ANÁLISE DE POLIMORFISMO DO GENE GSTP1 EM CÂNCER … · Após o diagnóstico, o câncer é classificado de acordo com o tecido de origem, podendo ser Carcinoma (células epiteliais),

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA

CURSO DE BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA MOLECULAR

JAÍSE PAIVA BRAGANTE DE ARAÚJO

ANÁLISE DE POLIMORFISMO DO GENE GSTP1 EM CÂNCER GÁSTRICO

JOÃO PESSOA, PARAÍBA

2013

2



Monografia apresentada ao Curso de

Ciências Biológicas (Trabalho Acadêmico de

Conclusão de Curso), como requisito parcial

à obtenção do grau de Bacharel em Ciências

Biológicas da Universidade Federal da

Paraíba.

Orientador: Prof. Dr. Eleonidas Moura Lima

João Pessoa, Paraíba

2013

3



Monografia apresentada ao Curso de

Ciências Biológicas, como requisito parcial à

obtenção do grau de Bacharel em Ciências

Biológicas

Data: 26 de abril de 2013

Resultado: ____________________________

BANCA EXAMINADORA:

Orientador: Prof. Dr. Eleonidas Moura Lima

Universidade Federal da Paraíba/ CCEN

Prof. Dr. Clayton Zambeli Oliveira


Profª. Drª. Hilzeth de Luna Freire Pessôa


4

AGRADECIMENTOS

A meus pais Anísio e Jaidete, meu irmão Igor, meus avós Clênia e João, minha

tia Juliene e todos os meus familiares e amigos, pelo apoio e motivação.

Ao professor Eleonidas Moura Lima, pela orientação e disponibilidade; aos

colegas do laboratório Cynthia, Rubistênia, Talitta, Juarez e João, pela imensa ajuda,

paciência, ensinamentos e convivência.

Aos membros da banca, os professores Clayton e Hilzeth, que aceitaram julgar

o meu trabalho e me ajudar a crescer cada vez mais.

A todos os professores da graduação que foram importantes para a construção

dos meus conhecimentos e possibilitaram o alcance de meu objetivo. Aos meus

colegas e amigos de graduação que compartilharam desafios e conquistas, desde 2009.

Aos coordenadores do curso de Ciências Biológicas, em especial, Eliete,

sempre solícita; sem sua ajuda seria impossível chegar até aqui.

A todos que fazem parte do Departamento de Biologia Molecular e do Centro

de Ciências Exatas e da Natureza.

5

RESUMO

O câncer gástrico ocorre no estômago e é a segunda causa de morte mais

comum em todo o mundo, tendo como principal fator de risco a infecção pela bactéria

Heliobacter pylori. Enzimas responsáveis pelo metabolismo dos xenobióticos podem

exercer um papel fundamental no desenvolvimento do câncer, visto que os

xenobióticos são mutagênicos em potencial. Um polimorfismo simples, de troca de um

nucleotídeo, pode fazer com que uma enzima diminua ou perca sua função, causando

desequilíbrios e, dependendo de que processo esta enzima participe, alterações nos

controles de crescimento e morte celular, conduzindo à carcinogênese. Polimorfismos

nas enzimas envolvidas no metabolismo de xenobióticos, como a GSTP1, vêm sendo

estudados na busca pela associação com o desenvolvimento do câncer. Este trabalho

teve como objetivo investigar a associação entre um polimorfismo de base única que

causa uma troca de Isoleucina para Valina, e o desenvolvimento de câncer gástrico. Há

evidências de que a atividade catalítica das enzimas codificadas por estas variantes

encontra-se alterada, influenciando, assim, na susceptibilidade ao câncer. Este estudo

analisou amostras de DNA de 23 indivíduos que desenvolveram câncer gástrico do

tipo intestinal. Foram utilizadas técnicas de PCR Alelo Específica e Eletroforese em

gel de Poliacrilamida para análises moleculares. Não foram encontradas associações

estatisticamente significativas das variantes genéticas com o câncer gástrico.

Palavras-chave: Genética, Oncogenética, Câncer Gástrico, Polimorfismo, GSTP1.

6

ABSTRACT

Gastric cancer occurs in the stomach and is the second most common cause of

death around the world, with the infection by the bacteria Helicobacter pylori as main

risk factor. Enzymes responsible for xenobiotics metabolism may play a key role in

cancer development, since xenobiotics are potentially mutagenic. A Single Nucleotide

Polymorphism can make an enzyme reduces or loses its function, causing imbalances,

and depending on which enzyme participates this process, changes the control of

growth and cell death, leading to carcinogenesis. Polymorphisms in enzymes involved

in the metabolism of xenobiotics, as the GSTP1, have been studied in the search for

association with the development of cancer. This study aimed to investigate the

association between a polymorphism that causes a single base exchange of isoleucine

to valine and the development of gastric cancer. There is evidence that the catalytic

activity of the enzymes encoded by these variants are altered, thus influencing in

cancer susceptibility. This study analyzed DNA samples from 23 individuals who

developed intestinal type gastric cancer. Were used Allele Specific PCR and

polyacrylamide gel electrophoresis techniques for molecular analysis. There were no

statistically significant associations between genetic variants and gastric cancer.

Keywords: Genetics, Oncogenetics, Gastric Cancer, Polymorfisms, GSTP1.

7

LISTA DE TABELAS

TABELA 1: TNM Patológico ..................................................................................... 16

TABELA 2: Amostras de câncer gástrico do tipo intestinal e informações clínicas dos

pacientes diagnosticados ............................................................................................. 22

TABELA 3: Iniciadores utilizados para amplificação do fragmento específico em

estudo (TA = Temperatura de anelamento; TFA = Tamanho do fragmento

amplificado; pb = Pares de bases) ............................................................................. 24

8

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1: Representação esquemática das partes e curvaturas do estômago ........ 14

FIGURA 2: Conjugação da glutationa (GSH) a um xenobiótico por ação da GST

resultando na formação da glutationa-S- conjugado ................................................. 18

FIGURA 3: Centrífuga ................................................................................................ 23

FIGURA 4: Termociclador Bio-Rad® ........................................................................ 25

FIGURA 5: Fonte Bio-Rad® e Cuba Loccus® Biotecnologia para Eletroforese ...... 26

FIGURA 6: Fotografia do Gel de Poliacrilamida das amostras 22, 23, 26, 27 e 28.

Onde não aparece a segunda banda, relativa ao alelo G, considera-se o genótipo

homozigoto para AA ................................................................................................... 27

9

SUMÁRIO

RESUMO .......................................................................................................... 5

ABSTRACT ...................................................................................................... 6

LISTA DE TABELAS ...................................................................................... 7

LISTA DE FIGURAS ....................................................................................... 8

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 11

1.1 O CÂNCER ..................................................................................................... 11

1.2 O CÂNCER GÁSTRICO ................................................................................ 12

1.2.1 Epidemiologia .................................................................................................. 12

1.2.2 Localização ...................................................................................................... 13

1.2.3 Tipos ................................................................................................................ 14

1.2.4 Fatores de Risco .............................................................................................. 14

1.2.5 Sintomas, Diagnóstico e Tratamento ............................................................... 15

1.2.6 Estadiamento do Câncer Gástrico e Sistema TNM ......................................... 16

1.3 TRANSFERASE-S DA GLUTATIONA (GST) ............................................. 17

1.3.1 POLIMORFISMO DO GSTP1 ....................................................................... 19

2 JUSTIFICATIVA ............................................................................................ 20

3 OBJETIVOS .................................................................................................... 21

3.1 GERAL ............................................................................................................ 21

3.2 ESPECÍFICOS ................................................................................................ 21

4 METODOLOGIA ............................................................................................ 22

4.1 ASPECTOS ÉTICOS ...................................................................................... 22

4.2 AMOSTRAS ................................................................................................... 22

4.3 EXTRAÇÃO DO DNA ................................................................................... 23

4.4 VALIDAÇÃO IN SÍLICO .............................................................................. 24

4.6 ALELO ESPECÍFICO PCR (AE-PCR) .......................................................... 24

4.6 ELETROFORESE ........................................................................................... 25

4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA .............................................................................. 26

5 RESULTADOS ............................................................................................... 27

10

6 DISCUSSÃO ................................................................................................... 28

7 CONCLUSÃO ................................................................................................. 30

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................ 31

11

1 INTRODUÇÃO

1.1 O CÂNCER

Toda a célula tem um conjunto de informações que controla a forma como

cresce e se comporta. O câncer ocorre quando há alterações nestas informações e a

célula passa a crescer e se multiplicar descontroladamente. Este processo de

transformação progressiva de células normais em malignas é denominado

carcinogênese (HANAHAN & WEINBERG, 2000).

Há muitas razões pelas quais isso pode ocorrer. Alterações epigenéticas que

regulam a atividade protéica, mutações que se acumulam ao longo do tempo, fatores

externos, como xenobióticos que interagem com o DNA ou radiação. Vírus e

infecções bacterianas também são capazes de modificar o código genético, originando

alterações irreversíveis e tumorigências. Quando as alterações carcinogênicas são

herdadas, caracterizam uma predisposição daquele indivíduo ao desenvolvimento de

câncer.

Os polimorfismos, por sua vez, são variações de sequencia do DNA (alelos)

presentes numa população e também podem caracterizar uma predisposição à

carcinogênese ou alteração de proteínas críticas. Os de nucleotídeo simples, ou Single

nucleotide polymorphisms (SNPs) são a forma de variação sequencial mais comum no

genoma, representando cerca de 90% dos polimorfismos de DNA humano.

(BROOKES, 1999).

O sucesso da carcinogênese depende de quais proteínas terão suas funções

alteradas devido às mutações, polimorfismos ou alterações epigenéticas. São várias as

que controlam o ciclo celular, a morte celular programada, a reparação do DNA

durante o ciclo celular, a fixação das células no tecido. É uma perda ou alteração de

função nestas proteínas críticas que dá início à transformação da célula (BREIVIK,

2005).

Duas classes de genes foram identificadas de acordo com as suas funções em

relação à carcinogênese: oncogenes e genes supressores de tumor. As mutações

carcinogênicas agem de certa forma a promover o crescimento celular ativando

oncogenes e inibir o controle deste crescimento desativando genes supressores de

tumor (HANAHAN & WEINBERG, 2000; BREIVIK, 2005).

12

Outros genes envolvidos com a progressão do tumor são os genes de reparo,

que atuam durante o ciclo celular evitando e corrigindo possíveis erros de transcrição

de DNA. São os responsáveis pela estabilidade genética e falhas no reparo destes erros

de transcrição podem acumular-se, alterando o equilíbrio celular (ALBERTS et al.,

2004).

Uma vez transformada, a célula passa a multiplicar-se, formando um

aglomerado de células chamado tumor. Um tumor sofre pressão do ambiente tecidual

para ser eliminado, tanto através de sinalização celular para a morte quanto ataques do

sistema imunológico. O tumor precisa evadir a estes sinais, manter sempre uma fonte

de nutrição, conseguir desprender-se do tecido e invadir outros (metástase).

(HANAHAN & WEINBERG, 2000). Quando ocorre a metástase, o tumor é

considerado maligno, denominando-se câncer.

Após o diagnóstico, o câncer é classificado de acordo com o tecido de origem,

podendo ser Carcinoma (células epiteliais), Sarcoma (tecido conjuntivo), Leucemia

(células hematopoiéticas) ou tumor do sistema nervoso (WEINBERG, 2008). O

diagnóstico ainda é complicado e muitas vezes tardio. A medicina caminha para

diagnósticos mais precisos e particulares, baseados no padrão genético de cada

indivíduo.

1.2 O CÂNCER GÁSTRICO

1.2.1 Epidemiologia

A incidência do câncer do estômago está diminuindo nos países desenvolvidos,

mas é alta nos países em desenvolvimento. Esta incidência aumenta com a idade e é

maior no homem. O câncer do estômago era o mais incidente do mundo nos anos 80,

mas atualmente perde para os tumores de pulmão (KASSAB & LEME, 2003).

O Câncer Gástrico (CG) é a segunda causa de morte mais comum ao redor do

mundo (FERLAY et al, 2010). A alta mortalidade é registrada atualmente na América

Latina, principalmente na Costa Rica, Chile e Colômbia. Porém, o maior número de

casos ocorre no Japão, onde são encontrados 780 doentes por 100.000 habitantes. A

Sociedade Americana de Câncer estimou para câncer gástrico nos Estados Unidos,

neste ano, aproximadamente 21.600 casos serão diagnosticados e 10.990 pessoas

morrerão deste tipo de câncer.

13

No Brasil, as estatísticas do Instituto Nacional de Câncer – INCA para 2012

estimaram 12.670 casos novos de CG em homens e 7.420 em mulheres. Esses valores

correspondem a um risco estimado de 13 casos novos a cada 100 mil homens e 7 a

cada 100 mil mulheres (INCA, 2012).

O CG em homens é o segundo mais frequente nas regiões Norte e Nordeste e o

quarto nas regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste. Para as mulheres, ocupa a quarta

posição na região Norte, quinta na região Centro-Oeste e a sexta nas regiões Sudeste,

Sul e Nordeste (INCA).

A sobrevida geral em cinco anos do CG é baixa, variando entre 10% e 20%

(GONZALEZ et al, 2002; FAIVRE et al., 1998; BERRINO et al., 1999). Esta continua

sendo uma doença de prognóstico ruim e alta mortalidade, atrás apenas do câncer de

pulmão como a maior causa de morte relacionada a câncer do mundo. Em geral, países

com maiores incidências de CG apresentam melhores taxas de sobrevivência que

países com incidências menores (CREW & NEUGUT, 2006).

1.2.2 Localização

O CG origina-se no estômago, órgão muscular e glandular em forma de saco,

responsável pelo armazenamento do alimento mastigado e ingerido e pelo início da

digestão através da secreção de sucos gástricos. A mistura de alimento e suco gástrico

é despejada no duodeno, primeiro segmento do intestino.

O estômago possui cinco partes: cardia, fundo, corpo, antro e piloro (Figura 1).

As três primeiras partes formam o estômago proximal, cujas células produzem ácidos

e pepsinas. As duas últimas partes são chamadas de estômago distal. O estômago tem

duas curvas, formando as bordas internas (curvatura menor) e externas (curvatura

maior).

São cinco as camadas do estômago. Na mucosa, a camada mais interna, são

sintetizadas enzimas digestivas e ácido. Os cânceres gástricos na quase totalidade

iniciam-se nesta camada. Seguindo em direção à camada mais externa, temos a

submucosa e a musculares propria, camada grossa de musculatura responsável pelos

movimentos peristálticos. As camadas mais externas, subcerosa e cerosa, envolvem o

órgão. As camadas são importantes para o diagnóstico do câncer, uma vez que este

cresce da mucosa para as camadas mais externas (Amercian Cancer Society, 2013).

14

Figura 1: Representação esquemática das partes e curvaturas do estômago. Retirada de:

http://ruirodrigues.net/radioterapia/images/stories/estomago.jpg

1.2.3 Tipos

De acordo com a localização, podemos identificar os seguintes tipos:

Adenocarcinoma, quando se originam do tecido glandular estomacal, localizado na

mucosa. Aproximadamente 90% dos casos são adenocarcinomas (DIMITRIOS et al,

2002).

Os outros 10% estão divididos entre linfomas gástricos e sarcomas. Linfomas

quando trata-se do câncer no tecido linfático próximo ao estômago, e sarcomas quando

ocorre nas células musculares do órgão (DIMITRIOS et al, 2002).

1.2.4 Fatores de risco

Estudos comparativos entre orientais e ocidentais sugerem origem étnica um

possível fator de risco (DAVIS & TAKESHI, 2001; GORE, 1997; PRANKIN et al.,

1997). Por outro lado, fatores ambientais podem superar a baixa incidência de uma

determinada etnia (GORE, 1997). Ramon et al. (1993) identificaram a dieta rica em

sal, o tabagismo ou alimentos mal preservados, nitratos, nitritos e amino-secundários

como associados a um aumento do risco de CG.

Os CG apresentam ocorrência esporádica, estima-se que apenas de 8% a 10%

possuem um componente familiar herdável (LA VECCHIA et al., 1992). Foram

identificadas algumas proteínas críticas que estão mutadas em indivíduos que

desenvolveram CG: a proteína p53, do ciclo celular, BRCA2, E-cadeirina, responsável

http://ruirodrigues.net/radioterapia/images/stories/estomago.jpg

15

pela adesão celular (FENOGLIO et al. 2000; HUNTSMAN et al., 2001; ASCANO et

al., 2001; DUSSAULX-GARIN et al., 2001; MACHADO et al., 1999).

Existem síndromes que funcionam como uma predisposição do indivíduo

portador ao desenvolvimento de CG. Como exemplo, temos o Câncer colorretal não-

poliposo hereditário, a Polipose adenomata familiar (FAP), Síndrome de Cowdens,

Síndrome de Peutz-Jeghers (BEVAN & HOULSTON, 1999).

O maior fator de risco para o desenvolvimento do CG, porém, é a infecção

através da bactéria Heliobacter pylori. Esta bactéria causa uma inflamação ativa

crônica da mucosa gástrica na maioria dos infectados, seguida de perda das glândulas

gástricas e estabelecimento de gastrite atrófica. Em resposta a este estresse, as células

sofrem metaplasia e erros constantes no código genético, resultando em câncer

gástrico. (KUIPERS, 1999). H. pylori também pode agir através de outros

mecanismos, como hiperproliferação das células gástricas e interferência nas funções

antioxidantes (GONZALEZ et al., 2002).

1.2.5 Sintomas, Diagnóstico e Tratamento

Os principais sintomas são: dor abdominal, fezes escuras, dificuldade para

deglutir, declínio geral na saúde, perda de apetite, náusea e vômito, vômito de sangue,

fraqueza ou cansaço e perda de peso (NATIONAL CANCER INSTITUTE, 2010).

A Endoscopia ainda é o método de diagnóstico mais sensível, permitindo a

visualização direta da localização do tumor, extensão da mucosa afetada e retirada de

amostra para biópsia. Quando combinada com modalidades radiológicas, pode

maximizar a identificação do estádio tumoral por prover informações a respeito da

profundidade de invasão tumoral (KARPEH & BRENNAN, 1998; SADOWSKI &

RABENECK, 1997; DICKEN et al., 2005).

A remoção cirúrgica do estômago (gastrectomia) é o único tratamento curativo.

A radioterapia e a quimioterapia auxiliam, mas não garantem a cura (RUSTGI, 2007;

GUNDERSON et al., 2008)

No intuito de facilitar a identificação e prognóstico dos pacientes, tanto quanto

estudos epidemiológicos e patogênicos, surgiram as classificações para os vários

cânceres, inclusive o gástrico. A classificação de Laurén, primeiro descrita em 1965,

divide o CG em dois tipos de acordo com a aparência histológica: o Tipo Intestinal

16

assemelha-se com o câncer de cólon e é precedido por uma gastrite crônica; O Tipo

Difuso, por sua vez, ocorre apenas no estômago, incide em pacientes mais jovens e

inicia-se numa mucosa comum – este tipo é o mais maligno (LAURÉN, 1965).

Definir o estadiamento do tumor é outra forma de classifica-lo, nesse caso em

inicial ou avançado, permitindo-se conhecer as chances de sobrevivência do paciente.

O estádio da doença, na ocasião do diagnóstico, pode ser um reflexo não somente da

taxa de crescimento e extensão da neoplasia, mas também do tipo de tumor e da

relação tumor-hospedeiro (INCA, 2004).

1.2.6 Estadiamento do Câncer Gástrico e Sistema TNM

Após diagnóstico do câncer gástrico, a determinação do estadiamento da

doença é fundamental para a tomada de decisão terapêutica. O sistema mais utilizado

para se realizar o estadiamento do câncer gástrico é o TNM, proposto pela UICC

(União Internacional Contra o Câncer), o qual se apoia em três componentes: T- a

extensão do tumor primário na parede gástrica, N- ausência ou presença e extensão das

metástases em linfonodos regionais e M- ausência ou presença de metástases à

distância (UICC, 2011).

Tabela 1: TNM Patológico (UICC, 2011)

Tumor Primário (pT)

TX Tumor primário não pode ser avaliado

T0 Sem evidência de tumor primário

Tis Carcinoma in situ

T1 Tumor invade a lâmina própria ou submucosa

T2 Tumor invade a muscular própria ou suberosa

T2a Tumor invade a muscular própria

T2b Tumor invade subserosa

T3 Tumor invade a serosa sem invadir estruturas adjacentes

T4 Tumor invade estruturas adjacentes

Linfonodos Regionais (pN)

NX Linfonodos regionais não podem ser avaliados

N0 Sem metástase para linfonodos regionais

N1 Metástase em 1 a 6 linfonodos regionais

N2 Metástase em 7 a 15 linfonodos regionais

N3 Metástase em mais de 15 linfonodos regionais

Metástase a Distância (pM)

MX Presença de metástase a distância não pode ser avaliada

M0 Sem metástase a distância

M1 Com metástase a distância

17

Essas classificações são meramente descritivas, não abrangendo os aspectos

etiológicos e anomalias genéticas (KUIPERS, 1999). Após a conclusão do projeto

genoma, a pesquisa médica do câncer tomou outro rumo, sendo importante hoje a

identificação dos genes envolvidos na tumorigênese, como eles interagem e quais os

papéis das proteínas por eles codificadas nas vias moleculares (RYU et al, 2003).

Desta forma, é possível identificar as particularidades de cada câncer e oferecer

tanto um diagnóstico quanto um tratamento personalizado de acordo com a genética

individual do paciente. Este trabalho investiga um gene que possa ter relação com o

CG, visando a soma de conhecimentos a respeito deste câncer e possíveis alvos

genéticos para tratamento.

1.3 TRANSFERASE-S DA GLUTATIONA (GST)

A Transferase-S da Glutationa ou Glutationa s-transferase (GST) é uma

proteína associada ao câncer, uma vez que protege os tecidos contra danos oxidativos,

tendo uma via de detoxificação para vários xenobióticos incluindo carcinogênicos

(PICKETT, 1989), está superexpresso em lesões preneoplásicas e neoplásicas

(HARRIES et al, 1997), e é relacionado com a resposta à quimioterapia (STRANGE

et al, 2000). Significa, portanto, um interessante alvo gênico para os estudos sobre o

câncer.

As GST são parte de um complexo grupo de proteínas com duas superfamílias

distintas: a citosólica e a associada à membrana. A superfamília GST, como são

denominadas as citosólicas, são solúveis e possuem 8 famílias: GSTA, M, P, S, T, Z,

O e K. As associadas à membrana são denominadas MAPEG (SHERRATT &

HAYES, 2001).

O metabolismo de químicos exógenos (carcinógenos, poluentes e drogas

anticâncer); detoxificação de componentes reativos endógenos (função anti-oxidante)

e síntese e inativação das prostaglandinas (SHERRATT & HAYES, 2001).

Recentemente, foi descoberto um papel não enzimático na sinalização celular,

regulando vias de proliferação e morte celular programada (LABORDE, 2010).

O metabolismo dos xenobióticos acontece em dois momentos ou fases. Na fase

I, são oxidados por enzimas específicas, aumentando sua reatividade e potencialidade

de interação. Na fase II, esta reatividade é equilibrada por enzimas que fazem a

18

conjugação entre substratos endógenos, como as glutationas. A quantidade final

efetiva de carcinógenos produzida depende da ação competitiva entre os mecanismos

de ativação e detoxificação, envolvendo as enzimas que tomam parte nessas vias

bioquímicas da célula (HAYES, 1995) (Figura 2).

Figura 2: Conjugação da glutationa (GSH) a um xenobiótico por ação da GST resultando na

formação da glutationa-S- conjugado (CORREIA, 2010).

Na fase I, compostos xenobióticos como as nitrosamidas, várias drogas

medicamentosas e os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAHs) são convertidos

a metabólitos altamente reativos pelas enzimas oxidativas, principalmente pelas

enzimas da superfamília do citocromo P-450 (CYPs). Assim, se introduz grupamentos

hidroxila ao substrato, aumentando a capacidade reativa e transformando um pró-

carcinógeno em carcinógeno. Como exemplo, o benzopireno é convertido em epóxido

de benzopireno, um composto altamente reativo.

Por outro lado, as reações da Fase II conjugam um substrato endógeno (como

glutationa, sulfato, glicose e acetato) através das glutationa-Stransferases (GSTs),

UDP-glucoroniltransferases e N-acetiltransferases (NATs), que agem então como

enzimas inativadoras dos produtos da Fase I, tornando tais metabólitos mais

hidrofílicos e, portanto, passíveis de excreção (UMENO et al., 1988; PERSSON et al.,

1993; BOIS et al., 1995; KROEMER & EICHELBAUM, 1995; RAUNIO et al.,

1995).

A proteína abordada especificamente neste estudo é a Glutathiona S-transferase

P1 (GSTP1), que além da supracitada função antioxidante, participa da sinalização

celular e da regulação das vias que controlam a proliferação celular e a apoptose. Ou

seja, GSTP também pode contribuir para o escape da célula da morte, por isso está

19

superexpressa em tumores resistentes às drogas, tendo em vista que algumas drogas

utilizam-se da via apoptótica para agir (LABORDE, 2010).

O gene GSTP1 pertence à classe pi da família gênica, localizada no

cromossomo 11q13, o único membro desta classe a ser expresso em humanos

(AUTRUP, 2000; HARRIS et al., 1998). Estende-se por 2.48kb de DNA e

compreende 7 éxons (MORROW et al, 1989 e BORA et al., 1997), os quais codificam

a enzima citosólica.

1.3.1 Polimorfismo do GSTP1

Nos últimos anos, SNPs ocuparam o lugar dos microssatélites como

marcadores em estudos do DNA humano (MILLER et al., 2005; SABETI et al., 2007).

Estudos recentes sugerem que a análise dos SNPs pode lançar luz na compreensão dos

mecanismos envolvidos na carcinogênese gástrica (EL-OMAR et al, 2001). Vários

xenobióticos que influenciam na etiologia de doenças são ativados ou desativados por

enzimas polimórficas, entre elas, as GSTs (DALY et al., 1993).

O presente trabalho aborda uma transição A-G (rs1695) no éxon 5 do gene

GSTP1, causando uma mudança do aminoácido Isoleucina para Valina no resíduo

105. Esta troca reduz a atividade catalítica dessa enzima (KATOH et al., 1999).

20

2. JUSTIFICATIVA

O Projeto Genoma transferiu as atenções para a variação genética individual e

sua capacidade de definir variabilidade em predisposição a doenças assim como um

novo alvo para tratamentos (DASGUPTA et al., 2003).

Diferenças interindividuais como essas em mecanismos celulares de ativação

ou detoxificação de químicos potencialmente carcinogênicos, podem conferir diversos

graus de susceptibilidade ao câncer (VAN IERSEL et al., 1999).

Informações obtidas a partir de estudos como este se referem à genética

populacional, e são importantes para o entendimento do genótipo de uma população de

um determinado local, sob determinadas influências do meio ambiente, podendo-se

inferir fatores e causas que levaram estes indivíduos a desenvolver o câncer em

questão.

21

3. OBJETIVOS

3.1 GERAL

Analisar a associação do polimorfismo genético do gene GSTP1 (rs1695) à

carcinogênese gástrica.

3.2 ESPECÍFICOS

o Identificar os genótipos e frequências gênicas de uma população de

indivíduos que desenvolveram câncer gástrico;

o Comparar os valores observados com os esperados, calculados através

do Equilíbrio de Hardy-Weinberg;

o Validar estatisticamente estas comparações utilizando o teste Qui-

quadrado;

o Interpretar se estes resultados significam associação entre o

polimorfismo e o desenvolvimento do câncer.

22

4. METODOLOGIA

4.1 ASPECTOS ÉTICOS

Atendendo à Resolução nº 196/96 do Conselho Nacional de Saúde (Ministério

da Saúde, 2003), que trata das normas para pesquisa envolvendo seres humanos, este

projeto foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (CEPHC-FMRP) e à Comissão Nacional de

Ética em Pesquisa (CONEP), em Brasília. O presente trabalho foi avaliado e aprovado

pelo CEPHC-FMRP sob o número 12479/2004 (Anexo I).

Os pacientes, ou seus responsáveis legais foram informados a respeito da

utilização das amostras e seu objetivo, tendo assinado um Termo de Consentimento

Livre e Esclarecido (TCLE). As amostras ocultam a identidade dos pacientes.

4.2 AMOSTRAS

Neste estudo foram analisadas 23 amostras de câncer gástrico do banco de

amostras do Laboratório de Biologia Molecular Estrutural e Oncogenética – LBMEO

(Tabela 2). Os indivíduos dos quais se retiraram amostras de câncer foram

diagnosticados com o tipo histopatológico intestinal, de acordo com a classificação de

Laurén (LAURÉN, 1965).

Tabela 2: Amostras de câncer gástrico do tipo intestinal e informações clínicas dos

pacientes diagnosticados.

Amostra Idade Sexo Estadiamento

3 72 Feminino T3N2

5 47 Masculino T3N2

6 42 Masculino T3N0

7 57 Masculino T2N2Mx


11 61 Feminino T3N1

12 49 Masculino T2N0



18 49 Feminino T2N0


23 73 Feminino T3N1



28 72 Feminino T3N0

29 64 Feminino T3N1

23





49 63 Feminino T3N1Mx



4.3 EXTRAÇÃO DO DNA

Os procedimentos de extração do DNA foram realizados no Laboratório de

Biologia Molecular Estrutural e Oncogenética (LBMEO), localizado ao Departamento

de Biologia Molecular (DBM) da Universidade Federal da Paraíba (UFPB), João

Pessoa, Paraíba.

Aproximadamente 1cm3 de tecidos neoplásicos foram macerados e

criopreservados em nitrogênio líquido a -196ºC. Após a pulverização, foram

centrifugadas (Figura 2) as amostras com 5 mL de tampão de extração (Tris 1M;

EDTA 0,5 M; NaCl 5 M), 50 µL de proteinase K (10 mg/mL) e 0,5 mL de SDS 20%

até obtenção de uma mistura homogênea. Posteriormente, incubou-se em banho-maria

a 37ºC overnite.

Figura 3: Centrífuga (Foto: Anísio Henriques, 2013)

Adicionou-se 5 mL de fenol/ clorofórmio/ álcool isoamílico (25:24:1) e

homogeneizou-se suavemente por cinco minutos. Esta solução homogênea foi

centrifugada a 3000 rpm durante 10 minutos, transferindo-se o sobrenadante para

24

outro tubo, adicionando-se 3 mL de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1) e

homogeneizando-se mais uma vez durante cinco minutos.

Por último, retirou-se o sobrenadante e adicionou-se 7.5 M de acetato de

amônio, equivalente a um terço do volume do sobrenadante e um volume de etanol

absoluto, correspondente a três vezes o volume do sobrenadante.

Agitou-se o frasco até a precipitação do DNA, este posteriormente lavado em

etanol absoluto e ressuspendido em 100-500 L de água Milli-Q estéril. Estocaram-se

as amostras a -20ºC.

4.4 VALIDAÇÃO IN SÍLICO

Para desenhar os primers, utilizou-se o banco de dados Ensembl Genome

Browser, disponível online, onde se encontra descrito o genoma humano. A

temperatura de anelamento, formação de estrutura secundária e tamanho do fragmento

amplificado foram analisados pelo programa Gene Runner (Versão 3.05, 1994

Hastings Software Inc.) (Tabela 3). Os dados foram enviados para síntese em

Integrated DNA Technologies - IDT®, Estados Unidos.

Tabela 3: Iniciadores utilizados para amplificação do fragmento específico em estudo (TA =

Temperatura de anelamento; TFA = Tamanho do fragmento amplificado; pb = Pares de bases).

Gene Sequências dos iniciadores TA (ºC) TFA (pb)

GSTP1

F1: 5’ -AGG ACC TCC GCT GCA AAT ACA- 3’

F2: 5’-AGG ACC TCC GCT GCA ATT ACG- 3’

R: 5’-GTG CCC AAC CCT GGT GCA- 3’

56ºC 71 pb

4.5 ALELO ESPECÍFICO PCR (AE-PCR)

A técnica AE-PCR consiste em desenhar iniciados específicos para os diferentes

polimorfismos, ela apresenta alta sensibilidade e pode ser usada para qualquer

polimorfismo de base única. No presente trabalho a técnica AE- PCR foi padronizada

para o polimorfismo do gene GSTP1 (rs1695) em amostras de câncer gástrico.

A reação da PCR-AE foi realizada em um volume final de 25 μL contendo 200

μM de dNTPs (deoxinucleotídeo trifosfato), 2.0 mM de MgCl2 (Cloreto de magnésio),

50 ng de DNA, 200 pM de cada oligonucleotídeo (primer) e 0.5U AmpliTaq GOLD

25

(Applied Biosystems, Foster City, CA). As condições da AE-PCR para amplificação

dos alelos serão as seguintes: uma desnaturação prévia por 5 minutos a 95ºC e 35

ciclos de 95°C por 1 minuto, 56°C por 1 minuto e 72°C por 40 segundos, com uma

extensão final de 5 min a 72°C, essa reação foi realizada no Termociclador Bio-Rad®

(Figura 4).

Figura 4: Termociclador Bio-Rad® (Foto: Anísio Henriques, 2013)

4.6 ELETROFORESE

O resultado da amplificação foi observado através da técnica de eletroforese

em gel de Poliacrilamida, na concentração de 8% a partir de uma solução de

acrilamida 30% (sistema 29:1), contendo tampão TBE 10x, persulfato de amônia e

Temed, a 20ºC, durante aproximadamente 1 hora a 100 Volts. Utilizou-se a Fonte Bio-

Rad® e Cuba Loccus® para Eletroforese no LBMEO (Figura 5).

Para revelação do gel, utilizou-se 50 mL de solução fixadora (etanol 18%;

ácido acético glacial 0,75%, concentrações finais) acrescida de 1 mL de solução de

Nitrato de Prata a 5% por 5 minutos; lavou-se o gel com água deslitada e por fim,

revelou-se em meio básico (NaOH 9%; formaldeído 0,3%, concentrações finais)

durante 5 minutos. O gel mostra bandas de peso molecular 71 pb (peso do fragmento)

onde a amplificação ocorreu com sucesso.

26

Figura 5: Fonte Bio-Rad® e Cuba Loccus® Biotecnologia para Eletroforese (Foto: Anísio

Henriques, 2013)

4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA

De acordo com o autor Mark Ridley (2006),

“O Teorema de Hardy-Weinberg depende de três prerrogativas

principais: ausência de seleção natural, cruzamentos aleatórios

e tamanhos populacionais grandes. Em uma população natural,

qualquer uma dessas três poderia ser falsa; não podemos

assumir que populações naturais estejam em equilíbrio de

Hardy-Weinberg. Na prática, podemos descobrir se uma

população está em equilíbrio para um loco simplesmente por

meio da contagem das frequências genotípicas.” (RIDLEY,

2006).

A fim de determinar se os resultados obtidos estão em equilíbrio, utilizou-se o

conceito de equilíbrio de Hardy-Weinberg, da genética de populações, com validação

dada pelo teste Qui-quadrado.

27

5 RESULTADOS

As amostras foram analisadas através da técnica PCR Alelo Específica,

utilizando-se três primers específicos, sendo um para a fita molde e os outros dois com

a modificação de um nucleotídeo referente ao polimorfismo. Foram analisadas 23

amostras de câncer, a distribuição genotípica foi AA = 8; AG = 15 e GG = 0 e as

frequências alélicas encontradas foram: p = 0,67 (frequência alélica de A) e q = 0,33

(frequência alélica de G). Através da análise estatística a população encontra-se em

equilíbrio de Hardy-Weinberg e o resultado não foi estatisticamente significativo para

associação do polimorfismo do gene GSTP1 (rs1695) ao desenvolvimento de câncer

gástrico (χ2 = 5,521) (Figura 6).

Amostra: 22 23 26 27 28

Genótipo: A G/ A G/A G/A G/ A G

Figura 6: Fotografia do Gel de Poliacrilamida das amostras 22, 23, 26, 27 e 28. Onde não

aparece a segunda banda, relativa ao alelo G, considera-se o genótipo homozigoto para AA.

71 pb

28

6 DISCUSSÃO

O câncer gástrico é a segunda causa de morte mais comum ao redor do mundo

(FERLAY et al, 2010). Embora o maior fator de risco ainda seja a infecção por H.

pylori, fatores ambientais e genéticos também contribuem para o desenvolvimento

desta neoplasia, que ocorre no estômago. O entendimento do metabolismo dos

xenobióticos trouxe possibilidades de associação da atividade catalítica envolvida

neste processo e a carcinogênese, uma vez que as enzimas de conjugação neutralizam

possíveis agentes mutagênicos. Uma dessas enzimas, a GSTP1, alvo deste trabalho, já

foi abordada em busca de associação com todos os tipos de câncer (WELFARE et al.,

1999; HONG et al., 2006; LEE et al., 2000 e PARK et al., 1999).

Os estudos envolvendo câncer e polimorfismos da enzima GSTP1, apresentam

resultados semelhantes aos deste trabalho, não mostrando associação entre o

polimorfismo e o desenvolvimento do câncer em questão. Um estudo de 2006 feito por

Hong et al., analisou o câncer gástrico e não mostrou diferenças significativas entre

casos e controles (HONG et al., 2006). Outros estudos abordando outros tipos de

câncer corroboram com este resultado, Park et al (1999), analisaram associação entre

polimorfismo de GSTP1 e câncer de boca. Gsur et al (2001), avaliaram associação do

polimorfismo do gene GSTP1 a desenvolvimento de câncer de próstata. Quanto a

susceptibilidade da presença de mutação polimórfica do gene GSTP1 em câncer

colorretal, Welfare et al (1999) não observaram diferença significativa entre os casos e

os controles.

Por outro lado, sempre que uma variável é adicionada, como o tabagismo, a

estatística tende a mostrar significância e associação entre o metabolismo dos

xenobióticos do cigarro e o aumento do risco de desenvolvimento do câncer, como

visto em Lee et al (2000) e Park et al (1999), que estudaram os cânceres de esôfago e

boca, respectivamente.

Outra forma de abordar uma associação seria estudar a variação da expressão e

função das proteínas entre os indivíduos e no mesmo indivíduo, inclusive. O fato de

não apresentar significância estatística não exclui completamente a possibilidade de

aquele polimorfismo exercer influência no desenvolvimento do câncer, já que os genes

podem contribuir de forma diferenciada na expressão das proteínas e estas trabalham

29

em associação com outras, podendo o erro está em qualquer parte do sistema ou até

mesmo em outro polimorfismo da mesma proteína.

O nosso resultado sugere que não há associação polimorfismo de GSTP1

estudado e aumento do risco de desenvolvimento de câncer gástrico, porém não é

conclusivo por um motivo: o tamanho amostral reduzido. No caso deste trabalho,

apenas 23 amostras de DNA representavam o câncer gástrico, o que significa muito

pouco para a estatística. Por outro lado, fazendo uma projeção percentual sobre os

resultados obtidos neste trabalho, vê-se que este estudo tem potencial, apresentando

uma tendência de significância em estudos que abordassem maior tamanho amostral.

30

7 CONCLUSÃO

A partir deste trabalho, conclui-se que o polimorfismo genético do gene

GSTP1 (rs1695) não está associado à carcinogênese gástrica nestes pacientes, pois se

encontram todos em equilíbrio de Hardy-Weinberg.

Entretanto, precisa-se observar que o tamanho amostral foi pequeno para uma

análise estatística. Portanto, este resultado não exclui completamente a possibilidade

destes genes exercerem influência na carcinogênese gástrica.

Para futuros estudos de associação entre polimorfismo e desenvolvimento de

câncer, recomenda-se um acréscimo de tamanho amostral e estudos funcionais das

enzimas codificadas pelos genes polimórficos, além de observar diferentes variáveis

como idade, sexo e tabagismo entre os pacientes da pesquisa.

31

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALBERTS, B. Et al. Biologia molecular da célula. 4ª edição, Porto Alegre: Artmed,

2004.

AMERICAN CANCER SOCIETY. Gastric Cancer. 2013

ASCANO, J. J., FRIERSON, H. JR, MOSKALUK, C. A., et al. Inactivation of the E-

cadherin gene in sporadic diffuse-type gastric cancer. Modern Pathology, v.14, p.942–

949, 2001.

AUTRUP, H. Genetic polymorphisms in human xenobiotica metabolizimg enzymes

as susceptibility factors in toxic response. Mutation Research, n.464, p.65-76, 2000.

BEVAN, S., HOULSTON, R.S. Genetic predisposition to gastric cancer (Mini-

review). Q J Med, v.92, p.5–10, 1999.

BOCCIA, S., A SAYED-TABATABAEI, F., PERSIANI, R., GIANFAGNA, F.,

RAUSEI, S., ARZANI, D., LA GRECA, A., D'UGO, D., LA TORRE, G., VAN

DUIJN, C. M., RICCIARDI, G. Polymorphisms in Metabolic Genes, their

Combination and Interaction with Tobacco Smoke and Alcohol Consumption and Risk

of Gastric Cancer: A Case-Control Study In An Italian Population. BioMedCentral

Cancer, n.7, v.206, p.1-8, 2007.

BERRINO, F., CAPOCACCIA, R., ESTEVE, J. Survival of Cancer Patients in

Europe: The EUROCARE-2 Study. IARC Scientific Publications, n.151, 1999.

BOIS, F.; KROWECH, G.; ZEISE, L. Modeling human interindividual variability in

metabolism and risk: the example of 4-aminobiphenyl. Risk Analysis, v.15, p.201-213,

1995.

BORA, P. S., GURUGE, B. L., MILLER, D. D. Human fatty acid ethyl ester

synthase-III gene: genomic organization, nucleotide sequencing and chromosomal

localization. Molecular Cell Biochemistry. n.173, p.145-151, 1997.

BRASIL. Instituto Nacional do Câncer (INCA), 2013.

BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Atenção à Saúde. Instituto Nacional de

Câncer. TNM: classificação de tumores malignos / traduzido por Ana Lúcia Amaral

Eisenberg. 6. ed. - Rio de Janeiro: INCA, 2004.

BREIVIK, J. The evolutionary origin of genetic instability in cancer development

(Review). Seminars in Cancer Biology, v.15, p.51-60, 2005.

BROOKES, A. J. The essence of SNPs. Gene, v.234, p.177–186, 1999.

CORREIA, F. M. R. P. Genes de Metabolismo de Genotóxicos: Papel na

Susceptibilidade e Tratamento do Cancro da Mama. 86 pg. Dissertação - Faculdade de

Medicina da Universidade de Coimbra. Portugal, 2010.

CREW, K.D.; NEUGUT, A. I. Epidemiology of gastric cancer. World Journal of

Gastroenterology, v.12, n.3, p.354-362, 2006.

32

DALY, A. K.; CHOLERTON, S.; GREGORY, W.; IDLE, J.R. Metabolic

polymorphisms. Pharmacology & Therapeutics.,v. 57, p.129-160, 1993.

DASGUPTA et. al. Polymorphic variation in GSTP1 modulates outcome following

therapy for multiple myeloma. Blood Journal, v.102, n.7, p.2345-2350, 2003.

DAVIS, P.; TAKESHI, S. The difference in gastric cancer between Japan, USA, and

Europe: what are the facts? What are the suggestions? Critical Reviews in

Oncology/Hematology, v.40, p.77–94, 2001.

DICKEN, B. J.; BIGAM D, L.; CASS, C.; MACKEY, J. R.; JOY, A. A.;

HAMILTON, S. M. Gastric Adenocarcinoma: Review and Considerations for Future

Directions. Annals of Surgery, v.241, n.1, 2005.

DIMITRIOS, H., ROUKOS, M. D., NIKI, J., AGNANTIS, M. D., MICHAEL, M. D.,

ANGELOS, M., KAPPAS, M. D. Gastric Cancer: Introduction, Pathology,

Epidemiology (Mini review). Gastric Breast Cancer, n.1, v.1, p.1-3, 2002.

DUSSAULX-GARIN, L., BLAYAU, M., PAGENAULT, M., et al. A new mutation

of E-cadherin gene in familial gastric linitis plastica cancer with extradigestive

dissemination. European Journal of Gastroenterology & Hepatology, v.13, p.711–

715, 2001.

EL-OMAR, E. M., CHOW, W. H., RABKIN, C.S. Gastric cancer and H. pylori: Host

genetics open the way. Gastroenterology, v.4, n.121, p.1002-1004, 2001.

ESTADOS UNIDOS. National Cancer Institute. Gastric cancer treatment, 2010.

GONZALEZ, C. A., SALA, N., CAPELLA, G. Mini Review: Genetic Susceptibility

and Gastric Cancer Risk. International Journal of Cancer, n.100, p.249–260, 2002.

GORE, R. Gastrointestinal cancer. Radiologic Clinics of North America. V.35, p.295–

310, 1997.

GSUR, A., HAIDINGER, G., HINTEREGGER, S., BERNHOFER, G., SCHATZ, G.,

MADERSBACHER, S., MARBERGER, M., VUTUC, C., MICKSCHE, M..

Polymorphisms of glutathione-S-transferase genes (GSTP1, GSTM1 and GSTT1) and

prostate-cancer risk. International Journal of Cancer, v.95, n.3, p.152–155, 2001.

GUNDERSON, L. L., DONOHUE, J. H., ALBERTS, S. R. Cancer of the stomach. In:

Abeloff MD, et al., eds. Abeloff's Clinical Oncology. 4th ed. Philadelphia, Pa:

Saunders Elsevier;2008:chap 79.

FAIVRE, J.; FORMAN, D.; ESTEVE, J.; GATTA, G. Survival of patients with

oesophageal and gastric cancers in Europe. Europe Journal of Cancer, v.34, p.2167-

2175, 1998.

FENOGILO-PREISER, C., CARNEIRO, F., CORREA, P., et al. Gastric carcinoma.

In: Hamilton S, Aaltonin L, eds. Pathology and Genetics. Tumors of the Digestive

System, vol 1. Lyon, France: Lyon Press, p.37–52, 2000.

FERLAY, J., SHIN, H. R., BRAY, F., FORMAN, D., MATHERS C., PARKIN D. M.

Cancer Incidence and Mortality Worldwide. IARC CancerBase n.10, v.1.2, 2010.

33

HANAHAN, D., WEINBERG, R. A., The Hallmarks of Cancer. Cell, v.100, p.57-70,

2000.

HARRIES, L. W., STUBBINS, M. J., FORMAN, D., HOWARD, G. C. W., WOLF,

C. R. Identification of Genetic Polymorphisms at the Glutathione S-transferase Pi

Locus and Association with Susceptibility to Bladder, Testicular and Prostate Cancer.

Carcinogenesis, v.18, n.4, p.641–644, 1997.

HARRIS, M. J., COGGAN, M., LANGTON, L., WILSON, S. R., BOARD, P. G.

Polymorphism of the Pi class glutathione S-transferase in normal populations and

cancer patients. Pharmacogenetics, v.8, n.1, p.27-31, 1998.

HAYES, R. B. Genetic susceptibility and occupational cancer. La Medicina del

lavoro., v,86, p.206-213, 1995.

HUNTSMAN, D. G.; CARNEIRO, F.; LEWIS, F. R., et al. Early gastric cancer in

young, asymptomatic carriers of germ-line E-cadherin mutations. The New England

Journal of Medicine, v.344, p.1904 –1909, 2001.

KARPEH, M., BRENNAN, M. Gastric carcinoma. Annals of Surgical Oncology, v.5,

p.650– 656, 1998.

KASSAB, P.; LEME, P. L. S. Revista da Associação Médica Brasileira, v.49, n.3,

p.225-43, 2003.

KATOH, T., KANEKO, S., TAKASAWA, S., NAGATA, N., INATOMI, H.,

IKEMURA, K., ITOH, H., MATSUMOTO, T., KAWAMOTO, T., BELL, D. A.

Human glutathione S-transferase P1 polymorphism and susceptibility to smoking

related epithelial cancer; oral, lung, gastric, colorectal and urothelial cancer.

Pharmacogenetics, v.9, n.2, p.165-169, 1999.

KROEMER, H.; EICHELBAUM, M. Molecular bases and clinical consequences of

genetic cytochrome P450 2D6 polymorphism. Life Sciences, v.56, p.2285-2298, 1995.

KUIPERS, E. J. Review article: exploring the link between Helicobacter pylori and

gastric cancer. Alimentary Pharmacology & Therapeutics, n.1, v.13, p.3-11, 1999.

LA VECCHIA, C., NEGRI, E., FRANCESCHI, S., et al. Family History and the Risk

of Stomach and Colorectal Cancer. Cancer, n.70, p.50 –55, 1992.

LABORDE, E. Glutathione transferases as mediators of signaling pathways involved

in cell proliferation and cell death (Review). Cell Death and Differentiation, v.17,

p.1373–1380, 2010.

LAURÉN, P. The two histological main types of gastric carcinoma: diffuse and so-

called intestinal-type carcinoma. Acta Pathologica et Microbiologica Scandinavica,

n.64, p.31-49, 1965.

LEE, J.-M., LEE, Y.-C., YANG, S.-Y., SHI, W.-L., LEE, C.-J., LUH, S.-P., CHEN,

C.-J., HSIEH, C.-Y., WU, M.-T.. Genetic Polymorphisms Of P53 And GSTP1,But

Not NAT2,Are Associated With Susceptibility To Squamous-Cell Carcinoma Of The

Esophagus. International Journal of Cancer, v. 89, n.5, p.458–464, 2000.

34

MACHADO, J., SOARES, P., CARNEIRO, F., et al. E-cadherin gene mutations

provide a genetic basis for the phenotypic divergence of mixed gastric carcinomas.

Laboratory Investigation, v.79, p.459–465, 1999.

MILLER R. D et al. High-density single-nucleotide polymorphism maps of the human

genome. Genomics, v.86, p.117–126, 2005.

MORROW, C. S., COWAN, K. H, GOLDSMITH, M. E. Structure of the human

genomic glutathione S-transferase-pi gene. Gene, n.75, p.3-11, 1989.

MULLIS, K., FALOONA, F., SCHARF, S., SAIKI, R., HORN, G., ERLICH, H.

Specific Enzymatic Amplification of DNA in Vitro: The Polymerase Chain Reaction.

Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, v.51, 1986.

PARK, J. Y., SCHANTZ, S. P., STERN, J. C., KAUR, T., LAZARUS, P. Association

between glutathione S-transferase pi genetic polymorphisms and oral cancer risk.

Pharmacogenetics, v.9, n.4, p.497-504, 1999.

PERSSON, I.; JOHANSSON, T.; BERGLING, H.; DAHL, M.L.; SEIDEGARD, J.;

RYLANDER, R.; RANNUG, A.; HÖBERG, J.; SUNDBERG, M.I. Genetic

polymorphism of cytochrome P450 2E1 in a Swedish population. Relationship to

incidence of lung cancer. FEBS Letters, v.319, p.207-211, 1993.

PICKETT, C. B. Glutathione S-Transferases: Gene Structure, Regulation and

Biological Function. Annual Reviews of Biochemistry, n.58, p.743-764, 1989.

PRANKIN, D.; WHELON, S.; FERLAY, J.; et al. Cancer Incidence in Five

Continents. Lyon, France: IARC Press; 1997.

RAMON, J. M., SERRA, L., CERDO, C., et al. Dietary factors and gastric cancer risk.

A case–control study in Spain. Cancer, v.71, p.1731–1735, 1993.

RAUNIO, H.; HUSGAFVEL-PURSIANEN, H.; ANTILLA, S.; HIETANEN, E.;

HIRVONEN, A.; PELKONEN, O. Diagnosis of polymorphism in carcinogen-

activating and inactivating enzymes and cancer susceptibility - a review. Gene, v.159,

p.113-121, 1995.

RIDLEY M. Evolução. 3a. ed. Porto Alegre: Artmed Editora, 2006.

RUSTGI, A. K. Neoplasms of the stomach. In: Goldman L, Ausiello D, eds. Cecil

Medicine. 23rd ed. Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier; 2007:chap 202.

RYU, J-W., KIM, H-J., LEE, Y-S., MYONG, N-H., HWANG, C-H., LEE, G-S.,

YOM, H-C. The Proteomics Approach to Find Biomarkers in Gastric Cancer. Journal

of Korean Medical Science, v.18, p.505-509, 2003.

SABETI, P. C., VARILLY, P., FRY, B., LOHMUELLER, J., HOSTETTER, E.,

COTSAPAS, C., X. XIE, E.H. BYRNE, S.A. MCCARROLL, R. GAUDET, S.F.

SCHNAFFER, E.S. LANDER, T.I.H. Consortium Genome-wide detection and

characterization of positive selection in human populations. Nature, v.449, p.913–

919, 2007.

35

SADOWSKI, D. C.; RABENECK, L. Gastric ulcers at endoscopy: brush, biopsy, or

both? The American Journal of Gastroenterology, v.92, p.608–613, 1997.

SHEEHAN, D., MEADE, G., FOLEY, V. M., DOWD, C. A. Structure, Function and

Evolution of Glutathione Transferases: Implications for Classification of Non-

Mammalian Members of an Ancient Enzyme Superfamily. Biochemestry Journal,

v.360, p.1-16, 2001.

SHERRATT, P. J., HAYES, J. D. Glutathione S-transferases. Enzyme Systems that

Metabolise Drugs and Other Xenobiotics, University of Dundee, UK, 2001.

STRANGE, R. C., JONES, P. W., FRYER, A. A. Glutathione S-transferase: genetics

and role in toxicology. Toxicology Letters, 112–113, p. 357–363, 2000.

TOWNSEND, D. M., MANEVICH, Y., HE, L., HUTCHENS, S., PAZOLES, C. J.,

TEW, K. D. Novel Role for Glutathione S-Transferase: Regulator of Protein S-

Glutathionylation Following Oxidative and Nitrosative Stress. Journal of Biological

Chemistry, v.284, n.1, p.436-445, 2009.

UMENO, M. MCBRIDE, O.; YANG, C.; GELBOIN, H.; GONZALEZ, F. Human

ethanolinducible P450IIE1: complete gene sequence, promoter characterization,

chromosome mapping and Cdna-directed expression. Biochemistry, v.27, p.9006-

9013, 1988.

VAN IERSEL, M. L., VERHAGEN, H., van BLADEREN, P.J. The role of

biotransformation in dietary (anti)carcinogenesis. Mutation Research, v.443, p.259-

270, 1999.

WEINBERG, R. A. A Biologia do Câncer. Porto Alegre: Artmed, 2008.

WELFARE, M., ADEOKUN, A. M., BASSENDINE, M. F., DALY, A. K..

Polymorphisms in GSTP1, GSTM1, and GSTT1 and Susceptibility to Colorectal

Cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Preview, 1999.

36

ANEXO

37

ANEXO 1: Reprodução do ofício de aprovação do trabalho de pesquisa pelo Comitê

de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto (CEPHC-FMRP) e Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP), em

Brasília. O presente trabalho foi avaliado e aprovado pelo CEPHC-FMRP sob o

número 12479/2004.

Documents

ANÁLISE DE POLIMORFISMO DO GENE GSTP1 EM CÂNCER … · Após o diagnóstico, o câncer é classificado de acordo com o tecido de origem, podendo ser Carcinoma (células epiteliais),