Análise de variantes do gene CDKN1C e pré-eclâmpsialivros01.livrosgratis.com.br/cp136076.pdf · Murilo Racy Soares Análise de variantes do gene CDKN1C e pré-eclâmpsia Dissertação

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

Murilo Racy Soares

Análise de variantes do gene CDKN1C e

pré-eclâmpsia

Ribeirão Preto

2010

Livros Grátis

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Milhares de livros grátis para download.

Murilo Racy Soares

Análise de variantes do gene CDKN1C e

pré-eclâmpsia

Dissertação apresentada ao

Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

para obtenção do Título de Mestre em

Biologia da Reprodução.

Área de Concentração: Ginecologia e Obstetrícia

Orientadora: Profa. Dra. Ester Silveira Ramos

Ribeirão Preto

2010

AUTORIZO A DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR

QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO

E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca Central do Campus Administrativo de Ribeirão Preto/USP

Soares, Murilo Racy. Análise de variantes do gene CDKN1C e pré-eclâmpsia / Murilo Racy Soares;

orientadora: Profa Dra Ester Silveira Ramos. - Ribeirão Preto, 2010.

104p. il.; 30 cm.

Dissertação (Mestrado – Programa de Pós-graduação em Biologia da Reprodução), Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Orientadora: Ramos, Ester Silveira

Título em inglês: Variation assay of CDKN1C gene and pre-eclampsia.

1. Imprinting genômico. 2. gene CDKN1C. 3. síndromes hipertensivas gestacionais. 4. pré-eclâmpsia. 5. polimorfismos. 6. variantes.

FOLHA DE APROVAÇÂO Murilo Racy Soares Análise de variantes do gene CDKN1C e pré-eclâmpsia.

Área de Concentração: Ginecologia e Obstetrícia

Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo

para obtenção do Título de Mestre em Biologia da Reprodução.

Área de Concentração: Ginecologia e Obstetrícia Aprovado em ____/____/_____

Banca examinadora

Prof. Dr. _______________________________________________________

Instituição___________________________ Assinatura__________________

Prof. Dr. _______________________________________________________


Prof. Dr. _______________________________________________________


AGRADECIMENTOS

Primeiramente a toda minha família, especialmente aos meus pais Ademilson e Elisabet que

sempre fizeram tudo por mim e pelo amor incondicional.

A minha orientadora, Profa. Dra. Ester Silveira Ramos pela dedicação, confiança,

oportunidade, paciência e por ter sempre acreditado em mim.

Ao Prof. Dr. Geraldo Duarte pelos grandes ensinamentos e sabedoria e por permitir que

esse trabalho fosse feito.

A Francielle Marques Araujo por ter coletado todas as amostras e tornar esse trabalho real e

possível. Obrigado Fran!

A todo o Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da FMRP, em especial as “meninas” da

secretaria e a todos os professores que tive a honra de conhecer.

Ao Departamento de Genética da FMRP pelo fundamental apoio.

A TODOS os professores, funcionários, alunos (os que já passaram e os aqui presentes) e

amigos do BLOCO C.

A todos os amigos da minha vida dentro e fora da universidade.

A Carla Martins Kaneto, ao Prof. Dr. Wilson Araújo da Silva Junior, a Cristiane Ayres

Ferreira e a Adriana Marques pela disponibilidade e a realização dos seqüenciamentos no

Laboratório de Genética Molecular e Bioinformática (LGMB) da FMRP-USP e na Fundação

Hemocentro da FMRP-USP. Muito obrigado!

A Profa. Dra. Maria Helena de Souza Goldman e a Dra. Andréa Carla Quiapim pela

realização dos seqüenciamentos no Laboratório De Biologia Molecular de Plantas (LBMP)

da FFCLRP-USP.

A Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP), aos demais funcionários do

Departamento de Ginecologia e Obstetrícia e do Departamento de Genética da FMRP-USP

que colaboraram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho.

As agências financiadoras e de fomento à pesquisa CNPq, CAPES, FAEPA e

principalmente a FAPESP.

A todos que participaram de qualquer forma contribuindo para o meu crescimento

profissional e pessoal.

Este trabalho foi desenvolvido com o apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (processo número: 2007/01911-6), do Conselho Nacional de Desenvolvimento de Pesquisa (CNPq), da Fundação de Amparo ao Ensino, Pesquisa e Assistência do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FAEPA) e da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

RESUMO

A pré-eclâmpsia (PE) caracteriza-se pelo aumento da pressão arterial e proetinúria,

após 20 semanas de gestação, sendo comum em primigestas e nos extremos da vida

reprodutiva feminina. A sua etiologia é desconhecida, mas há evidências da predisposição

genética no desenvolvimento da PE e vários estudos que dizem respeito a genes candidatos

têm sido realizados. O gene CDKN1C (cyclin-dependent kinase inhibitor 1C), também

denominado P57Kip2, sofre marcação (imprinting) genômica e está mapeado no cromossomo

11p15.5 em humanos. O CDKN1C possui um importante papel na inibição da proliferação

do trofoblasto. Estudos em camundongos mostraram que alterações da PE talvez sejam

induzidas por perda de expressão deste gene. O presente trabalho verificou a associação de

PE com variantes do gene CDKN1C. Foram selecionadas 75 pacientes que apresentaram

PE, quatro mulheres com diagnóstico de eclâmpsia, 42 com hipertensão arterial crônica

(HAC), 66 com diagnóstico de hipertensão gestacional (HG) e 162 gestantes como grupo

controle. Também foram incluídos 302 indivíduos (204 mulheres não grávidas e 98 homens)

da população geral. Após extração do DNA de sangue periférico, foram utilizadas técnicas

de Biologia Molecular [Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), Polimorfismo

Conformacional de Fita Simples (SSCP) e seqüenciamento automático] para o estudo do

genótipo das pacientes e controles. Foram encontradas quatro novas variantes do gene

CDKN1C humano (uma em uma mulher do grupo controle da população geral, duas em

portadoras de HAC e uma no grupo controle). As variantes do gene CDKN1C não se

mostraram bons marcadores para o desenvolvimento de pré-eclâmpsia, mas os resultados

sinalizam para um papel em casos de hipertensão arterial crônica. Este é o primeiro estudo

populacional em larga escala do gene CDKN1C na população brasileira.

ABSTRACT

Pre-eclampsia (PE) is characterized by hypertension associated with proteinuria, after

20 weeks gestation, with higher risk on the extremes of maternal reproductive life. The

etiology is unknown, but there are evidences that genetics predisposition is involved in the

development of PE. Studies with candidate genes have been realized to associate the

epidemiologic data and to establish a heritance model. The CDKN1C (cyclin-dependent

kinase inhibitor 1C) gene, also called P57Kip2, is located on 11p15.5 region in human

chromosome and is able to suffer genomic imprinting. Studies using animal models (mice)

showed that alterations in PE might be induced by loss of expression of this gene. The

present study associated the CDKN1C variations with PE. Blood samples of 75 women with

PE and 162 pregnant controls patients were collected. Additionaly, four eclamptic women, 42

pregnant women diagnosed with cronic arterial hypertension and 66 diagnosed with

gestacional hypertension were included in the studied cohort. We also analyzed 302 healthy

subjects (204 females and 98 males) of the general population. After the DNA extraction

from peripheral blood, PCR, Single Strand Conformational Polymorphism (SSCP) and

automatic genome sequencing were used to analyze the genotypes of the patient and

controls. Four new variants of CDKN1C gene (one mutation in the control group of pregnant

women, one in a female from the general population and two variants in two distinct women

with cronic arterial hypertension). The variants of of CDKN1C gene did not seem to set a

marker to development of pre-eclampsia, but the results shows that this gene may play a key

role in cases of cronic arterial hypertension. This is the first large-scale population study of

the CDKN1C gene in Brazilian population.

ABREVIATURAS E SIGLAS

% - porcentagem

°C – Graus Celsius

A - adenina

AGAR - Ambulatório de Gestação de Alto Risco

AIG – adequado para a idade gestacional

C - citosina

cm - centímetros

CDKN1C - Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor 1C (inibidor de quinase dependente de ciclina 1C)

CEP - Comitê de Ética em Pesquisa

CONEP - Comissão Nacional de Ética em Pesquisa

DNA - Deoxyribonucleic Acid (ácido desoxirribonucléico)

dNTP - desoxinucleotídeo trifosfatado

E – eclâmpsia

EDTA – ácido etilenodiaminotetraacético

FFCLRP – Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto

FMRP – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

G - guanina

g - grama

GIG – grande para a idade gestacional

H19 - gene supressor tumoral

HAC - hipertensão arterial crônica

HCFMRP - Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

HCl - ácido clorídrico

HG – hipertensão gestacional

IG – idade gestacional

IGF2 - Insulin-like growth factor 2 (fator de crescimento semelhante à

insulina 2)

KCl - Cloreto de potássio

kg – quilograma

KvLQT1 – K+ channel voltage-gated Long QT1 (canal de potássio QT1

LBMP - Laboratório de Biologia Molecular de Plantas

LGMB - Laboratório de Genética Molecular e Bioinformática

LIT1 - long QT intronic transcript 1

M – molar

mA – miliampere

MgCl2 – Cloreto de Magnésio

miRNA – micro RNA

ml – miliitro

mM – milimolar

múltiplos de g - força da gravidade

NaCl – cloreto de sódio

ng – nanogramas

NHBPEP - National High Blood Pressure Education Program

OMIM - Online Mendelian Inheritance in Man

p - braço curto do cromossomo

pb – pares de bases

PC – parto cesárea

PCR – Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase)

PE – pré-eclâmpsia

pH - potencial hidrogeniônico

PIG – pequeno para a idade gestacional

PN – parto normal

PSA – Persulfato de amônia

q - braço longo do cromossomo

RN – recém-nascido

RNA - Ribonucleic Acid (ácido ribonucléico)

RPM – rotações por minuto

SBW - Síndrome de Beckwith-Wiedemann

SHG - síndromes hipertensivas gestacionais

SNP – Single Nucleotide Polymorphism (polimorfismo de nucleotídeo único)

SSCP – Single Strand Conformational Polymorphism (polimorfismo conformacional de fita

simples)

T - timina

TBE - tris/borato EDTA

TCLE – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

U - uracila

USP – Universidade de São Paulo

UTR - untranslated region (região não traduzida)

V – Volts

W – watts

μg – micrograma

μl – microlitro

LISTA DE FIGURAS

Figura 01 Hipótese de Graves. 26

Figura 02 Fragmento de interesse do gene CDKN1C humano. 37

Figura 03 Seqüência de aminoácidos do gene CDKN1C humano. 38

Figura 04 Imagem de gel de poliacrilamida com a padronização dos primers específicos

para a PCR das regiões do intron 1 e do exon 2.

40

Figura 05 Imagem de gel de SSCP com a padronização dos primers específicos da região

dos Primers 1.

46


dos Primers 2.

47


dos Primers 3.

48

Figura 08 Imagem de gel de SSCP com a amostra 789 (grupo controle) com padrão de

migração das bandas alterado para a região dos Primers 1.

53

Figura 09 Imagem de gel de SSCP com a amostra 236 (grupo controle da população

geral) com padrão de migração das bandas alterado para a região dos Primers

1.

54

Figura 10 Imagem de gel de SSCP com as amostras 484 e 859 (grupo HAC) com padrão

de migração das bandas alterado para a região dos Primers 2.

55

Figura 11 Imagem de gel de SSCP com as amostras 236, 484, 789 e 859 com padrão de

migração das bandas inalterado para a região dos Primers 3.

56

Figura 12 Imagem parcial do cromatograma com o resultado do seqüenciamento da

amostra 789 referente aos Primers 1.

57

Figura 13 Alinhamento das seqüências de nucleotídeos da seqüência referência GenBank

e a amostra 789 do grupo controle.

58

Figura 14 Imagem parcial do cromatograma com o resultado do seqüenciamento da

amostra 236 referente aos Primers 1.

59


e a amostra 236 do grupo controle da população geral.

60

Figura 16 Imagem parcial do cromatograma com o resultado do seqüenciamento das

amostras 484 e 859 referentes aos Primers 2.

61


e a amostra 484 do grupo HAC.

62


e a amostra 859 do grupo HAC.

62

Figura 19 Seqüência referência de aminoácidos do gene CDKN1C humano do banco de

dados do programa GenBank e seqüência de aminoácidos polimórfica.

64

Figura 20 Seqüência referência do gene CDKN1C humano do banco de dados do

programa GenBank e seqüência com polimorfismos descritos em banco de

dados.

66

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 Sub-divisão da casuística segundo o diagnóstico. 34

Tabela 02 Caracterização quanto ao sexo de um segundo grupo controle constituído por

homens e mulheres não grávidas saudáveis, da população geral.

34

Tabela 03 Seqüências de primers obtidas para análise molecular do gene CDKN1C. 37

Tabela 04 Reagentes utilizados para a PCR da região de interesse dos Primers 1 e

Primers 2 do gene CDKN1C humano.

42

Tabela 05 Reagentes utilizados para a PCR da região de interesse dos Primers 3 do gene

CDKN1C humano.

43

Tabela 06 Condições das amostras, do gel e da corrida de eletroforese padronizadas para

a técnica de PCR-SSCP referentes às regiões de interesse dos Primers 1,

Primers 2 e Primers 3.

45

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 16

1.1 Classificação de síndromes hipertensivas gestacionais 18

1.2 Pré-eclâmpsia 19

1.3 Genética e pré-eclâmpsia 23

1.4 Imprinting genômico e pré-eclâmpisa 25

1.5 Região cromossômica 11p15.5 e o gene CDKN1C 27

2. OBJETIVOS

30

2.1 Objetivo geral 31

2.2 Objetivos específicos 31

3. MATERIAL E MÉTODOS

32

3.1 Casuística 33

3.2 Análise molecular 35

3.2.1 Coleta de sangue periférico 35

3.2.2 Extração de DNA genômico 35

3.2.3 Seleção e validação dos primers 36

3.2.4 Identificação da seqüência de aminoácidos do gene CDKN1C humano 38

3.2.5 Reação em cadeia da polimerase 38

3.2.6 Polimorfismo Conformacional de Fita Simples (SSCP) 43

3.2.7 Seqüenciamento automático de nucleotídeos 49

3.2.8 Identificação in silico de polimorfismos e variantes no gene CDKN1C humano

50

3.3 Análise estatística 51

4. RESULTADOS

52

4.1 Reação em cadeia da polimerase e Polimorfismo Conformacional de Fita Simples (PCR-SSCP)

53

4.2 Seqüenciamento automático de nucleotídeos e alinhamento de seqüências 57

4.2.1 Primers 1 57

4.2.2 Primers 2 61

4.3 Seqüência de aminoácidos 64

4.4 Pesquisa de SNPs em banco de dados 65

4.4.1 Programa BLAST SNP Sequence e RepeatMasker Open-3.0 65

4.5 Análise estatística 67

5. DISCUSSÃO

70

6. CONCLUSÕES

77

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

79

8. ANEXOS

88

Anexo A – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) 89

Anexo B – Ofício referente à aprovação do TCLE pelo CEP do HCFMRP-USP 90

Anexo C – Parecer do CONEP referente ao projeto de pesquisa 91

9. APÊNDICES

92

Apêndice A – Grupo de pacientes com PE/E, HAC, HG e grupo controle 93

Apêndice B – Grupo controle da população geral 99

I. INTRODUÇÃO

Algumas estimativas indicam que 600.000 mulheres vão a óbito anualmente devido a

causas relacionadas à gravidez e 99% dessas mortes ocorrem em países em

desenvolvimento, ou seja, países onde vivem 85% da população mundial (ALTMAN et al.,

2002; WHO, 2007). Somente as síndromes hipertensivas gestacionais (SHG) são

responsáveis por 50.000 mortes por ano, tornando-as a segunda causa mais comum de

mortalidade em países industrializados (RATH & FISCHER 2009). Mesmo com esses altos

índices, poucos progressos têm sido alcançados para salvar a vida dessas mulheres

(UNITED NATIONS, 2008).

Nos Estados Unidos da América, a taxa de mortalidade materna devida às SHG

atinge de 6 a 8% das gestantes (LEEMAN & FONTAINE, 2008; MAGEE et al., 2009)

chegando a uma média de 16% em países desenvolvidos (KHAN et al., 2006). No Brasil

este índice é de aproximadamente 26%, taxa semelhante à do restante da América Latina e

do Caribe, colocando a hipertensão como a principal causa de mortalidade materna, sendo

importante observar que de acordo com a região brasileira estudada essa taxa pode chegar

até 40% (KHAN et al., 2006; DULEY et al., 2009; KALE & COSTA, 2009). No Brasil,

doenças hipertensivas são as principais causa de morte materna e constituem grave

problema de Saúde Pública (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007).

1.1 - Classificação de síndromes hipertensivas gestacionais (SHG)

A classificação e o manejo das SHG são referidas em consenso por protocolos

internacionais (REY et al., 1997; BROWN et al., 2000; LOWER et al., 2009; MAGEE et al.,

2008). A classificação mais utilizada foi apresentada em 2000 pelo National High Blood

Pressure Education Program (NHBPEP), onde foram estabelecidos os critérios descritos a

seguir:

a) Hipertensão Arterial Crônica (HAC): definida como hipertensão de qualquer

etiologia, precedendo a gestação ou diagnosticada antes da vigésima semana de gestação.

Hipertensão diagnosticada pela primeira vez durante a gestação e que persiste no pós-parto

é também classificada como hipertensão arterial crônica. A hipertensão é definida quando a

pressão sistólica é ≥140 mmHg e/ou a pressão diastólica ≥90 mmHg;

b) Pré-eclâmpsia/Eclâmpsia (PE/E): A PE é uma síndrome específica do ciclo

gravídico-puerperal que surge após a vigésima semana de gestação. É determinada por

aumento da pressão sanguínea (pressão sistólica/diastólica ≥ 140/90 mmHg) acompanhada

por proteinúria. Sua caracterização é determinada em pacientes normotensas antes da

vigésima semana de gestação. A proteinúria (proteína na urina) é considerada significativa

para diagnóstico de PE quando for ≥ 300mg em urina de 24 horas, na ausência de infecção

urinária, sangue e corpos cetônicos. De forma geral, esta medida corresponde a valor ≥ 300

mg/litro em amostra isolada de urina ou ao valor quantitativo de 1+ em urina tipo 1.

Caracteriza-se como eclâmpsia a ocorrência de convulsões não atribuídas a outras causas,

em pacientes com PE. Presença de edema e do acréscimo de 30/15 mmHg nas pressões

sistólica/diastólica não fazem parte dos critérios diagnósticos da PE nesta nova

classificação, mas são considerados indicativos de cuidados, principalmente na presença de

proteinúria. O edema foi excluído dessa nova classificação porque ocorre em muitas

mulheres com gravidez normal;

c) Hipertensão arterial crônica com pré-eclâmpsia sobreposta: diagnóstico baseado

no aumento da pressão arterial e do aparecimento de proteinúria maior que 300mg/24horas.

A sobreposição do processo específico da gestação com a HAC previamente instalada é

uma complicação cujo prognóstico materno-fetal é potencialmente pior do que qualquer das

duas complicações isoladamente;

d) Hipertensão gestacional (HG): a elevação da pressão arterial na segunda metade

da gestação, mas sem desenvolvimento de proteinúria é considerada hipertensão

gestacional. Este diagnóstico inespecífico pode ser temporário. A finalização deste

diagnóstico pode ser realizada somente após 12 semanas do término da gravidez, sendo

também denominada de hipertensão transitória da gravidez. Se a hipertensão persistir, a

paciente é considerada hipertensa crônica.

1.2 - Pré-eclâmpsia

A pré-eclâmpsia (PE) continua um dos maiores problemas obstétricos mundiais

(ROBERTS, 2000), mesmo após seus primeiros relatos datarem de mais de 2000 anos

(CHESLEY, 1978) e ter sido reconhecida clinicamente desde os tempos de Hipócrates

(KANASAKI & KALLURI, 2009).

A PE é uma doença multissistêmica, de causa desconhecida, sendo exclusiva na

gravidez humana, possuindo incidência na população estimada em 10% e constituindo uma

das maiores causas de morte materna e fetal nos países desenvolvidos e em

desenvolvimento (SAFTLAS et al., 1990; SIBAI et al., 2005; KHAN et al., 2006; DULEY et al.,

2009; MAGEE et al., 2009).

A PE pode ser classificada em PE de início precoce ou Tipo I (antes da trigésima

quarta semana de gestação), PE de início tardio ou Tipo II (após a trigésima quarta semana

de gestação), bem como a PE pode ocorrer durante ou após o trabalho de parto (PRIDJIAN

& PUSCHETT, 2002). Além da classificação, a PE pode ser dividida, de acordo critérios

diagnósticos, em subtipos: leve, severa e sobreposta, (SIBAI et al., 2008).

Os critérios de diagnóstico da PE e de seus subtipos são discrepantes entre os

estudos publicados, resultando em insignificantes avanços nos métodos de projeção,

prevenção, manejo e não confirmando marcadores para o diagnóstico da PE e seus

subtipos (SIBAI et al., 2008).

De maneira prática e geral, a PE é comum em primigestas e nos extremos da vida

reprodutiva feminina (antes dos 18 e depois dos 35 anos de idade) (SAFTLAS et al., 1990;

SIBAI et al., 2005). Caracterizada por achados clínicos e laboratoriais heterogêneos, a PE

pode manifestar-se tanto no acometimento predominantemente materno como fetal, ou

ainda em ambos na condição de síndrome materno-fetal (MAGEE et al., 2008; SIBAI et al.,

2008).

Na forma materna da PE, os importantes sinais, sintomas e mecanismos que podem

ser destacados nessa gravidez de alto risco são: hipertensão (de etiologia ainda

desconhecida, causa complicações materno-fetais), disfunção endotelial (remodelamento da

artéria espiral devido à invasão superficial do trofoblasto), proteinúria (lesões glomerulares

renais conhecidas como endoteliose glomerular), errônea adaptação imune aos antígenos

paternos e resposta inflamatória sistêmica exacerbada. Mulheres com vários fatores de

riscos (doença cardiovascular ou microvascular pré-existente, doenças renais ou

trombofilias) estão sujeitas a sofrer complicações consideráveis. Já na forma fetal a restrição

do crescimento intra-uterino se dá quase que exclusivamente devido à disfunção placentária

que acarreta um fornecimento alterado de sangue para a placenta (aterosclerose

placentária), levando ao pequeno crescimento intra-uterino e precipitando o nascimento pré-

termo (SIBAI et al., 2008; DULEY et al., 2009; KANASAKI & KALLURI, 2009).

Apesar das numerosas pesquisas relacionadas à etiologia, biologia, patogênese e

patofisiologia da PE (ROBERTS & LAIN, 2002; VON DADELSZEN et al., 2002; ROBERTS &

GAMMILL, 2005; STEPAN et al., 2006; GOLDMAN-WOHL & YAGEL, 2007; FURUYA et al.,

2008), essa doença continua sendo uma incógnita, o que acaba conferindo à PE a

denominação de “doença das teorias” (BROUGHTON PIPKIN & RUBIN, 1994;

SCHLEMBACH, 2003) e de “doença de dois estágios” (REDMAN & SARGENT, 2005;

ROBERTS & HUBEL, 2009).

Nesta última, o primeiro estágio ocorreria na primeira metade da gestação (15 a 16

semanas de gravidez) com a reduzida perfusão placentária, que resultaria na liberação de

fatores de reconhecimento imunológico materno do feto derivados da placenta, que levariam

a mudanças patofisiológicas sistêmicas maternas (segundo estágio) durante a segunda

metade da gravidez. Este modelo não abrange todos os aspectos das várias alterações

pertinentes à PE, mas foca em uma opção de modelo de mecanismo de comprovada

importância (REDMAN & SARGENT, 2005).

Embora a presença da placenta seja fundamental para o desenvolvimento da PE e a

sua resolução seja a expulsão da placenta (HAWFIELD & FREEDMAN, 2009), a PE não

ocorre naturalmente em outros animais placentários, inclusive em primatas superiores

(WINN et al., 2009). Modelos animais são pouco eficientes para servirem para o estudo da

PE devido em grande parte à incompetência e à dificuldade de apresentarem o espectro

completo da doença humana, possibilitando apenas o estudo de características isoladas

(PODJARNY et al., 2004).

A origem da PE consistiria de quatro principais componentes: adaptação imune

deficiente; isquemia placentária; estresse oxidativo e predisposição genética. Uma

combinação destes fatores decidiria se uma mulher grávida estaria destinada a desenvolver

a PE e sua severidade (WILSON et al., 2003).

A PE talvez resulte de uma resposta imune materna deficiente e anormal aos

antígenos paternos. O mecanismo no qual essa má adaptação imune está relacionada a

disfunção endotelial celular na PE permanece obscura, mas há indícios que as células

imunes ativadas na decídua possam liberar mediadores que atuam nas células endoteliais.

As evidências para o envolvimento dessa resposta imunológia anormal, estão baseadas em

estudo epidemiológicos onde se observou que: o risco de PE diminui após a primeira

gestação; o efeito protetor da multipariedade é perdido com a mudança de parceiro; aborto

ou transfusão sanguínea protege contra PE; inseminação artificial de doadores e doação de

oócitos levam a um aumento no risco de PE; exposição ao sêmen aumentada (como por

exemplo período do relacionamento com o parceiro ou uso de contraceptivo oral) pode ser

um fator protetor (WILSON et al., 2003).

A hipótese da isquemia placentária na PE se deve inicialmente à invasão

trofoblástica e subseqüente remodelamento da artéria espiralada deficiente, resultando na

diminuição do diâmetro da mesma. Esta resposta é devida ao aumento da demanda

vascular na gravidez, levando ao déficit de suprimento de sangue à placenta (VAN BECK &

PEETERS, 1998; DEKKER & SIBAI, 1998; DEKKER & SIBAI, 1999).

Outra hipótese é a de que o estresse oxidativo gerado na placenta hipóxica é

transferido à circulação sistêmica, resultando em dano oxidativo nas células endoteliais

vasculares de todo o organismo (ROBERTS, 2000; ROBERTS & COOPER, 2001). A

interação de componentes maternos, particularmente neutrófilos e lipídios susceptíveis à

oxidação, com células placentárias e fatores derivados da placenta induzem o estresse

oxidativo que causa a referida disfunção celular e manifestações clínicas da PE (WILSON et

al., 2003; REDMAN & SARGENT, 2009).

Diversos estudos mostram que células fetais livres presentes no sangue materno têm

valor preditivo, apesar de restrito, como biomarcadores para gestações pré-eclâmpticas

entre 17 e 25 semanas de gestação. Vários autores detectaram um número até cinco vezes

maior de células fetais livres em mulheres com PE quando comparadas ao grupo controle

(GRILL et al., 2009).

Evidências de componentes genéticos na PE vêm da observação do relevante

aumento entre mães, filhas, irmãs e avós de mulheres que tiveram PE (WILSON et al.,

2003), como veremos a seguir.

Em mulheres com baixo ou elevado risco de desenvolver PE, um dos

componentes/mecanismos observados isoladamente não explica a PE e suas variações.

Essa dificuldade se deve em grande parte à heterogeneidade da doença e aos complexos e

diversos mecanismos em que ela está envolvida. Contudo as pesquisas atuais devem ser

dirigidas à avaliação desses diversos mecanismos assim como às vias que são comuns a

eles (MAGEE et al., 2008; KANASAKI & KALLURI, 2009).

1.3 – Genética e pré-eclâmpsia

CHESLEY et al. (1961) foram os primeiros a descrever de forma consistente a

influência familial na PE. Eles relataram um acentuado aumento na incidência da doença na

primeira gravidez de irmãs e filhas de mulheres eclâmpticas, quando comparada à da

população controle. A contribuição genética na PE também foi observada em outros estudos

onde foi constatado o aumento da ocorrência da doença entre mães, filhas, irmãs e netas de

mulheres que tiveram PE (SERRANO et al., 2006).

O papel genético na PE é amplamente aceito, mas o padrão de herança ainda é

assunto de debate (MIM número 189800, disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim).

COOPER & LISTON (1979) não chegaram a conclusões sobre a heterogeneidade genética,

o papel do genótipo materno e o genótipo fetal e a possível interação entre ambos os

genótipos.

Em um estudo de populações homogêneas, foi observado que padrões de heranças

recessiva e dominante poderiam explicar os dados obtidos a partir da análise de filhos e

filhas de mães que tiveram pré-eclâmpsia severa e eclâmpsia (ARNGRIMSSON et al.,

1990). Alguns pesquisadores sugeriram isoladamente que a susceptibilidade para PE pode

ser herdada por meio de um gene autossômico recessivo (materno) ou um gene dominante

com penetrância incompleta. Por outro lado, outros autores propuseram que a

susceptibilidade à PE é devida a uma complexa interação entre dois ou mais genes

maternos, fatores ambientais e genótipo fetal/paterno (MORGAN et al., 1999; WILSON et al,

2003). O gene ou os genes envolvidos nos riscos para PE talvez dependam, pelo menos em

parte, das características da população estudada (etnia, idade materna na gestação).

Nenhum estudo foi capaz de separar os efeitos de fatores genéticos maternos e

fetais dos fatores ambientais. CNATTINGIUS et al., (2004) afirmam que os fatores genéticos

são os responsáveis por mais da metade da contribuição para o desenvolvimento da pré-

eclâmpsia, e ainda, que os genes maternos contribuem mais que os genes fetais.

Em um estudo familial com gestantes atendidas no Hospital das Clínicas da

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (HCFMRPUSP)

realizado pela equipe da Profa. Dra. Ester Silveira Ramos, foi verificado por meio de análise

estatística que pacientes brasileiras com PE/E apresentam maior número de parentes de

primeiro-grau (mãe/irmã) com PE/E quando comparadas a gestantes com HG e à população

controle (ARAUJO et al., 2007). Estes resultados estão de acordo com a literatura e

pesquisas de outros países (CARR et al., 2005).

Diversos estudos sugerem um componente fetal (paterno) para susceptibilidade à

PE. A associação entre a doença e anormalidades cromossômicas fetais confirma uma

contribuição fetal para a etiologia (BOYD et al., 1987). O risco de desenvolver PE é

aumentado em mulheres com molas hidatiformes completas, que são de origem paterna

(DEVRIENDT, 2005). O pequeno, mas significativo, aumento estatístico da incidência entre

noras de casos índices e a observação de uma maior freqüência de gravidez com PE em

crianças cuja avó paterna apresentava histórico de PE durante a gravidez do pai dessa

criança colaboram com a idéia do risco da contribuição paterno/fetal (WILSON et al., 2003).

A influência do genótipo fetal na PE tem levado à hipótese de um modelo combinado

de transmissão. COOPER et al. (1988) relataram um aumento na incidência da PE em

mulheres nascidas de uma gravidez eclâmptica quando comparadas com mulheres

nascidas de uma gravidez normal, mas com irmã ou irmão nascidos de uma gravidez

eclâmptica. LISTON & KILPATRICK (1991) concluíram, por meio de um estudo baseado no

modelo de herança mendeliana, que mãe e feto deveriam expressar o mesmo gene

recessivo para o desenvolvimento de PE. ESPLIN et al. (2001) chegaram a um resultado

semelhante.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/#189800_Reference11

BERENDS et al. (2008) analisando conjunto de famílias, consangüinidade e os

efeitos de origem dos pais, estabeleceu que a co-segregação observada na PE e na

restrição de crescimento intra-uterina comprova uma etiologia genética comum.

Já SKJAERVEN et al. (2005) afirmaram que os genes maternos e fetais que foram

maternalmente ou paternalmente herdados podem desencadear a PE. CHAPPELL &

MORGAN (2006) enumeraram genes candidatos para serem estudados como marcadores

que podem contribuir de forma significativa para um melhor entendimento da PE, entre eles,

genes que são regulados por mecanismos epigenéticos.

1.4 - Imprinting genômico e pré-eclâmpsia

O imprinting genômico é um tipo de marcação epigenética do genoma parental de

um organismo diplóide de acordo com a sua respectiva origem, onde apenas um dos alelos

herdados (materno ou paterno) é expresso de uma forma específica para o tecido e estágio

do desenvolvimento (WALTER & PAULSEN, 2003).

Neste caso, a cópia dos genes de um dos pais é expressa, enquanto a outra é

silenciada. As duas cópias parentais do gene marcado dividem informação genética igual. O

não silenciamento de um alelo necessariamente pré-determina que qualquer função

relacionada àquele gene seja agora dependente de uma simples cópia ativa (MURPHY &

JIRTLE, 2003).

HALL (1990) sugeriu que o imprinting talvez sirva para proteger as fêmeas da

proliferação descontrolada do trofoblasto durante a gravidez. Na Hipótese de Graves (Figura

1), é sugerido que para um gene hipotético E, a expressão normal de um alelo materno (EM)

que sofre imprinting paterno (o alelo materno é expresso) é necessária para invasão

trofoblástica e estabelecimento da placentação normal. Devido à sua origem parental, o

alelo materno EM deve ser expresso no feto, mas se esse alelo materno herdado da mãe é

mutado (eM) ou está ausente no feto, a PE é induzida no organismo materno. Com isso,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/#189800_Reference7

mães com PE que segregam o alelo mutante eM têm um padrão de expressão da PE que

dependerá do alelo materno herdado pelo feto. Uma mulher será afetada somente se gerar

um feto com o alelo materno mutado (eM). Dessa forma, uma mulher afetada deve ser

heterozigota (EMeM) e deve passar o alelo mutante eM para seu feto (EPeM) (Figura 1). É

importante ressaltar que um feto heterozigoto (ePEM), que recebeu o alelo mutante (eP) do

pai, iniciará o processo de placentação normal e não causará efeito adverso na mãe, desde

que o alelo paterno esteja inativo (“marcado”). Pode-se concluir que essa variação dos

alelos maternos e o seu padrão de herança no feto teriam um efeito importante no fator de

risco do desenvolvimento da PE (GRAVES, 1998).

Figura 1: Hipótese de Graves em que o gene E sofre imprinting paterno (materno ativado), a

mãe é heterozigota (EMeM) e o genótipo paterno (neste exemplo EPEP) é irrelevante

(modificado de GRAVES, 1998).

GENÓTIPO MATERNO

EMe

M

GENÓTIPO PATERNO

EPE

P

GAMETAS

EP

EP

EM e

M

EME

P e

ME

P FERTILIZAÇÃO

GESTAÇÃO

1/2 NORMAL

1/2 PRÉ-ECLÃMPSIA

O seqüenciamento de 17 genes em uma região crítica em 10q22 revelou variações

nucleotídicas que foram utilizadas para estudos de ligação de famílias de pacientes com PE

na população holandesa. Esta região apresenta vários genes que sofrem imprinting,

homologia com as regiões 2p12 e 9p13 (também descritas como ligadas à PE), homologia

com uma região em camundongos ligada à pressão sanguínea e uma possível influência da

origem parental, uma vez que, em famílias holandesas com PE, o alelo compartilhado entre

os afetados era sempre o materno (VAN DIJK et al., 2005).

Em um amplo artigo de revisão, NEJATIZADEH et al. (2008) ressaltam a importância

cada vez maior dos fenômenos epigenéticos para a compreensão dos fatores que levam e

conduzem à PE e que estudos em larga escala incluindo gestantes afetadas e seus filhos

são essenciais para o estudo das bases gênicas e multifatoriais da PE.

1.5 - Região cromossômica 11p15.5 e o gene CDKN1C

O gene cyclin-dependent kinase inhibitor 1C (CDKN1C), também denominado,

P57Kip2, possui quatro exons, é marcado paternalmente e foram encontradas três variantes

de transcritos codificando duas isoformas (isoforma A – longa e isoforma B - curta) para este

gene (disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/).

O gene CDKN1C codifica um inibidor de quinase dependente de ciclina, está

envolvido na regulação do ciclo celular, apresenta ação de supressão tumoral e localiza-se

entre um grupo de genes marcados mapeados no cromossomo 11p15.5 em humanos (LAM

et al., 1999). A mais nova função atribuída à proteína P57Kip2 inclui a organização do

citoesqueleto celular (PATERAS et al., 2009).

A 11p15.5, importante região relacionada à regulação gênica e desenvolvimento

celular, é dividida em dois domínios gênicos regulados por imprinting, sendo um telomérico,

controlado pela ICR1 (imprinting control region 1) onde se encontra a região

diferencialmente metilada (DMR) H19DMR, os genes IGF2 (insulin-like growth factor-2) e

H19, e outro centromérico, controlado pela ICR2 (imprinting control region 2), onde estão

mapeados a KvDMR, os genes CDKN1C, KvLQT1 (K+Channel voltage-gated Long QT 1) e

LIT1 (Long Intronic Transcript 1 ou KvLQT1AS) (ENGEL et al., 2000; MAHER & REIK, 2000).

A expressão do gene CDKN1C é conhecida em diferentes tipos de tecidos, como células

sanguíneas mononucleadas (KOCZAN et al., 2005), células do fibroblasto (DIAZ-MEYER et

al., 2003) e tecido placentário (BOURQUE et al., 2010).

Em humanos, alterações da região 11p15.5 acarretam o desenvolvimento de

neoplasias e a síndrome de Beckwith–Wiedemann (SBW), que é caracterizada por

hipercrescimento e está associada com o aumento do risco de alguns tumores infantis

(MAHER & REIK, 2000). Os portadores de SBW com perda da região materna, envolvendo

o gene CDKN1C mostram uma proliferação anormal do trofoblasto que é freqüentemente

associada com PE (MCCOWAN & BECROFT, 1994).

Existem algumas mutações de CDKN1C associadas principalmente aos casos

familiais de SBW. LAM, et al. (1999) verificaram mutações no gene CDKN1C em 70

portadores de SBW e confirmaram a importância das alterações nesse gene para o

diagnóstico da síndrome. LEW et al. (2004), analisando portadores de SBW, descreveram

uma mutação em um sítio de splicing (processamento) no intron 3 do gene CDKN1C. Os

autores relataram que esta mutação intrônica, que foi herdada maternalmente, era

responsável pela SBW naqueles portadores analisados e que esta mutação estava

diretamente relacionada com a eficiência do splicing, mas não afetava a quantidade final de

RNA mensageiro transcrito.

Analisando 200 portadores de SBW, COOPER et al. (2005) encontraram 130

indivíduos com alterações nos centros controladores de imprinting na região 11p15.5 e 16

indivíduos com mutações do CDKN1C, o que aumenta a importância deste gene na

caracterização da etiologia da SBW.

Variações no sitio promotor proximal e na região codante dos genes CDKN1C e

CDK4 também foram encontradas e relacionadas com casos de diabetes tipo 2. As análises

nas mutações desses dois genes em 62 pacientes resultaram na descoberta de sete

variantes do CDKN1C (NIELSEN et al., 2005). Os autores concluíram que as variações

encontradas no gene CDKN1C também podem contribuir nas variações individuais do peso

ao nascimento. Já RODRIGUEZ et al. (2007) encontraram correlação positiva entre

polimorfismo do CDKN1C e o risco de infarto do miocárdio e aterosclerose.

Durante o desenvolvimento embrionário e fetal, os genes paternalmente expressos

tendem a favorecer a utilização mais intensa de fontes maternas para potencializar o

crescimento fetal, onde uma parcela dos genes maternalmente expressos parece suprimir o

crescimento fetal. Experimentos com modelos animais knockout demonstraram o papel que

os genes IGF2 (paternalmente expresso) e o CDKN1C (maternalmente expresso) possuem

na regulação do suprimento de nutrientes através da placenta (REIK et al., 2003).

TAKAHASHI et al. (2000), utilizando camundongos, estudaram os níveis de expressão de

IGF2 e H19 na placenta de embriões com deficiência de CDKN1C, mas não houve diferença

baseada nos genótipos.

O CDKN1C parece ter um importante papel na inibição da proliferação do trofoblasto.

Em camundongos, alterações típicas da PE talvez sejam induzidas por proliferação do

trofoblasto resultante da perda de expressão do gene CDKN1C. Fêmeas de camundongos

prenhes portadoras de deleções heterozigotas do gene CDKN1C desenvolveram quadro

semelhante à PE com uma seqüência de eventos placentários e alterações clínicas

similares às dos humanos (KANAYAMA et al., 2002). Em outro experimento, KNOX &

BAKER (2007), utilizando camundongos knockout para o gene CDKN1C, constataram falha

no desenvolvimento da placenta.

A complexidade do processo envolvido e o fato de ser um fenômeno materno-fetal

torna a pesquisa das bases moleculares da PE uma tarefa difícil. É possível que o simples

fenótipo da PE deva ser dividido em diferentes subgrupos nos níveis genético e bioquímico.

Estudos futuros auxiliarão na elucidação e criação de medidas preventivas dessa doença.

II. OBJETIVOS

2.1 - Objetivo geral

Verificar a ocorrência de variantes do gene CDKN1C em mulheres com síndromes

hipertensivas gestacionais (SHG) com especial ênfase em PE/E.

2.2 - Objetivos específicos

Detectar variantes do gene CDKN1C por meio de polimorfismo conformacional de fita

simples (SSCP) e seqüenciamento automático;

Verificar a distribuição das variantes do gene CDKN1C entre as pacientes com SHG

e na população controle;

Verificar a possibilidade de utilização do gene CDKN1C como marcador de

predisposição à SHG, em especial da PE/E.

III. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 - Casuística

As pacientes foram recrutadas durante sua internação na enfermaria do Ambulatório

de Gestação de Alto Risco (AGAR) do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia do

Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP (HCFMRP-USP),

onde foi apresentado o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Anexo A),

previamente aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do HCFMRP-USP,

Processo HCRP n° 4628/2004 (Anexo B), e pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa

(CONEP n°1351/2004) (Anexo C).

Foram selecionadas pacientes com diagnóstico de PE, eclâmpsia (E), hipertensão

gestacional (HG) e hipertensão arterial crônica (HAC), segundo os critérios do National High

Blood Pressure Education Program Working Group on High Blood Pressure in Pregnancy

(NHBPEP, 2000). Foram excluídos os casos de PE/E sobreposta à HC, gemeralidade,

malformações fetais, diabetes, doença vascular, trombose, câncer e outras doenças

crônicas maternas.

O grupo controle foi composto por mulheres da população geral, internadas ou que

passaram por internação na mesma enfermaria, voluntárias, que possuíam pelo menos um

filho(a) vivo(a), sem história de PE/E durante a gravidez (ou em parentes de primeiro grau),

sadias, sem hipertensão e/ou proteinúria maior do que 300mg/24 horas, com idade similar à

do grupo principal (+/- 5 anos) e sem relação de parentesco com o grupo de estudo.

Portanto do total de amostras de sangue coletadas, 75 eram de portadoras de PE,

quatro de eclâmpsia, 66 de HG, 42 de HAC e 162 pacientes do grupo controle (Tabela 1).

Tabela 1: Sub-divisão da casuística segundo o diagnóstico.

População Número de Pacientes

Portadoras de pré-eclâmpsia 75

Portadoras de eclampsia 04

Portadoras de hipertensão gestacional 66

Portadoras de hipertensão arterial crônica 42

Grupo controle 162

Total 349

Todas as amostras coletadas e a análise dos prontuários foram realizadas pela aluna

de doutorado do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da FMRP-USP, Francielle

Marques Araujo, sob orientação e supervisão da Profa. Dra. Ester Silveira Ramos do

Departamento de Genética da FMRP-USP e do Prof. Dr. Geraldo Duarte do Departamento

de Ginecologia e Obstetrícia da FMRP-USP.

Adicionalmente, foi acrescentado um segundo grupo controle, composto por 302

indivíduos (204 do sexo feminino não grávidas e 98 do sexo masculino) saudáveis da

população geral com idades entre 18 e 35 anos como um segundo grupo controle (Tabela 2).

Tabela 2: Caracterização quanto ao sexo de um segundo grupo controle constituído por homens e mulheres não grávidas saudáveis, da população geral.

População Número de Indivíduos

Sexo feminino 98

Sexo masculino 204

Total 302

3.2 - Análise molecular

As análises moleculares foram realizadas no Laboratório do Grupo de Epigenética e

Reprodução do Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto –

USP. O seqüenciamento automático foi realizado no Laboratório de Genética Molecular e

Bioinformática (LGMB) do Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto – USP e no Laboratório de Biologia Molecular de Plantas (LBMP) do Departamento de

Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP.

3.2.1 - Coleta de sangue periférico

Após leitura e assinatura do TCLE (Anexo A) por parte de cada doadora, foram

coletados 5-10 ml de sangue venoso periférico em tubos estéreis, a vácuo, contendo EDTA.

3.2.2 - Extração de DNA genômico

O DNA genômico de todas as amostras coletadas foi extraído por meio de

precipitação salina (NaCl) por meio de método modificado de OLERUP & ZETTERQUIST

(1992). Ao volume de 1,0ml de sangue periférico foi adicionado 0,5ml de Tampão de Lise

[Sacarose 0,32M; Tris HCl 12mM (pH 7,5); MgCl2 5,0M; Triton X 1,0%] em microtubos de

1,5ml. As amostras foram centrifugadas a 16000 g por 20 segundos, o sobrenadante

descartado e o procedimento repetido com adição de 1,0ml de Tampão de Lise até a

obtenção de pellet branco. O pellet foi ressuspendido em 80μl de Tampão de Proteinase K

(5X) [NaCl 0,375M; EDTA (pH8,0) 0,12 M], 8,0μl de proteinase K (20ng/ml), 10μl de SDS

20% e 283,3μl de água destilada e deionizada e incubado à 55°C por 16 horas. Foram

adicionados 120μl de NaCl 5M e após agitação por 15 segundos a amostra foi centrifugada

a 16000 g por 8 minutos. O sobrenadante foi transferido para outro microtubo de 1,5ml,

onde foi adicionado 1,0ml de etanol à 20°C, homogeneizado por inversão manual e

centrifugado por 10 minutos à 16000 g a uma temperatura de 4°C. O sobrenadante foi

descartado e o pellet restante desidratado. O pellet foi ressuspendido em 50μl de água

destilada e deionizada.

3.2.3 - Seleção e validação dos primers

Para obtermos a seqüência específica dos três pares de primers utilizados, foi

realizado um estudo preliminar in silico da região de interesse do gene CDKN1C utilizando-

se o banco de dados do programa GenBank (GENBANK, 2008), sob identificação de acesso

D64137.

Após conferirmos a região de interesse do gene CDKN1C, o desenho dos primers

para a região dos intron 1 e exon 2 foram obtidos de acordo com a posição física

NC_000011 de 2906424 a 2906314. As seqüências de primers denominadas de Primers 1

(seqüência sense: 5’ – TCTTCTCGCTGTCCTCTCCT – 3’ e antisense: 5’-

CGCCCCACCTGCACCGTCT – 3’) e Primers 2 (seqüência sense: 5’ –

GAACCGCTGGGATTACGAC – 3’ e antisense: 5’- GAGCCAGGACCGGGACT – 3’) foram

construídas em consenso com os primers descritos por LEW et al. (2004) originando

amplicons de 348 e 293 pares de bases (pb) respectivamente (Tabela 3) (Figura 2).

Neste estudo in silico, sob o mesmo número de acesso D64137 e a mesma

localização física do gene CDKN1C (NC_000011 de 2906424 a 2906314), as seqüências de

primers denominadas de Primers 3 (seqüência sense: 5’ – CTGCCTAGTGTCCCGGTC – 3’

e antisense: 5’- CGCGCTGCCCCTGGTTC – 3’, amplicon de 297 pb) foram identificadas a

partir das seqüências de aminoácidos de interesse descritos por NIELSEN et al. (2005).

Para isso, transpusemos estas seqüências de aminoácidos para a forma de códons e em

seguida alinhamos as seqüências de nucleotídeos para identificar as seqüências específicas

da região de interesse, possibilitando desenhar e validar as seqüências referente ao Primers

3 neste estudo (Tabela 3) (Figura 2).

Tabela 3: Seqüências de primers obtidas para análise molecular do gene CDKN1C.

Nome do primer

Seqüência Amplicon Posição física

Primers 1

sense: 5’ – TCTTCTCGCTGTCCTCTCCT – 3’

antisense: 5’- CGCCCCACCTGCACCGTCT – 3’

348 pb intron 1 + exon 2

(2906424-2906772)

Primers 2

sense: 5’ – GAACCGCTGGGATTACGAC – 3’

antisense: 5’- GAGCCAGGACCGGGACT – 3’

293 pb exon 2

(2906254-2906546)

Primers 3

sense: 5’ – CTGCCTAGTGTCCCGGTC – 3’

antisense: 5’- CGCGCTGCCCCTGGTTC – 3’

297 pb exon 2

(2906020-2906314)

tcttctcgctgtcctctcctctctcgtgcccgcgtttgcgcagccccgggccatgtccgacgcgtccctccgca

gCACATCCACGATGGAGCGTCTTGTCGCCCGTGGGACCTTCCCAGTACTAGTGCGCACCAGCGCCT

GCCGCAGCCTCTTCGGGCCGGTGGACCACGAGGAGCTGAGCCGCGAGCTGCAGGCCCGCCTGGC

CGAGCTGAACGCCGAGGACCAGAACCGCTGGGATTACGACTTCCAGCAGGACATGCCGC

TGCGGGGCCCTGGACGCCTGCAGTGGACCGAAGTGGACAGCGACTCGGTGCCCGCGTTCTACCGC

GAGACGGTGCAGGTGGGGCGCTGCCGCCTGCTGCTGGCGCCGCGGCCCGTCGCGGTCG

CGGTGGCTGTCAGCCCGCCCCTCGAGCCGGCCGCTGAGTCCCTCGACGGCCTCGAGGAGGCGCC

GGAGCAGCTGCCTAGTGTCCCGGTCCCGGCCCCGGCGTCCACCCCGCCCCCAGTCCCGGTCCTGGCTCCAGCCCCGGCCCCGGCTCCGGCTCCGGTCGCGGCTCCGGTCGCGGCTCCG

GTCGCGGTCGCGGTCCTGGCCCCGGCCCCGGCCCCGGCTCCGGCTCCGGCTCCGGCCCCGGCTCCAGTCGCGGCCCCGGCCCCAGCCCCGGCCCCGGCCCCGGCCCCGGCCCCCGCCCCGGCCCCGG

CCCCGGACGCGGCGCCTCAAGAGAGCGCCGAGCAGGGCGCGAACCAGGGGCAGCGCG

Figura 2. Fragmento de interesse com posição física NC_000011 de 2906424 a 2906314 da seqüência 5’-3’ do gene CDKN1C humano obtido sob identificação D64137 do banco de dados do programa GenBank. Em letras minúsculas, em negrito e em itálico está representada parte da seqüência do intron 1 e em letras maiúsculas parte da seqüência do exon 2. Na cor amarela estão representadas as seqüências de primers que geram um amplicon de 348 pb (Primers 1) e flanqueiam região do intron 1 e exon 2. As seqüências de primers que flanqueiam o exon 2 estão na cor rosa (Primers 2 - amplicon de 293 pb) e na cor vermelha (Primers 3 - amplicon de 297 pb).

3.2.4 - Identificação da seqüência de aminoácidos do gene CDKN1C humano

Em outro estudo in silico, obtivemos a seqüência de aminoácidos a partir da

seqüência codificadora do gene CDKN1C humano (sob o mesmo número de acesso

D64137) utilizado o banco de dados dos programas GenBank (GENBANK, 2008) e UniProt

(disponível em http://www.uniprot.org/) (Figura 3).

MSDASLRSTSTMERLVARGTFPVLVRTSACRSLFGPVDHEELSRELQARLAELNAEDQNRWDYDFQQDMPLRGPGRLQWTEVDSDSVPAFYRETVQVGRCRLLLAPRPVAVAVAVSPPLEPAAESLDGLEEAPEQLPSVPVPAPASTPPPVPVLAPAPAPAPAPVAAPVAAPVAVAVLAPAPAPAPAPAPAPAPVAAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPDAAPQESAEQGANQGQRGQEPLADQLHSGISGRPAAGTAAASANGAAIKKLSGPLISDFFAKRKRSAPEKSSGDVPAPCPSPSAAPGVGSVEQTPRKRLR

Figura 3. Sequência de aminoácidos do gene CDKN1C humano.

3.2.5 – Reação em Cadeia da Polimerase

Para a amplificação por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase, do inglês

Polymerase Chain Reaction), as amostras de DNA genômico extraído do sangue periférico

(template) tiveram suas concentrações auferidas em espectrofotômetro e foram diluídas

para a concentração de 100 ng/μl utilizando água destilada e deionizada.

A PCR foi realizada em um termociclador eletrônico, seguindo protocolos descritos

em INNIS et al. (1990) e seguindo instruções do fabricante dos primers e da enzima DNA

Polimerase (Taq DNA Polymerase Recombinant e Platinum® Pfx DNA Polymerase ambas

Invitrogen®).

Os produtos de PCR durante a padronização foram visualizados em gel de

poliacrilamida (8%) corado com nitrato de prata e revelado com carbonato de sódio. Optou-

se pela padronização em gel de poliacrilamida devido à nitidez e a fidelidade de visualização

de bandas dessa metodologia quando comparada à metodologia de visualização por meio

de gel de agarose (2%) corado com brometo de etídio.

Todos os géis de poliacrilamida foram corados com nitrato de prata e revelados com

carbonato de sódio utilizando o seguinte protocolo: o gel foi retirado da placa e colocado em

repouso em solução de etanol 10% por no mínimo dez minutos. Foi retirada toda solução de

etanol 10% e adicionada solução de ácido nítrico 1,54% e deixado em agitador (shaker) por

3 minutos. Após agitação, foi retirada toda solução de ácido nítrico e feita lavagem com

água destilada e deionizada para que em seguida fosse aplicada solução de nitrato de prata

0,2% e o gel agitado por 20 minutos. Toda solução de nitrato de prata foi retirada e lavada

três vezes com água destilada e deionizada. Após a lavagem, foi aplicada a solução de

carbonato de sódio acrescida de 108 μl de formaldeído e agitada até atingir a coloração

desejada. Para encerrar a reação de coloração foi aplicada solução de ácido acético 5%.

As PCRs para as seqüências dos Primers 1, Primers 2 e Primers 3, que

compreendem a região do intron 1 e do exon 2 do gene CDKN1C humano (Figura 4), foram

padronizadas conforme demonstram as bandas únicas presentes na altura de 348 pb, 293

pb e 297 pb, respectivamente. A eficiência da reação pode ser comprovada por meio da

intensidade e nitidez das bandas e principalmente por meio da ausência de bandas

inespecíficas derivadas de pareamento errôneo dos primers ao DNA template.

A ausência de bandas inespecíficas nos controles negativos demonstrou que não

houve contaminação.

Figura 4. Imagem de gel de poliacrilamida onde é observado o marcador (ladder) de 100 pb seguido de três amostras-controle utilizadas para a padronização dos primers específicos para a PCR das regiões do intron 1 e do exon 2 compreendendo amplicons de 348 pb (Primers 1), 293 pb (Primers 2) e 297 pb (Primers 3).

200 pb -

300 pb -

100 pb -

LADDER Primer Primer Primer 1 2 3

348 pb -

293 pb - 297 pb -

Para amplificação por PCR da região de interesse dos Primers 1, a padronização

final das condições para cada amostra teve o meio de reação (mix) composto por: 18,80 µl

de água destilada e deionizada, 2,5 µl de Buffer (tampão) [10X: 200 mM tris-HCl; 500 mM

KCl], 1,0 µl de MgCl2: [50 mM], 0,5 µl de dNTP [10 mM], 0,5 µl de primer sense [10 pmoles],

0,5 µl de primer anti-sense [10 pmoles], 0,2 µl de Taq DNA Polymerase (Invitrogen®) [5 U/µl]

e como template 1µl de DNA [100 ng/ µl] (Tabela 4). A ciclagem ou programa do

termociclador eletrônico programável (modelo Biometra T-Gradient®), independentemente

do número de amostras foi: denaturação inicial 94°C por 5 minutos, 35 ciclos de 94°C por 30

segundos, 65°C por 30 segundos e 72°C por 30 segundos, extensão final de 72°C por 10

minutos e 10°C por 5 minutos para finalizar e inativar a reação.

Na amplificação por PCR da região de interesse dos Primers 2, foi otimizada para

cada amostra o meio de reação composto por: 19,30 µl de água destilada e deionizada, 2,5

µl de Buffer (tampão) [10X: 200 mM tris-HCl; 500mM KCl], 0,5 µl de MgCl2: [50 mM], 0,5 µl

de dNTP [10 mM], 0,5 µl de primer sense [10 pmoles], 0,5 µl de primer anti-sense [10

pmoles], 0,2 µl de Taq DNA Polymerase (Invitrogen®) [5 U/µl] e como template 1 µl de DNA

[100 ng/ µl] (Tabela 4). O programa do termociclador (modelo Biometra T-Gradient®)

utilizado foi: denaturação inicial 94°C por 5 minutos, 35 ciclos de 94°C por 45 segundos,

57°C por 30 segundos e 72°C por 30 segundos, extensão final de 72°C por 10 minutos e

10°C por 5 minutos finalizando a reação.

Tabela 4: Reagentes utilizados para a PCR da região de interesse dos Primers 1 e Primers 2 do gene CDKN1C humano.

Reagentes utilizados Volume de reagentes por amostra

Primers 1 Primers 2

Água destilada e deionizada 18,80 µl 19,30 µl

Tampão 2,5 µl [10X: 200 mM tris-HCl; 500mM KCl],

2,5 µl [10X: 200 mM tris-HCl; 500mM KCl],

MgCl2 1,0 µl [50 mM] 0,5 µl [50 mM]

dNTP 0,5 µl [10 mM], 0,5 µl [10 mM]

primer sense 0,5 µl [10 pmoles] 0,5 µl [10 pmoles]

primer anti-sense 0,5 µl [10 pmoles] 0,5 µl [10 pmoles]

Taq DNA Polymerase Recombinant (Invitrogen®)

0,2 µl [5 U/µl] 0,2 µl [5 U/µl]

DNAg molde 1 µl de DNA [100 ng/ µl] 1 µl de DNA [100 ng/ µl]

Devido a características específicas da região de interesse dos Primers 3,

flanqueando uma pequena região repetitiva, a padronização da PCR se mostrou um pouco

mais complicada no que tange à especificidade da reação, uma vez que era comum o

aparecimento de bandas inespecíficas. Para solucionar esse problema foi necessária a

utilização de enzima DNA polimerase high-fidelity com atividade exonuclease 3’ – 5’

(proofreading), de maior especificidade no pareamento dos primers e maior fidelidade na

síntese de novas cópias do template durante a reação. Portanto, essa reação foi

padronizada e otimizada utilizando-se para cada reação: 1,25 µl de Buffer Platinum PFX

[10X: Sulfato de Amônia concentração não divulgada], 0,25 µl de MgSO4 Platinum PFX [50

mM], 0,25 µl de dNTP [10 mM], 0,25 µl de primer sense [10 pmoles], 0,25 µl de primer anti-

sense, 9,65 µl de água destilada e deionizada, 0,1 µl de Platinum® Pfx DNA Polymerase

(Invitrogen®) [2,5 U/µl]e 0,5µl de DNA [100 ng/ µl] de template (Tabela 5).

Tabela 5: Reagentes utilizados para a PCR da região de interesse dos Primers 3 do gene CDKN1C humano.

Reagentes utilizados Volume de reagentes por amostra

(Primer 3)

Água destilada e deionizada 9,65 µl

Buffer Platinum PFX 1,25 µl [10X],

MgSO4 Platinum PFX 0,25 µl [50 mM]

dNTP 0,25 µl [10 mM],

primer sense 0,25 µl [10 pmoles]

primer anti-sense 0,25 µl [10 pmoles]

Platinum® Pfx DNA Polymerase (Invitrogen®)

0,1 µl [2,5U/µl]

DNAg molde 0,5 µl de DNA [100 ng/ µl]

A reação referente aos Primers 3 também foi realizada em termociclador eletrônico

(modelo Biometra T-Gradient®), onde as condições ideais foram: denaturação inicial 94°C

por 3 minutos, 40 ciclos de 94°C por 20 segundos, 66°C por 30 segundos e 68°C por 15

segundos, extensão final de 68°C por 5 minutos e 10°C por 5 minutos finalizando a reação.

As três reações foram padronizadas utilizando-se temperatura inicial de denaturação,

ciclagens de três passos (composta por temperatura de denaturação, temperatura de

annealing ou de pareamento dos primers e temperatura de extensão ou síntese ou

polimerização), temperatura de extensão final e temperatura de inativação ou finalização.

3.2.6 – Polimorfismo Conformacional de Fita Simples (SSCP)

Na técnica de polimorfismo conformacional de fita simples (ou SSCP do inglês Single

Strand Conformational Polymorphism), após a corrida eletroforética, quando existe uma

variante do gene, é possível observar alteração no padrão de migração das bandas que

pode ser devido à variação de apenas um nucleotídeo, seja essa variação do tipo frameshift

ou troca de bases (bases púricas e/ou pirimídicas). Portanto, a presença de apenas uma

base alterada no fragmento amplificado pela PCR modifica a interação intramolecular, que

pode induzir a uma mudança na conformação estrutural terciária adquirida pela fita simples

de DNA que poderá ser detectada por meio de diferenças na mobilidade migratória no gel.

(NOLL & COLLINS, 1987; HONGYO et al., 1993).

Na corrida do gel para SSCP é comum ocorrer a formação de heteroduplex, que

consiste em uma molécula de DNA (fita-dupla) híbrida formada pelas fitas simples de dois

alelos distintos, que também pode ser utilizada como referência no padrão de migração do

produto de PCR no gel.

Durante a corrida do gel de SSCP não é necessária a utilização de marcador de

pares de bases (ladder) como padrão para obtenção do padrão de migração tendo em vista

que devido à conformação estrutural tridimensional, os fragmentos denaturados (fita simples

de DNA) migram no gel de forma muito mais lenta que os fragmentos de fita dupla que estão

presentes no ladder e dos que são provenientes do produtos de PCR que naturalmente se

renaturam (voltam a formar dupla fita) após o aquecimento, mesmo com a presença de

tampão denaturante. O ladder nesta técnica é utilizado para verificar a integridade do gel e

auxiliar como controle de coloração no protocolo usado para corar o gel de poliacrilamida.

Para a realização da técnica de PCR-SSCP, previamente as amostras foram

submetidas à amplificação da PCR com os respectivos primers flanqueando as regiões de

interesse, sendo os produtos submetidos à corrida eletroforética em gel de agarose 2%

corado com brometo de etídio para se verificar a presença do fragmento amplificado.

Posteriormente o material considerado de boa qualidade era submetido à corrida em gel de

SSCP. As amostras de baixa qualidade tinham a PCR refeita até apresentarem padrão de

banda satisfatório para serem submetidas a técnica de screening.

O SSCP foi verificado por meio de corrida eletroforética em géis de poliacrilamida

10% não denaturante (cada gel composto por 14.600 µl de água destilada e deionizada,

10.200 µl de poliacrilamida, 3.000 µl de TBE - tris/borato EDTA 10X, 450 µl de persulfato de

amônia – PSA e 22,5 µl do catalítico TEMED) e tampão de corrida composto por TBE

(tris/borato EDTA) 1X. Na padronização das amostras a serem aplicadas no gel, foram

utilizados diferentes volumes de produto de PCR e diferentes volumes de solução

denaturante (loading buffer) específica (impede a renaturação da dupla-fita de DNA)

composta por 0,015 g de azul de bromofenol, 0,015 g de xileno-cianol, 200 µl de EDTA 0,5M

pH 8,0 e 9,75 ml de formamida deionizada.

Em microtubos de 200 µl foram misturados e homogeneizados os corretos volumes

de produto de PCR e tampão denaturante formando o mix do SSCP. Estes mix foram

aquecidos em termociclador a 94°C para a denaturação da dupla-fita de DNA por 5 minutos

e rapidamente foram aplicados no gel e submetidos à corrida eletroforética. De forma geral,

nesta padronização primeiramente foram observadas características específicas de cada

produto amplificado [quantidade de bases de adenina (A), timina (T), citosina (C) e guanina

(G), comprimento do amplicon e eficiência da PCR previamente padronizada] para em

seguida serem observadas as características secundárias da padronização como o tempo

da corrida do gel e a tensão (Volts - V), corrente (mili-Ampéres - mA) e a potência (watts -

W) elétrica utilizadas (Tabela 6).

Tabela 6: Condições das amostras, do gel e da corrida de eletroforese padronizadas para a técnica de PCR-SSCP referentes às regiões de interesse dos Primers 1, Primers 2 e Primers 3.

Condições das amostras e do gel de eletroforese de SSCP

Produto de PCR da região de interesse

Primer 1 Primer 2 Primer 3

Volume de produto de PCR por amostra

8 l 5 l 6 l

Volume de tampão denaturante por amostra

2 l 2 l 5 l

Volume total do gel e concentração de poliacrilamida

28.272,5 l [10%] 28.272,5 l [10%] 28.272,5 l [10%]

Volume do tampão de corrida TBE (tris/borato EDTA) 1X

2.000 ml 2.000 ml 2.000 ml

Tensão (V), corrente (mA) e potência (W) elétrica da corrida

do gel

130V, 30mA, 30W 100V, 40mA, 40W 80V, 40mA, 40W

Tempo de corrida do gel 24 horas 23 horas 17 horas

Temperatura de corrida do gel 5°C 5°C 5°C

As amostras para a corrida de gel SSCP para os Primers 1 (amplicon de 348 pb)

foram otimizadas utilizando-se um total de 8 μl de produto de PCR adicionado de 2 μl de

tampão denaturante (volume final de mix de 10 μl) com as amostras sendo aquecidas em

termociclador a 94°C para a denaturação da dupla-fita de DNA por 5 minutos e subseqüente

aplicação no gel. A corrida eletroforética foi realizada com tampão TBE (tris/borato EDTA)

1X com tempo de corrida de 24 horas a 130 volts, 30 mili-Ampéres e 30 watts. Após a

corrida do gel em temperatura controlada (aproximadamente 5°C), o mesmo foi corado com

nitrato de prata e revelado com carbonato de sódio para permitir a visualização das bandas

(Tabela 6 e Figura 5).

Figura 5. Imagem de gel de SSCP com um ladder de 1000pb seguido de oito amostras-controle (1-8) utilizadas para a padronização dos primers específicos da região dos Primers 1, onde não ocorreu alteração no padrão de migração das bandas. O ladder de 1000 pb foi utilizado apenas para verificar a integridade do gel, uma vez que ele não serve de padrão para a migração de bandas do gel de SSCP.

Na Figura 4 não se observa diferença no padrão de migração, demonstrando que os

controles utilizados na padronização da técnica possuem as seqüências de nucleotídeos do

amplicon de 348 pb (Primer 1) semelhantes entre si.

LADDER 01 02 03 04 05 06 07 08

5000 pb -

6000 pb -

Para o amplicon da região dos Primers 2 (amplicon de 293 pb) utilizou-se um total de

5 μl de produto de PCR adicionado de 2 μl de tampão denaturante (volume final de mix de 7

μl) com as amostras aquecidas em termociclador a 94°C para a denaturação da dupla-fita

de DNA por 5 minutos. A corrida eletroforética foi realizada com tampão TBE (tris/borato

EDTA) 1X a 100 volts, 40 mili-Ampéres e 40 watts com tempo de corrida de 23 horas

(Tabela 6 e Figura 6).

Figura 6. Imagem de um gel de SSCP com um ladder de 1000pb seguido de oito amostras-controle utilizadas para a padronização dos primers específicos da região do Primer 2 onde não ocorreu alteração no padrão de migração das bandas. O ladder de 1000 pb foi utilizado apenas para verificar a integridade do gel, uma vez que ele não serve de padrão para a migração de bandas do gel de SSCP.



amplicon de 293 pb (Primer 2) iguais.

3000 pb -

4000 pb - LADDER 01 02 03 04 05 06 07 08

Semelhantemente à PCR-SSCP dos Primers 1 e Primers 2, para o amplicon da

região dos Primers 3 (de 297 pb) utilizou-se 6 μl de produto de PCR adicionado de 5 μl de

tampão denaturante (volume final de mix de 11 μl) com as amostras igualmente aquecidas

em termociclador a 94°C para a denaturação da dupla-fita de DNA por 5 minutos. A corrida

eletroforética foi realizada com tampão TBE (tris/borato EDTA) 1X com tempo de corrida de

17 horas a 80 volts, 40 mili-Ampéres e 40 watts (Tabela 6 e Figura 7).

Figura 7. Imagem de um gel de SSCP com um ladder de 1000pb seguido de oito amostras-controle utilizadas para a padronização dos primers específicos da região do Primer 3 onde não ocorreu alteração no padrão de migração das bandas. O ladder de 1000 pb foi utilizado apenas para verificar a integridade do gel, uma vez que ele não serve de padrão para a migração de bandas do gel de SSCP.



amplicon de 297 pb (Primer 3) semelhantes.

Todas as amostras teste que apresentaram padrão de migração diferente dos

demais foram submetidas a no mínimo cinco novas PCRs para excluir a possibilidade da

variável ter sido criada amplificação por PCR (erro na síntese da nova fita por parte da

enzima DNA polimerase) ou durante o preparo e execução da técnica de SSCP e para

permitir a reprodutibilidade da técnica confirmando que realmente em determinada amostra

havia um novo e diferente padrão de migração de bandas. Estas amostras que

apresentaram novo padrão de migração, ao serem detectadas, imediatamente passavam a

3000 pb -

4000 pb - LADDER 01 02 03 04 05 06 07 08

fazer parte de todos os géis de SSCP seguintes, servindo como um novo padrão e controle

para o restante das amostras que estavam sendo estudadas por meio da técnica de PCR-

SSCP. É importante ressaltar que em todos os géis de SSCP havia uma amostra do padrão

predominante que era repetida no gel seguinte.

3.2.7 – Seqüenciamento automático de nucleotídeos

Após a detecção do padrão de migração alterado por SSCP, as amostras alteradas e

os controles foram submetidos a uma nova PCR e tiveram seus produtos amplificados

corridos em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio, onde tiveram suas bandas na

posição de seus respectivos amplicons retiradas do gel e purificadas com o kit de

purificação Illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit® (GE Healthcare) seguindo

os protocolos do fabricante.

Concluído o processo de purificação, estas amostras seguiram os protocolos da

reação de seqüenciamento automático de nucleotídeos utilizados para o seqüenciador

automático ABI Prism 3130 Genetic Analyzer fazendo-se uso do kit de seqüenciamento ABI

Prism Big Dye Terminator v3.0® (Applied Biosystems) de acordo com os protocolos do

fabricante.

A reação de precipitação da reação de seqüenciamento foi realizada por meio do

seguinte protocolo: foi adicionado 80µl de álcool isopropílico 65% ao produto final de cada

amostra da reação de seqüenciamento, homogeneizado e colocado em repouso ao abrigo

da luz por no mínimo 1 hora. As amostras foram centrifugadas a 16.000 g por 30 minutos à

temperatura ambiente. O próximo passo foi a retirada de todo o álcool isopropílico da

amostras para ser adicionado 250µl de etanol 70 % e centrifugado a 16.000 g por 15

minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, todo o etanol foi removido para as

amostras serem secadas, ao abrigo da luz, em placa aquecedora (termoplaca, termociclador

ou estufa estéril) a 37°C por 15 minutos. As amostras foram ressuspendidas em 10µl de Hi-

Di Formamide® (Applied Biosystems) antes de serem colocadas no seqüenciador.

Na reação de seqüenciamento, os primers sense e anti-sense de cada par (Primers 1,

Primers 2 e Primers 3) foram adicionados separadamente em cada amostra com a

finalidade de obtermos as seqüências de nucleotídeos das fitas simples de forma separada,

para em seguida por meio de programas de bioinformática Mult Alin (CORPET, F. 1988) e

GeneRunner (versão 3.05 – sob licença livre da Hastings Software, 1994) unirmos e

alinharmos às seqüências das fitas simples complementares.

Para detectar a qualidade da reação analisando os cromatogramas referentes ao

seqüenciamento de cada fita simples, foi utilizado o software Finch TV (versão 1.4.0 – sob

licença livre da Geospiza Inc., 2004-2006).

3.2.8 - Identificação in silico de variantes no gene CDKN1C humano

A presença de polimorfismos descritos e seqüências repetitivas foi realizada por meio

dos programas BLAST SNP Sequence (disponível em

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/), International HapMap Project (disponível em:

http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/index.html.en) e RepeatMasker Open-3.0 (SMIT et al., 1996)

disponível em http://repeatmasker.org). Outras variantes para o gene CDKN1C humano

também foram pesquisadas na literatura.

3.3 – Análise estatística

Para o cálculo das freqüências alélica e genotípica, utilizou-se o procedimento GLM

do software SAS (SAS - Statistical Analysis System, 2003) com p<0,05 sendo considerado

significativo.

O Teste Exato de Fisher (two tails, p<0,05 significativo) foi utilizado para observar

variações entre os grupos estudados (PE, eclâmpsia, HG, HC e grupo controle), os dados

dos prontuários das pacientes (peso do recém nascido em relação à idade gestacional,

idade materna) e os genótipos encontrados.

O teste de comparação de médias (Teste de Tukey com p<0,05 significativo) foi

utilizado para comparar a média dos valores obtidos a partir dos dados dos prontuários

também utlizando-se o software SAS.

O número de pacientes por grupo, média de idade das pacientes e média da idade

gestacional foram calculados com o auxílio do software Microsoft® Excel.

IV. RESULTADOS

4.1- Reação em cadeia da polimerase e Polimorfismo Conformacional de Fita

Simples (PCR-SSCP)

De todas as amostras analisadas para o gene CDKN1C por meio da técnica de PCR-

SSCP, quatro apresentaram variação no padrão de migração durante a corrida eletroforética.

Para a região de análise dos Primers 1 (amplicon de 348 pb), foram detectadas

alterações do padrão de migração das bandas do gel de SSCP em uma amostra do grupo

controle (1/162), de número 789 do registro de DNA do laboratório (Figura 8); e de uma

amostra do grupo controle da população geral (1/302) de registro número 236 (Figura 9).

Figura 8. Imagem de um gel de SSCP com quatro amostras mostrando o padrão de migração das bandas para o amplicon dos PCR-SSCP dos Primers 1. Nota-se a alteração no padrão de migração da amostra 789 (grupo controle). O padrão de migração das bandas das amostras 795, 844 e 852 (grupo controle) foi considerado como predominante.

795 789 844 852

Figura 9. Imagem de um gel de SSCP com quatro amostras mostrando o padrão de migração das bandas para o amplicon dos PCR-SSCP dos Primers 1. Nota-se a alteração no padrão de migração da amostra 236 (grupo controle da população geral). O padrão de migração das bandas das amostras 234, 235 e 237 (também do grupo controle da população geral) foi considerado como predominante.

234 235 236 237

Na região de interesse dos Primers 2 (amplicon de 293 pb), foi detectada alteração

do padrão de migração das bandas do gel de SSCP em duas amostras, sendo ambas do

grupo das portadoras de HAC (2/42) e que possuíam os números de DNA 484 e 859 (Figura

10).

Figura 10. Imagem de um gel de SSCP com quatro amostras mostrando o padrão de migração das bandas para o amplicon da região dos Primers 2. Nota-se a alteração no padrão de migração das bandas das amostras 484 e 859 (grupo das portadoras de HAC). O padrão de migração das amostras 413 e 240 (grupo das portadoras de HAC) foi considerado como normal (predominante).

Todas as amostras restantes analisadas sob as condições de PCR-SSCP para os

Primers 1, Primers 2 apresentaram padrão de migração normal, ou considerado

predominante.

413 484 859 240

Na região de interesse dos Primers 3 (amplicon de 297 pb), não foi detectada

alteração do padrão de migração das bandas do gel de SSCP, portanto, todas as amostras

apresentaram mesmo padrão de migração de bandas (Figura 11).

Figura 11. Imagem de um gel de SSCP com quatro amostras mostrando o padrão de migração das bandas para o amplicon da região dos Primers 3. Não foi possível notar alteração no padrão de migração das bandas das amostras 236 (grupo controle da população geral), 484 e 859 (grupo das portadoras de HAC) e 789 (grupo controle). Este padrão de migração foi considerado como normal (predominante).

236 484 789 859

4.2- Seqüenciamento automático de nucleotídeos e alinhamento de seqüências

4.2.1 – Primers 1

A amostra 789 do grupo controle, após ter sido submetida ao seqüenciamento

automático de nucleotídeos, apresentou uma alteração do tipo troca de bases (inversão)

pirimídicas, confirmado a alteração encontrada no gel de SSCP (Figura 8). Um nucleotídeo

C (citosina) foi substituído por um nucleotídeo T (timina) em um de seus alelos, conferindo a

esta amostra o genótipo de heterozigota para a o polimorfismo +275C/T do gene CDKN1C

humano (Figura 12).

Figura 12. Imagem parcial do cromatograma com o resultado do seqüenciamento da amostra 789 referente aos Primers 1, onde é possível observar os picos sobrepostos (seta) indicando a presença de duas bases sobrepostas localizadas na mesma posição, consistindo em alelos heterozigotos.

Na posição 184 do amplicon dos Primers 1, ou INVS+275C/T do gene CDKN1C

humano, a seqüência referência do banco de dados do programa GenBank (identificação de

acesso D64137) possui uma base C nesta posição, conforme podemos observar no

alinhamento das seqüencias nucleotídicas entre a seqüência referência e a amostra 789

proveniente da reação de seqüenciamento, promovidas por meio do programa de

bioinformática Mult Alin (CORPET, F. 1988) (Figura 13).

Figura 13. Alinhamento das seqüências de nucleotídeos da seqüência referência GenBank e a amostra 789 do grupo controle. A seqüência “F” é proveniente do primer sense 5’-3’ e “R” do primer anti-sense, ambas dos Primers 1.

A amostra 236 do grupo controle da população geral, apresentou uma alteração do

tipo troca de bases (inversão) púricas, confirmado a alteração encontrada no gel de SSCP

(Figura 9). Um nucleotídeo A (adenina) foi substituído por um nucleotídeo G (guanina) em

um de seus alelos, conferindo a esta amostra o genótipo de heterozigota para a o

polimorfismo +317A/G do gene CDKN1C humano (Figura 14).

Figura 14. Imagem parcial do cromatograma com o resultado do seqüenciamento da amostra 236 referente aos Primers 1, onde é possível observar os picos sobrepostos (seta) indicando a presença de duas bases sobrepostas localizadas na mesma posição, consistindo em alelos heterozigotos.

Na posição 225 do amplicon dos Primers 1, ou INVS+317A/G do gene CDKN1C

humano, a seqüência referência do banco de dados do programa GenBank (identificação de

acesso D64137) possui uma base G nesta posição, conforme podemos observar no

alinhamento das seqüencias nucleotídicas entre a seqüência referência e a amostra 236

proveniente da reação de seqüenciamento, promovidas por meio do programa de

bioinformática Mult Alin (CORPET, F. 1988) (Figura 15).

Figura 15. Alinhamento das seqüências de nucleotídeos da seqüência referência GenBank e a amostra 236 do grupo controle da população geral. A seqüência “F” é proveniente do primer sense 5’-3’ e “R” do primer anti-sense, ambas dos Primers 1.

As amostras 484 e 859, pertencentes ao grupo HAC, que apresentaram variação na

corrida eletroforética do SSCP (Figura 10) em relação aos Primers 2, também foram

submetidas ao seqüenciamento automático de nucleotídeos utilizando-se os Primers 1,

mesmo após o resultado de PCR-SSCP dessas amostras terem sido semelhantes ao

padrão predominante. Estas amostras apresentaram seqüencias nucleotídicas idênticas às

da seqüência referência do banco de dados do programa GenBank (Figura 2, Figura 13 e

Figura 15).

Dessa forma, com exceção das amostras 789 e 236, todas as amostras analisadas

possuem genótipo CC para o polimorfismo +275C/T e genótipo AA para o polimorfismo

+317A/G do gene CDKN1C humano.

4.2.2 – Primers 2

As amostras 484 e 859 do grupo HAC, após serem submetidas ao seqüenciamento

automático de nucleotídeos, também apresentaram inversão de bases, confirmado as

alterações encontradas no gel de SSCP (Figura 10).

Na amostra 484 foi detectada a troca de um nucleotídeo C por G, ou seja, houve a

inversão de uma base pirimídica por uma púrica na posição +495C/G. Na amostra 859 foi

encontrada a troca de um nucleotídeo C por T (inversão de bases pirimídicas) na posição

+498C/T. As alterações singulares a cada amostra conferiram a elas genótipo heterozigoto

para seus respectivos polimorfismos (Figura 16).

Figura 16. Imagem parcial dos cromatogramas com os resultados do seqüenciamento das amostras 484 (A) e 859 (B) referentes aos Primers 2. Em ambas amostras é possível observar os picos sobrepostos (seta) indicando a presença de duas bases sobrepostas localizadas na mesma posição, consistindo alelos heterozigotos.

Na amostra 484, na posição 179 do amplicon dos Primers 2, ou INVS+495C/G do

gene CDKN1C humano, a seqüência referência do banco de dados do programa GenBank

(identificação de acesso D64137) possui uma base C nesta posição (Figura 17); já a

amostra 859, na posição 182 do amplicon dos Primers 2, ou INVS+498C/T, a seqüência

A B

referência também possui uma base C nesta posição (Figura 18), como podemos observar

no alinhamento das seqüencias nucleotídicas feitas pelo programa Mult Alin (CORPET, F.

1988).

Figura 17. Alinhamento das seqüências de nucleotídeos da seqüência referência GenBank e a amostra 484 do grupo HAC. A seqüência “F” é proveniente do primer sense 5’-3’ e “R” do primer anti-sense, ambas dos Primers 2.

Figura 18. Alinhamento das seqüências de nucleotídeos da seqüência referência GenBank e a amostra 859 do grupo HAC. A seqüência “F” é proveniente do primer sense 5’-3’ e “R” do primer anti-sense, ambas dos Primers 2.

A amostra 789, pertencente ao grupo controle, que apresentou variação na corrida

eletroforética do SSCP (Figura 8) em relação aos Primers 1, também foi submetida ao

seqüenciamento automático de nucleotídeos utilizando-se os Primers 2, apesar de seu

resultado de PCR-SSCP ter sido semelhante ao padrão predominante. Esta amostra

apresentou seqüencias nucleotídicas iguais às da seqüência referência do banco de dados

do programa GenBank (Figura 2 e Figura 17 ou Figura 18).

Esses dados nos permitem concluir, com exceção das amostras 484 e 859, que

todas as amostras analisadas possuem genótipo CC para os polimorfismos +495C/G e

+498C/T do gene CDKN1C humano.

As amostras 494 e 592 do grupo controle também foram seqüenciadas utilizando-se

os Primers 1, Primers 2 e Primers 3, e apresentaram suas seqüencias nucleotídicas

idênticas às da seqüência referência do banco de dados do programa GenBank,

confirmando e corroborando com os nossos achados por meio da técnica de PCR-SSCP e

seqüenciamento automático de nucleotídeos.

Adicionalmente, para serem utilizados como seqüência referência e auxiliar na

confirmação da seqüência das amostras do grupo controle, foram seqüenciados dois

indivíduos normais do sexo masculino, que apresentaram suas seqüencias nucleotídicas

idênticas às da seqüência referência do banco de dados do programa GenBank para os os

Primers 1, Primers 2 e Primers 3.

4.3 - Seqüência de aminoácidos

Com as alterações nucleotídicas detectadas após o seqüenciamento e a análise por

bioinformática, foi possível por meio do programa gene GeneRunner, simular in silico as

alterações encontradas na seqüência de nucleotídeos na seqüência de aminoácidos.

Pudemos observar que os polimorfismos +275C/T, +317A/G, +495C/G e +498C/T,

em um dos alelos, promovem alteração da seqüência de aminoácidos ao longo da cadeia

polipeptídica (ou estrutura primária). O polimorfismo +275C/T promove a troca do

aminoácido R (arginina – Arg) por C (cisteína – Cis), +317A/G promove a troca de Q

(glutamina - Gln) por R (arginina – Arg), +495C/G promove a troca de P (prolina – Pro) por A

(alanina – Ala) e +498C/T a troca de L (leucina – Leu) por F (fenilalanina – Fen) (Figura 19).

A) Seqüência referência:

MSDASLRSTSTMERLVARGTFPVLVRTSACRSLFGPVDHEELSRELQARLAE

LNAEDQNRWDYDFQQDMPLRGPGRLQWTEVDSDSVPAFYRETVQVGRCRL

LLAPRPVAVAVAVSPPLEPAAESLDGLEEAPEQLPSVPVPAPASTPPPVPVLA

PAPAPAPAPVAAPVAAPVAVAVLAPAPAPAPAPAPAPAPVAAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPDAAPQESAEQGANQGQRGQEPLADQLHSGISGRPAAGTAAASANGAAIKKLSGPLISDFFAKRKRSAPEKSSGDVPAPCPSPSAAPGVGSVEQTPRKRLR B) Seqüência polimórfica:

MSDASLRSTSTMERLVARGTFPVLVRTSACRSLFGPVDHEELSCELQARLAE

LNAEDRNRWDYDFQQDMPLRGPGRLQWTEVDSDSVPAFYRETVQVGRCRL

LLAPRPVAVAVAVSPAFEPAAESLDGLEEAPEQLPSVPVPAPASTPPPVPVLA

PAPAPAPAPVAAPVAAPVAVAVLAPAPAPAPAPAPAPAPVAAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPDAAPQESAEQGANQGQRGQEPLADQLHSGISGRPAAGTAAASANGAAIKKLSGPLISDFFAKRKRSAPEKSSGDVPAPCPSPSAAPGVGSVEQTPRKRLR

Figura 19. Seqüência de aminoácidos do gene CDKN1C humano. (A) Seqüência referência do banco de dados do programa GenBank; (B) Seqüência de aminoácidos polimórfica obtida a partir dos polimorfismos encontrados e análise in silico. Na cor rosa está representada a troca de Arg>Cis, na cor azul a troca de Gln>Arg, na cor verde a troca de Pro>Ala e em vermelho a troca de Leu>Fen.

4.4 - Pesquisa de SNPs em banco de dados

4.4.1 - Programa BLAST SNP Sequence e RepeatMasker Open-3.0

A pesquisa de polimorfismos únicos de troca de base (SNP – Single Nucleotide

Polymorphism) utilizando o Programa BLAST SNP Sequence, nos forneceu as seguintes

alterações: um frameshift, do tipo inserção de base, de uma citosina na região do intron 1 e

a troca de bases únicas no exon 2 representadas pelas letras R (pode ser adenina ou

guanina), W (adenina ou timina) e Y (citosina ou timina). Utilizando o programa

RepeatMasker Open-3.0, foi identificada uma região de repetição de 176pb, correspondente

a 23,40% do tamanho de toda região estudada (Figura 20).

A) Seqüência referência com os polimorfismos detectados na população analisada:

tcttctcgctgtcctctcctctctcgtgcccgcgtttgcgcagccccgggccatgtccgacgcgtccctccgca

gCACATCCACGATGGAGCGTCTTGTCGCCCGTGGGACCTTCCCAGTACTAGTGCGCACCAGCGCCT

GCCGCAGCCTCTTCGGGCCGGTGGACCACGAGGAGCTGAGCCGYGAGCTGCAGGCCCGCCTGGC

CGAGCTGAACGCCGAGGACCAGAACCGCTGGRATTACGACTTCCAGCAGGACATGCCGC

TGCGGGGCCCTGGACGCCTGCAGTGGACCGAAGTGGACAGCGACTCGGTGCCCGCGTTCTACCGC

GAGACGGTGCAGGTGGGGCGCTGCCGCCTGCTGCTGGCGCCGCGGCCCGTCGCGGTCG

CGGTGGCTGTCAGCCCGSCCYTCGAGCCGGCCGCTGAGTCCCTCGACGGCCTCGAGGAGGCGCC

GGAGCAGCTGCCTAGTGTCCCGGTCCCGGCCCCGGCGTCCACCCCGCCCCCAGTCCCGGTCCTGGCTCCAGCCCCGGCCCCGGCTCCGGCTCCGGTCGCGGCTCCGGTCGCGGCTCCG

GTCGCGGTCGCGGTCCTGGCCCCGGCCCCGGCCCCGGCTCCGGCTCCGGCTCCGGCCCCGGCTCCAGTCGCGGCCCCGGCCCCAGCCCCGGCCCCGGCCCCGGCCCCGGCCCCCGCCCCGGCCCCGG

CCCCGGACGCGGCGCCTCAAGAGAGCGCCGAGCAGGGCGCGAACCAGGGGCAGCGCG

B) Seqüência Blast SNP Sequence e RepeatMasker Open-3.0:

tcttctcgctgtcctctcctctctcg+Ctgcccgcgtttgcgcagccccgggccatgtccgacgcgtccctcc

gcagCACATCCACGATGGAGCGTCTTGTCGCCCGTGGGACCTTCCCAGTACTRGTGCGCACCAGC

GCCTGCCGCAGCCTCTTCGGGCCGGTGGACCACGAGGAGCTGAGCCGCGAGCTGCAGGCCCGCC

TGGCCGAGCTGAACGCCGAGGACCAGAACCGCTGGGATTACGACTTCCAGCAGGACATG

CCGCTGCGGGGCCCTGGACGCCTGCAGTGGACCGAAGTGGACAGCGACTCGGTGCCCGCGTTCTA

CCGCGAGWCGGTGCAGGTGGGGCGCTGCCGCCTGCTGCTGGCGCCGCGGCCCGTCGC

GGTCGCGGTGGCTGTCAGCCCGCCCCTCGAGCCGGCCGCTGAGTCCCTCGACGGCCTCGAGGAG

GCGCCGGAGCAGCTGCCTAGTGTCCCGGTCCCGGCCCCGGCGTCCACCCCGCCCCCAGYCCCGGTCCTGGCTCCAGCCCCGGCCCCGGCTCCGGCTCCGGTCGCGGCTCCGGTCGCGG

CTCCGGTCGCGGTCGCGGTCCTGGCCCCGGCCCCGGCCCCGGCTCCGGCTCCGGCTCCGGCCCCGGCTCCAGTCGCGGCCCCGGCCCCAGCCCCGGCCCCGGCCCCGGCCCCGGCCCCCGCCCCGGC

CCCGGCCCCGGACGCGGCGCCTCAAGAGAGCGCCGAGCAGGGCGCGAACCAGGGGCAGCGCG

Figura 20. Fragmento de interesse com posição física NC_000011 de 2906424 a 2906314 da seqüência 5’-3’ do gene CDKN1C humano obtido sob identificação D64137 do banco de dados do programa GenBank. (A) Em letras minúsculas,em negrito e em it[alico está representada parte da seqüência do intron 1 e em letras maiúsculas parte da seqüência do exon 2. Na cor amarela estão representadas as seqüências de Primers 1, na cor rosa Primers 2 e na cor vermelha Primers 3. Grifados na cor cinza estão os SNPs detectados (a letra S representa uma citosina ou guanina). (B) Grifados em verde estão os SNPs encontrados no programa BLAST SNP Sequence e grifado em amarelo está a seqüência repetitiva identificada pelo programa RepeatMasker Open-3.0.

4.5 - Análise estatísitca

Devido à ausência de variação nos genótipos estudados nos grupos de eclâmpsia,

PE, e HG, não foram realizadas as análises de freqüência alélica e genotípica.

No grupo controle, composto por 162 pacientes, foi encontrado o genótipo

heterozigoto +275 C/T em uma paciente (0,62%) e o genótipo homozigoto +275 C/C em 161

pacientes (99,38%). Em equilíbrio de Hardy-Weinberg, as freqüências alélicas encontradas

foram f(C)=0,997 e f(T)=0,003. Apesar do valor de p=0.001 aparentar ser extremamente

significativo estatisticamente, o resultado de heterozigoto para apenas um indivíduo não nos

permite adotar este valor como representativo para uma população.

No grupo controle da população geral, composto por 302 indivíduos (98 homens e

204 mulheres não grávidas) foi encontrado o genótipo heterozigoto +317 A/G em um

indivíduo (0,33%) e o genótipo homozigoto +317 A/A em todos os outros indivíduos

(99,67%), com freqüências alélicas f(A)=0,998 e f(G)=0,002 e em equilíbrio de Hardy-

Weinberg. Ao selecionar apenas o grupo feminino, no qual esse polimorfismo foi encontrado,

esta genótipo corresponde a 0,5% do grupo feminino (99,5%), com freqüências alélicas

f(A)=0,997 e f(G)=0,003 e em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Dessa forma neste grupo

controle da população geral, o valor de p=0.001 é significativo estatisticamente. No entanto,

houve o mesmo problema de número reduzido de indivíduos heterozigotos para uma análise

estatística mais adequada.

No grupo das portadoras de HAC (42 pacientes), foi encontrado o genótipo

heterozigoto +495 C/G em uma paciente (2,38%) e no restante das pacientes desse grupo

(41 pacientes - 97,62%) foi encontrado o genótipo homozigoto +495 C/C. As freqüências

alélicas encontradas foram de (C) 0,988 e (G) 0,012, que estão em equilíbrio de Hardy-

Weinberg. Neste grupo, o valor de p=0.006, apesar de demonstrar ser significativo (p<0.05),

de novo não pode ser levado em consideração como valor estatisticamente significativo,

devido ao baixo número de amostras.

Também no grupo HAC, foi encontro o genótipo heterozigoto +498 C/T em uma

paciente (2,38%) e no restante das pacientes HAC (41 pacientes - 97,62%) foi encontrado o

genótipo homozigoto +498 C/C, com f(C)=0,988 e f(T)=0,012. Sob a mesma ótica, o mesmo

valor de p=0.006, não pode ser levado em consideração como valor estatisticamente

significativo.

Os recém-nascidos (RN) foram subdivididos em Pequenos (PIG ou p<10), Grandes

(GIG ou p>90) e Adequados (AIG ou p≤90 e ≥10) para a Idade Gestacional (IG), de acordo

com a relação do peso ao nascimento e IG verificados em estudo populacional (HALL et al.,

2007).

Das 349 pacientes, 260 (74,5%) deram a luz a recém-nascidos (RN) AIGs, 37

(10.6%) a RNs GIGs, 27 (7,7%) a RNs PIGs. Três (0,85%) RNs nasceram abaixo de 27

semanas de gestação, cinco (1,45%) RN nasceram acima de 42 semanas de gestação (não

era possível inserir e analisar por meio do gráfico RNs que nasceram antes de 27 semanas

e depois de 42 semanas, tendo em vista que a escala do gráfico começava em 27 e

terminava em 42 semanas) e 17 (4,9%) RN não apresentavam os dados nos prontuários

para que fosse possível classificá-los. Quando utilizados, os testes de Fisher e do Qui-

quadrado não apresentaram valor estatisticamente significativo (p<0.05) entre esses dados.

Ao serem novamente classificados os RNs em peso em relação à IG, porém

separando as mães em grupos, as 159 mães do grupo controle tiveram 124 (76,54%) RNs

AIGs, 17 (10,49%) GIGs, oito (4,94%) PIGs; um (0,62%) abaixo de 27 semanas de gestação,

três (1,85%) acima de 42 semanas de gestação e nove (5,56%) não foram classificados. No

grupo PE, foram encontrados 56 AIGs (74,67%), oito PIGs (10,67%), sete GIGs (9,33%),

dois (2,67%) abaixo de 27 semanas de gestação e dois (2,67%) sem classificação e as

quatro portadoras de eclâmpsia tiveram RNs AIGs. No grupo HAC, 29 AIGs (69,05%),

quatro PIGs (9,52%), cinco GIGs (11,9%), um (2,38%) acima de 42 semanas de gestação e

3 (7,14%) sem classificação. Finalmente no grupo HG, foram encontrados 47 AIGs (71,21%),

sete PIGs (10,61%), oito GIGs (12,12%), um (1,52%) acima de 42 semanas de gestação e

trës (4,55%) permaneceram sem classificação. Os testes de Fisher e do Qui-quadrado não

apresentaram diferença estatisticamente significativa (p<0.05) entre esses grupos.

A idade média de idade materna de todo o grupo de mulheres grávidas foi de

aproximadamente 27 anos, onde a mais nova possuía 14 anos e a mais velha 42 anos, na

data da coleta dos dados. A média de idade materno do grupo controle foi de 26 anos

(menor idade encontrada de 14 anos e maior de 42 anos), no grupo de PE, a média foi de

27 anos (mínima de 15 e máxima de 42 anos), no grupo HAC a média foi de 30 anos (menor

idade encontrada 18 anos e maior 42 anos) e no grupo HG a média foi de 27 anos (menor

idade 16 e maior 41 anos). O teste de Tukey não apresentou valores estatisticamente

significativos (p<0,05) entre os valores das médias obtidas.

Dos dados dos RN disponíveis, 158 eram do sexo feminino e 173 do sexo masculino;

65 do sexo feminino e 88 do sexo masculino no grupo controle, 42 do sexo feminino e 34 do

sexo masculino no grupo PE/E, HAC 24 do sexo feminino e 15 do sexo masculino e HG 27

do sexo feminino e 36 do sexo masculino.

Analisando os dados disponíveis, 174 RN nasceram por meio de parto cesárea (PC)

e 158 nasceram de parto normal (PN). Dividindo nos grupos estudados, no grupo controle,

65 RN nasceram por meio de PC, 94 por meio de PN. No grupo PE/E, 49 PC e 28 PN; HAC

26 por meio de PC e por meio de 13 PN e HG 34 PC, 29 PN.

V. DISCUSSÃO

Das mulheres gestantes, cerca de 1% sofre complicações devidas à hipertensão

arterial pré-existente, de 5% a 6% é acometida por hipertensão gestacional sem proteinúria

e 2% sofre de PE (MAGEE et al., 2009). No nosso estudo, como o projeto inicial estava

focado em PE, as pacientes inicialmente eram recrutadas devido à hipertensão na gestação,

mas, muitas vezes o diagnóstico de PE só era confirmado ou excluído após a reavaliação

dos prontuários. Com isso, do universo de 349 amostras coletadas, o grupo controle (162)

representou 46,55% dos casos, PE (74) representou 21,26%, eclâmpsia (4) 1,15%, HAC

(42) 12,07% e HG (66) 18,97%.

Podemos observar que a frequência de PIG, AIG e GIG encontrados na população

estudada não são discrepantes quando inseridos na curva padrão descrita por

LUBCHENCO et al. (1963).

Estudos em diversos modelos de camundongos knockout ou trasngênicos confirmam

que a região 11p15.5 possui um importante cluster de genes que sofrem imprinting e que

são cruciais para o controle do crescimento fetal. Estes estudos sugerem grande relevância

na associação de alterações dessa região com as síndromes de Beckwith-Wiedemann e

Silver-Russell (NAGAYA et al., 2009).

Em mamíferos, muitos genes “marcados” estão envolvidos no controle do

crescimento fetal e são expressos em ambos os tecidos, placentário e fetal. Na placenta,

estes genes regulam o crescimento e a transferência de nutrientes (ANGIOLINI et al., 2006).

OUDEJANS et al. (2007) propuseram que variações de genes que contribuem para o

padrão e as características epigenéticas nos tecidos placentários, em especial os genes que

sofrem imprinting, devem ser mais investigados.

A atuação desses genes no crescimento fetal pode ser mediado, em partes, por meio

de mudanças no desenvolvimento placentário, particularmente na principal superfície de

transferência de nutrientes materno-fetais durante o final da gestação. Em modelos de

camundongos knockouts do gene CDKN1C, o labirinto trofoblástico é fracamente

vascularizado ou desproporcionalmente reduzido em tamanho, mas normal em relação às

suas estruturas (FOWDEN et al., 2006).

Alterações das características epigenéticas como hipermetilação ou hipometilação do

promotor do gene CDKN1C também têm sido relacionadas ao surgimento de alterações

mielóides malignas (HATZIMICHAEL et al., 2008) e neoplasias de ducto pancreático (SATO

et al., 2005).

Segundo LEE et al. (1997), em alelos mutantes herdados maternalmente a perda de

um único nucleotídeo G nesta seqüência hexanucleotídica (CGGCC) (denominada del347G

pelos autores), prevê a produção de uma proteína truncada composta por 24 aminoácidos

N-terminal mais seis aminoácidos, ocasionando a falta de produção do domínio inibidor de

CDK e do domínio QT (domínio que contém glutamina e treonina) tornando essa alteração

uma mutação nula e sem efeito. Mas essa alteração precisa ser melhor investigada na

população brasileira, uma vez que foram encontradas duas amostras (número 236-controle

da população geral e número 789, da população de gestantes-controles) com alterações

nessa região descrita por LEE et al. (1997).

Os resultados apresentados não demonstraram associação da PE com supostas

alterações nucleotídicas na seqüência do gene CDKN1C na região de deleção del347G e na

região de inversão IVS1+60G→A, descritas por NIELSEN et al., (2005). Esses resultados

não demonstraram uma diferença de proporção e freqüências alélicas estatisticamente

significativas nas populações estudadas, devido ao fato do número de amostras não ser tão

representativo quando estratificado em grupos e principalmente de terem sido encontradas

alterações pontuais em indivíduos de grupos distintos, ou seja, uma amostra do grupo

controle das portadoras de PE (1/162 ou 0,61%) na região dos Primers 1 e duas amostras

do grupo das portadoras de HAC (2/42 ou 4,76%) na região de inversão IVS1+60G→A ou

dos Primers 2.

As alterações encontradas não estão em concordância com a freqüência dessas

alterações no gene CDKN1C nos achados da literatura descritos por NIELSEN et al. (2005),

RODRIGUEZ et al. (2007) e ROMANELLI et al. (2009), mesmo quando essas freqüências

são comparadas a outras doenças estudadas como diabetes, arteriosclerose e HELLP/Pré-

eclâmpsia.

A eficiência, sensibilidade e a resolução da técnica de PCR-SSCP podem ser

influenciadas por diversos parâmetros que incluem a qualidade, o comprimento e a

quantidade de bases de citosina e guanina no amplicon, a temperatura do gel durante a

eletroforese, condições e composição do tampão de denaturação e de corrida do gel, tipo de

malha ou poros de acordo com a matriz do gel e concentração do gel (ZHU et al., 2006).

ENQUOBAHRIE et al. (2008), na tentativa de encontrar genes associados à PE,

investigaram por meio das técnicas de microarray e reação em cadeia da polimerase (PCR)

quantitativa em tempo real o RNA da placenta de 18 mulheres portadoras de PE e 18

mulheres normotensas. Neste trabalho, sondas de 22 mil genes foram utilizadas e após

análise estatística os autores encontraram expressão diferencial em 58 genes relacionados

ao sistema imune, inflamação, estresse oxidativo, sinalização, crescimento e vias de

desenvolvimento nas placentas das mulheres portadoras de PE, evidenciando também a

importância de genes como o CDKN1C no risco do aparecimento da PE.

A supressão (downregulation) ou expressão aberrante dos transcritos do gene

CDKN1C têm sido associadas ao surgimento de neoplasias como hepatocarcinoma celular

(FORNARI et al., 2008) e osteossarcoma (LI et al., 2008). Após análise de polimorfismos

intrônicos do gene CDKN1C em 82 amostras de câncer de mama, foi levantada por

LARSON et al. (2008) a possibilidade de este gene ser um supressor tumoral de câncer de

mama.

SENGUPTA et al. (2009) utilizando um modelo de células-tronco embrionárias

humanas, descreve que o microRNA (miRNA) miR-92b atua diretamente na supressão

(downregulation) dos níveis de proteína do gene P57 durante a fase de checagem

(checkpoint) G1/S do ciclo celular. A inibição do miR-92b em células-tronco embrionárias

aumenta os níveis de proteína P57, e a super-expressão do miR-92b em células

diferenciadas diminui os níveis de proteína P57.

ROMANELLI et al. (2009) em um trabalho realizado com pacientes com HELLP (do

inglês hemolysis; elevated liver enzimes; low platelets; ou hemólise, enzimas hepáticas

elevadas, baixa contagem de plaquetas), uma forma severa de PE, descreve mutações no

gene CDKN1C que predispõem à produção de proteínas truncadas em três crianças filhas

de mães com HELLP/PE. Os autores encontraram mutações no exon 2 (232 C/T) e no exon

3 (845 C/A e 845delC).

Dessa forma, com os resultados descritos neste estudo, não foi possível confirmar a

possibilidade de utilização do gene CDKN1C como marcador de predisposição à PE. A

freqüência dessas variantes do gene CDKN1C deve ser investigada na população brasileira

devido à escassez de dados e a particular heterogeneidade da mesma. Pesquisar a

associação dessas variantes com possíveis doenças e com o seu modelo de transmissão

traria grande auxílio para o diagnóstico, tratamento e manejo das doenças estudadas.

É importante salientar que foram encontradas duas novas variantes no grupo de

HAC (2/37), o que poderia indicar um papel das variantes nesses casos, corroborando os

dados de RODRIGUEZ et al. (2007), de associação com arteriosclerose e infarto do

miocárdio.

Não podemos descartar a importância do estudo de mecanismos epigenéticos que

regulam o gene CDKN1C, salientando a pesquisa do envolvimento de genes que sofrem

imprinting na etiopatogenia da PE.

RODRIGUEZ et al. (2007) encontraram uma associação significativa entre variações

de marcadores microsatélites da região promotora do gene CDKN1C e infarto do miocárdio

em pacientes com aterosclerose, mostrando uma associação de alterações nesse gene com

a clínica. Esses autores finalizam com a hipótese de que esses polimorfismos possam servir

como marcadores farmacogenéticos para o tratamento que reduz a aterosclerose

diminuindo o rico de infarto do miocárdio. Essa associação poderia justificar os dados

encontrados em nosso trabalho, onde foram detectados polimorfismos nos casos 484 e 859,

diagnosticados como pacientes com HAC. Nesse sentido, estudos mais amplos na

população brasileira precisam ser realizados, principalmente entre portadores de

hipertensão arterial.

Mudanças na seqüência de aminoácidos da proteína não necessariamente alteram

sua função, portanto estudos de função dessa proteína se fazem necessários.

Todas as variantes encontradas neste estudo não estavam descritas e não

constavam em banco de dados de pesquisa de SNPs e mutações [BLAST SNP Sequence

(disponível em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/), International HapMap Project

(disponível em: http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/index.html.en), SNP Database (disponível

em: snpnet.jst.go.jp/top_e.html)]. Dessa forma as novas seqüências identificadas serão

depositadas na forma de novos SNPs no banco de dados do programa BLAST SNP

Sequence.

Devido ao fato de esses polimorfismos não estarem descritos na literatura, foi de

grande importância identificar e analisar a seqüência de aminoácidos que compõem a

proteína traduzida por este gene, uma vez que alteração na seqüência de aminoácidos pode

resultar em um stop códon (códon de término de transcrição), uma proteína truncada (que

possui uma estrutura defeituosa que não pode desenvolver a função para a qual foi

concebida), uma alteração silenciosa (onde o códon codifica o mesmo aminoácido) ou ainda

como nossos resultados indicam, resultar em uma alteração missense (que promove a

codificação de um aminoácido diferente).

As variantes encontradas são referentes à seqüência da isoforma A (de cadeia

longa) do gene CDKN1C, já que a isoforma B (de cadeia curta) possui uma grande região

deletada, o que não corresponde aos dados encontrados no seqüenciamento e no

alinhamento da seqüência obtida com a seqüência referência descrita no GenBank

(GENBANK, 2008) sob identificação de acesso D64137, como isoforma A.

Nos casos de PE não foi possível encontrar variantes do gene estudado pelo menos

nas regiões pesquisadas. No entanto, os resultados para as pacientes 484 e 859, variantes

+495C/G e +498C/T, respectivamente, parecem sinalizar para um papel do CDKN1C em

quadros de hipertensão desvinculados da gravidez, uma vez que as duas pacientes

pertenciam ao grupo de HAC. Já o caso 236 (variante +317A/G), da população geral,

apresentava histórico familial de alterações de tireóide em mãe e irmã.

Vários genes polimórficos têm sido associados com o risco de desenvolver PE.

Recentemente um relevante e significativo estudo sobre a genética da pré-eclâmpsia não

confirmou a associação significativa entre polimorfismos genéticos em genes candidatos e a

doença (CARTY et al., 2008).

A produção e o nível de biomarcadores são em última instância dependentes de

estudos genômicos. Contanto, em comparação como o genoma, o proteoma é muito mais

dinâmico, assumindo que o genoma não muda durante a gravidez e o proteoma mudará

significativamente. Estudos de proteômica e metabolômica em paralelo com estudos

genômicos, irão contribuir positivamente com o sucesso da aquisição de novos e eficientes

marcadores para a PE.

A importância maior desta pesquisa é de que se constitui o primeiro estudo

populacional de larga escala do gene CDKN1C na população brasileira.

VI. CONCLUSÕES

Não foi verificada a associação de variantes do gene CDKN1C com o

desenvolvimento de pré-eclâmpsia.

Foram detectadas quatro variantes do gene CDKN1C não descritos na literatura,

sendo dois em pacientes com hipertensão arterial crônica.

Não houve diferença estatisticamente significantiva na distribuição das variantes das

regiões estudadas do gene CDKN1C entre as populações estudadas.

As variantes do gene CDKN1C não se mostraram bons marcadores para o

desenvolvimento de pré-eclâmpsia, mas os resultados sinalizam para um papel em casos de

hipertensão arterial crônica.

VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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VIII. ANEXOS

Anexo A – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE)

HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA

DE RIBEIRÃO PRETO DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

CEP. 14048-900 RIBEIRÃO PRETO - S.P.

B R A S I L

CAMPUS UNIVERSITÁRIO - MONTE ALEGRE FONE: 602-1000 - FAX (016) 633-1144

ESCLARECIMENTO AO SUJEITO DA PESQUISA

1.Nome da Pesquisa: “Estudo da influência da região 11p15.5 na pré-eclâmpsia” 2.Pesquisador responsável: Francielle M Araujo, Profa.Dra.Ester S Ramos (CRM - 57.626) 3. Promotor da pesquisa: Hospital das Clínicas da FMRP-USP 4. Esclarecimentos: Algumas mulheres após a 20ª semana de gravidez apresentam pressão alta e perda de proteínas na urina, o que é chamado de pré-eclâmpsia. Se a paciente não tiver os cuidados médicos necessários, o problema pode se agravar e prejudicar a saúde da mãe e do bebê. Uma das causas pode ser genética (ou de família) podendo repetir em parentes. Nesta pesquisa, através dos resultados de algumas perguntas sobre sua família e alguns exames, poderá ser dada depois uma melhor orientação para você e seus parentes. O estudo não trará nenhuma despesa para você. Você pode auxiliar neste trabalho através de um pouco de sangue e com um pouco de urina (colhidos como qualquer exame de rotina). Em casos especiais, também com um pedacinho da placenta depois que ela estiver fora do útero e não tiver mais contato com o nenê. Todo esse material será usado para estudar a sua constituição genética através do DNA (mas não será utilizado para outros fins sem um novo consentimento).

Ribeirão Preto, ____ de _____________ de ______.

____________________________________________ Francielle Marques Araujo/Ester Silveira Ramos

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Eu _______________________________________________RG n

o _______________,

abaixo assinado, tendo sido devidamente esclarecido sobre todas as condições do Projeto de Pesquisa intitulado “ESTUDO DA INFLUÊNCIA DA REGIÃO 11p15.5 NA PRÉ-ECLÂMPSIA” que tem como pesquisadoras

responsáveis a Srta. Francielle Marques Araujo e a Profa. Dra. Ester Silveira Ramos, especialmente no que diz respeito ao objetivo da pesquisa, aos procedimentos que serei submetido, aos riscos e aos benefícios, à forma de ressarcimento no caso de eventuais despesas, bem como a forma de indenização por danos decorrentes da pesquisa, declaro que tenho pleno conhecimento dos direitos e das condições que me foram assegurados, a seguir relacionados: 1. A garantia de receber a resposta a qualquer pergunta ou esclarecimento de qualquer dúvida a respeito dos procedimentos, riscos, benefícios e de outras situações relacionadas com a pesquisa e o tratamento a que serei submetido; 2. A liberdade de retirar o meu consentimento e de deixar de participar do estudo, a qualquer momento, sem que isso traga prejuízo à continuidade do meu tratamento; 3. A segurança de que não serei identificado e que será mantido o caráter confidencial da informação relacionada a minha privacidade; 4. O compromisso de que me será prestada informação atualizada durante o estudo, ainda que esta possa afetar a minha vontade de continuar dele participando; 5. O compromisso de que serei devidamente acompanhado(a) e assistido(a) durante todo o período de minha participação no projeto, bem como de que será garantida a continuidade do meu tratamento, após a conclusão dos trabalhos da pesquisa.

Declaro, ainda, que concordo inteiramente com as condições que me foram apresentadas e que, livremente, manifesto a minha vontade em participar do referido projeto.

Ribeirão Preto, ____de _____________de _____

___________________________________ Assinatura do paciente

Anexo B – Ofício referente à aprovação do TCLE pelo CEP do HCFMRP-USP

Anexo C – Parecer do CONEP referente ao projeto de pesquisa

IX. APÊNDICES

Apêndice A – Grupo de pacientes com PE/E, HAC, HG e grupo controle

DNA Classificação CDKN1C CDKN1C CDKN1C Tamanho em relação Tipo de Sexo Idade

primer 1 primer 2 primer 3 a idade gestacional parto RN materna

236 eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 23

237 pré-

eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência PIG normal F 16

238 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 34


240 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 31


242 controle seq.referência seq.referência seq.referência abaixo 27s normal M 30


244 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 19


246 pré-

eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 21

255 controle seq.referência seq.referência seq.referência PIG normal M 24

256 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 25

257 controle seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea M 21

258 pré-

eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 38

259 controle seq.referência seq.referência seq.referência PIG normal F 17



262 pré-


264 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 29

265 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 38


268 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 16

269 pré-

eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 27

270 HAC seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea F 41



273 pré-


274 HG seq.referência seq.referência seq.referência PIG cesárea M 30


279 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 21

280 HG seq.referência seq.referência seq.referência 22

281 controle seq.referência seq.referência seq.referência PIG cesárea F 28






293 pré-


294 pré-

eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência PIG normal 30

295 pré-


296 pré-


300 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 33

301 pré-

eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência PIG normal M 28

302 pré-




322 HG seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea M 21

323 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 17

324 pré-

eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência PIG cesárea M 30

325 pré-

eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 19

341 pré-


342 HG seq.referência seq.referência seq.referência PIG normal F 18

344 pré-


348 pré-



368 HG seq.referência seq.referência seq.referência GIG normal M 33

369 pré-



373 pré-



375 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 28

376 HAC seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea M 18





392 controle seq.referência seq.referência seq.referência 27


407 pré-



409 pré-


410 pré-


411 HG seq.referência seq.referência seq.referência PIG normal M 17






418 pré-

eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG

normal F 20









429 HG seq.referência seq.referência seq.referência acima 42s normal M 26








438 pré-

eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência PIG

cesárea F 22











476 pré-

eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência PIG

normal F 17



480 pré-


cesárea F 25

481 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 24

482 pré-



484 HAC seq.referência 495C/G seq.referência AIG normal F 42

485 pré-


cesárea F 19


488 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG 20

489 HAC seq.referência seq.referência seq.referência 33








497 pré-


498 HAC seq.referência seq.referência seq.referência PIG normal M 37

499 pré-





503 controle seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea F 21



507 pré-



509 HAC seq.referência seq.referência seq.referência PIG cesárea F 40






515 pré-

eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência abaixo 27s cesárea F 24

516 controle seq.referência seq.referência seq.referência GIG normal M 32

517 pré-

eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência GIG normal M 15



521 HAC seq.referência seq.referência seq.referência PIG cesárea M 30





533 pré-

eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência PIG normal F 16

















560 controle seq.referência seq.referência seq.referência GIG normal F 28

561 pré-


562 pré-





567 pré-



569 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG3 normal M 25







577 HAC seq.referência seq.referência seq.referência 26












609 eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 20



620 HAC seq.referência seq.referência seq.referência PIG cesárea M 27

623 pré-

eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência PIG cesárea F 34

634 pré-


637 pré-


638 pré-


639 pré-

eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea F 33

651 pré-

eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência GIG normal F

652 pré-


655 pré-



657 pré-




693 HG seq.referência seq.referência seq.referência PIG cesárea F 24



701 HG seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea F 29

703 HAC seq.referência seq.referência seq.referência



707 pré-


708 pré-











789 controle 275 C/T seq.referência seq.referência AIG cesárea F 38





800 pré-



810 pré-




843 pré-

eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência abaixo 27s cesárea F 33


845 pré-


846 controle seq.referência seq.referência seq.referência GIG normal M 40

847 controle seq.referência seq.referência seq.referência GIG fórceps M 25




851 HG seq.referência seq.referência seq.referência GIG fórceps F 35



855 pré-


856 pré-

eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea F 32

857 controle seq.referência seq.referência seq.referência acima 42s fórceps M 26


859 HAC seq.referência 498C/T seq.referência 42s cesárea F 18

860 controle seq.referência seq.referência seq.referência acima 42s cesárea M 29

861 controle seq.referência seq.referência seq.referência normal M 26



865 HG seq.referência seq.referência seq.referência PIG cesárea F 27













900 pré-

eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência 27

909 pré-




914 pré-


915 pré-




932 pré-


938 pré-

eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência GIG normal F 20


969 pré-


971 pré-


973 pré-









1144 pré-



1148 pré-


1149 pré-



1152 pré-









1162 pré-



1170 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG fórceps M 30











1209 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG fórceps M 20

1211 controle seq.referência seq.referência seq.referência acima 42s cesárea F 32


1214 pré-

eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência 16

1215 pré-



1218 pré-

eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea M 35

1279 pré-




1284 pré-

eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência GIG normal F 33



1288 pré-









1301 pré-






1366 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG fórceps F 23


Apêndice B – Grupo controle da população geral

DNA CDKN1C CDKN1C Idade Sexo Antecedentes familiares

primer 1 primer 2

1 seq.referência seq.referência 25 F pai diabético e mãe pressão baixa

2 seq.referência seq.referência 23 F




6 seq.referência seq.referência 22 M

7 seq.referência seq.referência 22 F pai hipertenso





12 seq.referência seq.referência 23 M pai e mãe


14 seq.referência seq.referência 23 M pai e mãe diabéticos





19 seq.referência seq.referência 22 M mãe obesa

20 seq.referência seq.referência 23 F pai






26 seq.referência seq.referência 25 M mãe

27 seq.referência seq.referência 21 M mãe hipertensa

28 seq.referência seq.referência 22 M paie e mãe hipertensos


30 seq.referência seq.referência 23 M pai









39 seq.referência seq.referência 23 F mãe


41 seq.referência seq.referência 21 F mãe obesa e pai hipertenso


43 seq.referência seq.referência 21 F pai diabético e mãe hipertensa




47 seq.referência seq.referência 20 F pai hipertenso e obeso







54 seq.referência seq.referência 23 F pai/mãe/irmãos obesos e hipertensos







61 seq.referência seq.referência 18 F mãe hipertensa




65 seq.referência seq.referência 21 M irmãos obesos


67 seq.referência seq.referência 26 F pai/mãe/irmãos




71 seq.referência seq.referência 20 F pai/mãe

72 seq.referência seq.referência 22 M pai hipertenso














86 seq.referência seq.referência 18 M irmãos obesos











98 seq.referência seq.referência 24 F mãe e irmãos colesterol alto











110 seq.referência seq.referência 27 M pai/mãe/irmãos


112 seq.referência seq.referência 20 F pai/mãe/irmãos







119 seq.referência seq.referência 22 F pai/irmãoes



122 seq.referência seq.referência 24 M avó materna diabética

123 seq.referência seq.referência 23 F pai/irmãos obesos

124 seq.referência seq.referência 24 F pai/mãe hipertensos




128 seq.referência seq.referência 34 M avô materno obeso



















147 seq.referência seq.referência 18 M pai/mãe/irmãos










157 seq.referência seq.referência 23 M pai hipertenso e mãe diabética

158 seq.referência seq.referência 21 F pai obeso



161 seq.referência seq.referência 25 M pai diabético


163 seq.referência seq.referência 23 M pai obeso




167 seq.referência seq.referência 22 F pai diabético

168 seq.referência seq.referência 23 F mãe obesa e hipertensa


170 seq.referência seq.referência 21 F mãe diabética


172 seq.referência seq.referência 22 F mãe e irmão hipertensos









181 seq.referência seq.referência 22 M pai diabético e colesterol alto



184 seq.referência seq.referência 21 F pai diabético e colesterol alto



187 seq.referência seq.referência 20 F mãe colesterol alto

188 seq.referência seq.referência 19 F mãe diabética e obesa



191 seq.referência seq.referência 24 F pai hipertenso e colesterol alto

192 seq.referência seq.referência 26 F irmã obesidade mórbida




196 seq.referência seq.referência 18 F mãe diabetes e irmão obeso










206 seq.referência seq.referência 21 F mãe tireóide


208 seq.referência seq.referência 19 M irmão hipertenso





213 seq.referência seq.referência 22 F pai colesterol alto


215 seq.referência seq.referência 20 F mãe colesterol alto e hipertensa







222 seq.referência seq.referência 22 M pai colesterol alto











233 seq.referência seq.referência 25 F pai e mãe hipertensos



236 317A/G seq.referência 32 F mãe e irmã tireóide


238 seq.referência seq.referência 22 M pai e mãe e irmã obesos







245 seq.referência seq.referência 21 F pai diabético e mãe hipertensa





250 seq.referência seq.referência 21 M pai hipertenso e pai diabética




254 seq.referência seq.referência 19 F pai colesterol alto

255 seq.referência seq.referência 22 F pai e mãe hipertensos

256 seq.referência seq.referência 21 F avó materna hipertensa



259 seq.referência seq.referência 19 F avô materno diabético
















275 seq.referência seq.referência 18 M avô materno hipertenso



278 seq.referência seq.referência 20 F irmã colesterol alto

279 seq.referência seq.referência 22 F avó hipertensa e obesa

280 seq.referência seq.referência 22 F avó diabética


282 seq.referência seq.referência 22 M avô diabético




286 seq.referência seq.referência F

287 seq.referência seq.referência 21 F avó diabética




291 seq.referência seq.referência 22 M mãe diabética


293 seq.referência seq.referência 23 F mãe obesa








301 seq.referência seq.referência 25 F pai hipertenso e tio diabético

302 seq.referência seq.referência 24 F pai e mãe colesterol alto



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Análise de variantes do gene CDKN1C e pré-eclâmpsialivros01.livrosgratis.com.br/cp136076.pdf · Murilo Racy Soares Análise de variantes do gene CDKN1C e pré-eclâmpsia Dissertação