AUTOIMUNIDADE

Daniela Amaral ToméR2 da Patologia Clínica

Introdução

• O Sistema Imune normal tem a capacidade de reagir a uma enorme variedade de microorganismos, mas não contra cada antígeno próprio do indivíduo.

• A esta não-responsividade específica a um antígeno induzido pela sua exposição aos linfócitos chamamos de:– Tolerância Imunológica

TolerânciaImunológica

• Ocorre através de três mecanismos:

Exposição Antígeno Linfócito

Os antígenos próprios são classificados como tolerogênicos ou não-imunogênicos e essa sua característica é que gera a tolerância imunológica.

Importância da Tolerância Imunológica

• Primeira: os antígenos próprios normalmente induzem tolerância

• Segunda: aprendermos com ela como induzir tolerância em linfócitos específicos para um antígeno particular, assim podemos ser capazes de usar este conhecimento para prevenir ou controlar as reações imunes indesejáveis.

Mecanismos de Tolerância Imunológica

Autoimunidade

Definida como uma resposta imune contra antígenos próprios.

Tolerância Central da célula T

Tolerância Periférica da célula T

• Ocorre através de três mecanismos:– Anergia: é a inativação funcional dos linfócitos T que ocorre

quando células reconhecem antígenos sem níveis adequados de co-estimuladores que são nescessários para a ativação do linfócito T

– Deleção: a ativação repetida dos linfócitos T maduros pelos antígenos próprios, ou o reconhecimentos dos antígenos próprios sem o segundo sinal, estimulam vias de apoptose que resultam na deleção dos linfócitos T auto-reativos

– Supressão Imune: alguns linfócitos auot-reativos, ao se encontrar com linfócitos próprios, podem se desenvolver em células regulatórias cuja função é prevenir ou suprimir a ativação de outros linfócitos auto-reativos potencialmente perigosos

Anergia

Deleção

Tolerância central dos linfócitos B

Tolerância periférica dos linfócitos B

Fatores genéticos na Autoimunidade

• Múltiplos genes predispõem a doenças auto-imunes, e os genes mais envolvidos nesse processo são os do MHC

• Lembrando que o MHC é a molécula responsável pela apresentação do antígeno ao linfócito T

• Quando temos a herança de determinados alelos de MHC, que são incapazes de apresentar o antígeno ao linfócito T, apresentamos doenças auto-imunes

• Se herdamos um alelo particular do HLA , aumentamos o risco relativo de apresentarmos uma doença auto-imune.

• Porém esse alelo do HLA por si só não irá causar a doença, como no caso da alteração no loci do MHC.

Associações de doenças auto-imunes com alelos do locus do MHC

Genes não-MHC associados a autoimunidade

Papel das infecções na autoimunidade

DOENÇAS AUTO-IMUNES

Orgão Específicas e SistêmicasOrgão Específicas Sistêmicas

Doença de HashimotoDoença de GravesEsclerose Múltipla Artrite ReumatóideMyasthenia Gravis Lúpus Eritematoso Sistêmico

Anemia Hemolítica auto-imune

Esclerose Sistêmica

Púrpura trombocitopênica auto-imune

Doença Mista do Tecido Conjuntivo

Síndrome do anticorpo antifosfolípide

Síndrome de Sjögren

Diabetes Mellitus Tipo 1

DIAGNÓSTICO: ACHADOS SOROLÓGICOS COMUNS PARA AS

VÁRIAS DOENÇAS AUTO-IMUNES

Componentes Nucleares Reconhecidos por auto-anticorpos

• Membrana Nuclear• Cromatina• Nucléolo• Proteínas Nucleares• Partículas Ribonucleoproteínas(RNA)• Moléculas de DNA

Anticorpos Auto-Imunes

• FAN(Fator Anti-Núcleo)Hep-2/ ANA/PAAC• Anti-DNA• ENA (Screening, 4, 6, 8...)• ANCA (C-ANCA ou P-ANCA)• FR (Fator Reumatóide)• Anti-CCP3

ANA/ FAN /IFI EM CÉLULAS

HEP-2/PAAC

ANA (Anticorpos Anti-Nucleares)

• Estão presentes em várias doenças auto-imunes como:– LES– Doença Mista do Tecido Conjuntivo– Artrite Reumatóide– Esclerodermia– Esclerose sistêmica progressiva– Vasculites– Polimiosites– Síndrome de SJögren

ANA

• Pode ser utilizado como indicador :

– Prevendo o aparecimento de doença auto-imune– Diagnóstico– Prognóstico– Para monitorizar efetivamente o tratamento

Histórico do ANA

• 1948: Hargraves descobre a célula LE em pacientes com LES

• 1948 A 1997: Célula LE é usada como critério diagnóstico para LES

• 1957: Fries utiliza a imunofluorescência indireta para teste de triagem de ANA usando imprinting de fígados de camundongo

• Hoje: Imunofluorescência indireta com células Hep-2 (melhores

ANA

• Métodos para diagnóstico:– EIA (Enzyme Imune Assay)– ELISA(Enzyme Linked Imunosorbent Assay)– IFI (Imunofluorescência Indireta)

• ANA anteriormente era chamado de FAN quando realizado por IFI

• Hoje chamamos o ANA de PAAC (Pesquisa de Anticorpos contra Antígenos Celulares)

• A nomenclatura FAN não designava corretamente o teste já que nele descrevemos auto-anticorpos não só contra o núcleo, mas também contra nucléolos, actina, miosina, mitocôndria , Complexo de Golgi, citoplasma.

IFI Hep-2,FAN ou PAAC

• É o teste de escolha na maioria dos laboratórios para triagem e semi-quantificação do ANA

• PAAC é um teste de alta sensibilidade para vários auto-anticorpos

• De acordo com o seu padrão conseguimos determinar os auto-anticorpos envolvidos e a doença auto-imune relacionada

• Várias evidências demonstram que a presença de auto-anticorpos precedem o aparecimento de doenças auto-imunes

• No LES ,o PAAC por IFI em células HEP-2 positivo, pode preceder o aparecimento da doença em até 9 anos

Princípio do Teste: IFI em células Hep-2

A reação de IFI é baseada na ligação dos auto-anticorpos presentes no soro do paciente aos auto-antígenos expressos presentes nas células de carcinoma de laringe humana que são utilizadas como substrato para a detecção dos possíveis auto-anticorpos e estes são revelados por um anticorpo antiimunoglobulina humana conjugado ao isotiocianato de fluoresceína.

Por que células Hep-2?

• Por apresentarem antígenos humanos não encontrados em tecidos de roedores

• Antígenos semelhantes estarem presentes em maiores concentrações

• Apresentarem todas as fases de divisão celular( intérfase/prófase, metáfase, anáfase e telófase)

• Apresentarem também uma relação núcleo/citoplasma em favor do núcleo

• E ainda presença de vários nucléolos

Critérios para Laudar a IFI Hep-2

1. As diluições de triagem são 1/80 e 1/3202. Os critérios morfológicos para a leitura da

lâmina de IFI:a) Aspecto da matriz nuclearb) Aspecto do nucléoloc) Observação de todos os estágios de divisão

celulard) Aspecto do fuso mitóticoe) Aspecto do citoplasma

Correlação dos critérios gerou as seguintes árvores de decisões

1. Padrões nucleares2. Padrões nucleolares3. Padrões relacionados ao aparelho mitótico4. Padrões citoplasmáticos5. A leitura do título final deve ser feita na última

diluição em que o padrão é observável de forma definida

PASSOS PARA LEITURA DA LÂMINA DE IFI HEP-2

1° Passo

• Definição da região celular fluorescente

2°Passo

• Observação da fase de divisão celular e classificação da placa metafásica cromossômica

3°Passo• Caracterização do aspecto da fluorescência

PADRÕES DA IFI HEP-2

Nuclear tipo membrana nuclear• Auto-anticorpos:

– Antilamina e contra componentes antigênicos do envelope nuclear(lâminas,LAPs,nucleoporina,gp210)

• Padrão caracteriza-se por:– Fluorescência de toda a membrana contínua ou pontilhada, sem

fluorescência em nucléolos e citoplasma, há células em todos os estágios de divisão

• Relevância Clínica:– Pode não apresentar associação clínica específica– Associado a Cirrose Biliar Primária, Hepatites auto-imunes– Raramente associado a: doenças reumáticas e SAAF– Associado a algumas formas de LES e Esclerodermia Linear

Nuclear Homogêneo

• Auto-anticorpos:– Anti-DNA nativo, Anti-histona e Anticorpo anticromatina

• Padrão caracteriza-se por:– Nucleoplasma fluorescente e nucléolo não visualizado por

sobreposição da coloração– Placa metafásica positiva na anáfase e telófase

• Relevâncias clínicas:– Anti-DNA nativo: marcador de LES– Anti-histona: marcador de LES induzido por drogas e LES

idiopático– Anticorpo anticromatina: LES, AIJ importante na forma

oligoarticular com uveíte,Síndrome de Felty e HAI

Nuclear pontilhado grosso

• Auto-anticorpos:– Anti-Sm e anti-RNP

• Padrão caracterizado por:– Nucleoplasma com grânulos de aspecto grosseiro e tamanho

heterogêneo– Placa metafásica negativa

• Relevâncias clínicas:– Anti-Sm: marcador para LES– Anti-RNP: critério obrigatório no diagnóstico de doença mista

do tecido conjuntivo, também presente no LES, Esclerose sistêmica e AR.

Nuclear pontilhado grosso reticulado

• Auto-anticorpos:– Anticorpos contra componentes das

ribonucleoproteinas heterogêneas– Componentes da matriz celular

• Padrão caracteriza-se por: – Nucleoplasma com grânulos grandes e grosseiros que

se organizam linearmente formando redes– Placa metafásica negativa

• Relevâncias clínicas:– Raramente presentes em doença auto-imune, exceto

quando em níveis altos

Nuclear pontilhado fino

• Auto-anticorpos:– Anti-SS-A/Ro– Anti-SS-B/La

• Padrão caracteriza-se por:– Nucleoplasma com granulação fina e bem distribuída– Placa metafásica negativa

• Relevâncias clínicas:– Anti-SS-A/Ro: Sjögren primária, LES, lúpus neonatal e

cutâneo subagudo,Esclerose sistêmica e cirrose biliar primária

– Anti-SS-B/La: Sjögren primária, LES e lúpus neonatal

Nuclear pontilhado fino denso

• Auto-anticorpos:– Antiproteína p75 e LEDGF/p75

• Padrão caracteriza-se por:– Nucleoplasma da célula em intérfase apresenta-se como

pontilhado fino denso grosseiro– Placa metafásica positiva com as mesmas carcterísticas do

nucleoplasma• Relevâncias clínicas:– Sem relevância clínica até o momento– Evidenciado em indivíduos normais,processos

inflamatórios específicos e não específicos, doenças alérgicas e auto-imunes

Nuclear pontilhado pontos isolados

• Auto-anticorpos:– Anti-p80 colina – Anti-Sp100

• Padrão caracteriza-se por:– Nucleoplasma com pontos fluorescentes isolados– Placa metafásica negativa

• Relevâncias clínicas:– Anti-p80 colina: sem associação clínica definida– Anti-Sp100: descrito principalmente em Cirrose

biliar primária e em diversas outras situações.

Nuclear pontilhado centromérico

• Auto-anticorpos:– Anti-centrômero

• Padrão caracteriza-se por:– Nucleoplasma da célula em intérfase apresentando

pontilhado com um número constante de 46 pontos

– Placa metafásica positiva• Relevâncias clínicas:– Esclerose sistêmica forma CREST e cirrose biliar

primária e Sjögren

Nuclear pontilhado pleomórfico

• Anticorpo contra núcleo de células em proliferação

• Padrão caracteriza-se por:– Nucleoplasma apresenta-se não fluorescente na

célula em fase S da intérfase, passando a pontilhado com grânulos variando de grosso,fino a fino denso na medida em que a célula evolui para a fase G2

• Encontrado em pacientes com LES

Padrão Nucleolar

• Auto-anticorpos:– Anti-PM/SCL, To/Th,nucleolína , anti-fibrilarina(U3-RNP), anti-

NOR 90 e anti-RNA polimerase I• Relevâncias Clínicas:

– Anti-PM/SCL, To/Th,nucleolína : Sindrome de superposição da polimiosite com esclerose sistêmica

– Anti-fibrilarina: associado a esclerose sistêmica com comprometimento visceral(hipertensão pulmonar)

– Anti-NOR 90 : sem relevância clínica definida, descrito na esclerose sistêmica

– Anti-RNA polimerase I: esclerose sistêmica com compromentimento visceral

Citoplasmático fibrilar linear

• Auto-anticorpos:– Antiactina– Antimiosina

• Descrição :– Fibras de estresse que constituem o citoesqueleto

decoradas de forma retilínea, cruzando toda a extensão da célula e não respeitando os limites nucleares

• Relevâncias clínicas:– Antiactina: hepatite auto-imune– Antimiosina: hepatite C, hepato-carcinoma, miastenia

gravis

Citoplasmático fibrilar filamentar

• Anticorpo antivimentina e antiqueratina

• Descrição do padrão:– Decoração de filamentos com acentuação uni ou

bipolar em relação à membrana nuclear

• Relevância clínicas:– Antiqueratina: doença hepática alcoólica,em várias

doenças inflamatórias e infecciosas

Citoplasmático fibrilar segmentar

• Auto-anticorpos:– Antialfa-actina, antivinculina e anti-tropomiosina

• Descrição de padrão:– Apenas segmentos curtos das fibras de estresse

se encontram fluorescentes.• Relevâncias clínicas:– Anticorpos encontrados nas miastenia gravis,

doença de crohn e colite ulcerativa

Citoplasmático pontilhado polar

• Auto-anticorpos:– Antigolginas

• Descrição do padrão:– A decoração é apenas citoplasmática em pontos

agrupados de situação perinuclear, normalmente em apenas um polo nuclear

• Relevâncias clínicas:– Em altos títulos: LES, Sjögren primária e outras

doenças auto-imunes sistêmicas como ataxia cerebelar e infecções virais por EBV e HIV

Citoplasmático pontilhado pontos isolados

• Anticorpo anti-EEA1, antifosfatidilserina e anticorpo anti-GWB

• Descrição do padrão:– Pontos definidos de número variável por toda a

extensão do citoplasma• Relevâncias clínicas:– Anti-EEA1 e antifosfatidilserina: sem associação

clínica definida– Anti-GWB: associado a Sjögren primário

Citoplasmático pontilhado fino denso

• Anticorpo antiproteína P-ribossomal e anti-PL7/PL12

• Descrição do padrão:– Fluorescência de finos, densos e confluentes pontos,

chegando quase a homogeneidade• Relevâncias clínicas:– Antiproteína P-ribossomal: específico do LES e pode

estar associado a quadros psiquiátricos– Anti PL7/PL12: raramente encontrados na

polimiosite

Citoplasmático pontilhado fino

• Anticorpo anti-histidil t RNA sintetase (Jo1)• Descrição de padrão:– Pontos definidos em grande número e

densidade, célula em divisão e nucléolo não fluorescentes

• Relevâncias clínicas:– Marcador de Polimiosite no adulto– Descrito raramente na dermatomiosite

Citoplasmático pontilhado reticulado

• Anticorpo anti-mitocôndria• Descrição do padrão:– Fluorescência em retículo por todo o citoplasma

• Relevâncias clínicas:– Pode sugerir a presença do anticorpo anti-M2

( antipiruvato desidrogenase), marcador da cirrose biliar primária

– Esclerose sistêmica

Aparelho mitótico tipo centríolo

• Anticorpo antialfa-enolase

• Descrição do padrão:– Ponto fluorescente isolado na célula em repouso

que se divide em dois e migra ao polo oposto do núcleo à medida que a célula entra em divisão

• Relevância clínica:– Altos títulos sugestivo de esclerose sistêmica

Aparelho mitótico tipo ponte intercelular

• Anticorpo antibeta-tubulina• Descrição do padrão:– Antígenos que formam a união entre células mãe

e filha ao final da telófase encontram-se fluorescentes

• Relevâncias clínicas:– Encontrado no LES e na Doença Mista do Tecido

Conjuntivo

Aparelho mitótico tipo fuso mitótico

• Anticorpo anti-HsEg 5• Descrição do padrão:– Há decoração intensa e grosseira nos polos

mitóticos das células em divisão e as pontes intercelulares são positivas em telófase.

• Relevâncias clínicas:– Associado a diversas condições auto-imunes com

baixa especificidade

Misto do tipo nucleolar homogêneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafásica decorada em anel

( cromossomos negativos)

• Anticorpo anti-KU

• Relevâncias clínicas:– Marcador de superposição de polimiosite e

esclerose sistêmica– Pode ocorrer tb no LES e esclerodermia

Misto tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafásica positiva

• Anticorpo anti-topoisomerase I (Scl-70)

• Relevância clínica:– Associado a esclerose sistêmica forma difusa– Mais raramente pode ocorrer na síndrome CREST

Misto tipo citoplasmático pontilhado fino denso a homogêneo e nucleolar homogêneo

• Anticorpo anti-RNP

• Relevância clínica:– Marcador do LES e freqüentemente direcionado

a quadros psiquiátricos.

Misto tipo nuclear pontilhado fino com fluorescência do aparelho mitótico

• Anticorpo anti-NuMa1

• Relevância clínica:– Associado a Síndrome de Sjögren

Importância do PAAC no diagnóstico das doenças auto-imunes

• Função para o clínico de teste de triagem na detecção de doença auto-imune

• Conforme seu padrão podemos relacioná-lo a determinados auto-anticorpos e dessa forma o clínico pode direcionar a pesquisa desses auto-anticorpos utilizando outros testes mais específicos

• Lembrando que após a utilização de células Hep-2 aumentamos a sensibilidade do teste

ANTI-DNA

Anti-DNA

• Alta correlação com a atividade do LES quando há comprometimento renal

• Os testes Anti-DNA em metodologia de IFI e Colorzyme® utilizando como substrato a Crithidia luciliae baseando-se no princípio de reação contra o cinetoplasto

• Devido a sua alta sensibilidade e especificidade essa metodologia é a mais utilizada mundialmente.

Crithidia luciliae

• É um parasita flagelado unicelular • Não patogênico ao ser humano• Encontrado no sistema digestivo de insetos tipo

“moscas varejeiras”• Este microorganismo possui uma estrutura

privilegiada o cinetoplasto que é:– Uma mitocôndria gigante rica em ds-DNA

• Portanto é um substrato sensível e específico para detectar anticorpos anti ds-DNA

Significado Clínico

• A presença de reação positiva para ds-DNA é uma forte evidencia da presença de LES com comprometimento renal

• Este teste faz parte do 10° critério de classificação do LES pelo American College of Rheumatology

Objetivos do teste

• A pesquisa de anticorpos anti-DNA geralmente é utilizada como prova de segmento e diferenciação de diagnóstico de LES

• Realizado para diferenciação de padrão nuclear homogêneo em IFI com células Hep-2

• Utilizado para avaliação do grau de atividade da doença

Princípio do teste- IFI

• Lâminas contendo 14 poços com Crithidia luciliae aderidas neles

• Coloca-se as amostras sorológicas em cada poço• Iniciando triagem com titulações de 1/20 para diagnóstico e

após se positivo repetir com mais titulações até 1/1280• Incubar por 30 minutos em camara úmida• Seguir com lavagens com tampão PBS• Após coloca-se o conjugado (anticorpo anti IgG humana ligado

a fluoresceína)• Incubar por 30 minutos em camara úmida• Seguir com lavagens com PBS• Aplicar glicerina e colocar as lamínulas

IFI Anti-DNA

• Se presença de anti-DNA visualizamos fluorescência do cinetoplasto da Crithidia luciliae

• Lembrar que ele encontra-se posterior ao núcleo na base do flagelo

ENA SCREENING, ENA 4 E ENA 6

Ac Específicos-Detecção do ENA (Anticorpos Nucleares Extraíveis)

• Pode ser realizada através das seguintes técnicas:– Imunodifusão Dupla de Outcherlony (IDD) – ELISA ( antígenos específicos e screening )– IFI com substrato específico (Anti-DNA -

Crithidea Lucillae)– Western Blotting

Método ELISA• Baseia-se na reação antígeno-anticorpo detectáveis através de reações

enzimáticas

• A enzima mais comumente utilizada nestas provas é a peroxidase, que catalisa a reação de desdobramento da água oxigenada (H2O2) em H2O mais O2

• Existem vários modelos de testes de ELISA

• Em sua forma mais simples, chamada ELISA indireto, um antígeno aderido a um suporte sólido (placa de ELISA) é preparado;

• A seguir coloca-se sobre a placa os soros em teste ( ex. soro humano), na busca de anticorpos contra o antígeno.

Método ELISA• Se houver anticorpos no soro em teste ocorrerá a formação da ligação

antígeno-anticorpo, que posteriormente é detectada pela adição de um segundo anticorpo dirigido contra imunoglobulinas da espécie onde se busca detectar os anticorpos (humana, no caso), a qual é ligada à peroxidase.

• Este anticorpo anti-IgG, ligado à enzima denomina-se conjugado.

• Ao adicionar-se o substrato apropriado para a enzima (isto é, H2O2 dissolvida em uma substancia química que dá uma reação colorida quando H2O2 é desdobrada).

• Os orifícios onde ocorreu a reação antígeno-anticorpo apresentam uma coloração (variável dependendo do substrato).

• Por último , é realizada a leitura da placa em um espectofotômetro que faz a medida do comprimento de onda da cor da reação

Detecção de Ac Específicos(ENA)

• Através do ELISA pode-se usar vários antígenos específicos como substrato para investigar a existência de um auto-anticorpo específico no soro de um paciente (anti-Ro, anti-La, Scl-70, Anti-RNP,Anti-ssDNA, Anti-dsDNA entre outros) ou usar um pool de anticorpos para realizar um screening.

• Os antígenos estão separados por kits, que contém o número de antígenos que cada kit contém: – ENA screening : Possui vários antígenos.– ENA – 4 : Possui 4 tipos de antígeno diferentes– ENA – 6 : Possui 6 tipos de antígeno diferentes– E outros testes com mais antígenos

ENA

• Screening:– Método utilizado como triagem quando temos a IFI com Hep-2

positiva– Se positivo correlacionar com os dados clínicos e realizar o ENA-4– Consiste em :

1. colocar as amostras na placa de ELISA com vários anticorpos nucleares extraíveis

2. Incubar 30 minutos em temperatura ambiente3. Lavar por 3 vezes com solução de lavagem4. Acrescentar o conjugado e incubar por 15 minutos 5. Lavar por mais três vezes6. Incubar por mais 15 minutos após adição de substrato7. Adicionar solução STOP 8. Ler em 450 nm no espectofotômetro

ENA

• ENA -4:– Imunoensaio enzimático imunométrico– Microplaca constituída por 3 módulos com 8 poços

cada revestidos com SS-A; SS-B; Sm; RNP-Sm– Teste que determina especificamente os anticorpos

que positivaram o PAAC e o ENA Screening• ENA- 6:– Imunoensaio enzimático imunométrico– Microplaca contendo além dos anticorpos do ENA -4

Jo 1 e Scl-70

ANCA-AUTOANTICORPOS ANTICITOPLASMA DE NEUTRÓFILOS

ANCA• São anticorpos direcionados contra constituintes citoplasmáticos de

neutrófilos e monócitos.• Testes para detectar ANCA são utilizados para fazer o diagnóstico e a

monitorização de atividade inflamatória de vasculites autoimunes de pequenos vasos :

– Granulomatose de Wegner – Poliangeíte Microscópica– Glomerulonefrite Necrotizante segmentar pauciimune (forma renal

de PAM)– Síndrome de Churg Strauss

• É melhor demonstrado nessas doenças usando uma combinação de IFI de neutrófilos normais de sangue periférico e ELISA (Enzmyme – linked immunosorbent assays) que detecta ANCA para PR3 (proteinase3) ou MPO (Mieloperoxidase).

Correlação dos autoanticorpos relacionados ao ANCA e as patologias

• Pacientes com Granulomatose de Wegener produzem anticorpos :– anti-PR3(proteinase 3)

• Pacientes com poliangeíte microscópica, Churg-Strauss, poliarterite nodosa produzem anticorpos:– anti-MPO (mieloperoxidase)

Quando solicitar ANCA

Descrição do método de detecção do ANCA e seus Padrões

• Neutrófilos possuem grânulos citoplasmáticos contendo PR3 e MPO .

• Em lâminas com neutrófilos fixadas com etanol ocorre a migração dos grânulos contendo MPO para a Periferia do núcleo , gerando:– padrão P - ANCA

• O mesmo não acontece com os grânulos com PR3, que permanecem no citoplasma, gerando:– padrão C - ANCA

• Quanto fixados com formalina não ocorre distribuição de grânulos, estes sendo PR3 ou MPO continuam no citoplasma, resultando em um padrão C – ANCA em todas as vezes.

• Neutrófilos contendo anticorpos contra outro antígeno que não o PR3 ou MPO , como por exemplo na RCUI apresentam padrão P – ANCA quando tratados com etanol, por isso são chamados P – ANCA Atípico.

• Tanto o padrão P-ANCA como o P-ANCA Atípico são artefatos e só ocorrem quando os neutrófilos são fixados com o etanol.

• Quando fixados com Formalina os neutrófilos adotam o padrão de fluorescência citoplasmática (C – ANCA ).

• Com exceção do P-ANCA Atípico que continua com padrão P-ANCA mesmo fixado com formalina.

• Quando temos um padrão ANA ao formol ,temos ausência de fluorescência devendo ser realizado IFI com Hep-2 para investigar anticorpos anti-antígenos nucleares

Doenças que geram P-ANCA Atípico

• Doenças Inflamatórias Intestinal:– Colite Ulcerativa em 80% dos casos– Doença de Crohn

• Colangite Esclerosante Primária em 25% dos casos

ETANOL

FORMALINA

FATOR REUMATÓIDE-FR: DOSADO POR NEFELOMETRIA

Fator Reumatóide - FR

• O termo FR engloba um grupo de autoanticorpos das classes IgG, IgA e IgM que têm em comum a capacidade de reagir com diferentes epítopos da porção Fc da IgG humana

• O FR IgM pode servir como marcador precoce da Artrite Reumatóide(AR

• O risco de desenvolvimento da doença aumenta de forma proporcional ao aumento de FR em indivíduos normais

• Está presente em 90% dos casos de AR clássicos, após seis meses de início da doença

• Pode está aumentado em 15-35% em pacientes com LES • Falso positivos variam de acordo com o método utilizado

para sua detecção

Métodos para Diagnóstico

• Antigamente era mensurado utilizando-se a prova do látex, mais sensível, associado a técnica Waller-Rose mais específica

• Atualmente o método de pesquisa utilizado para detecção do FR é a nefelometria que é capaz de identificar as três classes :IgG, IgM e IgA, fornecendo valores numéricos em UI/ml.

Princípio da Técnica

O FR se presente no soro irá promover a aglutinação de partículas de látex revestidas com gama-globulina humana presentes no reagente, promovendo um aumento da turbidez, que é determinado fotometricamente através do nefelômetro contra padrões conhecidos.

• Valor de referência normal < 20 UI/ml

Nefelometria

• Técnica utilizada para medir concentrações no sangue ,LCR ou urina de várias proteínas como:– Imunoglobulinas : IgG, IgM e IgA– Fator Reumatóide– Complemento : C3, C4

• Mede a difração (desvio) da luz ao passar por uma solução contendo complexos imunológicos formados após reação de imunoprecipitação

Nefelometria

Nefelometria

Vantagens• É uma técnica precisa

• Rápida

• Fácil realização

• Totalmente automatizada

Desvantagens• Alto custo do anti-soro

• Podem surgir reações inespecíficas de soros lipêmicos :– Nescessidade de ultracentrifugar

a amostra para clarificá-la

• Necessidade de várias diluições para antígenos muito concentrados

ANTI-CCP3

Histórico Anti-CCP3

• Foi demonstrado em diversos trabalhos que anticorpos perinucleares (APF) e anti-queratina (AKA) são muito mais específicos para AR, embora hoje seja conhecido que eles reagem contra a filagrina nativa e passaram a ser tratados como anticorpos anti-filagrina (AFA).

• Em 1995, Sebbag e cols., demostraram que todos esses anticorpos eram direcionados para a citrulina contendo epítopos.

• A citrulina é um aminoácido não padrão, pois não é incorporado em proteínas durante a síntese protéica, sendo gerada via modificação pós-translacional de resíduos de arginina pela enzima arginina-peptidil-deaminase (PAD).

• Em 1998, Schellekens cols. Descobriram que peptídeos lineares contendo citrulina eram muito específicos para anticorpos anti-AR (aprox.. 96%) em ensaio por método ELISA.

• Um artigo subsequente demonstrou que variantes cíclicas destes peptídeos, chamados peptídeos citrulinados cíclicos (CCP), eram igualmente específicos para AR, mas com maior sensibilidade que dos peptídeos lineares.

• Em 2007, a Liga Européia contra o Reumatismo (EULAR) publicou diretrizes para o diagnóstico precoce de AR, incluindo o Anti-CCP como o principal teste no diagnóstico precoce da Artrite Reumatóide.

Importância Clínica do Anti-CCP3

• O anticorpo anti-CCP é um novo marcador sorológico para a AR, com utilidade diagnóstica e prognóstica que suplementa o FR.

• A sua importância fica realçada diante da tendência atual de tratar a AR mais cedo e mais agressivamente com agentes que modificam o curso da doença.

Princípio do Método de detecção do Anti-CCP3

• O antigénio utilizado no teste QUANTA Lite™ CCP 3.1 IgG/IgA ELISA é um péptido sintético cíclico citrulinado que tem uma sensibilidade e especificidade elevada na detecção de anticorpos em doentes com AR.

• Este antigénio está ligado à superfície de uma placa de micropoços.• Os controles pré-diluídos e as amostras diluídas dos doentes são adicionados

aos diferentes poços, permitindo que quaisquer anticorpos CCP IgG presentes se liguem ao antigénio imobilizado.

• A amostra não ligada é lavada e adiciona-se um conjugado IgG/IgA anti-humano marcado a cada poço.

• Uma segunda incubação permite ao conjugado enzimático ligar-se a quaisquer anticorpos de doentes que tenham ficado agarrados aos micropoços.

• Depois da segunda lavagem para retirar o excesso de conjugado, a restante atividade das enzimas é medida adicionando um substrato cromogénico e medindo a intensidade da cor que se desenvolve.

• A intensidade da cor é feita por espectrometria, medindo e comparando a intensidade da cor desenvolvida nos poços do doente com a cor dos poços de controle.

OBRIGADA!

Referências Bibliográficas• Imunologia Celular e Molecular, ABBAS et al. Edição atual. 2• Pfrimer IAH, Francescantonio PL, Von Mühlen CA, et al. I Consenso Nacional

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