INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA, CONSERVAÇÃO E

BIOLOGIA EVOLUTIVA

DEYLA PAULA DE OLIVEIRA

Manaus - Amazonas

Abril de 2010

ANÁLISE DA PATERNIDADE DE Caiman crocodilus crocodilus (L.) DA RESERVA

DE DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL PIAGAÇU-PURUS, USAND O

MARCADORES MICROSSATÉLITES

DEYLA PAULA DE OLIVEIRA

ORIENTADOR: Dr. Tomas Hrbek

CO-ORIENTADORA: Dra. Izeni Pires Farias

Dissertação apresentada ao Programa de Pós -

graduação do Instituto Nacional de Pesquisas da

Amazônia, como parte dos requisitos para a obtenção

do título de mestre em Genética, Conservação e

Biologia Evolutiva.

Manaus – Amazonas

Abril de 2010

ANÁLISE DE PATERNIDADE DE Caiman crocodilus crocodilus (L.) DA RESERVA

DE DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL PIAGAÇU-PURUS, USAND O

MARCADORES MICROSSATÉLITES

FICHA CATALOGRÁFICA

(Catalogação realizada pela Biblioteca do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia –

INPA

O48 Oliveira, Deyla Paula de Análise da paternidade de Caiman crocodilus crocodilus (L.) da Reseva de Desenvolvimento Sustentável Piagaçu-Purus, utilizando marcadores microssatélites / Deyla Paula de Oliveira. --- Manaus : [s.n.], 2010 xii, 97 f. : il. color. Dissertação (mestrado)-- INPA, Manaus, 2010 Orientador : Tomas Hrbek Co-orientador : Izeni Pires Farias Área de concentração : Genética, Conservação e Biologia Evolutiva 1. Caiman crocodilus crocodilus – Amazonas. 2. Microssatélites. 3. Marcadores genéticos. 4. Testes de Paternidade. I. Título. CDD 19. ed. 597.980415

SINOPSE

Realizou-se o isolamento e caracterização de 12 locos microssatélites específicos

para Caiman. crocodilus (jacaré – tinga) através da biblioteca enriquecida em

microssatélites dinucleotídeos e teste de amplificação cruzada em uma outra

espécie relacionada. Os seis locos mais polimórficos foram utilizados para analisar

o sistema de acasalamento em 13 ninhos da espécie coletados na Reserva de

Desenvolvimento Sustentável Piagaçu – Purus. Foi constatada a paternidade

múltipla em 100% dos ninhos.

Palavras-chave: Jacaré – tinga, microssatélite, sistema de acasalamento.

Ao meu pai, Raimundo Mendes de Oliveira e minha mãe Leila Maria Oliveira Mendes.

Essa dissertação não seria possível sem toda a educação, caráter e persistência

proporcionada por eles!

Aos jacarezinhos e aos comunitários do grande coração do Purus (RDS Piagaçu - Purus).

E a todos aqueles que estão longe de seus familiares em prol de um sonho e que sabem o

significado da palavra saudade.

OFEREÇO

Ao grande mestre John Thorbjarnarson (in memorian),

que amava os crocodilianos mais que tudo!

DEDICO

AGRADEÇO...

Agradeço a todos que, direta e indiretamente contribuíram para a realização desse

trabalho. Em especial:

Aos meus pais Raimundo e Leila, irmãos Ana Paula e Douglas e minha querida

sobrinha Raíssa que no auge dos seus 4 anos nos disse "A vida é apenas um ventinho!".

Mesmo longe fisicamente, eles estavam comigo sempre no coração;

Ao Dr. Tomas Hrbek, pela orientação, pelos ensinamentos, pelas sugestões e

constante preocupação com o trabalho;

Á Dra. Izeni Pires Farias, pela co-orientação, pelo direcionamento e dedicação.

Posso dizer que ela foi a minha mãe de pesquisa aqui em Manaus;

Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia e aos professores do Programa de

Pós-graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva, pela oportunidade desse

aperfeiçoamento,

A Dra. Vera Scarpassa, coordenadora do GCBEv e a Alessandra, secretária do

GCBEv, sempre solicitas,

Aos colegas do mestrado, em especial ao grande amigo Edson pela amizade, por

me aturar nesses dois anos de mestrado, por me ouvir, aconselhar, por sempre me

acompanhar e esperar nas madrugadas e feriados em que tive que ir a UFAM e pelas

sextas-feiras nada culturais da vida;

Aos colegas do laboratório de Evolução e Genética Animal – LEGAL, pela ajuda e

pelos momentos de convivência no dia-a-dia do laboratório: Áureo, Adam, Carla (Carlota),

Edvaldo (Ed), Fábio (Fabinho), Fabíola (FCR), Jaqueline (Jaq), Mauro, Maria da

Conceição (Concy), Maria Doris, Mário, Marina, Natasha (Jovem), Olavo, Patrícia (Pat),

Pedro, Kelmer, Rafaela (Rafa), Roberta, Valéria, Waleska (Wal). Em especial á Nat e Olavo

pela companhia nas noites e madrugadas no laboratório e pelas constantes caronas, á

Concy, Fabíola e Rafa pela ajuda no laboratório, principalmente com os microssatélites, ao

Pedro pela ajuda nas análises;

Ao técnico do LEGAL Adriano por nos proporcionar momentos de descontração

com suas brincadeiras e pela imensa ajuda no laboratório;

Ao amigo e companheiro de coleta Boris Marioni, pela ajuda em campo na RDS

Piagaçu – Purus e por sempre ser solicito em responder as imensas dúvidas que tive com a

biologia dos tingas no decorrer desses dois anos de trabalho;

Aos comunitários da RDS Piagaçu – Purus pela ajuda em campo e pelos

ensinamentos durante um mês que permaneci na reserva;

A todos os integrantes da expedição de coleta em 2008: comandante, ajudantes e

tripulantes do barco "Jesus me deu", pela imensa ajuda nas coletas;

Ao Instituto Piagaçu e á Wildlife Conservation Socity (WCS) que viabilizaram os

equipamentos e a logística na RDS Piagaçu – Purus;

A Zilca Campos pela oportunidade na expedição de coleta em 2008, pelas

referências bibliográficas e por sempre ser solicita em responder aos meus e-mails;

Aos avaliadores do projeto de dissertação e membros da banca da aula de

qualificação, Cleiton Fantin, Doriane Picanço Rodrigues, Maristerra Lemos, Rodrigo

Barban Zucoloto, pelas valiosas sugestões, as quais aprimoraram consideravelmente este

trabalho;

Aos colegas de república Cadú (a mãe da casa), Pedro e Renato pela campanha

"Deyla vai dormir" nos últimos dias em que estive escrevendo a dissertação e pelo carinho

disponiblizado a mim, a única mulher da casa;

Ao Sisbio pela emissão da licença de pesquisa e coleta de material biológico na

RDS Piagaçu – Purus;

Á secretaria de Estado do Meio Ambiente e Desenvolvimento Sustentável, órgão

gestor e responsável pela RDS – Piagaçu - Purus,

Ao Conselho de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão

da bolsa de mestrado;

Á PROCAD-CAPES, pelo financiamento do Banco enriquecido em marcadores

moleculares microssatélites para C. crocodilus;

Aos monitores Adna Sousa, Fernanda Cidade, Marcos Prado, Tatiana Campos e

professores Anete Pereira, Michel Vincentz, Miriam Rafael, Maria Imaculara Zuchi e

Marcelo Cavallari responsáveis pelo curso "Construção de bancos enriquecidos em

microssatélites de eucariotos: um curso prático e teórico";

Ao John Thorbjarnarson (in memorian) e ao Robinson Botero-Arias coordenadores

do IV Workshop de Treinamento em Pesquisa sobre Jacarés na Reserva de

Desenvolvimento Sustentável Mamirauá pela oportunidade da participação no Workshop;

Aos colegas Dani Rivera, Diego Forrisi, Johnny Severiche, Lucía Fernandez, Luiza

Passos, Mauro Hoffman, Rafael Barboza, Virginia Parachú pela convivência durante os 15

dias do Worshop na RDS Mamirauá;

Aos vários amigos que fiz em Manaus pelas alegrias e tristezas compartilhadas;

Aos amigos que carinhosamente dispuseram um tempinho e fizeram as correções

do meu plano de dissertação, resumos, manuscritos dos artigos e a dissertação final;

Ao CNPq/PPG-7 (Processo nº 55326012005-7) e National Geographic

Society/Waitt Grants Program pelo financiamento do projeto.

Meus mais sinceros agradecimentos!

Filho da floresta, água e madeira vão na luz dos meus

olhos, e explicam este jeito meu de amar as estrelas e

de carregar nos ombros a esperança.

Thiago de Melo, poeta amazonense

Os Estatutos do Homem (Ato Institucional Permanente)

Artigo I

Fica decretado que agora vale a verdade.

agora vale a vida,

e de mãos dadas,

marcharemos todos pela vida verdadeira.

Artigo II

Fica decretado que todos os dias da semana,

inclusive as terças-feiras mais cinzentas,

têm direito a converter-se em manhãs de domingo.

Artigo III

Fica decretado que, a partir deste instante,

haverá girassóis em todas as janelas,

que os girassóis terão direito

a abrir-se dentro da sombra;

e que as janelas devem permanecer, o dia inteiro,

abertas para o verde onde cresce a esperança.

Artigo IV

Fica decretado que o homem

não precisará nunca mais

duvidar do homem.

Que o homem confiará no homem

como a palmeira confia no vento,

como o vento confia no ar,

como o ar confia no campo azul do céu.

Parágrafo único:

O homem confiará no homem

como um menino confia em outro menino.

Artigo V

Fica decretado que os homens

estão livres do jugo da mentira.

Nunca mais será preciso usar

a couraça do silêncio

nem a armadura de palavras.

O homem se sentará à mesa

com seu olhar limpo

porque a verdade passará a ser servida

antes da sobremesa.

Artigo VI

Fica estabelecida, durante dez séculos,

a prática sonhada pelo profeta Isaías,

e o lobo e o cordeiro pastarão juntos

e a comida de ambos terá o mesmo gosto de aurora.

Artigo VII

Por decreto irrevogável fica estabelecido

o reinado permanente da justiça e da claridade,

e a alegria será uma bandeira generosa

para sempre desfraldada na alma do povo.

Artigo VIII

Fica decretado que a maior dor

sempre foi e será sempre

não poder dar-se amor a quem se ama

e saber que é a água

que dá à planta o milagre da flor.

Artigo IX

Fica permitido que o pão de cada dia

tenha no homem o sinal de seu suor.

Mas que sobretudo tenha

sempre o quente sabor da ternura.

Artigo X

Fica permitido a qualquer pessoa,

qualquer hora da vida,

uso do traje branco.

Artigo XI

Fica decretado, por definição,

que o homem é um animal que ama

e que por isso é belo,

muito mais belo que a estrela da manhã.

Artigo XII

Decreta-se que nada será obrigado

nem proibido,

tudo será permitido,

inclusive brincar com os rinocerontes

e caminhar pelas tardes

com uma imensa begônia na lapela.

Parágrafo único:

Só uma coisa fica proibida:

amar sem amor.

Artigo XIII

Fica decretado que o dinheiro

não poderá nunca mais comprar

o sol das manhãs vindouras.

Expulso do grande baú do medo,

o dinheiro se transformará em uma espada fraternal

para defender o direito de cantar

e a festa do dia que chegou.

Artigo Final.

Fica proibido o uso da palavra liberdade,

a qual será suprimida dos dicionários

e do pântano enganoso das bocas.

A partir deste instante

a liberdade será algo vivo e transparente

como um fogo ou um rio,

e a sua morada será sempre

o coração do homem.

Thiago de Melo, poeta amazonense

RESUMO

Nos últimos anos, estudos genéticos têm sido utilizados para investigar os sistemas de

acasalamento em crocodilianos, mas até a presente data nenhuma pesquisa tinha sido

realizada para investigar a paternidade de Caiman crocodilus crocodilus. Para investigar a

paternidade é necessária a utilização de locos microssatélites altamente polimórficos, que

apresentem uma alta probabilidade de exclusão de paternidade e permita diferenciar

indivíduos. Neste sentido, foram isolados e caracterizados 12 locos microssatélites

dinucleotídeos a partir de uma biblioteca genômica enriquecida com repetições de

dinucleotídeos (CT) e 8 (GT) 8. Os 12 locos foram caracterizados em C. c. crocodilus da

Reserva de Desenvolvimento Sustentável Piagaçu – Purus, Amazonas e também testado

em Caiman c. yacare de Cáceres, Mato Grosso. Os resultados da caracterização indicaram

que estes locos são adequados para o estudo do sistema de acasalamento e também para

estudos populacionais com o complexo C. crocodilus. Seis locos mais polimórficos com

alto poder de exclusão de paternidade e com alto poder de diferenciar indivíduos foram

usados em sistema do PCR multiplex para a análise do sistema de acasalamento da espécie

C. c. crocodilus da Reserva de Desenvolvimento Sustentável Piagaçu – Purus. Foram

genotipados 198 filhotes de 13 ninhos (representando um esforço de amostragem que

variaram de 30% a 100% de filhotes por ninho) de duas temporadas reprodutivas (2007 e

2008), além de 11 fêmeas que estavam ao lado dos respectivos ninhos e 21 machos,

potencias pais. Em 100% dos ninhos houve uma contribuição de 2-4 pais, sendo que todos

os machos contribuíram igualmente para a ninhada, e nenhum dos machos genotipados

foram os pais reais dos filhotes. Nenhum macho acasalou com mais de uma fêmea e as

fêmeas não mostraram fidelidade a um único macho. Todas as fêmeas encontradas nas

proximidades dos ninhos eram as mães dos filhotes dos ninhos. Nosso estudo destaca que a

poliandria é comum nesta espécie não há um único macho reprodutivo dominante e que as

fêmeas copularam com machos geograficamente distantes. Nossos resultados têm

implicações importantes para os esforços de conservação e manejo de espécies na área de

estudo e outras áreas do entorno.

PALAVRAS-CHAVES: Amazonas, Caiman crocodilus crocodilus, microssatélites,

sistema de acasalamento, Piagaçu – Purus

ABSTRACT

Recently genetic studies have been utilized to study breeding systems of several

crocodilian, however, no paternity studies involved Caiman crocodilus crocodilus. To

investigate paternity, it is necessary to use highly polymorphic microsatellite loci that have

high probability of exclusion of paternity and differentiating individuals. For this purpose

12 dinucleotide microsatellite loci were isolated and characterized from a genomic library

enriched for the dinucleotide repetitions (CT)8 and (GT)8. The 12 loci were characterized

in C. c. crocodilus from the Piagaçu-Purus Sustainable Development Reserve, Amazonas,

and their utility also tested in Caiman c. yacare from Cacéres, Mato Grosso. The results of

the characterization indicated that these loci are adequate for the study of the breeding

system and also for population studies with the Caiman crocodilus complex. Six loci with

highest polymorphism, high power of paternity exclusion and with high probability of

differentiating among individuals were used in a PCR multiplex system for breeding

system analysis of the C. c crocodilus from the Piagaçu-Purus Sustainable Development

Reserve. We genotyped 198 hatchlings from 13 nests (representing a sampling effort that

varied from 30% to 100% of the hatchlings per nest) sampled in the two reproductive

seasons (2007 and 2008), as well as 11 females that were beside their respective nests and

21 males, potential fathers. In 100% of the nests there was a contribution of two to four

fathers, all males contributed approximately equally per clutch, and none of the genotyped

males were the actual fathers of the hatchlings. No male mated with more than one female,

and no female showed across-year male fidelity. All females found in proximity of nests

were mothers of the hatchlings of those nests. Our study highlights that polyandry is

common in this species, that no single male reproductively dominates, and that females

mate with geographically distant males. Our results have important implications for

conservation efforts and species management in the study area and beyond.

KEY WORDS: Amazon, Caiman crocodilus, microsatellites, mating systems, Piagaçu –

Purus

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO GERAL...............................................................................................16

1.1. Aspectos gerais da ordem Crocodylia (Gmelin 1789)..................................................16

1.11. Ocorrência dos crocodilianos......................................................................................18

1.2. Taxonomia, relações filogenéticas e suas controvérsias................................................19

1.2.1. Complexo Caiman crocodilus....................................................................................20

1.2.11. Caracteristicas do complexo Caiman crocodilus.....................................................21

1.3. Ameaças aos crocodilianos...........................................................................................23

1.3.1. Manejo dos crocodilianos...........................................................................................24

1.4. Aspectos do sistema reprodutivo dos crocodilianos......................................................25

1.5. Técnicas moleculares para o estudo do sistema de acasalamento em animais.............29

CAPÍTULO I

ARTIGO I . Marcadores microssatélites para o sistema de acasalamento e análise de

populações de jacaré-tinga Caiman crocodilus (Linnaeus 1758).........................................32

CAPÍTULO II

ARTIGO II . Análise do sistema de acasalamento de Caiman crocodilus da Reserva de

Desenvolvimento Sustentável Piagaçu-Purus, Amazonas, Brasil........................................41

2. CONCLUSÃO GERAL.................................................................................................71

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................72

APÊNDICE I......................................................................................................................87

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO I

Tabela 1. Caracterização dos 12 locos microssatélites para Caiman c. crocodilus e teste de

amplificação cruzada em Caiman c. yacare.........................................................................40

CAPÍTULO II

Tabela 1. Código dos ninhos e informações dos corpos de água, setores, quantidade de

filhotes genotipados e porcentagens e ano de coleta dos 13 ninhos amostrados em 2007 e

2008 na RDS Piagaçu-Purus................................................................................................64

Tabela 2. Amostras dos machos de jacaré-tinga coletados em corpos de água nas

proximidades dos ninhos amostrados na RDS – Piagaçu – Purus.......................................65

Tabela 3. Combinações dos seis locos para genotipagem tipo multiplex............................65

Tabela 4. Número de alelos por loco dentro dos ninhos e em todos os 13 ninhos de Caiman

crocodilus.............................................................................................................................66

Tabela 5. Potencial dos locos microssatélites para a análise de parentesco em C. crocodilus

da RDS Piagaçu – Purus.......................................................................................................66

Tabela 6. Potencial dos locos microssatélites combinados para análise de parentesco em C.

crocodilus da RDS Piagaçu – Purus.....................................................................................67

Tabela 7. Evidências de paternidade múltipla em 13 ninhos de Caiman crocodilus através

de seis locos microssatélites espécie – específicos..............................................................68

Tabela 8. Genótipos dos parentais reconstruídos com o auxílio do programa Gerud 2.0 e

estimativa da contribuição relativa de cada um dos pais nos 13 ninhos de Caiman

crocodilus.............................................................................................................................69

LISTA DE FIGURAS

Fig. 01. Representação do rostro de animais da família Alligatoridae.................................16

Fig. 02. Representação do rostro de animais da família Crocodylidae................................17

Fig.03. Representação do rostro de animais da família Gavialidae.....................................17

Fig. 04. Distribuição das espécies de crocodilianos em oito regiões zoogeográficas. PA:

Paeloártico, NA: Neoártico, NT: Neotropical, AT: Afrotropical, OL: Oriental, AU:

Autralásia, PAC: Ilhas do Oceano Pacífico, ANT: Antártico...............................................18

Fig 05. Distribuição de C .c.chiapasius (1), C.c. fuscus (2), C.c.crocodilus (3), C.c.yacare

(4), C.c.aporiensis (5) e C. c.crocodilus e C.c.yacare (6)....................................................20

Fig. 06. Fêmea de Caiman crocodilus (A). Filhote de Caiman crocodilus

(B).........................................................................................................................................22

Fig. 07. Fêmea de Melanosuchus niger aproximando-se do ninho devido à presença

humana na RDS Mamirauá, Amazonas................................................................................27

Fig. 08. Fêmea de Caiman latirostris em defesa do ninho no

Uruguai.................................................................................................................................27

16

1. INTRODUÇÃO GERAL

1.1. ASPECTOS GERAIS DA ORDEM Crocodylia (Gmelin 1789)

Os membros da classe reptilia evoluíram a partir dos antracosauros a cerca de 60

milhões de anos após o aparecimento destes últimos. Desde o Permiano e ao longo do

Cretáceo, eram os vertebrados mais abundantes (Hildebrand e Goslow, 2006).

Os crocodilianos atuais são os únicos sobreviventes da subclasse Archousaria que

incluia dois clados extintos: os pterossauros e os dinossauros (Hickam et al., 2006). A história

evolutiva do grupo tem sido estudada por Buffetaud (1982), Taplin (1984), Taplin e Grigg

(1989) e Brochu (2003).

Os primeiros crocodilianos chamados Protosuchia apareceram no início do Jurássico,

enquanto que os modernos crocodilianos (Eusuchia) apareceram no Triássico Superior a cerca

de 220 milhões de anos atrás sob a forma de carnívoros terrestres (Martin, 2008). Estes

animais diferem pouco entre si ou das formas da era Mesozóica. A maior variação

interespecífica observada nos crocodilianos atuais refere-se à morfologia da cabeça. Estas

variações se devem basicamente as preferências e estratégias alimentares. Os representantes

da família Alligatoridae apresentam um rostro mais largo (Fig.01), os representantes da

família Crocodylidae possuem uma variedade de larguras dos rostros (Fig.02), e os

representantes da família Gavialidae possuem um rostro bem estreito (Fig.03).

Fig. 01. Representação do rostro de animais da família Alligatoridae.

Fonte: http://iucncsg.org/ph1/modules/Crocodilians/crocfacts.html

17

Fig. 02. Representação do rostro de animais da família Crocodylidae

Fonte: http://iucncsg.org/ph1/modules/Crocodilians/crocfacts.html

Fig.03. Representação do rostro de animais da família Gavialidae.

Fonte: http://iucncsg.org/ph1/modules/Crocodilians/crocfacts.html

Os crocodilianos apresentam o crânio bastante resistente, com uma forte musculatura

que movimenta a mandíbula disposta de maneira a permitir uma grande abertura e um

fechamento rápido e poderoso (Hickam et al., 2006). Os dentes são inseridos em cavidades ou

tecas (tecodonte) e apresenta um palato secundário completo, o que permite que a respiração

aconteça mesmo enquanto a boca contém água, alimentos ou ambos (Hickam et al., 2006).

São animais que vivem em áreas tropicais e subtropicais em vários habitats aquáticos

(rios, pântanos, lagos, córregos, etc) (Ross, 1989). Ocasionalmente podem adaptar-se as águas

salgadas e salobras como mangues ou estuários, pois apresentam glândulas na língua que

podem ser usadas para excretar o excesso de sal.

São ectotérmicos e o controle da temperatura corpórea ocorre através de trocas de

energia com o meio ambiente. A termorregulação ocorre quando o animal se posiciona na

superfície da água expondo todo o corpo ou parte dele. Estes animais também saem da água

para a terra firme e recebem radiação solar de forma direta e indireta, e conforme o aumento

da temperatura retorna para a água. A atividade de termorregulação está diretamente

relacionada às atividades de reprodução, captura de alimento, digestão e crescimento (Pough

et al., 2003).

Os crocodilianos são predadoras oportunistas e a dieta depende do seu estágio de

desenvolvimento e diversidade de presas potenciais, que varia com o hábitat, estação e região

geográfica (Webb et al., 1982; Magnusson et al., 1987). Os indivíduos adultos apresentam

uma dieta mais variada do que a dieta dos mais jovens (Webb et al., 1982). A dieta dos jovens

18

durante o primeiro ano de vida é composta principalmente por invertebrados, desde insetos

(principalmente Odonata, Hemíptera e Coleóptera), crustáceos (principalmente caranguejos),

moluscos (principalmente Pomacea e Bivalvia), e a mudança ontogenética realiza-se no início

do segundo ano de vida, fase em que pequenos peixes já são incorporados á dieta (Coutinho e

Campos, 2007).

1.1.1. OCORRÊNCIA DOS CROCODILIANOS

A maioria dos crocodilianos são endêmicos de uma única região zoogeográfica.

Apenas as espécies C. niloticus, C. porosus, C. siamensis e Gavialis gangeticus são

encontrados em duas regiões adjacentes (Martin, 2008). (Fig.04).

Fig. 04. Distribuição das espécies de crocodilianos em oito regiões zoogeográficas. PA:

Paeloártico, NA: Neoártico, NT: Neotropical, AT: Afrotropical, OL: Oriental, AU: Autralásia,

PAC: Ilhas do Oceano Pacífico, ANT: Antártico. Fonte: Martin, 2008.

No Brasil são encontradas apenas espécies da família Alligatoridae: Paleosuchus

palpebrosus (jacaré - paguá) (Cuvier 1807), Paleosuchus trigonatus (jacaré – coroa)

19

(Schneider 1801), Melanosuchus niger (jacaré – açu) (Spix 1825), Caiman latirostris (jacaré-

do-papo-amarelo) (Daudin 1802) e Caiman crocodilus (jacaré-tinga) (Linnaeus 1758).

Alguns autores consideram que no Brasil são encontradas seis espécies, pois elevam o

status de Caiman crocodilus yacare ao nível específico de Caiman yacare. Esta convenção é

atualmente adotada pela autoridade ambiental brasileira (IBAMA) (Coutinho e Campos,

2007).

1.2. TAXONOMIA, RELAÇÕES FILOGENÉTICAS E SUAS CONTR OVÉRSIAS

Conforme Coutinho e Campos (2007), a taxonomia, biogeografia e filogenia dos

crocodilianos são assuntos de longos e consideráveis debates.

A ordem Crocodylia divide-se em três famílias, sendo elas: Crocodylidae, Gavialidae e

Alligatoridae. Com base em dados moleculares, Janke et al. (2005) dividiram a ordem em

duas famílias: Alligatoridae e Crocodylidae, incluindo Gavialis único gênero da família

Gavialidae, agora na família Crocodylidae.

O número de espécies aceitas atualmente varia de vinte e três (Brochu, 2003), vinte e

quatro (Martin, 2008) a vinte e cinco (elevando as subespécies ao nível de espécies)

(McAliley et al., 2006). Estas espécies estão distribuídas em nove gêneros Caiman,

Melanosuchus, Paleosuchus, Alligator, Crocodylus, Mecistops, Osteolaemus, Tomistoma,

Gavialis (McAliley et al., 2006). O maior nível de diversidade das espécies encontra-se no

gênero Crocodylus, que reúne 13-14 espécies, conforme Martin (2008).

A posição da espécie Tomistoma schlegelii (falso gavial) flutua entre Crocodylidae a

partir de estudos morfológicos a Gavialidae a partir de estudos bioquímicos ou moleculares

(Salisbury et al., 2006). Dados genéticos suportam a hipótese de que a espécie Crocodilus

catapharactus representa o único membro sobrevivente de uma linhagem antiga endêmica do

continente Africano, o gênero histórico Mecistops (Gray, 1844) (McAliley et al., 2006). Esta

idéia também é apoiada por evidências morfológicas feitas por Brochu (2003).

Estudos da distribuição e as relações entre as populações de Caiman c. crocodilus e

Caiman c. yacare foram investigados no Brasil por Brazaitis et al. (1998). Busack e Pandya

(2001) usando dados morfológicos, relataram que C. c. yacare é suficientemente diferenciado

das outras subespécies, o que rejeita a sua validade como uma subespécie. Hrbek et al. (2008)

utilizando dados moleculares, mostraram que as relações filogenéticas entre C. c. crocodilus e

C. c. yacare não são claras. Os dados não apóiam que as duas subespécies sejam

20

evolutivamente distintas pelo menos ao nível molecular.

Venega-Anaya et al. (2008), utilizando dados moleculares, inferiram a história

evolutiva de C. c. crocodilus, C. c. fuscus e C. c. chiapasius obtendo resultados coerentes com

a taxonomia. C. c. fuscus são geneticamente estruturadas no sul da Mesoamérica, C. c

chiapasius pode ser considerada uma linhagem com evolução distinta e pode estar havendo

uma hibridização entre C. c. fuscus e C. c. chiapasius no norte da Mesoamérica.

1.2.1. COMPLEXO Caiman crocodilus

Caiman crocodilus é um táxon bastante complexo que inclui atualmente quatro ou

cinco subespécies com base na morfologia: C. c. fuscus (Cope 1868), C. c. apaporiensis

(Medem 1955), C. c. chiapasius (Bocourt 1976), C. c. crocodilus (Linnaeus 1758), C. c.

yacare (King e Burke 1989) (Ross, 1998). Baseado em evidências fósseis, filogenéticas e

geográficas, C. crocodilus parece ter uma origem sul-americana (Venegas-Anaya et al., 2008).

Esse complexo é amplamente distribuído no continente americano, habitando desde o sul do

México até o norte da Argentina (Fig. 05) (Ross, 1998).

A IUCN indica para C. crocodilus no Brasil projetos com moderada prioridade como a

implantação de programas de manejo sustentável, a diminuição do comércio ilegal de peles e

estudos taxonômicos aprofundados que definam mais precisamente as espécies/subespécies e

suas respectivas distribuições geográficas.

21

Fig 05. Distribuição de C. c .chiapasius (1), C. c. fuscus (2), C. c. crocodilus (3), C. c.

yacare (4), C. c. aporiensis (5) e C. c. crocodilus e C. c. yacare (6). Fonte: Busack e

Padya, 2001.

1.2.1.1. CARACTERISTICAS DO COMPLEXO Caiman crocodilus

Caiman crocodilus (Caiman sclerops aparece em algumas publicações como um

importante sinônimo para esta espécie) é conhecido popularmente no Brasil como jacaré –

tinga, termo indígena que significa jacaré-branco, devido a sua coloração verde amarelada

(Fig. 06).

Segundo Ross (1998), os machos desta espécie podem alcançar 2,5 metros de

comprimento total, apesar de alguns autores relatarem que os indivíduos deste tamanho sejam

raros na Amazônia Brasileira (Marioni et al., 2008), e as fêmeas atingem um tamanho

corporal menor. A espécie pode atingir a maturação sexual rapidamente, entre 4,5 e 6 anos de

idade na Amazônia (Da – Silveira, 2001), bem menos tempo que os outros crocodilianos, que

22

requerem mais de 9 anos para as fêmeas alcançarem a maturidade sexual. Por atingir o

comprimento reprodutivo em um intervalo de tempo bem mais curto do que as demais

espécies de crocodilianos existentes, Rebêlo e Magnusson (1983) relatam que a espécie possa

suportar maior pressão de exploração, pela facilidade no recrutamento de indivíduos para a

população reprodutiva.

Distribui-se na Colômbia, Bolívia, Brasil e Peru (Ross, 1998). Encontra-se em

simpatria com C. c. yacare em algumas regiões do Brasil (Mato Grosso e Rondônia) e no Rio

Madre de Dios (Peru). No Brasil a espécie habita as águas de drenagem do Rio Solimões, Rio

Amazonas, Araguaia, Araguari, Itapicuru, Paranaíba, Negro, Tapajós, Tocantins, Xingú e os

rios que drenam para o Oceano Atlântico sobre a costa norte do Brasil (Brazaitis et al, 1998).

Atualmente a espécie está listada no Apêndice II da CITES e considerada na categoria

de baixo risco pela IUCN (Ross, 1998).

Fig. 06. Fêmea de Caiman crocodilus (A). Filhote de Caiman crocodilus (B) Foto: Boris

Marioni.

C. c. yacare distribui-se pelo norte da Argentina, parte do território paraguaio,

boliviano e centro – oeste brasileiro (Coutinho e Campos, 2007). No Brasil, a principal área

de ocorrência da espécie é a região do Pantanal, nos estados de Mato Grosso e Mato Grosso

do Sul (Brazaitis, 1998). Apresenta corpo esverdeado, com manchas amarelas e cinzas e pode

atingir até 2,5 metros de comprimento. Está listada no Apêndice II da CITES e na categoria

baixo risco pela IUCN (Coutinho e Campos, 2007).

C. c. fuscus distribui-se na Colômbia e Venezuela (Rueda – Almonacid et al., 2007).

Encontra-se associada à área com cobertura vegetal flutuante (Balaguera – Reina e Gonzáles –

Maya, 2009). Apresentam o dorso marrom claro, verde oliva ou marrom amarelado com

23

listras visíveis apenas na cauda e podem chegar até 2 m de comprimento (Rueda – Almonacid

et al., 2007). Está listado no Apêndice II da CITES.

C. c. apaporiesis é endêmica da Colômbia, ocorrendo em um trecho de 200 Km

(Rueda – Almonacid et al., 2007). Apresenta um rostro muito longo e relativamente largo, a

cor do dorso é marrom - amarelo brilhante com manchas pretas na cabeça, listras escuras no

corpo e na cauda, perna cinza escuro ou preta e abdômen amarelo (Rueda – Almonacid et al.,

2007). É sobre-explorado e por apresentar uma distribuição restrita é muito sensível a caça.

Está incluída no apêndice I da CITES (Rueda – Almonacid et al., 2007).

C. c. chiapasius distribui-se do sul do México, Guatemala, El Salvador, Honduras,

Nicarágua, Costa Rica, Panamá até a Colômbia e Equador. A morfologia cranial, como a

cabeça e o rostro menos largo que em C. c. fuscus, tem sido um argumento para a separação

como entidades subespecíficas diferentes (Rueda – Almonacid et al., 2007).

1.3. AMEAÇA AOS CROCODILIANOS

Dentre as principais ameaças aos crocodilianos encontram-se a superexploração dos

seus estoques, como a grande pressão de caça comercial para produção de couro e carne, a

modificação da vegetação ciliar, a alteração de habitats e de sítios de reprodução, a

contaminação das águas e perturbações antrópicas, tais como a circulação de embarcações

motorizadas (Thorbjarnarson, 1992).

Segundo Miles et al. (2009a), apesar dos esforços dos programas de recuperação das

espécies de crocodilianos com a diminuição das pressões da caça ilegal e fragmentação de

habitat, 17 espécies de crocodilianos ainda estão listadas no apêndice I da CITES, sendo elas:

Alligator sinensis, Caiman crocodilus apaporiensis, Caiman latirostris (exceto as populações

da Argentina, que estão incluídas no apêndice II), Melanosuchus niger (exceto as populações

do Brasil e do Equador, que estão incluídas no apêndice II), Crocodylus acutus (exceto as

populações de Cuba, que estão incluídas no apêndice II), Crocodylus cataphractus,

Crocodylus intermedius, Crocodylus mindorensis, Crocodylus moreletii, Crocodylus niloticus

(exceto as populações de Botswana, Etiópia, Quénia, Madagáscar, Malawi, Moçambique,

Namíbia, África do Sul, Uganda, República Unida da Tanzânia, Zâmbia e Zimbabwe, que

estão incluídas no apêndice II), Crocodylus palustris, Crocodylus porosus (exceto as

populações da Austrália, Indonésia, Papúa Nova Guiné que estão incluídas no apêndice II),

24

Crocodylus rhombifer, Crocodylus siamensis, Osteolaemus tetraspis, Tomistoma schlegelii,

Gavialis gangeticus.

Segundo critérios da União Internacional para a Conservação da Natureza e dos

Recursos Naturais (IUCN), cinco espécies de crocodilianos estão criticamente em perigo de

extinção (Alligator sinensis, Crocodylus mindorensis, Crocodylus intermedius, Crocodylus

siamensis, Gavialis gangeticus), duas espécies estão em perigo (Crocodylus rhombifer e

Tomistoma schlegelii), três espécies são consideradas vulneráveis (Crocodylus acutus,

Crocodylus palustris, Osteolaemus tetraspis), doze espécies são consideradas em baixo risco

de extinção (Crocodylus moreletii, Melanosuchus niger, Alligator mississippiensis,

Crocodylus johnstoni, Crocodylus niloticus, Crocodylus novaeguineae, Crocodylus porosus,

Caiman crocodilus crocodilus, Caiman latirostris, Caiman crocodilus yacare, Paleosuchus

palpebrosus, Paleosuchus trigonatus) e a espécie Crocodylus cataphractus devido a dados

insuficientes como distribuição e / ou status das suas populações, não está classificada em

nenhuma das categorias acima.

No Brasil, antes da criação da Lei de Proteção a Fauna (Lei 5.197/67, 1967), a caça

comercial de crocodilianos era uma prática legal (Smith, 1980). Apesar da exploração

comercial atualmente ser uma atividade proibida, permanece até os dias de hoje em várias

localidades. Há estimativas de que 50 toneladas de carne salgada de jacarés, principalmente

C. c. crocodilus, são comercializadas por ano na Reserva de Desenvolvimento Sustentável

Piagaçu-Purus, que fica localizada no baixo rio Purus (Marioni et al., 2006) e, segundo Da –

Silveira (2003), esta região é considerada a maior produtora ilegal de carne de jacaré do

mundo. Em virtude da sobreexploração que C. c. crocodilus vem sofrendo na área, há

necessidades de estudos que gerem informações sobre vários aspectos da biologia, visando à

composição do plano de manejo e conservação para a população da área.

1.3.1. MANEJO DOS CROCODILIANOS

O manejo dos crocodilianos objetivando o aproveitamento econômico da carne e

couro pode ser dividido em três modalidades: manejo extensivo ou caça controlada de

populações selvagens, conhecido por harvesting ou cropping, retirada de ovos de ninhos

provenientes da natureza e posterior criação dos filhotes em cativeiro, conhecido por

ranching, e, por último, o ciclo completo em cativeiro, incluindo reprodução, conhecido por

farming (Ashley, 1996).

25

No Brasil, o modelo vigente de uso do jacaré (extração de ovos e criação de jovens em

cativeiro), a partir da Portaria 126 de 1990 do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos

Recursos Naturais Renováveis (IBAMA), é a opção legal disponível para explorar as

populações naturais de jacarés (Coutinho e Campos, 2006). No entanto, uma das deficiências

técnicas da Portaria é que as cotas anuais de extração de ovos são baseadas em estimativas de

anos anteriores, e isso pode resultar em erros graves com autorizações de cotas super ou

subestimadas (Coutinho e Campos, 2006). Para as Unidades de Conservação (UCs) a

legislação vingente tem sido atualizada e revisada (Instituto Piagaçu, 2010).

As estratégias de manejo em UCs devem ser baseadas em informações sobre aspectos

relacionados à demografia, capacidade de regeneração, na estrutura genética e biologia

reprodutiva das espécies a serem manejadas. Deve haver uma participação efetiva das

comunidades locais, tanto no planejamento, como na implementação e nas decisões

(Arunachalan, 2000), quanto no direito ao beneficiamento e conservação dos recursos (Brasil,

1999). O manejo para ser sustentável, deve ser economicamente viável, ecologicamente

defensável e socialmente justo.

1.4. ASPECTOS DO SISTEMA REPRODUTIVO DOS CROCODILIANOS

O comportamento reprodutivo dos crocodilianos é dividido em corte e cópula,

nidificação, incubação, eclosão e pós-eclosão. O ciclo reprodutivo tem-se mostrado mais

complexo e evoluído do que o dos demais répteis (Magnusson et al., 1989).

A maturidade sexual é dependente do tamanho e idade dos animais, sendo que

normalmente os machos crescem mais rápido e apresentam um porte maior que as fêmeas

quando adulto. De um modo geral, os jacarés, aligátores e os pequenos crocodilos alcançam a

maturidade sexual com um porte relativamente pequeno, enquanto que os maiores crocodilos

e o gaviais tornam-se sexualmente maduros apenas quando relativamente grandes

(Magnusson et al., 1989).

Ainda permanece desconhecido como é feita a escolha de um determinado sítio de

nidificação pelos jacarés (Reagan, 2000). Há relatos de que a disponiblidade de certos tipos de

vegetação utilizados na composição do ninho possa ser importante para a escolha do local de

nidificação (Carbonneau, 1987).

O ninho dos crocodilianos varia de um simples buraco escavado na areia, como os

feitos pelas espécies Gavialis gangeticus, Tomistoma schlegeli, C. acutus, C. intermedius, C.

26

johnsoni, C. niloticus, C. palustris, C. rhombifer e C. siamensis, a montes de restos orgânicos

próximos a corpos de água, como os feitos pelas espécies C. novaeguineae, C. porosus,

Osteolaemus tetraspis, Alligator mississipiensis, Melanosuchus niger, Paleosuchus spp. e

Caiman spp (Coutinho e Campos, 2007). O tamanho e a composição dos ninhos dependem

mais do habitat e da disponibilidade de material (restos de folhagens e gravetos) do que das

espécies envolvidas (Coutinho e Campos, 2007).

Embora algumas fêmeas de crocodilianos desovem em anos consecutivos em

cativeiro, existem dados limitados do intervalo de nidificação em crocodilianos na natureza

(Reagan, 2000). Elsey et al. (2008) relatam que certamente muitos fêmeas de Alligator

mississipiensis não reproduzem a cada ano, visto que o esforço de nidificação é afetado pelo

nível das águas e pelas condições de habitat, fato observado em Louisiana nos Estados Unidos

onde a taxa de nidificação variou de 20.000 ninhos em 2006 para 43.000 ninhos em 2007.

De acordo com Campos e Magnusson (1995) e Campos (2003), o período de

nidificação dos jacarés na Amazônia ocorre predominantemente no final da estação seca, com

o nível da água ainda baixo. Da postura dos ovos até a eclosão dos jovens pode decorrer até

70 dias, isso dependendo das condições de incubação dos ovos e do cuidado das fêmeas.

Pouco se sabe sobre a fidelidade ao sítio de desova em crocodilianos e os dados de

vários estudos mostraram uma baixa porcentagem de reutilização imediata dos sítios de

desova em Alligator mississippiensis (Elsey et al., 2008). A partir da captura e marcação de

fêmeas de Alligator mississippiensis que estavam em defesa dos ninhos ao longo dos anos de

1997 a 2007 (exceto os anos de 1998 e 1999) no Rockefeller Wildlife Refuge (sudoeste de

Lousiana, USA) para o estudo do sistema de acasalamento iniciado por Davis et al. (2001),

Elsey et al. (2008) documentaram a reutilização ocasional de ninhos pelas fêmeas e vários

casos de fidelidade ao sítio de desova, incluindo dois casos de fidelidade ao sítio de desova

durante 7 anos.

As fêmeas dos crocodilianos investem tempo para a construção e cuidado contra

ataque de predadores aos seus ninhos, apresentando cuidado parental elaborado (Coutinho e

Campos, 2007) (Fig. 07 e 08). Apesar da alegação de que os filhotes dispersam-se

imediatamente após emergir do ovo (Hunt e Watanabe, 1982), sabe-se que alguns filhotes

permanecem perto da mãe no primeiro ano de vida e às vezes no segundo ou mesmo terceiro

ano (Hunt e Watanabe, 1982).

27

Fig. 07. Fêmea de Melanosuchus niger aproximando-se do ninho devido à presença humana

na RDS Mamirauá, Amazonas. Foto: Luiza Passos.

Fig. 08. Fêmea de Caiman latirostris em defesa do ninho no Uruguai. Foto: Diego Forrisi.

A comunicação vocal entre os filhotes e os adultos começa antes do ovo eclodir e

continua após a eclosão dos recém – nascidos. Os sons produzidos pelos recém-nascidos

28

estimulam a fêmea a escavar o ninho, utilizando seus membros e maxilas para afastar a

vegetação ou a terra e quebrar delicadamente a casca dos ovos com seus dentes para ajudá-los

a eclodir. Em seguida, a fêmea coloca os filhotes na boca e leva-os, um ou dois de cada vez,

para serem liberados na água (Pough et al., 2003). Os filhotes quando amedrontados, emitem

um grito de angústia que estimula os machos e fêmeas adultos a virem em sua defesa (Pough

et al., 2003). Golpes na água, com a cabeça e a cauda, e uma variedade de vocalizações

também são utilizados pelos machos durante a corte e exibições de territorialidade (Pough et

al., 2003).

O sexo dos crocodilianos não é um fator genético (não apresentam cromossomos

sexuais heteromórficos) e sim fenotípico, dependente da temperatura de incubação dos ovos.

Os ninhos incubados a temperaturas baixas (≤ 31,5 °C) originam fêmeas e os ninhos

incubados em temperaturas altas (≥ 31°C) originam principalmente machos (Coutinho e

Campos, 2005). Mudanças nas condições térmicas próximas aos ninhos podem resultar em

desvios da razão sexual (Rodrigues, 2005).

O tamanho corporal no nascimento, tamanho da ninhada, freqüência da reprodução,

época da maturidade sexual e modo de reprodução são componentes de história de vida de

uma espécie e compõe parte do seu esforço reprodutivo (Pough et al., 2003). Dessa forma, o

estudo da reprodução é essencial para a compreensão da dinâmica populacional de qualquer

espécie.

De acordo com Coutinho et al. (2005), a reprodução dos crocodilianos, tanto em

condições naturais como em cativeiro, tem recebido considerável atenção, particularmente

devido a sua aplicação no manejo e conservação das espécies. Muito das informações

disponíveis são relacionadas à produção de ninhos, duração do período de postura, tamanho

de ovos e filhotes e sua relação com tamanho das fêmeas.

Em C. c. crocodilus, parte da variação no número de ovos por ninho pode ser

explicada pelo tamanho das fêmeas, mas provavelmente existem outros fatores que interferem

na produção de ovos como idade, estado nutricional e a genética (Campos, 2003).

A estrutura social é caracterizada por hierarquias de dominância e territorialidade

(Lang, 1989), sendo que há lutas pelo domínio de territórios entre os machos (Garrick e Lang,

1977). Os machos maiores, mais agressivos ganham o combate e a prioridade de acesso às

fêmeas (Garrick e Lang, 1977). Neste sentido, os sistemas de acasalamento dos crocodilianos

têm sido geralmente classificados como políginicos em que grandes machos garantem a

maioria das cópulas (Lang, 1989). Porém, as fêmeas de jacarés podem circular livremente

29

entre os territórios dos machos rivais e acasalar com vários machos, inclusive com os machos

subordinados (Garrick e Lang, 1977), fato coroborado recentemente com dados genéticos

(Davis et al. 2001; McVay et al., 2008; Amavet et al., 2008; Lance et al., 2009).

1.5. TÉCNICAS MOLECULARES PARA O ESTUDO DO SISTEMA DE

ACASALAMENTO EM ANIMAIS

Dentre os vários marcadores moleculares utilizados para a análise de paternidade e

parentesco encontram-se: DNA polimórfico amplificado ao acaso - RAPD, polimorfismo do

comprimento de fragmento de restrição - RFLPs, minissatélites e os microssatélites que

também podem ser conhecidos por alguns sinônimos como: sequências simples repetidas

(SSR's), pequenas sequências repetidas (STR's), sequências simples repetidas lado a lado

(SSTR), simples polimorfismos de comprimento de seqüência (SSLP), sequências

microssatélites seguidas (STMS).

Os RAPDs não diferenciam os locos em heterozigose dos locos em homozigose e

apresenta uma baixa reprodutibilidade. Os RFLP possuem baixa heterozigosidade e baixo

conteúdo de informação de polimorfismo. Os minissatélites são de difícil interpretação devido

à extrema variabilidade genética que apresentam. Já os microssatélites apresentam vantagem

em relação aos outros marcadores para estudo de paternidade e parentesco por fornecer

informações sobre locos individuais, cálculo das freqüências alélicas e por exibir altos níveis

de diversidade genética e de polimorfismo (Parker et al., 1980).

Microssatélites são repetições em tandem de pequenos motivos de seqüência com 1 a

6 pb (Goldstein e Pollock, 1997), 1 a 5 pb (Schotterer, 1999) ou 2 a 8 pb (Armour et al.,

1999), sendo encontrados amplamente distribuídos pelo genoma da maior parte dos

eucariotos, embora também presente em procariotos (Litt e Luty, 1989), sendo flanqueadas

por seqüências conservadas (Avise, 1994).

Esses marcadores podem ser classificados quanto à presença ou a ausência de

interrupção na unidade repetitiva e ainda, quanto à presença de mais de um tipo de unidade

repetitiva (Goldstein e Schlotterer, 1999). De acordo com a presença ou ausência de

interrupção na unidade repetitiva, os microssatélites podem ser classificados como: a)

microssatélites perfeitos: consistem de um único motivo de repetição, não sendo

interrompidos ao longo da seqüência por nenhuma outra base (Ex: TATATATATATATATA); b)

microssatélites imperfeitos: quando uma única base altera o padrão do motivo repetitivo (Ex:

30

TATATATACTATATATA); c) microssatélites interrompidos: apresentam a inserção de um

pequeno número de bases ao longo da sequência de repetição (Ex:

TATATATAGGGTATATATA); d) microssatélites compostos: consistem de dois ou mais

microssatélites diferentes na mesma sequência (Ex: TATATATAGAGAGAGA) (Weber,

1990). Quanto à presença de mais de um tipo de unidade repetitiva, os microssatélites são

classificados como mono-, di-, tri-, tetra-, penta- ou hexa- nucleotídeos (Queller e Goodnight,

1989).

Os microssatélites mais comuns são os dinucleotídeos, seguidos pelos

mononucleotídeos e tetranucleotídeos, sendo menos abundantes os trinucleotídeos (Ellegren,

2004). A raridade dos microssatélites trinucleotídeos em crocodilianos da família

Alligatoridae foi observada por Glen et al. (1998). Segundo Morgante et al. (2002),

seqüências microssatélites compostas por motivos trinucleotídicos são mais abundantes em

regiões codificantes e isso resulta de uma seleção negativa contra mutações que alteram a fase

de leitura em regiões codificantes.

Os microssatélites apresentam uma elevada taxa de mutação, que pode variar entre

espécies, sendo considerada entre 10 -3 a 10 -10 por loco em cada geração (Goldstein e

Schlotterer, 1999). Essa elevada taxa de mutação resulta em uma ampla variação no número

de unidades repetidas, o que faz com que sejam altamente informativos e amplamente

utilizados na identificação de indivíduos (Goldstein e Schlotterer, 1999).

A explicação precisa para a variação encontrada no número de repetições em tandem

de um microssatélite é desconhecida, mas acredita-se que esteja associado à ocorrência de

crossing-over desigual ou por erros durante a replicação do DNA, processo descrito como

slippage, e seguido por falha no sistema de reparo que restaura a seqüência original

(Chalesworth et al., 1994). Alguns modelos de mutação são adotados quando se analisam

locos microssatéliters em estudos populacionais: modelo de alelos infinitos (IAM), modelo de

mutações escalonadas ou passo-a-passo (SMM) e o modelo de duas fases (TPM). O modelo

SMM é o mais utilizado para explicar as características evolutivas dos microssatélites, pois

sugere que o ganho e a perda de unidades de repetição se dão em igual probabilidade (taxa

fixa) e admite uma simetria no processo, independentemente do tamanho da repetição. No

modelo IAM, cada mutação cria um novo alelo a uma dada taxa (u), não permitindo

homoplasia e cada alelo idêntico compartilha o mesmo ancestral e são idênticos por

descedência. O modelo TPM surgiu como uma extensão do SMM e postula que diversos

eventos mutacionais resultam em um aumento ou diminuição de uma unidade de repetição,

31

embora também ocorram alterações de um grande número de repetições, ainda que menos

freqüentemente (Oliveira et al., 2006).

Dentre as principais aplicações dos marcadores microssatélites estão os estudos em

genética de populações, genética da conservação, estudos epidemiológicos e de patologia

molecular, mapeamento de QTLs (Locos de características quantitativas), mapeamento

genético, história evolutiva e análise do sistema de acasalamento (Chistiakov et al., 2006).

Os microssatélites possuem características que os tornam excelentes marcadores para a

análise do sistema de acasalamento como: alto polimorfismo, são abundantes e

uniformemente distribuídos por todo o genoma, são marcadores codominantes, apresentam

herança mendeliana, são automatizáveis em sistemas multiplex, o que permite avaliar

rapidamente um grande número de indivíduos para um grande número de locos em pouco

tempo, possuem alto poder de exclusão de paternidade (PE) o que permite indicar o

verdadeiro pai e também baixa probabilidade de identidade genética (PI), o que permite

diferenciar indivíduos.

As inferências do sistema de acasalamento baseados em marcadores microssatélites

têm demonstrado que a paternidade múltipla é freqüente em várias espécies de invertebrados e

vertebrados, incluindo Littorina obtusata (lula) (Buresch et al., 2001), Palaemonetes pugio

(camarão) (Baragona et al., 2001), Schmidtea polychroa (platelminto) (Pongratz e Michiels,

2003), Microtus arvalis (rato) (Borkowska e Ratkiewicz, 2010), Thamnophis sirtalis (cobra)

(McCraken et al., 99), várias espécies de tartarugas (Galbraith, 93, Peare e Parker, 94; Hoekert

et al., 99; Valenzuela, 2000; Fantin et al., 2008, Fantin et al., 2010), peixes (Avise e DeWoody,

2001), Ambystoma t. tigrinum (anfibio) (Gopurenko et al., 2006) e tem sido extensivamente

estudado em aves (Westneat et al. 90; Birkhead e Møller 92; Westneat e Sherman, �97;

Møller e Cuervo, 2000; Griffith et al. 2002). Em contraste com as aves, poucos estudos têm

investigado os padrões de acasalamentos múltiplos em crocodilianos (Uller e Olsson, 2008).

O conhecimento do sistema de acasalamento de uma dada espécie é particularmente

importante, pois influencia em uma série de fatores que vão desde a sustentabilidade da

população variando ao relativo sucesso reprodutivo dos indivíduos para a manutenção da

diversidade genética populacional e, conseqüentemente, o potencial evolutivo futuro de toda a

espécie (Frankham et al., 2002). Neste sentido, o presente trabalho visou gerar conhecimentos

sobre o sistema de acasalamento da espécie C. c. crocodilus da RDS Piagaçu – Purus usando

locos microssatélites isolados e caracterizados para a espécie. Os dados serão utilizados para

compor o plano de manejo da espécie na área coletada.

32

CAPÍTULO I

ARTIGO PUBLICADO NA REVISTA CONSERVATION GENETICS RESOURCES

(APÊNDICE I).

MARCADORES MICROSSATÉLITES PARA SISTEMA DE ACASALAM ENTO

E ANÁLISES DE POPULAÇÃO DE JACARÉ - TINGA Caiman crocodilus

(LINNAEUS 1758)

33

MARCADORES MICROSSATÉLITES PARA SISTEMA DE ACASALAM ENTO E

ANÁLISES DE POPULAÇÃO DE JACARÉ - TINGA Caiman crocodilus (LINNAEUS

1758)

Deyla Paula de Oliveira 1, Izeni Pires Farias 1, Boris Marioni 2, Zilca Campos 3, Tomas Hrbek 1,4*

Laboratório de Evolução e Genética Animal, Departamento de Biologia, Universidade Federal do Amazonas, Av.

Rodrigo Octávio Jordão Ramos, 3000, 69077-000, Manaus, AM, Brazil 1

Instituto Piagaçu, Rua UZ, Quadra Z, Numero 8, Conjunto Morada do Sol, Aleixo, 69060-000, Manaus/AM,

Brazil 2

EMBRAPA-Pantanal, Corumbá, MS, Brazil 3

Biology Department, University of Puerto Rico, Rio Piedras, San Juan, PR 00931, Puerto Rico 4

*Correspondência para:

Tomas Hrbek

Fone: + 1 787 764 000 ext. (1) 2909; e-mail: hrbek@uprrp.edu

RESUMO: Nós usamos a biblioteca enriquecida em microssatélites para isolar e caracterizar

12 locos microssatélites dinucleotídeos para Caiman crocodilus. Os microssatélites foram

caracterizados em populações de C. c. crocodilus da Reserva de Desenvolvimento Sustentável

Piagaçu Purus, Amazonas. Brasil e C. c. yacare de Cáceres. Mato Grosso, Brasil. Os

resultados da caracterização foram comparados entre as duas subespécies, com o número de

alelos variando de 3 a 20 e 1 a 14 por loco, em C. c. crocodilus e C. c. yacare,

respectivamente. A heterozigosidade observada variou de 0,088 – 0,816 e 0,115 – 0,833,

respectivamente. A exclusão de paternidade (QC) foi superior a 0,999 em ambas as

subespécies, e a probabilidade de identidade genética variou de 4,631 x 10 -13 em C. c.

crocodilus a 2,233 x 10 -6 em C. c. yacare. Todos os locos estão em equilíbrio de ligação e

com exceção de três locos em C. c. crocodilus todos os locos estão em equilíbrio de Hardy –

Weinberg. As características destes locos indicam que eles são uma excelente ferramenta para

o estudo do sistema de acasalamento e estrutura populacional no complexo de espécie

Caiman crocodilus.

PALAVRAS - CHAVE : Caiman crocodilus, sistema de acasalamento, análise de população,

34

loco microssatélite, jacaré – tinga.

INTRODUÇÃO

Caiman crocodilus (Linnaeus 1758) é amplamente distribuído no novo mundo. A sua

distribuição estende-se do Sul do México ao norte da Argentina, incluindo bacias

hidrográficas importantes, tais como Magdalena, Orinoco, Amazonas e Paraguai (Ross 1998).

É considerado um táxon bastante complexo dependendo do autor (Brazaitis et al. 1996; Ross

1998), até quatro subespécies são reconhecidas: C. crocodilus fuscus (Cope 1868), C.

crocodilus apaporinses (Medem 1955), C. crocodilus chiapasius (Bocourt 1976), C.

crocodilus yacare (King e Burke 1989), alternativamente C. c. yacare é considerado uma

espécie distinta (Busack & Pandya, 2001). Recentes análises moleculares identificaram várias

linhagens filogeneticamente divergentes que correspondem basicamente às subespécies

(Hrbek et al. 2008; Venegas-Anaya et al. 2008).

Busack e Padya (2001) relataram que os jacarés sul – americano, desempenham um

papel importante na economia local da bacia amazônica e tem sido uma importante fonte de

proteína animal, desde pelo menos 1200 a C. A exploração comercial dos crocodilianos para

comercialização de couro resultou na exportação de mais de 1,5 milhões de couro de jacarés

entre 1960 e 1969 da Amazônia Brasileira (Smith 1980), levando a um declínio populacional

(Ross 1998). Atualmente C. crocodilus está listada no Apêndice II pela Convenção

Internacional do Comércio de Espécies Exóticas da Flora e da Fauna (CITES), enquanto na

União Internacional para a Conservação da Natureza e dos Recursos Naturais (IUCN) está na

lista vermelha considerada na categoria baixo risco. Por causa do grave declínio populacional

de várias espécies de crocodilianos no século 20 e sua importância para a economia local, a

IUCN e o Crocodile Specialist Group (CSG) enfatizam a necessidade do desenvolvimento de

ferramentas moleculares e estudos genéticos. Os estudos genéticos são fundamentais para a

obtenção de informações sobre: estrutura populacional, padrões de dispersão e fluxo gênico,

hibridização, sistemas de acasalamento, entre outros parâmetros importantes para o manejo e

conservação. Inferências a cerca dos padrões e seus processos subjacentes podem ser obtidos

a partir da análise de marcadores polimórficos, como os microssatélites.

Marcadores microssatélites foram isolados para uma variedade de espécie de

crocodilianos incluindo Alligator mississipiensis (Glenn et al. 1998), Crocodylus moreletii

(Dever e Densmore 2001), Crocodylus johnstoni (FitzSimmons et al. 2001), Caiman

35

latirostris (Zucoloto et al. 2002), Crocodylus porosus (Miles et al. 2009 b), Paleosuchus

trigonatus (Villela, 2008), Alligator sinensis (Jing et al., 2009) e (Zhu et al. 2009). Alguns

desses marcadores foram amplificados com sucesso em Caiman c. crocodilus, no entanto, os

níveis de polimorfismo foram geralmente baixos e os padrões dos microssatélites foram

difíceis de interpetrar em Caiman crocodilus (dados não publicados), tornando os marcadores

heterólogos ineficientes para análise do sistema de acasalamento e para estudo da estruturação

populacional. Portanto, foram isolados e caracterizados 12 locos microssatélites altamente

polimórficos para Caiman c. crocodilus.

Os marcadores microssatélites foram isolados de acordo com o protocolo de Billotte et

al. (1999), com modificações. O DNA genômico total foi extraído de uma amostra de tecido

de um indivíduo proveniente da Reserva de Desenvolvimento Sustentável Piagaçu – Purus

(Amazonas, Brasil), através do protocolo CTAB 2% (Doyle e Doyle, 1987), com

modificações. O DNA foi digerido com a enzima Rsa I (10 U/mL), ligados a um adaptador

construído a partir do primer Rsa 21 (5´ - CTC TTG CTT ACG CGT GGA CTA - 3´) e Rsa 25

(5� - TAG TCC ACG CGT AAG CAA GAG CAC A - 3�) e amplificados com o primer RSA

21 de acordo com protocolo padrão de PCR (Billote et al. 1999). Os produtos de PCR

purificados foram hibridizados com oligonucleotídeos ligados a biotina III (CT)8 e (GT)8 e os

produtos hibridizados foram recuperados através do kit Streptavidine-Magnesphere (Promega,

Madison, WI). Os produtos hibridizados foram re-amplificados usando o primer RSA 21.Os

fragmentos de PCR purificados foram cloanados em um vetor pGEM-T (Promega, Madison,

WI), transformado em Escherichia coli XlL1 Blue (Invitrogen, Carlsbad, CA) e a seleção das

células azul/brancas foram realizadas. As PCRs foram realizadas diretamente das colônias

positivas utilizando os primers universais M13 (-21) e primer reverse M13 (-48). Os produtos

de PCR foram purificados usando Exo - Sap (Invitrogen, Carlsbad, CA) e as reações de

seqüenciamento foram feitas usando o Kit BigDye Terminator versão 3.1 (Applied

Biosystems, Inc), com os primers internos T7 e Sp6 de acordo com o protocolo do fabricante.

As reações de sequência foram feitas em sequenciador automático ABI 3130 xl (Applied

Biosystems, Inc).

Um total de 96 clones foram seqüenciados e destes, 28 foram selecionados para o

desenho dos pares de primers através do software Primer 3 (Rozen e Skaletsky 2000). Em 13

pares de primers, um dos iniciadores tinha uma cauda M13 (- 21) adicionado à sua

extremidade 5� (Schuelke 2000), enquanto nos 15 pares restantes, um dos iniciadores tinha

uma cauda M13 (- 48) adicionado à sua extremidade 5�. A adição de duas diferentes caudas

36

permite o anelamento simultâneo de primer universal M13 marcado com a fluorescência

FAM- 6 e HEX, respectivamente.

A temperatura ideal de anelamento foi inferida através do gradiente de PCR na faixa

de 48 a 63°C. A temperatura ideal para cada marcador variou de 50 a 60 °C e foram utilizados

para a caracterização de 12 primer altamente polimórficos a partir do conjunto original de 28

primer. As reações de genotipagem foram realizadas em um termociclador Veriti™ Thermal

Cycler (Applied Biosytems, Inc.) em um volume final de 10 µL. Cada reação continha 2,6 µL

de água ultrapura, 0,8 µL de 50 mM MgCl2, 0,8 µL de 10 mM dNTPs, 1,0 µL de tampão de

PCR (100 mM Tris-HCl, pH 8,5, 500 mM KCl); 1,0 µL de 5c de BSA, 0,3 µL de 2 µM do

primer forward; 0,7 µL de 2 µM do primer M13 marcado com fluorescência, 1,0 µL de 2 µM

do primer reverse; 0,8 µL de 2,5 U da enzima Taq DNA polimerase e 1,0 µL de DNA (50 –

100 ng/µL). As reações foram submetidas a duas ciclagens: desnaturação a 94ºC por 30 seg,

seguida de 20 ciclos de desnaturação a 94ºC por 30 seg, anelamento dos primers (temperatura

específica para cada par de primer) por 30 seg, extensão a 68ºC por 40 sec e a etapa de adição

da fluorescência consistiu em 25 ciclos de desnaturação a 94ºC por 20 seg, anelamento a 53ºC

por 30 seg, extensão a 72ºC por 40 seg, um passo final de extensão a 72ºC por 30 min. Um µL

do produto de PCR foi combinado com 1 µL de ROX de tamanho padrão (DeWoody, 2004) e

8,0 µL de formamida Hi - Di (Applied Biosystems, Inc) e genotipados em sequenciador

automático ABI 3130 xl (Applied Biosystems). Os genótipos foram visualizados com o

auxílio do programa GeneMapper v 4.0 (Applied Biosystems, Inc). Os locos microssatélites

foram caracterizados em 38 indivíduos de Caiman c. crocodilus da RDS Piagaçu – Purus

(Amazonas, Brasil) e 21 indivíduos de Caiman. c. yacare de Cáceres (Mato Grosso, Brasil),

nos programas GenAIEx v6.3 (Peakall & Smouse 2006), Fstat v2.9.3 (Goudet 1995) e Micro-

Checker v2.2.3 (Van Oosterhout et al. 2004).

Na população de Caiman c. crocodilus da RDS Piagaçu – Purus, a heterozigosidade

observada variou de 0,088 a 0,816 e a heterozigosidade esperada variou de 0,242 a 0,929. O

número de alelo por loco variou de 3 (loco Cc_B10) a 20 (loco Cc_D09), com média de 9,667

alelo/loco. A probabilidade de identidade genética para os locos individuais variaram de 0,012

a 0,531 por loco, enquanto que a probabilidade conjunta de identidade genética foi 4,631 x 10-

13. A probabilidade de exclusão de paternidade variou de 0,156 a 0,841 entre os locos,

enquanto que a probabilidade conjunta de exclusão de paternidade foi maior que 0,999

(Tabela 1). Três locos encontravam-se em significativo desvio do equilíbrio de Hardy-

Weinberg, e dois desses locos (Cc_B09 e Cc_D09) evidenciaram alelos nulos. Não houve

37

evidência de desequilíbrio de ligação entre os locos.

Os 12 locos polimórficos foram similarmente caracterizados na população de Caiman.

c. yacare de Cáceres, no entanto, apenas 10 locos foram polimórficos (Tabela 1). A

heterozigosidade observada variou de 0,115 a 0,833, a heterozigosidade esperada variou de

0,160 a 0,924, e o número de alelos por loco variou de três nos locos Cc_B10, Cc_D02 e

Cc_F03, a 14 nos locos Cc_E06 e Cc_E08. Os locos não mostraram desvio significativo de

Hardy-Weinberg, no entanto, os locos Cc_D02, Cc_D07, Cc_D09 e Cc_E06 evidenciaram

potencialmente a presença de alelos nulos. A probabilidade de identidade genética para os

locos individuais variaram de 0,017 a 0,714 por loco, enquanto que a probabilidade conjunta

de identidade genética foi de 2,233 x 10-8. A probabilidade de exclusão de paternidade variou

de 0,082 a 0,804 entre os locos, enquanto que a probabilidade conjunta de exclusão de

paternidade foi maior que 0,999 (Tabela 1). Todos os locos estão em equilíbrio de ligação.

Os 12 locos caracterizados parecem ser adequados para análises evolutivas do

complexo de espécies Caiman crocodilus que exige um conjunto de marcadores altamente

polimórficos, tais como estudos de sistema de acasalamento, estrutura populacional e variação

clinal em toda a Amazônia/Cerrado/Ecótono do Pantanal, parte superior do sistema do rio

Madeira.

AGRADECIMENTOS:

Este trabalho teve o suporte financeiro do CNPq/PPG7 5570090/2005-9 e CNPq/CT-

Amazônia 575603/2008-9 para I.P.F., e PROCAD-Amazônia-

INPA/UNICAMP/UFRGS/CAPES (023/2006). Permissão para a coleta das amostras de

tecido foi concedida pelo RAN/IBAMA n º. 18187-1 e SDS/CEUC. Este estudo faz parte da

dissertação de Mestrado de D.P.O em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva do

programa de pós-graduação do INPA/UFAM. D.P.O foi apoiada com uma bolsa do CNPq, e

para o trabalho de campo foi apoiado pelo WCS e Instituto Piagaçu.

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40

Tabela 1. Caracterização dos 12 locos microssatélites para Caiman c. crocodilus e teste de amplificação cruzada em Caiman c. yacare

GenBank Primer Tamanho Caiman c. crocodilus Caiman c. yacare

Locos Acesso. (5’-3’) Repeat motif Ta (ºC) (bp) n NA Ho He Q I n NA Ho He Q I

Cc_B09 GU807530 (GT)9 F - GTGAGGAACAGCTGGGAGAG

R - AAAAACACACACATGCATACATACT 50 °C 317 - 483 35 5 0.088 0.242* 0.156 0.53 19 4 0.208 0.231 0.116 0.610

Cc_B10 GU807531 (CA)9 F - CCTGGGTGTCCATGGGTAG

R - TGCTTTCAACTTCCCAGAGG 56 °C 240 - 248 36 3 0.571 0.568 0.326 0.255 21 3 0.154 0.275 0.133 0.555

Cc_C05 GU807532 (GT)20 F - TGTGATCTCTCTGATCTCCATGA

R - TCTGCCACAAGACAGGAGTG 60 °C 261 - 323 38 19 0.763 0.929* 0.841 0.012 19 4 0.125 0.160 0.082 0.714

Cc_D02 GU807533 (GT)12 F - GTGGAAAGTTCTGGGGTCAG

R - TTAATCCCTCCGCCCACA 60 °C 250 - 276 38 7 0.711 0.740 0.543 0.103 21 3 0.269 0.523 0.273 0.290

Cc_D03 GU807534 (CA)8 F - CTCTAACAGAGTAACCACCTTGC

R - GGTCATTTTGTAAATGCCAAAC 60 °C 279 - 289 38 4 0.526 0.532 0.310 0.275 21 1

Cc_D07 GU807535 (CA)12 F - TGGCATAGGACTGTTTTCCA

R - CAACAGCGGGAGTTTGGTT 58 °C 197 - 225 38 13 0.816 0.848 0.688 0.047 21 10 0.615 0.849 0.678 0.045

Cc_D09 GU807536 (GT)26 F - GGGTTCTGGGTTTGAGGAGT

R - GACAGAACCTGGCACACAAA 53 °C 267 - 337 35 20 0.559 0.888* 0.765 0.026 19 9 0.500 0.746 0.514 0.109

Cc_E06 GU807537 (CA)25 F - AGAGCTGGCATTTTCTGAGG

R - TGGACTATCAGGGGACAGGA 60 °C 205 - 317 37 10 0.622 0.800 0.628 0.067 18 14 0.652 0.924 0.804 0.017

Cc_E08 GU807538 (GT)16 F - ATTAAGCATATACAAACACACCAGA

R - TGGGTTTCCAAAATGACTTG 60 °C 206 - 242 36 14 0.778 0.835 0.680 0.048 19 14 0.833 0.876 0.719 0.035

Cc_F03 GU807539 (GT)9 F - GTGGTAATCCATTCTTTGTTCG

R - GGCAGTATCACACATTCCAGAG 50 °C 212 - 240 37 5 0.595 0.639 0.388 0.202 21 3 0.115 0.302 0.145 0.521

Cc_G08 GU807540 (CA)10 F - AACACCCCCTTGTAATGTGC

R - AGGGAGAATCAATGCACAGC 56 °C 260 - 272 37 5 0.541 0.559 0.336 0.25 21 1

Cc_H04 GU807541 (GT)16 F - AATGGGCTTTCCAGAAACTG

R - CCAGTGACCTAAATTCCAACC 53 °C 247 - 390 36 11 0.806 0.843 0.686 0.047 20 8 0.231 0.587 0.39 0.198

QC = IC = QC = IC =

0.999 4.631 x 10-13 0.999 2.233 x 10-8 Ta, temperature de anelamento; n. número de indivíduos, A. número de alelos; Ho Heterozigosidade observada; He Heterozigosidade esperada; I. Probabilidade de identidade genética por loco individual; IC. Probabilidade de identidade genética para todos os locos; Q. probabilidade de exclusão de paternidade para cada locos; QC. Probabilidade de exclusão para todos os locos

41

CAPÍTULO II

ARTIGO A SER SUBMETIDO AO JOURNAL OF EXPERIMENTAL Z OOLOGY

PART A: ECOLOGICAL GENETICS AND PHYSIOLOGY

ANÁLISE DO SISTEMA DE ACASALAMENTO DE Caiman crocodilus da RESERVA

DE DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL PIAGAÇU – PURUS, AMA ZONAS,

BRASIL

42

ANÁLISE DO SISTEMA DE ACASALAMENTO DE Caiman crocodilus da RESERVA

DE DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL PIAGAÇU – PURUS, AMA ZONAS,

BRASIL

Deyla Paula de Oliveira 1, Boris Marioni 2, Izeni Pires Farias 1, Tomas Hrbek 1,3*

Laboratório de Evolução e Genética Animal, Departamento de Biologia, Universidade Federal do Amazonas, Av.

Rodrigo Octávio Jordão Ramos, 3000, 69077-000, Manaus, AM, Brazil 1

Instituto Piagaçu, Rua UZ, Quadra Z, Numero 8, Conjunto Morada do Sol, Aleixo, 69060-000, Manaus/AM,

Brazil 2

Biology Department, University of Puerto Rico, Rio Piedras, San Juan, PR 00931, Puerto Rico 3

*Correspondência para:

Tomas Hrbek

Fone: + 1 787 764 000 ext. (1) 2909; e-mail: hrbek@uprrp.edu

RESUMO: Nós investigamos o sistema de acasalamento de Caiman crocodilus crocodilus da

Reserva de Desenvolvimento Sustentável Piagaçu – Purus, Amazonas, Brasil. Através do uso

de seis locos microssatélites específicos para C. c. crocodilus foram genotipados 229

indivíduos, incluindo 198 filhotes de 13 ninhos (n= 4 a 28), 10 fêmeas e 21 machos. Para a

determinação da paternidade foram realizadas duas abordagens comparativas que incluíram a

contagem simples dos alelos e a reconstrução dos genótipos parentais para inferir a

contribuição relativa dos pais para cada ninho. Os resultados foram similares entre as duas

abordagens e a hipótese nula de paternidade única foi rejeitada em todos os 13 ninhos,

demostrando que dois a quatro pais poderiam estar contribuindo para a prole e que as fêmeas

de C. c. crocodilus são poliândricas. Esta é a primeira evidência do sistema de acasalamento

em C. c. crocodilus, e mostra que a paternidade múltipla é comum na espécie e que a

freqüência está entre os maiores valores já relatada para outros crocodilianos. Os dados serão

utilizados para compor o plano de manejo da espécie na RDS – PP.

PALAVRAS – CHAVE: Caiman crocodilus crocodilus, microssatélites, sistema de

acasalamento

43

INTRODUÇÃO

O conjunto de estratégias e interações sociais que ocorrem entre os indivíduos de uma

população e formam um contexto dentro do qual tem lugar à união de gametas é denominado

sistema de acasalamento (Carranza, 1994). Dinamicamente, o acasalamento é a acepção de

duas fases sucessivas na reprodução, o pareamento e a cópula. Pode haver ainda uma terceira

fase: a corte nupcial que se situa cronologicamente entre as duas já mencionadas (Davis,

1955).

Os vertebrados apresentam três formas gerais de sistema de acasalamento: a

monogamia, a poligamia e a promiscuidade (Karl, 2008). A monogamia é caracterizada pelo

acasalamento de um macho com uma única fêmea, formando um par unido durante a estação

reprodutiva ou por toda a vida. Com poucas exceções, a monogamia é rara em animais (Karl,

2008). Existem três formas de poligamia: a poliginia, poliandria e a poliginandria. A poliginia

é caracterizada pelo acasalamento de um macho com muitas fêmeas (poliginia de defesa de

recurso e poliginia de dominância dos machos). A poliandria é o inverso da poliginia: uma

fêmea acasala com vários machos ao mesmo tempo (poliandria simultânea) ou

sucessivamente (poliandria sucessiva). A poliginandria é caracterizada como o acasalamento

com dois ou mais machos com duas ou mais fêmeas (Karl, 2008). A promiscuidade é a

mistura de poliginia, poliandria e poliginandria, onde tanto os machos quanto as fêmeas

acasalam-se com vários indivíduos diferentes. Essas três formas de sistema de acasalamento

ocorrem em répteis, sendo que os mesmos apresentam as maiores taxas de sistema de

acasalamento poligâmico comparado a qualquer outro grupo de vertebrado (Uller e Olsson,

2008).

É amplamente aceito que a estrutura do sistema de acasalamento dos vertebrados é

influenciada por uma série de variáveis ecológicas, como a disponibilidade e distribuição de

recursos alimentares e locais de reprodução, condições climáticas, pressão de predadores,

competição intra e interespecífica, densidade populacional e distribuição espacial e temporal

de parceiros sexuais (Kwiatkowski e Sullivan, 2002). Assim, o conhecimento do sistema de

acasalamento é particularmente importante, pois influencia em uma série de fatores que vão

desde a sustentabilidade da população ao relativo sucesso reprodutivo dos indivíduos (ou seja,

seu fitness individual) (Chapman et al., 2004).

O uso de marcadores moleculares para tais atribuições pode trazer informações que

seriam difíceis ou impossíveis de obter a partir de observações comportamentais, por

44

exemplo, nos casos em que os mecanismos pós-copulatórios afetam a paternidade

(Fitzsimmons, 98) ou onde o acasalamento em si é difícil ou impossível de observar (Coltman

et al., 1998). O marcador molecular de microssatélites é considerado o marcador ideal para a

análise do sistema de acasalamento por ser altamente polimórfico, co–dominante, ser

amplificado via reação em cadeia da polimerase (PCR) (Jones et al., 2010), ter herança

mendeliana (Paeker et al., 1980) e por permitir examinar o sistema de acasalamento sem a

observações de comportamento na natureza. Os marcadores microssatélites permitem ainda

responder as seguintes questões sobre o sistema de acasalamento: se as fêmeas estão

acasalando com mais de um macho na mesma temporada de reprodução, quantos e quais

machos são pais de uma determinada prole, e se há domínio de certos machos durante a

reprodução (Davis et al., 2001).

Nos últimos anos, estudos genéticos têm sido realizados para investigar o sistema de

acasalamento em algumas espécies de répteis, confirmando que a paternidade múltipla é

generalizada na classe (Uller e Olsson, 2008). São reportados a evidência da paternidade

múltipla e padrões de acasalamento em Alligator mississippiensis (Davis et al. 2001),

evidência da poliandria em Crocodylus moreletti (McVay et al., 2008), Caiman latirostris

(Amavet et al., 2008), teste de maternidade em Caiman latirostris (Zucoloto et al., 2009) e

paternidade múltipla plurianual e fidelidade ao companheiro de longa data em Alligator

mississippiensis (Lance et al., 2009).

A paternidade múltipla é devido ao acasalamento múltiplo numa estação reprodutiva

sem o armazenamento de espermatozóides; ao acasalamento múltiplo numa estação

reprodutiva com o armazenamento de espermatozóides entre as estações ou ao acasalamento

com um único macho nas estações reprodutivas com o armazenamento de espermatozóides

entre as estações.

Os grupos de vertebrados que armazenam espermatozóides incluem as aves e os

répteis, grupos que possuem ovos telolécitos completos ou megalécitos (Gist et al., 2008). Em

répteis o armazenamento de espermatozóides é generalizado em todos os grandes táxons

(Uller e Olsson, 2008). Evidências indiretas do armazenamento de espermatozóides em

crocodilianos foram relatadas por Davenport et al. (1995). Porém, a estratégia de

armazenamento e o local potencial de armazenamento dos espermatozóides pelas fêmeas de

crocodilianos só foram confirmadas recentemente em Alligator mississippiensis por Gist et al.

(2008).

A descoberta da múltipla paternidade em vários táxons e conseqüentemente a

45

poliandria têm ampliado o papel na compreensão dos benefícios para as fêmeas que realizam

acasalamentos múltiplos (Moore et al., 2008). Embora Karl (2008) ressalte que a poliandria

não acarreta o aumento do tamanho efetivo populacional, acredita-se geralmente que o

sistema de acasalamento poligâmico tenha efeitos profundos sobre a diversidade genética de

uma população e que a poliandria possa aumentar o tamanho efetivo populacional devido à

diversidade genética proporcionado pela cópula com mais de um macho com a conseqüente

competição dos espermatozóides desses machos no oviduto das fêmeas (Yue et al., 2010). São

relatados também que o acasalamento de poucos machos com várias fêmeas pode levar ao

declínio populacional (Fantin et al., 2008).

Como o sistema de acasalamento determina quais genes serão representados nas

gerações futuras e, portanto, afeta a trajetória evolutiva de uma população, o conhecimento

sobre o sistema de acasalamento é um fator decisivo para o sucesso em longo prazo em

qualquer sistema de manejo e conservação a ser estabelecido para uma determinada

população selvagem.

O presente trabalho faz parte de um estudo amplo do Programa de Conservação de

Crocodilianos na Reserva de Desenvolvimento Sustentável Piagaçu – Purus (RDS-PP), que

visa gerar informações sobre vários aspectos da ecologia geral da espécie Caiman croodilus

crocodilus. O conhecimento dos aspectos da ecologia da espécie junto com o conhecimento

do sistema de acasalamento dará embasamento para avaliar a susceptibilidade dessa espécie

quanto á exploração a qual a espécie vem sofrendo atualmente, visando à manutenção da

capacidade reprodutiva dessas populações a serem manejadas legalmente no futuro. Neste

sentido, o presente trabalho teve como objetivo analisar o sistema de acasalamento da espécie

C. c. crocodilus utilizando marcadores moleculares microssatélites espécie – específicos. O

estudo pretendia responder as seguintes questões: as fêmeas de C. c. crocodilus são

poliândricas? Qual a freqüência da poliandria (generalizada em todos os setores da RDS-PP)?

Os machos contribuem de maneira igualmente em cada ninho? Há machos dominantes? Há

evidência de fidelidade da fêmea a algum macho? Os machos da área de entorno contribuem

para a paternidade dos ninhos?

46

MATERIAL E MÉTODOS

Coleta das amostras

As coletadas foram realizadas na Reserva de Desenvolvimento Sustentável Piagaçu -

Purus (RDS - PP), localizada no baixo rio Purus, região central do Estado do Amazonas,

Brasil, entre as coordenadas geográficas 4º05´e 5º35´S e 61º73́e 63º35´O.

As coletas dos ninhos de C. c. crocodilus foram concentradas nos anos de 2007 e

2008, principalmente no período de vazante – seca entre os meses de setembro e dezembro

em três setores Cauá – Cuiuanã, Itapuru e Jari – Arumã, localizados na região norte da RDS –

PP. Os ninhos foram localizados durante caminhadas de varreduras nas margens de 15 lagos,

contando com a participação ativa dos moradores locais que atuaram como assistentes de

campo. Foram coletados de 30 a 100% de ovos de cada ninho (n= 4 a 28 ovos por ninho) em

13 ninhos, totalizando 198 filhotes (Tabela 1), sendo quatro ninhos da temporada reprodutiva

de 2007 e nove ninhos da temporada reprodutiva de 2008. Em alguns casos os ninhos estavam

parcialmente predados, o que inviabilizou a coleta de mais de 30% dos ovos.

As fêmeas encontradas guardando os ninhos foram consideradas como as possíveis

mães dos ninhos mais próximos e capturadas através de um laço especial de aço e cambão. Os

indivíduos capturados foram medidos, pesados e marcados individualmente, mediante a

remoção combinada de no máximo quatro das mais de 40 escamas caudais. Foram amostradas

11 fêmeas, sendo que uma destas fêmeas foi capturada em 2007 e recapturada em 2008 na

mesma localidade e com isso foi possível amostrar ninhos de duas temporadas reprodutivas

distintas. Uma fêmea de um ninho não foi capturada.

Adicionalmente, 21 amostras dos machos foram coletadas para ver a contribuição

relativa deles na prole de cada ninho (Tabela 2). Os machos foram capturados nos corpos de

água adjacentes aos locais onde os ninhos foram amostrados. Os procedimentos de captura,

medição, marcação individual e soltura foram os mesmos que os utilizados para as fêmeas no

ninho.

Todas as amostras de tecidos foram armazenadas em microtubos devidamente

identificados contendo álcool 95%, estocados em caixas de armazenamento e depositados na

Coleção de Tecidos de Genética Animal / CTGA – ICB / UFAM (CGEN, deliberação n. 75 de

26/08/04) do Laboratório de Evolução e Genética Animal, Universidade Federal do Amazonas

(LEGAL/UFAM).

47

Protocolos de laboratório

O DNA genômico foi isolado das amostras de tecido pelo método CTAB 2% (p/v)

(Doyle e Doyle, 87), com algumas modificações.

Para as reações de PCR foram utilizados seis locos microssatélites mais polimórficos,

que em conjunto mostraram PEC > 0.95 e PI < 0.001 e que permitiam formar multiplex dos

desenvolvidos por Oliveira et al. (2010) para C. c. crocodilus.

As amplificações foram realizadas em um termociclador Veriti™ Thermal Cycler

(Applied Biosytems, Inc.) em um volume final de 10 µL. Cada reação continha 2,6 µL de

água ultrapura, 0,8 µL de 50 mM MgCl2, 0,8 µL de 10 mM dNTPs, 1,0 µL de tampão de PCR

(100 mM Tris-HCl, pH 8,5, 500 mM KCl); 1,0 µL de 5c de BSA, 0,3 µL de 2 µM do primer

forward; 0,7 µL de 2 µM do primer M13 marcado com a fluorescência FAM ou HEX, 1,0 µL

de 2 µM do primer reverse; 0,8 µL de 2,5 U da enzima Taq DNA polimerase e 1,0 µL de

DNA (50 – 100 ng/µL). As amplificações foram realizadas em dois diferentes programas de

ciclagem: desnaturação a 94ºC por 30 seg, seguida de 20 ciclos de desnaturação a 94ºC por 30

seg, anelamento dos primers (temperatura específica para cada par de primer) por 30 seg,

extensão a 68ºC por 40 seg e a etapa de adição da fluorescência consistiu em 25 ciclos de

desnaturação a 94ºC por 20 seg, anelamento a 53ºC por 30 seg, extensão a 72ºC por 40 seg,

um passo final de extensão a 72ºC por 30 min.

Um µL do produto de PCR foi combinado com 1 µL de 6-carboxi-X-rodamina (ROX) de

tamanho padrão (DeWoody, 2004) e 8,0 µL de formamida Hi - Di (Applied Biosystems, Inc)

e genotipados em sequenciador automático ABI 3130 xl (Applied Biosystems, Inc). As

genotipagens foram feitas em sistema multiplex onde as combinações dos pares de locos

foram escolhidas por possuírem alelos em faixas de tamanho diferentes ou estarem marcados

por diferentes tipos de fluorescências (Tabela 3). Os genótipos foram visualizados com o

auxílio do programa GeneMapper TM software versão 4.0 (Applied Biosystems Inc.) para

inferir os tamanhos dos alelos de cada loco.

Ao todo foram genotipados 229 indivíduos, totalizando 198 filhotes de 13 ninhos (n=

4 a 28), 10 fêmeas e 21 machos. A amostra da fêmea do ninho 1 não foi amplificada devido a

má conservação do tecido em campo.

48

Análise dos dados

Foram calculadas a probabilidade de identidade genética, por loco (I) e combinada

(PI), probabilidade de exclusão de paternidade (PE) e de exclusão de paternidade combinada

(PEC) através do programa GenAIEx 6.3 (Peakall e Smouse, 2006). A probabilidade de

exclusão (PE) foi calculada para três casos: PE1 quando o genótipo de ambos os parentais são

conhecidos, calculada por meio da fórmula 1a de Jamieson e Taylor (1997), PE2, quando não

está disponível um ou outro genótipo parental, calculada segundo a fórmula simplificada 2a

de Jamieson e Taylor (1997), com base em Garber e Morris (1983) e PE3 quando não está

disponível nenhum genótipo parental, calculada segundo a fórmula 3a de Jamieson e Taylor

(1997), com base em Grundel e Reetz (1981). A probabilidade de exclusão combinada para

todos os locos é dada por: PEC = 1 – (1-P1) (1-P2) (1-P3)...(1-Pk), sendo n o número de locos

avaliados e k é a probabilidade de exclusão de cada loco.

Determinou-se a probabilidade de identidade (I), segundo estabelecido por Paetkau et

al. (1995) para cada um dos locos escolhidos e a probabilidade de identidade combinada (PI),

calculada segundo a fórmula: PI = Σi p4

i + Σi Σ j>i (2pipj)2, onde pi e pj são as freqüências de

dois alelos de uma determinada população.

A contagem dos alelos e dos genótipos foi utilizada para testar a presença ou a

ausência de mais de um pai em cada ninho. O método mínimo de contagem de alelos

pressupõe uma distribuição mendeliana dos alelos na progênie (Myers e Zamudio, 2004). Este

método atribui à paternidade múltipla dentro de uma ninhada supondo que todos os alelos não

contabilizados pelo genótipo materno foram contribuídos pelo genótipo do pai (Myers e

Zamudio, 2004).

Como a análise usando o método mínimo de contagem dos alelos é feita

individualmente para cada loco foi utilizado o programa Gerud 2.0 (Jones, 2005), que faz as

análises de reconstrução dos genótipos utilizando todos os locos microssatélites em conjunto.

Este programa reconstrói os possíveis genótipos maternos e paternos, dado que todos os

filhotes de um ninho são irmãos ou meio irmãos e faz uma busca exaustiva de todos os

possíveis genótipos dos pais contra a matriz da progênie para encontrar o número mínimo de

pais para explicar a matriz.

O programa não aceita dados faltantes, assim a prole com dados perdidos não pode ser

analisada e foi eliminada. Também não faz concessão a erros de genotipagem ou mesmo

mutações, mas ele detecta as incompatibilidades entre os parentais e os filhotes conhecidos, o

49

que pode dar uma indicação sobre a taxa de erros das genotipagens no conjunto dos dados,

permitindo que estes dados sejam retirados das análises.

RESULTADOS

Todos os seis locos foram altamente polimórficos e o número de alelos por loco dentro

dos ninhos, variou de 2 a 9, e em todos os ninhos o número de alelos observados variou de 11

para o loco Cc_H4 A 21 para o loco Cc_D9 (Tabela 4).

A probabilidade de exclusão obtida por loco variou de 0,794 a 0,872 quando ambos os

pais são conhecidos, de 0,657 a 0,772 quando apenas um dos pais é conhecido, e de 0,931 a

0,971 quando nenhum dos pais é conhecido (Tabela 5). A probabilidade de exclusão

combinada variou de 0, 816 a 0,999 quando ambos os pais são conhecidos, de 0,689 a 0,988

quando apenas um dos pais é conhecido, e quando não há a possibilidade de indicar nenhum

dos parentais, a probabilidade variou de 0,945 a 0,999 (Tabela 6).

A probabilidade de identidade genética por loco variou de 0,299 a 0,371 (Tabela 5) e a

probabilidade combinada de identidade genética (PI) variou de 0, 299 a 0,001 (Tabela 6),

indicando um valor baixo de identidade genética.

Os genótipos maternos foram determinados diretamente a partir das genotipagem das

amostras das fêmeas que estavam ao lado dos ninhos e estes puderam ser observados nos

genótipos dos descendentes. Foram genotipados todos os alelos maternos através dos seis

locos microssatélites nos ninhos N2, N3, N4, N7, N9, N11, N12, N13. No ninho 5 os alelos

maternos só puderam ser genotipados através dos locos Cc_D7, Cc_D9, Cc_E6, Cc_E8 e

Cc_H04, no ninho 6 os alelos maternos só foram genotipados através dos locos Cc_C5,

Cc_E6 e Cc_E8 e no ninho 8 os alelos maternos só foram genotipados através dos locos

Cc_C5, Cc_D7, Cc_E6 e Cc_E8 e Cc_H4. A fêmea do ninho N1 foi capturada, porém pela má

conservação do tecido em campo, os alelos correspondentes a cada loco não puderam ser

genotipados. A fêmea do ninho N14 não foi capturada, portanto os genótipos dessa fêmea

foram deduzidos a partir dos filhotes homozigotos quando presentes no ninho para cada loco.

Para as contagens simples dos alelos foram considerados os genótipos maternos dos ninhos

N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, N11, N12 e N13, com base nos padrões de herança

mendeliana e com isso, foi possível averiguar a contribuição relativa de mais de um pai para a

prole em cada ninho.

A presença de filhotes homozigotos para um alelo permitiu a dedução de um alelo

50

paterno no ninho N1 através do loco Cc_H4, ninho N2 através dos locos Cc_C05 e Cc_D9,

ninho N3 através dos locos Cc_E6, Cc_E8 e Cc_H4, ninho N4 através dos locos Cc_C05,

Cc_E08 e Cc_H04, ninho N5 através dos locos Cc_D7, Cc_D9, Cc_E8 e Cc_H4, ninho N6

através dos locos Cc_E6 e Cc_E8, ninho N7 através dos locos Cc_C5, Cc_D7, Cc_E6 e

Cc_H4, ninho N8 através dos locos Cc_C5, Cc_D7, Cc_E6, Cc_E8 e Cc_H4, ninho N9

através dos locos Cc_C5, Cc_D09, ninho N11 através dos locos Cc_C5, Cc_E6 e Cc_H4,

ninho N12 através dos locos Cc_C5, Cc_D7, Cc_D9, Cc_E6 e Cc_H4 e ninho N13 através

dos locos Cc_C5, Cc_D9, Cc_E6, Cc_E8, Cc_H4. Já a presença de filhotes homozigotos para

dois alelos permitiu a dedução de dois alelos parternos nos ninhos N2 (loco Cc_E06), ninho

N5 (loco Cc_E6), ninho N7 (loco Cc_D09), ninho N9 (loco Cc_H04), N11 (loco Cc_E8),

ninho N13 (loco Cc_D7). A presença de filhotes homozigotos para um alelo permitiu deduzir

tanto o alelo materno nos casos em que alguns dos locos não puderam ser genotipados para as

fêmeas e também permitiram deduzir os alelos dos pais nos ninhos N1 através dos locos

Cc_D7, Cc_E8 e Cc_H4, ninho N6 através dos locos Cc_D7, Cc_D9 e Cc_H4), ninho N8

através do loco Cc_D9 e ninho N14 através do loco Cc_H4. A presença de filhotes

homozigotos para dois alelos permitiu deduzir tanto o alelo materno quanto os alelos dos pais

no ninho N1 através do loco Cc_E6, ninho N5 através do loco Cc_C5 e ninho N14 através dos

locos Cc_D9 e Cc_E6. Assim, a presença de filhotes homozigotos diferentes para um ou dois

alelos facilitou a reconstrução dos genótipos parentais e permitiu a verificação da presença de

mais de um pai em cada um dos ninhos.

Através da contagem simples dos alelos foi detectada a paternidade múltipla através de

dois locos microssatélites nos ninhos N4, por três locos nos ninhos N3, N9 e N14, por quatro

locos nos ninhos N1, N5 e N8, por cinco locos nos ninhos N1, N2, N11 e N12 e por todos os

locos nos ninhos N6, N7 e N13 (Tabela 7).

Através do programa Gerud 2.0 foi possível reconstruir os genótipos dos parentais das

progênies. Foi realizada a determinação dos genótipos das mães compatíveis e em seguida

foram feitos os testes dos possíveis genótipos paternos para ver qual combinação mínima dos

pais poderia explicar o conjunto dos dados.

Verificou-se que todos os genótipos das mães reconstruídos com o programa Gerud

2.0 foram compatíveis com os genótipos das fêmeas que estavam em defesa dos ninhos e que

haviam sido genotipadas. Como a fêmea do ninho 14 não foi capturada, os genótipos desta

fêmea foram reconstruídos pelo programa. Esse genótipo reconstruído também foi compatível

com o genótipo deduzido a partir dos filhotes homozigotos quando presentes no ninho para

51

cada loco através do método da contagem simples dos alelos. Também foi possível confirmar

que a fêmea do ninho N3 capturada em 2007 e recapturada em 2008 na mesma localidade era

realmente a mãe do ninho N3 e do ninho N4.

Através da reconstrução de todos os possíveis genótipos paternos para ver qual

combinação mínima dos pais poderia explicar o conjunto dos dados, verificou-se a

contribuição relativa de dois pais para os ninhos N3, N4, N5, N8, N9 e N11, de três pais para

os ninhos N1, N7, N12 e N14 e de quatro pais para os ninhos N2, N6 e N13, sendo que cada

um dos pais contribuiram diferentemente para cada prole (Tabela 8). Portanto, os dados

gerados pelo programa Gerud 2.0 confirmam que há paternidade múltipla em 100% dos

ninhos de C. c. crocodilus da RDS – PP.

Os genótipos dos 21 prováveis pais amostrados nos mesmos corpos de águas dos 13

ninhos, não corresponderam a nenhum dos genótipos dos pais reconstruídos por Gerud 2.0.

Assim, nenhum destes machos genotipados poderia ser o pai de algum dos ninhos.

DISCUSSÃO

Poder de discriminação dos locos microssatélites para a análise de parternidade em

C. c. crocodilus

Todos os seis locos utilizados para a análise da paternidade na espécie foram altamente

polimórficos. Tal constatação é importante, pois o conteúdo de informação do loco, que por

sua vez, depende do número de alelos e da distribuição das freqüências alélicas, melhora a

possibilidade de avaliação da paternidade (Wenk et al., 2005). O poder informativo de um

microssatélite para a determinação da paternidade é determinado pelo valor da probabilidade

da identidade genética e pela probabilidade de exclusão da paternidade, que são dependentes

do número de alelos e da distribuição de freqüências desses alelos na população. Constatou-se

que os seis locos também apresentaram bons índices de probabilidade de identidade genética

por loco e combinada e de probabilidade de exclusão de paternidade e de exclusão de

paternidade conjunta. O índice de identidade genética que é definida como a probabilidade

que dois indivíduos ao acaso da população apresentaram um perfil genético idêntico com os

locos testados, mostrou valores baixos, sendo que quanto menor os valores de identidade

genética, maior será o potencial de discriminação dos locos utilizados. Os seis locos

combinados indicaram uma alta probabilidade de um pretenso pai ser o verdadeiro pai,

52

quando comparado, ao acaso, com a probabilidade de que outro macho da população seja o

verdadeiro pai. A probabilidade de exclusão de paternidade variou de 98 % (quando apenas

um dos parentais é conhecido) a 99% (quando ambos os parentais são conhecidos e quando

não há a possibilidade de indicar nenhum dos parentais). Isberg et al. (2004) também

encontraram valores altos de probabilidade de exclusão de paternidade (99,8%), porém com

14 locos desenvolvidos por FitzSimmons et al. (2001) para Crocodylus porosus. Segundo

Curi e Lopes (2001), a eficácia do teste de paternidade não depende do número de locos

utilizados, mas sim do poder informativo que esses locos proporcionam.

Os resultados destes índices demonstraram o alto poder de discriminação dos seis

locos combinados, evidenciando que apenas os seis locos foram marcadores robustos para

inferir o sistema de acasalamento na espécie.

Análise de paternidade em C. c. crocodilus

O método mínimo de contagem dos alelos pressupõe uma distribuição mendeliana dos

alelos na progênie, onde cada filhote da ninhada deve herdar um dos dois alelos maternos e

um alelo paterno. Este método assume que todos os alelos dos filhotes não herdados pelas

fêmeas foram necessariamente contribuídos pelo genótipo dos pais (Myers e Zamudio, 2004).

Os filhotes homozigotos presentes nos 13 ninhos analisados também foram extremamente

importantes para inferir os prováveis alelos paternos e também para inferir se havia a

possibilidade de mais de um pai para cada um dos ninhos. Esse método, apesar de ser

informativo, é conservador na medida em que não é contabilizada a paternidade múltipla por

machos com alelos similares (Myers e Zamudio, 2004). O método também não permite

estimar quantos prováveis pais poderiam estar contribuindo para cada um dos ninhos e nem

permite reconstruir os verdadeiros genótipos dos parentais. Estas informações foram obtidas

através do programa Gerud 2.0 (Jones, 2005), que permitiu a reconstrução dos genótipos dos

parentais e também verificou a combinação mínima dos pais que poderiam estar contribuindo

para cada um dos 13 ninhos.

Os dados dos segundo método de análise confirmam que há paternidade múltipla em

100% dos ninhos. Os dados revelam ainda que a freqüência da paternidade múltipla obtida

esteja entre os maiores valores já registrados para as demais espécies de crocodilianos.

Para Alligator mississippiensis, Davis et al. (2001) relataram que a paternidade

múltipla foi detectada em 31,8% (7/22) dos ninhos analisados através de cinco locos

53

microssatélites. Para a realização do trabalho foram amostrados três ninhos na temporada

reprodutiva de 1995 e dezenove na temporada reprodutiva de 1997, sendo que os três ninhos

coletados em 1995 também foram genotipados utilizando um loco isoenzimático.

McVay et al. (2008) testaram a evidência da paternidade múltipla em Crocodylus

moreletii de duas localidades de Belize (América Central) através de cinco locos

microssatélites. Os autores relataram que 50% (5/10) dos ninhos analisados apresentaram a

contribuição de mais de um macho. Os dados sugerem que a paternidade múltipla é uma

estratégia de acasalamento nos crocodilos verdadeiros.

Amavet et al. (2008) detectaram a paternidade múltipla em 50% (2/4) dos ninhos de

Caiman latirostris de Santa Fé (Argentina) através de quatro locos microssatélites

desenvolvidos por Zucoloto et al. (2002) para a espécie.

Lance et al. (2009) obtiveram resultados da variação da paternidade múltipla em

Alligator mississippiensis durante oito estações reprodutivas no período de 10 anos (1995 a

2005). Foram analisados 92 ninhos, juntamente com os 22 ninhos do estudo de Davis et al.

(2001), através de cinco locos microssatélites. Foram detectados 51% de paternidade múltipla

em todos os ninhos, com variação de 40 a 67% entre os anos, ilustrando a complexa natureza

do comportamento de acasalamento dos crocodilianos. Os autores detectaram pela primeira

vez em crocodilianos a fidelidade parcial ao macho. Através da análise dos ninhos de dez

fêmeas recapturadas, foi possível detectar que sete destas fêmeas exibiram fidelidade ao

macho, sendo que uma fêmea copulou com o mesmo macho em três anos (1997, 2002 e

2005). Cinco destas fêmeas exibiram fidelidade parcial ao macho e tiveram pelo menos um

ninho com paternidade múltipla, ou seja, essa fêmea acasalou com o mesmo macho, mas não

exclusivamente.

No presente estudo foram amostrados dois ninhos (N3 e N4) de uma mesma fêmea em

duas temporadas reprodutivas e foi possível detectar que esta fêmea acasalou com quatro

diferentes machos em 2007 e 2008 (dois em cada estação reprodutiva), não sendo detectada

fidelidade a um único macho entre as duas temporadas reprodutivas. Seria necessária a

inclusão de outros ninhos de fêmeas recapturadas para averiguar se o comportamento de

fidelidade ao macho também seria comum em fêmeas de C. c. crocodilus. Porém, este único

caso reforça o fato de que as fêmeas da espécie apresentam fidelidade ao local de desova na

RDS Piagaçu – Purus. Este comportamento também já foi observado para A. mississippiensis

por Elsey et al., (2008) que relataram que a espécie apresenta graus variados de fidelidade ao

local do ninho, em geral na mesma área do ano anterior e alguns ninhos no mesmo local

54

durante anos.

A contribuição relativa dos machos para cada prole variou de 2 a 4 pais, sendo que em

46 % (6/13) dos ninhos, dois machos possivelmente contribuíram para a paternidade da prole,

em 31 % (4/13) dos ninhos três machos contribuíram para a paternidade da prole e em 23 %

(3/13) foram necessários quatro pais para explicar a contribuição extra para a prole. Ao total,

37 machos contribuíram para a paternidade dos 13 ninhos em conjunto em freqüências

aproximadamente iguais. Nenhum dos 21 machos capturados contribuiu para a paternidade

das proles dos 13 ninhos. Torna-se necessário fazer uma maior amostragem dos machos de

várias localidades da RDS Piagaçu – Purus para verificar os possíveis pais que estejam

contribuindo para a prole nas respectivas áreas amostradas.

Foi constatado que cada genótipo paterno foi único (não há compartilhamento na

fertilização de fêmeas de outros ninhos). Este tipo de contribuição diferencial de cada um dos

machos nos ninhos pode surgir através de vários fatores como a freqüência da cópula,

procedência do esperma e / ou momento da cópula e a competição dos espermatozóides

(Lance et al., 2009; Yue et al., 2010). Lance et al. (2009) constataram que em mais de 87 %

dos ninhos de A. mississipiensis analisados havia a contribuição de um macho primário

responsável pela paternidade de aproximadamente 50 % dos filhotes. Os autores concluíram

que o sistema de acasalamento desta espécie não é caracterizado por alguns machos

dominantes monopolizando o acasalamento.

Fisher e Hoekstra (2010) mostraram a partir de um experimento com camundongos do

gênero Peromyscus, cujas fêmeas são poliândricas, que os espermatozóides dos machos

podem formar agrupamentos com os outros espermatozóides gerados pelo mesmo indivíduo.

Os espermatozóides agregados têm a vantagem em serem mais rápidos do que os

espermatozóides individuais, o que os ajudam a atravessar o inóspito ambiente do aparelho

reprodutor feminino e permitem ainda a competição com os espermatozóides dos outros

indivíduos que a fêmea venha a copular. Do ponto de vista evolutivo, o agrupamento garante

que um determinado espermatozóide tenha seu material genético representado na prole, visto

que os demais espermatozóides que não fertilizaram o óvulo têm em média 50% de seu

material genético semelhante ao espermatozóide - irmão que fertilizou o óvulo.

É desconhecido se a existência da paternidade múltipla em C. c. crocodilus se deve ao

acasalamento com mais de um macho na mesma temporada reprodutiva com a conseqüente

competição dos espermatozóides desses machos no oviduto da fêmea apenas nesse ciclo

reprodutivo ou se a fêmea possa armazenar espermatozóides dos machos copulados em várias

55

temporadas reprodutivas como já relatado para algumas espécies de répteis como lagartos,

serpentes e tartarugas.

Davis et al. (2001) ressaltam que muitos dos argumentos de adaptação do

armazenamento dos espermatozóides em muitas espécies de répteis não se aplicam aos

crocodilianos. Além disso, os crocodilianos desovam apenas uma vez por temporada

reprodutiva e com isso não precisariam armazenar espermatozóides para desovas

subseqüentes (Magnusson et al., 89; Davis et al., 2001). Dados do trabalho de Gist et al.

(2008) com a espécie A. mississippiensis reforçam estes argumentos, sendo que os autores

demonstraram que está espécie pode armazenar o espermatozóide dos machos em seu oviduto

dentro da mesma época reprodutiva, mas não encontraram provas de que os espermatozóides

possam ser armazenados de uma estação reprodutiva para a próxima.

Implicações do sistema de acasalamento para a conservação e manejo

A Reserva de Desenvolvimento Sustentável Piagaçu – Purus (RDS – PP), por ser uma

Unidade de Conservação Estadual de Uso Sustentável, é regido pelo Sistema Nacional de

Unidades de Conservação da Natureza (SNUC) e, em virtude disso, as espécies da fauna

silvestres tradicionalmente sujeitas à exploração econômica, como os C. c. crocodilus, são

passíveis de manejo legalizado, desde que previsto no plano de manejo da área. Esta espécie

merece uma atenção especial, pois está sujeita a uma alta pressão de caça na RDS - PP, de

forma que o baixo rio Purus é atualmente considerada uma das áreas de maior produção ilegal

de carne de jacarés (Da - Silveira, 2003)

Para a implantação do projeto de manejo há necessidade de estudos que gerem

informações sobre vários aspectos da biologia da espécie a ser manejada. Baseado nisso, o

Instituto Piagaçu (co - gestor da RDS – PP), através do Programa de Conservação de

Crocodilianos, realiza vários estudos na área da reserva, visando levantar informações básicas

que irão complementar o plano de manejo e conservação da espécie (Instituto Piagaçu, 2010).

Foram realizados mapeamentos dos locais de nidificação de jacarés e levantamentos noturnos

a fim de determinar a abundância, densidade e razão sexual das populações.

Os dados ecológicos indicam alguns possíveis efeitos da caça ilegal na estrutura

populacional de C. crocodilus, por exemplo, a estrutura de tamanho das populações indica que

81% dos indivíduos estão abaixo do tamanho mínimo reprodutivo (comprimento rostro –

cloacal ≤ 60 cm), sugerindo inclusive o manejo específico e monitoramento em longo prazo

(Instituto Piagaçu, 2010).

56

É relato que fêmeas de Alligator mississippiensis têm uma ampla oportunidade de

avaliar e escolher os machos preferidos, sendo que em cativeiro as fêmeas preferem machos

dominantes, mas que ocasionalmente podem acasalar com os machos subordinados (Garrick e

Lang, 77). Também o padrão de fidelidade ao macho encontrado por Lance et al. (2009) para

a mesma espécie sugere uma potencial escolha dos machos pelas fêmeas. Assim, a exploração

ou caça ilegal pode estar afetando diretamente o sistema de acasalamento da espécie C. c.

crocodilus na RDS – PP, porque ela tende a alterar a dinâmica de corte e a seleção de

parceiros, pois elimina indivíduos com características particulares, reduz o sucesso global de

acasalamento, a qualidade genética dos descendentes resultantes da baixa seleção sexual e

conseqüentemente a produtividade e tem forte efeito sobre o recrutamento posterior

(Allendorf e Hard, 2009).

A dinâmica de acasalamento encontrada para C. c. crocodilus, nos permite afirmar que

deve ser protegidas áreas maiores do que as áreas de ocorrência dos ninhos, pois as fêmeas

estão copulando com machos de outras áreas.

No presente trabalho, constatou-se que C. c. crocodilus apresenta um sistema de

acasalamento poligâmico, fato já observado para outras espécies de crocodilianos. Não

descartando o fato da poligamia ser o sistema de acasalamento preferencial da espécie

também em outras áreas, o alto índice de poliandria observado nas fêmeas da RDS – PP,

também pode ser a conseqüência de uma mudança no comportamento feminino, devido à

sobre-exploração que a espécie vem sofrendo.

Gosselin et al. (2005) demonstraram a mudança de comportamento no sistema de

acasalamento na lagosta americana (Homarus americanus) em decorrência da exploração

humana. Os autores observaram que as fêmeas amostradas em locais explorados são

principalmente poliândricas. Essa mudança decorre do fato de que machos maiores são o

principal alvo da caça predatória. Nesse caso as fêmeas buscam acasalar com outros machos

para garantir que todos os seus ovúlos sejam fertilizados.

Chevolot et al. (2007) demonstraram que as fêmeas da raia Raja clavata uma das

espécies mais pescadas comercialmente no Atlântico e no Mediterrâneo são poliândricas. Os

autores não descartam a possibilidade de que a poliandria na espécie seja uma resposta

compensatória ao enfrentamento análogo ao efeito Allee, uma situação em que a escassez dos

machos leva a uma diminuição da aptidão média da população.

A cópula com diferentes machos pode ser vantajosa para a fêmea por trazer benefícios

diretos, como o aumento da fertilização dos seus óvulos por machos com qualidade genética

57

superior ou indiretos proporcionando um maior potencial para a sua prole (Klemmer et al.,

2008), através de mecanismos pré - copulatórios ou pós - copulatórios. No mecanismo pré -

copulatório a fêmea pode copular com o primeiro macho disponível, o que asseguraria a

fecundação de seus óvulos e posteriormente copular com outro macho que apresente uma

melhor qualidade genética, averiguado através das características sexuais secundárias,

proporcionando a maximização da qualidade genética de seus descendentes (Pircher et al;

2003; Lee e Hays; 2004). No mecanismo pós - copulatório, haverá uma competição dos

espermatozóides no interior do trato reprodutivo da fêmea (Klemmer et al., 2008). Essa

competição funcionará como um mecanismo de reforço para o sucesso reprodutivo, pois

haverá a seleção dos espermatozóides com elevada qualidade genética o que culminará com a

seleção dos melhores e, portanto com o aumento da aptidão dos filhotes devido a herança dos

"bons genes" (Klemmer et al., 2008). A competição de espermatozóides também pode reduzir

a probabilidade de fecundação por espermatozóides geneticamente incompatíveis (Zeh e Zeh,

97), evitar a depressão endogâmica que pode surgir a partir do acasalamento com machos

aparentados, assegurar a fertilização através da presença de um número suficiente de

espermatozóides, caso a fêmea copule com um macho estéril ou que transfira um número

insuficiente de espermatozóides (Avise et al., 2002).

Embora Karl (2008) não discorde dos benefícios advindos da cópula com mais de um

macho, ele argumenta que a paternidade múltipla não aumenta o tamanho efetivo

populacional como relatado em vários trabalhos (Murray, 64; Moran e Garcia-Vazquez, 98).

Segundo o autor, na maioria dos casos, a paternidade múltipla diminuirá o tamanho efetivo

populacional por causa do aumento da variância global no sucesso reprodutivo masculino.

Apenas quando a contribuição dos machos para a prole for igualada, o tamanho efetivo será

inalterado. O autor enfatiza que há necessidade de um teste empírico em todos os estudos que

argumentam que a paternidade múltipla esteja aumentando o tamanho efetivo populacional.

Para ele, apenas Sugg e Chesser (94), fizeram um tratamento teórico que especificasse os

efeitos da paternidade multipla sobre o tamanho efetivo populacional, demonstrando que

poderia haver um aumento do tamanho efetivo com a paternidade múltipla.

Como a exploração ou caça ilegal reduz substancialmente a variabilidade genética de

uma população, limitando a expansão futura, a alta freqüência de paternidade múltipla

detectada em C. crocodilus na RDS – PP pode ser um fator importante, pois pode estar

assegurando a qualidade genética dos descendentes. Porém, sugere-se a avaliação futura dos

níveis de variabilidade genética da espécie na RDS - PP, pois as informações geradas poderão

58

fornecer um indicador do número de indivíduos que contribuem com genes para a próxima

geração e, portanto, é uma valiosa estimativa do tamanho efetivo populacional (Ne). Estas

informações também poderão auxiliar no plano de manejo e conservação da espécie na

reserva.

AGRADECIMENTOS

Este trabalho teve o suporte financeiro do CNPq/PPG7 5570090/2005-9 e CNPq/CT-

Amazônia 575603/2008-9 para I.P.F. Permissão para a coleta das amostras de tecido foi

concedida pelo RAN/IBAMA n º. 18187-1 e SDS/CEUC. Este estudo faz parte da dissertação

de Mestrado de D.P.O em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva do programa de pós-

graduação do INPA/UFAM. D.P.O foi apoiada com uma bolsa do CNPq, e para o trabalho de

campo foi apoiado pelo WCS e Instituto Piagaçu.

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64

Tabela 1. Código dos ninhos e informações dos corpos de água, setores, quantidade de

filhotes genotipados e porcentagens e ano de coleta dos 13 ninhos amostrados em

2007 e 2008 na RDS Piagaçu-Purus.

*Mais do que 30% dos ovos não puderam ser coletados

** Ninhos da mesma fêmea.

Amostras Amostras Ano Código Ninho Corpo de água Setor genotipadas % fêmeas Coleta

IT07CC011 N01 Lago Patinho Itapuru 9 * Sim 2007 CA07CC069 N02 Lago Craveirinha Cauá 21 100 Sim 2007 IT07CC95 N03 Paranã Capitarizinho Itapuru 5 * ** 2007 IT08CC003 N04 Paranã Capitarizinho Itapuru 4 * ** 2008 IT08CC005 N05 Paranã Capitarizinho Itapuru 24 100 Sim 2008 AR08CC003 N06 Lago Miauzinho Jari - Arumã 22 100 Sim 2008 IT08CC032 N07 Paranã Tapagem Itapuru 11 100 Sim 2008 CA08CC009 N08 Lago Viola Cauá 11 50 Sim 2008 CA08CC027 N09 Lago Bololão Cauá 13 50 Sim 2008 CA08CC039 N11 Paranã do Carro Cauá 18 50 Sim 2008 CA08CC002 N12 Lago Bijogó Cauá 25 100 Sim 2008 CA08CC003 N13 Lago Bijogó Cauá 28 100 Sim 2008 IT07CC94 N14 Paranã Capitarizinho Itapuru 7 * Não 2007

65

Tabela 2. Amostras dos machos de jacaré-tinga coletados em corpos de água nas

proximidades dos ninhos amostrados na RDS – Piagaçu – Purus.

Machos Corpo de água Setor Cc_D1S2S7 Lago Cunhã Atravessado Paricatuba Cc_D1S2S11 Lago Cunhã Atravessado Paricatuba Cc_D1S2S9 Lago Cunhã Atravessado Paricatuba

Cc_E1S3 Lago Esfolinha Itapuru Cc_E1S5 Lago Esfolinha Itapuru Cc_E1S7 Lago Esfolinha Itapuru Cc_E1S8 Lago Esfolinha Itapuru Cc_E1S4 Lago Esfolinha Itapuru Cc_E1S6 Lago Esfolinha Itapuru Cc_E1S2 Lago Esfolinha Itapuru

Cc_D1S10 Lago. C. Peua Grande Caua-Cuiuanã Cc_D2S3 Lago. C. Peua Grande Caua-Cuiuanã Cc_D1S5 Lago. C. Peua Grande Caua-Cuiuanã Cc_D3S5 Lago. C. Peua Grande Caua-Cuiuanã Cc_D1S3 Lago Bololão Caua-Cuiuanã

Cc_D1S2S6 Lago Araçatuba Paricatuba Cc_D1S2S5 Lago Araçatuba Paricatuba Cc_D1S3S9 Paranã Paricatuba Paricatuba Cc_D1S3S8 Paranã Paricatuba Paricatuba

Baja22 Lago Bijogó Caua-Cuiuanã Baja26 Lago Araça da Prainha Caua-Cuiuanã

Tabela 3. Combinações dos seis locos para genotipagem tipo multiplex

Locos combinados Fluorescência Tamanho (pb) C5 + D7 FAM/HEX 261- 323/197 - 225 D9 + E8 HEX/HEX 267 - 337/206 - 242 E6 + H4 HEX/HEX 205 - 317/247 - 390

66

Tabela 4. Número de alelos por loco dentro dos ninhos e em todos os 13 ninhos de Caiman

crocodilus

Locos Ninhos Cc_C5 Cc_D7 Cc_D9 Cc_E6 Cc_E8 Cc_H4

N1 4 3 5 3 3 5 N2 5 5 8 5 3 4 N3 4 4 4 5 3 2 N4 5 4 5 3 2 2 N5 4 4 5 4 2 6 N6 6 3 3 4 4 3 N7 6 4 9 4 4 4 N8 5 3 4 3 3 4 N9 6 4 5 5 4 3 N11 5 4 5 3 3 3 N12 7 6 3 4 5 4 N13 8 3 4 4 5 5 N14 5 5 2 3 3 3

Todos os ninhos 18 12 21 15 13 11

Tabela 5. Potencial dos locos microssatélites para a análise de parentesco em C. crocodilus da

RDS Piagaçu – Purus.

Locos PE 1 PE 2 PE 3 PI C5 0,872 0,772 0,971 0,299 D7 0,813 0,683 0,942 0,351 D9 0,863 0,759 0,967 0,346 E6 0,794 0,657 0,931 0,371 E8 0,813 0,683 0,942 0,364 H4 0,813 0,683 0,942 0,340

PE1 = probabilidade de exclusão por loco quando o genótipo de ambos os parentais são conhecidos. PE2 = probabilidade de exclusão por loco quando não está disponível um ou outro genótipo parental. PE3 = probabilidade de exclusão por loco quando não está disponível nenhum genótipo parental. PI = probabilidade de identidade genética por loco.

67

Tabela 6. Potencial dos locos microssatélites combinados para análise de parentesco em C.

crocodilus da RDS Piagaçu - Purus

Locos combinados PEC 1 PEC 2 PEC 3 PI 1 0,816 0,689 0,945 0,299

1+2 0,936 0,839 0,99 0,105 1+2+3 0,98 0,922 0,998 0,036

1+2+3+4 0,992 0,955 0,999 0,013 1+2+3+4+5 0,997 0,975 0,999 0,004

1+2+3+4+5+6 0,999 0,988 0,999 0,001

Nota: 1= Loco Cc_C05; 2= Cc_D07; 3= Cc_D09; 4= Cc_E06; 5= Cc_E08; 6= Cc_H04 PEC1 = probabilidade de exclusão combinada quando o genótipo de ambos os parentais são conhecidos, PEC2 = probabilidade de exclusão combinada quando não está disponível um ou outro genótipo parental, PEC3 = probabilidade de exclusão combinada quando não está disponível nenhum genótipo parental, PI = probabilidade combinadda de identidade genética

68

Tabela 7. Evidências de paternidade múltipla em 13 ninhos de Caiman crocodilus crocodilus com base em informações de seis locos

microssatélites espécie – específicos

C05 D07 D09 E06 E08 H04

Ninhos N H AP/AE N H AP/AE N H AP/AE N H AP/AE N H AP/AE N H AP/AE

N1 9 0 0/4 9 2 2/3 9 0 0/5 9 6 4/3 9 2 2/3 9 1 2/5 N2 21 1 3/5 21 3 3/5 19 1 3/8 19 5 4/5 21 0 2/3 15 2 3/4 N3 5 0 2/4 5 0 2/4 5 0 2/4 5 3 3/5 5 0 3/3 3 1 3/2 N4 4 1 3/5 4 0 2/4 4 0 2/5 4 0 2/3 4 2 3/2 4 2 3/2 N5 24 7 4/4 24 2 3/4 24 21 3/5 24 13 4/4 24 9 3/2 23 2 3/5 N6 22 8 2/6 22 3 4/3 20 19 4/3 21 9 3/4 20 3 3/4 16 8 4/3 N7 11 0 2/6 11 0 2/4 11 3 4/9 11 3 3/4 11 0 2/4 11 4 3/4 N8 11 2 3/5 11 3 3/3 11 1 2/4 11 4 3/3 11 4 3/3 11 1 3/4 N9 13 1 3/6 13 0 2/4 13 6 3/5 13 0 2/5 13 0 2/4 13 5 4/3 N11 18 2 3/5 18 0 2/4 18 0 2/5 18 7 3/3 18 8 4/3 17 11 3/3 N12 25 2 3/7 25 4 3/6 24 3 3/3 25 7 3/4 25 0 2/5 24 4 3/4 N13 28 8 3/8 28 7 4/3 25 4 3/4 28 1 3/4 28 4 3/5 28 0 3/5 N14 7 0 0/6 7 0 0/5 7 7 4/2 7 3 4/3 7 0 0/3 7 3 2/3

Nota: N = número de indivíduos genotipados por cada loco/ninho; H = filhotes homozigotos presentes em cada loco/ninho; AP/AE = alelos

parentais inferidos/número de alelos encontrados para cada loco/ninho. Os resultados em negrito indicam a presença de paternidade múltipla.

69

Tabela 8. Genótipos dos parentais reconstruídos com o auxílio do programa Gerud 2.0 e

estimativa da contribuição relativa de cada um dos pais nos 13 ninhos de C. c. crocodilus

Locos Ninhos Família Cc_C05 Cc_D7 Cc_D9 Cc_E6 Cc_E8 Cc_H4 % da contribuição dos pais

N1 Mãe 303/305 213/217 303/315 299/303 219/231 365/375 Pai 1 301/301 213/201 305/311 299/303 219/219 375/377 25% Pai 2 301/303 213/201 307/311 299/299 209/209 369/369 25% Pai 3 307/303 213/201 305/311 303/301 209/219 369/367 50%

N2 Mãe 291/297 199/201 291/305 299/309 219/225 365/369 Pai 1 305/299 201/205 279/307 299/299 213/213 369/369 27,27% Pai 2 305/299 201/205 279/311 299/315 213/213 373/363 45,45% Pai 3 309/299 199/199 307/311 317/279 213/213 369/369 18,18% Pai 4 299/299 201/201 277/277 317/317 213/213 373/373 9,09%

N3 Mãe 303/307 203/213 271/275 299/299 213/213 369/369 Pai 1 295/295 221/199 277/277 319/299 233/231 363/363 66.66 % Pai 2 305/305 199/199 271/271 299/299 213/213 369/369 33,33%

N4 Mãe 303/307 203/213 271/275 299/299 213/213 369/369 Pai 1 307/279 199/199 305/307 309/309 213/213 369/369 50% Pai 2 279/309 199/215 311/311 309/305 219/219 361/361 50%

N5 Mãe 303/307 201/221 275/275 303/307 223/223 367/371 Pai 1 303/301 205/205 275/275 307/307 223/223 367/377 25% Pai 2 307/305 199/205 275/329 303/307 223/213 367/369 75%

N6 Mãe 301/303 201/205 277/275 305/307 213/213 363/369 Pai 1 299/307 201/201 275/275 299/305 233/233 369/361 27,27% Pai 2 299/301 201/201 277/277 299/299 235/215 363/369 27,27% Pai 3 305/307 201/201 277/277 299/299 213/215 369/369 18,18% Pai 4 261/303 205/205 277/277 305/297 233/215 369/369 27,27%

N7 Mãe 301/301 207/213 299/313 307/317 209/213 363/369 Pai 1 303/305 199/199 271/271 299/299 215/215 361/369 25% Pai 2 303/313 197/199 271/277 307/299 231/231 365/365 50% Pai 3 313/307 199/199 279/309 307/299 231/231 365/363 25%

N8 Mãe 293/293 199/213 275/271 303/303 219/231 365/367 Pai 1 305/293 199/203 297/275 299/303 231/213 361/367 50% Pai 2 307/301 199/203 297/275 299/303 231/213 367/375 50%

N9 Mãe 299/317 205/205 277/279 309/311 223/229 363/367 Pai 1 305/305 213/199 277/277 299/303 227/213 367/367 33,33% Pai 2 305/301 213/199 307/311 299/303 227/213 363/369 66,66%

N11 Mãe 295/305 203/205 279/299 303/303 223/225 367/369 Pai 1 303/287 199/209 275/287 299/303 213/223 367/361 70% Pai 2 303/287 199/209 287/277 299/283 223/225 367/367 30%

70

Cont. Tabela 8. Genótipos dos parentais reconstruídos com o auxílio do programa Gerud 2.0

e estimativa da contribuição relativa de cada um dos pais nos 13 ninhos de Caiman crocodilus

Locos Ninhos Família Cc_C05 Cc_D7 Cc_D9 Cc_E6 Cc_E8 Cc_H4 % da contribuição dos pais

N12 Mãe 303/307 199/205 277/305 299/305 209/221 369/371 Pai 1 309/301 199/199 301/301 299/301 231/223 367/371 36,36% Pai 2 305/303 205/197 279/277 305/301 231/223 367/371 45,45% Pai 3 305/311 199/197 301/275 301/301 231/231 367/367 18,18%

N13 Mãe 303/321 201/203 275/299 299/299 213/225 369/369 Pai 1 315/305 201/205 307/307 305/279 213/213 361/361 27,27% Pai 2 305/307 203/203 307/309 305/307 219/227 361/365 27,27% Pai 3 311/319 203/203 275/305 305/305 219/219 365/365 18,18% Pai 4 301/303 201/205 307/309 307/307 213/219 361/365 27,27%

N14 Mãe 303/307 199/213 277/279 303/309 215/223 367/371 Pai 1 313/309 221/215 277/277 311/303 231/231 371/369 42,85% Pai 2 303/303 203/203 279/279 303/303 223/223 369/369 14,28% Pai 3 311/311 215/213 277/277 311/309 231/231 371/369 42,85%

71

2. CONCLUSÃO GERAL

Os 12 locos isolados e caracterizados para C. c. crocodilus:

• São polimórficos

• Apresentam alto poder de exclusão de paternidade

• Baixa probabilidade de identidade genética

• São ideais para estudos de paternidade

• Poderão ser utilizados em estudos populacionais com outras espécies e subespécies

relacionadas

Sistema de acasalamento:

• Primeira evidência do sistema de acasalamento de C.c. crocodilus

• Fêmeas de C. c. crocodilus são poliândricas

• Foi encontrada uma alta freqüência de paternidade múltipla (100% dos ninhos)

• Não houve evidência de fidelidade a um único macho

• Foi relatado caso de fidelidade ao sítio de desova em duas temporadas reprodutivas

• Houve contribuição diferencial dos machos na fertilização

• Não há machos dominantes

• Dados importantes para a conservação e manejo da espécie na RDS Piagaçu – Purus

72

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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