UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA

PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR

ANÁLISE DAS MUDANÇAS NO PERFIL PROTÉICO DURANTE O ESTRESSE OXIDATIVO IN VIVO E ATUAÇÃO

DA MUTY-GLICOSILASE EM RESPOSTAS CELULARES

ANA HELENA SALES DE OLIVEIRA

NATAL-RN 2009

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA

PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR

ANÁLISE DAS MUDANÇAS NO PERFIL PROTÉICO DURANTE O ESTRESSE OXIDATIVO IN VIVO E ATUAÇÃO DA MUTY-

GLICOSILASE EM RESPOSTAS CELULARES

ANA HELENA SALES DE OLIVEIRA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Genética e Biologia Molecular.

Orientadora: Profª. Drª. Lucymara Fassarella Agnez-Lima

Co-Orientadora: Profª. Drª. Adriana Ferreira Uchôa

NATAL-RN 2009

Divisão de Serviços Técnicos

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede Oliveira, Ana Helena Sales de. Análise das mudanças no perfil protéico durante o estresse oxidativo in vivo e atuação da MutY-Glicosilase em respostas celulares / Ana Helena Sales de Oliveira. – Natal, RN, 2009. 71 f : il. Orientadora: Lucymara Fassarella Agnez-Lima. Co-orientadora: Adriana Ferreira Uchoa. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Departamento de Biologia Celular e Genética. Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular.

1 Mutagênese – Dissertação. 2. Reparo de DNA – Dissertação. 3. Estresse oxidativo – Dissertação. 4. Proteoma – Dissertação. 5. MutY-Glicosilase – Dissertação. 6. Oxigênio singlete – Dissertação. I. Agnez-Lima, Lucymara Fassarella. II. Uchôa, Adriana Ferreira. III Título.

RN/UF/BCZM CDU 575.224.4(043.3)

iii

AGRADECIMENTOS

Meus sinceros agradecimentos...

À minha orientadora Lucymara Fassarela, minha grande referência profissional, pelo apoio e estímulo durante o desenvolvimento deste projeto.

Às amigas do “estresse oxidativo”, Iza, Lelinha e Ju, pela dedicação, companheirismo,

parceria constante na execução do nosso projeto e principalmente, pela amizade sincera.

Aos meus pais pelo dom da vida, por acreditarem sempre em mim e por compreender a minha ausência em diversos momentos familiares.

Ao meu irmão por todo o amor, carinho e compreensão, mesmo me desconcentrando e tirando minha atenção em diversos momentos da minha pesquisa, meu amor é grande.

À Rafa pelo carinho, pelos bons momentos de alegria, pela força nos dias difíceis, por acreditar em mim e por estar sempre ao meu lado.

À professora Adriana Uchôa, pela orientação e por me inserir no mundo da proteômica, seus ensinamentos levarei por toda vida, muito obrigada pela atenção e amizade.

À professora Silvia Regina e Keronnin Bessa, pelos conselhos e correções durante a execução desta dissertação.

À Ralfinho, pela companhia nas conversas, momentos de lazer e váaaarias festinhas para aliviar a tensão do mestrado!

À “próxima” (Cristina), amiga presente em todas as horas, sempre me divertindo e animando

em todos os momentos.

À Fabão por me auxiliar em diversas ocasiões deste trabalho, pela ajuda constante, amizade e momentos de descontração, o laboratório ganhou muito com o retorno dele, tanto pelo grande conhecimento e disponibilidade em ajudar, quanto pela alegria. Aos colegas, Jule, Leonam e Thayse, do Laboratório de Biologia Molecular e Genômica, pela amizade, incentivo, apoio técnico e cientifico. À todos os amigos que conquistei na turma do mestrado, Andrea, Angel, Amanda, Denise, Ivan, Jair, Luciana, Milena e Ritinha, todos sempre muitos dedicados e dispostos a compartilhar conhecimento, nas dezenas de noites em claro em que estudamos juntos.

À minha “nova irmã” Carol, pela amizade e companheirismo durante todo o mestrado e na

vida pessoal, laço conquistado que continuará por toda vida.

À Gisélia, pelo trabalho dedicado com o laboratório e por estar sempre disponível em fornecer todo material necessário para a realização deste projeto.

À CAPES pela concessão da bolsa e ao CNPq pelo apoio financeiro. Aos professores, colegas e amigos que, de alguma maneira contribuíram para a realização deste trabalho.

Ana Helena Sales

iv

RESUMO

Espécies reativas de oxigênio (EROs) são produtos do metabolismo celular capazes de

reagir com biomoléculas, como proteínas, lipídeos e ácido nucléico. Essas reações podem

causar modificações deletérias para a célula. Fotossensibilizadores como o azul de metileno

(MB), são capazes de produzir EROs, como o oxigênio singlete (1O2), uma das formas mais

reativas do oxigênio molecular. O 1O2 é capaz de oxidar guaninas, gerando lesões no DNA,

como 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG), o mais frequente produto da oxidação, que durante

a replicação pode emparelhar com adenina levando à mutações. Foi de interesse desse estudo,

caracterizar a citotoxicidade, o potencial mutagênico e o padrão de expressão protéica,

durante o estresse oxidativo induzido pelo MB, usando como modelo cepas de Escherichia

coli proficiente em reparo e deficientes em MutY-Glicosilase, uma enzima de reparo

envolvida na correção de pares 8-oxoG:Adenina. Essas cepas foram tratadas com MB em

presença ou ausência de luz. O crescimento, sobrevivência, a taxa de mutagênese e padrão de

síntese protéica, foram analisados. O tratamento afetou o crescimento bacteriano, induzindo

morte celular, mutagênese, e mudanças no padrão de síntese protéica em ambas as cepas.

Entretanto a cepa deficiente em MutY mostrou uma maior sensibilidade em relação a cepa

proficiente. Adicionalmente, a cepa deficiente em MutY apresentou um padrão de expressão

protéica diferenciado quando comparado com a cepa proficiente. Esses resultados sugerem o

envolvimento da MutY na correção de lesões de DNA não caracterizadas e que a ausência de

MutY induz alterações no padrão de expressão protéica.

Apoio financeiro: CNPq e CAPES.

Palavras chaves: MutY-glicosilase, oxigênio singlete, espécies reativas de oxigênio, danos

oxidativos e reparo de DNA, proteoma.

v

ABSTRACT

Reactive oxygen species (ROS) are cellular metabolism by-products that are able to

react with biomolecules, such as proteins, lipids and nucleic acids. These reactions can cause

deleterious modifications to cell. Photosensitizers like methylene blue (MB) may produce

ROS, such as singlet oxygen (1O2), one of the most reactive forms of molecular oxygen. The 1O2 carries out the oxidation of guanines, inducing DNA damage, such as 7,8-dihydro-8-

oxoguanine (8-oxoG), the most frequent oxidation product, that during replication may

misspair with adenine leading to mutations. The aim of this study was to characterize the

citotoxicity, the mutagenic potential and the pattern of proteins expression during oxidative

stress induced by MB, using as model Escherichia coli proficient strains and deficient in

MutY-glycosylases, a DNA repair enzyme involved in the correction of 8-oxoG:Adenine

misspair. These strains were treated with MB plus light or kept in the dark. The growth,

survival, mutagenesis rate and protein synthesis patterns were analyzed. The treatment

affected bacterial growth, inducing cell death, mutagenesis, and changes in the protein

synthesis patterns in both E. coli strains. However, the MutY deficient strain showed a higher

sensibility than the proficient one. Additionaly, the MutY deficient strain showed different

expressed protein patterns when compared with proficient strain. Taken all together, theses

results suggest the involvement of MutY in the correction of uncharacterized lesions and that

its absence induces changes in the pattern of protein expression.

Supported by: CNPq and CAPES.

Key words: MutY-glycosylase, singlet oxygen, reactive oxygen species, oxidative damage,

DNA repair, proteomic.

vi

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

BER – Reparo por excisão de bases

°C – Graus Celsius

dA – 2’-desoxiadenosina

dC – 2’-desoxicitidina

dG – 2’-desoxiguanosina

dT – 2’-desoxitimidina

D.O – Densidade óptica

DNA – Ácido desoxirribonucléico

dNTP – Desoxirribonuclotídeo

E. coli – Escherichia coli

EDTA – Ácido Etilenodiaminotetracetico

EROs – Espécies reativas de oxigênio

Fpg (MutM) – Formamidopirimidina DNA glicosilase

kDa – kilodaltons

LB – Luria Bertani

MB – Azul de metileno

MB-Luz – Azul de metileno fotossensibilizado

MB-Escuro – Azul de metileno não exposto à fotossensibilização

Mbp – Mega pares de bases

mg – Miligramas

mL – Mililitros

mM – Milimolar

MutY – Glicosilase de E.coli

NER – Reparo por excisão de nucleotídeos

ORFs – “Open reading frame” Sequencia que pode potencialmente codificar uma proteína

pb – Pares de bases

PDT – Terapia Fotodinâmica

pH – Potencial hidrogeniônico

PCR – Reação da polimerase em cadeia

RNA – Ácido ribonucléico

RNO – N,N-Dimethyl-4-nitrosoaniline

vii

Rif – Rifampicina

Rifr – Resistência à rifampicina

rpm – Rotações por minuto

rpoB – Gene que codifica a b-subunidade da RNA polimerase

SDS – Dodecil sulfato de sódio

SDS-PAGE – Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio

Sítios AP – Sítios apurínicos/apimimidícos, sítios abásicos

µg – Micrograma

µL – Microlitro

µM – micromolar

UV – Ultravioleta

U. F. C. – Unidades formadoras de colônias

Taq – Thermus aquaticus

W – Watts

8-oxoG – 8-oxo-7-hidrodeoxiguanosina

viii

FÓRMULAS QUÍMICAS

O2●- – Radical superóxido

O3 – Ozônio

OH●– Radical hidroxila

1O2 – Oxigênio Singlete

H2O2 – Peróxido de hidrogênio

ix

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 – Distribuição eletrônica nos orbitais moleculares (π*) do O2 02

Tabela 02 – Nomes para os produtos da oxidação de dG 06

Tabela 03 – Genótipo das cepas de Escherichia coli 21

Tabela 04 – Iniciadores utilizados na PCR de colônia e sequenciamento 31

Tabela 05 – Frequência de mutação induzida no gene rpoB 37

Tabela 06 – Possíveis proteínas diferencialmente expressas entre AB1157 e BH980 40

Tabela 07 – Supostas proteínas diferencialmente expressas na Cepa AB1157 44

Tabela 08 – Supostas proteínas diferencialmente expressas na Cepa BH980 45

Tabela 09 – Supostas proteínas com mudanças de expressão observadas em 2D 46

x

LISTA DE FIGURAS

Figura 01 – Fontes e alvos do 1O2 03

Figura 02 – Estrutura química do MB 04

Figura 03 – Mecanismo de fotoativação do MB 05

Figura 04 – A estrutura do par de bases normais G:C, T:A, 8-oxoG:C e 8-oxoG:A 07

Figura 05 – Estrutura de 8-oxodG e produtos da hiperoxidação da guanina 08

Figura 06 – A via BER e seus quatro passos para o reparo de bases oxidadas 11

Figura 07 – Atuação de MutM e MutY no sistema GO 12

Figura 08 – MutT e MTH1 na hidrólise da 8-oxo-dGTP 13

Figura 09 – Esquema das metodologias empregadas no projeto 23

Figura 10 – Ilustração do Tratamento II 25

Figura 11 – Esquemática do tratamento, seleção de mutantes e gel do PCR de colônia 30

Figura 12 – Absorbância do RNO 33

Figura 13 – Crescimento das cepas AB1157 e BH980 expostas ao MB-Escuro e MB-Luz 35

Figura 14 – Taxa de sobrevivência das cepas AB1157 e BH980 36

Figura 15 – Comparação do perfil protéico unidimensional das cepas AB1157 e BH980 coradas com prata

38

Figura 16 – Comparação do perfil protéico unidimensional das cepas AB1157 e BH980 coradas com coomassie blue

39

Figura 17 – Perfil bidimensional da cepa AB1157 exposta ao tratamento com MB 42

Figura 18 – Perfil bidimensional da cepa BH980 exposta ao tratamento com MB 43

xi

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS ii

RESUMO iii

ABSTRACT iv

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS v

FÓRMULAS QUÍMICAS vi

LISTA DE TABELA viii

LISTA DE FIGURAS ix

1. INTRODUÇÃO 01

1.1 – Oxigênio singlete (1O2) 02

1.2 – Azul de metileno (MB) 04

1.3 – Danos produzidos por 1O2 06

1.4 – Oxidação da guanina 07

1.5 – Vias de reparo do DNA 10

1.6 – MutY-Glicosilase 14

1.7 – Padrão de expressão protéica 15

2. OBJETIVOS 17

A. Objetivo Geral 17

B. Objetivos específicos 17

3. MATERIAL E MÉTODOS 18

3.1 – Cepas Bacterianas 18

3.2 – Azul de Metileno 19

3.3 – Detecção da produção de 1O2 19

3.4 – Tratamento in vivo com MB 21

3.5 – Análise do crescimento bacteriano durante o crescimento 22

3.6 – Extração de proteínas solúveis totais 22

3.7 – Quantificação de proteínas (Bradford) 23

3.8 – Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 23

3.9 – Eletroforese de segunda dimensão (2D) 24

3.10 – Análise dos géis 25

xii

3.11 – Ensaio de citotoxicidade 26

3.12 – Análise da mutagênese induzida e seleção de colônias mutantes 27

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 28

5. CONCLUSÕES 58

6. PERSPECTIVAS 59

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 60

Introdução 1

1. INTRODUÇÃO

O metabolismo celular normal dos organismos, constitui uma fonte endógena de

espécies reativas de oxigênio (EROs) que, em certas condições, podem escapar do

mecanismo de defesa e ser prejudiciais ao funcionamento celular. As EROs são agentes

lesivos responsáveis pelo estresse oxidativo, capazes de danificar diversas

biomoléculas, tais como, lipídios, proteínas e DNA, apresentando efeitos tóxicos e

inibindo funções normais (Valko et al., 2007). As EROs são produzidas continuamente

em processos redoxes que ocorrem durante o metabolismo de organismos aeróbicos,

cujos efeitos tóxicos são combatidos por um elaborado sistema antioxidante endógeno.

Embora as células possuam mecanismos de defesa, o aumento abrupto de EROs causa

estresse oxidativo, proporcionando a produção de lesões mutagênicas no DNA (Barnes

et al., 2004), que podem se acumular quando um sistema de reparo não estiver atuando

eficientemente. O acúmulo das lesões oxidativas no DNA genômico é associado com

apoptose, mutagênese, morte celular, envelhecimento, carcinogênese e doenças

neurodegenerativas (Finkel et al., 2000; Mandavilli et al., 2002; Olinski et al., 2002;

Cooke et al., 2003; Hussain et al., 2003; Sastre et al., 2003; Klaunig et al., 2004)

A produção basal de EROs nas células é justificada pela presença de fontes

endógenas no ambiente celular que produzem a maioria dos oxidantes. As EROs são

resultantes principalmente da respiração aeróbica normal, onde os organismos utilizam

o oxigênio molecular como uma ferramenta eficiente para a obtenção de energia,

embora que, os produtos intermediários formados possam interagir com biomoléculas e

ocasionar danos à célula (Ames et al., 1993). Entre os subprodutos intermediários do

metabolismo celular formados no processo respiratório encontram-se principalmente as

EROs, que também podem ser geradas em outros diferentes processos biológicos

celulares, como a resposta inflamatória contra a invasão de microorganismos estranhos

ao hospedeiro, na qual as células destroem bactérias e vírus através da lise oxidativa

(Badwey et al., 1980; Karnovsky et al., 1983; Sigler et al., 1999; Cooke et al., 2003);

durante o metabolismo celular normal de certas atividades enzimáticas (Cooke et al.,

2003); na degradação de ácidos graxos por peroxissomos (Ames et al., 1993); em

reações fotoquímicas realizadas por células vegetais (Inze et al., 1995), após exposição

a determinados agentes exógenos, tais como: rosa bengala, azul de metileno entre outros

Introdução 2

(Fischer et al., 2005; Defedericis et al., 2006) e em mecanismos citoplasmáticos ainda

não tão bem definidos (Messner et al., 2002; Seaver et al., 2004).

Em particular, os microrganismo são frequentemente expostos à agentes

nocivos, como as EROs, que podem danificar seus componentes celulares (Glaeser, et

al., 2006).

1.1 - OXIGÊNIO SINGLETE (1O2)

Dentre todas as EROs conhecidas, uma das mais importantes é o oxigênio

singlete (1O2). O oxigênio molecular, no estado fundamental, possui dois elétrons com

spins paralelos ocupando dois orbitais π de mesma energia, chamados de degenerados,

caracterizando, portanto, o estado triplete (3∑g

-). A forma mais reativa do oxigênio é

conhecida como oxigênio singlete (1O2), a qual é muito mais oxidante do que o oxigênio

molecular no seu estado fundamental. Ele pode ser gerado por um acréscimo de energia,

o que resulta na inversão de um dos spins dos orbitais π* e a passagem para o estado

singlete, o qual é altamente reativo e pode apresentar-se sob duas formas: o primeiro

estado excitado (1∆g), tem dois elétrons com spins opostos no mesmo orbital, possui

uma energia de 22,5 kcal acima do estado fundamental e tempo de meia vida em

solvente aquoso de aproximadamente 10-6 segundos; o segundo estado excitado (1∑g

+),

tem um elétron em cada orbital π degenerado, com spins opostos, e possui uma energia

de 37,5 kcal acima do estado fundamental, mas o tempo de vida é bastante curto em

meio aquoso, apenas 10-11 segundos, sendo rapidamente desativado para o estado 1∆g

(Ronsein et al., 2006). Portanto, apenas o primeiro estado apresenta interesse em

sistemas biológicos, por ser altamente reativo em sistemas celulares (Agnez-Lima, et

al., 2001). A Tabela 01 descreve as características do 1O2 no estado fundamental triplete

e nos dois estados excitado singlete.

Tabela 01 - Distribuição eletrônica dos orbitais moleculares (π*) do O2

Estado Orbital π* Energia (Kcal/mol) Tempo de Vida (s)

Fundamental Triplete 3∑g

- [↑ ] [↑ ]

Excitado Singlete 1∆g [↑↓] [ ] 22,5 10-6

1∑g

+ [↑ ] [↓ ] 37,5 10-11

Adaptado de Ronsein, et al. (2006).

Introdução 3

O 1O2 possui grande importância em sistemas biológicos, pois está relacionado

diretamente com sinalização celular (Klotz et al., 2003; Kochevar, 2004) e também está

envolvido nos mecanismos de defesa celular, através de sua produção por macrófagos e

leucócitos (Badwey et al., 1980; Karnovsky et al., 1983). No entanto, o 1O2 é um agente

altamente reativo e pode causar grandes prejuízos se produzido em excesso, pois é

capaz de atravessar a membrana celular (Valenzeno, 1987) e de induzir lesões no

genoma como, oxidação de bases, formação de sítios AP, quebras na simples fita e

dupla fita de DNA (Barnes et al., 2004), também pode provocar danos a muitas

biomoléculas incluindo lipídeos e as proteínas celulares (Halliwell, 1996) (Figura 01).

Figura 01 – Principais alvos e fontes do 1O2. Adaptado de Ronsein, et al. (2006).

Muitos processos deletérios como a peroxidação lipídica, danos nas membranas

e morte celular podem ser induzidos pelo 1O2 (Halliwell et al., 1984). As proteínas em

particular, são alvos interessantes da ação do 1O2 por serem muito abundantes no

sistema celular, além disso, alguns resíduos de aminoácidos como cisteína, histidina,

metionina, tirosina e triptofano, reagem rapidamente com o 1O2 em valores de pH

fisiológico, resultando na geração de intermediários muito tóxicos, como proteínas

peroxidadas, sulfóxidos e resíduos de ácido cistéico (Davies, 2003).

Introdução 4

1.2 - AZUL DE METILENO (MB)

Diferentes fontes do tipo química, física e biológica, podem gerar o 1O2, como

exemplificado na Figura 01. As fontes químicas vêm sendo amplamente usadas em

ensaios in vivo e in vitro, e uma extensa variedade de componentes incluindo corantes,

drogas e anticorpos atuam como fotossensibilizadores ao serem excitados pela luz

visível. Como por exemplo, o azul de metileno (MB – methylene blue), um corante

comumente classificado na classe das tiazinas (Floyd et al., 2003), é um

fotossensibilizador conhecido por produzir variados danos celulares, os quais podem ser

letais ou mutagênicos em bactérias (Gutter et al., 1977; Epe et al., 1989; Menezes et al.,

1990) e em células de mamíferos (Deoliveira et al., 1992). O MB é um agente

fotossensível usado extensivamente na inativação fotodinâmica de diversos vírus de

RNA, como o HIV, hepatite B, hepatite C e alguns vírus de plasma (Van Den Besselaar

et al., 2000; Floyd et al., 2003). Na terapia fotodinâmica, o emprego do MB é bastante

utilizado contra células tumorais (Orth et al., 2000; Chen et al., 2008) e em doenças na

epiderme (Kalka et al., 2000). A estrutura química do MB é apresentada na Figura 02.

Figura 02 – Estrutura química do MB, um dos principais corantes da classe da

tiazinas. Adaptado de Floyde, et al. (2003).

A fotoativação do MB tem sido estudada em sistemas químicos (Foote, 1976),

onde os princípios desse mecanismo são bases importantes para o entendimento da ação

do MB nos sistemas biológicos. A Figura 03 ilustra os mecanismos de fotoativação do

MB em sistemas aquosos que se inicia na presença da luz, a qual excita o MB no estado

fundamental, para um estado ativado singlete (1MB), este tem a mesma probabilidade de

voltar ao estado fundamental ou ser excitado para o estado ativado triplete (3MB). O

MB quando irradiado pela luz na presença do oxigênio, é capaz de gerar o 1O2 e o

superóxido (●O2) pelo mecanismo de fotoativação do tipo II. O 1O2 é o produto

essencialmente formado, pois o MB reage mais rápido com o oxigênio originando essa

espécie reativa. A taxa de formação do ●O2 é mais lenta e muito inferior, enquanto, o

decaimento do MB excitado no estado singlete (3MB) para a sua forma normal é um

Introdução 5

fenômeno insignificante. Alternativamente o MB, na ausência de oxigênio, pode reagir

diretamente com o substrato, no mecanismo de fotoativação do Tipo I, onde o processo

se dá através da transferência de um átomo de hidrogênio ou de um elétron, que pode

ocorrer com o solvente ou soluto (Figura 03). O MB quando ativado é um dos corantes

mais eficientes na geração de 1O2, além disso, é capaz de se ligar diretamente à

molécula de DNA (Rohs et al., 2000).

Figura 03 – Mecanismo de fotoativação do MB. A luz excita o estado fundamental

do MB para um estado ativado (1MB), o qual tem igual probabilidade de voltar ao estado fundamental ou ir para o estado ativado triplete (3MB). O 3MB pode decair vagarosamente de volta ao 1MB ou reagir no processo do Tipo I ou Tipo II. Adaptado de Floyd, et al. (2003).

O MB é um composto que possui a capacidade de atravessar a membrana

plasmática das células, é catiônico e por esta razão se liga fortemente ao DNA,

especialmente em regiões ricas no par de bases G-C (Kelly et al., 1987). O MB se liga

de modo intercalado na dupla hélice da molécula de DNA (Rohs et al., 2000) e ao RNA

dupla fita (Liu et al., 2000). Estudos anteriores mostraram que a capacidade de

intercalação do MB à dupla fita de RNA e à molécula de DNA, é responsável por

mediar ligações crosslinks de proteínas em ambas as moléculas (Lalwani et al., 1990;

Liu et al., 1996). O processo fotoquímico básico do MB tem sido bastante estudado

quando ele está presente no DNA, bem como em oligonucleotídeos ricos em G-C e A-T

(Kelly et al., 1987). Já se sabe há muito tempo, que o MB, na presença de luz, é

responsável por mediar quebras nas fitas do ácido nucléico (Cadet et al., 1986; Ohuigin

et al., 1987; Muller et al., 1990), gerar crosslinks, e também é responsável por gerar o 1O2 como principal intermediário (Tabatabaie et al., 1994), que atua preferencialmente

sobre a molécula de DNA (Hailer et al., 2005).

Introdução 6

1.3 - DANOS PRODUZIDOS POR 1O2

O oxigênio singlete (1O2) é capaz de atacar a molécula de DNA, reagindo

preferencialmente com a guanina (Cadet et al., 1978), decorrendo em variados produtos

resultantes da oxidação. No entanto, todas as bases do DNA são susceptíveis a

oxidação mediada pelo 1O2, mas devido ao baixo potencial redox da guanina (E0 = 1.3

V), esta base particularmente, é a mais susceptível a oxidação em relação à dA (E0 = 1.4

V), dC (E0 =1.6 V) e dT (E0 = 1.7 V) (Steenken et al., 1997); isto explica o grande

número de lesões que podem ser originadas a partir da oxidação da guanina, as quais

estão descritas na Tabela 02 adaptada de Neeley, et al. (2006) (Neeley et al., 2006).

Tabela 02. Produtos da oxidação de dG Abreviação Nomes dos produtos

8-oxoG 7,8-dihydro-8-oxoguanine

8-NO2-G 8-nitroguanine

N2-NO2-G N

2-nitroguanine

NI 5-guanidino-4-nitroimidazole; nitroimidazole

NO2-DGh N-NO2-N’-(2,4-dioxo-imidazolidin-5-ylidene)guanidine

DGh Dehydroguanidinohydantoin

Pa parabanic acid

Oa oxaluric acid

Ua Urea

HICA 4-hydroxy-2,5-dioxo-imidazolidine-4-carboxylic acid

Sp1 + Sp2 spiroiminodihydantoin; 2-imino-5,5’-spirodihydantoin

Gh guanidinohydantoin; 5-guanidinohydantoin

Ia Iminoallantoin

CAC 2,4,6-trioxo[1,3,5]triazinane-1-carboxamidine

Ca cyanuric acid

DIz Diiminoimidazolone

Iz imidazolone; 2-aminoimidazolone; 2,5-diaminoimidazolone

Z oxazolone; 2,2,4-triamino-2H-oxazol-5-one

nox-G 4,5-dihydro-5-hydroxy-4-(nitrosooxy)guanine

Adaptado de Neeley, et al. (2006)

Introdução 7

1.4 - OXIDAÇÃO DA GUANINA

O produto da oxidação da guanina mais frequentemente observado é o 8-oxo-7-

hidrodeoxiguanosina (também conhecido como 8-oxoguanina e 8-oxoG) (Ravanat et

al., 2001; Neeley et al., 2006). A lesão 8-oxoG possui uma forma tautomérica

alternativa, a qual é chamada de 8-hidroxiguanina (8-OH-dG). A presença de 8-oxoG

no DNA é frequentemente usada como um marcador celular para indicar a extensão do

estresse oxidativo (Steenken et al., 2000). A 8-oxoG é uma lesão altamente mutagênica,

resultado da modificação do nitrogênio-7 (N7) e do carbono-8 (C8) do anel da guanina

pela ação do 1O2 (Steenken et al., 1997). Devido esta modificação, a 8-oxoG na sua

conformação syn, tem habilidade de mimetizar funcionalmente a base dT formando um

par estável com adenina (8-oxoG(syn):A(anti)) (David et al., 2007) (Figura 04). A 8-

oxoG é considerada uma lesão de baixa letalidade uma vez que não constitui bloqueios

significativos nos ensaios de replicação in vitro (Shibutani et al., 1991). Este fato é

decorrente do seu grande potencial de emparelhamento com citosina e adenina (David et

al., 2007). Recentes ensaios de replicação in vivo também demonstraram que a 8-oxoG

não bloqueia a replicação em procariotos (Neeley et al., 2007), e em células eucarióticas

apresenta uma pequena habilidade em impedir a replicação (Tolentino et al., 2008).

Figura 04 – A estrutura do par de bases normais G:C (A) e T:A (B) são comparadas

com 8-oxoG(anti):C(anti) (C) e 8-oxoG(syn):A(anti) (D), as quais mimetizam o par de base normal. A 8-oxoG difere de dG por mudanças no C8 e N7 pela ação do 1O2, estas mudanças permitem a 8-oxoG parear facilmente com dC ou dA. Adaptado de David, et al. (2007).

Introdução 8

A 8-oxoG em contraste a maioria dos outros tipos de lesões no DNA, possui

uma característica estrutural que permite um eficiente bypass pelas DNA polimerases

replicativas, embora esse mecanismo seja impreciso (Neeley et al., 2007; Tolentino et

al., 2008). Portanto, a 8-oxoG é classificada como um produto pré-mutagênico com alto

grau de estabilidade e considerada um notável dano oxidativo entre mais de 60 tipos de

bases lesionadas identificadas, tornando-se foco de intensos estudos e sendo descrita

como a mais importante, em detrimento de outras lesões (Shibutani et al., 1991).

A 8-oxoG ao ser produzida, possui maior vulnerabilidade e reage mais

facilmente com 1O2 do que a dG não oxidada (Steenken et al., 2000), pois seu potencial

redox é ainda menor do que a dG (E0 = 1.3 V), (Koizume et al., 1996). A 8-oxoG a

partir de um segundo evento sequencial de oxidação pode originar outras lesões

mutagênicas.

Numerosos produtos da oxidação de 8-oxoG tem sido identificados in vitro e são

chamados de “produtos hiperoxidados” pelo fato de serem resultados de dois eventos

sequenciais de oxidação da dG. Estes produtos hiperoxidados incluem:

“Guanidinohidantoína” (Gh), dois diastereoisômeros de “espiroiminodihidantoína” (Sp1

e Sp2), “imidazolona” (Iz), “oxazolona” (Oz), “ácido oxalúrico” (Oa) e “ácido

cianúrico” (Ca) (Figura 05) (Neeley et al., 2006).

Figura 05 – Estrutura de 8-oxoG e algumas lesões decorrentes da hiperoxidação da guanina. Adaptado de Neeley, et al. (2006)

Muitos estudos mostram predominantemente mutações do tipo de G:CT:A e

G:CC:G, após replicação em células de DNA oxidado in vitro (Deoliveira et al., 1992;

Ribeiro et al., 1994; Takimoto et al., 1999; Agnez-Lima, et al., 2001) e também após a

Introdução 9

exposição de células a oxidantes. No entanto, a lesão 8-oxoG não induz mutações do

tipo G:CC:G (Neeley et al., 2006), este dado foi evidenciado em ensaios de

transformação utilizando plasmídeos monomodificados contendo uma única lesão do

tipo 8-oxoG em posição pré-estabelecida, deste modo observou-se somente a ocorrência

de transversões do tipo GT na posição onde se encontrava a lesão, este fato foi

evidenciado tanto em células procarióticas (Wood et al., 1990; Wagner et al., 1997)

quanto em células eucarióticas (Moriya, 1993).

Em ensaios de replicação in vitro, utilizando oligonucleotídeos contendo 8-oxoG

na fita molde e diferentes DNA polimerases, também comprovaram a geração exclusiva

da transversão de GT frente a lesão (Shibutani et al., 1991). Este fato sugere que

alguma lesão adicional derivada de dG (Tabela 02) ou algum produto da hiperoxidação

de 8-oxoG (Figura 05), pode ser responsável por transversões do tipo GC. Os

produtos hiperoxidados mostram-se também potencialmente mutagênicos, sendo

capazes de originar transversões de GT e GC in vitro (Gasparutto et al., 1999;

Duarte et al., 2000; Duarte et al., 2001; Kornyushyna et al., 2002) e in vivo (Henderson

et al., 2002; Henderson et al., 2003; Neeley et al., 2004; Henderson et al., 2005).

Entretanto, o tipo de lesão influencia a taxa do bypass pelas polimerases, como também

na escolha do nucleotídeo a ser inserido em posição oposta à lesão. Isto sugere que

apesar da semelhança estrutural entre a lesão e o sítio ativo da polimerase, as lesões

diferem o suficiente para causar significativas mudanças na assinatura mutacional

(Neeley et al., 2006; Neeley et al., 2007).

Recentes medições estimaram que os níveis de 8-oxoG no DNA de linfócitos,

podem ser de 0,3 à 4 lesões por 106 bases, mas esse valor pode variar em diferente tipos

célulares (Gedik et al., 2005). Devido a abundância de 8-oxoG no DNA celular e a

facilidade da sua oxidação em relação à dG, a existência in vivo das lesões derivadas de

8-oxoG é aceitável. Entretanto, as lesões hiperoxidadas ainda não são detectadas in vivo,

com exceção das lesões Sp1 e 8-NO2-G (Neeley et al., 2006).

As lesões do tipo Sp1 podem ser formadas no DNA após o tratamento com

dicromato de potássio Cr(VI) e retiradas do genoma pela DNA glicosilase Nei. O

acúmulo desta lesão tem sido detectado in vivo nas células de E. coli deficientes em Nei

(Hailer et al., 2005), já a lesão 8-NO2-G in vivo, é utilizada como um biomarcador de

inflamação (Sawa et al., 2006). Esses dados demonstram a importância da oxidação de

8-oxoG in vivo.

Introdução 10

1.5 – VIAS DE REPARO

As células possuem diferentes mecanismos de reparo para evitar as

conseqüências deletérias do DNA lesionado, essas vias de reparo retiram e substituem

as bases danificadas da molécula do DNA (Lindahl et al., 1999). Os mecanismos de

reparo em todos os organismos são adaptados para lidar com características especiais

dos danos oxidativos, na tentativa de mitigar seu alto potencial mutagênico e/ou

citotóxico.

As vias de reparo relacionadas na maioria das correções de bases modificadas do

genoma de bactérias e células eucarióticas são: reparo por excisão de nucleotídeos

(NER – nucleotide excision repair), reparo por excisão de base (BER – base excision

repair) e reparo de bases mal emparelhadas (mismatch) (Bercht et al., 2007).

A principal via de reparo para lesões no DNA provocadas por agentes oxidativos

é a via BER (Mitra et al., 2001). Dentre as lesões reconhecidas pela via BER estão as

bases oxidadas, sítios abásicos (ou sítios AP), bem como quebras da simples fita do

DNA (Hegde et al., 2008). Essas lesões no DNA apresentam ser um desafio para a

célula durante a replicação ou transcrição e podem ser potencialmente mutagênicas e/ou

citotóxicas, se não forem reparadas corretamente.

O mecanismo básico do BER foi primeiramente elucidado em E. coli, estudos

subsequentes mostraram que esse processo também é conservado em células

eucarióticas incluindo os mamíferos (Robertson et al., 2009). De forma simplificada, O

BER requer quatro enzimas nos passos básicos para reparar a fita de DNA contendo

sítios AP ou bases danificadas. Essas enzimas são: DNA glicosilase, AP endonuclease,

DNA polimerase e DNA ligase (Mitra et al., 2001).

A via BER (ilustrada na figura 06) é iniciada com a excisão da base danificada

pela DNA glicosilase, gerando um sítio abásico pela clivagem da ponte N-glicosídica da

base danificada. O segundo passo é a quebra do sitio AP por uma AP endonuclease ou

liase, para gerar extremidades 3’-OH e 5’-P. A lacuna gerada é re-sintetizada através da

incorporação de um nucleotídeo pela DNA polimerase e em seguida selada pela DNA

ligase no passo final para restaurar a integridade do DNA (Seeberg et al., 1995; Krokan

et al., 1997). As enzimas utilizadas nesta via são conservadas desde as bactérias até aos

mamíferos (Robertson et al., 2009).

Introdução 11

Figura 06 – A via BER e seus quatro passos para o reparo de bases oxidadas.

Primeiro passo, uma DNA glicosilase reconhece a base danificada e quebra a ponte N-glicosídica. Segundo passo, quebra do sitio AP por uma AP endonuclease ou liase, para a geração de extremidades 3’-OH e 5’-P. Terceiro passo, incorporação de um nucleotídeo pela DNA polimerase. Quarto e último passo, a fita de DNA é selada pela DNA ligase, restaurando sua confirmação original.

Assim, a 8-oxoG é uma lesão oxidativa resultante da modificação da base dG,

encontrando-se em níveis basais em todos os tipos de células, podendo ser aumentada

durante o estresse oxidativo. Entretanto, com a finalidade de evitar drásticas

consequências da 8-oxoG ao genoma, os organismos possuem glicosilases específicas,

para correção desta lesão, prevenindo mutações. As enzimas MutM (também conhecida

como Fpg), MutY e MutT, em bactérias (Michaels e Miller, 1992), bem como OGG1,

MUTYH e MTH1, suas correspondentes em humanos (Barnes et al., 2004), constituem

a via de reparo da 8-oxoG, conhecida como o sistema GO.

As glicosilases do BER, MutM (ou Fpg) em bactérias e OGG1 em humanos

(Michaels, et al., 1992; Klungland et al., 2007) removem a 8-oxoG quando pareada com

citosina (dC), guanina (dG) e timina (dT), o passo subsequente é o processamento por

outras enzimas da via BER, que restauram o par de bases correto G:C (Figura 08).

Contudo, se ocorrer a replicação antes da correção, a adenina (dA) poderá ser

Introdução 12

incorporada frente a 8-oxoG, formando o par 8-oxoG:dA, deixando de ser substrato para

a MutM e OGG1. Então a DNA glicosilase MutY em bactérias e MUTYH em humanos,

reconhece o par de base resultante, removendo a dA incorporada erroneamente

(Michaels, et al., 1992; Mcgoldrick et al., 1995). Os passos subsequentes do

processamento do sítio AP envolve a replicação pela polimerase de reparo,

restabelecendo o par 8-oxoG:C (Figura 07). A atuação da MutY e MUTYH, fornece

uma nova oportunidade para as DNA glicosilases, MutM e OGG1, restabelecer o par

G:C.

Figura 07 – A presença da 8-oxoG (O) no DNA pode causar transversões de GT,

como ilustrado na via central da figura. As enzimas MutM e MutY de bactérias, bem como OGG1 e MUTYH de humanos são envolvidas na via de reparo da 8-oxoG. As enzimas MutM e OGG1 removem 8-oxoG do par de bases 8-oxoG:C, restabelecendo o par normal G:C. As enzimas MutY e MUTYH removem A do par de bases 8-oxoG:A gerado após a primeira replicação, restabelecendo o par de bases 8-oxoG:C. Ambas as vias geram sítios AP no DNA. Os passos marcados como “reparo” sumarizam a ação da

AP nuclease ou liase, DNA polimerase e DNA ligase, restaurando a fita de DNA. Adaptado de David, et al.(2007).

A MutT, em bactérias e MTH1 em humanos, são fosfatases que previnem a

incorporação de 8-oxoG na fita de DNA nascente pelas polimerases (Maki et al., 1992;

Kakuma et al., 1995), pois são capazes de hidrolisar a 8-oxo-7,8-dihidrodeoxiguanosina

Introdução 13

trifosfato (8-oxo-dGTP), um nucleotídeo mutagênico, que pode ser inserido na fita de

DNA nascente e parear com dA, levando a erros na replicação (Saraswat et al., 2002)

(Figura 08). A 8-oxo-7,8-dihidrodeoxiguanosina monofosfato (8-oxo-dGMP) é formada

pela ação da MutT ou MTH1 e não pode ser usada na síntese de DNA, nem sofrer uma

nova fosforilação (Hayakawa et al., 1995).

Figura 08 – Os agentes oxidativos também reagem com nucleotídeos livres

intracelulares, formando 8-oxo-dGTP. Com a finalidade de evitar a incorporação de nucleotídeos oxidados na fita de DNA durante a replicação, as células utilizam a enzima MutT (células bacterianas) e MTH1 (células humanas), para hidrolisar a 8-oxo-dGTP em 8-oxo-dGMP.

As três atividades enzimáticas que fazem parte do sistema GO (Michaels e

Miller, 1992) ocorrem para prevenir mutações espontâneas. Se houver uma falha no

sistema GO ou a deficiência de alguma dessas enzimas de reparo nas células, ocorre o

aumento específico da taxa de mutação pela transversão G:CT:A devido a capacidade

de 8-oxoG parear frente a adenina (dA) durante a replicação (Michaels, et al., 1992;

Michaels e Miller, 1992).

A transversão G:CC:G é um segundo tipo de mutação que tem sido observado

com alta frequência após replicação de DNA lesado com o 1O2 em bactérias (Agnez-

Lima, et al., 2001) e em células eucarióticas (Deoliveira et al., 1992), mas as lesões

envolvidas nesse tipo de mutação ainda são desconhecidas e o seu papel biológico

permanece incerto. No entanto, foi demonstrado em estudos anteriores, o envolvimento

de algumas enzimas para a prevenção desse tipo de mutação, como por exemplo, a

MutY-Glisosilase (Zhang et al., 1998). Até o momento, os produtos hiperoxidados são

os principais candidatos para as lesões envolvidas com a ocorrência da transversão

Introdução 14

G:CC:G in vivo (Henderson et al., 2002; Henderson et al., 2003; Neeley et al., 2004),

porém o papel biológico dessas lesões ainda precisa ser melhor conhecido.

1.6 - MUTY-GLICOSILASE

A MutY-glicosilase é responsável por remover dA incorporada erroneamente na

fita de DNA, oposta à dG (Au et al., 1989) e 8-oxoG (Zhang et al., 1998; Li et al.,

2000), prevenindo assim mutações do tipo G:CT:A. A MutY-glicosilase de E. coli

(EcMutY) também pode remover dA dos pares de base: A:C, A:5-hidroxiuracil e

recentemente foi observado in vitro que MutY pode retirar dG do par de base 8-

oxoG:G, só que em pequenas taxas (Zhang et al., 1998; Lu et al., 2006b).

Particularmente, os pares de bases, 8-oxoG:A e 5-hidroxiuracil:A são substratos

extremamente importantes para a MutY-Glicosilase, pois esta enzima é exclusiva na

remoção de dA não danificada, pareada erroneamente com as lesões 8-oxoG e 5-

hidroxiuracil (Lu et al., 2006a).

As bases dC, dT, dG também podem ser incorporadas erroneamente frente a

lesão 8-oxoG in vitro, mas não se tornam substrato para a MutY, e sim para a MutM,

que irá atuar sobre a 8-oxoG. A atividade da MutM-Glicosilase na remoção de 8-oxoG

dos pares de base T:8-oxoG, G:8-oxoG e C:8-oxoG (Tchou et al., 1994), pode ser

modulada por MutY-Glicosilase (Bridges et al., 1996). A inibição da atividade de

MutM por MutY é particularmente importante se T:8-oxoG e G:8-oxoG surgirem de

incorporações inadequadas de dT e dG oposta à 8-oxoG, evitando assim, o

estabelecimento de mutações nos eventos subseqüentes de replicação.

Zhang e colaboradores (1998) mostraram que o plasmídeo contendo o gene

mutY+ ao ser inserido em cepas mutY e mut39 reduz mutações espontâneas do tipo

G:CT:A, como também do tipo G:CC:G (Zhang et al., 1998). No mesmo trabalho,

oligonucleotídeos contendo danos em posições pré-determinadas, foram incubados in

vitro com a enzima, MutY-Glicosilase, após a reação, as amostras foram submetidas a

corridas em gel de poliacrilamida e observou-se que a enzima de reparo além de estar

ligada ao par de base 8-oxoG:A, como esperado, também estava ligada ao par 8-

oxoG:G, sugerindo que a proteína MutY possui uma atividade DNA glicosilase, a qual

remove dG não modificada do par de bases 8-oxoG:G, deste modo foi suposto que a

proteína MutY previne a geração de transversões do tipo G:CC:G por remover a

guanina não oxidada do par de base 8-oxoG:G em E. coli (Zhang et al., 1998). No

Introdução 15

entanto, a capacidade da MutY em se ligar a danos do tipo G:8-oxoG foi demonstrada

apenas in vitro. A comparação da ação enzimática de MutY in vivo nas bactérias pode

não ser correlata com a ação de MutY in vitro, pois as condições e fatores como pH e a

concentração destes componentes variam muito entre os sistemas in vitro e in vivo.

Além disso, ensaios com plasmídeos monomodificados e de replicação in vitro não

indicaram a ocorrência do par 8-oxoG:G, como acima descrito (Wood et al., 1990;

Moriya, 1993).

1.7 PADRÃO DE EXPRESSÃO PROTÉICA

A análise da expressão de um genoma pode ser realizada através de ferramentas

da proteômica, os quais permitem revelar proteínas envolvidas nas respostas celulares

durante ou após o estresse, através de comparação da presença e concentração de

determinadas proteínas, antes e após o evento. O monitoramento do nível das proteínas,

através de proteômica quantitativa, também permite visualizar o efeito da regulação da

expressão genética que pode ocorrer após a transcrição e a tradução, desta forma são

obtidos informações quanto às funções biológicas das proteínas, bem como seu

envolvimento nos processos biológicos examinados. As diversas técnicas da proteômica

existentes atualmente permitem separar, identificar, quantificar e caracterizar diferentes

tipos de proteínas. As informações obtidas são analisadas através de ferramentas da

bioinformática e relacionadas aos bancos de dados de proteínas existentes. A aplicação

da proteômica representa um avanço para as pesquisas na genética, pois somente com as

análises da sequência do genoma, não seria possível obter informação sobre o nível de

expressão de genes e/ou quais as características das proteínas expressas. Visto que, para

cada tipo de célula e condição ambiental é possível verificar diferenças nos níveis de

expressão, modificações, localização, bem como interações das proteínas. Atualmente,

uma das abordagens mais comuns em proteômica quantitativa, recorre-se à separação

das proteínas presentes em amostras biológicas, por eletroforese bidimensional em géis

de poliacrilamida (O'farrell, 1975).

Assim, utilizando as ferramentas da proteômica, foi possível constatar as

primeiras respostas celulares ao 1O2 existentes em procariotos (Anthony et al., 2005;

Glaeser et al., 2005) e em eucariotos (Kochevar, 2004). Ambos os tipos celulares

possuem sistemas de proteção contra as EROs composto por enzimas de reparo,

mecanismos de defesa e antioxidantes contra o estresse oxidativo. Esse sistema de

Introdução 16

proteção possui uma expressão basal controlada para garantir a estabilidade genômica e

prevenir prejuízos ao organismo acarretados pelas reações de oxidação durante o

estresse oxidativo. Essa característica é muito importante porque a molécula de DNA

sofre constantemente a ação de agentes endógenos e exógenos. A expressão basal de

enzimas de reparo, mecanismos de defesa e antioxidantes, ocorre como forma de

prevenção, mesmo na ausência do estresse oxidativo e de danos no DNA da célula,

caracterizando assim a primeira linha de defesa do organismo. Sob condições de

estresse oxidativo, as células são preparadas para responder ao aumento abrupto da

concentração intracelular das EROs, através da indução dos mecanismos de defesa para

neutralizar e eliminar o agente nocivo, principalmente por mudanças no nível de

expressão de proteínas celulares que atuam diretamente contra EROs (Rabilloud et al.,

2005; Chen et al., 2008; Zeng et al., 2008).

Contudo, se os mecanismos de defesa não forem suficientes para proteger a

integridade celular e o estresse oxidativo resultar em danos ao genoma, as células

possuem diferentes mecanismos de reparo do DNA para tentar restabelecer a

integridade genômica. As enzimas relacionadas ao reparo de DNA terão seus níveis de

expressão aumentados em resposta ao estresse oxidativo e podem funcionar como

biomarcadores celulares (Rusyn et al., 2004). O aumento da expressão das enzimas de

reparo é necessário para tentar remediar os danos causados durante o estresse oxidativo

e é correlacionado com a extensão das lesões na molécula de DNA. A diferença nos

níveis de concentração dessas proteínas pode ser através da síntese de novas proteínas,

pela degradação ou através de modificação pós-traducional de proteínas existentes.

Objetivos 17

2. OBJETIVOS

A. Objetivo Geral

Caracterizar respostas celulares in vivo de cepas de E. coli, submetidas ao estresse

oxidativo gerado por MB fotossensibilizado e no escuro.

B. Objetivos Específicos

Avaliar in vivo o potencial citotóxico e mutagênico do MB na presença e na

ausência de luz.

Obter o espectro de mutações induzidas pelo MB.

Identificar proteínas com expressão diferencial induzida pelo tratamento com MB.

Identificar novos mecanismos de prevenção e defesa contra o estresse oxidativo

provocado pelo 1O2.

Material e Métodos 18

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 - Cepas Bacterianas

As cepas de Escherichia coli (E. coli) usadas no presente estudo, foram as cepas

proficiente em reparo e deficiente em MutY-Glicosilade, ambas cepas são derivadas da

E. coli K–12. A cepa AB1157 (gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Carlos Frederico

Martins Menck - USP, São Paulo – Brasil) é proficiente no reparo de DNA e possui a

expressão normal de todas as enzimas de reparo. No entanto, a cepa BH980 é uma

linhagem mutante que possui uma deficiência no gene mutY, responsável por codificar a

enzima de reparo MutY-glicosilase (gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Álvaro C. Leitão

- UFRJ, Rio de Janeiro – Brasil). As cepas bacterianas e suas principais características

genéticas estão descritas na Tabela 03.

Tabela 03. Genótipo das cepas de Escherichia coli.

Cepas Genótipo Resistência

AB1157 thr1, leu6, proA2, his4, argE3, thi1, lacY1,

galK2, ara14, xy15, mtl1, tsx33, rpsl31, supE44 (stpr)

Estreptomicina

BH980 Ara ∆(gtp e lac) 5 rpsL

[F’ lacI378, lacZ461, pro A+B+], mutY (kanr)

Canamicina

Entre todos os microrganismos, a E. coli K–12 é a bactéria que possui o genoma

melhor caracterizado (Blattner et al., 1997). A E. coli K–12 possui um genoma

minuciosamente detalhado de 4,6 Mbp (Mega pares de bases) e contém um número de

4290 ORFs (open reading frame) preditas (Blattner et al., 1997). As culturas foram

estocadas em glicerol (50%) e armazenadas a -80ºC. Quando necessário, as cepas foram

cultivadas a 37ºC sob agitação de 180 rpm.

Material e Métodos 19

3.2 - Azul de Metileno

O Azul de metileno (MB) (Merck) é um corante orgânico sintético, catiônico,

solúvel em água ou álcool e pode ser classificado pela estrutura química, na classe das

tiazinas (Floyd et al., 2003). O MB possui absorbância em 662 nm.

O MB foi diluído em água ultrapura e utilizado nos ensaios em uma única

concentração (25µM), tanto protegido da luz, quanto exposto em diferentes tempos de

iluminação (0’ 30’ 60’ 90’ e 120’) para a fotossensibilização e geração de EROs,

responsáveis pelo estresse oxidativo. Na fotossensibilização do MB, foi utilizada uma

lâmpada incandescente de 100W (osram) como fonte luminosa à 40 cm de distância.

3.3 - Detecção da produção de 1O2 no sistema

O Ensaio do imidazol mais RNO (N,N-Dimethyl-4-nitrosoaniline) é um

procedimento simples e há muitos anos é corriqueiramente utilizado como um teste

sensível e seletivo para a detecção do 1O2 originado em diferentes soluções aquosas

(Kraljic et al., 1978). O método consiste da perda de coloração do RNO, que ocorre

como consequência da captura do 1O2 pelo imidazol. O 1O2 ao reagir com o imidazol

forma um composto intermediário bastante reativo, o qual é capaz de reagir e induzir a

perda da coloração do RNO, processo pelo qual muda o valor da absorbância medida à

440 nm (Kraljic et al., 1978). No presente estudo, o ensaio do imidazol mais RNO foi

realizado nas mesmas condições do tratamento utilizado com as cepas bacterianas. O

ensaio foi importante para detectar a ocorrência da liberação do 1O2 e assim confirmar

que o sistema desenvolvido para este trabalho gera o estresse oxidativo.

O ensaio para a detecção de 1O2 foi realizado in vitro (sem a presença das células

bacterianas). Para este ensaio, adicionou-se na solução líquida e estéril do meio de

cultura Laurie Bertani (LB) (1% triptona, 0.5% extrato de levedura, 1.0% NaCl), o MB

(concentração final 25µM), o imidazol (concentração final 8M) e o RNO (concentração

final 5µM). Após a homogeneização, esta solução foi incubada por 20 minutos, dividida

em duas partes iguais e transferida para dois frascos do tipo erlenmayers, ambos os

frascos foram mantidos sob a mesma condição de temperatura e agitação (37ºC e 180

rpm respectivamente), diferindo apenas na exposição à irradiação, pois um frasco foi

protegido da luz e o outro foi irradiado por uma lâmpada incandescente de 100w

(Osram). O controle utilizado neste ensaio foi a solução de LB líquida acrescida do

Material e Métodos 20

imidazol e RNO, sem a presença do MB e exposta à luz nas mesmas condições descrita

anteriormente. Inicialmente, pequenas alíquotas foram retiradas simultaneamente dos

três recipientes e a absorbância das soluções medida a 440 nm, este processo se repetiu

durante duas horas, a cada intervalo de 30 minutos.

Após a confirmação da geração do 1O2 pelo sistema desenvolvido neste trabalho,

o estudo progrediu em diversas etapas, sumarizadas no esquema a seguir (Figura 09).

Figura 09 – Esquema com a descrição em etapas de todos os ensaios realizados no

projeto.

Material e Métodos 21

3.4 - Tratamento in vivo com MB

Os dois tipos de tratamentos desenvolvidos com as culturas bacterianas

proficiente e deficiente em MutY, foram realizados em uma única concentração de MB

(25µM), variando-se o tempo de exposição.

Os microorganismos utilizados nos experimentos foram Escherichia coli

AB1157 (proficiente em reparo) e BH980 (deficiente em MutY-glicosilase) (Descritas

na seção 3.1 A.) (Tabela 02). Culturas de ambas as cepas foram crescidas por 14-16

horas, em meio líquido Laurie Bertani (LB) (1% triptona, 0.5% extrato de levedura,

1.0% NaCl), em temperatura constante de 37°C e sob agitação constante a 180 rpm

(rotações por minuto), do “rotary shaker” (Tecnal, modelo TE-421). Após o

crescimento, as culturas em fase estacionária, foram reinoculadas em meio LB fresco na

diluição de 1:20 vezes. Quando as culturas atingiram densidade entre 0,30–0,35 e 0,75–

0,85 (medida a 600nm), foram utilizadas respectivamente, no Tratamento I e

Tratamento II, como descritos a seguir:

Tratamento I - Cada cultura foi dividida em três alíquotas (Controle, MB-Escuro e MB-

Luz) e em cada uma delas foram colocadas individualmente em erlenmayers de vidro (a

utilização do vidro se fez necessário para que a passagem dos possíveis raios UV

gerados pela lâmpada, fossem impedidos). Nas alíquotas MB-Escuro e MB-Luz, o Azul

de Metileno foi adicionado resultando em uma concentração final de 25µM. Após 20

minutos de incubação, as três alíquotas foram simultaneamente colocadas para crescer

durante 120 minutos, a temperatura constante de 37°C e abaixo de agitação a 180rpm,

do “rotary shaker” (Tecnal, modelo TE-421), apenas a alíquota MB-Luz foi exposta a

uma lâmpada incandescente de 100w (Osram) por até 120 minutos. Ensaio utilizado na

análise do crescimento e na extração de proteínas.

Tratamento II - As culturas bacterianas de AB1157 e BH980, na concentração final de

Azul de Metileno a 25µM, foram incubadas por 20 minutos em erlenmayers de vidro, e

posteriormente expostas a uma lâmpada incandescente de 100W (Osram) por até 120

minutos, na temperatura constante de 37ºC, utilizando uma barra magnética para

homogeneização da solução, de acordo com a Figura 10. Ensaio utilizado para as

análises de citotóxicidade e mutagenicidade.

Material e Métodos 22

Figura 10 – Modelo do Tratamento II, O frasco do tipo erlenmayer contendo a

cultura bacteriana (MB 25µM) foi exposto a uma lâmpada de 100w (Osram) por até 120 minutos e homogeneizado por uma barra magnética sob condições constante de temperatura.

3.5 - Análise do crescimento bacteriano durante o tratamento

A análise da interferência do MB sobre o crescimento celular bacteriano foi

realizada simultaneamente ao tratamento I (descrito na Sessão 3.2). O crescimento

celular da cepa proficiente e deficiente em MutY-Glicosilase, foi medido pela

absorbância da cultura celular à 600 nm, nos tempo 0’,30’,60’,90’e 120’. Pequenas

alíquotas das culturas de ambas as cepas (controle, MB-Escuro e MB-Luz), foram

retiradas e as absorbâncias destas amostras foram medidas em microplaca para titulação,

no leitor de placas µQuantTM (Bio-Tek). Após quatro experimentos independentes, as

absorbâncias das amostras foram analisadas utilizando o teste T de Student (valores

significativos igual à P < 0,05).

3.6 - Extração de proteínas solúveis totais

Durante o tratamento I, uma pequena parte de cada cultura bacteriana foi

coletada nos tempos 0’, 30’, 60’, 90’ e 120’ e utilizada para a extração de proteínas

totais. As culturas coletadas foram centrifugadas a 15.000 rpm por 20 minutos na

Material e Métodos 23

temperatura de 4°C, em seguida o sobrenadante foi cuidadosamente descartado e as

células bacterianas sedimentadas foram ressuspendidas em tampão de lise 2D (7M

uréia; 2M Tiouréia; 25mM DTT; 10% glicerol e 0,1% Triton-X), após a lise celular

foram deixadas em temperatura ambiente por 15 minutos e posteriormente estocadas em

freezer -80ºC.

3.7 - Quantificação de proteínas (Bradford)

Proteínas totais extraídas das culturas bacterianas foram quantificadas baseadas

no método de Bradford (Bradford, 1976). Este é um método simples e bastante preciso

para a determinação da concentração de proteínas solubilizadas. O método de Bradford

consiste na mudança da coloração da amostra ao adicionar um corante ácido, o

Commassie Blue (CB), na solução com proteínas. A intensidade da coloração é medida

pela absorbância a 595nm, é necessário ter algumas soluções de proteínas com

concentrações conhecidas (curva padrão) para a comparação, permitindo assim estimar

a medida da concentração protéica das amostras. As mudanças da coloração do corante

ocorrem em resposta a uma variação da concentração da proteína, o corante CB liga-se

primeiramente aos resíduos de aminoácidos básicos e aromáticos, especialmente

arginina. Algumas interferências podem ser causadas por interações entre reagentes

químicos e corantes, fazendo-se necessário a diluição das amostras com a finalidade de

evitar possíveis interferências.

Neste estudo, a amostra precisou ser diluída 10x, pois reagentes do tampão de

lise poderiam interferir na absorbância das amostras e estimar uma falsa concentração

de proteínas. Após a diluição, as amostras foram pipetadas cuidadosamente nos poços

da placa de microtitulação seguido da adição do corante CB diluído 1:4 vezes (Reagente

corante concentrado BioAgency), para este ensaio, utilizou-se o BSA (Bovine serum

Albumin) (Merck) como proteína padrão e a absorbância foi medida a 595nm.

3.8 - Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

O SDS-PAGE é uma poderosa técnica utilizada na separação de proteínas pelo

peso molecular, que utiliza um detergente iônico (SDS) como desnaturante de proteínas.

A utilização do SDS neste processo é muito importante para evitar a interferência da

carga elétrica da proteína durante a corrida eletroforética, pois esse detergente é

Material e Métodos 24

responsável por homogeneizar a carga elétrica das proteínas (Laemmli, 1970). Logo

após a quantificação, o SDS-PAGE a 12% foi utilizado para a separação das proteínas

solúveis do extrato bruto e assim observar, previamente, as alterações do padrão de

resposta celular ao tratamento realizado com as cepas bacterianas de E. coli. Os géis

obtidos foram corados com nitrato de prata (Tunon et al., 1984) e com coomassie blue

(Neuhoff et al., 1988). A partir da análise das amostras em SDS-PAGE, foram

selecionadas as amostras a serem usadas na eletroforese de segunda dimensão (2-D).

O cálculo aproximado da massa molecular das proteínas diferencialmente

expressas foi através de comparação com o marcador de proteínas Broad range

(Biolabs), que possui proteínas de tamanhos que variam de 6,5 a 212 kDa.

Após a identificação do peso molecular aproximado das proteínas

diferencialmente expressas, foi realizada uma pesquisa no banco de dados de proteínas,

“ExPASy Proteomics Server” (http://www.expasy.ch), para obter as proteínas

candidatas.

3.9 - Eletroforese de segunda dimensão (2-D)

A eletroforese de segunda dimensão (2-D) foi inicialmente introduzida por

O’Farrell em 1975 (O'farrell, 1975). A 2-D é um método poderoso e amplamente

utilizado para a análise de complexos extratos protéicos de células, tecidos e outras

amostras biológicas. Esta técnica separa proteínas de acordo com duas propriedades

diferentes em dois passos distintos. O primeiro passo (primeira dimensão) é a

focalização isoelétrica, separando as proteínas de acordo ao seu ponto isoelétrico (pI). O

segundo passo (segunda dimensão) é o SDS-PAGE (descrito na seção 3.2 F), separa as

proteínas de acordo com seu peso molecular, cada mancha resultante do gel da segunda

dimensão, potencialmente corresponde a uma única proteína da amostra. Milhares de

proteínas podem ser separadas por esta técnica e informações tais como pI, peso

molecular e quantidade de proteína podem ser obtidas.

No presente trabalho, a 2-D foi realizada no sistema Ettan IPGphor II (GE

Healthcare) em tiras de gel com 7cm (centímetros) de comprimento e gradiente linear

de pH imobilizado (IPG) variando de 4-7 (GE Healthcare), foi utilizado 60µg de

proteínas (Bore, Hebraud et al., 2007), de cada amostra previamente selecionada no

SDS-PAGE.

Material e Métodos 25

As tiras de IPG foram reidratadas por 14-20 horas com 60µg de proteínas

solubilizadas da amostra, mais a solução de reidratação (8M Uréia, 2% CHAPS, 0,002%

Azul de Bromofenol, 2%IPG-Buffer)*. Quando reidratadas, as tiras foram submetidas

simultaneamente a corrente elétrica para separação protéica pelo pI, logo em seguida ,

cada tira de IPG foi equilibrada em solução de equilíbrio I (6M uréia, 75mM Tris-HCL

pH 8.8, 29,3% glicerol, 2% SDS, 0.002% de azul de bromophenol e 10mM DTT)*,

transferida para a solução de equilíbrio II (6M uréia, 75mM Tris-HCL pH 8.8, 29,3%

glicerol, 2% SDS, 0.002% de azul de bromophenol e 25mM iodoacetamida)*, onde

permaneceram por 15 minutos em cada.

Após o equilíbrio, as tiras de IPG, foram colocadas individualmente no topo de

um gel SDS-PAGE (solução Acrilamida 12,5%)* e seladas com agarose ultra pura

(25mM Tris base, 192mM glicina, 0,1% SDS, 0,5% agarose e 0,002% azul de

bromofenol)*, para a realização da separação pelo peso molecular (segunda dimensão).

A eletroforese de segunda dimensão foi realizada no sistema miniVE SE-260 à

temperatura constante de 4°C. Os géis foram corados usando o corante Coomassie

Brilliant Blue (CBB), com algumas modificações do método de (Neuhoff et al., 1988),

seguido da digitalização das imagens pelo scanner ImageScanner (GE Health care).

*Todos os reagentes utilizados nesta etapa foram adiquiridos pela Amershan

bioscience.

3.10 - Análise dos géis

As análises das imagens dos géis 2-D foram realizadas usando o software de

imagens ImageMaster™ 2D Elite, de acordo com a descrição do fabricante (GE

Healthcare). As imagens dos géis controle, MB-Escuro, MB-Luz 30’ e MB-Luz 60’ de

ambas as cepas E. coli, foram comparadas e tiveram suas diferenças analisadas

quantitativamente e qualitativamente para determinar a alteração no padrão de

expressão das proteínas. As manchas protéicas (spots) detectadas com CBB foram

comparadas e os spots alterados tiveram a massa molecular estimados pelo padrão das

proteínas marcadoras e o valor do pI (estimado pela localização dentro do gradiente

IPG da tira). Os spots que surgiram com o tratamento e os que apresentaram mudanças

significativas foram hidrolisados (Kit Tripsina) e enviados para a o Prof. Dr. Gilberto

Barbosa Domont (Departamento de Química, UFRJ – RJ), para a identificação em

espectrometria de massas (MALDI-TOF-MS).

Material e Métodos 26

As extrações protéicas de três tratamentos independentes de cada cepa bacteriana

foram submetidas a 2-D e analisadas comparativamente, para confirmar a alteração da

expressão protéica.

3.11 - Ensaio de citotoxicidade

Com o intuito de avaliar a ação direta da fotossensibilização do MB e a

sensibilidade de cada cepa ao tratamento, foi realizada a análise citotóxica através da

contagem direta dos números de unidades formadoras de colônias (U.F.C.).

Antes de iniciar o tratamento II, uma alíquota das culturas celulares de AB1157

e BH980, foi retirada para se utilizada como controle. Após a incubação de 20 minutos

com MB e antes de iniciar a fotossensibilização uma alíquota foi retirada (Tempo 0’).

Durante a fotossensibilização, uma nova alíquota foi coletada a cada 30 minutos, até

completar 2 horas. Cada alíquota foi diluída a 10-4 e plaqueada em meio LB-ágar (1%

triptona, 0.5% extrato de levedura, 1.0% NaCl e1.5% ágar) e colocadas para crescer em

estufa à temperatura constante de 37ºC durante 14-16 horas. A análise citotóxica foi

avaliada através da contagem do número de colônias formadas em relação ao controle

não tratado e a análise estatística foi realizada utilizando o teste T de Student (valores

significativos igual à P < 0,05).

3.12 - Análise da mutagênese induzida e seleção de colônias mutantes

Para a análise da mutagênese induzida, utilizou-se o gene rpoB como alvo para a

mutação. Após o tratamento II, alíquotas coletadas concomitantes e da mesma forma

que descrito na (seção 3.2 J.), foram plaqueadas em meio LB-ágar acrescido de

rifampicina (Sigma) na concentração final de 100µg/mL seguido do crescimento em

estufa à temperatura constante de 37ºC, durante 14-16 horas para seleção de bactérias

mutantes no gene rpoB (Figura 11). As bactérias mutantes no gene rpoB são

selecionadas pela resistência à rifampicina (Rifr) (Garibyan et al., 2003), pois somente

as bactérias que são resistentes a este antibiótico podem crescer e formar colônia. As

colônias que crescerem em LB-ágar com rifampicina, adquiriram resistência durante o

tratamento, pois a E. coli é sensível a rifampicina, a qual se liga a subunidade β da RNA

polimerase (produto do gene rpoB), bloqueando assim, a transcrição. Mudanças nas

bases do gene rpoB podem resultar em mudanças conformacionais da subunidade β da

Material e Métodos 27

RNA polimerase, evitando a ligação a rifampicina, fazendo com que a bactéria adquira

resistência ao antibiótico, sendo assim possível a determinação da mutagênese direta

neste gene. A freqüência de mutação (f) no gene rpoB é determinada pela divisão do

número de mutantes pela média do números de colônias e a análise estatística foi

realizada utilizando o teste T de student (valores significativos igual à P < 0,05).

Resultados e Discussão 28

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados e a discussão estão protegidos para publicação.

Conclusões 29

5. CONCLUSÕES

Foi comprovado, que a enzima MutY-Glicosilase possui características especiais

ainda não completamente identificadas. No entanto, este trabalho mostra que a MutY

protege a célula de mutações e morte celular.

Os tratamentos realizados com a cepa proficiente em reparo e deficiente em

MutY evidenciaram diferenças marcantes no padrão de resposta celular ao estresse

oxidativo. Alterações no padrão do perfil protéico, bem como diferenças no

desenvolvimento bacteriano, sobrevivência e taxa de mutação foram observados.

Comprovando desta forma, que a MutY é uma enzima de reparo de extrema importância

na proteção da célula em condições de estresse oxidativo.

Estre trabalho levanta a hipótese da MutY-Glicosilse não está atuando no reparo

de forma linear, como descrita inicialmente. Desta forma pode estar interagindo ou

atuando em outras vias de reparo para a correção de prováveis produtos resultantes da

hiperoxidação da guanina, intercalados e crosslinks. No entanto, para garantir a

integridade do genoma e prevenir os efeitos deletérios do 1O2 na ausência da MutY, as

células possuem múltiplos mecanismos de defesa e reparo de lesões que podem ser

ativados, na tentativa de compensar a falta da enzima MutY.

Perspectivas 30

6. PERSPECTIVAS

Identificação das proteínas diferencialmente expressas, nas cepas AB1157 e BH980,

em resposta ao estresse oxidativo induzido por MB-Luz e MB-Escuro, para

confirmar se as supostas proteínas estão realmente envolvidas na resposta celular.

Sequenciamento das amostras de PCR de colônia, para confirmação do acúmulo da

frequência de mutação pela transversão do tipo de G:CC:G nas cepas deficientes

em MutY.

Testar as hipóteses levantandas a partir deste trabalho, como o envolvimento da

MutY-Glicosilase no reparo de intercalados, crosslinks e hiperoxidados, com

agentes capazes de originar esses danos.

Referências Bibliográficas 31

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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