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Miguel Augusto Golono
Variantes moleculares do vrus influenza
So Paulo2004
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Miguel Augusto Golono
Variantes moleculares do vrus influenza
So Paulo2004
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Miguel Augusto Golono
Variantes moleculares do vrus influenza
Dissertao apresentada aoInstituto de Biocincias daUniversidade de So Paulo, para aobteno de Ttulo de Mestre emCincias, na rea deBiologia/Gentica.
Orientador: Prof. Dr Willy Beak.
So Paulo
2004
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Golono, MiguelVariantes moleculares do vrusinfluenza
129 pginasDissertao (Mestrado) - Instituto de
Biocincias da Universidade de So Paulo.Departamento de Biologia/Gentica.
1. Influenza 2. Hemaglutinina 3.Drift
I. Universidade de So Paulo. Instituto deBiocincias. Departamento deBiologia/Gentica.
Comisso Julgadora:
________________________ _______________________Prof(a). Dr(a). Prof(a). Dr(a).
________________________ _______________________
Prof(a). Dr(a). Prof(a). Dr(a).
______________________
Prof. Dr. Willy beakOrientador
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Dedico esta dissertaao aos meus pais:
Edson Domingos Golono e Vera Lcia da
Silva Golono
A minha esposa: Iris Melina Politi Soza
E as minhas filhas: Amarillyz e Izabella
Politi Golono
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"Arrebentaram a porta. Derrubaram a porta.
Chegaram ao lugar luminoso
onde a verdade esplendia os seus fogos.
Era dividida em duas metades
diferentes uma da outra.
Chegou-se a discutir qual a metade mais bela.
Nenhuma das duas era perfeitamente bela.
E era preciso optar. Cada um optou
conforme seu capricho, sua iluso, sua miopia."
Carlos Drummond de Andrade.
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Agradecimentos
Agradeo meu orientador Prof. Dr. Willy Beak pela confiana em mim
depositada e por seu esforo dedicado a esta dissertao.
Ao Prof. Dr. Edison Luiz Durigon do Laboratrio de Virologia do ICB -
USP, por abrir as portas de seu laboratrio assim como propiciado os meios
para a concluso desta dissertao.
Ao Mrio Gustavo Mayer por toda ajuda na metodologia e no
delineamento a este projeto.A Dra. Maria Luiza Beak, pelo incentivo e ajuda para o trmino deste
trabalho de mestrado.
A Danielle Bruna Leal de Oliveira, por ter dedicado seu tempo para
meu treinamento em seqenciamento e para as anlises de seqncias.
Ao Dr. Marcelo Genofre Vallada, pela seleo dos pacintes e coleta
das amostras no Instituto da Criana da FMUSP.Ao Alexandre Pereira pelo acompanhamento deste trabalho.
A Dra Viviane Botosso por todas as sugestes dadas para a concluso
deste trabalho.
A Dra Rita de Cassia Stocco dos Santos por todo apoio e ajuda
dispensada a mim.
A Leonardo Setsuo Kobashi pela ajuda na finalizao do trabalho.
Aos amigos do Laboratrio de Virologia, em especial para Jansen de
Arajo pelo apoio nos experimentos de concluso desta Dissertao.
A Nair Aparecida da Silva Pereira, pelo apoio prestado durante a
execuo deste trabalho e pelo incentivo dado em todos os momentos.
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A Antnio Carlos de Freitas tambm pelo apoio e incentivo.
Aos amigos e tambm alunos do laboratrio de gentica: Marcelo M.
Tavares, Luis G. B. Goes, Luciana S. Cabral, Gil R. H. Ribeiro, Rodrigo F.Ramalho, Guilherme Francisco, Juliana S. Capitanio, Adriana M. Orimoto e
Daniela C. C. Santos.
Em especial a Olga Brunner pelo convvio desde o incio, mesmo antes
de eu ser aluno do curso de mestrado.
Aos fncionrios e tambm amigos do laboratrio de Gentica do
Instituto Butantan; Zenaide L. Silva, Vera L. A. Rodrigues, Tnia R. Berulis,Ivone S. dos Santos, Laerte P. do Santos, Ronaldo Dias, Helir Serralvo.
Aos funcionrios da Ps-Graduao por toda ajuda dispensada.
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ndice
I - Introduo...................................................................................................01
II - Objetivos....................................................................................................18
III - Materiais e Mtodos
1.Amostras.............................................................................................19
2.Extrao de RNA................................................................................193. Obteno de cDNAs por transcrio reversa.....................................20
4. Reao em Cadeia pela Polimerase -Nested Multiplex PCR.........21
4.1. Oligonucleotdeos Iniciadores (primers)..............................21
4.2. Reaes.................................................................................23
4.3. Anlise dos Produtos Amplificados......................................25
5. Reaes de Semi-Nested PCR e Nested-PCR".............................255.1. Oligonucleotdeos iniciadores..............................................25
5.2. Reaes.................................................................................30
5.3. Anlise dos Produtos Amplificados......................................32
6. Determinao da seqncia de nucleotdeos......................................32
6.1. Purificao dos Produtos de PCR.........................................33
6.2. Reao de determinao de Seqncias de nucleotdeos......33
7. Edio e Anlise das Seqncias Obtidas..........................................35
8. Localizao das diferenas na estrutura da hemaglutinina................35
9. rvore genealgica............................................................................36
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IV - Resultados.................................................................................................37
1. Deteco, tipagem e subtipagem das amostras clnicas.....................37
2. Obteno da regio codificadora completa de HA1..........................403. Nested e Semi-nested PCR................................................................40
4. Seqncias de aminocidos de HA1 das amostras estudadas:
anlise comparativa das amostras entre si e com as cepas vacinais...42
4.1. Tipo A Subtipo H1N1...........................................................42
4.2. Tipo A Subtipo H3N2...........................................................49
4.3. Tipo B...................................................................................594.4. Pesquisa das seqncias de nucleotdeos no "Genbank"......63
4.5. Pesquisa no "Genbank" das seqncias de A H1N1.............64
4.6. Pesquisa no "Genbank" das seqncias de A H3N2.............65
4.7. Pesquisa no "Genbank" das seqncias de vrus do tipo B..66
4.8. rvore Genealgica..............................................................66
V - Discusso...................................................................................................70
VI - Concluso.................................................................................................81
VII - Resumo....................................................................................................82
VIII - Abstract..................................................................................................83
IX - Apndice 1. Dados gerais dos pacientes..................................................84
X - Apndice 2. Distribuio das amostras.....................................................93
XI - Referncias Bibliogrficas........................................................................97
XII - Biografia................................................................................................119
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I - Introduo
A gripe uma doena respiratria aguda em seres humanos e
causada pelo vrus da influenza. Anualmente mais de 10% da populao
mundial, cerca de 600 milhes de pessoas so acometidas pelo vrus da
gripe (Gerdil, 2003). Somente nos Estados Unidos, a doena causa cerca
de 110.000 hospitalizaes com 36.000 mortes todos os anos (Thompson
e col., 2003). Idosos com idade igual ou superior a 65 anos constituem o
grupo de maior risco de morte por influenza. Cerca de 90% das mortes
causadas pela gripe ocorre nessa faixa etria (Simonsen, 1999). A doena
afeta tambm a classe economicamente ativa, o que causa queda deprodutividade e, conseqentemente prejuzos financeiros (Akazawa e
col., 2003).
A sintomatologia clssica da doena engloba febre, dores
musculares, tosse, dor de cabea, irritao na garganta e secrees nasais.
Os vrus se multiplicam no epitlio ciliado das vias respiratrias
superiores e inferiores, causando necrose celular e irritao. Os sintomas
podem variar de pessoa para pessoa, dependendo da idade do doente, deseu estado geral de sade e, do status imunolgico no que se refere a
infeces anteriores, podendo evoluir para complicaes como
pneumonia causada pela propagao viral no epitlio alveolar e/ou
pneumonia bacteriana (WHO Fact Sheet 211, 1999).
A famlia Ortomixoviridae composta de 4 gneros: Influenza
virus A, Influenza virus B, Influenza virus C e Thogotovirus (Pringle,
1996). Os vrus influenza tipo A e B causam um largo espectro de
doenas, incluindo doena respiratria do trato inferior, pneumonia e,
podendo no caso dos vrus influenza tipo A, causar encefalopatia e
encefalite. Por outro lado, infeces associadas ao vrus tipo C so
limitadas ao trato respiratrio superior (Murphy e Webster, 1990,
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Nicholson, 1998). Os thogotovirus so ortomixovirus transmitidos por
carrapatos.
Os vrus influenza do tipo A e B quando adaptados a condies
laboratoriais, assumem forma esfrica com dimetros de 80 a 120 nm. No
entanto, as cepas recm isoladas so pleiomrficas, podendo conter
partculas virais filamentosas (Lamb e Choppin, 1983, Roberts e
Compans, 1998). O genoma viral composto por segmentos de RNA de
fita simples e de polaridade negativa (complementar ao RNA
mensageiro). Cada um dos oito segmentos dos vrus influenza tipo A e B
e, os sete segmentos do vrus influenza tipo C esto associados
nucleoprotena NP (Mcgeoch e col., 1976, Desselberger e col., 1980,Klumpp e col., 1997) e esto associados a um complexo de polimerase
viral (Brown, 2000). Assim, forma-se um complexo ribonucleoprotico
composto por RNA viral (vRNA), NP e polimerase.
Englobando estas oito (ou sete) partculas, h uma matriz protica
constituda por protena M1, a qual envolvida por uma bicamada
lipdica derivada da clula hospedeira durante o processo de brotamento
(Kates e col., 1962, Lamb e Choppin, 1983, Braakman e Anken, 2000).Duas glicoprotenas de superfcie, codificadas pelo genoma viral,
projetam-se atravs da bicamada lipdica. Dessas, a glicoprotena
hemaglutinina (HA) a mais abundante e, apresenta-se na forma de
basto. J a neuraminidase (NA), presente em menores quantidades,
apresenta-se na forma de cogumelo. Ainda, uma terceira protena,
formadora de canais e denominada de M2, encontra-se inserida na
bicamada lipdica (Zebedee e Lamb, 1988, Park e col., 1998, Mould e
col., 2000).
Quanto capacidade codificadora dos genomas dos vrus
influenza, podemos dizer que os genomas dos vrus do tipo A e B
codificam pelo menos dez protenas, enquanto o genoma do tipo C
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codifica nove protenas (Neumann e col., 2000a) (tabela 1).
Tabela 1. Organizao do genoma do vrus da influenza.
*a - Os segmentos de RNA so numerados de acordo com seus tamanhos decrescentes.
*b - O tamanho dos RNAs mensageiros baseado em seqncias de cepas tipo A, no
entanto pode variar entre os tipos e subtipos, especialmente os segmentos 4, 6 e 8.
*c - As funes detalhadas das protenas que compem a polimerase dos vrusinfluenza tipo C, ainda no foram determinadas e so designadas de P1, P2 e P3.
*d Hemaglutinina esterase (HE) compreende as funes de HA e NA.
*e Recentemente, NS2 recebeu o nome de NEP (nuclear export protein). estrutural.
*f Ao vrus influenza tipo C possuem apenas 7 segmentos.
No vrus tipo A, os segmentos 1, 2 e 3 codificam as protenas
PB2, PB1 e PA respectivamente. No vrus tipo B os segmentos 1, 2 e 3
codificam respectivamente as protenas PB1 , PB2 e PA. Estas protenas
compem a polimerase viral, possuem atividade de transcriptase, e esto
intimamente associadas ao RNA genmico do vrus. A estrutura e funo
das polimerases do vrus tipo C ainda no foram totalmente
caracterizadas e, assim, so designadas por P1, P2 e P3 (Yamashita e col.,
Tamanho Polipeptdios Codificados
*a Segmento *b RNA viral *b RNAm Tipo A Tipo B Tipo C
1 2341 2320 PB2 PB1 *c P1
2 2341 2320 PB1 PB2 *c P2
3 2233 2210 PA PA *c P3
4 1778 1756 HA HA *d HE
5 1565 1539 NP NP NP
6 1413 1391 NA NA, NB M1, CM27 1027 1004, 314, 275 M1, M2 (M3) M1, BM2 NS1, NS2*e
8 890 868, 396 NS1, NS2*e NS1, NS2*e *f
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1989, Hay, 1998, Crescenzo-Chaigne e col., 1999). No entanto, admite-se
que essas ltimas possuam caractersticas estruturais e funcionais
semelhantes s correlatas dos vrus tipo A e B.
O segmento 4 codifica a hemaglutinina (HA). A HA a
glicoprotena de superfcie viral mais imunognica. O processamento ps-
traduo de seu precursor biossinttico (Ha0) envolve glicosilao, adio
de cidos graxos e clivagem proteoltica. A clivagem deste precursor
resulta em duas subunidades, HA1 e HA2, as quais permanecem unidas
por ligaes dissulfeto (Wiley e Skehel, 1987, Skehel e Wiley, 2002). A
subunidade HA1, correspondente extremidade N-terminal do precursor,
projeta-se para fora do envelope viral. J a subunidade HA2 permaneceancorada no interior do envelope viral. Tal processamento proteoltico
essencial para que os vrus tornem-se infectantes (Lamb, 1989, Skehel e
Wiley, 2002). A HA de importncia fundamental na interao da
partcula viral com a clula hospedeira. Esta glicoprotena, pela sua
regio HA1, liga-se ao receptor de cido silico existente na superfcie
celular (Zhirnov e col., 2002). Assim, a HA inicia o processo de infeco
mediando a fuso da partcula viral endocitada com a membranaendossmica, permitindo o acesso da partcula viral ao citoplasma celular
(Lamb, 1989, Skehel e Wiley, 2002). Contrastando com os vrus
influenza tipo A e B, o segmento 4 do vrus influenza tipo C codifica a
hemaglutinina esterase (HE), uma glicoprotena de superfcie que executa
de forma acoplada as funes de HA e NA. HE reconhece
especificamente apenas um tipo de cido silico modificado, o cido 9-
O-acetil-N-acetilneuramnico (Rogers e col., 1986, Skehel e Wiley,
2000), o que est relacionado com a menor patogenicidade dos vrus
influenza tipo C.
A nucleoprotena NP codificada pelo segmento 5. A NP
sintetizada em abundncia nas clulas infectadas e transportada para o
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ncleo celular. No ncleo, a NP liga-se ao RNA viral e o encapsida,
estabilizando-o e protegendo-o da ao de RNases. (Compans e
Duesberg, 1972; Jennings e col., 1983, Mena e col., 1999). A NP dos
vrus influenza tipo B no relacionada imunologicamente NP dos
vrus influenza tipo A, desempenhando, no entanto, a mesma funo. A
NP uma das protenas utilizadas na diferenciao dos tipos sorolgicos
A, B e C (Lamb, 1989).
A neuraminidase (NA) codificada pelo segmento 6. Na sua
forma madura, a NA um tetrmero com atividade cataltica de quebra de
cido silico em glicoconjugados (Colman, 1998). A NA tem a funo de
facilitar o acesso da partcula viral superfcie das clulas alvo, atravsda degradao de cido silico do muco extracelular, no estando
envolvida diretamente na fuso da partcula viral com a membrana celular
(Liu e col., 1995). Alm dessa funo, a atividade de NA destri os
receptores de HA na superfcie das clulas hospedeiras, facilitando a
disperso das partculas virais geradas no processo infectivo, impedindo-
as de serem imobilizadas na superfcie das clulas infectadas (Palese e
Compans, 1976, Yang e col, 1997). Essa glicoprotena est ancorada bicamada lipdica da clula hospedeira por uma seqncia de resduos
hidrofbicos. A neuraminidase concentra-se em aglomerados na
superfcie viral, contrastando com a distribuio uniforme de HA. No
vrus influenza tipo B, uma glicoprotena adicional codificada pelo
segmento 6. Essa glicoprotena foi denominada NB, sendo codificada por
uma fase de leitura distinta da fase de leitura de NA. NB, assim como
NA, uma protena de membrana, inserida no envelope viral (Betakova e
col., 1996; Brassard e col., 1996). Devido atividade formadora de canal
dessa glicoprotena, atribui-se a ela uma funo anloga da protena M2
(Odagiri e col., 1999, Fischer e col., 2000, Hatta e Kawaoka, 2003).
O segmento nmero 7 dos vrus influenza tipo A codifica as
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protenas M1, M2 e potencialmente um peptdeo M3. Estas protenas,
juntamente com a NP, so utilizadas para a tipagem sorolgica dos tipos
virais. M1 faz parte da matriz protica, a qual forma uma camada
eltrondensa logo abaixo do envelope viral e, a protena mais abundante
no vrion (Brown, 2000). J, M2 expressa em abundncia na superfcie
da clula hospedeira, no entanto, detectada em pequenas quantidades no
vrion (Hilleman, 2002). Ainda, um terceiro transcrito foi identificado
com o potencial de codificar um peptdeo constitudo de 9 resduos de
aminocidos (M3), no entanto, ainda no foi possvel a identificao
desse peptdeo em extratos celulares. O segmento 7 dos vrus tipo B
codifica uma protena M1 com semelhana estrutural e funcional protena M1 dos vrus influenza tipo A. Alm da protena M1, o
segmento 7 dos vrus tipo B codificam um segundo polipeptdio
denominado BM2 (Odagiri e col., 1999). BM2 uma protena de
membrana. Estudos recentes indicam que BM2 uma protena formadora
de canais inicos, e assim como M2, tem a funo de acidificar o interior
dos vrions quando esses se encontram nos endossomos celulares,
enfraquecendo as ligaes entre as protenas virais, tais como M1 e NP, efavorecendo o "desempacotamento" viral (Paterson e col., 2003, Mould e
col., 2003, Watanabe e col., 2003). O segmento 6 da influenza tipo C
codifica a protena de matriz M1 e uma protena integral de membrana
denominada CM2. Apesar da funo de CM2 no ser conhecida, sua
similaridade estrutural M2 dos vrus tipo A sugere uma funo anloga
(Hongo e col., 1997, Pekosz e Lamb, 1997, Pekosz e Lamb, 1998, Tada e
col., 1998).
Duas protenas no estruturais, NS1 e NS2, so codificadas pelo
segmento 8 (vrus tipo A e B) ou segmento 7 (vrus tipo C).
Recentemente, foi detectada a presena de NS2 em partculas virais, e
com isso NS2 foi elevada categoria de protena estrutural. Diferente da
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NS2, a NS1 no incorporada aos vrions e encontrada apenas em
clulas infectadas. Em sua forma madura, NS1 se apresenta como
homodmero, tanto para os vrus tipo A como para os vrus tipo B. No
entanto a ao de NS1 difere entre os dois tipos de vrus. A NS1
produzida pelos vrus influenza tipo A (NS1A) inibidora do
processamento ps-transcricional de RNAm celular, com isso NS1A
impede a sntese de protenas antivirais (Chen e Krug, 2000). Por outro
lado, NS1B que produzida pelos vrus tipo B, atua diretamente na
inibio da protena celular antiviral ISG15 (Chen e col., 1999, Krug e
col., 2003). Aparentemente, NS1 tambm possui a capacidade de
estimular a traduo dos RNAm virais em ambos os tipos virais (Wolff ecol., 1996, Egorov e col.,1998). A NS2 foi rebatizada de NEP ("nuclear
export protein") devido demonstrao de que NS2 (NEP) na realidade
uma protena estrutural. Alm da funo estrutural, NS2 ou NEP tem a
funo de mediar a exportao nuclear dos RNAs do vrion, atuando
como adaptadora entre os complexos ribonucleoproticos virais e a
maquinaria de exportao nuclear da clula (ONeill e col., 1998,
Neumann e Col., 2000, Paragas e col., 2001, Lommer e Lou, 2002).A influenza transmitida por aerossis. Quando as gotculas
contendo os vrus so inaladas, esses entram em contato com o epitlio do
trato respiratrio, sendo esse o tecido primrio alvo para os vrus
influenza (Lindsay e col.,1970, Nicholson, 1998). A glicoprotena de
superfcie NA uma enzima que age nos cidos silicos do muco
facilitando o acesso do vrus para que haja contato direto com a
membrana celular. As partculas virais, atravs da HA ativada, ligam-se a
receptores de cido silico presentes em glicoprotenas e glicolipdios da
superfcie celular. Aps essa ligao, o vrion endocitado pela clula. O
pH baixo da vescula endoctica induz mudanas conformacionais na HA
facilitando sua insero na membrana vesicular, iniciando a fuso das
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membranas viral e vesicular (Isin e col., 2002, Epand e Epand, 2003). Os
nucleocapsdeos virais migram para o ncleo da clula hospedeira e, as
protenas com atividade de polimerase iniciam a transcrio dos RNAs do
vrion (vRNAs) em RNAs mensageiros (mRNAs) (Yewdell e Garca-
Sastre, 2002).
A sntese de mRNA do vrus influenza iniciada por fragmentos
de RNAs celulares recm sintetizados pela RNA polimerase II da clula
hospedeira, os quais j possuem a modificao cap (m7GPPPNm) nas
suas extremidades 5. A partir desses iniciadores de transcrio, as
cadeias de mRNA so elongadas pela transcriptase viral at que esta
atinja uma regio terminadora composta por uma seqncia de 5 a 7nucleotdeos de uridina localizada aproximadamente a 16 nucleotdeos da
extremidade 5 do vRNA molde. Nesse ponto da sntese, adicionada
uma cauda de poliadenilato [poli (A)] extremidade 3 do mRNA (Krug,
1981, Chung e col., 1994, Pritlove e col., 1998, Fodor e col., 2000,
Fechter e col., 2003). Participam do processo de transcrio, compondo o
complexo da transcriptase viral, as protenas PB1, PB2 e PA. A
polimerase PB2 atua no reconhecimento e quebra das extremidades 5modificadas dos mRNAs celulares e, portanto inicia o processo de
transcrio (Ulmanem e col., 1981; Braam e col., 1983, Nakagawa e col.,
1995, Perales e Ortn, 1997, Brown e Bailly, 1999, Hiromoto e col.,
2000a). A polimerase PB1 responsvel pelo processo de elongao do
mRNA viral (Lazarev e col., 1999, Perez e Donis, 2001). A funo da
polimerase PA na transcrio primria ainda no conhecida, no entanto
este polipeptdio necessrio para a transcrio e replicao do vRNA
(Nakagawa e col., 1996, Sanz-Ezquerro e col., 1998, Fodor e col., 2003,
Huarte e col., 2003).
Os transcritos produzidos so utilizados na traduo das protenas
virais. No incio da infeco predominam as snteses de NP e NS1,
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protenas essas que migram para o ncleo. Acredita-se que o aumento da
concentrao de NP livre dispare a mudana da sntese de mRNA
(transcrio) para a sntese de cRNA e vRNA (replicao) (Skehel, 1972;
Hay e col., 1977; Smith e Hay, 1982; Shapiro e col., 1987, Arrese e
Portela, 1996, Mena e col., 1999, Medcalf e col., 1999).
A replicao feita atravs de um processo de transcrio
alternativo, que resulta na produo de cpias integrais de vRNAs. A
replicao iniciada pela sntese de um RNAs complementares (cRNA),
os quais diferem dos mRNAs pelas ausncias das modificaes 5 cap
metiladas e caudas de poli A 3 (Hay e col.,1977; Hay e col., 1982).
Assim, a primeira etapa na replicao dos vRNAs seria a mudana desntese de mRNA para sntese de cRNA. Os requisitos para esta mudana
so: (1) a mudana do processo de iniciao de transcrio, o qual era
dependente de iniciadores 5 "capped", para um processo de iniciao
que no requer iniciadores e; (2) antiterminao no stio de
poliadenilao, permitindo que a transcrio de cRNA gere uma cpia
completa do vRNA (Pritlove e col., 1998). Acredita-se que NP tenha
papel fundamental na mudana de sntese de mRNA para cRNA, comodescrito acima. Finalizando o processo de replicao, molculas de
cRNA atuam como molde para a sntese do vRNA genmico (Honda e
col., 2001).
Os vRNAs recm-sintetizados so encapsidados pela NP no
interior do ncleo e, funcionam como moldes para a transcrio de
mRNAs virais da infeco tardia (Biswas e col., 1998, Hoffmann e
Webster, 2000). Os principais produtos de traduo nesta etapa da
infeco so as protenas M1, HA e NA. HA e NA so processadas aps a
traduo no retculo endoplasmtico rugoso e, transportadas para a
superfcie celular apical via complexo de Golgi (Barman e col., 2001). A
entrada da protena M1 no ncleo celular parece estar associada com a
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migrao de nucleocapsdeos para fora do ncleo, culminando com a
montagem das partculas virais no citoplasma (Martin e Helenius, 1991,
Ali e col., 2000). Pouco se sabe a respeito do processo de montagem dos
vrus da influenza. Acredita-se que nucleocapsdeos envolvidos por uma
cpsula de protena M1 migrem para a face interna da membrana
plasmtica, para onde j foram transportadas as glicoprotenas HA, NA e
M2. Foi proposto que a interao de M1 com os domnios citoplasmticos
dessas 3 glicoprotenas sinalize o processo de brotamento (Elster e col.,
1994, Reinhardt e Wolff, 2000, Hilleman, 2002). A atividade de NA na
superfcie da clula infectada destri o receptor de HA, permitindo que as
partculas virais geradas sejam propagadas e, evitando a adsoro destaspartculas mesma clula (Palese e Compans, 1976, Mitnaul e col., 2000,
Wagner e col., 2000, Plakokefalos e col., 2001). O passo final na
maturao dos vrus a clivagem de HA0 em HA1 e HA2 por proteases
extracelulares do hospedeiro. As duas subunidades geradas, HA1 e HA2,
permanecem ligadas por uma nica ponte dissulfeto (Wiley e Skehel,
1987, Klenk e col., 2002, Zhirnov e col., 2002).
Os vrus influenza tipo A so classificados de acordo com aspropriedades de duas glicoprotenas presentes na superfcie viral, HA e
NA. At o presente momento foram descritos 15 subtipos de HA,
denominados de H1, H2, H3 e assim sucessivamente (Webster e col.,
1997). Estes, diferem entre si pela seqncia polipeptdica de HA1 em no
mnimo 30%, e no possuem sorologia cruzada. Cada subtipo pode ser
composto de variantes semelhantes entre si e, que possuem sorologia
parcialmente cruzada (Webster e col., 1992; Ellis e col., 1997). Dos 15
subtipos de HA descritos at hoje, 6 subtipos (H1, H2, H3, H5, H7 e H9)
foram encontrados em isolados da influenza humana, no entanto,
atualmente os subtipos H1 e H3 so aqueles que esto em circulao na
populao humana (Webster e col., 1997; Subbarao e col., 1998; Peiris e
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col., 1999; Fouchier e col., 2004). Outros subtipos de HA foram
encontrados em vrus da influenza de cavalos, porcos e mamferos
aquticos entre outros. Todos os subtipos de HA foram encontrados em
vrus influenza de aves.
Nove subtipos (N1 a N9) foram descritos para neuraminidase. A
influenza A humana e a influenza suna compartilham entre si os subtipos
N1 e N2 e, apesar de outros subtipos de NA terem sido encontrados em
sunos, somente N1 e N2 foram estabelecidos nessa populao. Outros
subtipos so encontrados em cavalos, mamferos aquticos alm de outros
mamferos. Nos vrus da influenza aviria foram encontrados todos os
subtipos de NA (Webster e col., 1997, Webby e Webster 2001). Osisolados de influenza tipo A so denominados pelos subtipos de HA e NA
que possuem, o local e o ano da coleta [por ex. A/Hong Kong/03/68
(H3N2)]. Os tipos B e C so denominados geralmente pelo local da coleta
e ano (por ex. B/Maryland/59).
As aves aquticas so os reservatrios naturais dos vrus tipo A.
Estudos ecolgicos levaram a hiptese de que todos os vrus da influenza
de mamferos so derivados dos reservatrios avirios (Webster e col.,1992). Mais recentemente, estudos filogenticos realizados a partir das
seqncias de nucleotdeos dos vrus tipo A de vrios hospedeiros, de
diferentes regies geogrficas, pertencentes a diferentes subtipos deram
suporte a essa teoria (Webster e col., 1992, Capua e Alexander, 2002).
A gripe usualmente ocorre em epidemias com rpida expanso
geogrfica, surgindo em focos e, podendo atingir propores mundiais,
quando so ento denominadas pandemias (Bridges e col., 2003).
Associado s epidemias, h um aumento na taxa de morbidade e
mortalidade. At o momento ocorreram cerca de 10 pandemias nos
ltimos 200 anos, dentre as quais, a pandemia de 1918-20, tambm
denominada gripe espanhola, cujo agente etiolgico foi um vrus tipo A
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subtipo H1N1. As estimativas iniciais calculavam que mais de 20 milhes
de pessoas foram a bito em conseqncia dessa infeco. No entanto,
devido falta de registros em muitos pases durante a gripe espanhola,
estima-se atualmente que o nmero de mortes foi da ordem de 40 ou 50
milhes de pessoas em todo o mundo (Kuszewski e Brydak, 2000, Potter,
2001). O subtipo H1N1 foi relacionado a cepas de influenza suna, o que
estabeleceu uma ligao entre influenza enzotica e influenza humana
(Reid e col, 2000).
A pandemia de 1957 (gripe asitica), causada pela influenza A
do subtipo H2N2, e a pandemia de 1968 (gripe de Hong - Kong)
causada pela influenza A do subtipo H3N2, mataram juntas mais de 1,5milhes de pessoas. Essas pandemias causaram danos estimados de 32
bilhes de dlares economia mundial, principalmente pela perda de
produtividade, despesas com medicamentos e internaes (WHO
Influenza Fact Sheet 211, 1999). Existem evidncias de que as pandemias
de 1957 e de 1968 estivessem associadas a vrus da influenza aviria.
J em 1976, um novo subtipo de vrus influenza advindo de
porcos causaram graves quadros clnicos em seres humanos (WHOInfluenza Fact Sheet 211, 1999) e, em 1977 a linhagem H1N1 reapareceu
(gripe Russa), infectando principalmente crianas e jovens, sendo as
pessoas com mais de 50 anos pouco afetadas. Esse subtipo, ainda hoje,
est em circulao causando gripe em seres humanos (Laver e Garman,
2002, Nguyen-Van-Tam e Hampson, 2003).
Em 1997-1998, 18 pessoas foram infectadas com o vrus avirio
tipo A subtipo H5N1, na cidade de Hong Kong, onde 6 pessoas foram a
bito. O vrus H5N1 no provocou uma epidemia ou pandemia devido a
sua incapacidade de se transmitir de uma pessoa a outra (Subbarao e
col.,1998, Hatta e Kawaoka, 2002, Shortridge e col., 2003, Cox e col.,
2003). Em maro de 1999 mais um subtipo relacionado influenza
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aviria infectou pessoas em Hong Kong. Identificado como sendo do
subtipo H9N2, causou apenas quadros brandos de gripe (Peiris e
col.,1999, Cox e Subbarao 2000). No incio de 2003, na Holanda, o
subtipo viral H7N7, que ainda no havia sido encontrado em infeco de
seres humanos, foi identificado em 89 pessoas e causou, na maioria dos
infectados, um quadro de conjuntivite. No entanto, duas pessoas
desenvolveram um quadro respiratrio com sintomatologia caracterstica
de gripe, e uma foi a bito devido a complicaes pulmonares (Fouchier e
col., 2004). Desde janeiro de 2004, a Tailndia e o Vietnam, esto
vivendo o ressurgimento do subtipo H5N1. At o dia 10 de maro j
haviam sido contabilizados 33 casos de infeco por H5N1 com 22mortes (www.who.int/csr/disease/influenza/en).
A proteo contra os vrus influenza correlaciona com os nveis
de anticorpos anti-HA e anti-NA. Uma das caractersticas marcantes do
vrus influenza sua extensa e contnua variao antignica,
principalmente no que se refere as glicoprotenas de superfcie viral (HA
e NA). Tal caracterstica assegura a esses vrus seu sucesso
epidemiolgico e, insere a influenza no hall de doenas emergentes oureemergentes.
Dois mecanismos principais so responsveis pela mudana
contnua na antigenicidade dos vrus da influenza, e so denominados
shift antignico e drift antignico (Zambon, 1999).
O drift antignico uma alterao antignica gerada por
mutaes puntuais e cumulativas nos genes de HA e NA. O drift
antignico ocorre como parte da evoluo contnua dos vrus da
influenza. Esse processo gera novas linhagens de vrus capazes de escapar
neutralizao por anticorpos gerados contra linhagens que circulavam
anteriormente (Bridges e col., 2003). Epidemias anuais ou bienais
ocorrem durante o perodo intra-pandmico pois um nmero suficiente de
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indivduos na populao suscetvel linhagem variante gerada (Lin e
col., 1999). A alterao de um nico resduo de aminocido em HA1
pode resultar em alterao estrutural, permitindo ao vrus mutante escapar
neutralizao pelos anticorpos gerados em processos infectivos
anteriores (Knossow e col., 1984, Nakajima e col., 2000). Cinco stios de
maior variabilidade no domnio globular da subunidade HA1 foram
identificados (Wiley e Skehel, 1987). Este stios, designados A, B, C, D e
E correspondem a regies expostas na superfcie de HA1, e prximas ao
stio de ligao ao receptor (Wiley e col., 1981). Variaes nesses
mesmos stios foram identificadas, quando variantes antignicos foram
gerados pelo crescimento de linhagens na presena de anticorposmonoclonais sabidamente neutralizantes (Wiley e Skehel, 1987, Bush e
col., 1999). Assim, os stios de maior variabilidade correspondem, pelo
menos em parte, s regies de ligao dos anticorpos neutralizantes, o que
poderia explicar o escape dos variantes gerados aos anticorpos produzidos
numa infeco anterior. Estudos correlatos tambm foram realizados com
NA (Webster e col., 1987, Ferguson e col., 2003).
O shift antignico pode ser definido como o aparecimento deum novo vrus influenza tipo A contendo um novo subtipo de HA ou HA
e NA, os quais so imunologicamente distintos dos vrus influenza
circulantes nas ltimas dcadas. O shift antignico ocorre quando
certos vrus de influenza animal, que normalmente infectam reservatrios
avirios ou sunos e, que no estejam relacionados aos vrus da influenza
que circulam no momento na populao humana, so transmitidos para o
homem. Evidncias sugerem que o aparecimento de linhagens
pandmicas podem ocorrer por dois mecanismos distintos. O primeiro
derivado da natureza segmentada do genoma dos vrus influenza e, refere-
se ao reagrupamento dos segmentos genmicos de vrus influenza
humana e vrus influenza animal, durante a co-infeco de uma mesma
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clula hospedeira (Cox e Subbarao, 2000). Como exemplos de shift
pode-se citar as pandemias de 1957 e 1968 (Nguyen-Van-Tam e
Hampson, 2003). A pandemia de 1957 foi gerada pela incorporao de
segmentos genmicos avirios que codificam para a HA, NA e PB1 em
vrus da influenza humana circulantes. Em 1968, os segmentos
genmicos de HA e PB1 originrios de aves foram introduzidos em vrus
da influenza humana circulantes. (Kawaoka e col., 1989; Laver e Webster
1973). O segundo mecanismo para o surgimento de linhagens pandmicas
a transmisso direta de uma linhagem animal para o homem (Cox e
Subbarao, 2000). Esse fenmeno foi observado no episdio ocorrido em
Hong-Kong, em 1997. Postula-se que, vrus da influenza aviria dosubtipo H5N1 foram transmitidos de aves migratrias para patos atravs
da contaminao da gua por fezes de aves infectadas. Dos patos os vrus
foram transmitidos para galinhas, as quais posteriormente so
comercializadas nos mercados de Hong-Kong. Durante a transmisso
entre diferentes espcies de aves os vrus agregaram a caracterstica de
serem altamente patognicos para galinhas, sendo, eventualmente,
transmitidos para humanos nos mercados de Hong-Kong (Lavanchy,1998, Matrosovich e col., 1999, Hiromoto e col., 2000b). Apesar do
subtipo H5N1 ser altamente patognico para galinhas e humanos, nada
causa em patos e gansos (Webster, 1998).
Muitas mortes e internaes causadas pelos vrus da influenza
podem ser evitadas pela vacinao anual, especialmente em pessoas
propensas a complicaes mdicas. Nesse grupo esto as pessoas com
idade acima dos 65 anos, pessoas com doenas crnicas do corao, do
pulmo ou rins, pessoas diabticas, imunodeprimidas e pessoas com
quadros clnicos de anemia severa (WHO Weekly Epidemiological
Record, 2000, Kemble e Greenberg, 2003).
As vacinas de vrus inativados constituem o principal mtodo de
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preveno da influenza (Palese e Garca-Sastre, 2002). O monitoramento
da antigenicidade dos vrus circulantes a cada ano necessrio para
identificao das linhagens variantes e, posterior escolha das linhagens a
serem utilizadas na composio da vacina (Rota e col., 1992, Gerdil,
2003). A eficcia da vacina em grande parte devida similaridade
antignica entre as linhagens circulantes e as da vacina (Kendal e Cox,
1985, Wood, 2002).
O monitoramento epidemiolgico da gripe uma atividade
mundial que conta atualmente com uma rede de 110 laboratrios, em 80
pases, coordenados pela Organizao Mundial da Sade (OMS). Um
comit da OMS encarrega-se de reunir os dados e recomendar acomposio da vacina para o ano seguinte (WHO Weekly
Epidemiological Record, 2000). A cada ano, a vacina deve conter os vrus
com tendncia a apresentar maior prevalncia. No entanto, a vacina
formulada para o hemisfrio norte nem sempre corresponde a linhagens
de vrus prevalentes em outras regies, fato esse observado em pelo
menos duas localidades do hemisfrio sul, frica do Sul (Besselaar e col.,
1996) e Argentina (Savy e col., 1999). Na frica do Sul, isolados (H3N2)de 1993 mostraram-se antigenicamente diferentes com relao cepa
vacinal A/Beijing/353/89 recomendada pela Organizao Mundial da
Sade. Os isolados possuem 8 resduos de aminocidos de diferena,
quando comparadas suas seqncias da subunidade de HA1 com a
seqncia de HA1 de A/Beijing/353/89 (Besselaar e col., 1996). Estes
resultados mostram a necessidade da intensificao do monitoramento no
hemisfrio sul, tendo em vista a formulao coerente de uma vacina mais
adequada.
A determinao da seqncia de nucleotdeos dos genes HA e NA
a metodologia mais precisa na associao de determinados resduos de
aminocidos a um drift antignico (Rota e col., 1990, Plotkin e col.,
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2002, Schweiger e col., 2002). A sensibilidade e especificidade da tcnica
de RT-PCR, e a determinao da seqncia de nucleotdeos dos produtos
amplificados aperfeioaram a anlise molecular das linhagens de vrus da
influenza circulantes, aprimorando a qualidade dos dados disponveis a
serem utilizados na formulao de vacinas (Smith, 2003).
Nosso trabalho est situado no mbito da monitorao de
variantes moleculares de vrus influenza tipo A, subtipos H3N2 e H1N1,
e tipo B em amostras coletadas na cidade de So Paulo, sendo relevante o
monitoramento desses variantes para a escolha das cepas vacinais.
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II Objetivos
1) Determinar a ocorrncia dos vrus influenza tipo A, subtipos H1N1 e
H3N2, e tipo B em amostras clnicas coletadas durante os anos de
2000 e 2001, atravs da tcnica de Nested Multiplex RT-PCR,
utilizando a regio varivel da hemaglutinina viral (HA1) como base
de investigao.
2) Obteno da seqncia codificadora da regio varivel completa da
hemaglutinina dos isolados de influenza, atravs da tcnica de Nested
Multiplex RT-PCR ou Semi-nested Multiplex RT-PCR.
3) Analisar comparativamente as seqncias de aminocidos obtidas da
regio HA1 da hemaglutinina do vrus influenza tipo A, H1N1 e
H3N2, e tipo B nos anos de 2000 e 2001.
4) Localizao das diferenas detectadas na estrutura da molcula de
hemaglutinina e, verificao da incluso ou no desses pontos emstios antignicos de alta variabilidade.
5) Analisar comparativamente as seqncias de aminocidos obtidas com
as das cepas vacinais utilizadas no hemisfrio sul por proposta da
OMS para os anos 2000 e 2001.
6) Analisar comparativamente as seqncias de nucleotdeos entre os
variantes isolados, assim como, compar-las a seqncias de
nucleotdeos presentes em bancos de dados. Elaborao de uma rvore
genealgica.
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tubo, prosseguiu-se com incubao por 3 minutos a temperatura
ambiente. A mistura foi centrifugada a 12.000 x g por 15 minutos a 4oC.
A fase aquosa foi transferida para outro tubo, e a precipitao do RNA foi
feita temperatura ambiente por 10 minutos aps a adio de 500L de
isopropanol (Merck). O precipitado foi coletado por centrifugao a
12.000 x g por 10 minutos a 4oC. O sobrenadante foi descartado, e o
precipitado foi lavado com 1 mL de etanol 75% (Synth). O RNA seco foi
dissolvido em 20 L de gua livre de RNAses.
3. Obteno de cDNAs por transcrio reversa.
Inicialmente, para a reao de transcrio reversa, 10 L do RNA
extrado de cada alquota de 250L de amostra foram desnaturados a
65oC por 5 minutos na presena de 50 ng de iniciador randmico (50
ng/L, Invitrogen Life Technologies) e 1 L de 10 mM de cada dNTP
(dATP, dGTP, dTTP e dCTP). Aps a desnaturao, a mistura foi
transferida para banho de gelo e, foram adicionados tampo para
transcrio reversa, inibidor de RNase (RNAguard, Amershan Pharmacia
Biotec Inc) e DTT para concentraes finais de 1X (50mM Tris-HCl,
pH 8,3, 75 mM KCl, 3mM MgCl2), 1U/L e 10 mM respectivamente,
considerando-se um volume final de reao de 20 L. Seguiu-se
incubao a 25oC por 2 minutos e adio de 200 U de transcriptase
reversa Superscript II RNase H- (200 U/L, Invitrogen Life
Technologies). A incubao a 25oC foi prolongada por mais 10 minutos,
seguindo-se aumento de temperatura para 42oC pelo tempo restante da
reao, ou seja, 50 minutos. Finalmente, a enzima foi inativada por calor
a 70oC durante 15 minutos.
Para um lote de reaes um controle negativo foi realizado. Nesse
controle, o mesmo volume de gua substituiu o volume original de RNA.
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4. Reao em Cadeia pela Polimerase -Nested Multiplex PCR.
Para a deteco, tipagem e subtipagem dos cDNAs de vrus
influenza A H1, A H3 e B foi utilizada a tcnica de Nested Multiplex
PCR previamente estabelecida (Ellis e col., 1997; Ellis e col., 1995 e
Zhang e Evans, 1991), na qual duas rodadas de amplificao so
utilizadas.
4.1. Oligonucleotdeos Iniciadores.
Para cada uma das duas rodadas de amplificao, foram utilizados3 pares de iniciadores especficos para cada um dos segmentos de RNA
codificante da hemaglutinina dos tipos A H1, A H3 e B (tabela 2 e
figuras 1, 2 e 3). Assim, do total de 6 pares de iniciadores utilizados, 3
pares tem localizao externa e destinam-se primeira rodada de
amplificao, enquanto na segunda rodada de amplificao so utilizados
3 pares de iniciadores internos (tabela 2).
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Tabela 2. Iniciadores utilizados na reao de Nested Multiplex PCR.
Iniciadores*
Posio da
extremidade
5' do
iniciador**
Tamanho do
Produto (pb)Seqncia (53)
Primeira Amplificao
AH1 A 76 cagatgcagacacaatatgt
AH1 FII 1090 1.015 aaaccggcaatggctccaaa
AH3 A 174 cagattgaagtgactaatgc
AH3 DII 1056 883 gtttctctggtacattccgc
BHA A 154 gtgactggtgtgataccact
BHA DII 1053 900 tgttttcacccatattgggc
Segunda Amplificao
AH1 B 96 ataggctaccatgcgaacaa
AH1 EII 1039 944 cttagtcctgtaaccatcct
AH3 B 348 agcaaagctttcagcaactg
AH3 CII 938 591 gcttccatttggagtgatgc
BHA B 196 cattttgcaaatctcaaagg
BHA CII 962 767 tggaggcaatctgcttcacc
O nmero romano II presente no nome dos iniciadores indica que estes socomplementares ao cDNA obtido por transcrio reversa do RNA viral. Os demais
oligonucleotdeos so complementares ao RNA viral.
** Posio da extremidade 5 do iniciador ocupada no cDNA completo (iniciadores
complementares ao RNA viral) ou, a posio onde a extremidade 5 do iniciador se associa
com o cDNA (iniciadores complementares ao cDNA).
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4.2. Reaes.
A primeira "PCR" foi realizada num volume total de 50 L,
utilizando-se de 2 L de cDNA ou do controle negativo de transcrio
reversa e nas seguintes condies: 20 mM Tris-Cl pH 8,4, 50mM KCl,
1,5 mM MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP, 0,1M de iniciador externo
(AH1 A, AH1 FII, AH3 A, AH3 DII, BHA A e BHA DII), 2,5 U de Taq
DNA polimerase (Invitrogen Life Technologies). As condies de
ciclagem utilizadas nessa primeira amplificao encontram-se na tabela 3.
A segunda "PCR" foi realizada partindo-se de 2 L do produto da
primeira amplificao e nas mesmas condies da primeira "PCR",excetuando-se a concentrao dos iniciadores, a qual foi alterada para 0,5
M de cada um dos iniciadores internos (AH1 B, AH1EII, AH3 B, AH3
CII, BHA B e BHA CII). As condies de ciclagem utilizadas nessa
segunda amplificao encontram-se na tabela 4. Todas as amplificaes
foram realizadas em termociclador "Perkin Elmer Cetus DNA Thermal
Cycler", utilizando-se leo mineral (Sigma) para se impedir evaporao
dos contedos.
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Tabela 3. Parmetros de ciclagem da primeira "PCR".
Programa de Ciclos da Primeira "PCR"
EtapasTemperatura
em oC
Tempo em
Minutos
Nmero de
Ciclos
Desnaturao
inicial95 2 1
Desnaturao 94 1
Associao 50 1Extenso 72 3
35
Manuteno 4 1
Tabela 4. Parmetros de ciclagem da segunda "PCR".
Programa de Ciclos da Segunda "PCR"
EtapasTemperatura
em oC
Tempo em
Minutos
Nmero de
Ciclos
Desnaturao
inicial95 2 1
Desnaturao 94 1Associao 60 1
Extenso 72 1
35
Manuteno 4 1
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4.3. Anlise dos Produtos Amplificados
A um volume de 15L de produto da segunda amplificao foram
adicionados de 3L de corante para amostra 6X (azul de bromofenol
0,25% e Ficoll tipo 400 15%), seguindo-se anlise por eletroforese
horizontal em gel de agarose 1.2% (Invitrogen Life Technologies), em
tampo 1X TAE (40 mM Tris-acetato pH 8,0, 1 mM EDTA). Os gis
foram corados com brometo de etdio na concentrao de 0,5g/mL
(Invitrogen Life Technologies). Aps a corrida, as bandas foram
visualizadas por iluminao com luz ultravioleta e o gel fotografado.
5. Reaes de Semi-Nested PCR e Nested-PCR.
Os mesmos cDNAs positivos para os vrus influenza analisados por
Nested Multiplex PCR foram utilizados para a amplificao de
segmentos dos cDNAs que codificam a poro externa completa da
molcula da Hemaglutinina (HA1). A tcnica de "Semi-Nested PCR", foi
utilizada para a amplificao de segmentos dos cDNAs dos vrus da
influenza tipo A subtipo H1N1 e tipo B. J para os vrus do tipo A
subtipo H3N2, foi utilizada a tcnica de "Nested PCR".
5.1. Oligonucleotdeos iniciadores.
As reaes de "Semi-Nested PCR" utilizaram um par de iniciadores
externos para a primeira amplificao, sendo os iniciadores H1F e H1R
utilizados para os vrus influenza A H1N1, e os iniciadores BF e BR
utilizados para vrus influenza B. Para a segunda amplificao foram
utilizados os mesmos iniciadores externos senso (H1F e BF), no entanto
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substituindo-se os iniciadores anti-senso utilizados na primeira reao por
iniciadores internos: H1R2 para vrus influenza A H1N1 e, BR2 para
vrus influenza B.
Para as reaes de "Nested PCR" de vrus influenza H3N2 foram
utilizados 2 pares de iniciadores, um par externo para a primeira
amplificao, H3F2 e H3R, e um par interno para a segunda
amplificao, H3F e H3R2.
A seqncia dos iniciadores H3F, H3R, H1F, H1R, BF e BR foram
descritas anteriormente (Xu e col., 1994; Xu e col., 1993; Rocha e col.,
1991) (tabela 5 e figuras 1, 2 e 3). Os demais iniciadores, H3F2 e H3R2
para o subtipo H3N2, H1R2 para o subtipo H1N1 e BR2 para o tipo B,foram desenhados utilizando-se os programas de computador para
anlise, Oligo Tech (verso 1.0, Oligos Etc Inc e Oligo Therapeutics inc)
e DNA Sequence Search Program (verso 2.1)(tabela 5 e figuras 1, 2 e 3).
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Tabela 5. Propriedades dos iniciadores do "Semi-Nested PCR e Nested PCR"
A letra R que compe o nome do iniciador indica que ele um iniciador reverso, enquanto letra F
indica que o iniciador senso.
Iniciador
Posio da
extremidade 5
do iniciador
Tamanho do Produto
(pb)Seqncia (53)
Primeiro "PCR" (iniciadores externos)
H3F2 12 gggataattctattaacca
H3R 1198 1187 atggctgcttgagtgctt
H1F 06 aagcaggggaaaataaaa
H1R 1210 1205 gtaatcccgttaatggcaBF 36 gaaggcaataattgtactac
BR 1140 1105 accagcaatagctccgaa
Segundo "PCR" (iniciadores internos)
H3F 36 actatcattgctttgagc
H3R2 1153 1118 catctatcattcctgtc
H1R2 1122 1117 catctatcattcctgtc
BR2 1075 1040 cattggcaagcttcaaag
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Fig. 1. Esquematizao da localizao dos iniciadores especficos para ovrus da influenza tipo A subtipo H1N1* Representao no cDNA do stio de clivagem da protena.
Stio de Clivagem*
HA1 HA2
H1A
H1R2 H1R
Direo de Sntese
H1F
Dire o de Sntese
H1B
H1FIIH1EII
HA2
Regio notraduzida
PeptdioSinal
cDNA
HA1
(6) (76) (96)
(1039) (1090) (1122) (1210)
5
53
3
PPrroodduuttooddeePPCCRRSSeemmii--NNeesstteedd 11220055ppaarreessddeebbaasseess
PPrroodduuttooddeePPCCRRSSeemmii--NNeesstteedd 11111177paarreessddeebbaasseess
PPrroodduuttooddeePPCCRRMMuullttiipplleexx11 11001155ppaarreessddee
PPrroodd..PPCCRRMMuullttiipplleexx22 994444ppbb
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29
Fig. 2. Esquematizao da localizao dos iniciadores especficos para ovrus da influenza tipo A subtipo H3N2* Representao no cDNA do stio de clivagem da protena.
Stio de Clivagem*
HA1 HA2
H3A
H3R H3R
Direo de Sntese
H3F2 H3F
Dire o de Sntese
H3B
H3DIIH3CII
HA2
Regio notraduzida
PeptdioSinal
cDNA
HA1
(12) (36) (174) (348)
(938) (1056) (1153) (1198)
5
53
3
PPrroodduuttooddeePPCCRRNNeesstteedd11 11118877ppaarreessddeebbaasseess
PPrroodduuttooddeePPCCRRNNeesstteedd22 11111188ppaarreessddeebbaasseess
PPrroodduuttooddeePPCCRRMMuullttiipplleexx 888833ppaarreessddeebbaasseess
PPrroodd..PPCCRRMMuullttiipplleexx22 559911ppbb
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30
Fig. 3. Esquematizao da localizao dos iniciadores especficos para ovrus da influenza tipo B.* Representao no cDNA do stio de clivagem da protena.
5.2. Reaes.
A primeira "PCR" foi realizada num volume total de 50 L,
utilizando-se de 2 L de cDNA positivo ou de controle negativo nos
experimentos de Nested Multiplex PCR e nas seguintes condies: 20
mM Tris-Cl pH 8,4, 50mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP,
0,2M de iniciador externo (H1F, H1R, H3F2, H3R, BF e BR), 2,5 U de
Taq DNA polimerase (Invitrogen Life Technologies). As condies deciclagem utilizadas nessa primeira amplificao encontram-se na tabela 6
para os vrus da influenza tipo A e tabela 7 para os vrus tipo B. A
segunda "PCR" foi realizada partindo-se de 1 L do produto da primeira
amplificao e nas mesmas condies da primeira "PCR", excetuando-se
Stio de Clivagem*
HA1 HA2
BHA
BR2 BR
Direo de
BF
Dire o de Sntese
BHA
BHADIBHACII
HA2
Regio notraduzida
PeptdioSinal
cDNA
HA1
(36) (154) (196)
(962) (1053 (1075 (1140
5
53
3
PPrroodduuttooddeePPCCRRNNeesstteedd 11110055ppaarreessddeebbaasseess
PPrroodduuttooddeePPCCRRNNeesstteedd 11004400ppaarreessddeebbaasseess
PPrroodduuttooddeePPCCRRMMuullttiipplleexx 990000ppaarreessddeebbaasseess
PPCCRRMMuullttiipplleexx22 776677ppbb
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a temperatura de associao, a qual foi alterada para 55oC. As condies
utilizadas nessa segunda amplificao encontram-se nas tabelas 6 e 7.
Todas as amplificaes foram realizadas em termociclador "Perkin
Elmer Cetus DNA Thermal Cycler", utilizando-se leo mineral (Sigma)
para se impedir evaporao dos contedos.
Tabela 6 Para vrus da influenza tipo A.
EtapasTemperatura
em oC
Tempo em
Minutos
Nmero de
Ciclos
Desnaturaoinicial
95 2 1
Desnaturao 94 1
Associao 53 1
Extenso 72 1.5
40
Manuteno 4 1
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Tabela 7 Para vrus da influenza tipo B.
Programa de Ciclos do "Semi-Nested PCR"
EtapasTemperatura
em oC
Tempo em
Minutos
Nmero de
Ciclos
Desnaturao
inicial95 2 1
Desnaturao 94 1
Associao 55 1Extenso 72 1.5
40
Manuteno 4 1
5.3. Anlise dos Produtos Amplificados.
Os produtos da segunda reao foram analisados por eletroforese
em gis de agarose exatamente da mesma maneira que os produtos de
Nested Multiplex PCR.
6. Determinao da seqncia de nucleotdeos.
A determinao da seqncia de nucleotdeos foi feita diretamente
do produto de "PCR". Para isso, foi utilizado o seqenciador ABI 377(Applied Biosystems Inc) que emprega um gel de poliacrilamida com
capacidade de 96 canaletas.
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6.1. Purificao dos Produtos de "PCR".
A purificao dos produtos das reaes de "Nested PCR e Semi-
Nested PCR" foi feita em colunas, utilizando o sistema "QIAquick PCR
Purification Kit" (Qiagen) de acordo com as instrues do fabricante.
Alquotas do produto purificado foram submetidas eletroforese
em gel de agarose 1,2% e quantificadas com o auxlio de DNA de
bacterifago Lambda de massa conhecida (Invitrogen Life Technologies).
6.2. Reao de determinao de Seqncias de nucleotdeos.
Para a reao de determinao de seqncias de nucleotdeos foramutilizados 3.2 moles de cada iniciador, 2 l de BigDye terminator
cycle sequencing kit 3.0 (Applied Biosystems Inc), 6l de tampo Save
Money (200mM de Tris-HCl pH 9 e 5mM de MgCl2), 30 a 100 moles
de produto de "PCR" e, gua deionizada para completar o volume final de
20 l. Os iniciadores utilizados foram os mesmos empregados para a
obteno de produtos do Nested-PCR e Semi-Nested PCR (H1F,
H1R2, H3F, H3R2, BF e BR2 - tabela 5). Para cada amostra foram feitas
quatro reaes de seqnciamento, duas reaes utilizando iniciadores
senso e duas com iniciadores anti-senso. As reaes foram realizadas no
termociclador "Thermal Cycler GeneAmp PCR System 2400". As
condies de ciclagem so apresentadas na tabela 8.
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Tabela 8. Programa de ciclagem utilizado para as reaes de
determinao de seqncias de nucleotdeos.
Programa de Ciclos do Seqnciamento
EtapasTemperatura
em oCTempo
Nmero de
Ciclos
Desnaturao
inicial
95 2 minutos 1
Desnaturao 94 45 segundos
Associao 50 10 segundos
Extenso 72 4 minutos
25
Manuteno 4 1
Os produtos das reaes de determinao da seqncia de
nucleotdeos foram purificados em colunas do kit "DyeEx 2.0 Spin Kit"
(Qiagen) de acordo com as instrues do fabricante, seguindo-se secagem
a vcuo por 30 minutos. As amostras purificadas foram ressuspendidas
em 3 l de formamida e submetidas eletroforese em gel de
poliacrilamida, utilizando o seqenciador automtico ABI 377 (AppliedBiosystems Inc).
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7. Edio e Anlise das Seqncias Obtidas.
As quatro seqncias de nucleotdeos obtidas para cada amostra
positiva foram alinhadas e editadas manualmente no programa de
computador "Sequence Navigator" (verso 1.0.1 Applied Biosystems).
As seqncias editadas foram comparadas utilizando-se o programa de
computador ClustalX 1.83 (Thompson e col., 1997) e traduzidas para
aminocidos pelo programa "BioEdit Sequence Alignment Editor"
(verso 5.0.9) (Hall, 1999). Para a apresentao grfica dos alinhamentos
das seqncias de nucleotdeos obtidas, foi utilizado o programa de
computador "GeneDoc Multiple Sequence Alignment Editor & ShadingUtility" (verso 2.4.002) (Karl Nicholas, Copyright).
8. Localizao das diferenas na estrutura da hemaglutinina.
Aps mapeadas as diferenas encontradas, quando foram
comparadas as seqncias de aminocidos das amostras estudadas entre si
e entre as seqncias peptdicas das cepas vacinais, foi possvel localizarestas diferenas na estrutura tridimensional da hemaglutinina. Para isso
foi utilizado o programa de computador "Rasmol" (verso 2.7.2.1.1)
(Sayle e Milner-White 1995) para a edio da estrutura tridimensional do
monmero de HA obtida por difrao de raios X (Influenza Sequence
Data Base, www.flu.lanl.gov). O Modelo foi baseado na estrutura obtida
por Sauter e cols., 1992 e depositada no Protein Data Bank sob o
nmero de acesso 1HGI.
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9. rvore genealgica.
Para a construo da rvore genealgica foi utilizado o programa de
computador Meg Align 4.05 Expert Analysis Software (DNASTAR,
Inc). As seqncias de nucleotdeos utilizadas na rvore foram todas
alinhadas com o programa "BioEdit Sequence Alignment Editor" (verso
5.0.9) e editadas para ficarem no tamanho de 555 resduos de
nucleotdeos, que corresponde menor seqncia de nucleotdeos obtida
nas amostras analisadas.
Alm das seqncias de nucleotdeos por ns determinadas,
tambm foram utilizadas seqncias obtidas em bancos de dados de genesGenBank e Influenza Sequence Database (www.ncbi.nlm.nih.gov e,
www.flu.lanl.gov respectivamente). Essas ltimas foram escolhidas de
acordo com trs critrios. Primeiro, foram obtidas seqncias de
nucleotdeos que tiveram maior similaridade com as seqncias das
amostras que analisamos. Segundo, foram selecionadas seqncias de
nucleotdeos de vrus influenza isolados em diferentes anos e hospedeiros
distintos, assim como uma seqncia do tipo A subtipo H5N1 e duasseqncias do tipo C para que o programa de computador DNASTAR
tivesse base de comparao tendo como material de anlise seqncias
relacionadas, no entanto, heterogneas. Terceiro, foram utilizadas na
obteno da rvore genealgica as seqncias de nucleotdeos das cepas
vacinais dos anos 2000 e 2001, propostas pela Organizao Mundial de
Sade. Todas as seqncias utilizadas na rvore genealgica foram da
regio HA1 da hemaglutinina viral, com exceo para seqncias de
nucleotdeos dos vrus tipo C onde foram utilizadas seqncias correlatas
da sua glicoprotena de superfcie, hemaglutinina esterase (HE).
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IV Resultados
1. Deteco, tipagem e subtipagem das amostras clnicas.
A tcnica de Nested Multiplex PCR previamente estabelecida (Ellis e
col., 1997) foi utilizada na deteco, tipagem e subtipagem dos vrus influenza
nas amostras estudadas. Essa tcnica baseia-se na amplificao de fragmentos
de tamanho distintos atravs da utilizao de iniciadores especficos para os
tipos e subtipos virais A H1N1, A H3N2 e B. Aps a segunda amplificao,
eram esperados fragmentos de tamanhos 944 pares de base (pb), 591pb e 767
pb respectivamente para amostras portadoras dos tipos virais A H1N1, A
H3N2 e B (figura 4). Em todos experimentos de Nested Multiplex PCR um
controle negativo onde o volume de cDNA foi substitudo pelo mesmo
volume de gua, controle dos reagentes, sempre resultou na ausncia de
deteco de algum produto, indicando a ausncia de contaminao dereagentes.
No ano de 2000 foram coletadas 91 amostras e, sendo 57 amostras
coletadas em 2001. Das 91 amostras coletadas no ano de 2000, 18 se
mostraram positivas para vrus da influenza. Duas dessas 18 amostras (006 e
015) mostraram a peculiaridade de serem positivas para dois subtipos virais, A
H1N1 e A H3N2. Assim, no ano de 2000 foi possvel a deteco de 20
produtos de Nested Multiplex PCR independentes (figura 4 B e tabela 9).
Portanto, do total de 20 registros positivos, o que corresponde a
aproximadamente 22% do nmero total de amostras, 12 (60% dos registros
positivos) pertencem ao tipo A subtipo H3N2, 2 (10% dos registros positivos)
pertencem ao subtipoH1N1 e, 6 (30% dos registros positivos) pertencem ao
tipo B (tabela 09).
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J para as 57 amostras coletadas em 2001, 16 se mostraram positivas
para o vrus influenza, o que corresponde a 28% do nmero total de amostras,
sendo 1 amostra positiva para o subtipo H3N2 (6,25% dos registros positivos),
14 para o subtipo H1N1 (87,5% dos registros positivos) e 1 amostra para o
tipo B (6,25% dos registros positivos) (figura 4 A e tabela 9).
Figura 4 Deteco, tipagem e subtipagem do vrus influenza em amostras clnicas. A) Gel
de agarose 1,2% corado com brometo de etdio representativo de amostras clnicas
portadoras dos diferentes tipos e subtipos virais. Canaleta 1, produto de Nested Multiplex
PCR da amostra 114, mostrando padro caracterstico de presena do vrus A H1N1.
Canaleta 2, produto de Nested Multiplex PCR da amostra 125, mostrando padro
caracterstico de presena do vrus A H3N2. Canaleta 3, produto de Nested Multiplex
PCR da amostra 110, mostrando padro caracterstico de presena do vrus tipo B.
Canaleta PM, padro de peso molecular 100 bp DNA Ladder (Invitrogen LifeTechnologies). B) Produtos de Nested multiplex PCR positivos para vrus do tipo A
subtipos H3N2 e H1N1 na mesma amostra clnica. Canaleta 1, produtos gerados a partir da
amostra 006. Canaleta 2, produtos gerados a partir da amostra 015. Canaleta PM, padro
de peso molecular 100 bp DNA Ladder (New England Biolabs).
PM 1 2 3
1.500 pb
600 pb
100 pb
H1N1 944 bB (767 pb)
H3N2 591 b
100 pb
1.200 pb
500 pb
PM 1 2
A B
H1N1 944 b
H3N2 591 b
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Tabela 9 Distribuio da amostras positivas pelos anos de coleta*.
Quantidade de Amostras positivas
Tipo A Tipo B Co-infeco com H3N2Ano da
Coleta Subtipo
H1N1
Subtipo
H3N2H1N1 B
2000 2 12 6 2 0
2001 14 1 1 0 0
Total 16 13 7 2 0
*Ver tambm o apndice 2.
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2. Obteno da regio codificadora completa de HA1.
A tcnica de "Semi-Nested PCR", foi utilizada para a amplificao do
segmento gnico contendo a poro externa da molcula de hemaglutinina
(HA1) dos vrus da gripe tipo A subtipo H1N1 e tipo B. Para os vrus do tipo
A subtipo H3N2 foi utilizada a tcnica de "Nested PCR". Os iniciadores
utilizados nestas reaes em cadeia pela polimerase foram desenhados para
serem especficos para a regio de peptdeo sinal do segmento gnico 4 e para
a regio que codifica a poro HA2 da hemaglutinina. Dessa forma, foi
possvel a obteno de produtos contendo as regies HA1 completas.
Os fragmentos obtidos com a tcnica de "Semi-Nested PCR" para os
vrus tipo A subtipo H1N1 foram de 1117 pares de bases, onde se incluem os
978 pares de bases quem compem a regio codificadora da poro HA1 da
hemaglutinina. Para os vrus do tipo B, foram obtidos produtos de PCR com
1040 pares de bases, sendo a regio codificadora de HA1 composta por 1038nucleotdeos. Com a tcnica de "Nested PCR" obtivemos para o tipo A subtipo
H3N2 produtos com 1118 pares de bases, os quais contm a regio
codificadora da poro HA1 da hemaglutinina viral de 984 pares de base.
Do total de 34 amostras positivas que geraram 36 produtos amplificados
pela tcnica de "Nested Multiplex PCR", conseguimos obter 32 produtos que
correspondem s regies HA1 completas da hemaglutinina (Figura 5). No foi
possvel a amplificao de produtos de PCR contendo a regio completa de
HA1 de 4 amostras, sendo 3 do tipo A subtipo H3N2 (006, 011 e 013) e 1 do
tipo A subtipo H1N1 (006).
As amostras de influenza A subtipo H1N1, 123, 126, 133 e 140
mostraram bandas inespecficas (figura 5A, linhas 12, 13, 14 e 15
respectivamente). O mesmo ocorreu com as amostras 08, 10, 12, 15 e 125 do
tipo A subtipo H3N2 (figura 5B, linhas 2, 4, 5, 6 e 11 respectivamente).
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A
BC
PM 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 PM 01 02 03 04 05 06 07 08 PM
PM 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 PM
500 pb
1.200 pb
100 pb
100 pb
1.200 pb
500 pb
600 pb
1500 pb
100 pb
Figura 5. Obteno das regies codifcadoras completas de HA1. por Semi-Nested PCR e
Nested PCR A: Produtos de Semi-Nested PCR para cDNAs A H1N1 analisados em gel de agarose
1,2% corado com brometo de etdio. Linhas de 01 a 15 correspondem s amostras 15, 99, 101, 103, 104,
109, 112, 113, 114, 121, 122, 123, 126, 133 e 140 respectivamente. Padro de peso molecular (PM)
100bp DNA ladder (New England Biolabs INC). B: Produtos de Nested PCR para cDNAs A H3N2
analisados em gel de agarose 1,2% corado com brometo de etdio. Linhas de 01 a 11 correspondem s
amostras 03, 08, 09, 10, 12, 15, 18, 24, 49, controle negativo e 125 respectivamente. Marcador de peso
molecular (PM) 100bp DNA ladder (New England Biolabs INC). C: Produtos de Semi-Nested PCR
para cDNAs B analisados em gel de agarose 1,2% corado com brometo de etdio. Linhas de 01 a 08
correspondem s amostras 17, 53, 55, 64, 74, 79, controle negativo e 110 respectivamente. Marcador de
peso molecular (PM) 100bp DNA ladder (Invitrogen Life Technologies).
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4. Seqncias de aminocidos de HA1 das amostras estudadas: anlise
comparativa das amostras entre si e com as cepas vacinais.
As regies codificadoras completas de HA1 da hemaglutinina viral das
amostras positivas foram utilizadas para a obteno de suas seqncias de
nucleotdeos. As seqncias de nucleotdeos obtidas foram traduzidas em
peptdeos, as quais foram utilizadas em diferentes alinhamentos. As
seqncias de aminocidos das regies HA1 obtidas foram alinhadas entre si,
assim como, com a seqncia das cepas vacinais utilizadas nos anos de 2000 e
2001.
Essa estratgia nos permite avaliar variaes na seqncia de
aminocidos para cada tipo e subtipo viral ao longo de 2 anos consecutivos e,
compar-las com as cepas vacinais. Uma vez mapeadas as diferenas,
podemos localiz-las na estrutura tridimensional da hemaglutinina e, verificar
se essas pertencem a stios antignicos conhecidos por sua alta variabilidade.
4.1. Tipo A Subtipo H1N1
Foram obtidos 14 produtos de "Semi-Nested PCR" para as amostras do
tipo A subtipo H1N1. A seqncia de nucleotdeos para esses produtos de
978 pares de bases. Devido ausncia de produto contendo a regio HA1
completa para a amostra 006, utilizou-se o produto de 891 pares de bases
obtido em experimentos de "Nested Multiplex PCR" para a obteno de
informao de seqncia de nucleotdeos. Esse fragmento corresponde a
aproximadamente a 91% da regio HA1 da hemaglutinina. Para a amostra 123
no foi possvel obter seqncias.
A comparao entre as seqncias peptdicas de HA1 de todas as
amostras do tipo A subtipo H1N1 entre si, assim como, com a seqncia da
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cepa vacinal utilizada nos anos 2000 e 2001 (A/New Caledonia/20/99)
mostrou vrias diferenas. Das 20 diferenas mapeadas, 19 so substituies
de aminocidos, enquanto uma configura-se como uma deleo (figura 06).
Entre as amostras positivas que foram coletadas no ano 2000 (amostras 006 e
015) foi encontrado um total de 15 aminocidos de diferena quando
comparadas com as seqncias da cepa vacinal, sendo 13 diferenas referentes
seqncia 006 e duas referentes a seqncias 015 (tabela 10). Entre as
amostras do ano 2001 foram encontradas apenas 6 diferenas em suas
composies peptdicas quando comparadas com a seqncia da cepa vacinal
A/New Caledonia/20/99 (figura 06 e tabela 10).
Todas as alteraes de aminocidos ocorridas entre as seqncias
peptdicas das amostras do subtipo H1N1 foram relacionadas com os cinco
stios de maior variabilidade na regio de HA1 da molcula de hemaglutinina
(figura 07 e tabela 10) (Yewdell e col., 1983, Caton e col., 1982, Drescher e
Aron, 1999).
10 20 30 40 50 60
Cepa DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCLLKGIAPLQLGNCSVAGW
121H1 ............................................................
122H1 ............................................................
101H1 ............................................................
099H1 ............................................................
109H1 ............................................................
103H1 ...........................................I................
112H1 ............................................................
113H1 ............................................................
133H1 ............................................................
126H1 ............................................................
114H1 ............................................................
104H1 ............................................................
140H1 ............................................................
015H1............................................................
006H1-------------.............................R.............I...
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70 80 90 100 110 120
Cepa ILGNPECELLISKESWSYIVETPNPENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKE
121H1 ............................................................
122H1 ............................................................
101H1 ............................................................
099H1 ............................................................
109H1 ............................................................
103H1 ............................................................
112H1 ............................................................
113H1 ............................................................
133H1 ............................................................
126H1 ............................................................
114H1 ............................................................
104H1 ............................................................
140H1 ............................................................
015H1............................................................
006H1........S.F........A....S...................................
130 140 150 160 170 180
Cepa SSWPNHTVT-GVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNGLYPNLSKSYVNNKEKEVLVLWGVH
121H1 N........-...................................A..............
122H1 N........-...................................A..............
101H1 .........-...................................A..............
099H1 .........-...................................A..............
109H1 .........-...................................A..............
103H1 .........-...................................A..............
112H1 .........-...................................A..............
113H1 .........-...................................A..............
133H1 .........-...................................A..............
126H1 .........-...................................A..............114H1 .........-...................................A..............
104H1 .........-...................................A..............
140H1 .........-...................................A..............
015H1.........-................................M.................
006H1.........K..T...............................................
190 200 210 220 230 240
Cepa HPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTI
121H1 ............................................................
122H1 ............................................................
101H1 ............................................................
099H1 ............................................................
109H1 ............................................................
103H1 ............................................................
112H1 ............................................................
113H1 ............................................................
133H1 ............................................................
126H1 ............................................................114H1 ............................................................
104H1 ............................................................
140H1 ............................................................
015H1............................................................
006H1..S.......I..............................G..................
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250 260 270 280 290 300
Cepa IFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNAPMDECDAKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTI
121H1 ...........R................................................
122H1 ...........R................................................
101H1 ...........R................................................
099H1 ...........R.............................................I..
109H1 ...........R................................................
103H1 ...........R................................................
112H1 ...........R................................................
113H1 ...........R................................................
133H1 ...........R................................................
126H1 ...........R................................................
114H1 ...........R................................................
104H1 ...........R................................................
140H1 ...........R................................................
015H1..........................................K.................
006H1..............................S.............................
310 320
Cepa GECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPSIQS
121H1 .........T................
122H1 .........T................
101H1 .........T................
099H1 ..........................
109H1 ..........................
103H1 ..........................
112H1 ..........................
113H1 ..........................
133H1 ..........................126H1 ..........................
114H1 ..........................
104H1 ..........................
140H1 ..........................
015H1..........................
006H1.........T----------------
Figura 06 - Comparao entre as seqncias peptdicas de HA1 obtidas de amostras do tipo A
subtipos H1N1 coletadas nos anos de 2000 e 2001 e a cepa vacinal A/New Caledonia/20/99.
Pontos (.) indicam similaridade entre as seqncias obtidas, somente os aminocidos diferentes
da seqncia da cepa vacinal esto representados. Traos (-) representam lacunas geradas por
ausncia de seqncia peptdica. A disposio grfica da figura foi obtida com o auxlio do
programa de computador "GeneDoc Multiple Sequence Alignment Editor & Shading Utility"
(verso 2.4.002) (Karl Nicholas, copyrigth). A ordem das seqncias foi determinada pela
similaridade entre as seqncias e arranjadas pelo programa de computador "ClustalX" (verso
1.83) (Thompson e col., 1997). Amostras coletadas no ano de 2000 esto em itlico e negrito, as
demais foram coletadas no ano de 2001. A seqncia peptdica da cepa vacinal A/New
Caledonia/20/99 (Cepa) foi obtida do "Genbank" sob nmero de acesso AJ344014.
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Tabela 10. Sumrio das alteraes nas seqncias de aminocidos das
amostras coletadas nos anos de 2000 e 2001 em relao cepa vacinal A/New
Caledonia/20/99.
Nmero da
Amostra
Posio dos
ResduosCepa Vacinal Alterao
Stio
Antignico
006 43 leucina arginina ---
103 44 leucina isoleucina ---
006 57 valina isoleucina Cb
006 69 leucina serina Cb
006 71 isoleucina fenilalanina Cb
006 80 valina alanina Cb
006 85 prolina serina ---
121 e 122 121 serina asparagina Ca1
006 130* Lacuna lisina Ca2
006 133 serina treonina Ca2
015 162 lisina metionina Sa
121, 122, 101,
099, 109, 103,
112, 113, 133,
126, 114 e
104 .
165 valina alanina Ca1
006 183 prolina serina ---
006 191 leucina isoleucina Sb
006 222 cido asprtico glicina---
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Nmero da
Amostra
Posio dos
ResduosCepa Vacinal Alterao
Stio
Antignico
121, 122, 101,
099, 109, 103,
112, 113, 133,
126, 114 e
104 .
251 triptofano arginina ---
006 271 prolina serina ---
015 282 glutamina lisina ---
99 297 valina isoleucina ---
006, 101, 121
e 122.309** alanina treonina ---
(---)Resduos de aminocidos que no se enquadram em nenhum stio antignico.
*A amostra 006 apresentou a insero de um aminocido na posio 130 da cadeiapeptdica.
** Para a amostra 006 esta alterao ocorreu no resduo 310 devido insero de um
aminocido na posio 130. Para as outras amostras esta diferena ocorreu no resduo 309.
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A B Legenda
A) Mutaes ocorridas nos stiosantignicos Ca2, Sa, Sb, Ca1 e Cb.
i) Ca2
ii) Sa
iii) Sb
iv) Ca1
iv) Cb
B) Mutaes ocorridas fora dos stiosantignicos descritos.
Resduo 130 Resduo 133
Resduo 162
Resduo 191
Resduo 121 Resduo 165
Resduo 57 Resduo 80
Resduo 69 Resduo 57
Resduo 43 Resduo 44Resduo 85 Resduo 183
Resduo 222 Resduo 251Resduo 271 Resduo 282
Resduo 297 Resduo 309
Figura 07. Estrutura do monmero de HA obtida por difrao de raios X (Influenza Sequence Data Base,
www.flu.lanl.gov). Modelo baseado na estrutura obtida por Sauter e cols., 1992 e depositada no Protein DataBank sob o nmero de acesso 1HGI. "Rasmol" (2.7.2.1.1), foi o programa utilizado na edio da figura (Sayle
e Milner-White 1995).
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4.2. Tipo A Subtipo H3N2
Foram obtidos 13 produtos de "Nested Multiplex PCR" para as
amostras do tipo A subtipo H3N2. Dessas, 9 tiveram as seqncias de
nucleotdeos, da regio codificadora de HA1 completa, determinadas. Devido
no ter sido possvel a obteno de produto de "Nested PCR" para as amostras
006, 011 e 013, foram obtidas seqncias dos produtos de "Nested Multiplex
PCR" com tamanho de 555 pares de bases ou, quando traduzidas para
aminocidos um tamanho de 185 resduos, cerca de 56% da regio HA1 da
hemaglutinina. Para a amostra 018 no foi possvel obter seqncias
caractersticas de influenza A H3N2. Todas as seqncias obtidas foram
traduzidas para sua forma peptdica e comparadas com a seqncia de
aminocidos da cepa vacinal.
A comparao entre as seqncias peptdicas de HA1 dasamostras coletadas do subtipo H3N2 com a seqncia de aminocidos das
cepas vacinais mostrou a existncia de 52 alteraes (Figura 08). Entre as
amostras coletadas no ano de 2000 a diferena entre a cadeia peptdica das
amostras e a seqncia da cepa vacinal de 2000 (A/Sydney/5/97) foi de 42
resduos de aminocidos (tabela 11). A seqncia peptdica da cepa vacinal de
2000 foi obtida no Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov) sob nmero de acesso
AJ311466. Para o ano de 2001 foi recomendada pela OMS a cepa vacinal
A/Panam/2007/99, sua seqncia peptdica foi obtida no banco de dados
Influenza Sequence Database (www.flu.lanl.gov) sob nmero de acessoISDNCDA001. Quando comparamos a seqncia peptdica da cepa vacinal de
2001 com a seqncia da amostra 125, coletada no ano de 2001, encontrou-se
o total de 10 diferenas de aminocidos (tabela 12).
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Todas as alteraes de aminocidos ocorridas entre as seqncias
peptdicas das amostras dos subtipo H3N2 foram relacionadas com os cinco
stios de maior variabilidade na regio de HA1 da molcula de hemaglutinina
(Wiley e col., 1981, Underwood, 1982, Underwood 1984, Wiley e Skehel,
1987) (tabelas 11 e 12 e figura 09).
10 20 30 40 50 60
Cepa1 QKIPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGRICDSPHRILD
Cepa2 ..L.................S...................................Q...
003H3 ..L.V...............P...........H.......................Q...
049H3 ..L.V...............P...........H.......................Q...
125H3 ..L.V...............P...........H.......................Q...
012H3 ..L.V...............P...........H.......................Q...
024H3 ..L.V...............P........M..H.......................Q...
008H3 ..L.................P.......................................
015H3 ..L.................P.......................................
010H3 ..L.................P.......................................
009H3 ..L.................P.......................................
006H3 ------------------------------------------------------------
011H3 ------------------------------------------------------------
013H3 ------------------------------------------------------------
70 80 90 100 110 120Cepa1 GENCTLIDALLGDPHCDGFQNKEWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEF
Cepa2 ............................................................
003H3 ...............................T............................
049H3 ...............................T............................
125H3 ...............................T...................I........
012H3 ...............................T............................
024H3 ...............................T............................
008H3 .K..........................................................
015H3 .K..........................................................
010H3 .K..........................................................
009H3 .K..........................................................
006H3 ------------------------------------........................
011H3 ------------------------------------........................
013H3 ------------------------------------........................
130 140 150 160 170 180
Cepa1 NNESFNWTGVAQNGTSYACKRSSIKSFFSRLNWLHQLKYKYPALNVTMPNNDKFDKLYIW
Cepa2 ................S....R.N...........................E........
003H3 ................S....R.I...........................E........
049H3 ................S....R.I...........................E........
125H3 ................S....R.I...........................E........
012H3 ................S....R.I...........................E........
024H3 ................S....R.I...........................E........
008H3 I..D........S.E......G.V...........KSD.............G........
015H3 I..D........S.E......G.V...........KSD.............G........
010H3 I..D........S.E......G.V...........KSD.............G........
009H3 I..D........S.E......G.V...........KSD.............G........
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