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Aspectos fundamentais de EM
• Ionizar é preciso: (a) ionização da amostra direta ou indiretamente; (b) método tradicional: ionização por impacto de
elétrons resultando na formação de M+ seguida de fragmentação induzida por excesso de energia interna do íon molecular;
(c) ionização química: método mais suave de ionização resultante de uma reação, em fase gasosa, entre íons e moléculas neutras;
(d) outros métodos mais recentes.
• Analisar m/z é preciso: Cenas dos próximos capítulos!!
Espectro de massas (ionização por elétrons) de
uma substancia simples
i) Identificação do íon molecular (massa nominal), M+..
ii) Identificação do pico base (m/z 77).
iii) Identificação do íon m/z 105, (M-16)+
• Analito depositado
numa “matriz”
orgânica, que possui
absorção intensa no
do laser ( = 337 nm
para laser de N2);
• Dessorção por um
laser pulsado (ns) de
alta intensidade;
• Espectro resultante
inclui íons (M+H)+, e
outros com prótons
adicionais, retirados
da matriz.
Ionização por MALDI
Espectro de um anticorpo monoclonal
Rel
ativ
e A
bu
nd
ance
Mass (m/z)
0
10000
20000
30000
40000
50000 100000 150000 200000
MH+
(M+2H)2+
(M+3H)3+
MALDI TOF spectrum of IgG
Positive-ion (a) and negative-ion (b) MALDI mass spectra of CS-D tetra with pmg.
Polysulfated-Derived Oligosaccharides
Aplicações de MALDI
• Identificação de proteínas de elevada massa molecular
( > 100.000 Da).
• Espectros de proteínas grandes apresentam íons
[M+H]+, [M+2H]2+, e [M+3H]3+.
• Proteínas pequenas apresentam espectros apenas
com [M+H]+.
• Alta sensibilidade.
• Espectros de polímeros sintéticos.
• Imagem por espectrometria de massas!!
IMS allows for distinction of different molecular species of β-amyloid plaques in an
Alzheimer's disease model.
Seeley E H , and Caprioli R M PNAS 2008;105:18126-18131
©2008 by National Academy of Sciences
Métodos de ionização a pressão atmosférica
• APCI: ionização química a pressão atmosférica.
• APPI: ionização química por fotoionização.
• ESI: electrospray
• DESI: electrospray por dessorção
• DART: (direct analysis in real time).
Aplicações de APCI
Tipo de amostras
• Substancias de polaridade e massa molecular
mediana: PAH, PCB, ácidos graxos,
esteroides, ftalatos,...
• Substancias sem sítios ácidos ou básicos.
• Substancias contendo heteroátomos: uréias,
carbamatos, ..
• Substancias a serem evitadas: substancias
instáveis a temperaturas mais altas, massa
molecular elevada,...
Espectro de massas de íons positivos obtido por APPI de petróleo
venezuelano (cortesia do líder imortal HC)
ESI – electronspray ionization
+
+
+
+
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+ +++
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++ +
+++
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++
+ + + + + + + + +++
++
1-10 kV
Solução
~10-5M
Capilarborossilicato
N2 paradessolvatação
Regiões de vácuoPressão atmosférica
Cone deTaylor
fissão
íonssolvatados
íonssem
solvente
ver
Procedimento típico em ionização “electrospray”
• Substancia dissolvida numa mistura, p.ex. agua-metanol, é injetada diretamente, ou por HPLC, ou por eletroforese capilar.
• Íons são formados a partir das gotas a pressão atmosférica e formam um jato por expansão livre. O mecanismo exato ainda é objeto de especulações. Amostragem ocorre através de um “skimmer”, e introduzidos no alto vácuo do espectrômetro.
• Íons provenientes de macromoléculas possuem freqüentemente um numero elevado de cargas.
• Espectros de massa medem a relação m/z e portanto íons com carga múltipla podem ser detectados mesmos com instrumentos menos sofisticados.
• A medida de distribuição de cargas não é sempre trivial. O número de cargas pode depender do pH, da presença de sais, desnaturação da proteína, quebra de ligações S-S, etc.
Espectro de massas pela técnica de “electrospray” de uma enzima: espectro indica as cargas dos íons e M = 17828 2.0
Da
Determinação do número de cargas e de M em espectros contendo íons com cargas múltiplas
a) Em espectros “electrospray”, a massa de um íon m1 com carga z1 pode ser equacionada em termos da massa da molécula (M) e da massa do próton (mp)
m1z1 = M + z1mp
b) Escolhendo outro pico no espectro, separado por (j-1) picos em ordem crescente de m/z, podemos equacionar a massa m2 como
m2(z1 – j) = M + (z1 – j) mp
c) Resolvendo as duas equações,
)(
)(
)(
11
12
2
1
p
p
mmzM
mm
mmjz