UNIVERSIDADE DE SO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRO PRETO

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

Alexandra A. C. Nascimento Enilza Maria Espreafico Maria Luisa Pa Larson Ndia Monesi Nilce Maria Martinez Rossi Vanderlei Rodrigues Reviso: Eliana Valria Patussi Mrcia A. S. Graminha

1999

I. CONCEITOS BSICOS 1. INTRODUO At a dcada de 70, o DNA era o componente celular mais difcil de ser analisado. Sua sequncia de nucleotdeos de enorme tamanho e monotonia qumica era geralmente analisada por meios indiretos como a sequncia de protenas e anlise gentica. A partir da dcada de 70 novas tecnologias foram desenvolvidas permitindo o isolamento e a purificao de genes especficos num processo chamado de clonagem gnica. Na verdade, muitas destas tcnicas so provenientes da Microbiologia, Bioqumica, Imunologia e Gentica Microbiana e permitiram que a anlise do DNA ganhasse um novo enfoque. O DNA tornou-se ento, a molcula mais fcil de ser analisada, sendo possvel isolar regies especficas, obt-las em grande quantidade e determinar a sua seqncia numa velocidade de milhares de nucleotdeos por dia. A Tecnologia do DNA recombinante, como se convencionou denominar este conjunto de tcnicas, tem uma ampla aplicao. Ela pode ser usada para estudar mecanismos de replicao e expresso gnica, na determinao da seqncia de um gene e conseqentemente da protena que ele codifica, ou no desenvolvimento de culturas microbianas capazes de produzir substncias teis tais como a insulina humana, hormnio de crescimento, vacinas e enzimas industriais em grandes quantidades. Sua aplicao comercial ou biotecnolgica parece ter um potencial inesgotvel. Como conseqncia do desenvolvimento desta tecnologia atualmente possvel realizar investigao de paternidade e o diagnstico de doenas genticas e infecciosas atravs da anlise de DNA.

2. CONCEITO DE CLONAGEM MOLECULAR A origem do termo clonagem vem da Gentica Bacteriana que considera uma colnia de bactrias como um clone porque todos os indivduos so geneticamente idnticos bactria inicial. A tcnica central da metodologia do DNA recombinante a clonagem molecular, a qual consiste no isolamento e propagao de molculas de DNA idnticas.1

A clonagem molecular compreende pelo menos dois estgios importantes: primeiro o fragmento do DNA de interesse chamado de inserto ligado a uma outra molcula de DNA chamada de vetor para formar o que se chama de DNA recombinante. Segundo, a molcula do DNA recombinante introduzida numa clula hospedeira compatvel, num processo chamado de transformao. A clula hospedeira que adquiriu a molcula do DNA recombinante agora chamada de transformante ou clula transformada. Um nico transformante, em condies ideais, sofre muitos ciclos de diviso celular, produzindo uma colnia que contm milhares de cpias do DNA recombinante.

3. ENZIMAS DE RESTRIO Em 1953 foi descrito um estranho fenmeno no qual a eficincia da replicao de um bacterifago (vrus de bactrias) dependia da clula hospedeira na qual ele estava inserido. Algum tempo depois percebeu-se que a inabilidade de certos fagos crescerem em determinadas linhagens bacterianas era devido a presena de nucleases altamente especficas que clivavam o seu DNA. Isto pode ser encarado como um sistema de defesa bacteriano que degrada DNA que lhe estranho (restrio). A bactria protege seu prprio DNA desta degradao camuflando-o atravs da metilao de algumas bases especficas (modificao). Como conseqncia, este sistema frequentemente descrito como fenmeno da restrio/modificao e existe em um grande nmero de bactrias. As enzimas de restrio ou endonucleases de restrio so divididas em vrias classes, dependendo da estrutura, da atividade e dos stios de reconhecimento e clivagem. As enzimas do Tipo II, as mais importantes na Tecnologia do DNA Recombinante, so proteinas monomricas ou dimricas e clivam o DNA no mesmo stio do seu reconhecimento. O stio de reconhecimento deste tipo de enzima

normalmente uma seqncia palindrmica, isto , ela tem um eixo de simetria e a seqncia de bases de uma fita a mesma da fita complementar, quando lida na direo oposta (Figura 1).

2

a) Clivagem no eixo de simetria

b) Clivagem simtricamente situada ao redor do eixo de simetria

...TC GA... ...AG CT...

...GAA TTC... ...CTT AAG...

3

5

+5 3 3 5

+5 3

Molculas com extremidades abruptas

Molculas com extremidades coesivas

Figura 1. Dois tipos de clivagem feitas por enzimas de restrio. As setas indicam os stios de clivagem. As linhas pontilhadas representam o centro de simetria da sequncia.

Estas enzimas reconhecem seqncias especficas de 4 a 8 pares de base (pb) na molcula de DNA e fazem dois cortes, um em cada fita. H 2 tipos distintos de clivagens: a) os dois cortes ocorrem no eixo de simetria da seqncia especfica, gerando extremidades abruptas, ou b) os cortes so feitos simetricamente, porm, fora do eixo de simetria, gerando extremidades coesivas. Estes dois tipos de clivagens e suas conseqncias esto mostrados na Figura 1. Atualmente, mais de 1000 enzimas de restrio j foram identificadas. A nomenclatura desenvolvida foi baseada na abreviao do nome do microrganismo do qual a enzima foi isolada. A primeira letra representa o gnero e as outras duas a espcie, seguido de um algarismo romano (ou outra letra) que indica a ordem da descoberta ou a linhagem da qual ela foi isolada. Por exemplo, a enzima de restrio denominada de EcoRI purificada de uma Escherichia coli que carrega um fator de transferncia de resistncia RI, enquanto que a Hind III isolada da Haemophilus influenzae, linhagem d III. A Tabela 1 mostra a seqncia palindrmica e o local de clivagem de algumas enzimas de restrio. Note que algumas enzimas deixam terminaes coesivas enquanto que outras fazem cortes abruptos ou no coesivos.

3

MicrorganismoEscherichia coli Bacillus amyloliquefaciens H Bacillus globigii Haemophilus aegyptius Haemophilus aegyptius

EnzimaEcoRI BamHI BglII HaeII HindIII

Sequncia AlvoG C A T A T T A T A C G

G C

G C

A T

T A

C G

C G

A T

G C

A T

T A

C G

T A

Pu Pi y

G C

C G

G C

C G

Pi P u

A T

A T

G C

C G

T A

T A

Providencia stuartii Streptococcus albus G Thermus aquaticus Brevibacterium albidium Haemophilus aegyptius

PstI SalI TaqI BalI HaeIII

C G

T A

G C

C G

A T

G C

G C

T A

C G

G C

A T

C G

T A

C G

G C

A T

T A

G C

G C

C G

C G

A T

A T

G C

G C

C G

C G

T A

Serratia marcescens

SmaI

C G

C G

C G

G C

G C

G C

Tabela 1. Algumas endonuclease de restrio: origem e stios de clivagem. A seta indica o local de clivagem. Pu e Pi referem-se, respectivamente, a qualquer purina e pirimidina.

O interesse por estas enzimas de restrio aumentou em 1973 quando se percebeu que elas poderiam ser usadas para fragmentar o DNA deixando extremidades de fitas simples de DNA que permitiam a ligao dos fragmentos. Isto significava que a recombinao poderia ser efetuada em tubos de ensaio. Alm disto, DNA bacteriano poderia recombinar com DNA humano ou de qualquer outra espcie, abrindo a possibilidade de clonar genes humanos ou isolar protenas de culturas bacterianas. Uma importante conseqncia da especificidade destas enzimas de restrio que o nmero de clivagens feito por cada uma delas no DNA de qualquer organismo 4

definido e permite o isolamento de fragmentos deste DNA. Portanto, cada enzima de restrio gera uma famlia nica de fragmentos quando cliva uma molcula de DNA especfica. Enzimas que reconhecem stios de restrio compostos por 4 pares de bases clivam o DNA em mdia a cada 256 nucleotdeos (44=256). Aquelas que reconhecem stios com 6 e 8 pb clivam o DNA em mdia a cada 4096 e 65536 pb, respectivamente. No entanto, esta mdia pode sofrer variaes significativas, dependendo principalmente da composio de bases do DNA analisado. Por exemplo, a enzima NotI reconhece um stio de restrio contendo 8pb, incluindo nucleotdeos CpG, que raramente ocorre no DNA de mamferos. A famlia de fragmentos gerados por digesto com enzima de restrio geralmente detectada pela separao destes fragmentos por eletroforese em gel de agarose. Os fragmentos migram em funo de seus pesos moleculares sendo que os menores migram mais rapidamente (Figura 2).

Sentido da migrao

Pares de base

Figura 2. Molculas de DNA de tamanhos diferentes podem ser separadas por eletroforese. Molculas menores movem-se mais rapidamente que molculas maiores, tornando-se portanto separadas em bandas. O DNA corado com brometo de etdeo uma molcula que fluoresce quando iluminada com luz Ultra Violeta.

4. CONSTRUO DO DNA RECOMBINANTE

5

Uma enzima de restrio particular reconhece somente uma seqncia nica de bases. DNAs de origem diferente sob a ao da mesma enzima de restrio produzem fragmentos com o mesmo conjunto de extremidades fitas simples. Portanto, fragmentos de dois diferentes organismos (por exemplo, bactria e homem) podem ser ligados por renaturao das regies de fita simples. Alm disto, se a ligao for "selada" com a enzima DNA ligase, depois do pareamento de bases, os fragmentos sero ligados permanentemente. A tcnica de DNA recombinante tem um interesse especial se uma das fontes de DNA clivado for um plasmdeo.

AC G TPlasmdeo de E.coli DNA humano

TGCA

TGCA ACGT

TGCA ACGT

Enzima

Enzima

GCA T

T ACGDNA ligase

TG

CA TG

AC

TGCA TG

Plasmdeo hbrido

Figura 3. Construo de uma molcula de DNA hbrida a partir de fragmentos de diferentes organismos obtidos com o uso de enzima de restrio.

A figura 3 mostra uma molcula de DNA de plasmdeo que tem somente um stio de clivagem para uma determinada enzima de restrio. A mesma enzima usada para clivar DNA humano. Se os fragmentos de DNA humano so misturados com o DNA plasmidial linearizado, permitindo a ligao entre eles, uma molcula de DNA plasmidial contendo DNA humano pode ser gerada. Este plasmdeo hbrido pode ser inserido numa bactria por transformao e ento o inserto ser replicado como parte do plasmdeo. Geralmente antibiticos so acrescentados ao meio da cultura para6

AC

selecionar somente as linhagens que portam os plasmdeos (o plasmdeo usado para esta finalidade porta resistncia a pelo menos um antibitico).

5. DNA LIGASE Conforme mencionado anteriormente esta enzima promove a ligao dos fragmentos de DNA em vetores previamente clivados por endonucleases de restrio. A DNA ligase requer um grupo OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias de DNA e um grupo fosfato na extremidade 5' da outra cadeia (Figura 4). A E.coli e o fago T4 codificam uma DNA ligase capaz de selar fragmentos de DNA com dupla fita. DNA ligase isolada de E.coli e de outras bactrias requer NAD+, enquanto que a isolada do bacterifago T4 requer ATP como cofator.O DNA 3 OH + O-

P

O

5

DNA

O DNA-LigaseATP ou NAD

O DNA 3 O-

P O

O

5

DNA

Figura 4. DNA ligase cataliza a juno de duas fitas de DNA que so partes da molcula da dupla-hlice.

Tipos de fragmentos de DNA que so ligados pela DNA ligase a) Fragmentos com extremidades coesivas As extremidades coesivas produzidas por vrias enzimas de restrio permitem dois fragmentos de DNA ligarem-se facilmente, atravs da formao de pontes de hidrognio pela complementariedade das bases. Finalmente a ligao covalente dos fragmentos realizada pela DNA ligase (ver figura 4).

b) Fragmentos com extremidade no coesivas

7

DNAs portando extremidades no coesivas so ligados com muito menos eficincia que aqueles que tem extremidades coesivas. Uma concentrao muito maior de DNA ligase e mesmo dos DNAs envolvidos necessria para que as molculas com extremidades no coesivas sofram reao de ligao. No entanto, a ligao deste tipo de fragmento facilitada pela transformao prvia das extremidades no coesivas em coesivas. Este procedimento pode ser feito atravs de dois processos: a) Adio de polidesoxi (A) na extremidade 3' de um fragmento de DNA e polidesoxi (T) na extremidade 3' de um outro fragmento de DNA, atravs da enzima desoxinucleotidil transferase terminal ou simplesmente transferase. Esta enzima, uma DNA polimerase incomum, adiciona nucleotdeos extremidade 3-OH de fragmentos fita simples proeminente de uma cadeia de DNA. Para gerar este tipo de extremidade proeminente a molcula tratada previamente com uma exonuclease 5-especfica para remover alguns nucleotdeos terminais. Aps a mistura dos dois tipos de fragmentos complementares e anelamento dos mesmos, as molculas so unidas preenchendo-se os espaos existentes com o auxlio da DNA pol I e selando-os com DNA ligase (Figura 5) b) Adio de adaptadores s extremidades no coesivas Os adaptadores so oligonucleotdeos sintticos e complementares que contm stios de clivagem para uma ou mais enzimas de restrio. Eles so unidos ao DNA com o auxlio da DNA ligase (Figura 6). c) O terceiro mtodo utiliza T4 ligase em concentraes que pode ligar molculas de DNA sem proeminncias.

8

5 3

3 5

5 3 5 - Exonuclease especfica

3 5

3 3 3

3

Deoxinucleotdio transferase terminal

+dATP AAAA AAAA TTTT

+dTTP TTTT

Espaos preenchidos com DNA Pol I. DNA ligase para completar a ligao

Figura 5. Fragmentos de DNA com extremidades no coesivas podem ser transformadas em coesivas pela adio de poli (A) e poli (T).

DNA a ser inserido Vetor GAATTC CTTAAG + GAATTC CTTAAG Adaptador Sinttico

T4 DNA ligase GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG

EcoRI

EcoRI G AATTC CTTAA G AATTC G G CTTAA

Figura 6. Fragmentos de DNA com extremidades no coesivas podem ser transformados em coesivas pela adio de adaptadores e posterior tratamento com a enzima de restrio que reconhece o adaptador.9

6. TRANSFORMAO BACTERIANA

6.1.Conceito de transformao induzida O processo de transformao constitui um evento de alta importncia na tcnica de manipulao gnica. A transformao natural descrita por Griffith, em 1928, e por Avery e colaboradores, em 1944, um evento raro. No entanto em 1970, Mandel e Higa encontraram que a E.coli tornou-se marcadamente competente para transformao com DNA exgeno, quando a bactria foi suspensa em cloreto de clcio gelado e submetida a um curto choque trmico 42oC. Estes mesmos autores tambm verificaram que as bactrias crescidas at a fase log eram mais competentes do que aquelas isoladas de outros estgios do crescimento. O procedimento do cloreto de clcio que usado at hoje produz uma eficincia de transformao de 105 a 107 transformantes por micrograma de DNA (a eficincia de transformao geralmente expressa como o nmero de clulas transformadas, obtido a partir de um micrograma de DNA plasmidial intacto). O tamanho e a conformao da molcula do DNA, afeta o processo de transformao. Plasmdeos pequenos so mais facilmente incorporados pela clula bacteriana competente, DNA linear pobremente incorporado, talvez pelo fato de sofrer degradao pelas enxonucleases presentes no espao periplasmtico.

6.2. Mecanismos de captao do DNA O mecanismo de captao da molcula do DNA pela bactria competente ainda desconhecido. Uma hiptese que as molculas do DNA passam atravs de canais situados nas chamadas zonas de adeso, que so locais onde a membrana interna e externa da clula bacteriana se unem formando poros. Estes poros s esto presentes durante o crescimento bacteriano (fase de crescimento exponencial). Em condies naturais, a captao do DNA torna-se difcil, devido a repulso eletrosttica existente entre as cargas negativas da camada de fosfolipdeos da membrana bacteriana com a carga negativa do grupo fosfato da molcula do DNA. O papel do clcio explicado pela hiptese de que a 0oC a fluidez da membrana celular cristalizada, estabilizando a distribuio dos fosfatos carregados. Os ons Ca+2

formam um complexo com este grupamento, cobrindo as cargas negativas, facilitando10

agora a atrao eletrosttica com as molculas do DNA na zona de adeso. O choque trmico, complementa este processo de captao, provavelmente criando um desbalano trmico entre o interior e o exterior da clula bacteriana, auxiliando o bombeamento do DNA atravs da zona de adeso. A figura 7 ilustra este processo.

DNA genmico

Clula Bacteriana

-

-

-

Zona de adeso

-

-

-

-

- -

Bicamada lipdica (interna)

Figura 7. Mecanismo molecular proposto para explicar a transformao de E. coli com uma molcula de DNA exgeno.

II. VETORES DE CLONAGEM MOLECULARAps o isolamento de uma informao gentica, por exemplo um fragmento de DNA obtido pela clivagem com enzimas de restrio, este fragmento dever ser inserido numa outra molcula de DNA diferente, capaz de amplificar aquela informao gentica em centenas de cpias. Este processo de amplificao obtido atravs do uso de molculas de DNA que so os chamados vetores de clonagem molecular.11

-

-

-

-

-

-

-

-

-

- - - -- - Plasmdeo - - - -

Camada peptido glucan Bicamada lipdica (externa) Fosfolipdeos on de clcio

Atualmente, os tipos bsicos de vetores usados na metodologia do DNA recombinante apresentam caractersticas especiais que os tornam excelentes veculos de clonagem em diferentes situaes. A seguir, vamos apresentar os principais tipos de vetores atualmente em uso na biologia molecular.

1. PLASMDEO

So pequenas molculas de DNA dupla fita, contendo os elementos necessrios para a sua replicao e pelo menos um gene que confere resistncia a antibitico. Estes elementos genticos extra cromossomais variam de 5 a 400 kilobases e comumente esto presentes em duas ou mais cpias por clula. Os plasmdeos presentes num grande nmero de cpias so usados como veculos de clonagem desde que capacitem a amplificao do segmento do DNA neles clonado. Um plasmdeo para ser um bom vetor de clonagem deve conter as seguintes propriedades: a) possuir uma origem de replicao (O), ou seja, uma seqncia de DNA que permita que o vetor seja replicado na clula hospedeira, b) apresentar dois ou mais stios nicos de clivagem para endonucleases de restrio. O conjunto destes stios denominado de Mltiplo Stios de Clonagem (MSC) o local onde o inserto incorporado ao vetor de clonagem, c) possuir um gene que codifica um produto que distingue a clula transformada da clula no transformada. Por exemplo, muitos vetores de clonagem carregam o gene que confere resistncia ampicilina (AmpR). As clulas transformadas com tais vetores so capazes de crescer num meio contendo o antibitico, enquanto que as clulas no tranformadas acabam morrendo. A figura a seguir ilustra as principais caractersticas estruturais de um plasmdeo.

12

O

AmpR

MSC

Figura 8. Estrutura molecular de um plasmdeo tipico usado em clonagem molecular

Um dos passos fundamentais no processo de clonagem molecular o uso de enzima de restrio que produz extremidades compatveis durante a clivagem do DNA a ser clonado (inserto) e a do DNA receptor (vetor). Uma vez que o DNA foi ligado ao vetor, esta molcula hbrida dever ser introduzida numa clula hospedeira geralmente bactrias, por um processo chamado de transformao, para que o vetor possa sofrer replicaes e consequentemente amplificar o nmero de cpias do inserto. A bactria transformada ser facilmente reconhecida pela aquisio de um novo fentipo dado pelo plasmdeo, ou seja, capacidade de crescer em meios contendo antibitico.

2. FAGOS

Um dos vetores mais utilizados nos processos de clonagem molecular o denominado bacterifago , o qual comporta-se como um vrus da E.coli. Antes de analisarmos o uso deste elemento como veculo de clonagem molecular, vamos mostrar resumidamente as suas propriedades biolgicas e estruturais.

2.1 Biologia do fago

O fago um parasita obrigatrio da E.coli, o qual necessariamente deve injetar o seu DNA na bactria hospedeira para a sua multiplicao. Aps a infeco da E.coli o genoma do fago pode seguir duas vias:13

a) No primeiro caso denominado estado ltico, o DNA do fago permanece na bactria como uma molcula independente, havendo a ativao de alguns genes do fago e a concomitante inativao de outros, dentro de um programa estritamente definido. Como resultado o cromossomo do fago replicado ativamente, ocorre a sntese das protenas da capa e da cauda, formam-se novas partculas virais. Em aproximadamente 45 minutos aps a infeco a clula hospedeira lisada havendo a liberao de cerca de 100 novos fagos. b) A outra via que o cromossomo do fago pode seguir o denominado estado lisognico. Neste caso, o DNA do fago integrado no cromossomo da bactria passando a ser chamado profago. No estado lisognico, todos os genes do profago esto inativos com excesso do gene que produz a protena repressora. A bactria hospedeira carregando o profago multiplica-se e este replicado passivamente e distribudo para as bactrias descendentes. Em condies naturais a opo entre seguir o estado ltico ou lisognico depende das condies do meio. Assim, via de regra em meio rico em nutrientes o estado ltico preferencial, por exemplo o fago na bactria E.coli intestinal. Por outro lado, em meio pobre de nutrientes como o caso da E.coli no solo, o fago prefere o estado lisognico. Em condies experimentais, o estado a ser seguido depende de um balano entre os fatores do meio intra e extra celular e de fatores genticos da bactria hospedeira e do bacterifago.

2.2 Genoma do fago

O bacterifago uma partcula viral constituda de aproximadamente 50% de protenas e 50% de DNA. O DNA do fago , na forma como ele isolado da partcula viral, uma molcula linear com dupla fita de aproximadamente 48.500 pares de bases. As extremidades da molcula contm uma frao de DNA fita simples com cerca de 12 nucleotdeos, os quais so complementares na sequncia de bases e atravs delas que o DNA assume a forma circular quando ele injetado na clula hospedeira. Estas extremidades so denominadas de stio cos. O genoma do fago codifica para aproximadamente 50 protenas, cujos genes tem um cronograma de expresso bem definido, o que determina a instalao do estado ltico ou lisognico.

14

As figuras 9 e 10 ilustram o ciclo biolgico do fago em uma clula hospedeira e o genoma do fago com alguns dos seus principais genes, respectivamente.

5 2 4 3

1

6

Figura 9. Replicao do fago no interior da clula hospedeira. Aps adsoro (1) e injeo (2) do genoma do fago na bactria, a via ltica indicada pelos nmeros 3, 4 e 5 leva a formao de novas partculas virais. Alternativamente, a via lisognica (6) pode ser ativada levando integrao do material gentico viral ao genoma da bactria hospedeira.

Empacotamento

Recombinao

Regulao

Replicao

Lise

cos

A

J

int

.cIII N pL

cI Cro pr

cII

O

P

S

R

Figura 10. Genoma do fago

2.3 Controle de expresso dos genes do fago

Seja qual for a via a ser seguida pelo fago , ou seja via ltica ou lisognica, a expresso dos genes envolvidos nestes circuitos comea pelos produtos dos genes N e

15

Cro, regulados pelos promotores pL e pR respectivamente situados esquerda (pL) e direita (pR) do gene cI. Durante o transcurso da via ltica, o produto do gene cro est diretamente relacionado com a replicao do genoma do fago , atravs da induo da expresso dos genes OP. Por outro lado, o produto do gene N est diretamente relacionado com a expresso dos genes da regio de empacotamento ou seja genes A e J, responsveis pela sntese das protenas da cabea e da cauda do fago como tambm da expresso dos genes S e R, diretamente envolvidos com a lise da clula hospedeira. Durante a via lisognica, a transcrio tambm se inicia pelos promotores pL e pR coordenando a expresso dos genes cII e cIII. O produto destes dois genes coordena a expresso do gene cI que produz uma protena repressora inibindo a expresso dos genes responsveis pelo empacotamento e a lise. Por outro lado, um outro gene importante o int cujo produto relaciona-se com a integrao do fago no genoma bacteriano estabelecendo o estado lisognico.

2.4 O uso do fago como vetor de clonagem molecular.

Durante o ciclo ltico, os genes envolvidos no processo de lisognia so dispensveis e consequentemente a chamada regio de integrao do genoma do fago pode ser totalmente substituda por um outro fragmento de DNA, sem que haja qualquer alterao nos processos envolvidos na via ltica. Uma das maiores vantagens de usar o fago como vetor de clonagem que o DNA inserido no fago empacotado in vitro. Embora a eficincia de empacotamento seja cerca de 10%, uma vez que os fagos so empacotados teremos 100% de eficincia na infeco da E.coli hospedeira. Este processo altamente eficiente quando comparado com o da transformao bacteriana com plasmdeos. Neste caso, os melhores resultados situam-se ao redor de 108 transformantes por g de DNA o que significa que menos de 1 em 1000 plasmdeos so transformados na E.coli hospedeira.

16

Atualmente, existem vrios derivados do fago onde um ou mais stios de restrio flanqueiam a regio de recombinao, facilitando a sua substituio por um outro DNA. Estes so os chamados vetores de substituio. Um exemplo tpico destes vetores o EMBL3, neste a regio de recombinao flanqueada pelas enzimas de restrio EcoRI, BamHI e SalI, as quais quando clivadas podem receber fragmentos de DNA variando de 10,4 a 20kb, como mostra a figura abaixo.

b DNA bacterifago a b b c

EcoRI b a

ligase

c

informaes desnecessrias replicao EcoRI

empacotamento in vitro

bacterifago contendo genes do camundongo

DNA camundongo

Figura 11. Representao esquemtica da clonagem de um fragmento de DNA genmico no fago . As regies indicadas por a contm todas as informaes necessrias para replicao em E. coli e empacotamento in vitro. Os diferentes fragmentos obtidos da digesto do DNA de interesse com enzima apropriada esto indicados pelas letras b e c, onde somente c possui tamanho adequado para o empacotamento.17

Outros derivados do fago so os chamados vetores de insero, neste tipo de vetor, os fragmentos de DNA que podem ser inseridos devem ter no mximo at 7kb de tamanho para no alterar os processos de empacotamento do genoma do fago. Os vetores de insero derivados do fago mais bem utilizados especialmente na clonagem de cDNA, so os vetores gt10 e o gt11. Vamos a seguir fazer algumas consideraes sobre estes dois tipos de vetores. No fago gt10, o inserto geralmente cDNA inserido no stio da EcoRI situado no gene repressor cI. O fago recombinante ter agora o gene cI obstrudo e consequentemente produzir durante a cultura, placas de lise com o centro claro morfologicamente fcil de ser distinguida da placa no recombinante que possue o gene cI ntegro e por conseguinte uma placa de lise turva. Por outro lado, o fago gt11 contm um stio de restrio EcoRI localizado no gene LacZ, 53 pares de bases anterior ao cdigo de trmino de expresso da enzima galactosidase. Quando o cDNA inserido no stio da EcoRI contm sequncias codificadoras em fase de leitura com as sequncias codificadoras do LacZ, o cDNA inserido expresso como uma protena fundida com a -galactosidase. Esta expresso obtida na presena do IPTG (isopropil--D-galactosdeo) que o indutor do promotor Lac que juntamente com o substrato cromognico X-gal iro produzir placas incolores no caso do inserto estar presente e obstruir a expresso da enzima -galactosidase, ou placas azuis quando no h inserto e a enzima expressa completamente ativa.

3. COSMDEO

A clonagem de fragmentos de DNA no fago apresenta uma limitao na qual o fragmento a ser clonado no ultrapasse cerca de 15kb (Figura 12). Na maioria das vezes, esta dimenso suficiente para conter um gene completo, incluindo as sequncias flanqueadoras. Entretanto, muitos genes apresentam dimenses da ordem de 35 a 40 kb e nestes casos, a tcnica usada para a clonagem deste tipo de fragmento a chamada clonagem em cosmdeos. Os cosmdeos, so plasmdeos que contm um fragmento de DNA do fago que inclue o stio cos. Estes cosmdeos podem ser usados como veculos de clonagem molecular empregando o sistema de empacotamento in vitro. Este sistema, reconstitue a estrutura do fago (cabea e cauda) e assim usado para infectar a clula hospedeira.18

As enzimas do sistema de empacotamento do fago reconhecem dois stios cos situados 35 a 49Kb de distncia e neste caso, somente fragmentos desta ordem de tamanho sero convenientemente empacotados. O DNA genmico clivado com uma enzima de restrio que produz grandes fragmentos de DNA, os quais sero ligados ao cosmdeo, tambm clivado com uma enzima semelhante. A situao ideal que cada fragmento do DNA genmico apresente um stio cos nas suas extremidades. Durante o empacotamento, as enzimas do sistema reconhecem os stios cos situados a uma distncia dentro de 49Kb, clivam estes stios e empacotam estas molculas. O DNA do cosmdeo injetado no interior da clula hospedeira, circulariza igual ao DNA do fago e replica como um plasmdeo normal, sem expresso de qualquer funo do fago. As clulas infectadas sero selecionadas com base na resistncia adquirida a um determinado antibitico. A figura ilustra um tpico processo de clonagem em cosmdeo.

19

Amp

R

Stio alvo de restrio

fragmentos de restrio de 35 a 40 kb cos

seleo de clones resistentes a ampicilina DNA circulariza aps infeco

Figura 12. Esquema de clonagem em cosmdio

4. VRUS

A biologia molecular dos vrus de DNA e RNA foi extensivamente estudada antes do advento da metodologia do DNA recombinante. O virus SV40 isolado de clulas tumorais de macacos, foi um dos primeiros sistemas virais utilizados para introduzir genes em clulas de mamferos. O DNA do SV40 apresenta 5.200 pares de bases e pode ser dividido em duas regies quanto a expresso gnica viral. Estas regies so chamadas de regio precoce e regio tardia.20

A regio precoce expressa atravs do cclo ltico, enquanto que a expresso dos genes da regio tardia, ocorre somente aps o incio da replicao do DNA viral. Entre estas duas regies, situa-se a origem de replicao do DNA do vrus. Um produto de expresso da regio precoce o antgeno T o qual responsvel pela transformao maligna de clulas no permissveis (clulas nas quais o vrus no completa a sua replicao), como tambm pelo incio da replicao viral em clulas permissveis. Os produtos de expresso codificados pela regio tardia correspondem s protenas que forma o capsdeo da partcula viral. A figura 13 ilustra o genoma do virus SV40.o Expresso precoce Expresso tardia

SV40 Genoma do SV40

Figura 13. O DNA do virus SV40

4.1. Clonagem no vrus SV40

A produo de DNA recombinante no vrus SV40, pode ser realizada atravs da substituio do segmento de expresso precoce ou do segmento de expresso tardia. No primeiro caso, o vrus recombinante no produz o antgeno T, ao passo que na segunda opo, no haver produo das protenas do capsdeo. Entretanto, estas funes deletadas podem ser suprimidas como veremos a seguir.

4.2.Clonagem no SV40 pela substituio da regio tardia

Quando a regio tardia do SV40 substituda com outro DNA, a perda das funes tardias, neste caso as protenas do capsdeo suprimida pelo uso simultneo de21

um outro vrus SV40 que tem uma deleo nos genes da regio precoce. As clulas permissveis so simultaneamente transfectadas com o SV40 recombinante e o SV40 deletado. O primeiro produz as protenas da regio precoce e o segundo as protenas da regio tardia. Como resultado, teremos a produo de uma populao de partculas virais mistas, ou seja, vrus deletado e vrus recombinante. A figura 14 ilustra este procedimento.

O Regio funcional precoce

SV40

Regio funcional tardia

gene da globina

SV40

SV40-globina

cotransfeco

empacotamento e lise

partculas Virais

Figura 14. Clonagem no SV40 pela substituio da regio tardia

22

4.3. Clonagem no SV40 pela substituio da regio precoce

Quando a clonagem no SV40 feita na regio precoce, a produo de partculas virais depende do suprimento das protenas codificadas pela regio precoce (antgeno T). Para evitar uma infeco mista com um vrus SV40 deletado, usa-se uma linhagem celular, as clulas COS as quais apresentam uma poro do genoma do SV40 integrado ao seu prprio cromossomo. Esta linhagem celular, produz a protena viral denominada antgeno T, a qual se liga na origem de replicao do vrus e induz a sua replicao. A figura 15 ilustra este tipo de clonagem. Apesar deste sistema viral ter sido usado como vetor de expresso em muitas estratgias de clonagem, existem algumas desvantagens de seu uso. Uma delas que o gene a ser clonado no pode ser grande, a outra que a clula hospedeira s pode ser clulas de macacos e finalmente, os genomas so muitas vezes rearranjados ou deletados. Atualmente, dois outros sistemas virais mais versteis esto em uso, so eles o virus da vacina e o Baculovirus, os quais podem aceitar genes bem maiores do que aqueles aceitos pelo SV40. Um inconveniente para estes dois sistemas virais que ambos apresentam um grande genoma e o gene a ser clonado s pode ser inserido por processos de recombinao dentro das clulas, o qual bastante lento em relao aos processos tradicionais em uso na metodologia do DNA recombinante. Finalmente, um sistema viral bastante promissor so os retrovirus que so vrus cujo material gentico o RNA e apresentam um ciclo bastante diferente dos mencionados anteriormente que so ciclos lticos. Os retrovirus infectam uma grande variedade de clulas de mamferos e o seu RNA transcrito para DNA o qual incorporado ao genoma da clula hospedeira. Neste estado ele produz continuamente novas partculas virais, juntamente com o produto do gene nele clonado. Devido a sua versatilidade, os retrovirus so atualmente os vetores eleitos para uso em terapia gnica.

23

O

Regio funcional precoce

SV40

Regio funcional tardia

gene da hemaglutinina (Ha)

SV40 mutante

SV40-Ha

co-transfeco

SV40 mutante integrado ao genoma da clula COS antgeno T replicao

empacotamento e lise

Partcula Viral

Figura 15. Clonagem no SV40 pela substituio da regio precoce5. BACTERIFAGO M13

O bacterifago M13, um fago filamentoso da E. coli e contm uma nica fita de DNA envolvida por protenas virais. Durante o seu ciclo, a clula hospedeira infectada pela fita (+) a qual servir como molde para a sntese da outra fita (-). A dupla fita denominada de forma replicativa, permanece no interior da clula hospedeira e 24

amplificada at 200 cpias por clula, quando ento a fita negativa no mais se replica e a fita positiva continua a ser sintetizada, adquire as protenas da cpsula viral e sai da clula hospedeira atravs de processo no ltico (Figura 16).E.coli

+M13

+

+

+

+Figura 16. Replicao do bacteriofago M13

5.1. Clonagem no bacterifago M13

A grande utilidade deste sistema de clonagem a sua facilidade na produo de DNA fita simples, facilmente recupervel do sobrenadante de uma cultura lquida da E.coli infectada com este vetor. Como veremos futuramente, este DNA fita simples bastante til no processo de sequenciamento do DNA pelo mtodo desenvolvido por Sanger e colaboradores (1977). Para facilitar o seu uso especialmente em estratgias de seqenciamento, foram desenvolvidos vetores da srie M13mp, os quais contm o MSC inserido no gene que expressa a -galactosidase. Mutaes foram realizadas de tal modo que a enzima s ativa quando o vetor est na clula hospedeira, convenientemente preparada. Este processo denomina-se de alfacomplementao. A incluso do mltiplo stio de clonagem no gene da galactosidade visa a identificao dos possveis recombinantes quando na presena de um substrato cromognico o X-gal ou Bluegal (5-bromo-4-cloro-indolil--Dgalactosdeo) e o indutor IPTG. Quando o vetor est intacto (no recombinante), a enzima funcional e frente ao substrato cromognico este clivado produzindo placas de cor azul. Por outro lado, quando um fragmento de DNA inserido no mltiplo sitio25

de clonagem, a expresso da enzima suprimida, portanto, incapaz de metabolizar o substrato cromognico formando como consequncia placas incolores.5.2. Estratgia de clonagem em vetores da srie M13mp.

A utilizao de vetores com diferentes orientaes do mltiplo stio de clonagem, tais como M13mp8 e o M13mp9, facilita a insero de um fragmento de DNA em ambas as orientaes. Como veremos adiante, esta estratgia apresenta grande aplicao no programa de sequenciamento de um DNA pelo mtodo de Sanger. A figura 17 ilustra a insero de um fragmento de DNA clivado com as enzimas Pst1 (P) e EcoRI (E), nos vetores M13mp8 e M13mp9, ambos clivados com as mesmas enzimas. Esta clonagem orientada, permite a insero do fragmento de DNA na orientao 5'3' no vetor M13mp8 e na orientao 3'5' no vetor M13mp9.

P5

E3

P

E

E

P

M13 mp9

M13 mp8

P

E

E

P

Figura 17. Clonagem de um fragmento de DNA nos vetores M13mp8 e M13mp9, clivados com as enzimas EcoRI (E) e PstI (P).

6. FAGEMDEOS

Apesar do bacterifago M13 apresentar grande aplicabilidade especialmente nos processos de seqenciamento de DNA, foram desenvolvidos outras geraes de fagos, os quais apresentam as vantagens do fago M13 e a do plasmdeo. Os primeiros foram os vetores da srie pEMBL e mais tarde os plasmdeos pTZ, pBluescript e pGEM

26

(+/-). Estes vetores so chamados de fasmdeos ou fagemdeos e apresentam as seguintes caractersticas principais: fagemdeo apresenta um verstil MSC, permitindo a clonagem de grandes insertos sem maiores dificuldades, alm de que, as enzimas situadas neste stio foram ordenadas de tal modo a permitir uma alternativa interessante durante o processo de sequenciamento. utilizando uma combinao estratgica de duas enzimas de restrio, possvel criar terminaes 5'e 3' proeminentes, tornando agora uma extremidade (a do inserto) susceptvel ao da Exonuclease III. Esta estratgia, permite a obteno progressiva e controlada de vrios fragmentos deletados do inserto, os quais aps a recircularizao tornam-se apropriados para o sequenciamento. Este procedimento, facilita o seqenciamento de um grande inserto de DNA, sem a necessidade de mltiplas subclonagens como usual no sistema M13 ou a sntese de vrios oligonucleotdeos internos, usados como iniciadores no processo de seqenciamento.

6.1. Clonagem no fagemdeo.

Vamos utilizar como exemplo, o fagemdeo ZAP o qual particularmente til para clonagem de cDNA. Este vetor, incorpora a biologia do fago M13 de tal modo que um cDNA clonado neste vetor pode ser automaticamente excisado do fago para um plasmdeo denominado pBluescript. Basicamente, qualquer DNA clonado no MSC inativa o gene LacZ, produzindo uma protena de fuso quando na orientao correta, podendo assim tambm ser rastreada com anticorpos. Quando uma cepa da E.coli (F') infectada com o fago recombinante e superinfectada com o fago auxiliar, este forma as protenas do sistema M13 que reconhecem duas sequncias de DNA a do sinal de iniciao e trmino da sntese do DNA, os quais foram incorporados no fago ZAP. A clivagem destas duas sequncias, liberar o inserto, o qual automaticamente circularizado na bactria para originar a forma recombinante do Bluescript SK(M13). O inserto clonado no Bluescript flanqueado por promotores para as RNA polimerases dos fagos T3 e T7. Neste sentido, aps o vetor ser convenientemente27

linearizado, cpias do RNA relativo ao inserto, podem ser obtidas em ambas as direes atravs do uso da T3 e T7 RNA polimerase.

7. VETORES PARA TRANSFORMAO DE LEVEDURAS

O grande interesse existente no estudo das leveduras Saccharomyces cerevisiae e Schizosacharomyces pombe deve-se ao fato de que tratam-se de organismos eucariotos inferiores e como tais possuem organizao celular similar de eucariotos superiores. Alm disso, muitas protenas de leveduras so similares estruturalmente e funcionalmente s suas homlogas em mamferos. A utilizao de leveduras como um modelo de estudo traz as seguintes vantagens: tempo de crescimento reduzido que permite a obteno de grandes quantidades de leveduras em pouco tempo. genoma de pequeno tamanho, cerca de 200 vezes menor que o genoma de mamferos, o que simplifica anlises moleculares e genticas. possibilidade de manter as leveduras como clulas haplides ou diplides, o que permite a obteno de mutaes recessivas em clulas haplides, bem como a realizao de experimentos de complementao gentica. As

clulas de mamferos so diplides o que torna impossvel a deteco de mutaes recessivas. Existem diferentes marcadores de seleo que so utilizados em leveduras. A maior parte dos genes marcadores utilizados em leveduras so genes envolvidos na biossntese de aminocidos e nucleotdeos. Um dos marcadores frequentemente utilizados o gene de levedura LEU2, que codifica para uma das enzimas da via de sntese da leucina, a enzima -isopropilmalato dehidrogenase. A linhagem mutante de levedura, leu2, no cresce em meio de cultura que no contm leucina. Assim quando o gene LEU2 utilizado na transformao da linhagem leu 2 as clulas desta linhagem que adquiriram o gene LEU2 sero capazes de crescer em meio de cultura deficiente no aminocido leucina. Esta estratgia semelhante a resistncia ampicilina adquirida por bactrias que foram transformadas com plasmdeos que contm o gene que promove a resistncia ampicilina. A tabela a seguir lista alguns dos marcadores de seleo comumente utilizados em levedura.28

GENE HIS3 LEU2 LYS2 TRP1 URA3

ENZIMAImidazol glicerolfosfato desidratase -Isopropilmalato desidrogenase -Aminoadipato redutase N-(5-fosforibosil)- antranilato isomerase Orotidina-5fosfato decarboxilase

SELEOhistidina leucina lisina triptofano uracil

Tabela 2. Genes marcadores de seleo em levedura. Os meios de cultura utilizados em geral contm todos os aminocidos necessrios manuteno da levedura com exceo de um. Assim, por exemplo, clulas transformadas com o gene HIS 3 so selecionadas em meio de cultura deficiente em histidina.

Os vetores utilizados na transformao de leveduras so capazes de propagarem-se em E. coli e levedura. A manipulao destes vetores (clonagem, mutagnese, seqenciamento, etc) realizada em bactria como para qualquer plasmdeo convencional e ento o mesmo transferido para levedura, organismo onde os ensaios de interesse so realizados. Tais vetores so denominados vetores do tipo ponte (shuttle vectors) e contm entre outros elementos origens de replicao de bactria e levedura bem como genes marcadores que funcionam para a seleo em bactria e em levedura. Diferentes tipos de vetores so utilizados na transformao de leveduras: Vetores de integrao: tais vetores contm origem de replicao de bactrias e genes marcadores para seleo em bactria e levedura. Neste caso o plasmdeo no capaz de replicar de modo autnomo na levedura. O modo pelo qual este tipo de vetor propagado e capaz de expressar o marcador de seleo atravs da integrao em um dos cromossomos de levedura. Vetores que replicam em levedura: tais vetores tambm contm origem de replicao de bactria e genes marcadores para seleo em bactria e levedura. Dois tipos de origens de replicao de levedura so empregadas nestes plasmdeos. O primeiro tipo consiste na origem de replicao do plasmdeo de 2 m, que de ocorrncia natural em levedura. O segundo consiste de origens de replicao isoladas de DNA cromossomal denominadas ARS ( Autonomously Replicating Sequence, sequncias de replicao autnoma). Plasmdeos contendo a origem de replicao do plasmdeo de 2m ou sequncias tipo ARS replicam em mltiplas cpias em levedura (Figura 18). Uma29

variante deste tipo de vetor inclui, alm da sequncia ARS, uma sequncia tipo centromrica, denominada CEN, que garante que a replicao destes plasmdeos seja estvel, ocorrendo uma nica vez por ciclo celular e que eles sejam segregados de modo preciso durante a mitose e meiose. Vetores contendo sequncias tipo CEN so mantidos em cpia nica na levedura (Figura 18). YACs: (Yeast Artificial Chromosome, cromossomo artificial de levedura) so uma variao de um vetor de cpia nica, que contm sequncias centromricas (CEN) e sequncias telomricas, que so sequncias das extremidades dos cromossomos. A presena de sequncias telomricas nestes vetores permite que sejam replicados como molculas lineares, com comportamento semelhante ao do DNA cromossomal. YACs no so utilizados de rotina em experimentos de clonagem, entretanto, tm se mostrado uma ferramenta valiosa na caracterizao de grandes segmentos genmicos na medida em que possvel clonar em um YAC fragmentos que vo de 100 a 2000 kb (Figura 19).LEU2 ARS Puc118Multicpias

LEU2 ARS Puc118 DNA Levedura DNA Levedura Cpia nica CEN

Figura 18. Vetores de levedura. Contm sequncias de plasmdeo (aqui de pUC118) que permitem a propagao e do resistncia a ampicilina em E.coli, o gene de seleo em levedura (neste caso LEU 2) e stios nicos de restrio. Vetores multicpias:. Estes plasmdeos existem na forma circular na levedura. Alguns destes vetores empregam a origem de replicao do plasmdeo de 2 m. Outros utilizam origens de replicao isoladas de cromossomos que so denominadas ARS. 2m e ARS permitem a replicao do plasmdio em mltiplas cpias. Vetores cpia nica: Vetores que contm origens de replicao tipo ARS podem ser mantidos estavelmente atravs da adio de sequncias centromricas, CEN. A existncia de sequncias tipo CEN assegura que o plasmdeo seja mantido em 1 ou 2 cpias na levedura e segregado de modo preciso durante a diviso celular.

30

EcoRI CEN4 ARS1 URA3 TRP1 AmpR

YAC

+EL

BamHI

+EL

Figura 19. YACs: Contm um centrmero, dois telmeros, gene(s) marcadores para seleo em levedura e uma seqncia tipo ARS. Devido presena destas seqncias os YACs so replicados como pequenos cromossomos lineares na levedura.

GLOSSRIO - ARS: (autonomous replication sequence, sequncia de replicao autnoma). Sequncia que funciona como uma origem de replicao em cromossomos de levedura. BAC: (bacterial artificial chromosome, cromossomo artificial de bactria). Vetor utilizado na clonagem de DNA genmico, baseado no fator F de plasmdeo que assegura que o plasmdeo seja mantido em pequeno nmero de cpias na bactria. Centrmero: regio do cromossomo que apresenta uma constrico e qual ligase o fuso mittico durante a meiose ou mitose. necessria para a manutno da estabilidade e segregao correta dos cromossomos durante a mitose e meiose. Origem de replicao: regio onde iniciada a sntese de DNA em um dado fragmento de DNA. Telmero: extremidade do cromossomo que contm sequncias repetitivas de DNA sintetizadas pela enzima telomerase e importantes na manutno da integridade cromossomal. YAC: (yeast artificial chromosome, cromossomo artificial de levedura). Sistema de clonagem em levedura que consiste de um vetor linear que tem capacidade de replicao autnoma e que contm um centromro de levedura e duas sequncias telomricas em suas extremidades.

31

III. CONSTRUO E USO DE BIBLIOTECAS DE DNA RECOMBINANTEA obteno de uma molcula de DNA recombinante, atravs da ligao de um fragmento de DNA de interesse com o DNA de um vetor, um processo direto e relativamente simples. Entretanto, problemas especiais surgem quando o fragmento de interesse constitui uma frao pequena do DNA total. Este o caso encontrado

comumente quando o objetivo o isolamento de genes presentes em uma nica cpia num genoma complexo, ou quando o objetivo o isolamento de clones portadores do DNA complementar RNA mensageiro raro. Deste modo, claro que quando

queremos clonar um determinado gene ou o DNA complementar da mensagem ou mensagens por ele codificada(s) necessrio a obteno de colees de clones recombinantes, portadores de molculas representantes de todo o genoma, ou de colees de clones de cDNAs derivados de toda a populao de mensageiros da clula ou tecido de interesse. Essas colees de clones de DNA recombinante so chamadas de bibliotecas: Biblioteca Genmica, no caso dos clones terem sido obtidos a partir do DNA genmico ou Biblioteca de cDNA, no caso dos clones terem sido construdos a partir de DNA complementar. O DNA de organismos superiores bastante complexo: por exemplo, o genoma haplide de mamfero composto de aproximadamente 3x109 pares de bases (pb). Portanto, se o fragmento de interesse tiver 3000 pb, ele compreender somente 1 parte em 106 de uma preparao do DNA total. De modo similar, uma espcie de RNAm particularmente rara pode compreender somente 1 parte em 105 ou 106 da frao de RNA mensageiros de uma clula. Deste modo, para que seja garantida a presena na biblioteca de pelo menos uma verso de todas as seqncias da populao alvo, um dos pontos principais na construo de bibliotecas teis a obteno de grandes quantidades de clones. Embora a soluo deste problema envolva estratgias

especficas no preparo do DNA alvo e na escolha do vetor de clonagem, em linhas gerais a construo de bibliotecas genmicas e de cDNAs segue um procedimento bsico bastante semelhante. Nos dois casos, o DNA genmico ou os cDNAs so preparados para a insero no vetor escolhido. O vetor e o DNA alvo so ligados e introduzidos em E.coli atravs de infeco ou em alguns casos, por transformao direta (Fig. 20).32

Tecido mRNA DNA Digerir o DNA, Parcial ou completamente cDNA Fracionar por tamanho

Escolha do Vetor

DNA clonvel

Ligar DNA a um vetor Introduzir o produto da ligao em E.coli

Titulao e caracterizao da Biblioteca

Figura 20. Passos envolvidos na construo de Bibliotecas de cDNA e Bibliotecas genmicas. 1. BIBLIOTECA DE cDNA

A descoberta da enzima transcriptase reversa, uma DNA polimerase dependente de RNA encontrada predominantemente em vrus de RNA de tumor, tornou possvel a sntese in vitro de DNA usando-se como molde RNAm. O DNA produto dessa reao o DNA complementar ou cpia da mensagem, abreviadamente chamado de cDNA. A sntese e possvel clonagem de cDNAs contribuiram para grandes avanos na anlise da estrutura e expresso de genes de eucariotos e propiciaram uma revoluo tecnolgica nas indstrias farmacutica e de alimentos. Esses clones so comumente isolados de bibliotecas de cDNA, construdas a partir da populao de RNAm isolada da clula ou do tecido de interesse. Portanto, em comparao com bibliotecas do genoma total essas bibliotecas so enriquecidas com seqncias gnicas. Uma vez que o cDNA cpia da mensagem, ele no contm introns e apresenta significativamente33

poucas seqncias que no codificam para protenas (Fig.21). A ausncia de introns permite que cDNAs relativos a clulas de eucariotos superiores sejam diretamente transcritos e traduzidos em bactrias e em outros microorganismos, permitindo assim a produo em grande escala de polipeptdeos importantes tanto na rea de pesquisa como na rea aplicada. A ausncia de introns tambm facilita a determinao direta da seqncia da mensagem e subsequente deduo da seqncia de aminocidos da protena por ela codificada. Isso tem resultado na identificao da seqncia de uma enorme quantidade de protenas, algumas vezes mesmo antes de terem sido identificadas gentica ou bioquimicamente. De modo resumido, o procedimento para a sntese, clonagem e isolamento de cDNAs especficos envolve 4 etapas: 1) Sntese in vitro de cDNAs de fita dupla a partir de RNAs mensageiros isolados do tecido de interesse. 2) Preparo dos cDNAs para a ligao com o vetor escolhido 3) Introduo dos cDNA recombinantes nas clulas hospedeiras, onde sero replicados. Isto resultar na amplificao dos recombinantes e dependendo do vetor utilizado, na expresso das protenas codificadas pelas mensagens que deram origem aos cDNAs. 4) Identificao dos clones de interesse atravs de um processo de triagem dos clones recombinantes

5 DNA Genmico

A

B5 5

C B B D D

D3 3

E

3

RNA mensageiro

cDNAA e E = Sequncias Flanqueadoras

B e D = exons

C = intron

Figura 21. Diagrama representando de forma simplificada as diferenas entre um fragmento de DNA genmico e do cDNA relativo a ele.

34

1.1. Sntese de cDNAs de fita dupla A construo de uma biblioteca de cDNA inicia-se com o isolamento do RNA total do tecido e subsequente seleo da frao de RNA poli (A)+, que compreende a maioria das mensagens presentes na clula. O isolamento de um RNA poli (A)+ de boa qualidade essencial, uma vez que qualquer degradao do RNAm afetar a representatividade das seqncias na biblioteca. Uma vez obtida a frao de RNA poli (A)+, procede-se a sntese dos cDNAs atravs de uma srie de reaes enzimticas (Figura 22). Nos ltimos dez anos foram descritos vrios mtodos para sntese de cDNA, cada um apresentando vantagens e desvantagens particulares. Como exemplo, apresentamos a seguir um procedimento amplamento usado para esse fim: a) Sntese da fita de DNA complementar ao RNAm (cDNA) atravs da enzima transcriptase reversa. Essa enzima capaz de catalizar in vitro a polimerizao de DNA a partir RNA e requer um "primer" com a extremidade 3'OH livre para iniciar a sntese. Na maioria das vezes, a molcula utilizada como "primer" um oligo (dT), que se anela na cauda poli (A)+ do RNA. b) Aps a sntese dessa fita de cDNA, o RNAm parcialmente removido, pelo uso da RNase A para cortar pedaos do RNA da molcula hibrida RNA-DNA. c) Utilizando como "primer" os fragmentos de RNA no digeridos pela RNaseA, a DNA polimerase de E.coli substitui eficientemente o RNA por DNA, resultando em uma molcula de cDNA de fita dupla. d) O cDNA fita dupla tratado com T4 polimerase. A atividade 3'-5' exonuclease dessa enzima usada para remover possveis nucleotdeos extras nas extremidades 3' do cDNA. e) O produto final desse conjunto de reaes uma molcula de DNA de fita dupla, cpia exata da mensagem.

1.2. Preparo dos cDNAs para a ligao com o vetor

35

Uma vez obtido o cDNA, o prximo passo prepar-lo para a insero em um vetor de clonagem (Figura. 22). Para isso tambm existem vrios mtodos disponveis, que diferem entre si dependendo do tipo de vetor escolhido: plasmdeo ou fago. O fago tem sido o vetor de escolha para a construo de bibliotecas de cDNA. A razo bsica desta preferncia a eficincia. Em comparao com plasmdeos, o fago requer cerca de 16 vezes menos cDNA por g do vetor para produzir nmero equivalente de clones recombinantes. Alm disso, bibliotecas em fago so mais fceis de serem manipuladas do que bibliotecas em plasmdeos. Entretanto, uma desvantagem dos vetores que no so favorveis para procedimentos de sequenciamento do DNA e de mutagnese dirigida. Mais recentemente, outro tipo de vetor foi idealizado para suprir essas deficincias. Essa classe de vetores compreende os fagemdeos que, como o prprio nome sugere, so plasmdeos contendo pores do genoma de fago e que reunem vantagens desses dois vetores. Para dar uma noo dos passos implicados na clonagem do cDNA relatamos a seguir um procedimento adotado para a clonagem de cDNA em fago . a) metilao dos stios de EcoRI atravs do tratamento do cDNA com EcoRI, na presena de S-adenosil metionina. Esse passo essencial para proteger os stios EcoRI que possam existir no cDNA contra a ao da EcoRI em digesto a ser realizada subseqentemente no processo de clonagem. b) adio de adaptadores, com o stio EcoRI, nas duas extremidades do cDNA. Essa reao resulta em molculas de cDNA com adaptadores mltiplos ligados nas duas pontas (ver figura. 23 ) c) um nico stio de EcoRI produzido em cada ponta do cDNA pela digesto com EcoRI, liberando o excesso de adaptadores ligados na molcula. A metilao prvia do cDNA garante que no haja digesto interna do cDNA. d) antes de ser inserido no vetor, o cDNA separado do excesso de molculas de adaptadores. Isso feito atravs de filtrao em colunas de Sephadex. e) as molculas de cDNA so ligadas ao vetor, atravs de reao com T4 ligase f) o produto da ligao empacotado com as protenas formadora do capsdeo do fago.

36

g) os fagos obtidos so utilizados para infectar bactria de linhagem que favorece o crescimento dos recombinantes. h) aps a infeco da bactria com os cDNA recombinantes temos como produto uma biblioteca de cDNA, que deve conter cpias de toda as seqncias de RNAm da populao original. Essa biblioteca pode ser estocada na geladeira, ou submetida a uma triagem em busca do clone de interesse.5 Cauda poli A 3 AAAAAAAA

AUG

mRNA

+dNTPs

AUGcDNAE.coli Rnase H

Oligo dT iniciador AAAAAAAA TTTT

cDNADNA Polimerase I

+dNTPs

CDNAT4 DNA Polimerase

CDNA fita dupla

Figura 22. Sntese de cDNA fita dupla.

{TTTT

Transcriptase reversa

TTTT

AAAAAAAA

37

1Me

2

3

MeMetilao do cDNA para proteger os stios internos de EcoRI Ligao dos adaptadores EcoRI com o cDNA

Digesto com EcoRI para gerar stios coesivos EcoRI

4

5

6

Separao do cDNA do excesso de adaptadores

cDNA purificado

Ligao do cDNA dos braos do fago lambda

7

8

9

Empacotamento dos recombinantes com as protenas formadoras da partcula viral

Infeco da bactria hospedeira o fago recombinante

Plaqueamento dos recombinantes

Figura 23. Clonagem de cDNA em fago . 2. BIBLIOTECA GENMICA

Para se obter informaes sobre a estrutura molecular de um gene de eucariotos necessrio o isolamento da poro do DNA genmico que contenha toda a unidade de transcrio, mais as regies flanqueadoras onde se localizam os elementos controladores da expresso desse gene. O modo mais eficiente para se conseguir isolar essa poro do DNA atravs do uso de uma biblioteca genmica, que deve conter38

clones portando fragmentos de DNA representantes de todo o genoma do organismo em questo. Deste modo, o aspecto principal considerado na construo de uma

biblioteca genmica atem-se obteno de um nmero grande de clones portando fragmentos do genoma, obtidos aleatoriamente. O tamanho necessrio de uma biblioteca genmica, para que um dado fragmento de interesse esteja entre os fragmentos clonados, determinado pelo tamanho do fragmento clonado e pelo tamanho do genoma. Deste modo, a estratgia bsica na construo de bibliotecas genmicas busca minimizar o nmero de clones necessrios atravs da clonagem de fragmentos de DNA de maior tamanho possvel, e maximizar a eficincia da clonagem, atravs da utilizao de vetores baseados no fago . Basicamemte, a construo da biblioteca genmica envolve os seguintes passos: a) isolamento de DNA de alto peso molecular, que posteriormente quebrado de modo a produzir fragmentos de tamanho compatvel com o vetor de clonagem b) ligao desses fragmentos no vetor e introduo dos recombinantes obtidos nas clulas hospedeiras. Dentre esses passos, o modo de preparo dos fragmentos a serem clonados (insertos) merece ser discutido criticamente dada sua importncia na representatividade da biblioteca. 2.1. Preparo do DNA inserto A representatividade de uma biblioteca genmica depende grandemente da aleatoriedade com que os fragmentos a serem clonados so gerados, para que no haja excluso sistemtica de nenhuma seqncia. O fracionamente mecnico do DNA o meio de se obter completa aleatoriedade na fragmentao do DNA. Entretanto, esse mtodo no comumente adotado devido a trabalhosa manipulao necessria para que os fragmentos assim obtidos possam ser inseridos no vetor. Com bom senso e cuidado possvel conseguir fragmentao sufientemente aleatria atravs de digestes parciais do DNA com enzimas de restrio. Uma vantagem em se utilizar a disgesto parcial do DNA a produo de fragmentos com pontas coesivas e que, portanto, podem ser diretamente ligados ao vetor. Para garantir que a digesto atinja todo o genoma so utilizadas enzimas de restrio que cortam frequentemente o DNA e que no39

apresentam desvios de preferncia de stios. A enzima Sau3A I, que reconhece o stio de 4 bases GATC, e que gera fragmentos compatveis com stios de clonagem de vrios fagos e cosmdeos, tem provado ser bastante til na produo de bibliotecas de DNA genmico digerido parcialmente. Aps a digesto parcial, os fragmentos gerados precisam ser fracionados antes de serem ligados ao vetor. Sem esse fracionamento, fragmentos pequenos podero ligar-se entre si produzindo falsos recombinantes. Fragmentos muito grandes que no permitem o crescimento do fago podero ligar-se aos braos do fago, alterando a relao entre as quantidades de DNA de inserto e vetor. Um mtodo de fracionamento frequentemente adotado o de centrifugao em gradiente de sacarose. Aps a digesto parcial, a soluo de DNA aquecida para que possveis fragmentos agregados se dissociem, e ento, aplicada sobre um gradiente de sacarose de alta salinidade. Aps a centrifugao, so coletadas fraes desse gradiente. Essas fraes so analisadas por eletroforese em um gel de agarose. As fraes

contendo os fragmentos de DNA de tamanho apropriado so utilizadas para a ligao com o vetor. A figura abaixo ilustra esse procedimento.

40

Tubo de plstico Tubo capilar

Bomba Gradiente de sacarose Tubos de coleta 4 2 3

1

5

Figura 24. Mtodo para fracionamento do DNA por centrifugao em gradiente de sacarose. O gradiente aspirado, de baixo para cima, com ajuda de uma bomba peristltica. A poro mais densa do gradiente contendo o DNA de maior peso molecular, aspirada primeiro. O gradiente coletado em alquotas de 750ul.

Uma vez garantida a aleatoriedade dos fragmentos clonados, bastante razovel se pensar que a probabilidade de uma dada seqncia de interesse estar presente em uma biblioteca genmica possa ser estimada estatisticamente, com base na distribuio de Poisson. Especificamente, o nmero de clone independentes (N) que precisam ser triados para uma propabilidade (P) de se isolar uma seqncia especfica dada por: N = ln(1-P)/ ln[1-(I/G)]

onde I o tamanho mdio dos fragmentos clonados, em pares de base, e G o tamanho do genoma, em pares de base. Deste modo, precisamos triar cerca de 690.000 clones de uma biblioteca que usa como vetor um fago , para termos 99% de chance de isolar qualquer dada seqncia presente em uma nica cpia em um genoma tpico de mamfero. N = ln(1-0,99)/ln[1- (2x104/3x109)]= 690.000

41

2.2. Vetores utilizados na construo de biblioteca genmica

Fagos e cosmdeos so os dois tipos de vetores comumente usados na construo de bibliotecas genmicas. Nos dois casos, fragmentos grandes de DNA gerados por fragmentao aleatria so ligados com o DNA do vetor para formar concatmeros que podem ento ser empacotados em partculas de fago . As bibliotecas construdas em vetores so armazenadas e propagadas na forma de fagos recombinantes. No caso de clonagem em cosmdeos, entretanto, essas partculas virais servem meramente como veculos para introduzir o DNA recombinante dentro da bactria. Uma vez dentro da bactria o cosmdeo se comporta como um plasmdeo grande. Os cosmdeos podem aceitar insertos de aproximadamente 45kb, quase duas vezes o tamanho dos insertos clonveis em fago . Deste modo, usando-se cosmdeo como vetor, necessrio gerar somente 350.000 recombinantes para atingir 99% de probabilidade de uma seqncia de cpia nica estar representada em uma biblioteca genmica de mamfero. Entretanto, bibliotecas em cosmdeos so mais difceis de se construir e manter do que as bibliotecas de fagos Cosmdeos so ento usados quando o gene de interesse muito grande ou quando uma regio extensa do DNA cromossomal desejada. No caso de isolamento rotineiro de segmentos de genes ou em circunstncias onde a biblioteca ser usada muitas vezes, o uso de vetores mais recomendado. Na figura abaixo apresentamos um diagrama da estrutura de um vetor tipo , bastante utilizado na construo de bibliotecas genmicas.B S E B E S

5 cos

3

BE

Fragmento central

BD

3 cos

5

BE=brao esquerdo

BD=brao direito

Figura 25. Estrutura do vetor EMBL3. LA=brao esquerdo; RA=brao direito; stuffer= fragmento central; S=SalI; B=BamHI; E=EcoRI.

Conforme indicado no diagrana este vetor apresenta um fragmento central flanqueado por dois fragmentos essencias (direito e esquerdo). O fragmento esquerda,42

chamado de brao esquerdo, codifica para as protenas do capsdeo e o fragmento direita, chamado de brao direito, contm a origem de replicao do fago e promotores de outros genes essenciais. Entre o fragmento central e os dois braos encontram-se os stios de restrio utilizados na clonagem - SalI, BamHI, EcoRI - em orientao inversa. Como todo fago , a extremidade de cada brao apresenta um segmento de fita simples (cos). Esses segmentos so complementares ente si e permitem a

recircularizao da molcula, e consequente replicao do DNA do fago dentro da clula hospedeira. Esse tipo de vetor chamado de vetor de substituio por que no processo de clonagem a parte central do DNA do fago substituida pelo fragmento de DNA a ser clonado, originando a molcula recombinante.

IV. DETECO E ANLISE DO CLONE RECOMBINANTE Um passo crucial na Tecnologia do DNA recombinante encontrar o clone correto na mistura de clones que foi criada durante os procedimentos da confeco da biblioteca genmica ou de cDNA. Embora seja relativamente fcil selecionar as colnias que abrigam os vetores de clonagem usando os marcadores de resistncia a antibiticos que esto presentes nos vetores (Figura 26), muito mais difcil selecionar o clone que contenha o gene de interesse. Note que no caso do vetor ser um plasmdeo devero ser examinadas milhes de colnias de bactrias crescidas em placas de petri contendo agar, para a deteco daquela(s) colnia(s) que produza(m) pequenas quantidades da proteina expressa pelo gene de interesse ou ento que possua(m) o gene de interesse sem qualquer expresso proteica que o caracterize. Ser discutido inicialmente a situao na qual a proteina expressa no hospedeiro. Em seguida ser discutida a situao mais comum onde a proteina no expressa e a anlise ser feita atravs da prpria presena do DNA de interesse no fago ou na bactria.

43

APstl Resistncia a ampicilina

EcoRI ClaI HindIII BamHI SalI

pBR322Resistncia a tetraciclina

Origem da replicao do plasmdeo

BAmpR

Stio BamHI TcR

pBR322

Stio BamHI BamHI

DNA Exgeno BamHI

DNA ligase

TcR

R Amp

TcR

R Amp

Plasmdeo hibrido contendo DNA Exgeno

pBR322 recirculacizado Transformao de E.coli Transformantes resistentes a ampicilina e tetraciclina

Transformantes resistentes a ampicilina mas sensvel a tetraciclina

Figura 26. Estrutura do plasmdeo pBR322, um tpico vetor de clonagem. A seta indica a direo da replicao do DNA a partir da sua origem (A). Mtodo da inativao insercional para isolar plasmdeos contendo DNA exgeno. A inserso do DNA exgeno no plasmdeo pBR322 causa inativao da resistncia tetraciclina, permitindo o isolamento de transformantes contendo o fragmento de DNA clonado (B).44

4.1. Quando o gene de interesse expresso no hospedeiro

Se o gene de interesse capaz de se expressar na clula hospedeira pode-se identificar o clone que carrega este gene pela presena desta proteina entre as colnias recombinantes. Para isto, o hospedeiro no deve produzir esta proteina, a menos que ele carregue o clone que a produza. Se esta proteina fr produzida normalmente pela clula hospedeira, ser ento necessrio o uso de uma clula hospedeira defectiva ou mutante para o gene de interesse. Quando este gene fr incorporado ele pode ser detectado por complementao daquela funo. Se a proteina a ser detectada fr especfica de mamfero, por exemplo, a clula hospedeira j ser naturalmente defectiva. Se a proteina fr uma enzima que cataliza uma reao mensurvel pode ser possvel triar as colnias por sua atividade enzimtica. Se a proteina de interesse no fr uma enzima com funo detectvel, uma outra estratgia ser necessria para a identificao do clone correto, como por exemplo, o uso de um anticorpo especfico para a proteina de interesse. Anticorpo uma proteina do soro produzida pelos mamferos que se combina com alta especificidade com outra proteina, o antgeno. Neste caso, a proteina de interesse o antgeno. Como o anticorpo se combina especificamente com o antgeno, se o antgeno estiver presente em uma ou mais colnias de uma placa de petri, a identificao destas colnias poder ser feita observando-se a reao antgeno-anticorpo. Para que o antgeno seja produzido na clula hospedeira a biblioteca de cDNA ter de ser construda num vetor de expresso. Neste caso os cDNAs so inseridos nestes vetores em regies que promovam sua expresso em E.coli, normalmente em promotores que possam ser regulados. Esta protena antignica ser expressa como uma protena de fuso ou seja, ser sintetizada subsequente a alguns aminocidos pertencentes proteina do vetor bacteriano. Estas protenas de fuso so geralmente mais estveis que a correspodente protena de eucarioto produzida em bactria e portanto podem ser obtidas em grande quantidade. Para visualizar a produo destas protenas, uma parte dos fagos de cada placa de lise (ou bactrias) recombinantes desenvolvidos numa placa de Petri so transferidos (como um carimbo) para uma membrana de nitrocelulose, tratados para expor suas protenas e ento submetidos a uma soluo contendo um anticorpo especfico para a protena desejada. Depois que os45

anticorpos livres so removidos, um segundo anticorpo adicionado para localizar a posio do primeiro. O segundo anticorpo normalmente radioativo e pode ser

identificado por autoradiografia utilizando-se um filme de raio X. Se uma colnia radioativa estiver presente, uma mancha no filme de raio X ser observada depois que o filme fr revelado (Fig. 27). A localizao desta mancha no filme corresponde a localizao da colnia que produziu aquela proteina, na placa de petri original. Esta colnia ser ento recuperada da placa original e cultivada. Uma limitao deste procedimento que o anticorpo utilizado nesta triagem precisa ser especfico para a proteina de interesse. A produo de anticorpos pode ser obtida pela injeo da proteina (antgeno) em um animal. No entanto, esta proteina injetada deve ser pura, caso contrrio mais que um anticorpo ser formado.

4.2 O uso de sondas moleculares de cidos nucleicos para identificar o gene de interesse

Como pode ser detectado um gene de interesse entre as colnias da biblioteca genmica ou de cDNA, se este gene no expresso? Quando o DNA em soluo aquosa aquecido 100C, ou exposto pH alto, as bases complementares que normalmente seguram as duplas hlices juntas so dissociadas em duas fitas simples. Este processo chamado de denaturao. Estas mesmas fitas simples podero se reassociar se forem conservadas 65C, por longos perodos, num processo chamado de renaturao (ou hibridao, quando a associao ocorre entre cidos nucleicos de diferentes origens). Reaes de hibridao ocorrem entre qualquer duas cadeias de cidos nucleicos de fita simples (DNA:DNA, RNA:DNA ou RNA:RNA) desde que tenham sequncias de nucleotdeos complementares.

46

Promotor EcoRI lac

gfll

-Galactosidase

EcoRI

EcoRI linker

cDNA

EcoRI

EcoRI

Proteina de Fuso

Empacotamento dos fagos in vitro e plaqueamento em camada bacteriana

Membrana de nitrocelulose

Nitrocelulose sobre as placas de lise Placas de lise Remoo da membrana Protenas se ligam a nitrocelulose

Filme de raio-X

anticorpo secundrio

Incuba membrana com anticorpo primrio Lava membrana Incuba membrana com anticorpo secundrio

anticorpo primrio

Figura 27. Triagem de bibliotecas de expresso com anticorpos. Se o inserto estiver na orientao correta e na apropriada sequncia aberta de leitura traduzido em proteina de fuso (antgeno). Os anticorpos identificam as placas de lise especficas destes antgenos. 47

Este princpio da hibridao molecular fundamental para caracterizar DNAs recombinantes quando o gene de interesse no expresso. Sondas de cidos nucleicos (fragmentos de cido nucleico marcados radioativamente, geralmente com32

P) so

utilizadas para localizar clones, numa biblioteca genmica ou de cDNA, que carreguem uma sequncia de DNA de interesse. Aps a confeco da biblioteca genmica (ou de cDNA) os fagos carregando DNA recombinante so espalhados juntamente com uma suspenso de bactrias numa placa de petri contendo meio de cultura slido. Uma vez visualisadas as placas de lise (ou as colnias, no caso do vetor ser um plasmdeo) preparada uma rplica de cada placa de petri com uma membrana de nilon ou de nitrocelulose. Este processo permite a transferncia de uma poro de fagos de cada placa de lise (ou de bactrias de cada colnia) para a membrana, de tal maneira que o padro das placas de lise da placa de petri original seja mantido na membrana. Para identificar qual das placas de lise porta o gene de interesse esta membrana tratada para expr e denaturar o DNA das colnias al presentes e incubado com uma soluo de DNA ou RNA fita simples, marcado radioativamente e complementar ao gene de interesse para permitir a hibridao. Dois polinucleotdeos simples fitas somente iro se hibridar se forem complementares. A localizao da placa de lise que se hibridou sonda determinada aps a exposio da membrana um filme de Raio-X (autoradiografia) e a comparao deste filme com a disposio da colonias na placa de petri original (Fig 28). Esta sonda molecular radioativa pode ser parte de um gene j clonado para o qual se procura o gene total, pode ser o DNA de um gene vizinho ao gene de interesse, pode ser o RNA de genes que so expressos em tecidos especficos ou em estgios especficos do ciclo celular, ou mesmo o gene de uma outra espcie que codifica para a mesma protena. Neste ltimo caso, a reao de hibridao pode ser realizada em baixa temperatura (420C ao invs de 650C) e em baixa concentrao de sal (baixa estringncia) para permitir a hibridao mesmo entre DNAs que tenham algumas bases no complementares.

48

Membrana de nitrocelulose

Placas de lise

Fagos absorvem a nitrocelulose

Placa mestra

Membrana rplica Sonda de cido nucleico marcada com 32p

Sonda Hibridiza DNA ligado ao filtro

Lavagem das sondas no incorporadas

Sonda hibridiza ao DNA do fago que contem a sequncia complementar

Filme de raio-X

DNA lambda isolado da placa de lise DNA clonado Placa mestra

Clone lambda purificado

Figura 28. Triagem de uma biblioteca genmica ou de cDNA, construdas no fago , com uma sonda molecular para encontrar um clone de interesse. Esta triagem feita espalhando-se os fagos previamente incubados numa cultura de bactrias, em vrias placas de agar. Depois que as placas de lise tornam-se visveis, so feitas as rplicas em membrana de nitrocelulose, seu DNA exposto e hibridizado com a sonda molecular. A posio do clone recombinante de interesse identificada atravs de autoradiografia. O DNA isolado dos fagos presentes na placa de lise positiva, identificada na placa de petri original e submetido anlises posteriores.49

Genes que respondem a um mesmo mecanismo de regulao podem ser identificados numa biblioteca de cDNA por hibridao diferencial. Isto , genes expressos em tecidos especficos, em estgios especficos do desenvolvimento ou do ciclo celular e genes regulados por fatores de crescimento so adequados para serem analisados por este tipo de abordagem. Para esta identificao necessrio produzir duas populaes celulares (ou extrair mRNA de dois diferentes tecidos) uma na qual eles no se expressam e outra na qual eles se expressam. Suponha por exemplo, que uma biblioteca de cDNA seja preparada usando o mRNA isolado de clulas tratadas com fatres de crescimento. Esta biblioteca plaqueada e transferida para dois conjuntos de membranas de nitrocelulose. Um conjunto ensaiado com DNA marcado radioativamente preparado por transcrio reversa do RNA das clulas tratadas com os fatores de crescimento. O outro conjunto de filtros hibridado com cDNA preparado de clulas no tratadas. Clones positivos identificados por hibridizar mais fortemente com a primeira sonda codificam mRNAs induzveis pelos fatores de crescimento (Figura 29). Quando o DNA a ser clonado expressa uma proteina cuja sequncia conhecida pode-se inferir a sequncia de um trecho de DNA que lhe deu origem e sintetizar oligonucleotdeos que lhe sejam complementares para serem utilizados como sondas moleculares. Estes nucleotdeos devem ter pelo menos 17 a 20 nucleotdeos de comprimento para ser especfico para a sequncia procurada. Um problema enfrentado para sintetizar estes oligonucleotdicos a degenerecncia do cdigo gentico. Alguns aminocidos so codificados por quatro ou mesmo seis diferentes cdons e portanto mesmo um pequeno polipeptdeo pode ter sido codificado por vrias sequncias de DNA. Para contornar este problema as sondas oligonucleotdicas so algumas vezes sintetizadas como uma mistura de todas as possveis combinaes dos cdons que so traduzidas naquela sequncia proteica (Figura. 30). Uma destas sequncias correta e ir hibridar com o clone de interesse, mas a possvel hibridao dos outros oligonucleotdeos com sequncias sem interesse pode levar a obteno de clones falsos positivos.

50

Clulas com fatores de crescimento

Clulas Quiescentes

Cresce em 3 hs Isola o mRNA poli(A)

Isola o mRNA poli(A)

AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAAOligo(dt) Transcritase Reversa 32p-dNTPA hibridao

AAAAA AAAAAmRNA induzido pelos fatores de crescimento

AAAAA AAAAAOligo(dt) Transcritase Reversa 32p-dNTPA hibridao

Prepara bibliotca de cDNA com fago lambda e infecta Ecoli

Placa mestra

Rplica em membrana de nitrocelulose

Autoradiogrfia cDNA comum Clone de cDNA indusvel por fatores de crescimento

Hibridao negligenciavel

Autoradiogrfia

Isola o clone do fago

Filme de raio-X

Filme de raio-X

Placa mestra

Figura 29. Clonagem de genes regulados por fatores de crescimento atravs de hibridao diferencial. Esta estratgia utilizada para clonar uma famlia de genes que so induzidas quando clulas quiescentes so estimuladas a crescer pela adio dos fatores de crescimento.

51

Cys-Met-Asp-Glu-Met-Lys-Arg-Asn-Ile

Sequncia Parcial de Aminocidos

A T A A A C C TG -ATG-GA -GA -ATG-AA -AG -AA -ATT C G G G T T C Parte da sequncia com A pouca ambigidade CG C G T Sondas contendo todas as possveis combinaes de condons de parte da sequncia TGTATGGATGAAATGAA TGCATGGATGAAATGAA TGTATGGACGAAATGAA TGCATGGACGAAATGAA TGTATGGATGAGATGAA TGCATGGACGAGATGAA TGCATGGATGAGATGAA TGTATGGATGAGATGAA

Sequncias Possveis do DNA

Sonda tentativa

5TGCATGGACGAGATGAAGCGCAACATC 3

Hibridao com cDna

5 TGCATGGACGA

GATGAAGCGCAAC ATC

3

---ACGTACCTGCTTTACTTCGCGTT TAG--A5 TGCATGGACGAAATGAA 3

---ACGTACCTGCTTTACTTCGCGTTATAG---

Figura 30. Desenho de sondas oligonucleotdicas baseadas na sequncia proteica. Como a maioria dos aminocidos so especificados por dois ou mais codons estes oligonucleotdeos so sintetizados usando-se uma mistura dos nucleotdeos das posies ambguas. A sequncia correta estar representada entre os oligos. Uma outra possibilidade usar uma sonda tentativa cuja escolha baseada na frequncia de uso do codon na espcie em estudo. Neste caso pareamentos incompletos podem ocorrer.52

Uma variao deste mtodo utilizar o menor nmero possvel de oligonucleotdeos como sonda, escolhendo a regio da proteina que contm o menor nmero possvel de cdons degenerados (por exemplo, metionina somente codificada pelo cdon AUG). Deve-se levar em conta tambm qual o cdon de uso mais frequente para cada aminocido, na espcie que est sendo analisada.

4.3 Anlise do DNA e RNA por eletroforese em gel e blotting.

Vrias tcnicas foram desenvolvidas baseadas nas propriedades de hibridao dos cidos nucleicos visando a triagem e isolamento de sequncias especficas destas molculas. A maioria destas tcnicas, conforme j mencionado, trabalha com uma rplica do DNA de interesse imobilizado num suporte slido tal como uma membrana de nailon ou de nitrocelulose. Um destes mtodos, desenvolvido na dcada de 70 por E.M.Southern, tornou-se conhecido por Southern blotting. Nesta tcnica o DNA digerido com uma ou mais enzimas de restrio e os fragmentos resultantes separados por eletroforese num gel de agarose. Os fragmentos de DNA dupla fita so visualizados por colorao com brometo de etdio, denaturados in situ com hidrxido de sdio e transferidos para uma membrana por capilaridade, com o auxlio de uma soluo de alta concentrao salina. Tais condies permitem que o DNA seja retido na membrana no ponto de contacto entre o gel e a membrana, criando portanto uma rplica do gel. O DNA covalentemente ligado membrana usando-se calor ou luz ultravioleta. Sondas de cidos nucleicos (DNA ou RNA marcados radioativamente) podem ser utilizadas para hibridar com o DNA fixado na membrana e a posio na qual a ligao especfica ocorrer pode ser detectada por autoradiografia da membrana (Figura. 31). O padro de hidridao pode ser comparado diretamente com a regio no gel original que contm a sequncia de DNA de interesse. Southern blotting uma tcnica to poderosa que permite que as informaes obtidas sejam utilizadas para a construo de um mapa de restrio de uma determinada parte do DNA clonado, por exemplo, para identificar a regio que contm o gene de interesse. Esta tcnica possibilita tambm que as sondas de cidos nucleicos sejam utilizadas para diagnsticos de distrbios genticos, ensaiando-se o DNA genmico dos indivduos afetados e de seus familiares.

53

Sonda de DNA marcada com P3 2

eletroforese

transferncia do DNA por blotting.

autoradiografia

gel de agarose

papel de nitrocelulose

autoradiograma

Figura 31. Southern blotting. Um fragmento de DNA especfico pode ser identificado separando-se a mistura de fragmentos por eletroforese, transferindo-se para nitrocelulose e hibridizando-se com uma sonda molecular complementar sequncia e marcada com 32P.

De modo anlogo, molculas de RNA tambm podem ser identificadas aps serem separadas por eletroforese, transferidas para nitrocelulose, sofrerem hibridao com sondas de DNA ou RNA. Esta tcnica de analisar RNA, por analogia ao Southern blotting, recebeu o nome de Northern blotting. Esta tcnica til como auxiliar na anlise de clones de cDNA porque, o tamanho do mRNA especfico pode ser comparado com o tamanho dos cDNAs clonados, revelando a integridade dos clones. Alm disto, esta tcnica permite indicar em qual tecido ou tipo celular um determinado gene expresso ou quais so os fatres que regulam a sua expresso.

4.4 Como os genes clonados so utilizados?

O clone de interesse pode ser explorado sob vrios aspectos. Ele pode ser sequenciado e comparado com outras sequncias j descritas, ser utilizado no estudo da expresso gnica do(s) gene(s) contido(s) no clone, ser alterado especificamente por mutagnese stio dirigida ou ser usado para gerar um produto de intersse comercial. Para isto quase sempre ser necessrio transferir o clone, ou parte deste para um vetor mais apropriado para atingir os objetivos desejados. Transferncia de parte do DNA clonado para um novo vetor conhecido como sub clonagem. Algumas destas aplicaes sero abordadas nos captulos seguintes.

4.5. Mapa de restrio54

O mapa de restrio do DNA clonado ou de pequenas molculas de DNAs de fagos, plasmdeos ou mitocondrias pode ser bastante til na caracterizao da molcula. Esta tcnica envolve a separao por eletroforese dos fragmentos de DNA obtidos aps digesto do DNA total com determinada enzima de restrio. A ordem dos fragmentos na molcula pode ser descoberta com o uso de outras enzimas de restrio, em duplas digestes e/ou por digestes sequenciais usando 2 enzimas. Assim cada fragmento obtido aps digesto com a enzima x removido do gel e submetido a digesto com a enzima y e vice-versa (Figura 32). Informaes sobre o mapa de restrio de um fragmento de DNA so utilizadas, por exemplo, para subclonar partes destes fragmento para o sequenciamento. O mapa de restrio do DNA mitocondrial vem sendo til na caracterizao de linhagens e/ou espcies de vrios organismos, auxiliando em estudos taxonmicos e evolutivos.

Figura 32. Mapa de restrio do DNA do fago para vrias endonucleases. As barrasverticais indicam os locais de clivagem de cada enzima e os nmeros no alto indicam o tamanho da molcula em unidades de 5000 pares de bases. Esta molcula possui no total 48502 pares de bases.

55

V. SEQENCIAMENTO DE DNA 5.1 Sequenciamento manual O mtodo de sequenciamento do DNA mais utilizado no momento foi desenvolvido por Sanger e colaboradores (1979), conhecido tambm como mtodo do trmino do crescimento da cadeia. O sequenciamento do DNA atravs deste mtodo, exige a clonagem do fragmento de DNA e de seus subfragmentos a serem sequenciados em vetores apropriados como os da srie M13mp os quais tem sido largamente utilizados para esta finalidade. O prncipio do mtodo baseia-se na capacidade da DNA polimerase copiar uma fita de DNA a partir do molde na presena de um iniciador. A reao de

sequenciamento consiste na hibridizao de um oligonucleotdeo sinttico (iniciador), com uma regio conhecida do vetor (M13), imediatamente adjacente ao inserto a ser sequenciado. A seguir, promove-se a sntese da fita complementar empregando o fragmento Klenow da DNA polimerase I e uma mistura de deoxinucleotdeos (dNTP), sendo um deles marcado com 32P ou 35S. No processo so realizadas quatro reaes independentes, sendo que em cada uma delas adicionado um tipo de dideoxinucleotdeo (ddNTP). Em cada reao, um nmero muito grande de molculas de fita complementar esto sendo copiadas simultaneamente. No entanto, em um dado momento da extenso, uma pequena porcentagem de molculas ir incorporar um ddNTP e neste caso a reao de alongamento da cadeia ser automaticamente interrompida naquele stio, devido ausncia do grupamento 3'OH do ddNTP. Por outro lado, em outras molculas a reao de extenso continua a ocorrer at que um ddNTP seja incorporado. Sendo assim, em cada uma das quatro reaes, haver fragmentos de todos os tamanhos sendo que todos eles tem incio comum ou seja adjacente ao iniciador. Uma vez terminadas as reaes de extenso, cada fragmento recm sintetizado separado em gel desnaturante de poliacrilamida-uria e a seguir autoradiografado. Como este tipo de gel tem alto poder de resoluo, possvel ento visualizar na autoradiografia cada um dos fragmentos sintetizados como uma banda especfica. Desta forma, possvel analizar de 200 a 300 nucleotdeos por gel (figura 33.).56

DNA Primer

ddATp

ddCTp

ddGTp

ddTTp

A

C

G

T

Leitura

CGACTGACTAGTG Sequncia obtida

Figura 33. Sequenciamento de nucleotdeos pelo mtodo do trmino do crescimento da cadeia.

5.2 Sequenciamento automtico

A utilizao de sequenciadores automticos essencial quando deseja-se realizar sequenciamneto em larga escala, como por exemplo em projetos genoma. O desenvolvimento e utilizao de sequenciadores automticos torna mais efeciente e rpido o sequenciamento de DNA na medida em que as etapas de leitura do gel e o processamento de sequncias so realizadas atravs de computadores. A reao de sequenciamento realizada atravs do mtodo de Sanger (1979), do mesmo modo que no sequenciamento manual. Entretanto, no sequenciamento automtico os nucleotdeos esto marcados com fluorocromos ao invs de istopos radioativos. Quatro diferentes fluorocromos so empregados e uma vez excitados por um feixe de laser emitem luz em57

diferentes comprimentos de onda.

possvel marcar com estes fluorocromos o

primer universal M13 ou ento cada um dos dideoxinucleotdeos (terminadores). Assim, uma vez que em cada uma das reaes (A, T, C, G) foi empregado um fluorocromo diferente possvel juntar estes produtos e realizar a corrida em uma nica raia do gel de sequenciamento. Os produtos da reao de sequenciamento, marcados com os fluorocromos, ao serem submetidos a eletroforese passam pelo feixe de laser, que promove a excitao dos fluorocromos. A luz emitida pelos fluorocromos

detectada por um fotomultiplicador e a informao processada atravs de um computador (Figura 34). VI. REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) A reao em cadeia da polimerase (PCR, Polymerase Chain Reaction), foi idealizada em meados de 1980 e totalmente descrita em 1987. A maior aplicao desta metodologia a possibilidade de se amplificar uma determinada sequncia do DNA sem a necessidade do uso das tradicionais tcnicas de clonagem molecular. Uma simples cpia de um gene especfico dentro de um genoma pode ser amplificado para alguns microgramas, partindo-se de quantidades mnimas como sub picogramas de DNA total. A condio bsica para a aplicao da tcnica, depende da construo de oligonucleotdeos (iniciadores) os quais so complementares as duas fitas opostas do DNA e que estejam flanqueando a sequncia a ser amplificada. O processo inicia-se com a desnaturao da dupla fita do DNA que contm a sequncia a ser amplificada. Geralmente, a desnaturao realizada a uma temperatura de 94C durante 5 minutos, onde nesta temperatura as duas fitas do DNA separam-se. O passo seguinte, consiste em abaixar a temperatura para nveis ao redor de 35 C, permitindo que os oligonucleotdeos iniciadores anelem-se especificamente nas extremidades flanqueadas da sequncia alvo e nas fitas opostas. Finalmente, a temperatura elevada para aproximadamente 72C e com isto a polimerase copia a sequncia