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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA E CONSERVAÇÃO
ASPECTOS DA CAPACIDADE VETORIAL E PERFIL DE
SUSCEPTIBILIDADE AO TEMEPHÓS DE POPULAÇÕES DE AEDES
AEGYPTI (DIPTERA: CULICIDAE) DE DIFERE�TES REGIÕES DO
ESTADO DE SERGIPE, BRASIL
Letícia Silva Marteis
Mestrado Acadêmico
SÃO CRISTÓVÃO
SERGIPE – BRASIL
2012
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
Marteis, Letícia Silva
M375a Aspectos da capacidade vetorial e perfil de suscetibilidade ao temephós de populações de Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) de diferentes regiões do estado de Sergipe, Brasil / Letícia Silva Marteis. – São Cristóvão, 2012.
81 f.; il.
Dissertação (Mestrado em Ecologia) – Programa de Pós-Graduação em Ecologia e Conservação, Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa, Universidade Federal de Sergipe, 2012.
O Orientadora: Profª. Drª. Roseli La Corte dos Santos
1. Saúde pública. 2. Aedes aegypti - controle. 3. Aedes aegypti – comportamento 4. Organofosforado temephós. 4. Sergipe. I. Título CDU: 595.77:614
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA E CONSERVAÇÃO
MESTRADO EM ECOLOGIA E CONSERVAÇÃO
LETÍCIA SILVA MARTEIS
ASPECTOS DA CAPACIDADE VETORIAL E PERFIL DE
SUSCEPTIBILIDADE AO TEMEPHÓS DE POPULAÇÕES DE AEDES
AEGYPTI (DIPTERA: CULICIDAE) DE DIFERE�TES REGIÕES DO
ESTADO DE SERGIPE, BRASIL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ecologia e Conservação da
Universidade Federal de Sergipe, como requisito
parcial para obtenção do título de Mestre em
Ecologia.
Orientadora: Profa. Dra. Roseli La Corte dos Santos.
SÃO CRISTÓVÃO
SERGIPE – BRASIL
2012
Aos meus pais, Lourdes e Dernival, que são o
combustível que me move em busca de lhes
proporcionar dias melhores.
AGRADECIME�TOS
Agradeço a Jeová Deus pela vida, por ter me dado equilíbrio e paz nos momentos
de maior desengano e por ter colocado em minha vida pessoas maravilhosas, às quais
expresso minha sincera gratidão, pois sem elas a realização deste trabalho não seria possível.
Assim, agradeço à professora Roseli La Corte por ter me orientado em mais essa
etapa e por fazê-lo com muita dedicação, carinho e competência. Agradeço pela confiança,
pelo apoio e por contribuir para meu crescimento científico.
Aos professores do Núcleo de Pós-Graduação em Ecologia e Conservação pelo
conhecimento e experiência transmitidos nas aulas teóricas e práticas, por me fazer ainda mais
encantada pela ecologia de vetores, e pelas sugestões para a realização deste trabalho, em
especial ao professor Leandro Souto que muito tem contribuído para este estudo desde a etapa
do projeto inicial.
Ao professor Lincoln Suesdek pela paciência, pela colaboração no estudo da
morfometria geométrica e pela disponibilidade em participar da minha banca examinadora.
À professora Luciene Barbosa pelo apoio durante meu tirocínio docente e por
sempre me dar a certeza de que no final tudo dá certo, e ao professor Silvio Dolabella pela
disposição em ajudar quando surgiam dúvidas nos experimentos.
Aos amigos do Laboratório de Parasitologia Liz, Lynna, Jonathas, Juci, Thales,
Helaina, Ranna, Grazi, Dani, Danilo, Túllio, Andrea, Juliana, Jordão, Pati e Márcio, que além
de me ajudarem nas atividades de campo, na manutenção das colônias no insetário e nos
experimentos, ainda me proporcionaram um ambiente de trabalho agradável e descontraído.
Aos amigos das turmas 2010/1 e 2010/2 do Mestrado, pelo companheirismo e
carinho, e por partilhamos uns com os outros a alegria das aulas de campo, o desespero diante
dos prazos se encerrando e a tão necessária prática do desapego.
Aos amigos do Colégio Estadual Edelzio Vieira de Melo pela convivência
agradável e a forma carinhosa como sempre me trataram, especialmente ao diretor Almir
Pinto, pelo incentivo e apoio para que eu conciliasse o trabalho com meus estudos.
À Juliana, secretária do NPEC, pela constante disposição em ajudar diante das
minhas constantes dúvidas.
À Secretaria Estadual de Saúde de Sergipe e Secretarias Municipais de Saúde das
cidades onde coletamos as amostras pelo auxílio no processo de instalação das armadilhas.
Ao Centro Meteorológico de Sergipe (CEMESE) pelo fornecimento de dados
climáticos dos municípios estudados.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela
concessão da bolsa de Mestrado.
À minha família (meus pais Lourdes e Dernival, meus irmãos Rodson e Everton e
meus sobrinhos), meu maior tesouro, por compreender minha ausência, pelo apoio, pela
torcida e pelo orgulho que sente de mim.
A Del e Dena, que são pais para mim, sempre muito atenciosos comigo, obrigada
pelo cuidado amoroso, pela força e incentivo.
A Albert, pelo amor a mim dedicado nos últimos três anos, por sonhar os mesmos
sonhos e acompanhar de perto cada conquista minha, por acreditar em minha capacidade mais
que eu mesma e pelos inúmeros finais de semana que passou comigo contanto larvas e pupas
de mosquito no insetário. Obrigada! Esse mestrado também é seu!
Meus sinceros agradecimentos a todos os amigos, inclusive aos não citados, que
de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho!
RESUMO
Estudos da ecologia de populações de Aedes aegypti são fundamentais para se conhecer o
comportamento e as adaptações apresentadas pela espécie de acordo com o ambiente em que
vivem e que se evidenciaram durante o processo evolutivo em função das diferentes pressões
seletivas que as espécies enfrentam em seu ambiente de origem. Assim, este estudo teve como
objetivo avaliar aspectos da capacidade vetorial e a resistência ao organofosforado temephós
de populações de Ae. aegypti provenientes de diferentes regiões do estado de Sergipe. Além
da razão de resistência das populações ao larvicida, os parâmetros de desenvolvimento e
reprodutivos observados foram duração do período imaturo, quantidade de pupas formadas e
de adultos que emergiram, razão sexual, sobrevivência dos adultos em diferentes condições de
alimentação, fecundidade das fêmeas, fertilidade dos ovos sob estressse climático, quantidade
de sangue ingerido, tamanho dos espécimes e ocorrência de assimetria alar. Todas as
populações de Ae. aegypti avaliadas apresentaram resistência ao temephós. A população
proveniente de Neópolis, município com características climáticas favoráveis ao
desenvolvimento da espécie, apresentou uma das menores razão de resistênicia ao larvicida e
melhor desempenho das variáveis de desenvolvimento e reprodução avaliadas. Já a população
de Pinhão, originária da região do semi-árido, além de apresentar a maior razão de resistência
ao temephós, inclusive com valor discrepante em relação aos apresentados pelas demais
populações, também foi a que exibiu maior perda nos parâmetros da capacidade vetorial, com
exceção da variável viabilidade dos ovos em condição de estresse climático, para a qual
apresentou o melhor desempenho. Assim, foram observadas variações em parâmetros da
capacidade vetorial que ora pareciam estar relacionadas às condições climáticas do ambiente
de origem das populações, provavelmente em virtude das adaptações desenvolvidas pelos
indivíduos, ora relacionavam-se com os diferentes status de resistência ao temephós
observados.
Palavras-chave: Saúde pública. Aedes aegypti – controle. Aedes aegypti – comportamento.
Organofosforado temephós. Sergipe.
ABSTRACT
Ecology studies of Aedes aegypti are crucial to understand the behavior and adaptations made
by the species according to their environment and that became evident during the evolutionary
process due to different selective pressures facing the species in their origin environment.
Therefore this study aimed to evaluate aspects of vectorial capacity and resistance to
organophosphate temephos for Ae. aegypti from different regions of Sergipe. In addition to
the resistance ratio of the populations to larvicides, developmental parameters and
reproductive outcomes were duration of theimmature, number of pupae formed and adults
emerged, sex ratio, survival of adults in different feeding conditions, fecundity of females,
fertility eggs under stress climate, amount of blood ingested, the size of specimens and the
occurrence of asymmetric wing. All evaluated populations of Ae. aegypti were resistance to
temephos . The population from Neopolis, a city with favorable climatic characteristics for the
development of species, showed a smaller ratio of the larvicide resistênicia and performance
of developmental and reproductive variables evaluated. The population from Pinhão, which
comes from the semi-arid, and has the highest resistance ratio to temephos, including outlier
compared to those presented by other people, which was also exhibited greater loss in the
parameters of vectorial capacity, with the exception of variable viability of eggs in a condition
of environmental stress, for which the best performance. Thus, changes were observed in
parameters of vectorial capacity which now seemed to be related to the climatic conditions of
the original environment of the populations, probably due to adaptations developed by
individuals, sometimes were related to the differents status of resistance to temephos
observed.
Keywords: Public Health. Aedes aegypti – control. Aedes aegypti – behavior.
Organophosphate temephos. Sergipe.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 11
1.1 Aspectos da capacidade vetorial de Aedes aegypti 11
1.1 Resistência de Aedes aegypti a inseticidas 15
2 OBJETIVOS 20
3.1 Objetivo Geral 20
3.2 Objetivos Específicos e hipóteses de trabalho 20
3 MATERIAL E MÉTODOS 22
3.1 Área de estudo 22
3.2 Obtenção dos ovos 26
3.3 Estabelecimento das colônias 27
3.4 Aspectos da capacidade vetorial 28
3.4.1 Variáveis de desenvolvimento 28
3.4.2 Variáveis de reprodução 29
3.4.3 Análises morfométricas 30
3.5 Bioensaios de resistência ao organofosforado temephós 32
3.5.1 Experimento Dose Diagnóstica (DD) 33
3.5.2 Experimento Dose Resposta (DR) 34
3.6 Análise estatística 34
3.7 Considerações éticas e de biossegurança 35
4 RESULTADOS 36
4.1 Obtenção dos ovos 36
4.2 Aspectos da capacidade vetorial 37
4.2.1 Variáveis de desenvolvimento 37
4.2.2 Variáveis de reprodução 42
4.2.3 Análises morfométricas 45
4.3 Bioensaios de resistência ao organofosforado temephós 49
5 DISCUSSÃO 53
6 CONCLUSÕES 65
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 67
1 I�TRODUÇÃO
Estudos da ecologia são fundamentais para se conhecer o comportamento e
as adaptações apresentadas pelas espécies de acordo com o ambiente em que vivem e
que se evidenciaram durante o processo evolutivo. Populações de áreas com diferentes
condições ambientais podem expor distintos padrões de desenvolvimento em função das
diferentes pressões seletivas que as espécies enfrentam em seu ambiente de origem.
Diversos estudos acerca de aspectos da ecologia de Aedes aegypti têm sido
desenvolvidos, no entanto, existem lacunas deste conhecimento que precisam ser
preenchidas. Considerar o desenvolvimento do ciclo de vida do mosquito e sua
capacidade adaptativa frente a condições ambientais adversas é importante em função
das relações estabelecidas entre Ae. aegypti e outras espécies, sobretudo a espécie
humana, visto que trata-se de mosquito essencialmente urbano e vetor de doença
endêmica.
1.1 Aspectos da capacidade vetorial de Aedes aegypti
O termo capacidade vetorial, inicialmente aplicado em estudos referentes à
malária, pode ser definido como a velocidade em que uma população de espécie vetora
consegue disseminar um agente etiológico entre indivíduos susceptíveis de determinada
área. Assim, um dos principais parâmetros da capacidade vetorial é a competência
vetorial, que representa a probabilidade de infecção do vetor em virtude do repasto
sanguíneo em vertebrado infectado. Dessa forma, os estudos de capacidade vetorial
envolviam análises referentes à infecção do vetor e à susceptibilidade dos hospedeiros,
como, por exemplo, a média de picadas infectantes por hospedeiro e duração do período
de incubação extrínseco, ou seja, período no qual o patógeno se desenvolve no
organismo do mosquito até surgirem formas infectantes disponíveis para transmissão.
No entanto, com o passar do tempo, a capacidade vetorial passou a ser analisada em
estudos que não consideravam diretamente aspectos da infecção e, assim, parâmetros
ecológicos, biológicos e comportamentais das espécies passaram a ser utilizados. Dessa
forma, há outros fatores consideráveis como a densidade da espécie vetora na área, a
duração do ciclo gonotrófico, a preferência pelo sangue ingerido e a longevidade do
12
vetor, que deve possibilitar tempo suficiente para que se complete o período de
incubação (LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, 2005; KLEMPNER et al., 2007). Lutz et al.
(2003) consideram o período de incubação extrínseco e a sobrevivência diária como os
parâmetros mais importantes para determinação da capacidade vetorial de Ae. aegypti.
Entretanto, é importante atentar para alguns fatores que podem contribuir para uma
interpretação enviesada da capacidade vetorial como, por exemplo, a infecção por
arbovírus que pode interferir na longevidade, na fecundidade e no comportamento
alimentar do inseto (MACIEL-DE-FREITAS, 2010).
O mosquito Ae. aegypti é o principal vetor da dengue, doença reemergente
no mundo que persiste como sério problema de saúde pública, especialmente nas áreas
de clima tropical e subtropical, onde as condições ambientais favorecem o
desenvolvimento e proliferação do mosquito (TAUIL, 2002). No entanto, em virtude do
aquecimento global, esse vetor tende a ampliar sua área de distribuição geográfica,
possibilitando a ocorrência da doença em áreas antes isentas do mosquito em virtude de
barreiras climáticas (CORTEZ, 2004).
Ae. aegypti é detectado em número cada vez maior de municípios brasileiros
e esse número cresce rapidamente a cada ano, evidenciando a necessidade de
conhecimento mais eficaz quanto ao seu controle (ILDEFONSO FERNÁNDEZ, 1999;
SOUZA-SANTOS & CARVALHO, 2000). Assim, é de fundamental importância
conhecer os princípios básicos de sua ecologia e biologia para determinação a aplicação
das medidas de prevenção e controle da dengue.
Culicídeo muito associado ao homem, o mosquito Ae. aegypti apresenta
comportamento altamente sinantrópico (adaptado a viver junto ao homem) e
antropofílico (associado ao homem), o que lhe propicia significativa função
epidemiológica. Trata-se de espécie com alto grau adaptativo tanto na fase imatura
quanto quando indivíduo adulto (NATAL, 2002). As especificidades biológicas do
vetor e a resistência dos ovos a longos períodos de seca contribuem para a falsa
impressão de não haver risco de novas epidemias de dengue em determinadas áreas,
visto que os ovos podem eclodir e re-infestar as localidades (GUIMARÃES, 2002).
Depois de formado o embrião, os ovos postos nas paredes dos recipientes adquirem
resistência e são capazes de enfrentar longos períodos de seca, à espera de água e
temperatura adequadas, quando são então estimulados a eclodir e há a formação de um
13
criadouro de imaturos de Ae. aegypti. (NATAL, 2002). Assim, mesmo secos, os
criadouros artificiais mantêm a infestação pelo vetor.
Diversos estudos mostram a adaptabilidade da espécie aos criadouros
artificiais provenientes de recipientes reutilizáveis, destinados ao armazenamento de
água ou descartados pelo homem (LIMA et al., 1988; TUN-LIN et al.,1995; SOUZA-
SANTOS & CARVALHO, 2000; PEREIRA, 2001, 1996; DONALÍSIO e GLASSER,
2002; DOMINGOS, 2005; SILVA et al., 2006; LAGROTTA, 2006; LAZCANO et al.,
2006, MACIEL-DE-FREITAS, 2007). Assim, a manutenção e a dispersão do Ae.
aegypti tem estreita relação com o modo de vida do ser humano (LEFÈVRE et al.,
2004). A depender da disponibilidade ambiental são encontrados também criadouros
naturais, embora a espécie Ae. albopictus, vetor potencial da dengue, esteja mais
associada a esse tipo de criadouros (FORATTINI et al., 1997; FORATTINI, 1998;
CHIARAVALLOTI-NETO et al., 2002; BRITO & FORATTINI, 2004). A vasta
heterogeneidade de criadouros evidencia a grande capacidade da fêmea de ovipor em
diversificado e elevado número de recipientes, transformando-os em criadouros
potenciais.
Em criadouros temporários, o mosquito Ae. aegypti tende a desenvolver a
fase imatura mais curta que aquela apresentada por culicídeos de criadouros
permanentes. Este mecanismo seletivo de encurtamento da vida imatura é uma
adaptação que propicia aumento na produtividade dos criadouros, com rápida formação
de indivíduos adultos. (NATAL, 2002).
Donalísio e Glasser (2002) reforçam a importância da análise das condições
climáticas quando do estudo da dengue, uma vez que a incidência da doença está
fortemente associada a estações chuvosas, temperaturas altas, ventos e altitudes. De
fato, a temperatura é um dos fatores ecológicos associados ao desenvolvimento de Ae.
aegypti que influencia na dinâmica populacional da espécie, uma vez que atua na
longevidade, fecundidade e atividade hematofágica dos insetos (COSTA et al, 1994;
VIANA et al., 1996; RIBEIRO et al., 2004).
Beserra et al. (2006) observaram interação significativa entre populações de
Ae. aegypti e a temperatura associada ao período de desenvolvimento embrionário,
eclosão e viabilidade dos ovos e longevidade dos adultos. Além disso, em estudo
realizado com populações de Ae. aegypti da Paraíba para estudar a fertilidade da
espécie, Beserra et al (2008) constataram um padrão diferenciado de desenvolvimento e
14
de potencial biótico associado à adaptação às condições climáticas, como variação na
temperatura, por exemplo.
Embora fatores socioeconômicos e culturais influenciem na densidade dos
mosquitos adultos (OLIVEIRA, 2004; MENDONÇA et al., 2004; FERREIRA &
CHIARAVALLOTI-NETO, 2007), o número de focos de Ae. aegypti e a proliferação
do vetor numa determinada área são determinados pelas condições ambientais, como
chuvas e temperaturas (DONALÍSIO & GLASSER, 2002; GLASSER & GOMES,
2002; RIBEIRO et al., 2004, 2006).
Um dos parâmetros que ainda pode ser associado à atividade vetora de Ae.
aegypti é a capacidade de dispersão da fêmea, que está diretamente relacionada à
probabilidade de encontrar vertebrado para o repasto sanguíneo. Nesse contexto,
estudos geométricos das asas dos mosquitos são importantes, uma vez que para
Hemiptera já foi observado que as características das asas geralmente estão associadas a
características biológicas como capacidade de vôo, além da produção de sons alares de
corte e pré-cópula e fecundidade. (BROGDON, 1994, 1998).
Morfometria é a formalização matemática das diferenças entre formas
geométricas dos objetos. A morfometria geométrica é uma ferramenta relativamente
recente, capaz de possibilitar comparações, com alto poder de resolução, de padrões
corporais considerando-se simultaneamente várias características de uma estrutura
corporal complexa. Para isso, são utilizados pontos de referência na estrutura corporal
analisada, os chamados pontos anatômicos. Sobre um plano cartesiano imaginário da
estrutura em estudo são tomadas as coordenadas posicionais desses pontos, as quais são
posteriormente ordenadas em tabelas de dados, com os quais são feitos análises
estatísticas de variação morfométrica, além de comparar a magnitude das informações
(ROHLF, 1993; MONTEIRO & REIS, 1999).
Entre os testes estatísticos aplicados nos estudos morfométricos encontra-se
a análise de variáveis canônicas que, através de um conjunto de dados multivariados,
fornece uma descrição das dissimilaridades de forma entre grupos especificados na
análise. Os dados são então expressos como variáveis latentes representadas em gráficos
bidimensionais (MONTEIRO & REIS, 1999). Além da análise da forma, é possível
realizar análise de tamanho através do teste que consiste em medir o tamanho do
centróide no intuito de detectar dissimilaridades não-alométricas de tamanho das
estruturas. O centróide é o ponto imaginário que representa o centro geométrico da asa e
15
é determinado pela média dos valores posicionais no plano cartesiano de todos os
pontos anatômicos de uma mesma asa. O tamanho do centróide é um vetor que sintetiza
todos os valores posicionais considerados no cômputo do centróide. Formalmente,
tamanho do centróide é a raiz quadrada da soma dos quadrados das distâncias de cada
ponto anatômico ao centróide. Na ausência de alometria essa é a única medida de
tamanho que não se correlaciona com as variáveis de forma. Assim, o tamanho do
centróide varia de acordo com o tamanho da asa e é uma forma de sumarizar o tamanho
dessa estrutura em uma única variável.
A morfometria geométrica foi inicialmente aplicada à família Culicidae por
pesquisadores tailandeses em estudos de variação temporal da forma
(JIRAKANJANAKIT, 2008) e do tamanho (JIRAKANJANAKIT, 2007) de asas de Ae.
aegypti. Atualmente esta técnica, visto que possibilita comparações morfológicas com
alta resolução, tem sido utilizada para avaliar o dimorfismo sexual entre espécies de
culicídeos através de diferenças nas asas que são de difícil percepção à observação
direta e de difícil descrição formal. Assim, a análise morfométrica complementa o
processo de sexagem realizado através da diferenciação da genitália e dos apêndices
cefálicos (JIRAKANJANAKIT et al., 2007, HENRY et al., 2010, DEVICARI et al.,
2011).
1.2 Resistência de Aedes aegypti a inseticidas
Nos últimos 40 anos, o controle vetorial no Brasil tem se baseado no
controle físico, que consiste na redução dos potenciais criadouros domiciliares de Ae.
aegypti, e no controle químico através do uso dos inseticidas convencionais. O controle
físico, porém, não é viável para todos os tipos de criadouros, especialmente os de
grande extensão. O controle químico vem sofrendo restrições em função da seleção de
populações de mosquitos resistentes aos inseticidas e devido às consequências que
podem causar ao meio ambiente. No Brasil, apesar de esforços do Ministério da Saúde,
o Programa de Controle da dengue não é eficaz em prevenir a ocorrência cíclica de
epidemias (CAVALCANTI et al., 2007; BRAGA & VALLE, 2007a; COELHO et al.,
2008).
De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), a resistência é
definida como a capacidade que uma população de insetos apresenta em tolerar uma
16
dose de inseticida que em condições normais seria letal. Esta resistência tem
característica genética, que pode ser explicada pela presença, numa população, de
insetos com alelos que lhes confiram resistência e outra com alelos que conferem
susceptibilidade. A resistência surge numa população quando há exposição continuada a
determinado inseticida, matando os indivíduos susceptíveis e deixando vivos aqueles
com alelos para resistência (BRAGA & VALLE, 2007b).
O programa de controle da dengue no Brasil baseia-se na utilização de
larvicidas organofosforados, como o temephós, e os piretróides cipermetrina e
deltametrina, utilizados no controle das formas adultas. O uso do organofosforado
temephós como larvicida é feito em todos os estados brasileiros desde 1980 (MACORIS
et al., 2007). A utilização desses inseticidas requer monitoramento constante para
retardar ou evitar o aparecimento de resistência (BRAGA & VALLE, 2007b; LUNA et
al., 2004).
Os mecanismos relacionados à resistência dos insetos aos inseticidas
geralmente envolvem alteração do comportamento, redução da taxa de penetração na
cutícula, diminuição da sensibilidade do sítio-alvo e detoxificação metabólica
aumentada. Como os mecanismos de ação são inespecíficos, o uso de inseticidas
estruturalmente relacionados pode ocasionar resistência cruzada (FERRARI, 1996).
Os compostos convencionalmente utilizados no controle químico
apresentam mecanismo de ação sobre o sistema nervoso central dos insetos
(RATHBURN JR, 1985). O temephós é o único larvicida organofosforado com
recomendação da OMS para uso em água potável (WHO, 1997) e atua inibindo a
enzima Acetilcolinesterase (AChE), o que resulta em acúmulo de acetilcolina nas
sinapses nervosas, impedindo assim a interrupção da propagação do impulso elétrico e
ocasionando o contínuo estímulo do sistema nervoso central e a consequente morte do
inseto (BRAGA & VALLE, 2007b).
A avaliação da resistência de uma população a inseticidas é realizada
através de bioensaio Dose Diagnóstica, onde as larvas são expostas a uma única dose do
inseticida para detectar a possível resistência. Para o temephós essa dose é fixada pelo
Ministério da Saúde em 0,012 ppm e equivale ao dobro da concentração letal para 99%
(CL99) das larvas de uma população reconhecidamente susceptível . Porém, em virtude
de possíveis variações na formulação do temephós a depender do fabricante ou mesmo
do lote, é recomendável fazer a calibração do inseticida através do experimento Dose
17
Resposta com a cepa susceptível e assim identificar sua CL99. O bioensaio Dose
Resposta é um experimento no qual a resistência detectada através do bioensaio Dose
diagnóstica é quantificada (WHO, 1992; BRAGA & VALLE, 2007b). A razão de
resistência (RR), em relação à população suscetível, é calculada durante o ensaio dose-
resposta e define o grau de resistência da população estudada. Valores de razão de
resistência entre três e cinco demonstram baixa resistência; de cinco a 10, resistência
moderada; de 10 a 20, resistência média; e acima de 20, resistência alta (CAMPOS &
ANDRADE, 2003).
Resistência tem sido detectada para todas as classes de inseticidas, o que
afeta direta e profundamente a re-emergência das doenças transmitidas por vetores, uma
vez que, apesar dos significativos avanços alcançados no desenvolvimento de métodos
alternativos, os inseticidas químicos continuam sendo ferramenta importante dos
programas de controle da dengue (BRAGA & VALLE, 2007c).
A resistência a inseticidas vem aumentando em vários países das Américas
Central e Sul, Ásia e Caribe (WHO, 1992). Na América Latina há registro de
populações de Ae. aegypti resistentes na Costa Rica, Cuba, Jamaica, Nicarágua, Peru e
Venezuela (RODRÍGUEZ et al., 2007). O uso contínuo do organofosforado temephós
desde 1967 proporcionou ao longo do tempo a seleção de populações de Ae. aegypti
resistentes a este larvicida (MONTELLA, 2007). No Brasil, populações de Ae. aegypti
resistentes ao temephós estão amplamente distribuídas e têm sido registradas em vários
estados como São Paulo (MACORIS et al., 1999), Distrito Federal (CARVALHO et al.,
2004), Paraíba (BESERRA et al., 2007), Ceará (LIMA et al., 2006), Rio de Janeiro,
Sergipe e Alagoas (BRAGA et al., 2004). No caso de Sergipe, foram analisados três
municípios: Aracaju, Barra dos Coqueiros e Itabaiana. A taxa de mortalidade foi de
27,5% em Aracaju, 26,5% na Barra dos Coqueiros e 7,1% em Itabaiana. Esses
resultados mostraram que as larvas analisadas apresentam resistência ao temephós, visto
que a mortalidade ficou abaixo dos 80% preconizado pela OMS (BRAGA et al., 2004).
Nesse mesmo ano, foram realizados no estado, testes de resistência ao piretróide
cipermetrina em adultos de Ae. aegypti. Nesse estudo, foram analisados dois
municípios: Aracaju e Barra dos Coqueiros. A mortalidade observada foi de 95, 7% em
Aracaju e 92, 7% na Barra dos Coqueiros. Os resultados foram classificados como
inconclusivos, pois a mortalidade observada ficou entre 80% e 98% (CUNHA et al.,
2005).
18
Diante desse contexto de resistência aos inseticidas convencionais, outros
produtos estão sendo utilizados no controle do vetor da dengue. São os chamados
inseticidas alternativos, e envolvem principalmente o grupo dos inseticidas biológicos e
dos Reguladores do Crescimento dos Insetos (IGR). Uma alternativa biológica é a
bactéria entomopatogênica Bacillus thuringiensis israelensis (Bti), efetiva contra larvas
de insetos de importância médica. O larvicida Bti, recomendado pela OMS para uso em
água potável, é um dos substitutos do organofosforado temephós (WHO, 1997). Em
alguns locais onde a resistência ao temephós foi estabelecida, realizou-se o controle
biológico utilizando as bactérias patógenas. No Rio de Janeiro, por exemplo, o Bti
começou a ser utilizado em 2001, quando a resistência ao temephós foi confirmada no
estado (BRAGA & VALLE, 2007c), porém, devido à seleção de cepas resistentes
também a este produto, de acordo com Secretaria Estadual de Saúde do Rio de Janeiro,
em 2009 iniciou o processo de utilização de outro larvicida, o diflubenzuron, um
regulador do crescimento dos insetos que atua inibindo a síntese de quitina. Na Região
metropolitana de Aracaju, de acordo com a Secretaria de Estado da Saúde de Sergipe,
em decorrência da constatação de resistência, o diflubenzuron também começou a ser
utilizado em 2009, em substituição ao larvicida temephós. No interior do estado, porém,
onde não há monitoramento, ainda é utilizado o organofosforado.
Embora os inibidores da síntese de quitina atuem sobre as larvas de Ae.
aegypti, constituindo uma alternativa de controle do vetor onde há resistência ao
temephós, estes compostos não são adequados para localidades onde há predominância
de recipientes destinados ao armazenamento de água para consumo humano (BRAGA
& VALE, 2007c; BRASIL, 2005). Nas áreas com essa característica, a recomendação
da Secretaria de Vigilância em Saúde é adotar medidas de saneamento ambiental
(BRASIL, 2005). No entanto, Martins & Silva (2004) sugerem que o uso do
diflubenzuron em depósitos de água para consumo humano não oferece perigo, visto
que o larvicida atua apenas na síntese de quitina, durante o processo de muda, e esta é
uma substância restrita aos artrópodes, o que afetaria apenas outros insetos que
compartilham dos criadouros naturais. Além disso, em municípios característicos por
apresentar recipientes que acondicionam pequeno volume de água, não é possível
aplicação direta da formulação do diflubenzuron em pó molhável sendo necessários sua
prévia diluição e acondicionamento em depósitos para uso em campo, o que pode
19
representar um problema operacional se a aplicação for realizada em larga escala
(BRASIL, 2005).
Apesar de agirem de maneira diferente dos inseticidas tradicionais, existem
registros de resistência aos inseticidas biológicos (BROGDON & MCALLISTER,1998;
KOTZE et al., 1997). Assim, a aplicação de inseticidas no controle vetorial deve ser
feita de maneira racional e as populações de Ae. aegypti devem ser monitoradas quanto
à seleção de resistência de modo a se obter a melhor relação custo-benefício no uso de
inseticidas e não comprometer as ações de controle da dengue.
Diante do exposto, este estudo investiga alterações na susceptibilidade de
populações de Ae. aegypti ao organofosforado temephós, larvicida usado com
frequência nas atividades de controle vetorial em Sergipe, possibilitando assim
averiguar a interferência antrópica no ambiente através da pressão seletiva imposta às
populações naturais do mosquito. Além disso, a avaliação do status de resistência a
inseticidas concomitante com a análise aspectos da capacidade vetorial das diferentes
populações de Ae. aegypti possibilita investigar a ocorrência de custos biológicos no
fitness de indivíduos resistentes, em virtude do seu metabolismo estar direcionado tanto
para produção quanto manutenção dos mecanismos de resistência.
20
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar aspectos da capacidade vetorial e a resistência ao temephós de
populações de Ae. aegypti provenientes de diferentes regiões do estado de Sergipe.
2.2 Objetivos Específicos e hipóteses de trabalho
1 – Averiguar o tempo de desenvolvimento larvário, de formação de pupas e
de emergência dos adultos para as diferentes populações.
Hipótese: populações provenientes de ambientes com diferentes condições
climáticas tendem a diferir o ciclo de vida, mesmo quando criadas sob condições
ambientais idênticas.
2 – Quantificar a razão sexual dos adultos que emergirem.
Hipótese: para todas as populações, machos e fêmeas tendem a apresentar a
mesma razão sexual.
3 – Observar a longevidade das fêmeas em três dietas diferentes: em jejum,
alimentadas apenas com solução açucarada e alimentadas com açúcar e repasto
sanguíneo.
Hipótese: na condição de jejum, fêmeas das populações oriundas de
ambientes com estresse climático são mais longevas que as fêmeas das demais
populações, embora não ocorra diferença na sobrevivência entre as populações nas
demais dietas.
4 – Comparar a sobrevivência de machos e fêmeas nas diferentes dietas.
Hipótese: em todas as dietas, a sobrevivência das fêmeas é maior que a dos
machos.
5 – Verificar a fecundidade das fêmeas após o primeiro repasto sanguíneo.
Hipótese: as fêmeas devem ovipor quantidades de ovos equivalentes.
6 – Verificar a fertilidade dos ovos de Ae. aegypti quando submetidos a
condições de estresse climático.
21
Hipótese: fêmeas de populações provenientes de região com ambiente hostil
apresentam maior fertilidade dos ovos quando submetidas em laboratório a condições
estressantes, em comparação com as fêmeas das demais localidades.
7 – Determinar a quantidade de sangue ingerido pelas fêmeas.
Hipótese: fêmeas menores tendem a apresentar menor quantidade de sangue
ingerido.
8 – Verificar, através da morfometria geométrica alar, o tamanho dos
indivíduos de cada população.
Hipótese: indivíduos das populações com maiores índices de resistência ao
temephós são menores que os indivíduos da cepa susceptível.
9 – Verificar a amplitude da assimetria nas asas de Ae. aegypti de cada
população.
Hipótese: indivíduos das populações de regiões com condições ambientais
estressantes tendem a apresentar assimetria alar quanto à forma e ao tamanho.
10 – Quantificar a resistência das populações de Ae. aegypti ao larvicida
temephós.
Hipótese: diferentes populações diferem quanto ao grau de resistência ao
temephós.
11 – Relacionar aspectos da capacidade vetorial com o status de resistência
das populações.
Hipótese: indivíduos das populações resistentes ao temephós tendem a
apresentar perda em aspectos do desenvolvimento e reprodução.
22
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Área de estudo
O estudo foi realizado em Sergipe, abrangendo municípios de diferentes
territórios do estado. Sergipe, apesar de ser o menor estado da federação brasileira,
apresenta áreas com diferentes condições ambientais. A extensão territorial é de 21.918
Km2, onde se encontram 2.068.017 habitantes (IBGE, 2010). De acordo com a
Secretaria de Planejamento de Sergipe, os 75 municípios do estado estão, inclusive de
acordo com parâmetros geo-ambientais como topografia, hidrografia, clima, fauna e
flora, divididos em oito territórios, a saber: Alto-Sertão Sergipano, Médio-Sertão
Sergipano, Baixo São Francisco, Centro-Sul, Grande Aracaju, Leste Sergipano, Agreste
Central Sergipano e Sul Sergipano.
O Estado de Sergipe está localizado nas coordenadas geográficas 9º 31’ S a
11º 33’ e 36º 25’ W a 38º 14’ W. De acordo com Centro Meteorológico de Sergipe
(CEMESE), o estado encontra-se na faixa tropical e possui como problema climático a
irregularidade espacial e temporal da distribuição da precipitação pluviométrica, sendo
decrescente do litoral, onde atinge precipitação superior a 1600 mm, em direção ao
semi-árido, onde são registradas precipitações inferiores a 500 mm. O período chuvoso
no estado como um todo se concentra entre os meses de abril a agosto, com o máximo
concentrado nos meses de maio e junho.
De acordo com o Sistema de Informação sobre Recursos hídricos de Sergipe
(SIRHSE), o clima no estado encontra-se dividido em três regiões classificadas de
acordo com a temperatura e a precipitação: região tropical úmida, com precipitação
média anual de 1355 mm, evaporação de 1000 mm/ano, umidade relativa do ar de 80%
no ano e temperaturas que variam entre 20 ºC e 29 ºC; a região do agreste, com
precipitação média anual de 1000 mm, umidade anual de 70% e com temperaturas
semelhantes às observadas na região tropical úmida, porém com maior evaporação
consideravelmente mais alta (2000 mm/ano); e a região do semi-árido, no interior do
estado, com precipitação média de inferior a 700 mm/ano, atingindo valores em torne de
30 mm nos meses de verão, com evaporação superior a 2100 mm/ano e temperaturas
mais altas que as observadas na região tropical úmida com valores que variam em torno
23
de 20 ºC e 32 ºC, onde a umidade relativa do ar é de, em média, 65%. Assim, é possível
que a variação de aspectos climáticos entre os territórios, especialmente entre os que
estão mais distantes entre si, interfira em diferentes aspectos da capacidade vetorial de
Ae. aegypti no estado.
Para análise de aspectos da capacidade vetorial foram selecionados quatro
municípios, sendo um em cada território, de modo que apresentassem diferentes
condições ambientais, sendo eles: Canindé do São Francisco, no Alto Sertão Sergipano;
Neópolis, no Baixo São Francisco; Pinhão, no Agreste Central Sergipano e Aracaju, na
região da Grande Aracaju, área litorânea do estado. Para investigar o perfil de
susceptibilidade das populações de Ae. aegypti do estado ao larvicida temephós, além
das populações dos municípios selecionados para estudo da capacidade vetorial, ainda
foram utilizadas populações originárias dos municípios de Carira, no Agreste Central
Sergipano; Capela, no Leste Sergipano e Maruim, na região da Grande Aracaju (Figura
1). A seleção de mais de um município nos territórios da Grande Aracaju e do Agreste
Central Sergipano para análise da susceptibilidade ao inseticida foi realizada no intuito
de verificar possíveis variações no status de resistência ao temephós mesmo entre
municípios vizinhos.
24
Figura 1: Ilustração da distribuição dos municípios selecionados para pesquisa no Estado de
Sergipe. FONTE: Secretaria de Estado da Infra-Estrutura <www.seinfra.se.gov.br>.
O município de Canindé do São Francisco, distante 213 Km da capital, está
situado no Alto Sertão Sergipano, no extremo noroeste do estado de Sergipe e limita-se
a norte com o estado de Alagoas, a leste com o município sergipano de Poço Redondo e
a oeste e sul com o estado da Bahia. Além disso, está inserido na bacia hidrográfica do
rio São Francisco e participa do polígono das secas. O município apresenta clima
megatérmico árido, caracterizado por muito sol e calor com temperatura média anual de
27 ºC, variando entre 19 ºC e 33 ºC, mas podendo atingir 43 ºC durante o verão. A
precipitação pluviométrica média no ano é de 485,5 mm e o período chuvoso está
compreendido entre março e julho, com chuvas ocasionais. Neste ambiente hostil, a
vegetação é predominantemente formada por capoeira e caatinga (SERGIPE, 1997,
2000).
O município de Neópolis, localizado no extremo nordeste do estado de
Sergipe, está inserido na bacia hidrográfica do rio São Francisco. Distante 121 Km da
capital Aracaju, encontra-se limitado geograficamente a norte pelos municípios de
Propriá e Santana do São Francisco e pelo estado de Alagoas, ao sul pelo município de
Pacatuba, ao leste pelo município de Ilha das Flores e a oeste pelos municípios de
Propriá e Japoatã. Apresenta tipo climático megatérmico seco e sub-úmido com pouco
25
ou mesmo ausência de excesso de água e temperatura média anual de 26 ºC, variando
entre 20 ºC e 30 ºC. O período chuvoso ocorre de março a agosto e a precipitação média
anual é de 1.200 mm (SERGIPE, 1998, 2002).
Localizado no Agreste Central de Sergipe, o município de Pinhão, distante
98 Km da capital, apresenta área territorial de 156 Km2, 258 m de altitute e população
de 5.973 habitantes, segundo dados do IBGE (2010). Com tipo climático semi-árido
com pequeno ou nenhum excesso de água e temperatura média anual que varia entre 16
ºC e 34 ºC, Pinhão abrange o bioma caatinga. Ainda na região do semi-árido, vizinho a
Pinhão encontra-se o município de Carira, distante 112 Km da capital, com 636 Km2,
351 m de altitude e 20.007 habitantes (IBGE, 2010). O tipo climático em Carira é o
megatermico seco sub-úmido com pequeno ou nenhum excesso de água, com variações
na temperatura média anual semelhantes às apresentadas por Pinhão.
No Leste Sergipano, o município de Capela apresenta 30.761 habitantes,
442 Km2 e 162 m de altitude (IBGE, 2010). Em Capela, o tipo climático é o
megatérmico úmido sub-úmido com moderada deficiência de verão e as temperaturas
variam entre 19 ºC e 32 ºC no ano.
Aracaju é município com tipo climático megatérmico úmido e sub-úmido de
moderada influência no verão, com precipitação média anual de 1.590 mm e
temperatura média anual de 26 °C, variando entre 20 ºC e 30 ºC. Geograficamente o
município está localizado no litoral da região nordeste, à margem direita do rio Sergipe.
O período chuvoso é de março a agosto, sendo que maio tende a ser o de maior
precipitação em média. Janeiro, fevereiro e março são, geralmente, os meses mais
quentes em Aracaju, com temperaturas médias que variam entre 30 °C e 24 °C.
Novembro e dezembro, entretanto, são os meses mais secos. Entre julho e agosto as
temperaturas médias máximas são de 27 °C e as médias mínimas de 21 °C (SERGIPE,
2002).
Assim como a capital sergipana, o município de Maruim também faz parte do
território da Grande Aracaju, com 10 m de altitude, 93 Km2 e 16.343 habitantes (IBGE,
2010). Em Maruim, o tipo climático é o megatermico seco sub-úmido com moderado
excesso de inverno.
Além das populações locais de Ae. aegypti, a cepa Rockfeller, mantida por
muitos anos em laboratório, também foi usada nos experimentos de análise da
26
capacidade vetorial e como padrão de susceptibilidade ao temephós nos bioensaios de
avaliação da resistência.
3.2 Obtenção dos ovos
Para obtenção dos ovos de Ae. aegypti dos sete municípios sergipanos,
foram realizadas coletas durante intervalo de oito meses, no período entre outubro de
2010 a junho de 2011, sendo que uma segunda coleta foi realizada no município de
Pinhão em agosto de 2011. A coleta dos ovos foi realizada através de visitas aos
municípios selecionados para instalação de armadilhas de oviposição. Para a
amostragem foram utilizadas armadilhas conhecidas no Brasil como ovitrampas. Cada
município foi dividido de acordo com os bairros, de modo aleatório, para incluir áreas
com diferentes níveis de infestação e emprego rotineiro de inseticidas. Por tratar-se de
municípios pequenos (<50.000 imóveis), com exceção de Aracaju, foram instaladas 100
ovitrampas em cada município, sendo uma por quadra. No caso de Aracaju, a coleta
envolveu a instalação de 30 ovitrampas no bairro Porto Dantas, local com
monitoramento da resistência a inseticidas pelo Laboratório de Parasitologia da
Universidade Federal de Sergipe desde 2007.
Para instalação das ovitrampas foi selecionado em cada quadra um imóvel
que preferencialmente apresentasse condições para monitoramento semanal e
preservação das armadilhas, como presença constante do morador e ausência de
crianças e animais domésticos. Nas ovitrampas instaladas no campo foram colocadas
palhetas de oviposição e as armadilhas permaneceram nos imóveis por duas semanas.
Para aumentar o rendimento da ovitrampa, foi misturada à água da armadilha solução
preparada a partir da infusão de gramíneas. Em cada município, as armadilhas
permaneceram nos imóveis por duas semanas consecutivas e, a cada semana, as palhetas
foram retiradas e realizou-se o exame e descarte da solução da armadilha para eliminar
larvas que pudessem ter eclodido, em caso de postura. As palhetas coletadas em campo
foram levadas para o Laboratório de Parasitologia da Universidade Federal de Sergipe,
onde secaram em temperatura ambiente para garantir que o embrião completasse seu
desenvolvimento. Após secagem foi realizada a leitura para contagem de ovos,
utilizando microscópio estereoscópico.
27
A instalação das armadilhas nos municípios foi realizada em parceria com a
Secretaria Estadual de Saúde, juntamente com as Secretarias Municipais de Saúde
através do apoio dos agentes de endemias de cada localidade. Todos os imóveis nos
quais foram instaladas as armadilhas foram georreferenciados.
3.3 Estabelecimento das colônias
As criações das populações de Ae. aegypti foram realizadas no insetário do
Laboratório de Parasitologia em ambiente climatizado com temperatura de 26 ºC ±2 ºC,
umidade de 60% ± 10% e fotofase de 12h.
As populações que deram origem à criação foram aquelas provenientes dos
ovos coletados durante trabalho de campo nos municípios selecionados. As palhetas
contendo os ovos coletados nas atividades de campo foram transferidas para uma bacia
grande (30 cm x 20 cm x 6 cm) contendo 1,0 L de água mineral e ração para roedores
triturada, de modo que o número total de ovos alcançasse um valor em torno dos 2.000
e fosse utilizado o maior número de palhetas para melhor amostrar a população de Ae.
aegypti de cada município. Depois de 24 horas de estímulo à eclosão dos ovos, as larvas
existentes na bandeja foram transferidas para outras bandejas contendo 1,5 L de água
além de 100 mg de ração para cada 150 larvas. Em cada bandeja foram adicionadas no
máximo 600 larvas e os imaturos de cada bandeja deram origem aos adultos de uma
gaiola. A alimentação das larvas foi realizada diariamente com ração para gatos
triturada, tamizada (1 mm) e colocada em estufa a 100 °C por uma hora. Ao atingir o
estágio de desenvolvimento de pupas, estas foram transferidas em tampas de borrel para
gaiolas de alumínio com 30 cm x 30 cm x 30 cm de dimensões, onde emergiram os
adultos que foram alimentados diariamente com solução de sacarose. A quantidade
máxima de pupas não excedeu 50 por tampa de borrel e 500 por gaiola. Ofereceu-se às
fêmeas repasto sanguíneo em ratos anestesiados, por 30 minutos, três vezes por semana.
Em cada gaiola foi adicionado um ovipositor contendo água e uma cartela de papel
filtro onde os ovos postos pelas fêmeas selvagens ficavam retidos. Em cada repasto
sanguíneo, a água e o ovipositor eram substituídos, sendo o papel recolhido posto para
secar em temperatura ambiente. Depois de secas, as cartelas contendo os ovos da
primeira geração de laboratório eram datadas e acondicionadas em envelopes
28
devidamente identificados com o nome da população. Os ovos da geração F1 foram
então utilizados nos experimentos de capacidade vetorial e resistência a inseticidas.
A cepa Rockefeller (ROCKE), considerada padrão de suscetibilidade a
inseticidas por ter sido retirada do campo antes da aplicação de inseticida começar a
fazer parte da rotina das atividades de controle, também foi mantida em laboratório.
Para o estabelecimento da colônia ROCKE, foram utilizados ovos cedidos pelo
Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes Vetores (LAFICAVE) do Rio de
Janeiro, de linhagem criada por muitos anos no laboratório.
Para todos os experimentos realizados com as populações de Ae. aegyti dos
municípios sergipanos, foi utilizada a primeira geração de laboratório, com exceção da
análise da morfometria alar para a mostra de Pinhão, na qual foram usados adultos
selvagens, criados em laboratório, provenientes dos ovos coletados em campo.
3.4 Aspectos da capacidade vetorial
A análise da capacidade vetorial de cada população consistiu em variáveis
de desenvolvimento: duração do período imaturo, percentual de pupas formadas e de
emergência de adultos, razão sexual e longevidade dos adultos em diferentes dietas; de
reprodução: quantidade de sangue ingerido, oviposição individual e viabilidade dos
ovos em condições de estresse climático; e análise da morfometria geométrica alar.
3.4.1 Variáveis de desenvolvimento
Para acompanhar o desenvolvimento larvar foram utilizadas as cartelas
contendo ovos de Ae. aegypti da primeira geração de laboratório de cada população,
uma semana após a postura, para garantir o desenvolvimento do embrião. A oviposição
foi considerada por 24h de exposição dos ovos à água, período depois do qual foram
retiradas as cartelas contendo os ovos para garantir que não ocorresse mais eclosão. As
larvas recém eclodidas foram transferidas para quatro réplicas de bandejas mantendo-se
a densidade em torno de 500 larvas por bandeja. O desenvolvimento larvar foi
acompanhado diariamente a partir da data de eclosão dos ovos até as larvas atingirem o
estágio de pupa. As pupas que surgiram foram contadas e transferidas para gaiolas
identificadas com a população e a data de transferência. O número de pupas foi
29
registrado diariamente no mesmo horário até que todas as larvas tivessem se
transformado em pupas ou morrido.
Diariamente foi acompanhada a emergência dos adultos e quantificado o
número de machos e fêmeas que emergiam. Foram formadas gaiolas para acompanhar a
sobrevivência dos adultos em diferentes dietas, sendo três réplicas para cada. As
diferentes condições de alimentação nas quais se observou a sobrevivência de machos e
fêmeas por no máximo 30 dias foram: jejum, alimentação apenas com solução
açucarada e alimentação com solução de sacarose e repasto sanguíneo. Para garantir que
mesmo com possíveis perdas, o número total de fêmeas e de machos acompanhados na
sobrevivência fosse em torno de 30 machos e 30 fêmeas, as réplicas com mosquitos
submetidos ao jejum foram feitas com 90 pupas cada, uma vez que 10 fêmeas de cada
réplica seriam retiradas para pesagem na determinação da quantidade de sangue
ingerido. Nas réplicas com mosquitos alimentados apenas com solução açucarada foram
colocadas 120 pupas em cada. O número maior de indivíduos nestas réplicas em relação
àquelas com mosquitos mantidos em jejum deve-se ao fato de que, em virtude da
substituição da solução açucarada a cada dois dias, há maior chance de perder
exemplares que na condição anterior, quando os mosquitos são mantidos em jejum e há
pouca manipulação nas gaiolas. Já nas gaiolas de sobrevivência dos mosquitos
alimentados com açúcar e sangue foram colocadas 140 pupas em cada. Das fêmeas
oriundas desta dieta, após o primeiro repasto sanguíneo, 10 exemplares de cada réplica
foram retirados para pesagem e determinação da quantidade de sangue ingerido e outras
10 também de cada réplica foram utilizadas para observação da oviposição individual.
A alimentação tanto das larvas quanto dos adultos ocorreu de acordo com a metodologia
de criação.
3.4.2 Variáveis de reprodução
Para análise da taxa de ingestão de sangue foram utilizadas as 30 fêmeas
retiradas das réplicas do jejum e da alimentação com açúcar e sangue. As fêmeas foram
colocadas no congelador por cinco minutos e depois de mortas foram pesadas em
balança de precisão em grupos de cinco para eliminar as diferenças individuais de
alimentação. A quantidade de sangue ingerido foi determinada pela diferença na
pesagem entre os dois grupos de fêmeas alimentadas e não alimentadas.
30
As outras 30 fêmeas separadas após o primeiro repasto foram colocadas
individualmente em placas de petri de vidro, devidamente identificadas, forradas com
papel filtro e levemente umedecidas com água, nas quais foram deixadas ovipondo por
no máximo cinco dias. Após esse período foi realizada a contagem do número de ovos
por fêmea e o número de fêmeas que não realizaram postura alguma.
A fertilidade dos ovos das fêmeas de Ae. aegypti de cada população foi
investigada para ovos mantidos por um período de 30 dias, desde o momento da
postura, em condições de estresse climático induzido, com temperaturas diárias de 34
°C e noturnas de 24 °C. Para isso foram selecionados, aleatoriamente, pedaços das
cartelas contendo ovos com quantidades equivalentes de ovos para dar origem às
réplicas submetidas ao estresse ambiental. Os ovos foram mantidos em bandejas de
plástico contendo um litro de água mineral e ração para roedores triturada por 24 horas.
Depois desse período, os pedaços das cartelas contendo os ovos foram retirados e o
número de larvas presentes na bandeja determinou o percentual de viabilidade dos ovos.
3.4.3 Análises morfométricas
Para as análises morfométricas das asas foram montadas gaiolas com
adultos da primeira geração de laboratório, com exceção da população de Pinhão, da
qual foram utilizados adultos selvagens criados em laboratório, e da cepa Rockefeller,
continuamente mantida em laboratório há muitos anos. Para originar os adultos
examinados morfometricamente e assegurar a representatividade de amostra, para cada
população, foram utilizadas cartelas de ovos provenientes de diferentes gaiolas dos
adultos selvagens e com diferentes quantidades de ovos, totalizando aproximadamente
2000 ovos expostos à água por 24 horas. Dos ovos que eclodiram nesse período, cerca
de 600 larvas foram separadas para compor a bandeja que originou a gaiola dos adultos
usados na morfometria. A criação e alimentação dos imaturos sucederam de acordo com
a metodologia estabelecida para manutenção das colônias.
A metodologia do estudo morfométrico envolveu a análise das asas direita e
esquerda das fêmeas de cada população. As asas foram retiradas e montadas entre
lâmina e lamínula fixadas com bálsamo do Canadá. Antes disso, porém, todas as asas
foram limpas para retirada das escamas e visualização das nervuras. As asas montadas
foram então digitalizadas utilizando-se câmera fotográfica digital Leica 320 acoplada a
31
microscópio estereoscópico Leica S6, no aumento de 40x. Após a captura das imagens,
foram colocados os marcos anatômicos tipo I na região dorsal das asas com auxílio do
programa TpsDig v. 2 (ROHLF, 2005). De acordo com Monteiro & Reis (1999), o
marco anatômico do tipo I é definido como um ponto no espaço onde estruturas se
encontram, representando assim uma justaposição de tecidos, o que no caso das asas
corresponde às interseções das nervuras. Dessa forma, cada marco corresponde a uma
coordenada xy num plano cartesiano, sendo que, cada asa é representada por uma matriz
com coordenadas xy, correspondente aos marcos anatômicos. Assim, em cada asa
analisada, foram tomadas as coordenadas de 18 pontos anatômicos sobre o plano
cartesiano (Figura 2). Foram analisadas em torno de 30 fêmeas de cada população,
sendo a de Canindé de São Francisco F1 (Can) com 32 indivíduos, Pinhão selvagem
(Pin) com 27, Neópolis F1 (Neo) com 29, Porto Dantas F1 (PD) com 39 e Rockefeller
(Rocke) com 30 indivíduos.
Os parâmetros observados na análise morfométrica foram: assimetria
bilateral, tamanho do centróide e disparidade métrica considerando a asa direita dos
espécimes, para verificar o grau de divergência intra e interpopulacionais das amostras.
Para isso, foram utilizados os programas de computador TpsUtil 1.26 (ROHLF, 2004),
TpsRelw 1.36 (ROHLF, 2003), MorphoJ 1.02 e Graph Pad Instat 3.10.
O estudo da morfometria geométrica das asas dos culicídeos, desde a
montagem das lâminas à análise dos dados, foi realizado em colaboração o Dr. Lincoln
Suesdeck, do Laboratório de Parasitologia do Instituto Butantan, em São Paulo.
32
Figura 2: Asa e consenso alar de Aedes aegypti. (A) Asa antes da limpeza, com grande
quantidade de escamas. (B) Asa após a limpeza com os 18 pontos anatômicos. (C)
Representação gráfica do consenso alar formado pelos 18 pontos anatômicos unidos por linhas
para facilitar a visualização.
3.5 Bioensaios de resistência ao organofosofrado temephós
Os bioensaios para investigar a seleção de resistência a inseticidas seguiram
o protocolo padrão da Organização Mundial de Saúde (OMS). Foram realizados os
ensaios Dose Diagnóstica e Dose Resposta.
O ensaio Dose Diagnóstica é um experimento qualitativo utilizado para
avaliar a susceptibilidade das larvas frente a uma concentração padrão, denominada
dose diagnóstica, que corresponde à concentração de inseticida equivalente ao dobro da
concentração letal que mata 99% das larvas (CL99) da cepa suscetível (Rockefeller). De
acordo com a mortalidade, a população é classificada em três status: mortalidade acima
de 98%, suscetível; abaixo de 80%, resistente; entre 80 e 98%, alteração de
suscetibilidade, necessitando a população de acompanhamento. Já no bioensaio Dose
33
Resposta, quantitativo, as larvas das populações consideradas resistentes são expostas a
um espectro de concentrações crescentes no intuito de definir uma faixa de
concentração de forma a se obter, aproximadamente, uma dose que cause mortalidade
inferior a 10% (CL10), quatro doses com mortalidade em torno de 50% (CL50), duas
abaixo e duas acima e uma dose com mortalidade próxima de 99% (CL99).
Nos dois tipos de bioensaio foram realizados três experimentos, em dias
diferentes, utilizando larvas de terceiro estádio das primeiras gerações de laboratório.
Todos os ensaios foram realizados com o monitoramento da temperatura e umidade e,
ao final de cada ensaio, as larvas sobreviventes foram mortas em água a 70 oC e
desprezadas na pia.
O primeiro passo antes de iniciar os experimentos foi calibrar o inseticida.
Para isso, foram realizados três experimentos Dose Resposta com a cepa Rockefeller,
em dias diferentes, para identificar a CL99 e, assim, determinar a dose diagnóstica
necessária nos experimentos com as populações testadas. Embora a Organização
Mundial de Saúde estabeleça a concentração de 0,012 ppm como a dose diagnóstica
padrão, a depender do fabricante e do lote, podem surgir variações nas formulações do
inseticida, sendo necessário, portanto, a calibração do produto antes de começarem os
experimentos.
3.5.1 Experimento Dose diagnóstica (DD)
Utilizando-se o temephós grau técnico 97,4%, do fabricante Fluka
Analytical e validade até 29/11/2012, foi preparada a solução denominada solução
estoque de 1.000 ppm, a qual foi armazenada por período máximo de 30 dias, na
geladeira. A cada ensaio foi preparada uma solução de uso a partir da solução estoque.
Em cada teste foram expostos oito copos com 20 larvas cada, em 250 mL de
água, na concentração de 0,012 ppm de temephós, correspondente à concentração
diagnóstica desse produto para Ae. aegypti. O controle do experimento foi realizado
expondo-se 20 larvas a 1 mL de etanol em 249 mL de água. No total foram 12 copos,
sendo quatro controles e oito expostos.
A leitura dos testes foi realizada após 24 horas de exposição ao produto,
calculando-se a taxa de mortalidade das larvas. O critério utilizado para definir a larva
como morta foi a diminuição acentuada ou ausência de movimentos, quando comparada
34
com larvas do controle, independente da larva se encontrar no fundo ou na superfície do
copo.
3.5.2 Experimento Dose resposta (DR)
No experimento Dose Resposta, a partir de dados da literatura, são definidas
nove concentrações inicias às quais são submetidas as larvas resistentes das populações
testadas. A partir da mortalidade obtida nessas concentrações iniciais, determinam-se as
doses seguintes. Para cada concentração são utilizados quatro copos (réplicas) com 20
larvas em terceiro estádio cada, totalizando 80 larvas expostas por concentração. O
controle é realizado expondo-se 20 larvas a 0,5 mL de etanol em 99,5 mL de água. No
total são 40 copos, sendo quatro controles e 36 expostos. Simultaneamente, com o
objetivo de confirmar a integridade do ingrediente ativo do temephós, é realizado teste
com larvas susceptíveis da linhagem Rockefeller, expondo quatro copos (réplicas) à
concentração de temephós equivalente à CL99, quatro à CL50 e dois copos com 0,5 mL
de etanol em 99,5 mL de água, representando o grupo controle para esse teste.
A mortalidade das larvas é observada após 24 horas de exposição ao
temephós e o critério utilizado para definir a larva como morta é o mesmo dos ensaios
Dose Diagnóstica.
3.6 Análise estatística
Para análise dos parâmetros de desenvolvimento e reprodução, foram
utilizados os testes de Kruskal-Wallis para as amostras não paramétricas e Anova,
seguida do teste de Tukey para as amostras com distribuição normal. Para análise da
sobrevivência foram aplicados os testes de Kaplan-Meier e Cox-Mantel.
Em relação às análises estatísticas dos parâmetros da morfometria
geométrica alar, para testar a normalidade das distribuições amostrais foi empregado o
teste de Kolmogorov-Smirnov. Como a maioria das amostras não apresentou
distribuição normal, para comparações múltiplas do tamanho do centróide aplicou-se o
teste não paramétrico Kruskal-Wallis para e as comparações baseadas no tamanho do
centróide foram realizadas análises estatísticas bicaudais ao nível de rejeição 0,05
através do programa Graph Pad Instat 3.10.
35
As análises da disparidade métrica e assimetria alar foram realizadas através
da construção do arquivo integrado com todas as asas, direita e esquerda, de cada
população que por sua vez foi transformado em única matriz de relative warps.
A análise dos dados referentes à resistência aos inseticidas foi obtida com o
auxílio do software SPSS Statistics 17.0, via análise probit. Foram calculadas as
concentrações letais que matam 50% e 99% (CL50 e CL99) das larvas expostas ao
temephós e as razões de resistência (RR50 e RR99) calculada por meio da razão entre as
respectivas concentrações letais da cepa experimental e as concentrações letais da cepa
Rockefeller.
3.7 Considerações Éticas e de biossegurança
A manutenção da colônia de Ae. aegypti requer alimentação sanguínea com
uso de animais e esta atividade é realizada no insetário do Laboratório de Parasitologia
com aprovação pelo Comitê de Ética e Pesquisa Animal da Universidade Federal de
Sergipe aprovada segundo o protocolo 12/07. Para criação de Ae. aegypti, o insetário
segue as normas técnicas contidas nos Parâmetros de biossegurança para insetários e
infectórios de vetores (FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ, 2005).
36
4 RESULTADOS
4.1 Obtenção dos ovos
A instalação das ovitrampas nos municípios sergipanos revelou a alta
infestação pelo mosquito Ae. aegypti no estado, com a positividade das armadilhas
chegando a 91% do total de armadilhas instaladas. Além disso, verificou-se que os
municípios mais próximos de Aracaju, capital do estado, apresentaram percentual de
armadilhas positivas superior a 50%, além de concentrarem os maiores valores de ovos
por imóvel investigado. A quantidade de ovos por imóvel variou de 23, em Canindé de
São Francisco, distante 213 km da capital, a 218 em Maruim, município a 30 km de
Aracaju. (Tabela 1).
Tabela 1. Distribuição dos municípios sergipanos de acordo com a quantidade de
ovitrampas instaladas e a média de ovos coletados. Sergipe, 2011.
Município Período da
coleta
Armadilhas
instaladas
Armadilhas
positivas (%)
Total de ovos
coletados
Média de
ovos/imóvel
investigado
Maruim fev/11 100 91 21.896 218
Carira out/10 100 80 6.161 61
Capela mar/11 100 77 7.140 71
Aracaju (Porto
Dantas)
mar/10 30 56 1.540 51
Canindé de
São Francisco
jun/10 100 51 2.302 23
Pinhão nov/10 100 39 2.367 23
Neópolis mar/10 100 28 2.801 28
37
4.2 Aspectos da capacidade vetorial
4.2.1 Variáveis de desenvolvimento
Quando criadas em laboratório, em condições controladas de temperatura,
umidade, densidade e alimentação, as larvas de Ae. aegypti das populações provenientes
dos municípios de Pinhão, Porto Dantas e Canindé de São Francisco concluíram a fase
imatura mais cedo que as larvas de originárias do município de Neópolis, com a duração
da fase imatura se estendendo até em torno do 17º dia, embora a população de Pinhão
tenha apresentado a fase imatura de menor duração entre todas as populações
sergipanas. Para as demais populações, Rockefeller e Neópolis, as pupas começaram a
surgir mais tardiamente e a duração do período entre a eclosão dos ovos e emergência
das fêmeas adultas foi maior. Houve diferença estatística entre todas as populações em
relação à duração em dias do período larvário (p<0,05) quando comparadas aos pares,
além de que a comparação das populações sugere a formação de dois grupos distintos,
um unindo as Rockefeller e Neópolis e outro abrigando as populações de Canindé,
Pinhão e Porto Dantas (Figura 3).
38
Figura 3: Distribuição das populações de Ae. aegypti de Sergipe de acordo com a duração em
dias do período entre a eclosão dos ovos e a emergência das fêmeas adultas.
Do total de ovos usados no experimento, a quantidade de pupas formadas e
de adultos que emergiram ocorreu de forma similar entre todas as populações. O
percentual de pupas formadas a partir do total de ovos utilizados variou de 88% para a
população de Canindé a 98% em Porto Dantas. Já a emergência dos adultos,
considerando o total de ovos, variou entre 75% em Canindé e 86% em Porto Dantas.
Embora a quantidade de pupas e adultos formados diariamente não tenha variado entre
as populações, quando observada a razão sexual para os mosquitos alados, houve maior
quantidade de machos que fêmeas em todas as populações, com exceção de Neópolis,
onde machos e fêmeas emergiram em quantidades equivalentes. Na cepa Rockefeller, a
quantidade de machos foi quase o dobro da quantidade de fêmeas (Tabela 2).
39
Tabela 2. Dados da pupação e emergência considerando a quantidade de larvas inicial e
as três réplicas para cada população.
População Pupas (%) Adultos (%) Razão sexual (fêmeas:machos)
Porto Dantas 98 86 0,7:1
Rockefeller 96 85 0,6:1
Pinhão 92 77 0,7:1
Neópolis 89 79 1,1:1
Canindé 88 75 0,6:1
Quando considerada a sobrevivência de machos e fêmeas nas três condições
de alimentação, observou-se que a longevidade dos adultos para cada tipo de tipo de
dieta é diferente entre machos e fêmeas e varia entre as populações consideradas.
Na condição de jejum, em nenhuma população a sobrevivência dos
indivíduos excedeu seis dias de vida. Na população de Canindé, única que diferiu de
todas as demais (p<0,05), embora algumas fêmeas conseguissem sobreviver até o sexto
dia, houve mortalidade de metade da população já no terceiro dia de jejum. Na
população de Pinhão, que apresentou maior número de fêmeas que conseguiram
sobreviver até o sexto dia, as maiores mortalidades ocorreram entre o quarto e quinto
dias (Figura 4).
40
Figura 4: Distribuição das populações de acordo com os dias de sobrevivência das fêmeas
submetidas ao jejum.
Na dieta com oferta apenas de solução açucarada, a população de Neópolis
diferiu das demais por apresentar fêmeas com maior sobrevivência (p<0,05), atingindo
21 dias, seguida da cepa Rockefeller. Entre as demais populações, Canindé, Pinhão e
Porto Dantas, não houve diferença estatística (p>0,05) na sobrevivência para esta dieta
(Figura 5).
Quando mantidas em condições ideais de alimentação, com oferta de
solução açucarada e repasto sanguíneo, as fêmeas das populações Rockefeller e
Neópolis diferiram entre si (p=0,015) e das demais (p<0,05). Na amostra Rockfeller a
mortalidade ocorreu mais tardiamente e, ao final dos 30 dias de observação, 30% das
fêmeas permaneciam vivas, contra 10% da população de Neópolis. As fêmeas das
demais populações submetidas à dieta com solução de sacarose e repasto sanguíneo não
diferiram entre si (p>0,05) (Figura 6).
41
Figura 5: Distribuição das populações de acordo com os dias de sobrevivência das fêmeas
submetidas à dieta apenas com solução açucarada.
Figura 6: Distribuição das populações de acordo com a sobrevivência das fêmeas submetidas à
dieta com solução açucarada e repasto sanguíneo.
42
A sobrevivência dos machos nas mesmas condições de alimentação às quais
as fêmeas foram submetidas apresentou o mesmo padrão da sobrevivência das fêmeas
para algumas populações. Na condição de jejum, não houve divergência entre a
sobrevivência de machos e fêmeas em nenhuma população (p>0,05). No entanto, na
dieta com oferta de solução de sacarose e repasto sanguíneo, em todas as populações as
fêmeas foram mais longevas que os machos (p<0,01). Para a alimentação apenas com
solução de sacarose, houve divergência entre a sobrevivência de machos e fêmeas das
populações Rockefeller e Neópolis (p<0,01), o que não diferiu entre as demais
populações (p>0,05).
Quando comparada a sobrevivência dos machos nas dietas da solução
açucarada e na dieta em que, além do açúcar, oferecia-se repasto sanguíneo às fêmeas,
não houve diferença significativa para os machos de Canindé, Pinhão e Porto Dantas
(p>0,05). Nas demais populações, Rockefeller e Neópolis, a adição de repasto
sanguíneo para as fêmeas aumentou a longevidade dos machos (p<0,01).
4.2.2 Variáveis de reprodução
Quando analisada a ingestão de sangue pelas fêmeas, observou-se diferença
na quantidade de sangue ingerido para algumas populações. As fêmeas das populações
Rockefeller e Neópolis ingerem mais sangue que as fêmeas das demais populações e
não diferem entre si (p<0,01). Entre as populações de Canindé, Porto Dantas e Pinhão,
nas quais as fêmeas ingerem menor quantidade de sangue, não há diferença estatística
(p>0,05), embora a população de Porto Dantas tenha apresentado maior amplitude de
variação (Figura 7).
43
Figura 7: Distribuição das populações de Ae. aegypti de Sergipe de acordo com a quantidade de
sangue ingerido pelas fêmeas.
Na análise da fecundidade das fêmeas, observada através da quantidade de
ovos por fêmea bem como do número de fêmeas que não realizou postura após o
primeiro repasto sanguíneo, observou-se que Pinhão foi a população com menor
número de ovos, diferindo estatisticamente das populações Rockefeller (p<0,01) e
Neópolis (p<0,05), que apresentaram as maiores quantidades de ovos por fêmea (Tabela
3). Embora a população de Neópolis apresentasse fêmeas com maior número de ovos
postos, a quantidade total de ovos foi maior para a cepa Rockefeller, com 1.411 ovos,
enquanto para Neópolis registrou-se o total de 902 (Figura 8).
44
Figura 8: Distribuição das populações de Ae. aegypti de Sergipe de acordo com a quantidade de
ovos por fêmea.
A população de Porto Dantas apresentou o maior percentual de fêmeas
inférteis, diferindo de Rockefeller (p=0,03), Canindé (p=0,04) e Pinhão (p=0,01).
Pinhão, embora sendo a população com menor quantidade de ovos por fêmea,
apresentou percentual de fêmeas férteis equivalente ao das populações Rockefeller,
Canindé e Neópolis (p<0,05), nas quais foram observadas as maiores médias de ovos
por fêmea.
A análise da viabilidade dos ovos quando submetidos à condição de estresse
indicou que a única semelhança quanto à quantidade de ovos viáveis ocorreu entre as
populações de Neópolis e Porto Dantas (p=0,67). As demais populações diferiram entre
si (p<0,01), sendo que Rockefeller apresentou a menor viabilidade enquanto as maiores
viabilidades foram observadas nas populações de Canindé e Pinhão (Tabela 3).
45
Tabela 3. Dados da oviposição individual para as populações de Ae. aegypti de Sergipe.
População Total de
ovos
Média ovos/
fêmea
Fêmeas com
postura (%)
Ovos viáveis em
estresse ambiental (%)
Rockefeller 1.411 64 73,4 1,0
Neópolis 902 60 50,0 7,3
Canindé 786 56 77,8 14,7
Pinhão 656 28 76,7 29,9
Porto Dantas 540 49 42,3 8,6
4.2.3 Análises morfométricas
A análise do tamanho do centróide possibilitou verificar que, entre todas as
populações consideradas, nenhuma amostra divergiu estatisticamente quanto aos lados
direito e esquerdo (p>0,05) (Figura 9). Além disso, Neópolis e Pinhão foram as
populações que apresentaram, respectivamente, maior e menor tamanho do centróide,
de modo que houve diferença significativa entre elas (p<0,001). Comparações
envolvendo as demais populações não indicaram diferença estatística entre elas quanto
ao tamanho do centróide (p>0,05). Na figura 10 é possível observar a distribuição das
populações quanto ao tamanho do centróide da asa direita das fêmeas para cada
amostra. As populações de Neópolis, Porto Dantas e Pinhão apresentaram indivíduos
com tamanhos discrepantes em relação aos demais indivíduos de suas respectivas
amostras (Figura 10).
46
Figura 9: Tamanho do centróide das asas direitas e esquerdas das fêmeas de Ae. aegypti para
cada população.
Figura 10: Tamanho do centróide da asa direita das fêmeas de Ae. aegypti para cada população.
47
Quanto à análise da disparidade métrica, observou-se que a população do
Porto Dantas apresenta o maior polígono, indicando que é a mais diversa
fenotipicamente e geneticamente, enquanto a de Canindé de São Francisco tem menor
variabilidade (Figura 11).
Figura 11: Gráfico dos componentes principais obtido através da comparação da disparidade
métrica intra e interpopulacional.
Comparações multivariadas da forma alar considerando simultaneamente as
asas direitas e esquerdas das cinco populações geraram duas variáveis canônicas. No
gráfico da análise discriminante da forma alar, a grande intersecção na área de dispersão
das asas direita e esquerda das fêmeas de cada população indica baixa ou nenhuma
assimetria intrapopulacional (Figura 12), o que pode ser confirmado pela matriz da
distância de procrustes, que mostra a distância fenotípica em cada grupo. As
comparações entre as asas esquerda e direita dentro de cada população revelam que a
assimetria na forma alar é mínima na maioria das amostras, porém é quase três vezes
maior em Neópolis (Tabela 4).
48
Legenda: 135D (Can D), 135E (Can E), 136D (Pin D), 136E (Pin E), 138D (Neo D), 138E (Neo
E), 139D (PD D), 139E (PD E), 140D (Rocke D), 140E (Rocke E).
Figura 12: Gráfico bidimensional formado pelas variáveis canônicas obtidas na comparação
entre as amostras das cinco populações (Can, Pin, Neo, PD e Rocke) indicadas na legenda.
Tabela 4. Valores das distâncias de procrustes para todos os espécimes analisados com
destaque para as comparações entre as asas direitas e esquerdas de cada população.
Can D Can E Pin D Pin E Neo D Neo E PD D PD E Rocke D
Can E 0,0054
Pin D 0,0277 0,0276
Pin E 0,0257 0,0255 0,0093
Neo D 0,0121 0,0146 0,0253 0,022
Neo E 0,0171 0,0201 0,0325 0,0289 0,0134
PD D 0,033 0,0349 0,0343 0,0354 0,0304 0,0319
PD E 0,0339 0,036 0,0356 0,0367 0,0313 0,032 0,0051
Rocke D 0,0304 0,0318 0,0376 0,0343 0,0253 0,0274 0,0261 0,0265
Rocke E 0,0315 0,0336 0,0388 0,0357 0,0258 0,0255 0,0243 0,0243 0,0074
49
4.3 Bioensaios de resistência ao organofosforado temephós
Os bioensaios de avaliação da resistência ao temephós com larvas de Ae.
Aegypti foram realizados no período entre setembro de 2010 e novembro de 2011.
O experimento Dose resposta com a cepa Rockefeller, para calibração do
inseticida, identificou a concentração 0,006 mg/L como responsável pela mortalidade de
99% dos indivíduos expostos. Assim, a dose diagnóstica utilizada nos experimentos,
equivalente ao dobro da concentração que mata 99% dos indivíduos da cepa susceptível,
foi 0,012 mg/L, mesma dosagem fixada pelo Ministério da Saúde.
Nos experimentos qualitativos de Dose Diagnóstica, a mortalidade variou
entre 0% e 10%, classificando todas as populações como resistentes ao
organofosforado, visto que os valores foram abaixo de 80%. Nesses testes, Neópolis foi
a população com maior mortalidade, em média 9,75% e desvio padrão 2,12. Já a menor
mortalidade ocorreu na população de Pinhão, com média de 0,12% e desvio padrão
0,35. A mortalidade da cepa Rockfeller foi acima de 98%, comprovando sua
susceptibilidade ao larvicida e validando, portanto, os resultados dos testes nas demais
populações.
Uma vez identificadas como resistentes, as amostras foram submetidas ao
teste Dose Resposta para quantificar o nível de resistência das populações. Foram
calculadas as concentrações letais CL50 e CL99 de cada população. A amostra de Pinhão
apresentou os maiores e mais discrepantes valores em comparação com as demais
populações. Assim, houve a suspeita de que a coleta em Pinhão pudesse ter sido
realizada em momento imediatamente após ações de controle vetorial através da
aplicação intensiva do larvicida, o que poderia ter selecionado os indivíduos mais
resistentes. Diante dessa possibilidade de viés, nova coleta foi realizada no município
para desenvolver novos experimentos a fim de constatar a veracidade dos resultados. A
primeira coleta foi realizada em novembro de 2010 e a segunda em agosto de 2011.
Assim como na primeira amostra, os experimentos da segunda coleta de Pinhão
continuaram apresentando os valores mais discrepantes para as concentrações letais,
sendo que na segunda amostra quando as CL50 e CL99 foram, respectivamente, 0,45
mg/L e 2,68 mg/L. Em contrapartida, a população Porto Dantas apresentou os menores
valores para as CL50 e CL99, sendo eles 0,03 mg/L e 0,20 mg/L, respectivamente (Tabela
5).
50
A razão de resistência (RR) define o grau de resistência de cada população
analisada em relação à população de referência e é calculada através da divisão do valor
da concentração letal da população analisada pelo valor da equivalente concentração
letal da cepa susceptível. Calculou-se a razão de resistência para as CL50 e CL99. Assim,
RR50 = CL50 da população analisada RR99 = CL99 da população analisada
CL50 da cepa Rockefeller CL99 da cepa Rockefeller.
Como valores da razão de resistência entre 3 e 5 indicam baixa resistência,
de 5 a 10 a resistência é moderada, entre 10 e 20 resistência média e, acima de 20, alta
resistência (CAMPOS & ANDRADE, 2003) e todas as populações apresentaram
valores de RR99 superiores a 20, detectou-se alta resistência ao temephós em todos os
municípios sergipanos considerados. Além disso, entre as populações, o valor da CL99
foi de 3,7 a 16,8 vezes maior que o valor da CL50 (Tabela 6).
51
Tabela 5. Valores das concentrações letais da população de referência Rockefeller e das
populações de Ae. aegypti provenientes do município de Sergipe, 2011.
População Concentrações
letais
Valor estimado
(mg/L)
Limite de confiança (95%)
inferior – superior (mg/L)
Rocke
CL50 0,002 0,002 – 0,003
CL99 0,009 0,007 – 0,012
Porto Dantas
CL50 0,034 0,032 – 0,037
CL99 0,200 0,170 – 0,250
Neópolis
CL50 0,07 0,071 – 0,078
CL99 0,26 0,24 – 0,28
Canindé
CL50 0,08 0,06 – 0,10
CL99 0,86 0,60 – 1,45
Maruim
CL50 0,09 0,08 – 0,10
CL99 0,77 0,60 – 1,08
Carira
CL50 0,08 0,06 – 0,10
CL99 1,34 0,81 – 3,04
Capela
CL50 0,11 0,09 – 0,13
CL99 0,79 0,53 – 1,56
Pinhão 1
CL50 0,31 0,27 – 0,36
CL99 1,89 1,26 – 3,72
Pinhão2
CL50 0,45 0,41 – 0,48
CL99 2,68 2,30 – 3,20
52
Tabela 6. Valores para a razão de resistência (RR) das larvas de Ae. aegypti das
populações dos municípios sergipanos analisadas, 2011.
População RR50 RR99 CL99/CL50
Rocke 1 1 4.5
Porto Dantas 17 22.2 5.9
Neópolis 35 28.9 3.7
Canindé 40 95.6 10.8
Maruim 45 85.6 8.6
Carira 40 148.9 16.8
Capela 55 87.8 7.2
Pinhão 1 155 210.0 6.1
Pinhão 2 225 297.8 6.0
53
5 DISCUSSÃO
A positividade das ovitrampas instaladas nos municípios sergipanos revela a
alta infestação por Ae. aegypti que ocorre no estado. Embora as armadilhas tipo
ovitrampa indiquem a infestação através do número de ovos coletados, dado este que
não necessariamente revela a real produção de mosquitos adultos, a positividade das
armadilhas atesta o elevado número de imóveis em cada município com presença da
fêmea de Ae. aegypti em busca de recipientes apropriados para realizar a postura.
Assim, apesar da ovitrampa não estimar a população de mosquitos alados, a presença de
ovos nos imóveis revela que os moradores estão expostos às investidas das fêmeas para
realizar a hematofagia, a qual é necessária para maturação dos ovos.
Nos municípios mais próximos à capital sergipana, mais da metade das
armadilhas instaladas foram positivas para ovos de Ae. aegypti e registrou-se maior
quantidade de ovos por imóvel investigado. Os valores extremos ficaram para Maruim,
município que faz parte da região da Grande Aracaju, distante 30 Km da capital, onde
registrou-se a maior média, 218 ovos por imóvel, e Canindé de São Francisco, que dista
213 Km da capital, onde a média foi de 23 ovos. É possível que os níveis de infestação
estejam relacionados à densidade demográfica, visto que nas proximidades da capital do
estado tende a haver maior número de habitantes por Km2. Canindé de São Francisco e
Maruim, que foram, respectivamente, entre os municípios sergipanos estudados, os que
apresentaram menor e maior média de ovos por imóvel investigado, são também os
municípios com menor (27,36 hab./km²) e maior (174,29 hab./Km²) densidade
demográfica, respectivamente. Regiões com maior concentração populacional tendem a
apresentar maior proliferação de Ae. aegypti (KNUDSEN & SLOOFF, 1992;
CHIARAVALLOTI NETO et al., 1998; BARATA et al., 2001; THAVARA, et al.,
2001; BRAKS et al., 2003). Aglomerações de pessoas estão frequentemente
relacionadas à maior oferta de recipientes em condições apropriadas para o
desenvolvimento do mosquito, o que viabiliza maiores níveis de infestação.
Todas as populações de Ae. aegypti analisadas diferiram significativamente
entre si quanto à duração do ciclo de vida do mosquito desde a eclosão das larvas até a
emergência do adulto, além de que a análise do processo de formação das pupas e da
emergência dos adultos sugeriu a formação de dois grupos: um com as populações
54
Rockefeller e Neópolis, onde pupas e adultos aparecem mais tardiamente e em maior
período de dias, e outro concentrando as populações de Porto Dantas, Pinhão e Canindé
de São Francisco, com desenvolvimento mais precoce e encurtamento do ciclo de vida.
Estudos têm mostrado que, em condições ambientais adversas, os culicídeos
frequentemente encurtam o estágio de larva para chegar mais rapidamente ao estágio de
pupa (NELSON, 1986), fase de resistência da espécie quando, inclusive, não ocorre
alimentação. Esse comportamento poderia ser viável no ambiente natural das
populações de Canindé de São Francisco e Pinhão, ambas com clima semi-árido e
oriundas do sertão sergipano, mas não se relaciona com a população Porto Dantas,
originária de Aracaju, cidade litorânea com temperatura média anual favorável ao
desenvolvimento do mosquito.
Embora diferentes entre si quanto ao início e duração dos processos de
pupação e emergência, as populações apresentaram quantidades equivalentes de pupas
formadas e de adultos que emergiram. Para a pupação houve variação de 10 pontos
percentuais entre a população com maior (Porto Dantas) e a de menor (Canindé) valor
observado. Para todas as populações, houve considerável aproveitamento dos
indivíduos, com percentual de larvas conseguindo completar o ciclo de vida e atingindo
a fase adulta variando de 75% na população de Canindé a 86% para Porto Dantas.
O estudo do ciclo de vida de populações de Ae. aegypti de diferentes
ambientes em cinco temperaturas constantes revelou interações significativas entre as
populações e a temperatura. Em regiões tropicais, esta espécie é caracterizada por um
ciclo biológico curto, da fase de ovo até o adulto, com duração de 15 a 30 dias
(BESERRA et al., 2006), o que se assemelha com os dados obtidos nesse estudo, com
duração do ciclo de vida partindo da eclosão dos ovos até a emergência do adulto
variando entre 12 e 22 dias.
Apesar de o esperado ser fêmeas e machos emergirem em quantidades
equivalentes, entre os adultos que emergiram houve maior proporção de machos que de
fêmeas em todas as populações, exceto em Neópolis, onde a razão sexual foi 1,1:1. Se,
por um lado, maior quantidade de fêmeas é importante para a capacidade vetorial visto
que apenas as fêmeas realizam a hematofagia e podem transmitir arbovírus para
hospedeiros susceptíveis, por outro lado, maior quantidade de machos em relação às
fêmeas é importante para o sucesso reprodutivo uma vez que, embora uma única cópula
seja suficiente para que a fêmea armazene espermatozóides para fertilizar seus ovos
55
durante a vida inteira, elas geralmente copulam múltiplas vezes com machos diferentes
(BORDA et al. 2003), o que favorece a variabilidade genética das populações.
É possível que alguma alteração nas bandejas de criação, como acúmulo de
resíduos alimentares e exúvias na água, tenha provocado maior mortalidade das pupas
no final da fase imatura, momento em que há maior quantidade de fêmeas, visto que os
machos emergem primeiro. Assim, maior mortalidade dos imaturos nesse período
resultaria em menor quantidade de fêmeas na população adulta. No entanto, semelhante
ao registrado neste estudo quanto à razão sexual, em mosquitos capturados no Rio de
Janeiro em três ambientes distintos, foi observada maior proporção de machos que
fêmeas de Ae. aegypti (LIMA-CAMARA et al., 2006). Em contrapartida, em estudo da
coexistência de Ae. aegypti e Ae. albopictus em cinco municípios do Paraná, observou-
se que a razão sexual de fêmeas por machos foram equivalentes a 1:1 para Ae. aegypti,
variando entre 0,8:1 e 1,5:1, enquanto para Ae. albopictus os valores da razão sexual
foram mais oscilantes, variando entre 0,38:1 e 5:1 (FANTINATTI et al., 2007),
discordância também registrada por Lima-Camara et al. (2006).
A longevidade dos adultos sob diferentes dietas revelou distintos padrões de
sobrevivência para machos e fêmeas entre as populações. Na condição de jejum, fêmeas
da população de Canindé foram menos longevas que as fêmeas das demais populações.
É possível que nesta população as fêmeas tenham desviado muita energia para a rápida
conclusão do ciclo de vida, uma vez que emergem mais precocemente que as fêmeas da
população de Neópolis, por exemplo, o que evidencia um custo maior no metabolismo,
o que pode ter interferido na sobrevivência das fêmeas diante da estressante condição de
jejum. Quando oferecida solução de sacarose às fêmeas, a população de Neópolis
apresentou a maior sobrevivência, mais próxima de Rockefeller que as das demais
populações. Quando adicionado o repasto sanguíneo à dieta, fêmeas das amostras de
Neópolis e Rockefeller foram mais longevas que as fêmeas das outras populações,
embora também diferissem entre si. Assim, com exceção da condição de jejum,
observa-se que entre as fêmeas dos municípios sergipanos, as das populações de
Canindé, Pinhão e Porto Dantas apresentam padrão de sobrevivência semelhante e com
menor longevidade que as fêmeas de Neópolis, que sobrevivem por mais tempo e estão
mais próximas da cepa Rockefeller, mantida em laboratório por muito tempo.
Não apenas quanto à sobrevivência, mas na maioria dos parâmetros
reprodutivos e de desenvolvimento observados, a população de Neópolis apresentou
56
tendência de aproximação com a cepa Rockefeller e ficou mais distante das demais
populações. Entre as populações sergipanas, a de Neópolis sobreviveu mais, ingeriu
maior quantidade de sangue e apresentou maior média de ovos por fêmea e fêmeas de
maior tamanho, porém, foi a menos fértil quando os ovos foram submetidos a estresse
climático, condição na qual as populações do sertão sergipano, Canindé e Pinhão,
exibiram maior fertilidade. É possível que este comportamento observado na população
de Neópolis esteja relacionado ao seu ambiente de origem, a região do Baixo São
Francisco, onde as condições ambientais são semelhantes às condições mantidas em
laboratório. Além disso, em relação ao temephós, a amostra de Neópolis apresentou um
dos menores status de resistência, o que pode ter contribuído para melhor desempenho
no fitness desta população.
Além disso, para as populações Rockefeller e Neópolis, a longevidade das
fêmeas interfere na sobrevivência dos machos. A dieta com adição do repasto sanguíneo
aumentou o tempo de vida das fêmeas, o que é fisiologicamente compreensível, uma
vez que as fêmeas precisam do sangue para maturação dos ovos e, ao realizar o repasto
sanguíneo, são estimuladas a manter o ciclo de vida através da reprodução, o que
demanda maior sobrevivência, fato que não ocorre nas réplicas que estão privadas deste
repasto. No entanto, a oferta de sangue não interfere no metabolismo dos machos, que
se alimentam apenas com solução açucarada. Porém, os machos das réplicas nas quais
foi adicionado o repasto sanguíneo para as fêmeas viveram mais dias que aqueles
condicionados apenas à oferta de solução de sacarose. Possivelmente em virtude da
presença das fêmeas, os machos desviaram energia para ampliar a sobrevivência e,
assim, garantir maior sucesso reprodutivo. Este comportamento é importante para a
capacidade vetorial visto que a presença dos machos junto com as fêmeas por maior
número de dias viabiliza a realização de cópulas por maior período de tempo e,
consequentemente, pode aumentar a oviposição e a densidade do vetor.
A longevidade das fêmeas é um parâmetro fundamental da capacidade
vetorial, mais importante inclusive que a densidade (MACDONALD, 1952), visto que
interfere na probabilidade da fêmea tornar-se infectante para hospedeiro vertebrado
susceptível, uma vez que ela deve sobreviver tempo suficiente para ultrapassar o tempo
de duração do ciclo extrínseco do vírus. Ao avaliar tanto a sobrevivência quanto à
fecundidade diária de Ae. aegypti da Tailandia em diferentes tratamentos nutricionais, a
saber: com água, solução de sacarose a 2%, com sangue de galinha viva mais água,
57
sangue mais solução de sacarose a 2% e sangue sozinho, Day et al. (1994) verificaram
que as fêmeas vivem mais em laboratório quando lhes é fornecida uma fonte de
carboidrato, embora o aumento da sobrevida associada à alimentação não reflita em
aumento no sucesso reprodutivo, visto que não houve diferença significativa na
oviposição em nenhuma das dietas com sangue. Além disso, machos mantidos só com
açúcar sobreviveram significativamente mais que aqueles nos outros tratamentos.
Lansdowne e Hacker (1975) observaram a sobrevivência de Ae. aegypti em
condições constantes e flutuantes de temperatura e umidade e constataram que não
houve diferença significativa na longevidade dos machos entre os dois tipos de
ambiente, em contraste com as fêmeas que manifestaram a tendência de serem mais
longevas no ambiente externo flutuante. Além disso, foi observada clara diferença
quanto ao sexo, com maior sobrevivência de fêmeas que de machos. Mais recentemente,
Strickman (2006) realizou estudo semelhante ao anterior comparando a longevidade das
fêmeas da Tailândia mantidas em gaiolas com a daquelas soltas no campo e observou
que, nas gaiolas, a sobrevivência estava relacionada com a temperatura, sendo maior
para os mosquitos engaiolados no período do frio, com mais de 75% das fêmeas vivas
após 30 dias, em detrimento aos meses mais quentes, com a temperatura atingindo 41
°C, quando a sobrevivência reduziu para menos de 40% no 30º dia. Para populações do
Rio de Janeiro, no entanto, a sobrevivência de fêmeas de Ae. aegypti foi mais alta
durante a estação seca (MACIEL-DE-FREITAS, 2006).
No presente estudo, quando oferecido às fêmeas dieta com solução de
sacarose e repasto sanguíneo, a maior sobrevivência foi observada para a cepa
Rockefeller, com 30% das fêmeas permanecendo vivas no 30º dia do experimento,
enquanto as populações sergipanas não alcançaram essa porcentagem. Mesmo Neópolis,
a mais longeva entre as populações sergipanas, no 30º dia apresentou menos de 10% de
fêmeas vivas enquanto em Canindé e Porto Dantas, metade das fêmeas já havia morrido
no 8º dia e para Pinhão as fêmeas não alcançaram o 30º dia. Dessa forma, no tocante à
capacidade vetorial da espécie, é preciso pensar na longevidade das fêmeas dessas
populações em seus ambientes de origem, visto que o esperado é que vivam menos
tempo no campo que engaioladas e a duração do ciclo extrínseco é de 9 a 14 dias,
embora a replicação e maturação do vírus no inseto sejam aceleradas com o aumento da
temperatura (WATTS, et al., 1987; FOCKS et al., 1995).
58
Quanto à fecundidade das fêmeas, embora Pinhão tenha a menor média de
ovos por fêmea, foi uma das populações com maior quantidade de fêmeas que
realizaram a postura. Na população de Neópolis, por exemplo, onde foi observada a
maior média de ovos por fêmea entre as populações sergipanas, metade das fêmeas que
realizou o repasto sanguíneo não ovipôs, ou seja, há menos fêmeas ovipondo, porém,
uma maior quantidade de ovos. Além disso, é possível que o número de ovos por fêmea
bem como a quantidade de fêmeas realizando postura, seja maior nos ciclos
gonotróficos seguintes, já que nesse estudo, a fecundidade das fêmeas foi observada
apenas para o primeiro repasto sanguíneo. Borda et. al (2003) observaram que a
primeira oviposição da maioria das fêmeas não correspondia à postura com maior
número de ovos. De qualquer forma, os resultados sugerem uma possível relação entre a
média de ovos postos e o status de resistência das populações, visto que Pinhão, com
menor média, foi a população mais resistente ao temephós e Neópolis apresentou umas
das menores razões de resistência. Porém, a fecundidade parece estar também associada
ao estresse climático enfrentado pelas populações em seu ambiente de origem, visto que
a população de Pinhão enfrenta o clima da região do semi-árido, enquanto Neópolis, na
região do Baixo São Francisco, dispõe de condições ambientais mais favoráveis.
A temperatura e a umidade são fatores abióticos fundamentais para
capacidade vetorial visto que influenciam não apenas na longevidade das fêmeas
(TSUDA & TAGAKI, 2001; STRICKMAN, 2006; HARRINGTON et al., 2008;
MILLERON et al., 2008), mas também interferem no período de incubação extrínseco
do vírus e no ciclo de desenvolvimento (DONALÍSIO & GLASSER, 2002), na eclosão
e viabilidade dos ovos (MILLERIN et al., 2008; DELLATE et al., 2009), na duração da
fase imatura, e no comportamento do repasto sanguíneo e ciclo gonotrófico
(NAHARAJ, 2003; ALMEIDA et al., 2005).
Canyon et al. (1999), ao investigar os efeitos da umidade e da concentração
de açúcar na sobrevivência e fecundidade de fêmeas de Ae. aegypti, observaram que a
fecundidade não foi afetada pela concentração de açúcar, mas, assim como a
sobrevivência, esteve associada à umidade. Em baixa umidade houve demora
significativa na oviposição e menor quantidade de ovos por fêmea, enquanto a média de
ovos foi duas vezes maior quando a umidade aumentou, de modo que, provavelmente,
parte do sangue ingerido quando as fêmeas estavam expostas a baixa umidade, pode ter
sido utilizada para manutenção do corpo. Quanto à longevidade, o percentual de
59
sobrevivência das fêmeas foi estatisticamente mais baixo e a mortalidade mais alta nos
ambientes com baixa umidade em relação aos ambientes com umidade alta.
O monitoramento semanal da oviposição de Ae. aegypti de três localidades
da Província de Salta, Argentina, observado durante um ano, revelou que durante a
estação seca o número de ovos foi pequeno nas três localidades e a atividade de
oviposição aumentou quando a temperatura subiu acima de 60%, com os maiores picos
de densidade populacional associados a chuvas mais intensas. Mesmo em temperaturas
favoráveis ao desenvolvimento do vetor, não foi observado aumento na atividade de
oviposição quando as chuvas foram escassas (MICIELI e CAMPOS, 2003). De forma
semelhante, o estudo da dinâmica populacional de Ae. aegypti associada a condições
ambientais na cidade de Uberlândia, Minas Gerais, mostrou que no clima seco a
positividade das armadilhas foi de 13,5%, enquanto no período chuvoso atingiu 86,5%.
Quanto à emergência de adultos, também foi observada redução na estação seca durante
os meses mais frios e secos (COSTA et al., 2008).
Com exceção das populações originárias do sertão sergipano, a viabilidade
dos ovos em condição de estresse não chegou a 9%. Para os ovos de Canindé e Pinhão,
no entanto, o percentual de viabilidade foi de 14,7 e 29,9% dos ovos, respectivamente.
Não foi verificado se a inviabilidade dos ovos ocorreu em função da morte do embrião
ou devido à interrupção no desenvolvimento em virtude da alta temperatura. Para
populações de Ae. aegypti provenientes de ambientes da Paraíba com temperatura média
mensal de 25 °C, o aumento da temperatura da água, a partir de 21 °C até 32 °C,
provocou redução no tempo de desenvolvimento embrionário. Além disso, quando os
ovos foram mantidos em temperatura de 17 °C, não ocorreu eclosão. No entanto,
quando submetidos a temperatura elevada de 34 °C, a viabilidade dos ovos das mesmas
populações variou entre 33,2% e 65,6%, o que sugere que essas populações de Ae.
aegypti são mais sensíveis à redução que ao aumento na temperatura, de modo que é
possível que os mosquitos adaptados a temperaturas acima de 20 °C não se
desenvolvam em temperaturas mais baixas que aquelas da sua região de origem.
(BESERRA, 2006). No presente estudo, os ovos foram mantidos em temperaturas mais
altas que as observadas nos municípios sergipanos de origem, sendo, no entanto, mais
próximas das registradas nos municípios do sertão sergipano, nos quais observou-se
maior eclosão, porém ainda baixa viabilidade. É possível que a umidade relativa do ar,
60
variando entre 20% e 90%, também tenha interferido na viabilidade dos ovos, que foi
baixa mesmo para as populações teoricamente mais adaptas a variações ambientais.
Tanto a fecundidade das fêmeas quanto a fertilidade dos ovos são fatores
importantes da capacidade vetorial de Ae. aegypti, visto que estão diretamente
relacionados à densidade de mosquitos por área e, quanto maior a quantidade de
mosquitos a qual o homem está exposto, maior a chance de ser alvo das investidas da
fêmea para realizar o repasto sanguíneo. Mesmo em ambientes com períodos de seca
prolongados, como é o caso do município de Canindé, que faz parte do polígono das
secas, a infestação pelo vetor pode ser mantida em função da capacidade que os ovos
desta espécie apresentam de entrar em estado de quiescência e resistir a longos períodos
de dessecação (SILVA & SILVA, 1999). De modo que, quando houver condições
favoráveis à eclosão dos ovos, é possível que ocorra rápido crescimento populacional
mesmo que a área esteja sob intervenção de controle vetorial, especialmente porque Ae.
aegypti é espécie oportunista, r-estrategista, capaz de utilizar grande variedade de
recipientes como criadouros (LIMA et al., 1988; TUN-LIN et al.,1995; SOUZA-
SANTOS & CARVALHO, 2000; PEREIRA, 2001, 1996; DONALÍSIO e GLASSER,
2002; DOMINGOS, 2005; SILVA et al., 2006; LAGROTTA, 2006; LAZCANO et al.,
2006, MACIEL-DE-FREITAS, 2007). O crescimento rápido da população quando em
condições favoráveis pôde ser observado no presente estudo através da tendência de
encurtamento do ciclo de vida apresentado pelas populações originárias do sertão
sergipano quando criadas em laboratório sob condições ambientais adequadas.
Através da análise do tamanho do centróide, observou-se que não há
diferença estatística no tamanho dos indivíduos das populações, exceto entre Pinhão e
Neópolis, já que foram, respectivamente, as populações com indivíduos menores e
maiores. A princípio, o tamanho dos espécimes pareceu estar relacionado com o status
de resistência das populações ao organofosforado temephós. Entre as populações, os
indivíduos da amostra de Pinhão são os mais resistentes e apresentam tamanho mais
reduzido, enquanto para Neópolis, com indivíduos maiores, a razão de resistência esteve
entre as menores. No entanto, essa associação não é válida quando considerado o
tamanho dos indivíduos da cepa Rockefeller, padrão de susceptibilidade ao inseticida,
cujo tamanho do centróide não diferiu do encontrado em populações resistentes como a
de Porto Dantas e de Canindé de São Francisco. Dessa forma, provavelmente a
resistência ao temephós não repercutiu em perda no tamanho dos espécimes e talvez as
61
populações de Neópolis e Pinhão possuam indivíduos, respectivamente, maiores e
menores, porque apresentam programação genética para isso, seja através do processo
de seleção natural imposta pelo ambiente ou por deriva genética.
O gráfico dos componentes principais obtido através da comparação da
disparidade métrica apresenta a amostra de Porto Dantas com maior polígono, indicando
que a população de Porto Dantas é mais diversa fenotipicamente e geneticamente que as
demais, enquanto a população de Canindé de São Francisco é a de menor variabilidade.
É possível que, em algum momento, em função de condições ambientais desfavoráveis
ao desenvolvimento de Ae. aegypti, o tamanho da população dos mosquitos no
município de Canindé de são Francisco tenha sofrido redução (efeito gargalo de
garrafa), impedindo que parte dos genótipos participassem na produção das gerações
seguinte, contribuindo assim para a perda da diversidade genética. Ou talvez a baixa
variabilidade seja resultante do efeito fundador, com uma nova colônia de mosquitos
estabelecida na localidade a partir de um número reduzido de indivíduos da população
original. É possível ainda que a diferença na variabilidade entre as populações ocorra
em função da localização no estado dos municípios de origem. A população Porto
Dantas, oriunda da capital sergipana, está localizada em área com maior movimentação
e fluxo intenso de pessoas em função de turismo seja através do aeroporto ou estradas, o
que possibilitaria maior fluxo gênico, enquanto Canindé, além de ser a população mais
afastada da capital, com menor intercâmbio com outras áreas infestadas, sofre com
longos períodos de estiagem, o que pode ser um fator limitante para a espécie.
Apesar dos valores da distância de procrustes, que indicam o grau de
divergência entre os indivíduos analisados morfometricamente, mostrar que a assimetria
é mínima entre os indivíduos de cada população, a amostra de Neópolis apresentou
maior valor de assimetria, chegando a ser quase três vezes maior que em outras
populações. No entanto, esperava-se que a amostra de Canindé de São Francisco fosse a
mais assimétrica, visto que o ambiente de origem é caracterizado por longos períodos de
estiagem e condições extremas de temperatura, o que representa estresse ambiental para
a espécie, fator este associado à assimetria bilateral em outras espécies de dípteros
(WOODS, et al., 1999; MPHO et al., 2001, 2002; SOUZA et al., 2007). No município
de Neópolis, as condições ambientais são favoráveis ao desenvolvimento da espécie Ae.
aegypti e aparentemente não há indício de estresse ambiental. De qualquer maneira,
mesmo para os indivíduos de Neópolis, há uma ligeira assimetria quanto à forma alar, o
62
que não interfere na capacidade vetorial da espécie, visto que o esperado é que
indivíduos com assimetria alar significativa tenham maior dificuldade de dispersão, o
que, a depender do ambiente, reduziria suas chances de encontrar hospedeiro vertebrado
para realizar o repasto sanguíneo. Além disso, a assimetria bilateral observada foi
referente à forma alar, que talvez seja menos prejudicial ao vôo que a assimetria de
tamanho. No entanto, são necessários mais estudos para esclarecer esse resultado.
Resultado semelhante referente à assimetria alar foi observado através da
comparação morfométrica de indivíduos da espécie Culex quinquefasciatus
provenientes de dois ambientes ecologicamente distintos do estado de São Paulo. Neste
estudo, as duas populações analisadas apresentaram leve assimetria alar, embora a
hipótese fosse de que os espécimes do ambiente mais poluído e modificado fossem mais
assimétricos (MORATORE, 2009). Em contrapartida, em outro estudo morfométrico
comparativo entre três populações também de Culex quinquefasciatus, observou-se
tênue assimetria bilateral da forma alar nas populações, porém mais pronunciada na
amostra proveniente de área associada a estresse ambiental (PERUZIN, 2009).
Quanto aos experimentos de avaliação da resistência ao organofosforado
temephós, os altos valores da razão de resistência revelam que a ação antrópica, através
da aplicação descontrolada de inseticida, provoca alterações na composição genética das
populações de Ae. aegypti visto que induz a pressão seletiva dos indivíduos resistentes e
a resistência é uma característica genética. Os dados são considerados preocupantes,
uma vez que indicam comprometimento da ação do larvicida, interferindo assim na
eficácia do controle vetorial. Resistência elevada foi encontrada em todas as populações
sergipanas analisadas, o que pode explicar parcialmente as falhas em relação ao controle
vetorial no estado e aponta a necessidade urgente de substituição do produto utilizado
por outro com diferente mecanismo de ação. A resistência ao temephós também foi
encontrada em outros estados do Nordeste, como Paraíba e Ceará (BESERRA, et. al.,
2007; OLIVEIRA et. al., 2001; LIMA et. al., 2006).
De acordo com a Secretaria Estadual de Saúde, a substituição do temephós
já foi iniciada em municípios da Grande Aracaju, onde é usado o regulador do
crescimento dos insetos, diflubenzuron. Porém, entre todas as populações analisadas
neste estudo, a originada da capital sergipana foi a que apresentou os menores valores
de resistência. Experimentos anteriores realizados com indivíduos de Aracaju no ano de
2001 já apontavam RR90 de 6,1, indicando resistência moderada (BRAGA et al., 2004).
63
Em 2008, em testes realizados com a população PD, encontrou-se RR99 igual a 19,83,
limite superior da resistência média (VALENÇA, 2009). Atualmente, três anos após os
últimos experimentos, a RR99 calculada foi de 22,2, classificada como alta. Este
histórico da resistência das amostras de Aracaju revela a rápida seleção de indivíduos
cada vez mais resistentes, o que pode inviabilizar o uso do temephós em curto espaço de
tempo. Assim, embora houvesse estudos que indicassem a necessidade da troca do
produto desde 2001, a substituição só ocorreu no final de 2009. Desse modo, há
preocupação ainda maior com os municípios do interior, onde não há monitoramento da
resistência e foram encontrados valores discrepantes de resistência que evidenciam o
uso incorreto do produto.
Além disso, os valores da RR99 encontrados nas duas amostras da população
de Pinhão mostraram-se muito elevados em relação aos demais, inclusive com aumento
da resistência no curto espaço de tempo entre a primeira e a segunda coletas. Esse fato
chama a atenção e sugere que o larvicida possa estar sendo utilizado de maneira
divergente dos demais municípios, o que é preocupante, visto que se este
comportamento continuar, é possível que ocorra rápida seleção de resistência a outros
compostos.
Na maioria das populações, os valores das CL99 foram mais de seis vezes
maiores que os valores das CL50, o que mostra que em Sergipe as populações de Ae.
agypti apresentam heterogeneidade quanto à resistência ao temephós. Em 2011, estudos
realizados com populações de diferentes localidades dos estados de Rio de Janeiro,
alagoas e Sergipe, inclusive Aracaju, a diferença entre os valores da CL90 e CL50 não foi
superior a 2,7 para nenhuma amostra. Naquele ano, essa diferença para a amostra
proveniente do município de Aracaju foi de 2,2 (BRAGA et al., 2004) e hoje é 5,9 vezes
maior. Embora no presente estudo a amostra de Aracaju não tenha considerado todo o
município, mas a localidade do bairro Porto Dantas, é possível sugerir que, ao longo
desses anos, a população de Ae. aegypti tornou-se menos homogênea quanto à
resistência dos seus indivíduos ao organofosforado temephós.
A heterogeneidade das populações quanto à resistência ao temephós parece
não ter relação direta com a heterogeneidade observada na dispararidade métrica da
análise morfométrica dos indivíduos. No gráfico dos componentes principais obtido
através da comparação da disparidade métrica (figura 11), a população de Porto Dantas,
que apresenta menor divergência entre as CL99 e CL50 (Tabela 4), é a que exibe maior
64
polígono, indicando também maior divergência fenotípica e genética. Já amostra
proveniente de Canindé do São Francisco é uma das mais heterogêneas no tocante à
diferença dos valores das concentrações letais, porém mais homogênea quanto à
disparidade métrica.
65
6 CO�CLUSÕES
Mesmo dentro de uma área relativamente pequena como o estado de
Sergipe, foi possível encontrar variações em aspectos da capacidade vetorial de
diferentes populações de Ae. aegypti. Porém, nem sempre foi possível associar essas
variações às diferenças climáticas do ambiente de origem das populações ou ao status
de resistência ao temephós.
Todas as populações de Ae. aegypti oriundas de regiões com diferentes
condições ambientais diferem significativamente entre si quanto à duração do período
larvário e aos processos de formação das pupas e emergência diária, embora pareça
existir uma tendência de aceitação das hipótese levantadas para a duração do ciclo de
vida, visto que parece existir dois grupos, um compondo as populações provenientes de
ambiente mais estressante, como Canindé e Pinhão, no qual parece ter ocorrido
encurtamento do ciclo de vida com formação das pupas e emergência dos adultos mais
precoces, e outro grupo juntando Neópolis e Rockefeller, onde a pupação e a
emergência ocorrem mais tarde e lentamente.
A população de Neópolis é a única entre as populações de Sergipe estudadas
a apresentar fêmeas e machos em quantidade equivalentes, enquanto nas demais
populações a razão sexual indica maior quantidade de machos, o que não confirma a
hipótese formulada de que as quantidades de macho e fêmea seriam semelhantes em
todas as populações.
Em todas as populações, e com exceção da dieta em jejum, as fêmeas
sobrevivem mais que os machos nas diferentes condições de alimentação, o que está de
acordo com a hipótese levantada, embora não estivesse previsto que a longevidade de
fêmeas e machos fosse equivalente quando submetidos ao jejum. Além disso, aumento
na sobrevivência das fêmeas induz aumento na sobrevivência dos machos.
A quantidade de sangue ingerido pelas fêmeas por ocasião do primeiro
repasto sanguíneo é maior para a população de Neópolis, que também apresentou
fêmeas de maiores tamanhos, logo, proporcionalmente, é possível que não ocorra
diferença na quantidade de sangue ingerido nas diferentes populações.
66
Pinhão é a população com fêmeas menos fecundas enquanto Neópolis
apresenta maior média de ovos por fêmea, diferente da hipótese levantada de que a
quantidade de ovos seria semelhante entre as populações.
As populações de Pinhão e Canindé apresentam maior viabilidade dos ovos
submetidos a estresse climático, em detrimento às populações de Neópolis e Porto
Dantas, o que corrobora a hipótese formulada de que fêmeas de populações
provenientes de região com ambiente de maior amplitude térmica e longos períodos de
estiagem apresentam maior fertilidade dos ovos submetidos a condições estressantes em
comparação com as fêmeas das demais localidades.
As populações não diferem muito quanto ao tamanho dos indivíduos, com
diferença de tamanho apenas entre Neópolis e Pinhão que, são, respectivamente, as
populações com indivíduos maiores e menores e com menor e maior status de
resistência ao temephós, o que está parcialmente de acordo com a hipótese formulada de
que indivíduos das populações com maiores índices de resistência seriam menores que
os indivíduos da cepa susceptível.
As fêmeas das populações são simétricas quanto ao tamanho da asa e a
ocorrência de assimetria é mínima entre as populações, porém mais acentuada na
população de Neópolis, o que refuta a hipótese de que populações submetidas a estresse
climático em seu ambiente de origem é que seriam mais assimétricas.
As populações apresentam diferentes status de resistência ao temephós, o
que confirma a hipóteses de que elas enfrentam diferentes pressões seletivas nos
municípios do estado de Sergipe.
As fêmeas da população de Neópolis são mais longevas, ingerem maior
quantidade de sangue, são maiores que as fêmeas das demais populações, mais
fecundas, e apresentam um dos menores status de resistência ao temephós. Enquanto as
fêmeas da população de Pinhão sobrevivem menos, apresentam baixa fecundidade,
ingerem pouca quantidade de sangue e são as mais resistentes ao temephós, o que
sugere que indivíduos das populações resistentes ao temephós tendem a apresentar
perda nos parâmetros da capacidade vetorial.
67
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