Aula04 tecnicas diagnostico virologia parte 2 final

VirologiaAno Lectivo 2010/11

Técnicas DiagnósticoVirologia – Parte II

TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

Detecção do genoma viral

Futuro do diagnóstico de vírus

Necessidade de equipamento e pessoal treinado

Biologiareal-time PCR

TécnicasMolecular

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 2

TÉCNICAS

Métodos de Amplificação

Polimerase Chain Reaction (PCR)

Restriction Fragment Lenght Position (RFLP)

Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)

Reverse Transcriptase - Polimerase Chain Reaction (RT- PCR)

Real-Time PCR

Sequenciação

Métodos de Hibridização

Captura Híbrida

Southern Blot

Hibridização em tiras

CHIPS


TécnicasMolecular


Extracção Ácidos Nucleicos

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

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ExtracçãoÁcidos Nucleicos Biologiareal-time PCR

TécnicasMolecular


Líse alcalina;

Neutralização;

Precipitação de Proteínas e detritos celulares;

Purificação Ácidos Nucleicos

Precipitação

Eluição em colunas

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TécnicasMolecular



TécnicasMolecular



TécnicasMolecular


Add DNase

Add RNase

+ DNase (protein)

+ RNase (protein)

Utilização Nucleases

Remoção DNA

Remoção RNA

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TécnicasMolecular


Avaliação Ácidos Nucleicos por Espectofotometria UV

Estimar a concentração de DNA e RNA a ~260nm.[dsDNA] ≈ A260 x (50 µg/mL)

[ssRNA] ≈ A260 x (40 µg/mL)

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Técnicas de Amplificação AN


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PolymeraseChain Reaction Biologiareal-time PCR

TécnicasMolecular


Amplifica um fragmento de DNA especifico;

Amplificação através de ciclos repetidos que vão permitir obter milhões de

cópias do fragmento pretendido;

Fragmento pretendido está localizado entre duas regiões de DNA de

sequência conhecida;

Região Alvo

5’ – (…) ATGCGTATCGATCGATATCGATAAGCTAGCTAGGCTA (…) – 3’

3’ – (…) TACGCATAGCTAGCTATAGCTATTCGATCGATCCGAT (…) – 5’


TécnicasMolecular



TécnicasMolecular

MISTURA DE REACÇÃO:

DNA

Primers: Oligonucleótidos de cadeia simples comsequência complementar às sequências alvo doADN (idealmente 20-24 nucleótidos);

Buffer: Solução tampão para estabilizar a reacção;

Mg2+ (Magnésio): Ajuda na ligação dos nucleótidose estabilidade da Taq;

dNTP’s: Nucleótidos livres (A, T, C, G);

Taq polimerase: Enzima termo-estável (+/-72ºC)que efectua a cópia da sequencia alvo do ADN.



TécnicasMolecular

PROCEDIMENTO

1º Passo: Abertura do ADN cadeia dupla (T=95ºC);

2º Passo: Annealing/Ligação dos Primers (Ta~50 a 65ºC);

3º Passo: Activação da Taq polimerase (T~75ºC);

3’ – (…) TACGCATAGCTAGCTATAGCTATTCGATCGATCCGAT (…) – 5’

5’ – (…) ATGCGTATCGATCGATATCGATAAGCTAGCTAGGCTA (…) – 3’

ATCCGAT (…) – 5’

5’ – (…) ATGCGTA



TécnicasMolecular

PROCEDIMENTO

4º Passo: Repetição dos passos anteriores por 30-45 ciclos no máximo;

FINAL: Obtenção de 2nºciclos copias do fragmento alvo.



TécnicasMolecular

Electroforese em Gel de Agarose:

Separa as moléculas (proteínas ou ácidos núcleicos) de acordo com o seupeso molecular;

DNA e RNA possuem carga eléctrica negativa migram para o pólo positivo(quanto mais pequenas mais migram);

Brometo de Etídeo que se vai intercalar na dupla hélice de ADN e possibilitara visualização dos fragmentos quando em exposição a luz UV;

Amostras da PCR carregadas no gel;


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TécnicasMolecular

Pólo Positivo (+)

Pólo Negativo (-)


PolymeraseChain Reaction

APLICAÇÕES

Detecção de sequências específicas de DNA viral

Detecção AdV em amostras respiratórias

Detecção EBV em biópsias Nasofaringe

Detecção JCV em LCR

...

DESVANTAGENS

Altamente sensível a contaminação com quantidades residuais de DNA.

Falsos positivos e artefactos.


TécnicasMolecular


Restriction Fragment LengthPolymorphism (RFLP)


TécnicasMolecular




TécnicasMolecular

Baseada na técnica da PCR;

Análise de polimorfismos (mutações pontuais funcionais);

Variação no tamanho de fragmentos de DNA provocada pela actividadediferencial de enzimas de restrição (cortam o DNA numa sequência específica)

Presença de polimorfismo Perda ou ganho de local de restrição Variação no tamanho de fragmentos de DNA.

5’ – (…) ACTGA (…) – 3’

3’ – (…) TGACT (…) – 5’




TécnicasMolecular




TécnicasMolecular




TécnicasMolecular


APLICAÇÕES

Detecção de variantes Virais

Detecção variantes CMV – Associação com resposta a terapia

Detecção variantes HPV – Associação com patologias

Detecção variantes EBV – Associação com agressividade

...

DESVANTAGENS

Todas as do PCR

Sensível a contaminação por DNAses

Artefactos

Single Strand ConformationPolymorphism (SSCP)


TécnicasMolecular




TécnicasMolecular


Análise de polimorfismos/mutações;

Diferenças de sequência de um único nucleótido são suficientes para quecadeias simples de DNA adquiram uma conformação tri-dimensionaldiferente;

Gel de Poliacrilamida permite correr as amostras (apenas em cadeiasimples/desnaturadas) em função da sua conformação.


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TécnicasMolecular





TécnicasMolecular

APLICAÇÕES

Detecção de variantes Virais

Detecção variantes CMV – Associação com resposta a terapia

Detecção variantes HPV – Associação com agressividade

...

DESVANTAGENS

Todas as do PCR

Contaminações

Leitura gel poliacrilamida

ReverseTranscriptase PCR Biologiareal-time PCR

TécnicasMolecular



TécnicasMolecular


Análise de expressão de mRNA;

Usa a enzima Transcritase Reversa para converter o mRNA em cDNA;

Protocolo PCR para aumentar exponencialmente o número de cópias do mRNA;

Molécula Alvo

mRNA: 5’ – AUGCGUAUCGAUAUCGAUAAGCUA (…) AAAAAAAAA – 3’

TTTTTTTTTT – 5’



TécnicasMolecular



TécnicasMolecular

VANTAGENS

Permite fazer análise quantitativa

da expressão de mRNA.



TécnicasMolecular


APLICAÇÕES

Expressão mRNA viral

Avaliação actividade viral

DESVANTAGENS

Todas as do PCR

Contaminações

RealTime PCR Biologiareal-time PCR

TécnicasMolecular



TécnicasMolecular

PCR was traditionally limited to end-point analysis using agarose gels

Limitations of end-point PCR:

Poor precision

Low sensitivity

Short dynamic range

Low resolution

Size-based discrimination

Ethidium bromide for staining does not allow for accurate quantitation

Requires post-PCR processing


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Monitoriza a fluorescência emitida durante a reacção de PCR como um indicador da produções de amplicões em cada ciclo de PCR;

Monitorização em tempo real;

Detecção da amplificação nos estádios precoces da reacção –maior precisão;

Alvo: DNA ou RNA


TécnicasMolecular


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TécnicasMolecular



TécnicasMolecular



TécnicasMolecular

SYBR Green I Sonda de Hibridação Sonda TaqMan


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PCR phases in linear view

Cycle #

[DNA]

ExponentialIf 100% efficiency – exact doubling of products. Specific and precise

Linear

High variability. Reaction components are being consumed and PCR products are starting to degrade.

PlateauEnd-point analysis. The reaction has stopped and if left for long –degradation of PCR products.


TécnicasMolecular

Exponential

Linear

Plateau


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TécnicasMolecular

Baseline – The baseline phase contains all the amplification that is below the level of detection of the real time instrument.

Threshold – where the threshold and the amplification plot intersect defines CT. Can be set manually/automatically

CT – (cycle threshold) the cycle number where the fluorescence passes the threshold

Rn – (Rn-baseline)

NTC – no template control

DRn is plotted against cycle numbers to produce the amplification curves and gives the CT value.


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CT = threshold cycle

Fracção dos ciclos de PCR a partir da qual édetectado sinal


TécnicasMolecular

Quanto maior a quantidade de DNA, menor o valor de Ct


RealTime PCR

Aplicações

Quantificação carga viral

Monitorização carga viral

Monitorização terapêutica

VANTAGENS

Amplificação monitorizada em tempo real

Ausência de processamento pós PCR (baixo risco de contaminação)

Requer pouca quantidade de amostra (DNA ou RNA)

Rápido, Específico, sensível e reprodutível

Quantitativo

Barato


TécnicasMolecular


Sequenciação Biologiareal-time PCR

TécnicasMolecular



TécnicasMolecular

Usada para determinar a sequência de nucleótidos

Método de sequenciação mais utilizado – método didesoxi

Adição de didesoxinucleótidos que terminam a reacção de polimerização

3’ OH – necessário para adição do nucleótido seguinte


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TécnicasMolecular



TécnicasMolecular


Técnicas de Hibridização


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Alvo – DNA ou RNA

Utilização de sondas específicas

Possibilidade de diferenciação entre subtipos de vírus

Técnicas

Captura Híbrida


Southern Blotting

CHIPS

Técnicas de Hibridização



TécnicasMolecular

Captura Híbrida Biologiareal-time PCR

TécnicasMolecular



TécnicasMolecular

Principio da técnica

Hibridização de Ácidos Nucleicos

Amplificação sinal por Quimioluminescência

Método semiquantitativo

Método

Hibridização amostras positivas com sondas específicas

Complexo Sonda-Amostra é capturado por anticorpos de uma microplaca

Reacção com anticorpo secundário conjudado com FA

Adição de reagente e detecção por quimioluminescência



TécnicasMolecular

45 minutesat 65ºC

60 minutesat 65ºC

60 minutesagitação

30 minutes

15 minutes


Southern Blot Biologiareal-time PCR

TécnicasMolecular


Southern Blot Biologiareal-time PCR

TécnicasMolecular


Hibridização em tiras Biologiareal-time PCR

TécnicasMolecular


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TécnicasMolecular

Chips Biologiareal-time PCR

TécnicasMolecular


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Chips



TécnicasMolecular

Tipagem de vírus:

HPV, HCV, HIV

Tubos ou lâminas com sondasespecíficas para cada subtipo

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Chips



TécnicasMolecular

Professor Mark Pallen

We ask the lab for a diagnosis,

expecting a yes or no, but often

end up with just a maybe…


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