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ANÁLISE IN SILICO PARA PROPOSIÇÃO DE INICIADORES EM DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE Campylobacter jejuni
Autores:
CÉSAR AUGUSTO DA SILVA1, LEANDRO ZAMPROGNA DOS SANTOS2 e
ALESSANDRO AFORNALI3.
1- Acadêmico do Curso Superior de Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia da
Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR).
2- Acadêmico do Curso Superior de Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia da
Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR).
3- Biólogo Mestre em Biologia Celular e Molecular e Especialista em Genética Humana.
Especialista Biomolecular do Laboratório de Biologia Molecular do O Boticário; Professor
Orientador Adjunto Mestre da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR)
Endereço eletrônico para correspondência: Alessandro Afornali, [email protected]
Endereço: João Obrzut, 283, São Bráz - Curitiba-PR
CEP: 82.300-310 Telefone: (41) 8849-9009
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RESUMO
O gênero Campylobacter tem grande impacto na saúde pública, principalmente pelo
fato das suas espécies serem patógenas em seres humanos. Elas podem ser encontradas em
água, alimentos e no trato intestinal de animais. A espécie Campylobacter jejuni compreende
a principal causa de gastroenterite humana e está relacionada a duas síndromes emergentes: a
síndrome de Guillain-Barré e a síndrome paralítica chinesa. Este estudo compreendeu o uso
de análise computacional (in silico) para propor iniciadores (primers) específicos para C.
jejuni, de forma que, através do método de amplificação pela reação em cadeia da polimerase
(PCR), seja possível a obtenção de um produto específico propondo um diagnóstico rápido e
preciso. As seqüências de primers foram obtidas através do programa Primer-BLAST, o qual
gerou cinco pares de oligonucleotídeos iniciadores. Após serem projetados, foram feitas
buscas no programa BLAST para comprovar sua seletividade, o que foi um sucesso. Em
seguida, foram feitos testes para a formação de Hairpin e dímeros no programa OligoAnalyzer
3.1, os quais demonstraram baixas probabilidades de ocorrem tais fenômenos. Com todos os
resultados obtidos, pode-se concluir que o par de iniciadores mais promissor para que sejam
feitos testes em PCR é o par 1, podendo agora ser realizados testes laboratoriais a partir dessa
seqüência, possibilitando assim um diagnóstico específico e seguro.
Palavras chave: Campylobacter jejuni, diagnóstico, biologia molecular, bioinformática
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ABSTRACT
The genus Campylobacter is of great public health impact, mainly because of its
species are pathogenic in humans. They can be found in water, food and the intestinal tract of
animals. The species Campylobacter jejuni comprises the main cause of human gastroenteritis
and is related to two emerging syndromes: Guillain-Barre Syndrome and Chinese paralytic
syndrome. This study involved the use of computational analysis (in silico) to propose
primers (primers) specific for C. jejuni, so that, by the method of amplification by polymerase
chain reaction (PCR), it is possible to obtain a specific product offering a quick and accurate
diagnosis. The primer sequences were obtained from Primer-BLAST program, which
generated five pairs of primers. After being designed, searches were made in the BLAST
program to verify its selectivity, which was a success. They were then tested for the formation
of dimers in the program and Hairpin OligoAnalyzer 3.1, which showed low probability of
such phenomena occur. With all the results obtained, it can be concluded that the most
promising pair of primers for PCR tests are made is the pair 1, can now be carried out
laboratory tests from this sequence, allowing a specific diagnosis and safe.
Keywords: Campylobacter jejuni, diagnosis, molecular biology, bioinformatics.
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1. INTRODUÇÃO
As bactérias do gênero Campylobacter vêm ganhando destaque como um problema de
saúde pública nos últimos 30 anos. Atualmente sabe-se que estas bactérias são uma das
principais causas de doenças bacterianas adquiridas pela ingestão de alimentos contaminados,
acometendo aproximadamente 1% de toda população dos Estados Unidos, e estima-se que a
incidência seja subestimada devido à natureza autolimitada das manifestações clínicas mais
usuais e a falta de notificação das infecções causadas. Estima-se uma grande perda anual de
faturamento por afastamento do trabalho ou com tratamento acarretado por este patógeno,
pela grande freqüência com que ocorrem em muitos países desenvolvidos (FRIEDMAN et al.,
1998). No Brasil, pela brusca diferença social, as parasitoses intestinais constituem um
problema na saúde devido à falta de acesso ao saneamento básico e condições
socioeconômicas precárias de uma boa parte da população (MELO, 2007).
O gênero Campylobacter engloba 24 espécies, 9 subespécies e 32 cepas, das quais a
Campylobacter jejuni, Campylobacter coli e Campylobacter lari pertencem ao grupo de
bactérias denominadas termofílicas, sua temperatura ótima de incubação oscila entre 42º C e
43º C, e as espécies C. jejuni e C. coli constituem-se nas espécies mais freqüentes de enterites
humanas. A Campylobacter jejuni predominantemente causa gastroenterite em animais e
humanos, mas infecções ocorrendo durante a gestação podem induzir a abortamentos,
natimortos, prematuros e sepsis neonatais (SCARCELLI et al., 1998).
Os quadros clínicos de gastroenterites mais comuns são causados pelas infecções da
Campylobacter e são determinadas quase sempre pela C. jejuni. Inicia-se com febre, cefaléia,
dores musculares, mal-estar e dor abdominal com cólicas em volta do umbigo, que podem ser
confundidos com os sintomas da apendicite. As infecções mais leves duram somente um a
dois dias e podem ser confundidas com doenças virais. Os sintomas por infecção de
Campylobacter podem permanecer por semanas determinando quadros sintomáticos,
recuperações espontâneas e recaídas até a cessação (COX, 2002). A maioria das infecções
causadas por Campylobacter são auto-limitadas e não requerem um tratamento específico.
Nos casos de bacteremia, de infecções prolongadas ou de complicações relacionadas com o
paciente faz-se necessária a antibiótico terapia, sendo as drogas de escolha eritromicina,
amoxacilina, fluoroquinolona ou tetraciclina. Porém, desde de 1990 são reportados casos de
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resistência a antibacterianos em cepas de Campylobacter, tornando importante a análise do
perfil de resistência para um tratamento eficaz (CEFAR, 2006).
A C. jejuni está entre as causas mais comuns de diarréia encontradas no homem,
podendo ser encontrada em certas regiões com mais intensidade do que as bactérias do gênero
Shigellas e as do gênero Salmonellas juntas (CAVIÚNAS, 2003), entre as vítimas a maioria
são crianças abaixo dos dois anos de idade, e as infecções que ocorrem durante a gestação
podem chegar a induzir a abortamentos e natimortos, sendo a terceira causa de morte por
infecções alimentares em recém nascidos, seguido das bactérias dos gêneros Salmonella e
Listeria (SCARCELLI et al., 1998).
Sua transmissão ao homem ocorre pelos animais (zoonose), os pássaros tanto os
silvestres como os domésticos, os hamsters, os cães, as aves aquáticas, os frangos, os porcos,
os carneiros e as cabras são hospedeiros de Campylobacters. O feto pode ser contaminado
durante o parto pela mãe portadora. Elas vivem perfeitamente bem no meio gastrointestinal,
tanto aerobicamente como anaerobicamente (CAVIÚNAS, 2003).
A contaminação ocorre pela ingestão de produtos animais, entre os principais alimentos
estão à carne de frango e o leite, também pelo contato com animais (principalmente animais
jovens), até o feto animal pode ser contaminado durante o parto da mãe portadora (SUZUKI
& YAMAMOTO, 2008)
A C. jejuni é a mais freqüente e mais patogênica em comparação com a C. coli, a qual
não tem patogenicidade bem definida, apesar das duas serem reconhecidas como causas de
gastroenterite em humanos, observa-se que no caso especifico da C. jejuni, a dose infectante é
relativamente baixa (500 a 10.000 bactérias) o que facilita a disseminação desta bactéria
(BAKER, PAREDES, QURESHI, 1987).
Pesquisas recentes apontam a infecção por C. jejuni a duas doenças neurológicas
emergentes: síndrome de Guillain-Barré (GBS) e a síndrome paralítica chinesa, mais
recentemente denominada de neuropatia axonal motora. A doença é caracterizada por um
rápido início de debilidade física simétricos que progride ao longo do dia e em até 4 semanas
e ocorre em pacientes de todas as idades. A maioria dos pacientes que desenvolvem essa
síndrome também têm distúrbios sensoriais como formigamentos e transtornos de sentimentos
e aborrecimento (ALTEKRUSE et al., 1999; VAN DOORN, 2009). Na pesquisa realizada as
análises sorológicas realizadas no Japão levantou que 35% dos pacientes com GBS tinham
sido infectados recentemente, sugerindo que os anticorpos dirigidos contra determinados
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sorotipos de C. jejuni reagem cruzadamente com as proteínas dos nervos periféricos,
causando a sua degeneração (ALTEKRUSE et al., 1999).
O controle da disseminação das infecções por Campylobater é aparentemente fácil.
Como principal modo de transmissão é o fecal-oral: saída de parasitoses pelas fezes,
contaminação do meio-ambiente e entrada pela boca (CAVIÚNAS, 2003). Princípios básicos
de higiene e saneamento básicos são suficientes para evitar este problema (SCARCELLI &
PIATTI, 2002).
A Campylobacter pode ser cultivada em laboratório usando meios de cultura
adequados, visualizada no microscópio com técnicas de coloração especiais e identificada por
alguns testes sorológicos e pelo DNA. Em meio adequado as colônias desenvolvem-se em 72
a 96 horas a 37-42 ºC (FRANCO E LANDGRAF, 1996).
Atualmente existem trinta e cinco (35) projetos genomas para as bactérias do gênero
Campylobacter. Destes, onze genomas completos já estão disponíveis no banco de dados de
seqüências no GenBank para consulta e análise, incluindo a espécie C. jejuni, treze projetos
estão em fase de montagem, incluindo C. coli, dez projetos estão em processo de
seqüenciamento e um projeto que envolve comparação dos genes de virulência e diferenças
estruturais dos genomas das bactérias do gênero Campylobacter.
A bioinformática é uma grande aliada nas pesquisas de biologia molecular. Este
instrumento é capaz de proporcionar análises mais velozes na análise de DNAs diferentes e no
processo comparativo de variabilidades e na previsão de resultados de análises
(GASPARINO, 2008). As ferramentas da bioinformática mais utilizadas são os bancos de
dados e programas computacionais disponíveis na internet, ponto de partida na análise de
seqüências de DNA (BAYAT, 2002).
Os dados disponíveis nestes bancos de seqüências, potencialmente servem para análises
comparativas robustas e específicas na tentativa de se buscar genes marcadores para um
diagnóstico mais preciso. A detecção e diferenciação entre as duas espécies fazem-se
necessárias, pois ainda não se sabe ao certo sobre a patogenicidade da C. coli, existem casos
registrados isolados, sendo que sua diferenciação para a espécie patogênica C. jejuni constitui
um diferencial para tratamentos mais rápidos e eficazes, o que é de grande importância
clínica.
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A maioria dos testes diagnósticos envolve meios de cultura para crescimento celular,
tornando o trabalho muito laboroso e demorado, poucos trabalhos oferecem uma metodologia
mais simplificada e objetiva (FONSECA et al., 2007).
O presente estudo teve como objetivo desenvolver um método de diagnóstico para
Campylobacter jejuni por intermédio de ferramentas de biologia molecular definindo regiões
específicas de DNA genômico passíveis de serem amplificadas através da PCR. Esse estudo
foi realizado através de testes in sílico, que permitiram desenhar 5 pares de oligonucleotídeos
iniciadores através do programa Primer- BLAST, a partir da seqüência gênica selecionada.
Logo após serem projetados, os pares de iniciadores passaram por testes em outros programas
para que pudessem avaliar sua eficiência.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
O trabalho foi constituído por análise computacional (in silico) compreendendo buscas
em bancos de dados de seqüências gênicas no GenBank do National Center for Biotechnology
Information, National Institutes of Health, USA - NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) por
genes que estivessem presentes na espécie em estudo (C. jejuni), porém escolhendo
seqüências que pudessem diferi-la de outras espécies do gênero. Nessa pesquisa foi utilizada a
cepa Campylobacter jejuni RM1221.
2.1 Escolha do gene de interesse
Para a escolha das seqüências foram estabelecidos alguns critérios. Não poderiam ser
utilizadas seqüências de DNA muito semelhantes ao DNA humano, ao DNA da
Campylobacter coli e a outras bactérias que habitassem ou infectassem o organismo humano,
pois seqüências muito semelhantes poderiam gerar um resultado falso positivo em uma
análise de PCR.
O gene selecionado na pesquisa foi um codificador de proteína ribossomal com um
tamanho de 831 pares de base (pb), o qual está contido entre as bases 1753925-1754755 do
genoma da Capylobacter jejuni RM1221. Seu GeneID é 3232499 e o código de referência da
seqüência no banco de dados do NCBI NC_003912.7. Ele foi utilizado para todas as análises
realizadas.
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2.2 Desenho dos oligos
Iniciadores (primers) específicos para Campylobacter jejuni foram projetados através de
um programa na tentativa de se obter o melhor desempenho na reação desencadeada pela
polimerase para os produtos estabelecidos. O programa utilizado para esta função foi o
Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Através desse programa,
foram desenhados 5 pares de iniciadores, os quais variam de 19bp à 21bp e geram produtos
com tamanhos que variam de 555pb à 594pb (Figura 1).
2.3 Análise de viabilidade dos iniciadores
Os iniciadores passaram por diversos testes in silico para a comprovação de sua
eficiência. Após seleção dos iniciadores utilizando o programa Primer-Blast, adotando o
critério de checagem para DNA humano, foi conduzida uma avaliação utilizando o programa
BLAST. Através desta busca foi possível analisar a especificidade dos iniciadores á espécie
em questão. Após essa etapa, os iniciadores foram submetidos individualmente e com o seu
par ao programa chamado OligoAnalyzer 3.1, que tem por finalidade a análise de outros
fatores, como o dobramento de iniciadores (Hairpin), formação de dímeros e análise de
estrutura secundária. Esta análise pode revelar possíveis problemas que os iniciadores teriam
caso fossem escolhidos para a reação de PCR.
3. RESULTADOS
Com a comparação feita contra todo o banco de dados utilizando o Nucleotide Blast
foi comprovada a seletividade de cada um dos pares de iniciadores, uma vez que nenhum
deles anelou com outra espécie com um índice superior a 18 pares de base. A espécie com a
maior similaridade foi a Propionibacterium acne, um bacilo anaeróbio Gram-positivo
pertencente à microbióta humana, habitando o folículo piloso (BRAGA, 2004). Dessa forma é
reduzida, de maneira drástica, a possibilidade de um resultado falso positivo em uma análise
de PCR para o diagnóstico da C. jejuni, uma vez que os iniciadores não se anelariam
facilmente com outra fita de DNA que não fosse o gene de interesse.
As análises feitas no programa OligoAnalyser 3.1 obtiveram resultados bem
satisfatórios. Nos testes para formação de estrutura secundário tipo Hairpin, não houve um
aparelhamento de bases intramoleculares superior a quatro pares simultâneos, observado no
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iniciador anterógrado do par 2 (Figura 2) e no iniciador retrógrado do par 4 (Figura 3). Na
análise de formação de dímeros, também não houve nenhum caso que o aparelhamento de
bases tenha superado quatro pares de base, como foi observado no iniciador anterógrado do
par 5 (Figura 4) na análise de homodímeros (dímeros formados pelo aparelhamento de bases
de dois ou mais iniciadores idênticos), e no par 4 (Figura 5) na análise de heterodímeros
(dímeros formados pelo aparelhamentos das bases dos iniciadores anterógrado e retrógrado),
o que de maneira geral é um bom resultado. Através dos testes feitos no OligoAnalyser 3.1 foi
possível observar as possibilidades de formação de estrutura secundária que poderiam ocorrer
e causar perda de funcionalidade na reação de PCR. Observaram-se índices baixos para
ocorrência de formação de hairpin e dímeros, demonstrando que as sugestões para uso dos
iniciadores se encontram adequados a futuros testes de padronização para diagnóstico de C
jejuni.
Como todas as análises in silico realizadas, pode-se concluir de maneira geral, que o
melhor par de iniciadores para que sejam feitos testes para a amplificação de seqüências em
PCR é o par de iniciadores 1. Essa escolha se deve pelo fato dele possuir uma maior
seletividade com a espécie Campylobacter jejuni, abrangendo um maior número de cepas dela
simultaneamente e ao mesmo tempo tendo baixa similaridade com outras espécies (Figura 6),
e por possuir uma baixa probabilidade da ocorrência do fenômeno hairpin (Figura 7) e da
formação de dímeros tanto para homodímeros (Figura 8) quanto para heterodímeros (Figura
9), os quais poderiam gerar um resultado falso negativo em uma PCR, já que perderiam a sua
função.
4. CONCLUSÃO
Com os testes realizados nos pares de oligonucleotídeos iniciadores, pode-se conferir a
seletividade deles através do programa Nucleotide Blast, os quais não anelaram com outras
espécies com mais de 90% de parelhamento. Também foi possível avaliar a eficiência deles
através dos testes no programa OligoAnalyzer 3.1, onde nenhum apresentou uma alta
ocorrência do fenômeno hairpin e na formação de dímeros. Em todos os testes, o par de
iniciadores que apresentou os melhores resultados foi o par 1.
Este trabalho demonstrou a necessidade no uso de técnicas moleculares que podem ser
abrangidas como um método de diagnóstico epidemiológico, auxiliando principalmente nos
casos duvidosos para a obtenção de um diagnóstico mais preciso.
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O uso de primers específicos é de fundamental importância na amplificação da
seqüência desejada. Essa pesquisa demonstrou 5 pares de oligonucleotídeos iniciadores
através do programa Primer-BLAST da bioinformática, podendo agora ser realizados testes
laboratoriais a partir das seqüências propostas, possibilitando assim, a diferenciação das
espécies em um teste de PCR, contribuindo para um diagnóstico mais específico e seguro.
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Figuras:
Fig 1 - Lista dos iniciadores gerados através do Primer-BLAST
12
Fig 2 - Hairpin observado no iniciador anterógrado do par 2
Fig 3 - Hairpin observado no iniciador retrógrado do par 3
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Fig 4 - Análise de homodímeros do iniciador anterógrado do par 5
Fig 5 - Análise de heterodímeros do par 4
14
Fig 6 - Análise do par de iniciadores 1 no Nucleotide Blast
Fig 7 – Fenômeno Hairpin observado no par de iniciadores 1
15
Fig 8 – Análise de formação de homodímeros no par de iniciadores 1
Fig 9 – Análise de formação de heterodímeros no par de iniciadores 1
