Antocianinas como Corantes Naturais

Escola Superior Agrária de Coimbra

Projecto I

Antocianinas como corantes

naturais_______________________________

Daniela Pereira 20603011

Patrícia Sousa 20603012

Pedro Sá 20603025

Vânia Gonçalves 20503024

Escola Superior Agrária de Coimbra Projecto І 2007/2008

Estabilidade da cor de antocianinas extraídas em relação à composição fenólica

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Índice

Índice ................................................................................................................. 1

Introdução ......................................................................................................... 3

Cor ........................................................................................................ 4

Corantes ............................................................................................... 5

Proveniência dos corantes naturais ...................................................... 6

Antocianinas ......................................................................................... 9

Co-pigmentação intra e intermolecular ................................................ 12

Compostos fenólicos ........................................................................... 13

Estabilidade da cor de extractos comerciais ricos em antocianinas e a sua relação com a composição fenólica&&&&&&&&&&&&&&&&..14

Materiais e métodos ....................................................................................... 15

Composição Fenólica ......................................................................... 15

Medições colorimétricas e de espectro&&&&&&&&&&.............16

Estabilidade térmica e fotoquímica ..................................................... 16

Resultados ...................................................................................................... 18

Composição fenólica e propriedades das cores dos extractos ........... 18

Estabilidade da cor ............................................................................. 19

Discussão........................................................................................................ 25

Copigmentação intermolecular ........................................................... 27

Copigmentação intramolecular ............................................................ 28

Conclusão ....................................................................................................... 29

Bibliografia ...................................................................................................... 30



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Introdução A cor é um parâmetro muito importante para a aceitação dos produtos

alimentares por parte dos consumidores. Por conseguinte devem ser fornecidas condições para que a cor natural dos alimentos seja preservada. No entanto por vezes esta cor natural pode não ser a melhor ou ter sido degradada por diferentes factores. Nestas situações recorre-se à utilização de corantes.

Existem corantes de origem natural e corantes de origem sintética, sendo os de origem natural os que vão ser abordados neste trabalho. Os corantes naturais são de duas classes principais: carotenoides e flavonoides. Dentro dos flavonoides as antocianinas são as de maior interesse, sendo responsáveis por uma gama de cores atractivas em frutos, flores e folhas, e que podem ser adicionadas a alimentos para restituição da sua cor natural, cuja cor varia do vermelho vivo ao violeta e azul. Os corantes naturais são obtidos através de pigmentos extraídos de frutos, vegetais, raízes ou sementes. Neste trabalho vamos ter em conta um artigo científico que trata da análise de diferentes corantes naturais extraídos de diferentes produtos, sendo esses produtos o rabanete, o bagaço de uva, a couve roxa, a baga de sabugueiro, black currant e chokoberry. Estes corantes naturais são de grande importância a nível agro-alimentar, entre outras indústrias, tendo um papel importante na estabilidade da cor em determinados alimentos que por condições adversas têm a sua cor degradada. Neste trabalho vai-se estudar o comportamento e estabilidade destes corantes, mais especificamente a nível da estrutura das antocianinas a diferentes pHs, temperaturas, e na presença de agentes complexos, fenóis e agentes metálicos, entre outros factores como a luz. Para além de conferirem cor, as antocianinas têm propriedades vantajosas para a saúde humana como propriedades antioxidantes e preservação de vitaminas.



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Cor

Segundo Delgado Vargas, et al 2003, a cor é produzida pela combinação do efeito de características físicas e aspectos químicos. A percepção da cor é um processo complexo que implica fenómenos físicos como transmissão, refracção, absorção, dispersão, entre outros. Os humanos são fascinados, ou melhor, deixam-se fascinar pela cor, sendo a cor uma característica fundamental como elemento atractivo para o consumidor, qualquer que seja produto. Assim, a cor é uma das características sensoriais mais importantes para a aceitabilidade do consumidor, segundo Maria João, 2008. A cor é uma percepção visual, resultante da detecção de luz após interacção com um objecto. Sem luz a cor não é possível, a luz é uma combinação de energia magnética e eléctrica, que viaja em velocidades extremamente elevadas. A luz é constituída por fotões, que progridem em pequenas ondas segundo uma linha recta com velocidades variáveis, diferentes amplitudes e frequências de onda. Cada comprimento de onda é caracterizado pela sua velocidade, amplitude e frequência. Os diferentes comprimentos de onda constituem o espectro electromagnético. A cada cor corresponde um determinado comprimento de onda e de luz visível, segundo Maria João, 2008. Portanto a cor de uma substância deve-se, em geral, à absorção selectiva das radiações visíveis que sobre ela incidem, e a cor que o olho humano observa é que aquela que não é absorvida mas sim reflectida, e por impulsos nervosos e descodificação da informação captada pela nossa visão e levada ao cérebro, somos capazes de diferenciar as diferentes cores existentes.

Figura 1. Diferentes comprimentos de onda do espectro visível.



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Corantes

Segundo Delgado Vargas, et al 2003, existem corantes naturais que

têm como função preservar a cor de alimentos, de forma a mantê-los atractivos para o consumidor. O efeito atractivo é muito importante do ponto de vista em que o consumidor compra o que na verdade lhe agrada e para isso a aparência do produto é muito importante para a sua escolha. A qualidade também é um factor importante e determinante, mas o primeiro impacto visual sobre o produto ajuda na decisão da preferência e a partir de uma boa aparência conclui-se que será de qualidade.

Segundo Maria João, 2008, os corantes são substâncias utilizadas para conferir cor ou restituir cor a um género alimentício e que são extraídos de diversos frutos, vegetais, sementes e raízes, sendo que os corantes em si não são consumidos como alimentos. Em diversos processos alimentares são usados corantes sintéticos para substituir corantes naturais. O efeito que os corantes têm nos alimentos vai desde simular uma cor no alimento de forma a parecer natural aos olhos do consumidor, promover um efeito diferente no alimento ou compensar a perda de cor devido a diversos factores como a luz, ar, excesso de temperatura, humidade, condições de armazenagem. Corantes naturais são compostos que se encontram em produtos naturais ou pigmentos inorgânicos existentes na natureza. Muitos dos pigmentos naturais utilizados inicialmente com o objectivo de corar os alimentos são fotoquímicos e com um elevado poder antioxidante. Estão, envolvidos em fotossínteses e foto protecção de plantas verdes e em muitas bactérias, por isso houve desenvolvimento de métodos de extracção de corantes naturais e investimento na sua aplicação industrial. O processo de produção de pigmentos inorgânicos e sintéticos pode ser, e é, estritamente controlado para assegurar a categoria de qualidade dos corantes dos alimentos, já que com o passar dos anos o número de pigmentos sintéticos alimentares foram reduzidos a quatro e que são aceites pela legislação, utilizados em áreas restritas, segundo Delgado Vargas, et al 2003.



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Proveniência dos corantes naturais

Rabanete

O rabanete pertence á família das crucíferas originária da região do Mediterrâneo, sendo parente próximo do repolho, da couve, do nabo e da couve-flor. Não é um alimento rico em nutrientes essenciais, mas é pouco calórico. É uma boa fonte de vitamina C contendo pequenas quantidades de ferro e potássio. Possui ainda compostos sulfurosos que podem prevenir diversos tipos de cancro. Os melhores rabanetes são os vermelhos e redondos, a sua cor viva indica que estão frescos.

Cenoura Roxa

Os cientistas holandeses afirmam que as cenouras roxas oferecem uma protecção contra o cancro e que contêm pigmentos que agem como antioxidantes. As cenouras contêm fotoquímicos como carotenoides, compostos fenólicos e antocianinas.

Bagaço de uva O bagaço de uva desperta um grande interesse na industria alimentar e farmacêutica devido às suas propriedades funcionais. O bagaço de uva constitui um resíduo da indústria que pode ser aproveitado pois possui dois grupos importantes de substâncias: os polifenois e fibras alimentares, que são altamente benéficas para a saúde humana. O bagaço de uva é obtido através do mosto de uva, ou seja dos resíduos da produção de vinho.

Figura 2. Rabanete

Figura 3. Cenoura Roxa

Figura 4. Bagaço de uva



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Couve Roxa

A couve roxa possui propriedades anti-anémicas, descongestionante, cicatrizante, depurativa. A couve roxa tem benefícios na saúde humana.

Black currant

São nativos do centro e norte da Europa e do norte da Ásia. Umas das espécies existentes de black currant são as groselhas que são produzidas em Portugal e outros países. São ricos em vitamina C e possuem nutrientes essenciais e sementes oleaginosas.

Chokeberry

Os chokeberry são atraentes pela sua cor forte que vai do vermelho até ao roxo. Têm um elevado teor em vitamina C e antioxidantes. As bagas podem ser usadas para fazer vinho e são também utilizados como flavor ou corante para bebidas e produtos alimentares. Devido à sua cor tem grande interesse a nível científico porque contém um corante natural muito usado na indústria alimentar que é a antocianina. O consumo destes mostrou benefícios no cancro do cólon, doenças cardiovasculares, inflamações crónicas, inflamações oculares e insuficiência hepática, segundo estudos preliminares.

Figura 5. Couve Roxa

Figura 6. Black Currant

Figura 7. Chokeberry



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Figura 8. Baga de Sabugueiro

Baga de Sabugueiro

Pertence à família das Caprifoliáceas. O sabugueiro é uma árvore de folha caduca, gosta de solos húmidos e de locais com uma boa exposição solar ou com pouca sombra. O sabugueiro é hoje em dia uma espécie de grande importância para a indústria, nomeadamente para a indústria farmacêutica, agro-alimentar, têxtil e cosmética.

As bagas de sabugueiro são utilizadas para a coloração de alguns vinhos. Segundo algumas opiniões esta adição não altera as características do vinho e dá-lhe uma cor e consistência aveludada e até aumenta a sua qualidade.

Os frutos de sabugueiro são uma matéria-prima para a produção de corantes alimentares naturais.

O mercado de substâncias aditivas naturais está em pleno crescimento, são cada vez mais os produtos agro-industriais que contem na sua composição aditivos extraídos do sabugueiro.

As bagas são ricas em antocianinas, pigmentos antociánicos, açucares redutores, pectinas, taninos, polifenois e contém flavonóides.

As antocianinas presentes nas bagas de sabugueiro têm excelentes e particulares propriedades terapêuticas.



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Antocianinas

Segundo Delgado Vargas et al. 2003, as antocianinas constituem uma

das classes dos flavonóides (compostos fenólicos constituídos por dois anéis de benzeno e um anel central heterocíclico contendo oxigénio), como ilustra a figura 2, frequentemente encontradas na natureza. A sua estrutura é baseada em quinze carbonos, e é complementada por uma ou mais moléculas de açúcar ligadas a diferentes posições de hidroxilatos na estrutura básica. Ou seja, segundo Delgado Vargas et al 2003, as antocianinas são estruturalmente diversas, mas todas são baseadas em dezassete estruturas básicas de antocianidinas, que são modificadas por combinações de hidróxidos, ácidos orgânicos e grupos de açúcares, sendo os mais frequentes a glicose, galactose, ramnose.

Figura 9. Estrutura molecular da antocianina e possíveis radicais para a formação de diferentes antocianinas.

Tabela 1. Tipos de antocianinas nas diferentes frutas.

Fruta Antocianidina Ruibardo (Rheum sp.) Cianidina Uva (Vitis vinifera) Cianidina, peonidina, petunidina, delfinidina,

malvidina Morango (Fragaria spp.) Cianidina, pelargonina Cereja (Prunus spp.) Cianidina, peonidina Framboesa (Rubus ideaus) Cianidina, pelargonina Groselha negra (Ribes nigrum) Cianidina, delfinina Amoras silvestres (Rubus fructicosus) Cianidina



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Portanto, as antocianinas são pigmentos roxo-azul (variando com o pH) que protegem as plantas, flores e frutos contra a luz ultravioleta e evitam a produção de radicais livres. São encontradas em muitas frutas escuras como as framboesas, amoras, cerejas, uvas, morangos, ou seja são responsáveis pela coloração destes mesmos frutos. São dos maiores grupos solúveis em água e têm uma forte actividade bioquímica e farmacológica. São utilizadas como corantes alimentares, por exemplo em gelatinas, em doces, em refrigerantes e em géneros alimentícios contendo cerais segundo Maria João, 2008. Segundo Delgado Vargas, et al 2003, estas são classificadas pelo número de moléculas de açúcar que estão ligadas á sua estrutura. Segundo Freitas, 2005, a absorção de luz pelas antocianinas é produto de combinações de vários factores, como o número de substituintes (açucares), a presença ou não de outras moléculas capazes de estabilizar a cor (co-pigmentos) e o pH do meio, e segundo Maria João, 2008, cor vai depender do número de grupos hidroxilo ou metoxilo do anel B (aglicona), e da ligação ao derivado de açúcar (glicósido) (ver figura2). A sua cor depende das reacções de co-pigmentação (formação de complexos entre as antocianinas e outros flavonoides, ácidos fenólicos, proteínas, aminoácidos ou polissacarídeos), podendo afectar as propriedades antioxidantes destes corantes naturais. Em termo de estrutura básica as antocianinas podem assumir maior complexidade pela ligação de outros compostos nativos (também antioxidantes) como os ácidos fenol-carboxílicos. Estes corantes como fenóis naturais são potentes antioxidantes. Em relação à saúde humana, um tipo de antocianina, a miricetina, que é encontrada em cerejas e ameixas, contribui para a redução do aparecimento de cancro da próstata. Em relação á extracção da antocianina, segundo Delgado Vargas, et al 2003, estas são moléculas polares e consequentemente são mais solúveis em solventes polares do que em solventes não polares. Contudo, é nítido que a solubilidade depende de vários factores como as propriedades químicas dos solutos e dos solventes. As antocianinas podem ser solúveis em éter e não são estáveis em soluções alcalinas ou neutras, no entanto o melhor para a sua extracção é o método que envolve o uso de solventes ácidos. O sistema de extracção pode ser modificado para produzir melhores rendimentos, mas tem sido comprometido por uma preocupação a nível da segurança. O ácido clorídrico tem e mantêm um pH baixo, e simultaneamente favorece a obtenção de formas antocianina-colorida, contudo sendo este um ácido forte, pode alterar a sua forma nativa pelo enfraquecimento de algumas ligações associadas com metais e copigmentos, por exemplo. Deste modo, ácidos fracos como o ácido cítrico ou ácido acético, são usados no processo de extracção de antocianinas complexas. Além disso, o uso de etanol ou SO2 aquoso têm sido introduzidos para obter concentrações com características de boa qualidade. Também se pode considerar que as antocianinas são obtidas facilmente a frio com metanol ou etanol (como já foi referido) fracamente acidificado. Em relação á separação de antocianinas a metodologia utilizada é a que envolve a adsorção no papel em cromatografia.



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Nas plantas, as antocianinas podem existir como glicósidos: • Cianidina: maior parte das fontes comestíveis de antocianinas; • Delfinidina: responsável pela cor vermelho-escuro da groselha preta; • Malvidina: cor do vinho tinto; • Peodina; • Petrinidina; • Pelargonidina: cor rosa-avermelhado dos morangos.

Segundo Maria João, 2008,a cor das antocianinas é instável e susceptível de alterações devido a mudanças de pH, temperatura e de luz. Estes corantes naturais existem em solução como um equilíbrio de várias estruturas que apresentam cores diferentes e dependem do pH do meio. Em meio aquoso ácido (até pH=4) a estrutura predominante é o catião flavílio (cor vermelha), e a valores de pH superiores a 4 uma das estruturas possíveis é a base quinonoidal (cor azul).

Tabela 2. Mudança de cor das antocianinas em diferentes pH.

Segundo Delgado Vargas, durante o processamento de alimentos, os compostos podem ser expostos a condições adversas (pH, temperaturas altas, luz), e os pigmentos de antocianinas são facilmente destruídos. Por isso aquando do processamento, embalamento e armazenamento, deve-se ter em conta certos cuidados para que o alimento permaneça com boa aparência para agrado do consumidor.

Faixa de pH Cor das antocianinas λλλλmáx (nm)

1 – 5 Vermelho 522 - 531

6 – 7 Violeta 550 - 567

8 - 10 Azul 570 - 576

11 - 12 Verde > 580

> 13 Amarelo -



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Co-pigmentação intra e intermolecular

Na natureza, as moléculas de antocianinas estão frequentemente

associadas a moléculas incolores (copigmentos) que exercem efeitos determinantes sobre a cor de diversos vegetais e frutas que contenham este tipo de corante natural. Em pH ligeiramente ácido, as antocianinas apresentam-se incolores. O facto é que as antocianinas se encontram associadas a moléculas de açúcar, e outros tipos de moléculas das plantas, frutos, indicando que estas devem estar estabilizadas por factores físico – químicos. A presença de compostos chamados copigmentos pode ser um desses factores. Os flavonóides não antociânicos, alcalóides, aminoácidos, entre outros, podem actuar como copigmentos e a própria antocianina pode agir como copigmento sobre outra antocianina.

Existem três mecanismos básicos de estabilização de antocianinas, a copigmentação intramolecular e copigmentação intermolecular e auto-associação, com o envolvimento de moléculas de antocianinas, de flavonóides ou ácidos aromáticos e de açúcares.

Quando a concentração de antocianinas é relativamente elevada, estas podem actuar como copigmentos sobre si mesmos.

A copigmentação intramolecular ocorre somente quando o pigmento e o copigmento são partes de uma única molécula, ou seja, quando uma parte da molécula da antocianina responsável pela cor e o copigmento estão covalentemente ligados ao mesmo resíduo de açúcar.

Na complexação intermolecular, predominam forças de Van Der Waals e efeitos hidrofóbicos em meio aquoso como resultado do “empilhamento” entre a molécula de antocianina e o copigmento, segundo Dangles, Wigand, 1992. A reacção de copigmentação estabiliza as antocianinas na sua forma colorida e retarda a reacção normal de hidratação. O aumento da estabilidade ocorre porque o copigmento compete com a água e interage com as antocianinas, complexando as formas coloridas e modificando a natureza do copigmento segundo Mazza e Miniati, 1993.

Com isto pode-se concluir que a reacção de copigmentação, inter e intra molecular aumenta a estabilidade das antocianinas e com isso, o seu potencial de aplicação a nível industrial, como corantes naturais.



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Compostos fenólicos

Aos compostos que têm na sua constituição um ou mais grupos

hidróxilos ligados directamente a um anel aromático dá-se o nome de compostos fenólicos, que são característicos das plantas e encontram-se mais normalmente como ésteres ou glicósidos do que como compostos livres. Quanto à classificação podem ser classificados pelo número de carbonos. Dentro dos compostos fenólicos temos os flavonóides, compostos com 15 Carbonos (C6 - C3 – C6), onde os dois anéis benzénicos estão ligados por um grupo de três carbonos. Quanto às propriedades químicas dos compostos fenólicos, tem que se salientar o anel benzénico que confere a classificação de aromático ao composto, tornando-o facilmente auto-oxidável. Para ser considerado aromático tem que conter um sistema cíclico, onde as ligações podem ser simples e/ou dupla, estes compostos têm uma preferência por reacções de substituição. Quanto ao isolamento dos compostos fenólicos, estes podem ser facilmente separados através de metanol ou do metanol acidificado com HCl.

Existem vários métodos para a determinação da quantidade de compostos fenólicos nos tecidos das plantas como o método colorimétrico com e Reagente de Folin-Ciocalteau e o método de cromatografia HPLC.



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Estabilidade da cor de extractos comerciais ricos em antocianinas e

a sua relação com a composição

fenólica.

(Malien-Aubert, C.; Dangles, O.; Amiot, M. J. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 170-176)

As antocianinas são pigmentos naturais que são extraídas de diversas plantas e frutos. Estes pigmentos são utilizados de forma a melhorar a cor de determinados alimentos, para que estes tenham uma boa apresentação e um bom impacto visual para o consumidor. De facto a estabilidade da cor das antocianinas depende da combinação de vários factores: ● Estrutura e concentração das antocianinas presentes nos frutos; ● Do pH; ● Temperatura; ● Presença de agentes complexos, fenóis, e agentes metálicos; Como a estabilidade da antocianina requer o controlo adequado dos factores já referidos, um dos inconvenientes do uso de antocianinas como corantes alimentares é a sua baixa estabilidade. Recentes investigações (Daves et al, 1993; e outros) sugerem que o complexo molecular das antocianinas com outros fenóis - também designados copigmentos - é o principal mecanismo estabilizante da cor em plantas. O objectivo deste trabalho é descrever a composição de extractos ricos em antocianinas e estudar a sua influência na estabilidade da sua cor. Os efeitos de diferentes valores de pH (3-5), aquecimento e exposição à luz, serão investigados em modelos de bebidas açucaradas e não açucaradas.



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Materiais e métodos

● Composição Fenólica

A partir de diferentes extractos obtidos comercialmente e provenientes de várias

fontes, foi feita uma extracção, como representa o diagrama, de forma a permitir

conhecer a composição fenólica de cada extracto assim como a quantidade de

antocianinas. Outro método utilizado foi o HPLC (high performance liquid chromatography).

Diagrama 1. Extracção dos compostos fenólicos e antocianinas.

Fase Aquosa

H2O/HCl

Acetato/Etilo

Fase Orgânica

Acetato Etilo

Fase Orgânica

Acetato Etilo

Filtração

Fase Orgânica



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Estabilidade térmica e fotoquímica

A estabilidade da cor foi estudada em modelos de bebidas açucaradas (100g/L sacarose, 500g/L ácido cítrico) e bebidas não açucaradas a três valores de pH (3,4e,5) usando soluções padrão. A concentração de corantes foi ajustada de modo a que as bebidas apresentassem uma absorvância de 1+/- 0,1 a um comprimento de onda de 520nm. Para o estudo da estabilidade térmica as soluções coradas (10mL) foram colocadas em tubos de ensaio tapados numa estufa a 50ºC. Cada tubo foi usado apenas para uma medição de espectro para minimizar o contacto com o oxigénio. Para o estudo da estabilidade fotoquímica, as soluções coradas (10mL) nos tubos, cheios até cima foram expostos a uma luz visível num compartimento a 32ºC, especialmente concebido para o estudo da estabilidade de alimentos.

Medições colorimétricas e de espectro

Absorvância a 520nm e BI ( Brown Index)foram analisados. Os

resultados foram a média de três medições da absorvância. A variabilidade foi menor que 2% para todos os corantes estudados. Neste trabalho usou-se o modelo CIELab. Este modelo permite representar numericamente as cores que as pessoas com visão normal podem perceber, e correlaciona os valores em RGB com os valores em L*, a*, e b*. L- luminosidade (value)- define a cor relativamente a ser mais clara ou mais escura. Limites: preto e o branco; a- Tom (hue)- define a tonalidade da cor. Limite: verde e o vermelho. b- Saturação (chroma) - define a intensidade ou pureza da cor. Limites: azul e

o amarelo. As coordenadas das soluções coradas foram calculadas na escala CIE Lab. Este modelo de CIE Lab gera um plano tridimensional policromático como representa a figura 3.



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As coordenadas são cilíndricas definidas por: L*=L L*- luminosidade; C*= C*- croma (pureza ou intensidade da cor); H˚= H˚- ângulo de tom (tonalidade);

Interpretação de dados:

Limites Luminosidade (L*) Máximo 100 Branco Mínimo 0 Preto

Limites Saturação (chroma-b) Tom (a)

Positivo (+) Amarelo Vermelho

Negativo (-) Azul Verde

Figura 10. Plano tridimensional policromático: Espaço de cor Hunter.



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Resultados

Composição fenólica e propriedades das cores

dos extractos

Uma boa diferença em relação à composição fenólica foi encontrada em sete corantes (tabela 3). A couve roxa e o rabanete são ambos ricos em compostos fenólicos totais (435 e 233 mg/g, respectivamente), 50% correspondendo a antocianinas (aciladas e não aciladas). No rabanete as antocianinas são aciladas e foram encontrados porções de ácidos fenólicos e ésteres. Estes dois grupos fenólicos também estão presentes na cenoura roxa. A principal diferença entre a cenoura roxa e o rabanete foi a estrutura das suas antocianinas, embora a cenoura roxa também mostre concentrações inferiores de antocianinas. Para a cenoura roxa, muitos dos seus pigmentos derivam da cianidina e no rabanete derivam da pelargonina, segundo Harbone e Grayer (1988) e Fuleki (1969). As cianidinas também são encontradas no rabanete segundo outros autores. Além disso, ácidos fenólicos ou os seus ésteres, estão presentes no rabanete como monómeros (69mg/g de corante) e como oligómeros ( 54mg/g de corante), representando 28% de composição fenólica total. No rabanete, foram encontrados vestígios de flavonóides, assim como na couve roxa e na cenoura roxa. De entre os corantes estudados, quatro fontes (baga de sabugueiro, black currant, chokeberry e uva) foram desprovidos de antocianinas aciladas. A baga de sabugueiro foi a mais rica fonte de antocianinas (37,5mg/g) e fenóis incolores (50,1 mg/g). Em contraste, o bagaço de uva foi caracterizado como o que continha menor teor de fenólicos (compostos fenólicos) e verificou-se a presença de malvidina na(forma de diferentes glicósidos). No bagaço de uva foram detectadas antocianinas aciladas, pelo facto da uva ser um sub produto do vinho (mosto). A cianidina (conjugada com diferentes açúcares) foi a maior aglicona na baga de sabugueiro, chokeberry e black currant. Finalmente foram identificadas delfinidinas glicosídicas no black currant. Considerando os dados de cor (tabela 3), os corantes ricos em antocianinas aciladas foram caracterizadas por um grande valor de C* e um baixo valor de H˚. O rabanete tem um valor negativo de H˚ que corresponde a um tom azulado. Para todos os corantes ricos em antocianinas aciladas (cenoura, rabanete e baga de sabugueiro), o ângulo de tom decresceu quando o pH aumentou; em contraste H˚ foi estável ou até mesmo ligeiramente mais alto o valor (tonalidade amarelo) quando o pH foi aumentado nos corantes contendo unicamente antocianinas não aciladas.



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Tabela 3.Composição Fenólica de corantes naturais expressa em mg/g de corante e Cor : saturação C* e

ângulo de tom H°) a pH=4 em bebida não açucarada.

Fontes de subgrupos fenólicos

Antocianinas aciladas

Ácidos fenólicos e ésteres

Catequinas monoméricas

Catequinas oligoméricas

Flavonóis C*

H°

Couve roxa 141,9 61,5 105,4 69,4 2,8 20,4 -17,0

Rabanete 116,1 0,0 116,5 0,0 0,0 25,7 0,3

Cenoura Roxa

6,4 2,4 17,4 0,0 0,0 25,6 2,3

Baga de sabugueiro

0,0 37,5 19,6 5,5 14,6 16,2 23,3

Black Currant

0,0 21,8 13,2 3,5 7,3 18,1 18,2

Chokeberry 0,0 6,3 19,9 0,0 3,6 20,1 19,8

Bagaço de uva

0,0 0,3 3,7 0,7 7,5 16,3 8,5

Estabilidade da cor

As tabelas 4 e 5 mostram os resultados obtidos por análise espectrofométrica em bebidas açucaradas e em bebidas não açucaradas a 3 valores de pH submetidas ao “armazenamento” a 50˚C. Os resultados foram expressos nos termos de comprimento de onda máximo e BI no tempo zero (t0) e depois de 72 horas. Os modelos de bebidas açucaradas e não açucaradas foram muito similares. No tempo zero, o comprimento de onda da máxima absorvância no espaço do visível (Máx.) foi desde 515nm (chokeberry a pH=3) até 549nm (rabanete a pH=5), que correspondem á escala de tom do laranja ao roxo. O BI inicial estava abaixo de 0,81 (baga de sabugueiro a pH=4 e pH=5) para todos os corantes estudados.

Depois de 72 horas armazenados a 50˚C, os corantes desprovidos de antocinaninas aciladas (tipicamente o bagaço de uva) mostra Max. com valores menores que 500nm e valores de BI maiores que 1 dando um tom amarelado. (Tabela 4) Em contraste, os corantes contendo antocianinas aciladas (tipicamente o rabanete) são relativamente estáveis em todos os valores de pH e uma disposição constante de valores de comprimento de onda máximo e valores de BI menores que 1 (Tabela 5). A Figura 4 mostra que a cor do extracto de rabanete é muito mais resistente ao calor que a dos extractos do bagaço de uva. Além disso os extractos de bagaço de uva rapidamente se tornam amarelos, durante o primeiro dia de armazenamento a 50ºC e pH=5, considerando que o ângulo de tom do extracto de rabanete aumenta lentamente, ficando na área do vermelho com o valor de 15º depois de 96 horas de armazenamento (Figura 5).



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Tabela 4.Características do espectro de corantes não acilados colocados numa estufa a 50ºC em duas bebidas

com três valores de pH diferentes.

Corante pH Tempo (h) Solução açucarada Solução não açucarada

λMáx. BI λMáx. BI

Bagaço de uva

3 0 526 0.57 528 0.61

72 514 0.90 456 1.07

4 0 531 0.67 527 0.65

72 442 1.09 438 1.15

5 0 530 0.66 529 0.64

72 445 1.19 445 1.29

Baga de Sabugueiro

3 0 518 0.65 517 0.65

72 505 0.94 509 0.88

4 0 523 0.81 522 0.81

72 444 1.18 437 1.20

5 0 528 0.76 529 0.78

72 454 1.30 451 1.32

Black Currant

3 0 521 0.57 521 0.58

72 450 1.06 438 1.07

4 0 527 0.71 524 0.69

72 449 1.29 436 1.41

5 0 527 0.72 528 0.64

72 452 1.34 451 1.56

Chokeberry

3 0 515 0.47 514 0.47

72 491 1.04 496 0.95

4 0 516 0.56 516 0.56

72 446 1.29 446 1.25

5 0 519 0.61 518 0.59

72 455 1.33 445 1.42

Figura 4. Evolução do ângulo de tom

(H°) durante o armazenamento a 50°C

com pH=5 em bebidas não açucaradas

durante 96horas.

Figura 5.Alterações no espectro visível do

rabanete e da uva em soluções açucaradas de

pH=3 durante o armazenamento (0,24,48,72 ou

96 horas) a 50°C (para o rabanete o espectro

registado ás 0 e 48 horas....



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Tabela 5. Características do espectro de corantes acilados colocados numa estufa a 50ºC em duas bebidas com

três valores de pH diferentes.

Corante pH Tempo (h) Solução açucarada Solução não açucarada

λMáx. BI λMáx. BI

Cenoura Roxa

3 0 526 0.38 523 0.37

72 524 0.41 525 0.41

4 0 530 0.44 527 0.43

72 527 0.54 527 0.55

5 0 534 0.47 533 0.48

72 531 0.67 531 0.70

Rabanete

3 0 517 0.29 516 0.27

72 516 0.29 516 0.29

4 0 522 0.34 523 0.30

72 527 0.40 522 0.37

5 0 529 0.36 530 0.32

72 527 0.51 531 0.50

Couve Roxa

3 0 534 0.34 534 0.32

72 534 0.38 532 0.37

4 0 546 0.48 545 0.48

72 544 0.64 543 0.67

5 0 549 0.47 547 0.44

72 548 0.84 544 0.97

Variação dos compostos fenólicos da mesma fonte: bagaço de uva

O conteúdo fenólico e características como o pH, matéria seca, BI, de quatro tipos de corantes de bagaço de uva (provenientes de diferentes uvas: a, b, c, d) foram analisados durante duas épocas de produção, em 1997 e 1998 (Tabela 6). Para os quatro extractos de bagaço de uva estudados valores de pH, matéria seca e BI foram similares, tanto em 1997 como em 1998; a concentração de dióxido de enxofre (SO2) conclui-se ser dependente do processo de fabrico de vinho usado e da extracção industrial do corante usado. Contudo as concentrações de antocianinas e de outros fenóis foi mais baixo em 1998 do que em 1997 (Tabela 6). Estes resultados estão relacionados com os baixos valores de radiação solar mensal em 1998 (a variação média entre 1998 e 1997 foi de 297dJ/cm2/mês). Assim a composição fenólica varia substancialmente com a mesma fonte. Para todos os extractos de bagaço de uva, a maior diferença para as antocianinas foi a malvidina 3- glucósido, o pigmento da Vitis Vinifera que



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representa entre 25% (1998) e 53% (1997) do total do conteúdo de antocianinas. Para uva b, a concentração de antocianinas foi bastante baixa comparada com outros compostos fenólicos (2-3% de fenóis totais). Em oposição a uva em 1998 é caracterizada por concentrações parecidas de antocianinas e outros fenóis. Consequentemente, diferenças na relação copigmentos/ pigmentos eram esperados. A uva b pode ser distinguida pela elevada relação pigmentos/copigmentos (r=30.9 em 1997 e 50.2 em 1998) e pela maior concentração de flavonóis (≈ 55% do total de concentração de fenóis incolores), que são os copigmentos de antocianinas mais potentes. Flavonóis foram também os copigmentos mais abundantes na uva d, considerando as uvas a e c ricas em flavonóis.

Tabela 6. Características industriais e composição fenólica em mg/g de diferentes bagaço de uva em 1997 e

1998.

Pigmentos antocianinas Copigmentos incolores

Glicósidos de malvidinas

Características Industriais flavanois

Uva pH % Brix BI SO2

(ppm) Oenin Outros Glicósido

s de cianidinas

Total Ácidos e ésteres fenólicos

monómeros

oligomericos

flavonois total Relação copigmento/ pigmento

1997

A 3.31 19 0.42 320 1.9 1.8 0.0 3.7 4.6 6.9 0.0 3.6 15.1 4.0

B 3.25 35 0.56 1574 0.9 0.8 0.0 1.7 8.6 6.4 7.5 31.1 53.6 30.9

C 3.53 24 0.48 979 1.8 3.2 0.0 5.0 9.3 16.1 14.0 14.8 54.2 10.7

D 1.56 31 0.44 3224 6.4 6.0 0.0 12.4 10.2 2.6 0.0 20.9 33.7 2.7

1998

A 3.28 18 0.40 598 1.3 2.1 0.5 3.9 1.0 0.8 2.0 1.3 5.2 1.3

B 3.66 34 0.58 1553 0.1 0.1 0.1 0.3 3.7 0.7 1.6 7.5 13.5 50.2

C 3.71 30 0.45 942 0.8 0.7 0.7 2.2 2.5 0.7 2.7 0.8 6.7 3.1

D 1.95 31 0.51 1792 0.5 1.1 0.4 2.0 10.6 1.7 3.0 5.1 20.5 9.9

Influência do pH e concentração de açúcar na estabilidade da cor de extractos de bagaço de

uva

Para um dado extracto de bagaço de uva, o comprimento de onda de máxima absorvância no espectro visível nas bebidas açucaradas foi semelhante ao comprimento de onda de máxima absorvância em bebidas não açucaradas. O decréscimo da absorvância visível a 520nm durante o



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armazenamento a 50ºC e pH 3 é quase a mesma em ambas as amostras estudadas. O BI parece ser mais sensível à presença de açúcar, este aumenta durante o armazenamento, sendo ≈ 10% mais forte nas bebidas não açucaradas (Tabela 7). O comprimento de onda máximo e o decréscimo no espectro visível durante o armazenamento são ambos fortemente dependentes do pH. Com o tempo as antocianinas das uvas passam a amarelo nos três valores de pH estudados. A perda gradual de cor na região vermelha (520nm) foi acompanhada por um aumento do BI e consequentemente do H° (Figura 6). As grandes diferenças ocorreram a pH = 5. A um pH=3 e passado 21 dias de armazenamento os corantes vindos do bagaço de uva b apresentou a menor diminuição de absorvância a 520nm sob todas as condições testadas. Para os bagaços de uva a, c e d a perda foi de ≈ 60% por calor e passou dos 30 a 50% por irradiação (Figura 7).

Figura 11. Evolução do ângulo de tom dos corantes da uva durante o armazenamento a 50ºC com pH=3 e

pH=5 de bebidas não açucaradas.

Figura 12. Efeitos da luz e da temperatura na absorvância a 520nm dos corantes da uva em bebida não

açucaradas com pH=3.



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Tabela 7. Evolução do comprimento de onda máximo, BI e absorvância a 520nm e pH=3.

Uva

Solução açucarada Solução não açucarada

λMáx. BI %A520nm λMáx. BI %A520nm

A t0 522 0.41 100 520 0.40 100

A t63h 521 0.57 60 518 0.51 65

B t0 529 0.56 100 530 0.57 100

B t63h 518 0.75 80 519 0.70 80

C t0 522 0.49 100 521 0.46 100

C t63h 515 0.75 68 516 0.65 74

D t0 528 0.52 100 528 0.54 100

D t63h 518 0.75 74 519 0.69 75



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Discussão

Dependendo da fonte natural dos corantes vermelhos estudados, estes

apresentaram grandes diferenças na intensidade da cor, tonalidade e estabilidade. A um dado pH, tais diferenças resultam principalmente da alteração da estrutura da antocianina, pois como foi referido na introdução acerca das antocianinas, a estrutura molecular destas também pode afectar a sua estabilidade, (os grupos acilfenólicos, moléculas de açúcar, e a substituição do anel B). a distribuição dos copigmentos (ácidos fenólicos, flavonóides e flavanóides), e a relação molar dos copigmentos e pigmentos.

Estrutura das antocianinas

Quando o número de grupos OH e OMe aumenta dentro do anel B, a cor

normalmente vai do laranja ao roxo, pois como já foi referido a cor das antocianinas depende do número de grupos hidroxilo ou metoxilo do anel B(aglicona). Dos corantes estudados, quatro tipos antocianinas foram identificadas: pelargonina (rabanete), cianidina (chokoberry, couve-roxa, cenoura, e baga de sabugueiro, e blackcurant), a malvidina (bagaço de uva) e a delfinidina (black curant). O black currant possui duas antocianinas principais, são elas: cianidina 3-rutinósido e a delfinidina 3-rutinósido em concentrações praticamente iguais que representam aproximadamente 60% do total das antocianinas.

O facto da cianidina se ligar a diferentes açúcares na baga de sabugueiro, no black curant e no chokeberry pode afectar ligeiramente a cor resultante. Mais importante a cenoura, a couve roxa e o rabanete contêm todos antocianinas aciladas. No rabanete e na couve roxa, a molécula de soforose acilada a O-6 da unidade de glucose é ligada á posição O-6 da aglicona. Os ângulos do tom do rabanete, da couve roxa e da cenoura diminui com o aumento do pH, um efeito típico da acilação no tom.

Efeito do pH e do açúcar

A adição de açúcares não teve um efeito significativo na estabilidade

fotoquímica e térmica dos pigmentos a um pH=3. O aumento do BI (raio da absorvância que vai desde 430nm até 520nm) em bebidas açucaradas pode ser devido à formação de compostos castanhos através da reacção de Maillard. Altas concentrações de açucares (> 20%) têm um efeito protector das antocianinas presumivelmente pelo abaixamento da actividade da água. Como representa a figura8 a um pH menor que 2 as antocianinas existem principalmente na forma de laranja vermelho, no catião flavílio. A um pH



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superior a 2 a adição de água no núcleo pirilium forma um hemiecetal incolor e a forma chalcona ( produtos termodinâmico, equilíbrio constante Kh), considerando a competição desprotonada de flaviliuns ácidos com os grupos OH das formas quinoidais roxas ( produtos cinéticos, equilíbrio constante Ka).

Figura 13. Transformação estrutural das antocianinas pelo efeito da mudança de pH, segundo Delgado

Vargas, 2003.



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Copigmentação intermolecular

Considerando a falta de antocianinas aciladas no extracto de bagaço de uva, a copigmentação intermolecular é proposta como sendo a principal responsável pela estabilização dos corantes. A copigmentação deverá ser mais eficiente nos extractos de plantas tendo altas taxas molares de pigmentos/copigmentos, apesar de não ser evidente por uma intensificação de cor, visto que todas as soluções de extractos são normalizadas para um máximo de absorvância de 1 para fins de comparação. Contudo, a influência da copigmentação na estabilidade da cor é bastante significativa e, por exemplo, no bagaço da uva b, apresenta a maior teor molar de pigmentos e copigmentos, e é o mais estável em termos térmicos dos extractos de bagaço da uva a.

De facto, a cor do bagaço de uva b continua estável por 23 dias sob calor e irradiação a um pH=3, enquanto que os outros extractos ficaram amarelos. Espantosamente, a uva b tem uma alta concentração em flavonóides, que são tipicamente os copigmentos mais eficientes das antocianinas. Esta observação sugere que a pigmentação intramolecular tem um papel chave na prevenção da perda de cor durante os tratamentos com calor e luz.

A conversão reversível dos iões flavílios em formas chalconais, tem mostrado ser um importante passo para todo o processo de degradação térmica das antocianinas.

A copigmentação baixa a taxa molar entre formas incolores e coloridas via selecção complexa da forma colorida, deve competir com o primeiro passo da degradação das antocianinas. Mais ainda, formas copigmentadas do acido fenólico e grupos flavonóides, que absorvem radiações UV, devem promover uma adicional protecção contra fotodegradação das formas coloridas.

A degradação térmica torna-se mais rápida quando o pH sobe de 3 para 5, com o aumento em simultâneo da concentração de formas incolores.

O extracto de uva menos estável é o da uva a (em 1997). Espantosamente este corante apresenta mais catequinas. Catequinas e a malvidina 3- glucósido (como outros iões flavideos) são conhecidas por formar de forma lenta, pigmentos amarelos, com a absorção máxima na ordem dos 420 – 480nm. Formação de pigmentos xantofilas pode ser responsáveis pelo grande aumento na absorção a 430nm, observado com o extracto de uva nas bebidas não açucaradas a pH 3.



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Copigmentação intramolecular

A cor dos extractos desprovidos de antocianinas aciladas (bagaço de uva; bagas de sabugueiro; black currant e chokeberry) é altamente sensível a condições térmicas, o BI aumenta com o aumento da deslocação da onda de absorção máxima no espectro visível de 50- 80 nm.

Em contraste, a cor dos extractos ricos em antocianinas aciladas (cenoura roxa; rabanete e couve roxa) é bastante estável a pH 3 e o comprimento de onda da absorvância nestas corantes é quase inalterada pelo calor nos três pH estudados. Tal diferença na estabilidade pode ser relacionada com copigmentação intramolecular. De facto, grupos acil aromáticos das antocianinas aciladas são conhecidas por prender no núcleo flavílio, e por isso, protegem o anel pirílico da adição nucleofílica da água. Consequentemente, a concentração de formas incolores a um dado pH é mais baixo que para o pigmento não acilado correspondente. Devido ao facto de as formas incolores (chalconas) serem primeiramente envolvidas na degradação de antocianinas copigmentação intramolecular, deve eficientemente proteger as antocianinas da degradação.

Ainda, a diferença na estabilidade da cor observada entre a cenoura roxa, rabanete e couve roxa, pode ser explicada pelas diferentes antocianinas aciladas presentes nesses corantes. Por exemplo, corantes da cenoura roxa desbotam mais rapidamente que os corantes do rabanete e da couve roxa. Espantosamente, os corantes contendo antocianinas diaciladas, o grupo aromático acil, que conseguem simultaneamente, presa em ambas as fases do cromóforo (molécula ou grupo de moléculas definidos como o sistema que absorve luz), oferecendo uma óptima protecção. Em oposição as antocianinas não aciladas presentes na cenoura roxa, tem apenas uma fase em que o anel pirilio protege contra a adição de água.

A copigmentação intermolecular por ácido clorogénico é mais forte com o ião flavilio do que com quinóides. Isto pode também ser verdade para a pigmentação intramolecular envolvendo resíduos de ácido cinâmico. A conformação de autoprotecção das antocianinas aciladas pode ser mais estável na escala de pH em que os iões flavíllios estão presentes (pH<4). Isto é consistente com a estabilidade dos corantes contendo antocianinas aciladas a pH 3. Assim como a copigmentação intramolecular, a copigmentação intermolecular pode também ser responsável pela estabilidade da cor.

Copigmentação intermolecular com ácidos fenólicos e copigmentação intramolecular podem agir cooperativamente para estabilizar a cor a baixos pH.



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Conclusão

Com este trabalho teve-se como resultado um conhecimento mais aprofundado sobre as antocianinas e sobre a sua importância a nível da indústria alimentar e também de outras indústrias, e seus benefícios para a saúde humana. Portanto conclui-se que este corante, por ser natural e por conferir estabilidade e melhoramento da cor de diversos produtos, é realmente muito importante, e por isso a necessidade de se estudar as suas características e o seu comportamento em diferentes situações. Estas situações podem ser diferentes pH’s, luz, temperatura, entre outros, e neste caso estudou-se a estabilidade das antocianinas em diferentes produtos, o que resultou numa observação, embora generalizada, de que na verdade as antocianinas, a nível de estrutura, (e que daí altera a sua cor e composição), a estabilidade vai ser diferente, e portanto as antocianinas podem ser estáveis ou instáveis conforme as condições em que se encontram. Claro que essas condições podem ser alteradas e estas podem ser mais estáveis, por isso é que existem tratamentos, para que este corante possa ser aplicado em produtos em que a sua cor natural se encontra um pouco degradada, garantindo estabilidade e duração da cor.



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Antocianinas como Corantes Naturais