Ambas as vacinas se

destacaram por apresentar as respostas mais elevadas em todos os subtipos de IgG (p<0,05,

“Tukey´s honestly significant difference, SPSS for Windows”), exceto para IgG1,

indicando que a cadeia de monoterpenos, ausente na saponina BS, não é necessária para

indução global de resposta humoral. Por outro lado, a vacina HS + FML apresentou índices

diminuídos de IgG, IgG2b, IgG3 e IgA; indicando que a integridade da cadeia glicídica

ligada ao C-28 é fundamental na indução destes anticorpos (Figura 14A). Chama a atenção

que no caso da vacina HS + FML, a produção de anticorpos IgG2a (subtipo relacionado

com a resposta imune protetora) está abolida após a imunização e é muito baixa após a

infecção (Figura 14A e B). Surpreendentemente, a vacina sapogeninaFML, que não possui

nenhuma cadeia glicídica, induziu aumento dos índices de IgG1, IgM e em menor

quantidade IgG2b.

No que diz respeito à evolução dos títulos de anticorpos, não houve aumento

significativo após a infecção uma vez que as absorbâncias já eram máximas após a

imunização (Figura 14A e B). Apenas o subtipo IgG2a, que foi nulo antes da infecção

demonstrou um suave aumento (p= 0,046) especificamente no caso da vacina HS + FML

(Figura 14A e B).

Logo após a imunização, diferenças significativas foram observadas na resposta de

IDR contra o lisado de Leishmania (L.) donovani nos diferentes tratamentos (p< 0,005;

24h e 48h após a injeção do antígeno) (Figura 15). O maior inchaço, foi detectado no caso

da vacina CP05 + FML, seguido pela vacina BS + FML. Diferente do que foi encontrado

na resposta imune humoral, na qual a vacina CP05 + FML e a vacina BS + FML foram

igualmente potentes, a indução de resposta IDR anti-Leishmania foi menor na vacina BS +



37

FML (Figura 15 B), indicando que este efeito seja mediado parcialmente pela cadeia de

monoterpenos acilada na cadeia glicídica ligada no C-28. Ambas as vacinas, no entanto,

demonstraram valores mais elevados que a vacina HS + FML e a vacina sapogenina + FML

(p<0.05, Tukey´s honestly significant difference), sugerindo que as cadeias glicídicas

íntegras ligadas no C-28 e no C-3 também contribuem parcialmente para nesta função. A

resposta de IDR medida após a infecção também demonstrou variações entre os tratamentos

(p<0,001) sendo a melhor resposta observada na vacina CP05 + FML (Figura 15B),

confirmando a relevância da cadeia hidrofóbica.

A análise fenotípica de esplenócitos após proliferação in vitro com lisado de

Leishmania (L.) chagasi (Figura 16A) mostrou variações significantes entre as diversas

vacinas para ambos linfócitos T CD4 + e T CD8+ (p< 0,003). A vacina BS + FML foi a

responsável por esta variação, demonstrando os valores mais elevados para ambas as

subclasses de linfócitos T: 22,34% de aumento nas células T CD4+ e 43,00% de aumento

nas células T CD8+, apesar da remoção de monoterpenos (Figura 16A).

A análise do IFN-ã nos sobrenadantes de esplenócitos estimulados com L.(L.)

chagasi revelou que todos as vacinas provocaram o seu aumento de secreção em relação ao

grupo controle salina (p<0,0005) (Figura 16B) com os valores mais altos detectados nos

animais tratados com a vacina BS + FML e HS + FML (3024 e 3125 pg/mL,

respectivamente).

Diferenças significativas entre os tratamentos (p<0,005) também foram encontradas

na avaliação de redução de carga parasitária no fígado. Para avaliar esta variável, um grupo

de controle tratado apenas com a saponina CP05 sem o antígeno FML, também foi incluído

(n=5). Uma redução significativa, a respeito dos grupos controles de salina e de saponina

CP05 apenas, foi detectada no grupo vacinado com BS + FML (94,0 %) seguida pelo grupo

tratado com CP05 + FML (92,1%). Não houve diferença significativa entre eles (p>0,05).

Estes resultados confirmaram a importância da integridade da fração glicídica da CP05 na

indução de resposta protetora e a ausência de reação inespecífica devida ao tratamento com

a saponina CP05 (Figura 17A).

Coincidentemente, o máximo de sobrevivência (100%) foi apresentada pela vacina

BS + FML, seguido pela vacina CP05 + FML (90%) (Figura 17B). Enquanto que os

controles de salina mostraram 70% de sobrevivência, a vacina HS + FML e a vacina



38

sapogenina + FML forneceram 60 e 50% de sobrevivência, respectivamente até o final do

experimento (Figura 17B).

Nenhuma proteção foi induzida pela vacina sapogenina + FML, o que correlaciona

com a sua diminuída resposta humoral, de secreção de IFN-ã e de IDR. Isto indica que o

núcleo triterpênico da saponina CP05, ácido equinocístico, que não apresenta aldeído, não é

um componente imunoestimulante.

Não se detectaram diferenças significativas no que diz respeito à variação de peso

corporal, hepato- ou esplenomegalia relativas, entre os diferentes tratamentos vacinais.



39

A

OO

N H

O

O

H

OH

OO

O

O

H

O

H

OH H

O

OH

O OO

H

H

O

OO

O

OO

H

O

H

O

O

O

O

O

H

OO

OHO

O

O

O H OH

O H

O

OH

OHO

O

H

OH

O

O O

H

O

OO

O

H

O

H

O

*

*

*

*

*

*

*

**

**

**

* *

*

*

*

*

*

*

*

*

O O

OHO

O

NHO

O

HO H

O

O

OHO

OH

O

OHHO

OH1

2

3

4 5

61

2

3

45

12

3

45

O OH

30

O O

12

34

56

7

89

10

1112

13

1415 16

1718

19 2021

22

23

24

2526

27

28

29

H

1

2

3

4

5

6

O

OHHO

O

HO

O

OHOHO

O

O

OHOHO

O

O

O

1

27

6

12

3

4 5

1

27

6

12

3

4

1

27

6

12

3

4

O

O

O

OHO

6O

O

HOOHOH

OH

O

HO OHO

O

HOOH

OH

45

2

3

1

45

3

21

1

23

4

5

12

3

4

56

65

5

MT'

MT"

MT'''

Xyl'''

Qui

Xyl''''

Ara'

Ara''GlcNAc

Glc'

Rha

Glc''

Xyl'

Xyl''

CP05

CP05o



40

B

Figura 7. Estrutura química das saponinas intactas CP05 (A) e QS21(B) e oxidadas com

periodato de sódio CP05o (A) e QS21o (B). *representam carbonilas de aldeídos,

*carbonilas de ésteres e *carbonilas de cetonas

O

OH

OH

O

OO

HO

O OH

OO

H

O H

HO

O

OH

H

O

O

O OH

O

OO

OO

H OH

O

OOH

O

OOH

OO

O

H

HO

HO

O

HO

OHO

O

OH

OHO

**

* *

*

**

**

*

*

*

*

**

QS21

H

OO

H

HH

H

13

24 5

6 7

8

910 11

1213

14

15

16

17

18

19 20

21

22

23

2425

26

27

28

29

30

O

O OHO

O

HO

OHHO

O

HO

OHHO

HO

OOH

O

O

HOOH

OH

OO

OHO

O

OH

HO

O

OH

HO

OH

O

O

O

OH

OOO

OH

H

O

OH HOO

HO

QS21o



41

Análise de toxicidade: animais que apresentaram alguma reação durante 21 dias.Grupos Dor Inchaço Queda de Pêlos Lesão Letalidade

Salina 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10

CP05 +FML 1/10 0/10 4/10 0/10 0/10

CP05o+FML 1/10 0/10 0/10 0/10 0/10

QS21 +FML 4/10 1/10 6/10 0/10 0/10

QS21o+FML 4/10 0/10 0/10 0/10 0/10

Tabela 1. Foram avaliados 5 parâmetros de indicação de toxicidade secundária dos animaisvacinados com saponinas intactas CP05 e QS21 e oxidadas com periodato de sódio: dor nomomento e após a administração da vacina, aparecimento de inchaço local, queda de pêloslocal e transitória, formação de lesões locais e letalidade. A avaliação foi feita diariamenteaté completa imunização de 10 animais por grupo.



42

A

B

0

0,5

1

1,5

2

2,5

1 2 3 4 5 6 7

Abs

492n

m ****# #

* ** **** * * * ** * *# # # # # # # # # #. .

0

0 , 5

1

1 , 5

2

2 , 5

Ig A Ig M IgG t IgG 1 IgG 2a IgG 2b IgG 3

492

nm

* *.# # # # # # # # # #

**** * ** * * **** *

Figura 8. Resposta humoral dos camundongos vacinados com as vacinasCP05 + FML, CP05o + FML, QS21 + FML, QS21o + FML. Anticorpos anti-FML após completa imunização dos camundongos Balb/c com o antígeno FMLem formulação com as saponinas íntegras ou tratadas com periodato de sódio(A) ou 30 dias após infecção com L.chagasi (B). Resultados apresentam a média± SD das absorbâncias individuais dos soros na diluição de 1/100 de cada grupode animais (n=10), no ensaio de FMLELISA. * Asteriscos marcam diferençassignificativas a respeito do controle de salina (ANOVA e Student-Newman-Keuls - SPSS for Windows). # marcam diferenças significativas a respeito deambas saponinas enriquecidas em aldeídos. marcam diferenças significativasa respeito de todos os grupos.

SalinaCP05+FMLCP05o+FMLQS21+FMQS21o+FML



43

Figura 9. Intradermorreação (IDR) reação contra lisado de promastigotas deLeishmania (L.) donovani. A resposta de intradermorreação foi avaliada nos camundongosBalb/c após completa imunização (A) com o antígeno FML em formulação com a saponinaCP05, CP05o, QS21ou QS21o, ou 28 dias após infecção com L (L.) chagasi (B). Osresultados são representados pelas médias ±SD dos inchaços das patas traseiras direitas doscamundongos (n=10 em cada grupo), 24 e 48 horas após injeção do lisado de promastigotasde L. (L.) donovani. Os valores de inchaço das patas contralaterais injetadas com salinaestéril controle já foram descontados. *Asteriscos marcam diferenças significativas emrelação ao controle salina (ANOVA e Student-Newman-Keuls - SPSS for Windows). #marcam diferenças significativas a respeito de ambas saponinas enriquecidas oxidadas.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

salina

CP05+

FML

CP05C

HO+FM

L

QS21+

FML

QS21C

HO+FM

Lsali

na

CP05+

FML

CP05C

HO+FM

L

QS21+

FML

QS21CH

O+FM

L

mm

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

salina

CP05+

FML

CP05C

HO+FM

L

QS21+

FML

QS21C

HO+FM

Lsali

na

CP05+

FML

CP05C

HO+FM

L

QS21+

FML

QS21C

HO+FM

L

mm

* * * *

24h 48h

# # # #

24h 48h

# # # #

* * * *

A

B

SalinaCP05+FMLCP05o+FMLQS21+FMLQS21o+FML



44

Figura 10. Proliferação in vitro de esplenócitos Leishmania-específicos. Células de baçode animais vacinados ou controles (n=3 animais por grupo) foram incubadas com (deesquerda à direita): lisado de promastigotas de L (L.) chagasi (105 a 107

promastigotas/poço), FML eluído de nitrocelulose (25µg/poço) e proteína NH36recombinante (0,4 ug/poço) durante 2 dias, seguindo-se a adição de MTT e incubação por4h. A reação foi parada com SDS 10% e leitura feita a 570ηm. As barras representam amédia ± SD dos valores de proliferação. *Asteriscos marcam diferenças significativas arespeito do controle de salina (ANOVA e Student-Newman-Keuls - SPSS for Windows). marcam diferenças significativas a respeito de todos os grupos.

0

20

40

60

80

100

Esp

lenó

cito

s(%

)

Figura 11. Fenotipagem de linfócitos. Células de baço de animais vacinados ou deanimais controle (pool de 3 animais por grupo) foram incubadas com lisado de 106

promastigotas de L.(L.) chagasi em fase estacionária, durante 5 dias a 37º C sob atmosferade CO2. Depois deste período, os esplenócitos foram tratados com anticorpos anti-CD4FITC (barra da esquerda) ou anti-CD8 FITC (barra da direita) e analisados por citometriade fluxo. *Asteriscos marcam diferenças significativas em relação ao controle de salina(ANOVA e Student-Newman-Keuls - SPSS for Windows). marcam diferençassignificativas a respeito de CP05 e CP05o

00,05

0,10,15

0,20,25

0,30,35

1 2 3 4 5

Abs

570n

m *.

*

*





45

0

50

100

150

200

250

%de

LDU

fígad

o

Figura 12. Carga parasitária de fígado. A proteção contra leishmaniose visceral murinainduzida por três doses de 150 µg de antígeno FML e 25 µg de saponina QS21, QS21o,CP05 ou CP05º (n=10/grupo) foi monitorada em LDU (“Leishman Donovan units ofStauber” = número de amastigotas / 1000 núcleos celulares x peso do fígado em mg).Animais controle foram tratados apenas com salina. As barras representam a média ± SDdo percentual de valores de LDU relativo ao grupo controle de salina, para cada grupo deanimais. * marcam diferenças significativas em relação ao grupo salina, marcamdiferenças significativas a respeito dos grupos tratados com QS21o e CP05o (ANOVA eStudent-Newman-Keuls - SPSS for Windows).


*



46

Figura 13. Estruturas químicas da saponina CP05 de Calliandra pulcherrima Benth e suasfrações. Saponina CP05; fração BS obtida após hidrólise alcalina suave; fração HS obtida apóshidrólise alcalina drástica e a fração sapogenina correspondente ao ácido equinocístico. As setaspretas indicam o local de remoção das cadeias glicídicas pelos processos de hidrólise.

O

NHO

O

HO H

O

O

OHO

OH

O

OHHO

OH1

2

3

4 5

61

2

3

45

12

3

45

O OH

30O OH

12

34

56

7

89

10

1112

13

1415 16

1718

19 2021

22

23

24

2526

27

28

29

A ra '

A ra''GlcNA c

O O

OHO

OH

O

NHO

O

HOH

O

O

OHO

OH

O

OHHO

OH1

2

3

4 5

61

2

3

45

12

3

45

O OH

30

O O

12

34

56

7

89

10

1112

13

1415 16

1718

19 2021

22

23

24

2526

27

28

29

H

1

2

3

4

5

6

O

OHO

6O

O

HOOHOH

OH

O

HO OHO O

HO OHOH

45

2

3

1

45

3

21

1

23

4

5

12

3

4

56

Ara'

A ra''GlcNAc

Glc'

Rha

Glc''

Xyl'

Xyl''

O O

OHO

O

NHO

O

HOH

O

O

OHO

OH

O

OHHO

OH1

2

3

4 5

61

2

3

45

12

3

45

O OH

30

O O

12

34

56

7

89

10

1112

13

1415 16

1718

19 2021

22

23

24

2526

27

28

29

H

1

2

3

4

5

6

O

OHHO

O

HO

O

OHOHO

O

O

OHOHO

O

O

O

1

27

6

12

3

4 5

1

27

6

12

3

4

1

27

6

12

3

4

O

O

O

OHO

6O

O

HOOHOH

OH

O

HO OHO

O

HO OHOH

45

2

3

1

45

3

21

1

23

4

5

12

3

4

56

65

5

M T'

M T"

M T '''

Xy l'''

Qu i

X yl''''

A ra '

A ra ''GlcNA c

Glc '

Rh a

Glc''

Xy l'

Xy l''

HS

CP05

BS

Sapogenina



47

Análise de toxicidade: animais que apresentaram alguma reação durante 21 dias.

Grupos: Dor Inchaço Queda de Pêlos Lesão Letalidade

salina 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10

CP05 + FML 0/10 0/9 7/9 3/9 1/10

BS + FML 5/10 0/10 1/10 0/10 0/10

HS + FML 8/10 0/10 0/10 0/10 0/10

Sapogenina+ FML 7/10 0/10 0/10 0/10 0/10

Tabela 2. Foram avaliados 5 parâmetros de indicação de toxicidade secundária: dor nomomento e após a administração da vacina, aparecimento de inchaço local, queda de pêloslocal e transitória, formação de lesões locais e letalidade. A avaliação foi feita diariamentepor 7 dias após cada dose, até completa imunização de 10 animais em cada grupo.



48

A0

0,5

1

1,5

2

2,5

IgA IgM IgGt IgG1 IgG2a IgG2b IgG3

Abs

492

nm

* *** * *** ** ** ** ** ** ***#

0

0 ,5

1

1 ,5

2

2 ,5

I gA I gM I gG t I gG 1 I gG 2a I gG 2b I gG3

Abs

492

nm

IgA IgM IgG IgG1 IgG2a IgG2b IgG3

.. .. .. ..

* ** **** **** **** ** * ** * *.. .. .. .. .. . ..#

salina

BS + FML

pré-imune

HS + FML

CP05 + FML

sapogenina + FML

B

Figura 14. Resposta humoral dos camundongos vacinados com FML esaponina CP05 e suas frações. Anticorpos anti-FML após completa imunizaçãodos camundongos Balb/c com o antígeno FML em formulação com a saponinaCP05, BS, HS ou sapogenina (A) ou 30 dias após infecção com L.(L.) chagasi(B). As barras representam a média ± SD das absorbâncias individuais dos sorosdiluídos 1/100, de cada grupo de animais (n=10), no ensaio de FMLELISA.*Asteriscos marcam diferença significativa em relação ao controle salina (p <0,05; Tukey`s honestly significant difference – SPSS for Windows). # indicamdiferença significante para todas as outras frações. indicam diferençasignificante entre os animais tratados com a HS e a sapogeninaFML.



49

Figura 15. Intradermorreação (IDR) contra antígenos de promastigotas deLeishmania (L.) donovani. Esta foi avaliada nos camundongos Balb/c após completaimunização com o antígeno FML em formulação com a saponina CP05, BS, HS ousapogenina (A) ou 28 dias após infecção com L.chagasi (B). As barras representam médias±SD dos inchaços nas patas dos camundongos (n=10 em cada grupo) inoculadas comantígeno, subtraídas das medidas das patas inoculadas com salina estéril, 24 e 48 horas apósinjeção. * Asteriscos indicam diferença significativa em relação ao controle de salina (p<0,05; Tukey`s honestly significant difference – SPSS for Windows). # indicam diferençasignificativa para todas as outras frações. indicam diferença significativa entre os animaistratados com a HS e a sapogeninaFML.

A

#

. .* * #

* *

24h 48h. .

00,20,40,60,8

11,21,4

Salin

a

CP0

5+FM

L

CP0

5BS+

FML

CPO

5HS+

FML

AGL+

FML

Salin

a

CP0

5+FM

L

CP0

5BS+

FML

CPO

5HS+

FML

AGL+

FML

mm

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

Salina

CP05+

FML

CP05B

S+FML

CPO5

HS+FM

L

AGL+F

MLSal

ina

CP05+

FML

CP05B

S+FML

CPO5HS

+FML

AGL+F

ML

mm

B

*#

24h 48h

.

*

salina

BS+FMLHS+FML

CP05+FML

Sapogenina+FML



50

0500

100015002000250030003500

1

pg/m

L

Figura 16. Fenotipagem de linfócitos e secreção de IFN-ã nos sobrenadantes deesplenócitos após proliferação in vitro contra antígeno de Leishmania. Células de baçode animais vacinados ou de animais controle (n=3 animais por grupo) foram incubadas comlisado de 106 promastigotas de L.(L.) chagasi em fase estacionária, durante 5 dias a 37º Csob atmosfera de CO2. Depois deste período, os esplenócitos foram tratados com anticorposanti-CD4 FITC ou anti-CD8 FITC e analisados por citometria de fluxo (A). O IFN-ãsecretado (pg/mL) nos sobrenadantes dos esplenócitos incubados durante 2 dias com 106

promastigostas de L.(L.) chagasi foi dosado por ensaio de ELISA (B). As barrasrepresentam médias ± SD dos resultados individuais (n=3). * Asteriscos indicam diferençasignificativa em relação ao controle de salina (p < 0,05; Tukey`s honestly significantdifference – SPSS for Windows). # indicam diferença significativa entre todas as outrasfrações.

* * * *

salina

BS+FMLHS+FML

CP05+FML

Sapogenina+FML

0

10

20

30

40

50

60

Salina Lch10x6 CP05+FM LLch10x6

CP05BS+FM LLch10x6

CP05HS+FM LLch10x6

AGLICONA+FM LLch10x6

Esp

lenó

cito

s(%

)

# #* *

A

# #

106 proB



51

0 10 20 30 40 50 600

50

100

150salCP05+FMLBS+FMLHS+FMLsapogenina+FML

tempo(dias)

%so

brev

ivên

cia

Figura 17. Carga parasitária de fígado e curva de sobrevivência dos animaisvacinados e infectados. A proteção contra leishmaniose visceral murina foi induzida portrês doses de 150 µg de antígeno FML e 100 µg de saponina CP05, BS, HS ou sapogeninafoi monitorada por LDU unidades de Stauber (número de amastigotas / 1000 núcleoscelulares x peso do fígado em mg). Animais controle foram tratados apenas com salina ouCP05 ( n=10, dois experimentos) (A). A curva de sobrevivência Kaplan-Meier representa opercentual de sobrevivência no tempo decorrido em dias, entre o dia de infecção (dia 0) e odia de morte por leishmaniose visceral em cada grupo de camundongos (B). As barras em(A) representam a média ± SD do percentual de valores de LDU relativo ao grupo controlede salina, para cada grupo de animais (n= 10). *Asterisco indica diferença significativa (p <0,05); Tukey`s honestly significant difference – SPSS for Windows) para os controles desalina e saponina CP05.

L

salinaControle CP05CP05+FMLBS+FMLHS+FMLSapogenina+FML

* *

B

0

40

80

120

160

200

240

280

SAL CP05 CP05FM L BSFM L HSFM L SAPGFM L

%de

LDU

fígad

o

92,1% 94,0%

A



52

V. Discussão

As saponinas são adjuvantes imunoestimulatórios que se destacam pela sua

capacidade de estimular as respostas imunes humoral, celular e citotóxica contra os

antígenos com as quais são formuladas (Marciani et al., 2001; Kensil et al., 1998). Por

essas razões, elas são boas candidatas para adjuvantes em vacinas contra parasitas

intracelulares obrigatórios. Entre elas, a saponina QS21 da Quillaja saponaria Molina se

destaca pela sua potência, efeito imunoprotetor e relativa baixa toxicidade (Marciani et al.,

2001). A saponina QS21, junto com duas saponinas contendo aldeídos, porém deaciladas,

tem demonstrado ser os princípios ativos da mistura de saponina Riedel de Haen (Santos et

al., 2002; Silva et al., 2005; Oliveira-Freitas et al., 2006), adjuvante das vacinas FML-

saponina e Leishmune ®, que mostraram um potente efeito imunoprofilático e

imunoterápico nos modelos murino e canino experimental e natural de leishmaniose

visceral (Santos et al., 1999; da Silva et al., 2000; Santos et al, 2002; Borja-Cabrera et al.,

2002; Borja-Cabrera et al., 2004; Nogueira et al., 2005, Oliveira-Freitas et al., 2006;

Saraiva et al., 2006). Tem-se atribuído muita importância à cadeia hidrofóbica de

normonoterpenos da saponina QS21 na indução de resposta proliferativa de linfócitos

(Marciani, 2003) e/ou da resposta citotóxica (CD8+) (Rhodes, 1996; Rhodes, 2002;

Marciani, 2003; Borja-Cabrera et al., 2004). Também a presença de um aldeído no C-4 do

núcleo triterpeno foi correlacionada com a indução da resposta TH1 de linfócitos, através

da simulação da molécula co-estimulatória B7, e/ou pela formação de bases de Schiff na

superfície de linfócitos, imitando o sinal gerado pela interação do ligante B7 no receptor

CD-28, mas sem o efeito de “down–regulation” do receptor de linfócitos CTLA4 (Rhodes,

1996; Rhodes, 2002; Marciani, 2003). Tanto a cadeia hidrofóbica de normonoterpenos

como a presença de aldeído no C-4 são muito raras em saponinas (Schenkel et al., 2002) e

explicam o destaque do potencial adjuvante da saponina QS21, justificando a sua ampla

utilização em vacinas veterinárias (Schetters et al., 1992; Ma et al., 1995; da Silva et al,

2000; Schetters et al., 2001; Barnet & Statham, 2002; Borja-Cabrera et al., 2002; Borja-

Cabrera et al., 2004 Schetters et al., 2006) e humanas contra malária, melanoma e infecção

por HIV (Wu et al., 1992; Stoute, et al., 1997, Ragupati et al., 2003; Slovin et al., 2005).

A literatura registrava a descrição de outras saponinas contendo frações hidrofóbicas

aciladas em açúcares ligados ao C-28 do triterpeno, isoladas da planta Calliandra



53

annomala (Takeda et al., 1993). Assim como a QS21, elas contêm também, duas frações

glicídicas ligadas no C-3 e no C-28 do triterpeno, respectivamente.

Recentemente, foi isolada da planta brasileira Calliandra pulcherrima Benth, a

saponina CP05 (Silva et al., 2005), que devido as grande número de semelhanças com a

saponina QS21, se tornou o nosso objeto de estudo (Nico et al., 2006). A saponina CP05 se

diferencia das saponinas da Calliandra annomala apenas no tamanho da cadeia hidrofóbica

(Takeda et al., 1993; Silva et al., 2005). Enquanto que a saponina CP05 alterna três

terpenos com duas unidades de xilose e uma de quinoviose (Silva et al., 2005), a saponina

da Calliandra annomala apresenta uma unidade de xilose entre dois monoterpenos

consecutivos (Takeda et al., 1993). Assim mesmo, enquanto não existe a descrição do

efeito biológico da saponina da Calliandra annomala, Silva et al. (2005) descreveram o

excelente potencial adjuvante da saponina CP05 da Calliandra pulcherrima Benth,

especificamente no modelo de vacinação contra a leishmaniose visceral murina com o

antígeno FML. Nesse trabalho, o potencial da saponina CP05 foi comparável ao da QS21

purificada a partir da saponina Riedel de Haen (Silva et al., 2005). De fato, ambas

apresentaram índices hemolíticos e os títulos de anticorpos anti-FML gerados foram

semelhantes para todos os tipos e subtipos de imunoglobulinas. Enquanto que a QS21

induziu 2 vezes maiores títulos do que a CP05 no subtipo protetor IgG2a, na indução de

títulos de IgG2b, ambas QS21 e CP05 foram igualmente potentes. Esta diferença na

indução da IgG2a em favor da QS21 foi atribuída à presença do aldeído em C-4 (Silva et

al., 2005). Estes resultados confirmaram os de Soltysik et al., (1995), que encontraram

diminuídos títulos de IgG2a em camundongos vacinados com QS21 bloqueada

quimicamente no aldeído com glicina, etilamina e etilenodiamina. Por outro lado, a

presença da cadeia hidrofóbica na CP05 podia explicar o forte estímulo na resposta imune

celular evidenciado através da IDR contra o antígeno de L.(L.) donovani (Silva et al.,

2005).

A presença de aldeídos ou cetonas nas frações sapogeninas das saponinas é muito

rara e apenas descrita para as saponinas de Quillaja saponaria Molina, Saponaria e

Gypsophila (Bomford et al., 1992). Coincidentemente, as três saponinas, além de

apresentar semelhanças na aglicona, apresentam glicosilação e ramificação no C-3 e no C-



54

28 dos triterpenos, características estas às quais foi atribuída enorme importância nos

respectivos potencias adjuvantes (Bomford et al., 1992).

Uma vez comprovado o potencial adjuvante da saponina CP05 e cientes da

necessidade do desenvolvimento de novos adjuvantes passíveis de serem utilizados em

vacinas contra parasitas intracelulares obrigatórios, continuamos no presente trabalho, o

estudo do potencial adjuvante da saponina CP05 tentando caracterizar a contribuição

seletiva de cada uma de suas frações (Nico et al., 2006).

Inicialmente, visamos comprovar a importância das cadeias de carboidratos da

CP05 e da QS21 nos respectivos potencias adjuvantes através da sua oxidação com 50 mM

de periodato de sódio, que quebra as ligações entre as hidroxilas vicinais (Sharon, 1975).

Pelo método usado nesta investigação e por Mislovicová (2002), as hidroxilas vicinais

acabam se transformando em aldeídos expostos. A oxidação das cadeias glicídicas íntegras

diminuiu a toxicidade secundária evidenciada. De fato, a queda de pêlos no local da injeção

foi abolida, indicando que as cadeias glicídicas íntegras eram as responsáveis por esta

reação. Confirmando os nossos resultados, Ronnberg et al. (1997), usando uma fração de

Quillaja saponaria Molina (100µg da saponina QH-B), descreveram que o tratamento

idêntico com periodato de sódio reduz a mortalidade de camundongos vacinados. Este

efeito somente aparece com a utilização do periodato de sódio em concentrações de 25 a

50mM. Assim mesmo, reações de queda de pêlos local eram ausentes em animas vacinados

com as frações sapogeninas isentas de glicídios e normonoterpenos, obtidas das saponinas

QuilA e Riedel de Haen (Palatnik de Sousa et al., 2004). Por outro lado, os resultados de

Oliveira-Freitas et al., (2006) sugeriam que era a fração hidrofóbica, e não as cadeias de

glicídios, a responsável pela queda de pêlos uma vez que as saponinas deaciladas (sem

normonoterpenos) contendo carboidratos íntegros, não apresentam este efeito deletério.

Nossos resultados da presente investigação coincidem também, revelando que a queda de

pêlo causada pela saponina CP05 íntegra está diminuída na saponina BS, que mantém os

carboidratos íntegros porém é isenta da cadeia de monoterpenos (Nico et al., 2006). Uma

possível explicação deste efeito do periodato de sódio consiste em que tanto no trabalho de

Ronnberg et al., (1997) como na presente investigação, a cadeia de monoterpenos ou

normonoterpenos não é removida, mas é entretanto alterada pelo tratamento com periodato

de sódio, pela quebra dos açúcares intercalados entre os terpenos, diminuindo a toxicidade.



55

Concluímos que a toxicidade secundária é devida à contribuição parcial das cadeias

glicídicas e hidrofóbicas das saponinas.

Os grupos de animais vacinados com as saponinas oxidadas revelaram resposta

imune humoral intensamente reduzida, exceto para o subtipo IgG1. Estes resultados

sugerem que os carboidratos não seriam necessários para a indução da síntese de IgG1. A

fração sapogenina isolada da CP05 (Nico et al., 2006) e as sapogeninas da Riedel de Haen e

da QuilA (Palatnik de Sousa et al., 2004) parecem as responsáveis pela indução deste

estímulo. Marciani (2003) considera a síntese de IgG1 como parte da resposta TH2,

induzida pela fração normonoterpeno da saponina. Entretanto, os nossos resultados com a

saponina BS isenta de terpenos (Nico et al., 2006), e os resultados das saponinas da

Quillaja isentas de terpenos (Oliveira-Freitas et al., 2006) contrariam essa hipótese.

Os títulos de anticorpos gerados pelas saponinas CP05 ou QS21 intactas são

comparáveis para todos os tipos de IgG menos para IgG2a (o subtipo ligado à proteção) no

qual, confirmando observações prévias, uma maior potência da QS21 foi observada,

provavelmente devido ao grupo aldeído ligado no C-4 (Soltysik et al., 1995; Rhodes, 1996;

Marciani, 2003;), presente na QS21 e ausente na CP05, conforme discutido acima. A

importância das cadeias glicídicas na indução da maioria de tipos e subtipos de anticorpos

foi confirmada nos experimentos com a saponina BS isenta de terpenos, que mostrou

resposta humoral praticamente idêntica à gerada pela CP05 (Nico et al., 2006).

Particularmente, a cadeia ligada ao C-28 se mostra relevante, especialmente no subtipo

IgG2a, uma vez que a saponina HS, que só possui açúcares ligados ao C-3 demonstra uma

resposta humoral muito falha, semelhante ou até menor que a da sapogenina (Nico et al.,

2006). Estes resultados se correlacionam com os de Bomford et al. (1992), que revelam

uma resposta de anticorpos mais fortes geradas pelas saponinas de Quillaja saponaria

Molina, Saponaria e Gypsophila que possuem cadeias de açúcares ramificadas ligadas ao

C-3 e ao C-28. Outras saponinas menos glicosiladas ou glicosiladas em outros carbonos

não induziram resposta de anticorpos (Bomford et al., 1992).

A importância funcional das cadeias de carboidratos é tão grande, que a sua

destruição pela oxidação com periodato de sódio suprime as suas principais funções. A

remoção destes efeitos não é compensada pelo aumento do número de aldeídos expostos

subsequente ao tratamento, apesar da relevância demonstrada pelo aldeído ligado ao C-4 do



56

triterpeno da saponina QS21. Podemos interpretar que a localização espacial deste aldeído é

o que torna a sapogenina imunoestimulante (Palatnik de Sousa et al., 2004). Inclusive a

posição axial do aldeído da sapogenina da Riedel De Haen orienta o predomínio da indução

de uma resposta humoral contra o antígeno (Palatnik de Sousa et al., 2004).

No que diz respeito à resposta de IDR, a oxidação das cadeias glicídicas também

causou perda do potencial de ambas as saponinas QS21 e CP05, tanto antes quanto após a

infecção. Isso sugere que a indução de resposta celular também é mediada pelas cadeias de

carboidratos íntegros. Entretanto a saponina BS, que mantém as suas frações glicídicas

intactas, já apresenta um ligeiro declínio da resposta IDR, indicando o envolvimento da

fração hidrofóbica ligada ao C-28 (Nico et al., 2006). Esta condição coincide com a

hipótese de Marciani, 2003, que atribui a fração hidrofóbica da QS21 o papel estimulador

da proliferação de linfócitos T, e com os resultados de Oliveira-Freitas et al., (2006) que

descrevem a IDR ativa apenas nos animais tratados com QS21 e não nos tratados com

saponinas naturalmente deaciladas.

Confirmando esta hipótese, a proliferação celular de esplenócitos Leishmania–

específicos in vitro, estava aumentada significativamente no grupo tratado com QS21,

seguida do grupo tratado com a QS21 oxidada, enquanto que a expansão dos linfócitos

CD4+ Leishmania-específicos foi detectada na CP05 íntegra, seguida da CP05 oxidada,

indicando que a oxidação com periodato de sódio não prejudicava nem a proliferação

celular in vitro, nem a expansão de linfócitos CD4+. Apesar de que em ambas variáveis era

esperada a indução do efeito por ambas as saponinas QS21 e CP05, podemos extrair dos

resultados obtidos, que assim como visto no caso da IDR, as respostas proliferativas de

linfócitos in vitro estão provavelmente associadas com a fração hidrofóbica das saponinas

em questão. Assim como observado para a IDR contra o antígeno de Leishmania, a

proliferação de linfócitos in vitro e a expansão de linfócitos CD4+ parecem estar associadas

às frações hidrofóbicas das saponinas (Marciani et al., 2000; Marciani et al., 2001; Liu et

al., 2002; Marciani, 2003; Oliveira-Freitas et al., 2006).

Os resultados sobre expansão CD4+/CD8+ são entretanto conflitantes, uma vez que,

o experimento de vacinação com saponina BS (Nico et al., 2006), isenta de monoterpenos,

mostrou nela o melhor perfil de proliferação in vitro tanto de células CD4 como de CD8,

sugerindo que o paradigma de que a indução da resposta proliferativa e citotóxica é



57

atribuída para a fração hidrofóbica da QS21 (Liu et al., 2002; Marciani, 2003; Borja-

Cabrera et al., 2004) possa não ser válido no caso da saponina CP05. Futuros estudos nesta

nova saponina poderão esclarecer esta questão. Paralelamente, ambas as vacinas BS + FML

e HS + FML, induziram um aumento na secreção de IFN-ã, que é característico de uma

resposta imune celular TH1 (Nico et al., 2006). Isto indica que, embora a cadeia

hidrofóbica seja indicada como a mais relacionada com a resposta imune celular (Marciani,

2003), a presença das cadeias glicídicas intactas ligadas no C-3 e no C-28 da saponina

CP05 mantêm a secreção sistêmica de IFN-ã.

No que diz respeito à proteção vacinal evidenciada pela redução da carga parasitária

no fígado, demonstramos que a oxidação com periodato de sódio destrói o efeito protetor

adjuvante das duas saponinas: QS21 e CP05, sugerindo a importância das cadeias glicídicas

nesta variável. Confirmando esta hipótese, a saponina BS contendo a fração glicídica

intacta mostrou um efeito protetor comparável ao da saponina CP05 intacta (Nico et al.,

2006). Foi visto na saponina BS uma impressionante redução de carga parasitária no fígado

e máxima sobrevivência dos animais, sugerindo que a as cadeias glicídicas intactas, e não

apenas à fração hidrofóbica de monoterpenos, sejam necessárias para um efetivo efeito

adjuvante e uma vacinação protetora. Já a remoção da cadeia glicídica ligada ao C-28, ou

de ambas as cadeias glicídicas ligadas no C-3 e no C-28, determinaram a perda de efeito

protetor e também o aumento do número de mortes dos animais (Nico et al., 2006). Em

trabalhos anteriores, usando a saponina QS21 e saponinas deaciladas purificadas da mistura

comercial Riedel de Haen, foram observados resultados similares, confirmando a relevância

das cadeias glicídicas na função adjuvante destas raras saponinas (Oliveira-Freitas et al.,

2006).

Vale salientar que o efeito protetor da vacina CP05 + FML contra a leishmaniose

visceral é específico, uma vez que não houve contribuição do tratamento com saponina

CP05 apenas, na redução da carga parasitária (Nico et al., 2006).

Trabalhos anteriores atribuíram funções biológicas importantes para as cadeias

glicídicas das saponinas (Bomford et al, 1992; Takechi e Tanaka, 1995; Santos et al, 1997;

Bernardo, 1998). Em relação, por exemplo, à capacidade de lisar hemácias, o mais alto

potencial hemolítico foi descrito para as saponinas esteroidais, enquanto que o mais baixo

potencial foi descrito para as saponinas triterpênicas (Takechi e Tanaka, 1995; Santos et al,



58

1997). Está descrito que uma forte atividade hemolítica pode ocorrer em contato com a

saponina QS21 (A= 5,3-23 µg/mL) (Oliveira-Freitas et al., 2006; Palatnik de Sousa et al,

2004). Entretanto, as saponinas deaciladas, que são isentas dos normonoterpenos,

apresentam diminuição do potencial hemolítico (Oliveira-Freitas et al, 2006; Pillion et al,

1996). E a ausência de hemólise foi observada utilizando a fração sapogenina (núcleo

triterpênico) de QS21, isenta das cadeias de carboidratos (Palatnik de Sousa et al., 2004).

Saponinas triterpênicas de Periandra mediteranea e Bredemeyera floribunda não

apresentam a cadeia hidrofóbica ligada ao C-28 e apresentam uma cadeia glicídica ligada

no C-3 (Santos et al., 1997) ou uma cadeia ligada no C-3 e outra no C-28 (Daros et al.,

1996), respectivamente. Estas saponinas tornaram-se não-hemolíticas após a remoção das

cadeias glicídicas. Bernardo (1998) estudou uma série de cinco saponinas isoladas de

Albizia saman que apresentam cadeias glicídicas ligadas no núcleo triterpênico no C-1, C-3

e C-28. As saponinas mais hemolíticas foram aquelas que demonstraram maior teor de

carboidratos (7-8 unidades de açúcares). A saponina PSAGLE também contendo longa

cadeia de açúcares (quatro unidades) ligada no C-28, foi a saponina que induziu a mais

forte resposta de anticorpos IgG1, IgG2a e IgG2b contra o antígeno FML (Bernardo,

1998). Sun et al. (2005), isolaram as saponinas Rd, RB1, R4 e K do Panax notoginseng,

todas elas contendo pelo menos 3 unidades de glucopiranose, duas cadeias glicídicas nas

posições C-3 e C-20 da aglicona e o mesmo esqueleto de 20(s) protopanaxadiol. Elas

diferem entre elas pela ligação da cadeia de açúcar no C-3 da aglicona e pelo número de

açúcares na cadeia ligada ao C-20. As cadeias glicídicas estam ligadas na aglicona destas

saponinas por uma ligação O-glicosídica o que as torna, em comparação as saponinas de Q.

saponaria (Marciani 2003), mais estáveis em solução aquosa (Sun et al., 2005).

Posteriormente, os autores (Sun et al., 2006) reportaram o estudo de estrutura-função

dessas saponinas, observando como o número, comprimento da cadeia glicídica,

localização da mesma e tipo de grupamento glicosídico afetam as atividades hemolíticas e a

resposta imune a ovalbumina no modelo murino.

Em solução aquosa, moléculas anfifílicas, tais como sabões e detergentes formam

micelas que são agregados de moléculas em contato com água (Voet, 1995). As soluções

aquosas diluídas de moléculas anfifílicas não formam micelas. Para a formação de micelas

é necessário que estas atinjam uma determinada concentração, que é denominada



59

concentração crítica micelar (cmc). Somente nessa condição ocorre a formação dos

agregados moleculares. Nas micelas, a porção hidrofílica das moléculas é direcionada para

o exterior (Voet, 1995), enquanto que a porção hidrofóbica das moléculas é encontrada no

interior da mesma. A saponina QS21 intacta forma micelas em menor concentração (100

µM) que a saponina QS21 deacilada, que é menos hidrofóbica (Pillion et al, 1996).

Bomford et al. (1992) demonstraram também que as saponinas da Quillaja saponaria

formam melhores micelas (ISCOMs) do que as saponinas que carecem de ramificações

hidrofóbicas. Neste trabalho, ambas as saponinas CP05 intacta e a BS deacilada

provavelmente formam micelas, uma vez que foram utilizadas na concentração de 194 µM

e 302 µM respectivamente. Entretanto, a saponina QS21 (Palatnik de Sousa et al., 2004),

usada nas concentrações acima da cmc (253,3 µM) (Pillion et al., 1996), demonstrou alto

potencial hemolítico, indicando que a capacidade de promover hemólise está relacionada à

exposição de moléculas glicídicas das saponinas e não da cadeia hidrofóbica dos

normonoterpenos, como sugerido primeiramente (Marciani, 2003). Devido à concentração

utilizada, a fração hidrofóbica encontra-se dentro das micelas (Pillion et al., 1996).

Suportando esta hipótese, a hemólise induzida pela saponina está relacionada com o

aumento do número de unidades de açúcares nas ramificações das saponinas (Osbourn,

1996a). A saponina QS21 apresenta três e quatro unidades de açúcares ligadas no C-3 e no

C-28, respectivamente (Marciani, 2003); enquanto que a saponina CP05 possui três e cinco

unidades de açúcares nas mesmas posições (Silva et al., 2005). No presente trabalho então,

as micelas formadas pela CP05 apresentariam a cadeia hidrofóbica no interior da micela, o

núcleo triterpênico constituindo a membrana e as cadeias glicídicas (ligadas no C-3 e no C-

28) expostas para a parte exterior da micela. Desse modo, as micelas formadas pela

saponina deacilada BS também poderia manter o núcleo triterpênico na membrana e expor

as cadeias glicídicas na parte exterior da micela (Nico et al., 2006).

Outra evidência da importância das cadeias glicídicas das saponinas na interação

entre micelas e células apresentadoras de antígeno surgiu do estudo dos adjuvantes

ISCOMS. Os ISCOMS são nanopartículas (40 ηm) usadas como sistemas de liberação de

antígenos nas preparações vacinais. São constituídos de saponinas de Quillaja saponaria,

lipídios e antígeno; usualmente unidos por interações hidrofóbicas entre os três

componentes (Morein et al, 2004). As saponinas de Quillaja saponaria, que compõem o



60

ISCOM-MATRIX apresentam afinidade com colesterol, o que promove estabilização do

complexo formado (Morein et al., 2004). Como esperado para outras micelas, nos

ISCOMS, a porção hidrofóbica dos normonoterpenos da saponina QuilA provavelmente é

orientada para a parte interior da vesícula, interagindo com os lipídios presentes.

Confirmando esta hipótese, a inclusão de derivados de QuilA aumentam a imunogenicidade

dos ISCOMS (Morein et al., 2004) e reduz a propriedade lítica das saponinas, atribuída à

porção hidrofóbica dos normonoterpenos, que não se encontra mais exposta (Marciani,

2003). Os ISCOMS contendo saponina QuilA estimulam tanto a apresentação de antígeno

via MHC de classe I quanto via MHC de classe II; induzindo o aumento da proporção de

células T CD4+ “helper” e de células T CD8 citotóxicas, respectivamente, devido a sua

capacidade de depositar antígeno, em vesículas endossomais e/ou diretamente no citosol

(Morein et al., 2004).

De acordo com as considerações anteriores, torna-se possível compreender que a

saponina deacilada BS, embora isenta da cadeia hidrofóbica de monoterpenos, mantenha a

hidrofobicidade do núcleo triterpênico, sendo ainda capaz de formar micelas. A presença

das cadeias glicídicas íntegras na saponina BS justifica a dupla capacidade dessas micelas

de induzirem simultaneamente o aumento da resposta de células T CD4+ e de células T

CD8+ contra antígeno específico de Leishmania (Nico et al., 2006).

Por outro lado, as micelas de saponina HS formadas apenas pela exposição da

cadeia glicídica de três açúcares ligadas no C-3, promoveram uma redução do potencial

adjuvante, sem provável liberação do antígeno FML no citosol nem no endossoma; nem

indução de resposta imune indutora de células T CD4+ ou de células T CD8+. Os índices

de anticorpos protetores (IgG2a) induzidos pela saponina HS foram drasticamente baixos,

contudo ainda presentes, provavelmente pela direta estimulação de linfócitos B pelo

antígeno FML solúvel; porém um forte prejuízo foi visto na mediação de resposta imune

celular.

Finalmente, a remoção completa dos monoterpenos e das duas cadeias glicídicas da

CP05, resultaram na obtenção da fração sapogenina, ou seja, o núcleo triterpênico. A

sapogenina perdeu importantes propriedades adjuvantes, causando uma diminuição de

resposta na secreção de IFN-ã, produção de anticorpos e resposta à IDR (Nico et al., 2006).

Isto indica que o núcleo triterpênico da saponina CP05, diferente do descrito para o núcleo



61

triterpênico da saponina QS21 (Palatnik de Sousa et al, 2004), não é um potente composto

imunoestimulante. Os núcleos triterpênicos das duas saponinas (QS21 e CP05), ácido

quiláico e ácido equinocístico, respectivamente, apresentam grande similaridade diferindo-

se apenas na presença do grupamento aldeído. A presença do grupo aldeído, ligado no C-4

do núcleo triterpênico de QS21 (Soltysik et al., 1995; Rhodes et al., 1996; Marciani, 2003;

Palatnik de Sousa et al., 2004), e a ausência de grupo aldeído no núcleo triterpênico de

CP05 (Silva et al., 2005), é provavelmente a razão de suas diferentes propriedades

biológicas.



62

VI. Conclusões

O objetivo deste trabalho foi a avaliação comparativa da contribuição das frações

carboidrato associadas ao C-3 e C-28 do triterpeno, das cadeias hidrofóbicas contendo

terpenos e do grupamento aldeído, na função adjuvante da saponina CP05 da Calliandra

pulcherrima Benth em comparação com a da saponina QS21 da Quillaja saponaria Molina.

Ambas saponinas se destacam pela presença destas estruturas e pelo seu excepcional

potencial adjuvante. Os resultados obtidos permitiram identificar a relevância das cadeias

carboidrato e parcialmente da cadeia hidrofóbica na toxicidade secundária, a importância

do carboidrato associado ao C-28 na indução global de anticorpos, do aldeído no C-4 na

indução de IgG2a e da sapogenina na indução de IgG1. A cadeia hidrofóbica influencia

predominantemente na indução de IDR e de proliferação de linfócitos in vitro e

parcialmente na expansão de linfócitos CD4 e CD8. As cadeias de carboidrato, por outro

lado, também estão envolvidas com a secreção de IFNã relacionada à expansão de CD4+ e

finalmente com a redução da carga parasitária e a sobrevivência gerada pela vacinas. Estes

resultados contribuirão para o futuro desenvolvimento de adjuvantes totalmente sintéticos,

ou de saponinas naturais enriquecidas sinteticamente com as frações hidrofóbicas e de

carboidrato ramificadas estudadas na presente investigação. Finalmente, caracterizamos que

a saponina CP05 de Calliandra pulcherrima Benth pode ser um novo candidato a adjuvante

para vacinação contra a leishmaniose visceral.



63

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VIII. Anexos

- Comunicação:

1. Nico, D., Santos, F.N., Borja-Cabrera, G.P., Palatnik, M., Silva, B., J.P.Parente,

Palatnik de Sousa, C.B. Structure-function studies of the novel CP05 saponin of

Calliandra pulcherrima Benth adjuvant: assessment of monoterpene, glycidic

fraction and triterpene in adjuvant function. In: Modern Adjuvants and Delivery

Systems, Londres. MVADS, 2006.

- Artigo in press:1. Nico, D., Santos, F.N., Borja-Cabrera, G.P., Palatnik, M. and Palatnik de Sousa,

C.B. Assessment of the monoterpene, glycidic and triterpene-moieties’

contributions to the adjuvant function of the CP05-saponin of Calliandra

pulcherrima Benth during vaccination against experimental visceral leirhmaniasis.

Vaccine. 2006.

- Artigos publicados:

1. Oliveira-Freitas, E., Casas, C.P., Borja-Cabrera, G.P., Santos, F.N., Nico, D., Souza,

L.O.P., Tinoco, L.W., Silva, B.P., Palatnik, M., Parente, J.P., Palatnik de Sousa,

C.B. Acylated and deacylated saponins of Quillaja saponaria mixture as adjuvants

for the FML-vaccine against visceral leishmaniasis. Vaccine. 2006; 24: 3909-3920.

2. Saraiva, E.M. Barbosa, A.F., Santos, F.N., Borja-Cabrera, G.P., Nico, D., Souza,

L.O.P., Mendes-Aguiar, C.O., Paraguai de Souza, E., Fampa, P., Parra, L.E.,

Menz, I., Dias Jr, J.G., Oliveira, S.M., Palatnik de Sousa, C.B. The FML-vaccine

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79

Structure-function studies of the novel CP05 saponin of Calliandra pulcherrima Benth

adjuvant: assessment of monoterpene, glycidic fractions and triterpene in adjuvant

function

Nico Da, Santos FNa, Borja-Cabrera Ga, Palatnik M c, Silva BPb, Parente JPb, Palatnik de

Sousa CBa.

aInstituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Centro de Ciências da Saúde,

Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), PO Box 68040 CEP 21941-590 Rio de

Janeiro, Brazil. [email protected]. aLaboratório de Química de Plantas Medicinais,

Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais, UFRJ, PO Box 68045 CEP 21944-970 Rio de

Janeiro, Brazil. cHospital Universitário Clementino Fraga Filho, Faculdade de Medicina,

UFRJ.

The CP05 saponin, isolated from the leaves of Calliandra pulcherrima Benth,

shows remarkable similarities to the previously described potent adjuvant, QS21 saponin of

Quillaja saponaria Molina [1,2]. Both saponins shared a normonoterpene containing

glycidic moiety attached to the triterpene C-28, and three sugars attached C-3. Different

from QS21, the CP05 does not show the aldehyde group in triterpene C-4, which is

responsible for mimetyzing the B-7 ligand of APC cells inducing a TH1 response [2].

Aiming to analyze the potential adjuvant contribution of each CP05 saponin fraction, the C-

28 monoterpene acylated moiety was removed by NaHCO3/MeOH hydrolysis [3], the

whole carbohydrate C-28 attached chain by alkaline hydrolysis with 1N NaOH [4] and the

sapogenin fraction by acid hydrolysis with 2N H2SO4. Balb/c females were immunized

through the sc route with 3 doses of either the intact saponin (CP05), monoterpene-deprived

(BS), C28-deprived (HS) or the sapogenin fraction, in formulation with the FML antigen of

Leishmania donovani, at weekly interval. Mice were challenged with 2x108 amastigotes of

L. chagasi. After immunization and also after the infective challenge, the antibodies to the

CP05 and the BS vaccines were significantly increased over the saline control, developing

the highest responses in all IgG subtypes (p<0.05) except for IgG1, indicating that the

monoterpene acylated moiety, absent in the BS vaccine, is not necessary for the induction

of a global antibody response. On the other hand, the HSFML vaccine showed a diminished



80

IgG, IgG2b, IgG3 and IgA responses and no production of IgG2a, indicating that the

integrity of the carbohydrate moiety attached to C-28 is mandatory for the induction of

these antibodies. Surprisingly, the vaccine containing sapogenin, with no carbohydrate

chains attached to either C-3 or C-28 still sustained increases in IgG1, and IgM and minor

titters of IgG2b. Soon after immunization, the highest DTH response to L. donovani antigen

was detected in the CP05 treated group, followed by lower swelling by the BS vaccine,

indicating that this effect is partially mediated by the monoterpene moiety. Both vaccines

were stronger that the HS. No significant differences were observed between saline control

and all the vaccine treatments, in in vitro Leishmania-specific splenocyte proliferation after

stimulation with 104 or 105 promastigotes, indicating a sustained but not increased cell

proliferation. In spite of that, the phenotype analysis of splenocytes disclosed the highest

CD4+ and CD8+ values for the BS vaccine. Different from what described for QS21[2],

where removal of the normonoterpene abolished CTL response, the CP05 BS-monoterpene

deprived vaccine induced a 22% increase of CD4+ and a 43% increase of CD8+ T cells. All

vaccines increased the IFNã secretion of splenocytes over the saline control (p<0.0005)

with the highest values developed by the BS and HS vaccine. Significant reduction of

parasite burden over the saline control were achieved by the BS (94.0%) followed by the

CP05 (92.1%) vaccines with no difference among them (p>0.05). Coincidently, survival

was maximal (100%) in the BS treated animals, and was 90% in the CP05 intact saponin

vaccine group. While in saline control 70% of mice survived until the end of experiment,

60 and 50% of survival, with no significant parasite reduction, were detected for the HS-

and the sapogenin vaccine treated animals, respectively. We conclude that, different form

what described for QS21 saponin [2], the removal of normoterpene moiety did not affect,

while the removal of the C-28 attached long carbohydrate chain abolished, the CP05 major

adjuvant properties. The carbohydrate chain attached to C-28 is therefore, the main

responsible for the CP05 adjuvant potential. No protection was induced by the sapogenin-

FML indicating that the CP05 triterpene, different from the triterpene of the QS21 saponin

[4], is not immunostimulating compound. Since the main difference between the quillaic

(QS21) and echinocystic (CP05) triterpene nuclei is the presence of the C4 aldehyde in

QS21, the absence of adjuvant potential of the echynocystic acid is due to the lack of an

aldehyde exposed group.



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IX. Outras publicações no período



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