Artigos Originais Abordagem citogenética e molecular em ... · resultados seguros na detecção de alterações cromossômicas numéricas e na determinação do sexo fetal. PALAVRAS-CHAVE:

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Rev Bras Ginecol Obstet. 2005; 27(9): 554-60

Artigos Originais

RESUMOObjetivos: avaliar o desempenho da citogenética e das técnicas de hibridização in situ fluorescente (FISH) e reação emcadeia da polimerase (PCR) no estudo das aneuploidias cromossômicas numéricas e na determinação do sexo fetal emamostras de abortos espontâneos. Métodos: duzentos e dezenove amostras de produtos de abortos espontâneos foramsubmetidas a estudo citogenético. Deste total, 40 amostras foram também submetidas à técnica de PCR-nested para adeterminação do sexo fetal: 32 foram selecionadas devido à falha de crescimento no estudo citogenético e oito foramescolhidas ao acaso. Vinte amostras foram selecionadas para detecção de aneuploidias cromossômicas pela técnica deFISH, utilizando-se sondas para os cromossomos 13, 18, 21, X e Y: 13 casos foram submetidos a FISH devido à falha decrescimento no estudo citogenético e sete foram escolhidos ao acaso. Foi calculada a taxa de sucesso (obtenção decariótipo) de cada técnica. Para comparação das taxas de sucesso foi utilizado o teste de χ2, sendo considerados significantesresultados com p<0,05. Foi avaliado o índice de acerto entre os resultados das amostras submetidas a mais de um exame,tomando-se como padrão-ouro o resultado do estudo citogenético. Resultados: houve crescimento celular em 84,9% dasamostras submetidas a análise citogenética. Em 51,1% dos casos foram encontradas alterações cromossômicas: 65,2%trissomias, 17,9% triploidias, 9,4% tetraploidias, 4,2% monossomia do cromossomo X e 1,1% trissomia dupla, tetrassomia ealteração estrutural. A trissomia mais freqüente foi a do cromossomo 16 (39%). FISH e PCR tiveram taxa de sucesso de 90%,não diferindo significativamente do exame citogenético. Em todos os casos submetidos a mais de um exame os resultadosforam concordantes. Nas amostras com falha de crescimento celular no exame citogenético e submetidas a outra técnica, aPCR obteve sucesso em 87,5% e a FISH em 84,6%. Conclusão: o estudo citogenético de restos ovulares de abortamentosespontâneos teve elevada taxa de sucesso e evidenciou anomalias cromossômicas em mais da metade dos casos. Astécnicas de biologia molecular (PCR–nested e FISH) complementaram o estudo citogenético e permitiram a obtenção deresultados seguros na detecção de alterações cromossômicas numéricas e na determinação do sexo fetal.

PALAVRAS-CHAVE: Aborto espontâneo/genética; Citogenética/métodos; Fluorescência em hibridização in situ; Reaçãoem cadeia da polimerase

ABSTRACTPurpose: to evaluate the performance of cytogenetic analysis, fluorescent in situ hybridization (FISH) and polymerasechain reaction (PCR) in the study of numerical chromosomal anomalies and in fetal sex determination of spontaneousabortion material. Methods: cytogenetic analysis was performed on 219 spontaneous abortion specimens. Forty of thesecases were also submitted to fetal sex determination using nested-PCR. Thirty-two of these cases were selected due to failedcytogenetic culture and the other eight were selected randomly. Twenty samples were submitted to the FISH technique,using probes for chromosomes 13, 18, 21, X and Y. Thirteen of these samples were selected due to failed cytogenetic cultureand the other seven were randomly selected. The success rates of each technique were compared using the χ2 test and an

Abordagem citogenética e molecular em material de abortos espontâneosCytogenetic and molecular evaluation of spontaneous abortion samples

Andréa Cristina de Moraes1, Antônio Fernandes Moron2, Elza Midori Hashimoto3,Ismael Dale Cotrin Guerreiro da Silva4, Maria Regina Torloni5,

Márcia Marcelino de Souza6, Francy Reis da Silva Patrício7

1 Bióloga, Diretora do Centro Paulista de Medicina Fetal (Laboratório de Citogenética), São Paulo; Aluna de pós-graduação do Departamento de Patologiada Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP - São Paulo (SP) - Brasil.

2 Médico, Diretor do Centro Paulista de Medicina Fetal, São Paulo, Chefe da Disciplina de Medicina Fetal, Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP- São Paulo (SP) - Brasil.

3 Bióloga, Diretora do Centro Paulista de Medicina Fetal (Laboratório de Citogenética), São Paulo4 Médico, Laboratório de Biologia Molecular do Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP - São Paulo (SP) - Brasil.5 Médica, Disciplina de Medicina Fetal da Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP - São Paulo (SP) - Brasil.6 Médica, Departamento de Patologia da Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP - São Paulo (SP) - Brasil.7 Médica, Professor Adjunto do Departamento de Patologia da Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP - São Paulo (SP) - Brasil.Correspondência: Andréa Cristina de MoraesRua: Estado de Israel, 847, ap 83 – Vila Clementino – 04022-002 - São Paulo-SP – Telefone: 11- 5084-7443 / 5572-4449 ramal 104/ 9599-1861 –e-mail: [email protected]

Recebido em: 10/2/2005 Aceito com modificações em: 14/9/2005

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IntroduçãoNos últimos 45 anos a citogenética huma-

na vem despontando como importante método nodiagnóstico de diversas doenças e também comomais um recurso de medicina preventiva, graçasao surgimento do aconselhamento genético. Esti-ma-se que as anomalias cromossômicas sejamresponsáveis por mais de 60 síndromesidentificáveis, sendo mais comuns que todos osdistúrbios monogênicos juntos1. As anomalias cro-mossômicas afetam 0,7% dos nascidos vivos, 2%das gestações em mulheres com mais de 35 anose estão presentes em 50% dos abortos espontâne-os do primeiro trimestre1.

O abortamento espontâneo é fenômeno co-mum que compromete 15 a 20% das gestações2.Estima-se que existam anomalias cromossômicasem aproximadamente metade das perdas fetaisocorridas entre a 8a e a 15a semana3.

Até a década de 60, a investigação das per-das fetais limitava-se ao estudo clínico e anato-mopatológico. O advento da citogenética possibili-tou a investigação de possíveis anomalias cromos-sômicas nesses casos.

Graças ao método de cultura direta desen-volvido por Simoni et al. (1983)4, o estudocitogenético passou a ser realizado rotineiramentepela maioria dos laboratórios de citogenética, po-rém o resultado demorava 30 a 40 dias. Osurgimento da cultura semidireta em 1990, umamodificação do método original, reduziu os custosdo exame e o prazo para obtenção de resultados,atualmente disponíveis em 24 a 48 horas.

Diversos estudos5,6 apontam a importânciado estudo citogenético dos restos ovulares e suge-rem que antes de os ginecologistas submeteremum casal que teve abortos a uma série de examescomplementares sofisticados para investigar pos-síveis causas de perdas, seria fundamental anali-sar o cariótipo dos abortos em questão.

A literatura reforça a importância do estudocitogenético em material de restos ovulares, evi-denciando anomalias cromossômicas em metadedos casos7-9. Porém, em até 40% das culturas deabortos não ocorre crescimento celular, provavel-mente devido à degeneração das vilosidadescoriônicas10. A obtenção de tecido viável é essen-cial para a análise cromossômica. Portanto, pre-coniza-se a obtenção da amostra (vilosidadecoriônica ou pele fetal) imediatamente após o di-agnóstico da morte embrionária ou fetal, não seultrapassando sete dias dessa data10. Infelizmen-te, nem sempre essas condições ideais existemna prática médica.

Quando ocorre falha de crescimento celularem material de abortamento, é possível tentar aobtenção do cariótipo por meio de técnicas de bio-logia molecular. Nos últimos anos, com os avan-ços do conhecimento e tecnologias nessa área, astécnicas de hibridização in situ fluorescente (FISH)e reação em cadeia da polimerase (PCR)-nested es-tão sendo utilizadas em associação à análisecitogenética no diagnóstico pré-natal e de abor-tos. Esses procedimentos aumentaram conside-ravelmente o nível de sensibilidade na detecçãodas aberrações cromossômicas, criando-se novaárea de estudo denominada “citogenéticamolecular”.

O uso dessas técnicas complementares se-ria importante especialmente nos casos de falhade crescimento celular em abortamentos com altorisco para cromossomopatias, por exemplo, emcasais com antecedentes familiares de aneuploi-dias ou doenças gênicas ligadas ao X ou naquelescasos em que o ultra-som obstétrico evidencioufeto hidrópico ou com anomalias estruturais.

Uma segunda vantagem dessas técnicascomplementares seria a obtenção de diagnósticorápido das aberrações cromossômicas numéricase das doenças ligadas ao sexo. Enquanto o estudocitogenético tradicional requer em média 20 diaspara ser concluído, os resultados da FISH e da PCRtornam-se disponíveis em 24 a 48 horas. Apesar

established p<0.05 level of significance. The results of samples submitted to more than one test were evaluated for accuracy,using the cytogenetic result as the gold standard. Results: cytogenetic analysis was successful in 84.9% of the samplesand in 51.1% of them the results were abnormal: 65.2% trisomy, 17.9% triploidy, 9.4% tetraploidy, 4.2% chromosome Xmonosomy, and 1.1% each for double trisomy, tetrasomy and structural abnormality. The most frequent trisomy was that ofchromosome 16 (39%). The success rate of FISH and PCR techniques (90%) did nod differ significantly from the cytogeneticanalysis. In all cases submitted to more than one test, the results were identical to those obtained through cytogeneticanalysis. Samples that failed to grow on cytogenetic test and that were submitted to other techniques of molecular biologyhad a success rate of 87.5 and 84.6% for PCR and FISH, respectively. Conclusion: cytogenetic analysis of spontaneousabortions had a high success rate and chromosomal anomalies were identified in over half of the cases. Molecular biologytechniques (PCR and FISH) complemented the cytogenetic study and proved to be reliable in the detection of numericalchromosomal anomalies and in fetal sex determination.

KEYWORDS: Abortion, spontaneous/genetics; Cytogenetics/methods; In situ hybridization, fluorescence; Polymerasechain reaction


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de teoricamente não existir urgência na obten-ção do resultado após um abortamento, a rapidezdos resultados pode auxiliar a reduzir a ansiedadedo casal.

Uma desvantagem dos exames de biologiamolecular seria seu alto custo, além de não per-mitirem a detecção de anomalias cromossômicasestruturais ou mosaicismo.

Em nosso meio, apesar de existirem algunstrabalhos a respeito do estudo citogenético de res-tos ovulares11,12, não encontramos publicaçõesrelatando o uso de técnicas de biologia molecularno estudo de casos de abortamento.

Movidos pela escassez de dados nacionais,decidimos analisar nossa experiência com o usodas técnicas atualmente disponíveis para análisegenética de restos ovulares.

O objetivo deste estudo foi avaliar o desem-penho da citogenética, da FISH e da PCR no estu-do de restos ovulares de abortos espontâneos. Es-pecificamente, avaliamos a taxa de sucesso decada um dos três métodos na obtenção de resulta-dos (cariótipo) e seu grau de concordância, noscasos submetidos a mais de um método. Um obje-tivo secundário foi avaliar a freqüência e a distri-buição de alterações cromossômicas em casos deabortamento espontâneo.

MétodosEste foi estudo retrospectivo que incluiu to-

das as amostras consecutivas (n=219) de abortosespontâneos (com idade gestacional de até 20 se-manas) provenientes do Hospital São Paulo e daMaternidade Santa Joana e enviadas ao CentroPaulista de Medicina Fetal entre janeiro de 2001e janeiro de 2002. O trabalho foi aprovado peloComitê de Ética da UNIFESP/Hospital São Paulo.

A idade das 219 pacientes variou de 18 a 44anos, com média de 31,7 anos (±6,2 anos, desvio-padrão). A idade gestacional média informada foide 10 semanas ±4,5 semanas. As 219 amostrasforam submetidas ao estudo citogenético e 40 de-las foram selecionadas para complementaçãodiagnóstica com biologia molecular (20 por PCR eFISH e 20 só por PCR).

Todos os 40 casos submetidos ao estudo com-plementar eram de alto risco, apresentando pelomenos um dos seguintes: história de aborto derepetição, história familiar de anomalias cromos-sômicas ou doenças gênicas ligadas ao X, ou ano-malias ultra-sonográficas sugestivas decromossomopatias.

Todos os casos sem crescimento celular noexame citogenético (n=33) foram submetidos aoestudo complementar, sendo 20 submetidos a PCR

e 13 submetidos a FISH e PCR. Entre os casos comcrescimento celular no exame citogenético, oitoforam selecionados aleatoriamente para seremsubmetidos também a técnicas moleculares.

Em todos os 219 casos, também foi realizadoo estudo histológico dos restos ovulares, a partirde uma segunda amostra do material de abortofixada em formol. Esta amostra foi processada (mé-dia de três lâminas por caso), corada comhematoxilina-eosina e analisada pelo patologistade forma habitual (avaliação histológica devilosidades, cordão, membranas, trofoblasto, fetoou embrião e alterações adaptativas deciduais),para determinar a provável época de ocorrênciado óbito embrionário13, dado este que foi utilizadono esclarecimento da possível causa da falha doestudo citogenético.

CitogenéticaOs restos ovulares foram encaminhados

para estudo citogenético em frasco estéril com 10mL de soro fisiológico ou meio de cultura 199. Otempo entre a coleta do material e o envio ao labo-ratório não excedeu 48 horas e durante esse perí-odo o material foi mantido refrigerado a 4oC.

O material de aborto ocorrido entre a 5a e a13a semana gestacional foi inicialmente submeti-do à cultura semidireta de vilosidade coriônica (cul-tura de 48 a 92 horas). Caso não ocorresse cresci-mento celular dentro desse prazo, o material erasubmetido a cultura prolongada (cultura de 20 a 30dias). Acima da 14a semana gestacional era sem-pre realizada a cultura prolongada. Nesta técnica,o material é inicialmente deixado em solução detripsina por 30 minutos e depois semeado em cul-tura, obtendo-se o crescimento celular dentro de20 a 30 dias. Foram analisadas de 10 a 20 metáfasesem dois microscópios (BX 40 - Olympus e Aristoplan– Leica Leitz® com objetiva de 100X), sendo a maisrepresentativa capturada para a análisecomputadorizada pelo sistema Leica Chantal®.

FISHA técnica de FISH foi desenvolvida de acordo

com os trabalhos de Eiben et al.14 e Jobanputra etal.15,16 e padronizada com algumas modificaçõesdo kit da marca Cytocell.

Nos casos sem crescimento celular no es-tudo citogenético, naqueles com história de abor-tamento de repetição ou naqueles com suspeitaultra-sonográfica de cromossomopatias, as lâmi-nas foram descoloridas em três séries crescentesde álcoois: 70, 85 e 90%, e posteriormente iniciou-se o pré-tratamento.

Após pré-tratamento, hibridização por 16 a18 horas com as sondas dos cromossomos 13, 18,21 X e Y e lavagem das lâminas pós-hibridização,elas foram coradas com 15 μL de 4’6’-diamino-2’-

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fenilindol (azul – DAPI) ou iodeto de propídio (PI),cobertas com lamínula e vedadas com esmalte.

A lâmina foi deixada no escuro por 30 minu-tos antes de ser analisada no microscópio defluorescência Aristoplan – Leica Leitz®, equipadocom filtros individuais para FITC (fluorocromoisotiocionato de fluoresceína [480-525 nm], DAPIe PI. Foram examinados de 100 a 150 núcleos e asimagens digitalizadas foram analisadas pelosoftware Q-FISH da Leica Image®.

PCRFoi utilizada a técnica de PCR-nested, que

possui duas etapas de amplificação, utilizando-sede dois pares de primers por etapa. Foramamplificadas simultaneamente a região homólogados cromossomos X e Y para a determinação dosexo fetal. O fragmento do cromossomo X serviucomo controle interno, e o sucesso da amplifica-ção dependeu da amplificação específica do frag-mento do cromossomo Y17.

A extração de DNA do material de aborto es-pontâneo e a técnica de PCR-nested foram padroni-zadas no Laboratório Experimental de BiologiaMolecular do Departamento de Ginecologia da Es-cola Paulista de Medicina da Universidade Federalde São Paulo. Foi usado o kit de extração MiniprepSystem da GIBCO, com algumas adaptações.

Na PCR-nested foram realizadas algumasmodificações na ciclagem proposta por Schaaff etal.17 e Lim et al.18. Enquanto estes autores reali-zaram 25 ciclos na primeira etapa e 30 ciclos nasegunda etapa da PCR, no presente estudo foramutilizados 35 ciclos e 40 ciclos. Esta adaptação foinecessária porque o numero de cópias de seqüên-cia de DNA produzida com 25 a 30 ciclos foi muitopequeno. O número de ciclos foi gradualmenteaumentado e com 35 ciclos na primeira etapa e40 ciclos na segunda etapa foi possível visualizare amplificar os genes estudados. Os primers utili-zados para determinação do sexo fetal foram os dogene da amelogenina localizado no cromossomo X(AMGX) para a primeira etapa da PCR-nested, sen-do que a seqüência do primer 1-AMG 3 era 5’-CTTCCCAGTTTAAGCTCTGATG–3’ e do primer 2-AMG 4 era 5’-CCTTGCTCATATTATACTTGAC–3’.

Na segunda etapa foram utilizados os primers3 e 415 do pseudogene da amelogenina localizadono cromossomo Y (AMGY). Suas seqüências eramprimer 3-AMG 5: 5’-CTCAGGGAGGTTCCATGA–3’ eprimer 4-AMG 6: 5’- TGAGAAAACCAGGGTTCC- 3’.

Para visualização do resultado final, foi uti-lizado gel de agarose 2%, corado com brometo deetídeo, e o produto final da PCR foi aplicado nestegel (20 μL). Nos poços das extremidades do gel fo-ram aplicados 7 μL do padrão de pares de bases ecolocou-se para correr em cuba de eletroforese aaproximadamente 90 volts. O gel foi fotografado

pelo sistema Kodak®.Foram avaliadas as taxas de sucesso (obten-

ção de cariótipo) e falha (impossibilidade de obten-ção de cariótipo) de cada uma das técnicas(citogenética, FISH e PCR). A taxa de sucesso decada método foi calculada dividindo-se o númerode amostras em que foi possível determinar ocariótipo pelo número total de amostras submeti-das ao exame, multiplicando-se o resultado porcem. Diferenças entre as taxas de sucesso dosdiversos métodos foram comparadas por meio doteste do χ2, sendo consideradas significantes dife-renças com p<0,05. Foi também avaliada a con-cordância dos resultados das amostras submeti-das a mais de uma técnica. Foram comparados osresultados das amostras submetidas a mais de umexame, sendo o resultado do estudo citogenéticoconsiderado como padrão-ouro.

ResultadosA Figura 1 apresenta os tipos de exames a

que foram submetidas as 219 amostras de restosovulares de abortos espontâneos. O crescimentocelular e conseqüentemente a determinação docariótipo foi possível em 186 das 219 amostrassubmetidas ao exame citogenético, o que repre-sentou uma taxa de sucesso deste exame de 84,9%(186/219). Em todos os 33 casos em que não hou-ve crescimento celular, o estudo anatomopatoló-gico confirmou a retenção do concepto por maisde sete dias após seu óbito. Dentre as 33 amos-tras sem crescimento, em 1 não havia materialsuficiente para extração de DNA e as outras 32foram submetidas a PCR. Houve sucesso (ampli-ficação na PCR) em 28 desses casos, resultandoportanto em taxa de sucesso de 87,5% (28/32) nasamostras com falha de crescimento celular noexame citogenético. Treze das 33 amostras semcrescimento no exame citogenético foram tambémsubmetidas a FISH e ocorreu hibridização em 11desses casos. Portanto, a taxa de sucesso da FISHnas amostras com falha de crescimento celularno exame citogenético foi de 84,6% (11/13).

Exame citogenético 219

Crescimento 186

FISH7

PCR8

FISH13

PCR32

Sem crescimento 33

sucesso* 7 sucesso* 8sucesso 11 insucesso 2 sucesso 28 insucesso 4

*Sucesso com FISH: hibridização, sucesso com PCR: amplificação. FISH = hibridizaçãoin situ fluorescente; PCR = reação em cadeia da polimerase.

Figura 1 - Seqüência de exames a que foram submetidas 219 amostras de restos ovulares.



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A PCR foi também usada em oito casos emque houve crescimento no estudo citogenético eem todos ocorreu amplificação. Avaliando o desem-penho geral da PCR, observamos que das 40 amos-tras de restos ovulares submetidas ao exame, hou-ve amplificação em 36, o que resultou em taxa desucesso total de 90% (36/40). Nas 36 amostras comamplificação, o sexo foi apontado como feminino(presença de um único fragmento de 323 pb) em65% e masculino (dois fragmentos amplificados de323 pb e 142 pb) em 35%. Houve concordância noresultado do sexo fetal nas oito amostras subme-tidas tanto ao estudo citogenético como à PCR.

A FISH foi também usada em sete casos emque houve crescimento no exame citogenético, eem todos os casos os resultados foram concordan-tes. Avaliando o desempenho geral da FISH, obser-vamos que dos 20 casos submetidos ao exame,em 18 ocorreu hibridização, resultando portanto emtaxa de sucesso geral de 90% (18/20). Nas 18 amos-tras com hibridização, o cariótipo foi normal em 14e anormal em quatro: dois casos de trissomias, umde triploidia e um de monossomia do X.

As taxas de sucesso geral dos três métodos,84,5% no estudo citogenético, 90% com FISH e 90%com PCR (Tabela 1), não apresentaram diferençasestatisticamente significantes (p = 0, 41 e 0,39,comparando FISH e PCR com o estudo citogenético).

Tabela 1 - Desempenho de três métodos na obtenção de cariótipos em material deaborto espontâneo.

Sucesso*Método n (%) pCitogenética 186/219 (84,9) –FISH 18/20 (90,0) 0,41PCR 36/40 (90,0) 0,39*Crescimento no estudo citogenético, hibridização na FISH, amplificação na PCR. FISH= hibridização in situ fluorescente; PCR = reação em cadeia da polimerase.

Figura 2 - Cariótipos representativos das alterações cromossômicas mais freqüentesnos abortos espontâneos. A: cariótipo representativo de trissomia do cromossomo 16(47,XY+16); B: cariótipo representativo de trissomia do cromossomo 22 (47,XY,+22); C:cariótipo representativo de trissomia do cromossomo 15 (47,XY,+15); D: cariótiporepresentativo de triploidia (69,XXY).

Tabela 2 - Distribuição das alterações cromossômicas encontradas em 95 casos deabortamento com cariótipos anormais no estudo citogenético.

Tipo de alteração n (%)Trissomias 62 65,2*Triploidia 17 17,9*Tetraploidia 9 9,4Monossomia X 4 4,2Trissomia dupla 1 1,1Tetrassomia 15 1 1,1Alteração estrutural 1 1,1* Mostradas na Figura 2.

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A Tabela 2 apresenta as anomalias cromos-sômicas específicas detectadas pelo estudocitogenético. As trissomias mais freqüentes foramas do cromossomo 16 (39%), do 22 (21%) e do 15(9%) (Figura 2A, B, C, D).

DiscussãoUtilizando técnica de cultura semidireta de

vilosidade coriônica obtivemos ótimo índice decrescimento celular (84,9%), comparável aos daliteratura, que se situam entre 71 e 80,2%5. Emtodos os nossos casos de falha de cultura celular,o exame histológico apontava que o óbito tinhaocorrido há mais de sete dias.

O estudo citogenético evidenciou que empraticamente metade dos casos de abortamentoespontâneo existiam anomalias cromossômicas,sendo 68% de aneuploidia, 26% de euploidia e 1%de alteração estrutural. Kalousek2,5 observouaneuploidia em 67% dos seus casos de aborto eeuploidia em 23%.

Diversos trabalhos indicam que astrissomias mais freqüentes em restos ovulares sãoas dos cromossomos 16, 22, 13 e 215,11,19. Obtive-mos resultados semelhantes, com predomínio datrissomia do cromossomo 16 (39%), seguida pelado cromossomo 22 (21%), do 15 (9%) e doscromossomos 21, 13 e 18 (7% cada uma). A fre-qüência relativamente baixa de trissomias duplase tetrassomias obtida em nosso material foi se-melhante aos 0,21 a 2,6% observados por outrosautores5,20 que estudaram perdas fetais. A inci-dência de 4,2% de monossomia do cromossomo Xcontrasta com a média de 10% observados por ou-tros autores5,10,11,19. Essa diferença pode ser decor-rente dos diferentes métodos de cultura(semidireto e longa duração). Nas culturas de lon-ga duração, segundo alguns autores12,19, amonossomia do cromossomo X pode ser mais bemvisualizada. Outro fator relevante seria a idade daspacientes. Enquanto a idade média de nossas pa-cientes com monossomia do X foi de 33 anos, asde Ohno et al.21 tinham 29 anos.

Nas últimas décadas a biologia molecularvem despontando como nova frente de investiga-ção. Esses procedimentos têm mostrado importan-tes aplicações em especialidades médicas comoneurologia, oftalmologia, ginecologia, obstetríciae medicina fetal. A FISH permite visualizar se-qüências específicas de ácidos nucléicos em pre-parações celulares, material fixado em parafina,tumores, embriões e blastômeros. Por ser métodorápido e seguro para detectar aneuploidias, atual-

mente a FISH tem sido cada vez mais utilizadacomo auxiliar da citogenética em diagnóstico pré-natal e nos casos de aborto espontâneo. As sondascentroméricas habitualmente utilizadas são as doscromossomos 13, 18, 21, 16, 22, 15, X e Y14,15.

Neste estudo, 13 casos com falha de culturaforam submetidos a FISH e em 11 (84,6%) ahibridização teve sucesso, permitindo a identifi-cação de anomalias cromossômicas em três amos-tras. Estes achados evidenciam a importância dautilização dessa técnica complementar nos casosde falha de cultura, especialmente nos casos dealto risco, conforme recomendado na literatu-ra12,14,21.

Uma das limitações da FISH é sua incapaci-dade de detectar anomalias estruturais oumosaicismo, porém esses achados são bastanteraros nos casos de abortamento. Um segundo in-conveniente da FISH é seu custo de 75 a 240 dóla-res, que, somado ao custo do estudo citogenéticoconvencional (30 a 80 dólares), limitaria a suautilização. Preocupados com esses custos, alguns20

sugeriram que a FISH só deveria ser oferecida emcasos selecionados de abortos espontâneos, comopor exemplo diante de suspeita clínica de molahidatiforme22.

Enquanto utilizamos a FISH em restosovulares a fresco, a maioria dos trabalhos empre-ga material incluído em bloco de parafina20,22, oque dificulta a comparação dos resultados. Utili-zando sondas centroméricas dos cromossomos 1,16, 18 X e Y em 18 amostras de abortos fixados emparafina, Van Lijnschoten et al.20 concluíram que,embora a qualidade do material a fresco seja supe-rior, a FISH pode ser empregada em estudo dematerial de aborto já processado.

A aplicação da técnica de FISH pode tambémauxiliar nos casos de mola hidatiforme22. Em nos-so estudo tivemos um caso com suspeita clínicade mola hidatiforme, cujo resultado anatomopato-lógico foi mola parcial; a PCR evidenciou sexomasculino e a FISH, três sinais para o cromosso-mo 18, dois para o cromossomo X e um para o cro-mossomo Y. O resultado citogenético confirmou apresença do cariótipo triplóide (69, XXY).

A técnica de PCR tem a vantagem de rapi-damente permitir a amplificação enzimática deuma pequena seqüência de DNA e a desvantagemde ser necessário ter o conhecimento prévio daseqüência que se pretende estudar. Realizamos aPCR em duas etapas, por isso denominada PCR-nested, na qual trabalhamos com dois pares deoligonucleotídeos, um que corresponde ao geneAMGX da amelogenina localizado no cromossomoX e o outro ao pseudogene da amelogenina locali-zado no cromossomo Y.



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A taxa de sucesso da PCR em amostras comfalha de crescimento foi elevada (28/32, 87,5%).Não encontramos na literatura trabalhos que ava-liassem o sexo fetal em material de aborto usandoa PCR-nested.

Em conclusão, este estudo evidenciou queem 80-90% das amostras de abortamentos espon-tâneo encaminhadas, foi possível determinar-seo cariótipo por meio do estudo citogenético, da FISHe da PCR. As técnicas de FISH e PCR foram impor-tantes nos casos sem resultado no estudocitogenético (devido à falha de crescimento celu-lar): permitiram a obtenção de resultado em maisde 80% desses casos. A concordância dos resulta-dos entre os três exames reforça o valor econfiabilidade das técnicas de biologia molecularcomo auxiliares da citogenética para o estudo docariótipo em material de abortamento. Assim comoapontado na literatura, a taxa de anomalias cro-mossômicas em casos de abortamentos espontâ-neos é elevada em nosso meio.

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Moraes AC, Moron AF, Hashimoto EM, Silva IDCG, Torloni MR, Souza MM, Patrício FRS

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