Microbilogia

Aula Pratica - Ação de agentes químicos e físicos sobre o crescimento bacteriano

Objetivos: 1. Definir esterilização, desinfecção e anti-sepsia.2. Definir os agentes bactericida e bacteriostático.3. Verificar a diferença de ação sobre o microrganismo de agentes físicos e químicos4. Discutir os mecanismos de ação de agentes físicos e químicos utilizados no

experimento pratico.5. Verificar a interferência de fatores externos na ação dos agentes físicos e

químicos.

Introdução:

Esterilização: é o processo de inativação total por meio de agentes físicos e químicos de todas as formas de vida quanto a capacidade reprodutiva, mas que não significa, necessariamente, destruição de todas as suas enzimas, produtos metabólicos, toxinas, etc.

Desinfecção: consiste na inativação ou redução dos micro-organismos presentes no material inanimado. A desinfecção não implica a eliminação de todos os micro-organismos viáveis, porém elimina a potencialidade infecciosa do objeto, superfície ou local tratado.

Anti-sepsia: consiste no mesmo conceito dado à desinfecção, só que está relacionada a substancias aplicadas ao organismo humano.

Limpeza: o simples ato de lavar com água e sabão pode por si só, resultar em efeito redutor dos micro-organismos patogênicos e a níveis suportáveis, tornando o local ou o alimento aceitável.

Há certos princípios básicos que devem ser lembrados e que são aplicáveis a todos os métodos de controle de micro-organismos. Em primeiro lugar o agente deve afetar diretamente os micro-organismos. Além disso, o contato do agente com o microrganismo é facilitado pela limpeza da superfície local ou do objeto a ser tratado.

Os processos de esterilização, desinfecção e anti-sepsia não são instantâneos, sendo necessário permitir a ação do agente escolhido pelo tempo adequado. Influem no tempo de ação diversos fatores, tais como: o número e natureza dos micro-organismos presentes, o tipo de agente selecionado, a temperatura, etc.

O controle da multiplicação bacteriana se dá por duas maneiras: inibição e morte. No primeiro caso, a ação do agente utilizados tem a capacidade de inibir a multiplicação, determinando um bloqueio de uma (ou de um conjunto) função fisiológica. No segundo caso, a ação do agente determina a perda irreversível da capacidade de reprodução. Esta é, portanto, a diferença fundamental entre os mecanismos de ação microbiostática e microbicida, respectivamente.

A microbiostase pode ser definida como a condição na qual o microrganismo está vivo, mas não multiplica. O agente determina um bloqueio metabólico suficiente para impedir a sua multiplicação, sem, contudo lesá-lo irreversivelmente. O efeito microbicida é compreendido como a morte do organismo. Um fato importante é que a microbiostase é perfeitamente reversível, desde que a inibição verificada não tenha sido prolongada a ponto de as células irem morrendo gradativamente. Podemos, então, comparar, grosso modo, a microbiostase a morte “lenta”, enquanto que o efeito microbicida é rápido.

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Agentes físicos:

Efeito do calor sobre o crescimento bacteriano.a)Técnica do experimento da ação de água fervente:- inocular uma alíquota de 0,1mL de uma suspensão de E. coli e outra de B. cereus pelo método de superfície em Agar EMB e MYP, respectivamente e identificar a placa como controle.- após a inoculação das placas controle, colocar a suspensão de micro-organismos em banho de água fervente e inocular por esgotamento decorridos os tempos de 5, 10 e 20 minutos em uma placa, pelo método de esgotamento em Agar EMB e MYP, devidamente dividida e identificada.- Incubar em estufa por 24hs a 35-37ºC- Proceder à contagem.

Esquema da técnica de analise:

2 placas EMB 2 MYP

Suspensão de E.coli

5’ 10’

20’

controle

Banho deágua fervente

Incubar por 24 hs a 35-

37ºC

0,1 mL

Alça de níquel cromo

Suspensão de B. cereus

5’ 10’

20’

controle

Banho deágua fervente

Incubar por 24 hs a 35-

37ºC

Alça de níquel cromo

0,1 mL

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b) Técnica do experimento da ação do calor úmido em vapor sob pressão- Inocular assepticamente uma suspensão de E. coli em caldo nutritivo e colocá-lo no interior de uma autoclave a temperatura de 121ºC por 15’.- Inocular pelo método de superfície 0,1 mL da suspensão de E. coli em Agar EMB em uma placa de Petri.- Repetir o procedimento com B. cereus em Agar MYP- Incubar as placas por 24hs a 35-37ºC- Proceder à contagem.

Esquema de analise:

Resultados

Micro-organismos

Tempo de exposição em água fervente

controle 5’ 10’ 20’E. coli

B. cereus

Sob a ação do calor úmido em vapor sob pressão (121ºC por 15’)

E. coli

B. cereus

1 placa EMB 1 placa MYP

Autoclavar por 15’ a 121ºC

0,5 mL

Suspensão de E. coli

ouSuspensão

de B. cereus

Caldo nutriente

Incubar por 24 hs a 35-37ºC

Inocular 0,1 mL

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Agentes químicos:

Efeito da ação de anti-sépticos sobre o crescimento bacteriano.a) Técnica de experimento da ação do vinagre e hipoclorito de sódio (concentração

utilizada para desinfecção de frutas, verduras e legumes).- Colocar 1,0 mL de suspensão de E. coli em 100mL de solução de vinagre a 2% por 15’ e em solução de hipoclorito de sódio a 200ppm, também por 15’.- Decorrido o tempo, inocular 0,1mL das soluções acima em Agar EMB pelo método de superfície.- Incubar em estufa por 24hs a 35-37ºC- Proceder à leitura.- Repetir o procedimento com suspensão de B. cereus e inocular em Agar MYP.

Esquema de analise:

2 placas EMB 2 placas MYP

Suspensão de E.coli

ouSuspensão

de B. cereus

Incubar por 24 hs a 35-37ºC

Vinagre 2% Hipoclorito de sódio a 200ppm

0,1 mL 0,1 mLApós 15’

1,0 mL

1,0 mL

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b) Técnica do experimento da ação do álcool a 70% e álcool a 92,8%

- Colocar 1,0 mL da suspensão de E. coli em 100 mL de solução de álcool a 70% e solução de álcool a 92,8%.- Após 15’, inocular 0,1 mL da solução acima pelo método de superfície em placas de Petri em Agar EMB.- Incubar as placas por 24hs a 35-37ºC- Proceder à leitura.

- Repetir o procedimento com B. cereus e inocular em Agar MYP.

Esquema de analise:

2 placas EMB 2 placas MYP

Suspensão de E.coli

ouSuspensão

de B. cereus

Incubar por 24 hs a 35-37ºC

Álcool 70%

0,1 mL

1,0 mL1,0 mL

Álcool 92,8%

0,1 mL

Após15’

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c) Analise das eficácias do álcool a 70% na desinfecção e anti-sepsia.

Anti-sepsia- Umedecer um swab estéril em meio liquido, esfregar na mão e semear em uma metade de placa com Agar BP. Umedecer um segundo swab em álcool 70%, passar na outra não e aguardar por 5’, e semear em outra metade da placa.- Repetir o procedimento do experimento do álcool 70%, com o álcool 92,8% e com o detergente.- Incubar a 35-37ºC por 24hs- Proceder a leitura.

Desinfecção- Umedecer um swab estéril em meio liquido, esfregar na bancada do Laboratório de Tecnologia de Carnes e semear em uma metade de placa com Agar BP. Fazer a desinfecção da bancada com álcool a 70%, esperar 5’, umedecer um swab estéril em meio liquido e semearem outra metade da placa.- Incubar a 35-37ºC por 24hs- Proceder à leitura.

Esquema de analise:

2 placas Agar BP

MÃO

Swab umedecido

estérilSwab com

álcool 70%

Swab com álcool 92,8%

Lavar com detergente

Esfregar swab

umedecido estéril

Agar BP Agar BP

Incubar por 24 hs a 35-37ºC

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Resultado: Construa uma tabela demonstrativa objetiva e clara da ação dos diferentes agentes físicos e químicos sobre crescimento bacteriano.

Conclusão: De acordo com os resultados acima, compare e discuta o melhor agente desinfetante e anti-séptico.

1 placa Agar BP

BANCADA

Swab umedecido

estéril

Desinfecção com álcool 70%

Swab umedecido

estéril

Incubar por 24 hs a 35-37ºC

Agar BP

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Tabela com resultados da ação de diferentes agentes físicos e químicos no crescimento bacteriano.

Agentes Tempo B. cereus E. coli

Placa Controle Água fervente 5’

10’20’

Autoclavagem 15’Vinagre 2% 15’Hipoclorito de sódio 200ppm 15’Álcool 70% 15’Álcool 92,8% 15’Controle – mãosMãos - álcool 70% 5’ - álcool 92,8% 5’ - detergenteBancada – controleApós desinfecção com álcool 70% 5’

7 placas EMB7 placas MYP3 placas Agar BP

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