AVALIAÇAO DA CONTAMINAÇÃO POR Salmonella spp. · PDF fileINSTITUTO DE QUÍMICA ... Parâmetros físico-químicos estabelecidos para linguiças pelo 20 . ... FIOCRUZ – Fundação

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

CENTRO DE CIÊNCIAS MATEMÁTICAS E DA NATUREZA

INSTITUTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS

AVALIAÇAO DA CONTAMINAÇÃO POR Salmonella spp.

EM LINGUIÇAS FRESCAIS COMERCIALIZADAS EM DUAS

CIDADES DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO – BRASIL

ANÁLISE DO PERFIL DE SUSCEPTIBILIDADE AOS

ANTIMICROBIANOS DOS ISOLADOS

CLAUDIUS COUTO CABRAL

Rio de Janeiro

2013







Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de Pós-graduação em Ciência de Alimentos – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Ciência de Alimentos Orientador: Vânia Margaret Flosi Paschoalin

Rio de Janeiro 2013

C117

Cabral, Claudius Couto.

Avaliação da contaminação por Salmonella spp. em linguiças frescais

comercializadas em duas cidades do estado do Rio de Janeiro - Brasil:

análise do perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos dos isolados /

Claudius Couto Cabral. – Rio de Janeiro: UFRJ/ IQ, 2013.

102f.: il.

Dissertação (Mestrado em Ciências) – Universidade Federal do Rio

de Janeiro, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Ciência

de Alimentos, 2013

Orientador: Vânia Margaret Flosi Paschoalin.

1. Lingüiça frescal. 2. Reação em cadeia da polimerase 3. Salmonella

spp. I. Paschoalin, Vânia Margaret Flosi. (Orient.). II. Universidade

Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Química. Programa de Pós-

Graduação em Ciência de Alimentos. III. Título.

CDD: 664.001







Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de Pós-graduação em Ciência de Alimentos – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Ciência de Alimentos Orientador: Vânia Margaret Flosi Paschoalin

Aprovado em: BANCA EXAMINADORA

_____________________________________________ Profa. Dra. Vânia Margaret Flosi Paschoalin Instituto de Química - UFRJ

_____________________________________________ Prof. Dra. Selma Gomes Ferreira Leite Escola de Química - UFRJ _____________________________________________ Prof. Dr. Robson Maia Franco Faculdade de Veterinária - UFF _____________________________________________ Dra. Ana Carolina da Silva Carvalho Instituto de Química - UFRJ

AGRADECIMENTOS

À ela, sempre guerreira, nunca desistindo frente a pior das intempéries da

vida, minha mãe, sem a qual eu jamais teria chegado a este momento. Muito

obrigado.

À minha companheira de todos os momentos, tristes e felizes, derrotas e

vitórias, mais de pobreza do que riqueza, minha namorada e meu grande amor,

Bianca.

À minha orientadora Vânia Paschoalin pela oportunidade concedida em seu

grupo de pesquisa, toda a paciência, conhecimentos passados e os bons momentos

proporcionados ao laboratório durante estes dois anos.

Ao meu amigo prof. Carlos Conte, pela confiança, toda a ajuda prestada e

ensinamentos concedidos até meia noite da sexta-feira ou aos sábados de manhã.

Aos amigos pesquisadores do “time barracuda”, equipe de pesquisa em

segurança e higiene do pescado do laboratório 545, Claudio “Zaca” Capella,

Raphael “Cabritinho” Leonardo, Josiane “Zé” Marília e Ana Carolina “Mala” Carvalho

pelos inúmeros “brainstorms”, momentos de companheirismo, amizade e risadas

durante as sextas a noite no mangue e na lapa.

Aos colegas pesquisadores, e amigos de laboratório, por toda a amizade,

solidariedade e bons momentos passados, tornando essa longa caminhada mais

agradável, Rafael “Bola” Luiz, Filipe “MP” Kayodê, Thiago “Marajá” Álvares, Wilson

“PB” Rodrigues, Eduardo “Pablito” Mere, Diego “Mamilos” Baião, a técnica Cristiana

“Cristina” Passinato, a colega Luciana Pacheco Golinelli e a todos os outros

companheiros aqui não citados, mas de igual importância.

Ao colega Marley Gomes do Laboratório de Micobactérias pela disposição em

ajudar.

Às minhas queridas professoras Teresinha Ferreira, Helenita Marques e Maria

Helena Cosendey, sempre dispostas a me ajudar, assim como ocorreu ao longo do

meu mestrado, com inúmeras oportunidades concedidas dentro da disciplina de

Doenças Infecciosas dos Animais Domésticos. Também aos amigos e professores

Márcio Figueiredo e Robson Maia Franco, ambos de igual importância e sempre

dispostos a ajudar e passar conhecimentos. A gratidão que tenho por estes amigos

é imensurável.

À professora Ana Lúcia Vendramini por ter me recebido de braços abertos em

sua disciplina, me concedendo uma oportunidade de valor inestimável para minha

formação.

E as demais pessoas que por ventura eu não tenha citado aqui, mas que

participaram com igual importância deste período de minha formação, meu muito

obrigado.

"O que sabemos é uma gota, o que ignoramos é um oceano."

Isaac Newton, 1687

RESUMO

Cabral, Claudius Couto. Avaliação da contaminação por Salmonella spp. em linguiças

frescais comercializadas em duas cidades do estado do rio de janeiro – brasil. Análise do

perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos dos isolados. Instituto de Química,

Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2013.

As linguiças frescais são os produtos embutidos mais consumidos no Brasil. No

entanto, o uso de matéria-prima contaminada, manipulação inadequada durante o

processamento e armazenamento inadequado pode representar um perigo para a saúde do

consumidor. No presente estudo, foi realizada a avaliação da contaminação por Salmonella

spp. em linguiças frescais comercializadas nas cidades de Niterói e do Rio de Janeiro. Oitenta

linguiças frescais foram coletadas de 22 diferentes estabelecimentos comerciais nas duas

cidades. Vinte e uma amostras (27%) estavam contaminadas com Salmonella spp. Dezesseis

(20%) amostras contaminadas foram detectadas pela PCR combinada com o enriquecimento

seletivo no caldo Rappaport-Vassiliadis e Tetrationato Hajna, enquanto na microbiologia

convencional foram detectadas oito amostras contaminadas. As embalagens dos produtos,

original, modificada ou fora da embalagem, não influenciaram significativamente na

contaminação por Salmonella spp. visto que amostras em sua embalagem original

apresentaram 23% de contaminação, enquanto 27% das amostras em embalagens não-

originais ou fora da embalagem estavam contaminadas. Similarmente, a composição da carne

também parece não influenciar na contaminação por Salmonella spp. de forma significante,

visto que 20% das linguiças de frango e 29% das linguiças suínas estavam contaminadas.

Dentre as linguiças suínas, 37% do tipo toscana estavam contaminadas, enquanto que a

contaminação foi observada em 21% das linguiças de pernil. De oito isolados de Salmonella

spp. foi realizado o teste de susceptibilidade aos antimicrobianos, onde nenhum dos isolados

apresentou-se como multirresistentes; a classe dos beta-lactâmicos foi a que teve o maior

percentual de isolados com resistência (quatro isolados). Considerando-se os resultados

obtidos, a PCR poderia ser utilizada para a avaliação da qualidade microbiológica durante o

processamento industrial de linguiças frescais.

Palavras-chave: Salmonella spp. Linguiças frescais suína e de frango. PCR. Embalagem.

Brasil.

ABSTRACT

Cabral, Claudius Couto. Avaliação da contaminação por Salmonella spp. em linguiças

frescais suínas e de frango comercializadas em duas cidades do estado do rio de janeiro –

brasil. Análise do perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos dos isolados. Instituto de

Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2013.

Fresh sausages are the most popular stuffed meat product available in Brazil.

However, the use of contaminated raw material, unhygienic handling during processing, and

inadequate storage could be hazardous consumers health, since fresh-sausage processing does

not include heat treatment and the product may carry several human pathogens such as

Salmonella spp. To evaluate Salmonella spp. contamination of fresh sausages marketed in Rio

de Janeiro and Niterói, 80 fresh sausages were collected from 22 stores in both cities. A total

of 21 sausage samples (27%) proved to be contaminated by Salmonella spp. Sixteen (20%)

contaminated samples were detected by PCR testing combined with RV or TTH broth

culturing, whereas conventional microbiological screening detected only 8 (10%). The

packing conditions of fresh sausages at the retail market, original or replaced packing, or even

unpacked, did not seem to significantly affect Salmonella spp. contamination, since the

samples in their original packing showed 23% contamination whereas the contamination rate

of sausages wrapped in plastic or unpacked was 27%. Similarly, the meat composition did not

seem to influence Salmonella spp. contamination significantly, since 20% of the chicken and

29% of the pork sausages proved to be contaminated. The contamination rate of Tuscan-type

sausages was 37%, while contamination was found in 21% of ham sausages, indicating that

the cut of pork did not affect the microbiological quality of the fresh sausages. The

antimicrobial susceptibility test revealed no multiresistance among the isolates, with beta-

lactams being the class with highest resistance rate (4 isolates).The results shown here

indicate that PCR testing could be a valuable tool for assessing the microbiological quality

during plant processing of stuffed food.

Keywords: Salmonella spp. Fresh pork and chicken sausages. PCR tests. Product packing.

Brazil.

LISTA DE ILUSTAÇÕES

Figura 1: Participação (%) dos produtos cárneos no mercado de frios e

embutidos no Brasil em 2009 (Fonte: Nielsen, 2012)

15

Figura 2: Fluxograma das etapas de produção de linguiças frescais

18

Figura 3: Esquema da proposta de Hoagland (1914) para a conversão do

nitrato até óxido nítrico em produtos curados

19

Figura 4: Representação esquemática de um integron de classe 1

30

Figura 5: Representação esquemática dos protocolos utilizados para a

determinação do limite de detecção da PCR

36

Figura 6: Prova da soroaglutinação macroscópica positiva com antígeno

polivalente somático anti-Salmonella

39

Figura 7 Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos pelo método de

difusão em disco de Kirby-Bauer em agar Mueller-Hinton

39

Figura 8: Avaliação da detecção de Salmonella spp. em linguiças

artificialmente contaminadas

41

Figura 9: Amplificação de fragmento de 598 pb do gene invA, exclusivo

de Salmonella spp., em linguiças contaminadas artificialmente e

submetidas as etapas de pré-enriquecimento primário e enriquecimento

seletivo

41

Figura 10: Contaminação por Salmonella spp. em linguiças frescais

coletadas em Niterói e no Rio de Janeiro

42

Quadro 1: Parâmetros físico-químicos estabelecidos para linguiças pelo 20

Ministério de agricultura, pecuária e abastecimento (MAPA) no país

(Brasil, 2000).

Quadro 2: Parâmetros microbiológicos estabelecidos para embutidos

frescais pela ANVISA no país (Brasil, 2000).

21

Quadro 3: Taxonomia do gênero Salmonella 25

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Principais agentes etiológicos de surtos de doenças transmitidas

por alimentos notificadas no Brasil, no período entre 1999-2009 (BRASIL,

2011b)

24

Tabela 2: Avaliação da contaminação por Salmonella spp. em linguiças

frescais suína e de frango por microbiologia convencional e por PCR

associada ao enriquecimento seletivo em RV e TTH.

42


frescais suína e de frango por microbiologia convencional.

42


frescais suína e de frango pela PCR.

43

Tabela 5: Análise das amostras de número 1 a 30 contaminadas e não-

contaminadas com Salmonella spp.

44

Tabela 6: Análise das amostras de número 31 a 60 contaminadas e não


45

Tabela 7: Análise das amostras de número 61 a 80 contaminadas e não


46

Tabela 8: Isolados de Salmonella spp. e seus respectivos perfis de

susceptibilidade frente a 16 antimicrobianos

47

LISTA DE SIGLAS

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária

APT- Água Peptonada Tamponada

BHI – Brain Heart Infusion

BPF – Boas Práticas De Fabricação

CDC – Center of Disease Control and Prevention

CLSI - Clinical and Laboratorial Standarts Institute

FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz

MAPA – Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

PCR – reação em cadeia da polimerase - “polymerase chain reaction”

PCR – RV – reação em cadeia da polimerase / Caldo Rappaport-Vassiliadis

PCR – TT - reação em cadeia da polimerase / Caldo Tetrationato Hajna

RV/Ra – caldo Rappaport-Vassiliadis / Ágar Rambach

TT/Ra – caldo Tetrationato Hajna / Ágar Rambach

RV/H – caldo Rappaport-Vassiliadis / Ágar Hektoen

TT/H – caldo tetrationato Hajna / Ágar Hektoen

QRDR – região determinante de resistência a quinolona “Quinolone Resistance Determining

Region”

RDC – Resolução de Diretoria Colegiada

RV – caldo Rappaport-Vassiliadis

TSI – triple sugar iron – “três açucares e ferro”

TTH – Caldo Tetrationato Hajna

UFC – Unidade Formadora de Colônia

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 14

2 REVISÃO DE LITERATURA 17

2.1 Elaboração de linguiças frescais 17

2.2 Microbiologia da carne e derivados e contaminação por Salmonella spp. 21

2.3 Epidemiologia da salmonelose no Brasil 23

2.4 Métodos para a detecção de Salmonella spp. 27

2.5 Resistência aos antimicrobianos em Salmonella spp. 28

3 JUSTIFICATIVA 31

4 OBJETIVOS 32

4.1 Objetivo geral 32

4.2 Objetivos específicos 32

5 METODOLOGIA DA PESQUISA 33

5.1 Microrganismos utilizados e meios de cultura 33

5.2 Obtenção das amostras 33

5.3 Extração do DNA 34

5.4 Condições e parâmetros da PCR 34

5.5 Determinação do limite de detecção de Salmonella spp.por PCR em caldo de

cultivo

35

5.6 Contaminação artificial de linguiças frescais 35

5.7 Análise bacteriológica 37

5.8 Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos 38

5.9 Análise estatística 39

6 RESULTADOS 40

6.1 Determinação do limite de detecção da PCR 40

6.2 Detecção de Salmonella nas amostras de lingüiças frescais analisadas 40

6.3 Influência da embalagem na contaminação de linguiças frescais por

Salmonella spp. nas amostras obtidas

43

6.4 Ocorrência de amostras positivas de acordo com a composição da linguiça 43

6.5 Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos dos isolados 46

7 DISCUSSÃO 48

8 CONCLUSÕES 56

9 REFERÊNCIAS 57

10 APÊNDICES 72

APÊNDICE A Resumos publicados no 26º Congresso Brasileiro de Microbiologia 72

APÊNDICE B Resumos publicados no XVI Congresso Mundial de Ciência

e Tecnologia de Alimentos

75

APENDICE C Trabalhos completos aceitos para publicação no XII Congresso

Brasileiro de Higienistas de Alimentos

77

APÊNDICE D Artigos submetidos para publicação 83

APÊNDICE E Análise das amostras coletadas em Niterói e no Rio de Janeiro por PCR 96

APÊNDICE F Características morfológicas de Salmonella spp. nos meios de cultura

utilizados para sua identificação.

101

14

1 INTRODUÇÃO

A produção agropecuária brasileira responde atualmente por mais de 35% do produto

interno bruto do país, com o agronegócio quebrando recordes a cada ano, tendo obtido no

primeiro semestre de 2011 um superávit de U$ 34,7 bilhões, tendo o setor de carnes

contribuído com R$1,36 bilhões, um aumento de 18,9% (BRASIL, 2011a). O Ministério da

Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) estima que até 2021 a produção de carne no

Brasil irá ser incrementada em 27% (BRASIL, 2011a). O consumo de carnes no Brasil vem

crescendo, com um consumo per capita estimado de 37,4 kg de carne bovina, 43,9 kg de

carne de aves e 14,1 kg de carne suína (BRASIL, 2010). O comércio de derivados cárneos

também segue em ascensão, pois encontra no mercado interno consumidores receptivos a

novos produtos mais saudáveis e sensorialmente agradáveis (DAGUER et al., 2010). Soma-se

a isto o incremento do poder aquisitivo da população devido ao crescimento da economia

brasileira e ascensão das classes sociais.

Dentro do comércio de produtos cárneos, as linguiças se destacam, representando 40%

do mercado de frios e embutidos (FIGURA 1), tendo obtido um crescimento de vendas de

60% no período entre 2000 a 2008; no entanto, o consumo nacional ainda é baixo, 1,7 kg de

linguiça/habitante/ano, se comparado a outros países como os Estados Unidos aonde esse

valor chega a 21 kg/habitante/ano (NIELSEN, 2009).

Dentro deste cenário, faz-se necessário o investimento em estudos voltados para o

aumento da qualidade do produto final, como pesquisas aplicadas ao melhoramento animal,

transformação da matéria prima, formação de produtos de características sensoriais

agradáveis, composições centesimais dentro do padrão exigido por legislação e controle de

qualidade microbiológico de forma a obtenção de produtos dentro dos padrões

microbiológicos exigidos.

Em trabalhos voltados para qualidade higiênico-sanitária destes alimentos, o objetivo é

a identificação de pontos de risco para a contaminação microbiológica e a minimização

destes, levando ao consumidor um produto final inócuo (PARDI, 1996). A contaminação por

microrganismos patogênicos pode ocorrer em diversos pontos ao longo da cadeia alimentar,

tais como na não observância e cumprimento dos aspectos sanitários envolvidos na criação

dos animais e de todo o processo de abate, com a qualidade do produto final sendo um reflexo

da matéria prima utilizada (MAURIELLO et al. 2004). Dentre os produtos cárneos, os

embutidos possuem algumas características particulares em relação a sua produção que

15

aumentam as possibilidades de contaminação. São derivados cárneos produtos de salsicharia

revestidos por um envoltório natural de origem bovina, ovina ou suína, que podem vir a ser

uma grande fonte de contaminação se o processo de obtenção e posteriormente de

conservação não for realizado com as devidas precauções higiênico-sanitárias. A carne e os

aditivos utilizados devem ser de boa qualidade, havendo a necessidade da realização de um

rígido controle de qualidade por parte dos estabelecimentos produtores (SPRICIGO et al.,

2008).

Figura 1: Participação (%) dos produtos cárneos no mercado de frios e embutidos no Brasil em 2009

Fonte: NIELSEN, 2012

A necessidade de rigor higiênico sanitário é maior em produtos frescais, pois estes não

sofrem processamento térmico; desta forma, a microbiota do alimento não será reduzida em

nenhum ponto da cadeia de produção, se mantendo até a casa do consumidor, ou mesmo

aumentando em caso de falhas durante as etapas que devem ser realizadas sob temperatura de

refrigeração ou de congelamento. Esta necessidade de manter o produto acondicionado de

forma correta sob temperatura de resfriamento já foi alvo de estudos, e apesar de sua

importância, os autores relataram ausência de conformidade em diversos estabelecimentos

comerciais (GARRIDO et al., 2010; JOSHI et al., 2010; IPEM-SP, 2010).

16

Levando em consideração que as linguiças, apesar de não serem consumidas cruas, são

frequentemente submetidas a interrupções na cadeia do frio e ao preparo inadequado antes do

consumo, trata-se de um produto que pode veicular bactérias patogênica, como Salmonella

spp., representando um risco que não deve ser negligenciado pelas autoridades sanitárias

(MÜRMANN et al., 2009).

Para auxiliar na detecção deste patógeno em linguiças frescais, no presente estudo foi

avaliada a detecção deste patógeno pela PCR em comparação com a técnica microbiológica

convencional. Além disso, foi estudada a influência de alguns fatores como a composição da

carne e a embalagem sobre a contaminação do produto por Salmonella spp.

17

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Elaboração de linguiças frescais

No Brasil, as linguiças são definidas como “produto cárneo industrializado, obtido de

carnes de animais de açougue, adicionados ou não de tecidos adiposos, ingredientes, embutido

em envoltório natural ou artificial, e submetido ao processo tecnológico adequado” (BRASIL,

2000). A carne utilizada para a elaboração destes produtos classicamente é a suína, mas

recentemente linguiças contendo carne de outros animais, como frango e pescado, têm sido

comercializados, o que é permitido pela legislação, desde que seja informado no rótulo,

garantindo que o consumidor tenha a possibilidade de conhecer a constituição do produto a

ser adquirido. Para ser utilizada, a carne deve estar livre de aponevroses, nervos, linfonodos,

esquírulas ósseas e objetos estranhos, estando esta inicialmente congelada ou resfriada

(BRESSAN e PEREZ, 2001). Além disso, é adicionada gordura suína, geralmente na forma

de toucinho, elemento importante do produto, pois confere o sabor e a textura característicos

do produto (PARDI, 1996).

O fluxograma da produção de linguiça frescal encontra-se na FIGURA 2. A carne

geralmente chega ao estabelecimento congelada em bloco, sendo reduzida a pedaços menores

em um quebrador de blocos e posteriormente moída; a gordura sofre a moagem em discos de

maior calibre, de modo que seus grandes pedaços sejam visíveis no produto final. Um

importante aspecto durante a moagem é a temperatura da carne, pois esta é aquecida, podendo

levar a desnaturação protéica da matriz gerando um produto final com textura alterada.

Recomenda-se que a carne seja moída a uma temperatura entre 0ºC e 4ºC (PARDI , 1996).

Após a moagem, a carne, separada em bateladas, é enviada para a misturadeira, onde são

adicionados o toucinho e os condimentos, que são utilizados de acordo com o produto final

desejado pela empresa. Estes ingredientes são previamente pesados, de acordo com a

formulação do produto, e separados antes de serem adicionados. Também ocorre a adição de

água gelada durante esta etapa, para evitar o superaquecimento da massa e assim a

desnaturação protéica da carne, conforme explicado anteriormente

18

Figura 2: Fluxograma das etapas de produção de linguiças frescais

Entre os aditivos intencionalmente adicionados à linguiça, destaca-se o nitrato. Este

composto é reduzido via metabolismo microbiano a nitrito e este posteriormente, em pH

ácido, se decompõe gerando o óxido nitroso, responsável por conferir a característica

coloração avermelhada típica de produtos curados. Esta coloração, muito atrativa para o

consumidor, ocorre pela ligação do óxido nítrico gerado pela redução do nitrito com o ferro

hêmico da mioglobina da carne, formando a mioglobina óxido nítrico (FIGURA 3). Esta nova

molécula se submetida ao tratamento térmico, sofre desnaturação formando o nitrosil-

hemocromo, composto responsável pela cor rósea característica da lingüiça cozida

(HONIKEL, 2010).

19

Figura 3: Esquema da proposta de Hoagland (1914) para a conversão do nitrato até óxido nítrico em produtos

curados.

Após a mistura dos ingredientes, a massa é mantida em repouso por cerca de 12h,

refrigerada, para que se desenvolva a reação de cura. Entende-se como cura o conjunto de

processos bioquímicos que resultam no desenvolvimento da cor, sabor e textura próprios do

produto em questão, mediante a adição de sais, aditivos e especiarias, sendo um processo

tecnológico de grande importância, pois torna o produto mais atrativo para o consumidor

(TAKAHASHI, 1979).

Após a reação de cura, a massa encontra-se pronta para ser embutida. O envoltório

utilizado para o embutimento de linguiças é do tipo natural, sendo os intestinos de bovinos,

suínos e ovinos de médio calibre (28-32 mm) os mais utilizados. Após o enchimento da tripa,

torções são realizadas, em média a cada 10 cm, formando os gomos da lingüiça, este que são

mantidos através do amarrio, geralmente utilizando-se fio de algodão (barbante). Diversos

cuidados são necessários nesta etapa, como o cuidado para que não ocorra um enchimento

excessivo da tripa, que pode causar sua ruptura. Além disso, é importante que o embutimento

seja realizado sem a incorporação de ar na massa, pois o oxigênio atmosférico reage com a

gordura da lingüiça, causando sua rancificação o que pode provocar escurecimento de regiões

adjacentes aos pedaços de gordura, prejudicando principalmente a cor do produto e a

aceitação pelo consumidor (BRESSAN e PEREZ, 2001). As grandes indústrias atualmente, de

modo a prevenir este problema, utilizam embutideiras à vácuo e automáticas para a realização

desta etapa, reduzindo a mão-de-obra necessária e aumentando a velocidade de produção.

Decorrida esta etapa, as linguiças são pesadas e embaladas a vácuo com embalagem

termoencolhível. Estas se retraem e se aderem na superfície dos produtos mediante imersão da

embalagem em água quente. Os produtos são posteriormente acondicionados em suas

embalagens secundárias (caixas de papelão) e mantidos em locais adequados sob refrigeração

(0°C – 4ºC), sendo mantidos na indústria até o momento de sua expedição. As linguiças são

transportadas até o comercio em caminhões com unidade frigorífica, e nos mercados, são

20

vendidas na embalagem original, ou em bandeja de poliestireno expandido envolta em filme

plástico ou a granel (PARDI, 1996).

Todo esse procedimento para a elaboração de linguiças frescais deve ser realizado

obedecendo-se o que preconiza as Boas Práticas de Fabricação (BPF), de modo a garantir a

qualidade do produto final, preservando a saúde do consumidor e a credibilidade da indústria

produtora (CHAVES et al., 2000). Durante a etapa de acondicionamento do produto final, são

retiradas amostras para a realização de análises microbiológicas e físico-químicas para

verificar se o lote produzido encontra-se dentro dos padrões estabelecidos pela legislação. No

Brasil, os parâmetros físico-químicos das linguiças frescais são regidas pela Instrução

Normativa nº4, de 31 de março de 2000 (BRASIL, 2000) e os limites microbiológicos pela

RDC nº 12 de 2 de janeiro de 2001 (BRASIL, 2001). Os requisitos estabelecidos na legislação

estão resumidos nos quadros 1 e 2.

Quadro 1: Parâmetros físico-químicos estabelecidos para linguiças frescais pelo Ministério de Agricultura,

Pecuária e Abastecimento (MAPA) no país (BRASIL, 2000)

Frescais Cozidas Dessecadas

Umidade (máx.) 70% 60% 55%

Gordura (máx.) 30% 35% 30%

Proteína (máx.) 12% 14% 15%

Cálcio (base seca) (máx.) 0,1% 0,3% 0,1%

Estes parâmetros foram estabelecidos uma vez que as linguiças frescais são produtos

com grande aceitação pelo consumidor. Desta forma, a fiscalização destes produtos é

necessária para garantir a qualidade destas matrizes alimentícias, de forma a evitar que o

produto sofra deterioração microbiana ou que este se torne um veículo para microrganismos

patogênicos. As bactérias e os fungos, de modo geral, podem se manter viáveis e se

proliferarem nos alimentos sem causarem alterações sensoriais perceptíveis. (CHAVES et al.,

2000).

21

Quadro 2: Parâmetros microbiológicos estabelecidos para embutidos frescais pela ANVISA no país (BRASIL,

2000). n= número de unidades a serem analisadas, c= número máximo de amostras com valores entre m e M

permitidas, m= limite mínimo aceitável para um determinado critério microbiológico, M= limite máximo

aceitável para um determinado critério microbiológico

Produto Microrganismo Tolerância para

amostra indicativa

Tolerância para

amostra representativa

n c m M

Embutidos

frescais

(linguiças cruas

e similares)

Coliformes a 45ºC/g 5 x 103 5 3 5x10

2 5x10

3

Estafilococos

coagulase positiva/g 5 x 10

3 5 2 10

3 5x10

3

Clostrídios sulfito-

redutores a 46ºC/g 3x10

3 5 2 5x10

2 3x10

3

Salmonella spp.25g Ausência 5 0 Ausência

2.2 Microbiologia da carne e derivados e contaminação por Salmonella spp.

A carne é um alimento nobre, rico em nutrientes, especialmente água e proteínas, o que a

torna um componente importante na dieta humana. No entanto, essa complexidade de

nutrientes também representa um meio rico para o crescimento microbiano, levando a sua

degradação, gerando alterações sensoriais indesejáveis para o consumidor, e tornando este

produto não comercializável (GRAM et al., 2002) Atualmente, uma grande preocupação

existente por parte das indústrias, dos órgãos fiscalizadores e do próprio consumidor diz

respeito à presença de microrganismos patogênicos na carne. Estes patógenos podem ser

responsáveis por diversas síndromes clínicas nos consumidores, algumas mais brandas como

diarréias auto-limitantes, ou graves como abortamentos, meningoencefalites e septicemias em

gestantes, crianças e imunodeprimidos, respectivamente (FERNANDES, 2009). Nos produtos

derivados de carne, como as linguiças frescais, que não recebem tratamento térmico, sua

microbiota está diretamente ligada a aquela presente na carne utilizada para a sua elaboração

e/ou em seus aditivos. A presença de Salmonella spp. nos animais de abate, invariavelmente,

resulta na contaminação do produto final, conforme os estudos de Castagna, (2004) que

detectaram altos níveis de contaminação da massa utilizada para a elaboração de linguiças em

estabelecimentos com grande número de animais portadores assintomáticos do patógeno.

Em geral, as bactérias patogênicas são mesófilas, incapazes de crescerem em

temperatura de refrigeração, e assim não possuem importância significativa para a

deterioração da carne, exceto que ocorra quebra da cadeia do frio; sob baixas temperaturas, a

decomposição da matriz cárnea se dá principalmente por ação de agentes psicrófilos (JAY,

22

2005). A microbiota inicial da carne é bastante variada, e seus aspectos qualitativos,

referentes a diversidade microbiana, e quantitativos, relacionados a carga de microrganismos

presentes no alimento são resultantes de uma complexa interação entre a microbiota presente

na pele, pêlos, penas, mucosas e órgãos internos do animal vivo associada a eficácia das

medidas higiênico-sanitárias aplicadas durante o abate e processamento da carcaça

(FERNANDES, 2009). Os diferentes processos tecnológicos realizados após o abate do

animal influenciam diretamente os níveis de contaminação da carne por microrganismos antes

ausentes, ou no aumento do número de agentes anteriormente presentes, principalmente

devido à manipulação da musculatura que é realizada a partir da esfola. A principal forma de

contaminação da carcaça de animais que possuem em seu processamento a etapa de esfola é

mediante a manipulação pelos funcionários e/ou contato com material fecal, de forma direta

por rompimento do intestino durante a evisceração, ou indiretamente, através de

equipamentos contaminados (VAN HOEK et al., 2012)

Dentre as bactérias patogênicas, as principais são veiculadas por contaminação fecal,

como Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens, Escherichia coli e Salmonella spp.

sendo que apenas algumas são associadas com o ambiente como Listeria monocytogenes,

microrganismo psicotrófico e que pode contaminar a carne se presente no ambiente de abate e

de elaboração dos produtos, como as câmaras de refrigeração (JEMMI e STEPHAN, 2006). O

trato gastrointestinal, por possuir uma grande carga microbiana, deve receber cuidados

especiais ao longo do abate evitando assim a contaminação da carcaça com seu conteúdo. A

oclusão do esôfago, do intestino e a do reto são operações realizadas com a finalidade de

evitar o extravasamento de conteúdo gastrointestinal para a carcaça. Apesar de ser improvável

a passagem de bactérias destes órgãos horas após a morte do animal, a evisceração deve ser

rapidamente realizada, pois a formação de gases decorrentes do metabolismo microbiano

causa o aumento do volume do estômago e do intestino, facilitando o seu rompimento durante

a abertura da cavidade abdominal (GILL et al., 1978).

Nos suínos, as principais etapas que podem ocasionar a contaminação da carcaça

durante o processo de abate, devido a ausência de esfola, é a escalda, o chamuscamento, a

toalete e a limpeza final da carcaça, sendo que estas etapas já foram estudadas por diversos

autores na tentativa de se determinar quais as melhores técnicas a serem utilizadas em cada

processo de modo a reduzir a contaminação microbiana da carcaça (GILL, 2009; SPECHA et

al., 2006; KOTULA et al., 1974). Na cadeia produtiva de carne de frango, a principal etapa

que favorece a disseminação de microrganismos é a depenagem. Esta ocorre logo após a etapa

de escalda, que remove até 95% dos contaminantes presentes na superfície da carcaça.

23

Bactérias presentes na pele e penas, como Staphylococcus spp. e Corynebacterium spp.

representam os principais gêneros de microrganismos que podem ser disseminados nesta

etapa, mas outros agentes como os coliformes, Campylobacter spp. e Salmonella spp. também

podem estar presentes, no caso de carcaças sujas com fezes, estas geralmente oriundas das

próprias aves (MULDER et al., 1978).

Com o advento de biologia molecular, novos e mais completos estudos foram realizados

na tentativa de se entender melhor a dinâmica de contaminação dos alimentos e dos

estabelecimentos produtores por Salmonella spp. Através de estudos de tipificação molecular,

KICH et al. (2011) demonstraram que os principais isolados de linfonodos mesentéricos

estavam relacionados com isolados da granja e das fezes, havendo pouca relação com os

isolados do ambiente de abate, apesar da grande diversidade de clones do gênero Salmonella

encontrados, o que poderia ser resultado de anos de contaminação do ambiente por outros

animais abatidos no estabelecimento. Em outro estudo, SILVA et al. (2012) não conseguiram

isolar clones de Salmonella spp. presentes nos suínos locais ou das possilgas de matança em

carcaças após a escaldagem, apesar do isolamento de outros clones deste patógeno. Esse

estudo mostrou que a adoção de medidas higiênico-sanitárias é de grande importância para o

controle da presença e da disseminação de Salmonella spp.

2.3 Epidemiologia da salmonelose no Brasil

Nos Estados Unidos, estima-se uma prevalência de 1,4 milhões de casos por ano de

infecções alimentares por Salmonella não-tifoidal (VOETSCH et al., 2004). No Brasil,

Salmonella spp. é o agente mais comumente envolvido em doenças transmitidas por

alimentos, presente em 42,5% dos casos (TABELA 1). Dentre os alimentos mais comumente

envolvidos, as carnes e derivados são a segunda principal forma de veiculação destes

patógenos (BRASIL, 2011b). Dentre as doenças potencialmente veiculadas por alimentos, a

salmonelose se destaca no mundo todo, causando surtos associados a diferentes matrizes

alimentares.

Salmonelose é o nome dado a doença resultante da infecção por bactérias do gênero

Salmonella. Este gênero encontra-se na família Enterobacteriaceae, com apenas duas espécies

são reconhecidas, S. enterica e S. bongori (REEVES et al., 1989). Dentro da espécie S.

enterica, encontram-se seis subespécies, sendo que cada uma delas possui centenas de

diferentes sorovares descritos (QUADRO 3). A subespécie de maior importância é a enterica,

que engloba a maior quantidade de sorovares descritos, mais de 2000, de um total atual que

24

ultrapassa os 2500 sorovares. A diferenciação dos sorovares é realizada através da análise de

três antígenos presentes nos membros do gênero Salmonella: antígeno externo (O), antígeno

flagelar (H) e o antígeno capsular (Vi) (POPOFF et al., 2004).

As bactérias deste gênero possuem ampla distribuição na natureza, sendo capazes de

infectar um grande número de animais, sejam domésticos, selvagens e mesmo o homem. A

principal via de infecção para os humanos é mediante a ingestão de alimentos contaminados,

em especial carnes e ovos (ALVAREZ-ORDÓÑEZ et al., 2010). Geralmente as infecções

são assintomáticas ou causam diarréia branda e auto-limitante, mas neonatos, crianças, idosos

e pessoas com o seu sistema imune comprometido, como portadores da síndrome da

imunodeficiência humana adquirida (AIDS) ou transplantados, constituem um grupo de risco

podendo desenvolver formas mais severas da salmonelose como a septicêmica ou encefálica

(HUMPHREY, T., 2004; ICHIKAWA et al., 2009). Em seus estudos, Peresi et al. (1998)

analisaram 19 surtos ocorridos em São Paulo, onde observaram que surtos envolvendo

crianças e idosos foram os que apresentaram maior percentual de indivíduos acometidos, 93%

e 100%, respectivamente, comprovando desta forma que grupos envolvendo indivíduos nestas

TABELA 1: Principais agentes etiológicos de surtos de doenças transmitidas por alimentos notificadas no

Brasil no período entre 2000-2011 (BRASIL, 2011b).

25

faixas etárias são os mais susceptíveis, e o cuidado na preparação dos alimentos destes

indivíduos deve ser redobrado.

Quadro 3: Taxonomia do gênero Salmonella

Espécie Subespécies Sorotipos

S.enterica enterica (I)

salamae (II)

arizonae (IIIa)

diarizonae (IIIb)

houtenae (IV)

indica (VI)

1547

513

100

341

73

12

S. bongori ------------- 23

Total ------------- 2610

Fonte: GUIBOURDENCHE et al., 2010

Indivíduos saudáveis que não desenvolvem doença podem se manter como portadores

assintomáticos do patógeno (GOPINATH et al., 2012). A capacidade do microrganismo em

se manter em um hospedeiro sem causar doença representa um importante fator de risco se

este portador for um manipulador de alimentos, uma vez que a triagem de rotina para

indivíduos portadores assintomáticos de Salmonella em locais de produção de alimentos não é

realizada rotineiramente. Ilustrando esse cenário, têm-se como exemplo um famoso caso

ocorrido nos Estados Unidos no início do século XX, envolvendo uma imigrante da Irlanda

chamada Mary Mallon, mas que ficou conhecida como “Typhoid Mary”. Esta trabalhadora

era cozinheira e era portadora assintomática de S. Typhi, fato na época inédito para a ciência.

Devido a sua profissão, ela foi responsável pela disseminação do patógeno para 54 pessoas

durante nove diferentes epidemias de febre tifóide em que 4 pessoas morreram (BROOKS,

1996).

A principal forma de transmissão da Salmonella spp. ao homem e aos animais é

mediante a ingestão de água e alimentos contaminados, devido a más condições de higiene ao

longo do processamento deste ou dos manipuladores no comércio, ou ainda devido ao uso de

matéria prima contaminada. No Brasil, ovos e produtos feitos a base de ovos tem sua

26

importância epidemiológica bem definida, e freqüentemente estão envolvidos em surtos de

salmonelose (BRASIL, 2011b), principalmente devido à capacidade das salmonelas adaptadas

às aves de contaminarem estes produtos quando a gema do ovo ainda encontra-se em

formação no ovário das aves (BRADEN, 2006).

O papel de outros alimentos ainda continua incerto, apesar de serem relatados como

envolvidos em surtos de salmonelose. A contaminação de lingüiça frescal suína possui poucos

relatos no Brasil (LIMA et al., 2011, RALL et al., 2009, SPRICIGO et al., 2008, CHAVES et

al., 2000 e GALARDA et al., 1991).

A entrada de animais já infectados, portadores do patógeno, em estabelecimentos de

abate é o principal risco para a contaminação da carne e seus derivados (BAPTISTA et al.,

2010). Diversos pesquisadores têm focado seus estudos na identificação de fontes de infecção

dos animais, antes da chegada aos matadouros ou nestes próprios, de modo a ajudar no

desenvolvimento e na aplicação de medidas de prevenção da contaminação por Salmonella

spp. no ambiente industrial, e no controle da infecção dos animais por este agente (SMID et

al., 2011; VAN HOEK et al., 2012; ALBAN e GOLDBACH, 2005). Além disso, diversos

matadouros possuem suas “microbiotas endêmicas”, o que facilita a contaminação dos

alimentos e dificulta o controle deste patógeno (VISSCHER et al., 2011; SORENSEN et al.,

1999).

Nos últimos anos, a ocorrência de salmonelose no Brasil e no mundo tem sofrido

grandes alterações, com a ascensão das Salmonellas não tifoidais como agentes da doença em

humanos, principalmente devido à contaminação de alimentos por estes microrganismos

(TAUNAY, 1996, OLSEN et al. 2001). No entanto, ainda ocorre alta prevalência de

salmonelas tifóides em países em desenvolvimento, como os do continente africano e asiático,

devido a fatores como menor disponibilidade de serviços de tratamento de água e reduzida

assistência médica (PARRY et al., 2002). No Brasil, os dados disponíveis sobre casos de

salmonelose são poucos e deve haver uma subestimação da real incidência da doença no país.

Estudos realizados no Estado de São Paulo (FERNANDES et al., 2003; TAUNAY et

al.,1996) mostraram que há alta prevalência das infecções pelo sorotipo Typhimurium,

seguido de Enteritidis. No entanto, essa distribuição de serotipos varia de acordo com a região

do país, como demonstrado por Loureiro et al. (2010), que relataram uma alta prevalência de

S. typhi, demonstrando que regiões sem saneamento básico e outras condições de promoção

da saúde ainda sofrem com a febre tifóide.

27

2.4 Métodos para a detecção de Salmonella spp.

Na tentativa de obter-se resultados mais confiáveis e em menor tempo, diferentes

técnicas têm sido avaliadas pelos pesquisadores. A detecção de Salmonella em alimentos é

realizada pela microbiologia convencional. No entanto, outras técnicas podem ser utilizadas

para a detecção deste patógeno, sendo que nos últimos anos, a reação em cadeia da polimerase

(PCR) tem sido avaliada em diferentes estudos, e em combinação com as etapas de pré-

enriquecimento, tem apresentado sensibilidade superior ao padrão ouro além de poder ser

realizada em tempos menores (RISSATO 2011, GERMINI 2009, SANTOS 2001).

A metodologia tradicional para a identificação destes microorganismos em alimentos

segue metodologia padronizada pelo Ministério da Agricultura e é amplamente empregado no

país. Esta consiste basicamente de etapas de pré-enriquecimento, enriquecimento seletivo,

isolamento e seleção, identificação bioquímica e soro-aglutinação (BRASIL, 2003). No

entanto, a técnica é demorada e trabalhosa (cerca de 5-7 dias), pois, necessita de muitos

reagentes e vidraria, principalmente quando existe a necessidade do processamento de um

grande número de amostras, como geralmente ocorre nas indústrias de alimentos. Esse prazo

muitas vezes não atende as necessidades dos órgãos de fiscalização, que em diversas ocasiões

precisam tomar medidas preventivas rápidas para proteger a saúde do consumidor (GILBERT

et al., 2003).

A aplicação da PCR na detecção de alimentos contaminados, animais e pessoas

infectadas é uma estratégia utilizada por muitos autores, sendo considerada uma técnica

rápida e eficiente para a detecção de diversos microrganismos. A rapidez na identificação de

agentes etiológicos pela detecção do seu DNA, em comparação ao método bacteriológico,

torna a PCR uma alternativa prática, além de sua alta sensibilidade e especificidade, dentre os

métodos de diagnósticos disponíveis para a Salmonella spp. (KUMAR et al., 2008). Para a

detecção de Salmonella spp. em alimentos, a amplificação de seqüências do gene InvA tem

sido utilizada pelos pesquisadores, por estar presente exclusivamente em microrganismos do

gênero Salmonella, não gerando falsos-positivos (ASENSI et al., 2008, GALAN et al., 1992).

Amostras de alimentos como carne, frango e queijos possuem diversos componentes

que atuam como inibidores da reação de PCR (WILSON, 1997), sendo necessária a adoção de

métodos que evitem ou diluam os potenciais inibidores presentes nas matrizes alimentícias

(ZHAO et al., 2009). A associação da PCR com caldos de pré-enriquecimento e

enriquecimento seletivo têm sido bastante utilizada pois agem diluindo possíveis inibidores da

28

PCR além de aumentarem o número de células do microrganismo alvo (OLIVEIRA et al.,

2005).

2.5 Resistência aos antimicrobianos em Salmonella spp.

Atualmente, a presença de Salmonella spp. e outros microrganismos resistentes a

antimicrobianos é uma grande preocupação de autoridades sanitárias e pesquisadores em todo

o mundo. A presença destes patógenos em alimentos possui impacto direto sobre a clínica

médica humana, especificamente nas medidas terapêuticas adotadas em pacientes vítimas de

doenças transmitidas por alimentos. Em alguns casos, após o julgamento médico, pode ser

necessária a utilização de antimicrobianos para o tratamento de casos mais graves, como uma

salmonelose septicêmica em um paciente imunodeprimido (EUA, 2005). A presença de

mecanismos de resistência aos antimicrobianos de eleição para estes casos pode por em risco

a vida do paciente, que pode evoluir para o óbito. Estudos realizados pelo Center of Disease

Control and Prevention (CDC) nos Estados Unidos revelaram que 22% dos pacientes com

infecções por salmonelas multirresistentes apresentaram quadro clínico mais grave e

necessitaram de internação, enquanto apenas 8% das pessoas com infecções por salmonelas

não-resistentes precisaram de intervenção médica (MOLBAK, 2005). Além disso, estes

patógenos multi-resistentes podem agir como disseminadores de genes de resistência a

antimicrobianos para outros microrganismos susceptíveis, e assim ajudar na transferência de

genes para bactérias de comunidades humanas e de outros animais (PRICE, 2007).

Nos Estados Unidos, na Austrália e na Europa, comissões foram formadas com o

objetivo de monitorar o status da resistência aos antimicrobianos em seus territórios,

principalmente em patógenos oriundos de amostras humanas (EUROPA, 2012; EUA, 2005;

AUSTRALIA, 2004). Apesar de não abordarem diretamente patógenos isolados de alimentos,

tal medida de vigilância é um grande avanço da comunidade cientifica destes locais na

tentativa de conter a disseminação de microrganismos resistentes. O Brasil não possui sistema

de vigilância similar, e mais importante e preocupante ainda é o fato de haverem poucos

estudos com microrganismos oriundos de alimentos. Especificamente com Salmonella spp.,

poucos são os estudos disponíveis na literatura nacional.

Os mecanismos de resistência aos antimicrobianos têm sido extensivamente estudados

em Salmonella spp. e alguns destes já foram elucidados. O mecanismo mais importante ocorre

mediante a captação de genes de resistência por elementos genéticos conhecidos como

integrons (FIGURA 4). Até o presente momento, integrons de classe 1 e classe 2 já foram

29

descritos em Salmonella spp. e estes contêm diversos cassetes de genes que codificam

proteínas envolvidas na resistência a antimicrobianos e mesmo a desinfetantes (FLUIT e

SCHMITZ, 2004; PLOY et al., 1998). Peirano et al. (2006) em seus estudos com isolados de

Salmonella spp. de origem humana e animal relataram a presença de 55 isolados contendo

integrons de classe 1 que continham em sua sequencia diversos genes de resistência a

ampicilina, oxacilina, sulfonamida, aminoglicosídeos e cloranfenicol, tendo sido demonstrado

que os integrons estavam contidos em plasmídeos de alto peso molecular, o que permitia sua

disseminação para outros microrganismos.

No entanto, os pesquisadores têm voltado sua atenção mais recentemente para os

mecanismos de resistência envolvendo as fluoroquinolonas, visto que é a classe que contêm

os antimicrobianos de eleição para uso em infecções causadas por Salmonella spp. (SOUZA

et al., 2010). O principal mecanismo envolvido, diferentemente das outras classes de

antimicrobianos, é a alteração das topoisomerases, II e IV, sendo esta mudança decorrente de

mutações nos genes codificadores destas proteínas, GyrA e ParC, respectivamente (CASIN et

al., 2003). No gene GyrA, a grande maioria das mutações ocorrem dentro da região que se

inicia no códon 67 e termina no 106, denominada região determinante de resistência às

quinolonas ou “Quinolone Resistance Determinant Region – QRDR”, sendo os aminoácidos

implicados a Ser-83 e Asp-87, que sofrem substituição por uma Phe, Tyr ou Ala no

aminoácido 83 e uma Gly, Asn ou Tyr no aminoácido 87; essas mutações inicialmente

ocorrem isoladas, apesar de já terem sido detectadas em salmonelas com resistência total a

quinolonas (RUIZ et al., 1997). Giroud et al. (1999) demonstraram que as mutações pontuais

ocorrem e se somam dentro da QRDR conforme a pressão de seleção aumenta sobre o

patógeno. Esta pressão seria decorrente do uso excessivo e sem critério de antibióticos, na

clínica humana e na criação animal. Não coincidentemente, nos isolados obtidos de animais,

os maiores índices de resistência, não somente as quinolonas, mas também a outros

antimicrobianos, ocorre frente às moléculas disponíveis a mais tempo no mercado, decorrente

do maior tempo de utilização do fármaco (SPRICIGO et al., 2012; TEUBER, 2001).

30

Figura 4: representação esquemática de um integron de classe 1.int = gene da integrase; attl = sítio de

recombinação; gene cassette = sítio de inserção de novos cassettes contendo genes de resistência; deltaqacE =

gene de resistência ao brometo de etídeo; sulI = gene de resistência a sulfonamida; orf5 = região sem função

conhecida

Fonte: adaptado de PLOY et al., 1998

31

3 JUSTIFICATIVA

As linguiças frescais são produtos que possuem grande aceitação pelo consumidor

brasileiro devido ao seu baixo custo e boa qualidade sensorial, mas é um produto que pode

agir como veiculador de patógenos como Salmonella spp. principalmente por não receber

tratamento térmico durante sua elaboração. Além disso, existe uma deficiência de estudos

relacionados à contaminação por Salmonella spp. nesta matriz alimentar. Levando-se em

conta que a microbiologia convencional possui suas falhas, a adoção de técnicas modernas

mais rápidas e sensíveis, como a PCR, pode ser de grande utilidade para o controle

microbiológico e a manutenção da qualidade do produto. Observa-se que no Brasil, um estudo

sobre a aplicação da PCR como técnica diagnóstica para Salmonella spp. é desconhecido.

Considerando todos os argumentos expostos, no presente trabalho se propôs a avaliar a

contaminação de linguiças frescais suína e de frango comercializadas no Rio de Janeiro e em

Niterói, os dois principais centros urbanos do estado do Rio de Janeiro. Além disso, foi

realizada a avaliação da PCR para a detecção de Salmonella spp. nesta matriz. Por fim, a

avaliação de alguns possíveis fatores de risco para a presença deste patógeno, como a origem

da carne, o tipo de lingüiça e a manutenção da embalagem original ou sua troca nos locais de

comercialização.

32

4 OBJETIVOS

4.1. Objetivo Geral

Avaliar a contaminação por Salmonella spp. de linguiças frescais, suína e de frango

nas cidades do Rio de Janeiro e de Niterói. Proceder a identificação fenotípica do perfil de

susceptibilidade dos possíveis isolados.

4.2. Objetivos Específicos

Determinar o limite mínimo de detecção de Salmonella spp. da pela PCR em linguiças

frescais.

Comparar o método de PCR com a microbiologia tradicional na detecção de

Salmonella spp. nestas matrizes alimentares.

Avaliar a influência da manutenção da embalagem original da indústria (a vácuo) ou

sua troca por uma própria do estabelecimento (em bandejas e cobertas por filmes plásticos) ou

sua comercialização a granel na contaminação por Salmonella spp. em linguiças frescais.

Investigar se existe influência da espécie produtora de carne (suíno ou frango) na

contaminação do produto final por Salmonella spp.

Avaliar a influencia do corte suíno sobre a contaminação por Salmonella spp. entre as

linguiças suínas tipo toscana e de pernil.

Caracterização fenotípica do perfil de susceptibilidade dos isolados frente a 16

antimicrobianos: ácido nalidíxico, amoxicilina + ácido clavulânico, ampicilina, amicacina,

cefalexina, ceftriaxona, ceftazidima, ciprofloxacina, cloranfenicol, doxiciclina, enrofloxacina,

estreptomicina, levofloxacina, tetraciclina, sulfonamidas e sulfametoxazol + trimetoprim.

33

5 METODOLOGIA DA PESQUISA

5.1 Microrganismos utilizados e meios de cultura

No presente estudo, para a realização da PCR e das análises microbiológicas, foi

utilizada uma cepa de Salmonella Enteritidis (ATCC 13076) gentilmente cedida pelo Instituto

Nacional de Controle de Qualidade em Saúde – FIOCRUZ. Para a análise microbiológica,

foram utilizados os caldos Rappaport-Vassiliadis (RV), Tetrationato Hajna (TTH) e água

peptonada tamponada (APT) (Himedia®

). Para o preparo do caldo RV e da APT, estes eram

pesados de acordo com a proporção indicada pelo fabricante (mg/L) (Himedia®

),

acondicionados em suas respectivas vidrarias e autoclavados a 121ºC/1atm/15min. O caldo

TTH era hidratado de acordo com as instruções do fabricante (Himedia®

), fervido em

microondas até a completa dissolução do meio de cultura e acondicionado em alíquotas de 9

mL em tubos de rosca esterilizados. Adicionalmente, para cada litro de TTH, era adicionado

40 mL de solução de iodo iodenado.

Dois meios sólidos de cultura foram utilizados neste estudo: ágar Hektoen entérico e

ágar Salmonella diferencial (Rambach). Ambos eram dissolvidos em água (mg/L) de acordo

com as instruções do fabricante (Himedia®

), fervidos em microondas até a completa

dissolução do meio e envasados a quente em placas de Petri de 90 mm descartáveis dentro de

fluxo laminar.

5.2 Obtenção das amostras

Foram coletadas 80 amostras de linguiça frescal, 40 em Niterói e 40 no Rio de Janeiro,

sendo 29 linguiças de carne de frango, 27 do tipo toscanas e 24 de pernil, em 22 diferentes

hipermercados do município de Niterói e do Rio de Janeiro, RJ, entre novembro de 2011 a

junho de 2012. No ato da compra, foi realizado o registro a respeito do tipo de embalagem do

produto, original utilizada pela indústria ou fora da embalagem original, sendo esta última

apresentada em outra embalagem ou livre (a granel) no balcão refrigerado, indicando

manipulação do alimento no estabelecimento comercial. Após sua obtenção no comercio

local, as amostras foram transportadas refrigeradas em caixa de poliestireno sob temperatura

de refrigeração em um período máximo de duas horas para o Laboratório de Análises

34

Avançadas em Bioquímica e Biologia Molecular (LAABBM) no Instituto de Química da

Universidade Federal do Rio de Janeiro, onde foram imediatamente processadas.

5.3 Extração do DNA

As alíquotas para a extração eram previamente centrifugadas a 21.950 g durante 10

minutos. O sobrenadante era descartado e o precipitado resuspendido em 1 mL de solução de

NaCl 0,9%, seguido de nova etapa de centrifugação sob as mesmas condições, caracterizando

a etapa de lavagem do precipitado. Na extração realizada a partir do caldo tetrationato,

previamente a etapa de lavagem era realizada uma centrifugação a 21.950 g para a

precipitação do carbonato de cálcio naturalmente presente nesse meio, de modo a prevenir o

entupimento das membranas do kit de extração. O sobrenadante era então repassado para

novo microtubo de centrífuga, e centrifugado a 21.950 g durante 10 minutos. O precipitado

obtido era utilizado para a etapa de lavagem.

Terminada a ultima etapa de centrifugação, o precipitado era utilizado para a extração

do DNA, realizado com o kit Dneasy Blood & Tissue (Qiagen®

, Hilden, Germany). O DNA

total foi quantificado por fluorescência utilizando o QuBit dsDNA HS Assay (Life

Technologies®

, Carlsbad, USA).

5.4 Condições e parâmetros da PCR

Para a reação da PCR, foram utilizados como iniciadores os primers (Invitrogen®

Carlsbad, USA) InvA1 (5´ CCT GAT CGC ACT GAA TAT CGT ACT G 3´) e InvA2 (5´

GAC CAT CAC CAA TGG TCA GCA GG 3´), conforme descritos por Kapley et al. (2000),

para a amplificação do gene InvA. Foram utilizados 0.25 μM (Invitrogen®)

de cada um dos

iniciadores, 2,5mM de cloreto de magnésio, 200 mM de cada dinucleotídeo, 2.5 U de

Platinum Taq (Invitrogen®

Carlsbad, USA), 5 μL de tampão 10x e 100 ng de DNA genômico

total em um volume final de reação de 50 μL.

A amplificação foi realizada em termociclador MyCycler Thermal Cycler (Bio Rad®

),

em um total de 40 ciclos, precedido de uma etapa inicial de desnaturação a 94ºC durante 30

segundos, seguido do anelamento a 60ºC durante 30 seg. e extensão a 72ºC durante 2 minutos,

seguido de uma etapa de extensão final de 72ºC/7 min. Os amplicons gerados eram

visualizados em fotodocumentador (BioAmerica®

Califórnia, USA) após corrida

35

eletroforética em gel de agarose a 2% (100V, 200 mA por 80 minutos) corado com GelRed

(Biotium®

, Califórnia, USA).

5.5 Determinação do limite de detecção de Salmonella spp. por PCR em caldo de cultivo

De modo a se estabelecer o número mínimo de células que a PCR seria capaz de

detectar, foram realizados ensaios experimentais com a cepa de Salmonella Enteritidis ATCC

13076 primeiramente em caldo BHI, e posteriormente com linguiças frescais artificialmente

contaminadas (FIGURA 5).

Após a reativação da cepa ATCC 13076, 200 μL do caldo de cultivo eram diluídos em

800 μL de solução salina 0,9%, e esta solução final de 1 mL era utilizada para a quantificação

do número de células em suspensão. Este procedimento era realizado em espectrofotômetro

SmartPec Plus (Bio Rad®

) pela absorbância no comprimento de onda de 600 nm. O resultado

obtido era multiplicado pelo fator de diluição (cinco) para a obtenção do valor final,

geralmente em torno de 108 UFC/mL.

Sabendo-se o número aproximado de células/mL, era realizada em seguida uma

diluição seriada mediante a adição de 100 μL do caldo em 900 μL de solução salina a 0,9%,

em microtubos de centrífuga, formando uma solução contendo 107 UFC/mL. A solução era

então homogeneizada em um agitador de soluções tipo vortex (Phoenix Luferco®

), e 100 μL

desta era adicionada em novo microtubo contendo 900 μL de solução salina 0,9%,

estabelecendo uma solução a 106 UFC/mL. Após agitação, o procedimento era repetido, até a

obtenção de soluções contendo 1 UFC/mL. Os microtubos contendo essas diluições eram

agitados e utilizados para a extração do DNA, conforme já descrito, com exceção da primeira

etapa de lavagem que não era realizada. Após a extração, o DNA obtido era quantificado e

utilizado para a PCR.

5.6 Contaminação artificial das linguiças

Para este experimento, uma amostra de lingüiça frescal suína congelada e embalada a

vácuo foi obtida em um estabelecimento comercial, e submetida a cultura microbiológica para

averiguação de possível contaminação prévia por Salmonella spp. A amostra obtida foi

mantida congelada até a confirmação do resultado negativo.

36

Figura 5: representação esquemática dos protocolos utilizados para a determinação do limite de detecção da

PCR. 1 – Limite de detecção em caldo; 2 – Limite de detecção em linguiças contaminadas artificialmente

submetidas ao pré-enriquecimento e enriquecimento seletivo

Para a contaminação artificial, 25g de lingüiça frescal foram obtidos com tesoura

cirúrgica romba/romba previamente esterilizada e colocados em sacos de homogeneização

(Interscience®

) junto a 225 mL de água peptonada tamponada (APT). Em seguida, 1 mL de

caldo BHI previamente crescido contendo 108 UFC/mL era inoculado a amostra em

37

suspensão, constituindo na amostra uma contagem total de 106 UFC/mL. Para a obtenção de

alimentos contaminados artificialmente com menores contagens da cepa de referência,

diluições contendo 107, 10

6, 10

5, 10

4, 10

3, 10

2 e 10

1 UFC/mL eram preparadas conforme

descrito anteriormente, e inoculadas em 25 g de lingüiça junto a 225 mL de APT, constituindo

desta forma amostras contendo 107, 10

6, 10

5, 10

4, 10

3, 10

2, 10 UFC / 25 g. Após a obtenção

destas soluções, 1 mL era obtido e utilizado para a extração do DNA de acordo com os

procedimentos já descritos. Posteriormente, o DNA extraído era utilizado para a PCR.

Foi realizado também o teste do limite de detecção da PCR associado aos caldos de

enriquecimento seletivo RV e TTH. Primeiramente, foram obtidas suspensões de 25g de

lingüiça com 225 mL contendo 107, 10

6, 10

5, 10

4, 10

3, 10

2, 10 e 1 UFC / 25g. Os sacos de

homogeneização eram então encubados a 37ºC durante 24h. Decorrido este tempo, 1 mL e

100 μL de cada saco eram repassados para tubos contendo 9 mL de caldo TTH e 9,9 mL de

caldo RV, respectivamente. O primeiro era incubado a 37 ºC durante 24h, enquanto o segundo

era incubado a 42ºC durante 24h. Decorrido este período, alíquotas de 1 mL de ambos os

caldos eram retiradas e utilizadas para a extração do DNA. O DNA obtido era utilizado para a

reação em cadeia da polimerase.

5.7 Análise bacteriológica

A partir de cada amostra, 25g foram coletadas de forma asséptica de diferentes pontos

do alimento dentro de fluxo laminar e com material previamente esterilizado ou descartável.

A alíquota retirada era colocada em um saco de homogeneização (Interscience®

) junto a 225

mL de água peptonada tamponada. Os sacos eram homogeneizados em stomacher (Seward

Stomacher 400 circulator®

) por 2 minutos a 230 RPM. Após processados, os alimentos eram

incubados a 37ºC durante 24 horas com posterior retirada de alíquotas de 1 mL e 100 μL

passa repasse em 9 mL do caldo TTH e 9,9 mL do caldo RV, respectivamente. O caldo TTH

era incubado a 37ºC durante 24h, enquanto o caldo RV era incubado a 42ºC por 24h.

Após o período de incubação, alíquotas dos dois caldos eram semeadas com alças

bacteriológicas descartáveis em agar Hektoen entérico e agar Salmonella diferencial

(Himedia®

). Nesta etapa ainda, alíquotas de 1 mL de caldo TTH e RV eram obtidas e

separadas para a extração de DNA. Decorrido novo período de incubação de 24h, as placas

eram analisadas, e entre 3 a 5 colônias com características suspeitas eram repicadas para o

agar Triple Sugar Iron (TSI) individualmente, seguido de nova incubação a 37ºC durante 24h.

As colônias em TSI que apresentavam características bioquímicas compatíveis com

38

Salmonella spp. eram selecionadas, e as colônias inoculadas em tubos contendo agar

fenilalanina e caldo uréia, seguido de nova incubação a 37ºC por 24h. A ausência de produção

de uréase e a não desaminação da fenilalanina caracterizava uma suspeita, cuja colônia era

enriquecida em ágar triptona de soja (TSA) por 24h a 37ºC para ser submetida a prova da

soroaglutinação, realizada com soro anti-Salmonella polivalente somático (PROBAC®

, São

Paulo, Brazil) (FIGURA 6). Colônias positivas nesta prova eram consideradas como

pertencentes ao gênero Salmonella.

5.8 Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos

As cepas isoladas nos meios seletivos de Salmonella foram mantidas congeladas em

BHI com 20% de glicerol em freezer a -80ºC até momento de uso. Os microtubos contendo os

isolados eram descongelados em gelo durante 20 minutos, e uma alíquota de 100 μL era

inoculado em 10 mL de caldo BHI e incubado a 37ºC durante 24h. O caldo BHI contendo as

células microbianas cultivadas era transferido para solução salina 0,9%, de forma que a

turvação obtida fosse igual a graduação 0.5 da escala nefelométrica de McFarland,

correspondente a uma densidade celular de 1,5 x 108 UFC/mL. Após ajuste da concentração

microbiana da suspensão, esta era plaqueada em ágar Mueller-Hinton. Este era preparado

especialmente para este teste, tendo sido utilizadas placas de Petri descartáveis de 150 mm. A

espessura do ágar era de 4 a 5 mm para garantir a perfeita difusão dos antimicrobianos.

Após o plaqueamento do cultivo, os discos de antimicrobianos (Sensifar®

) eram

colocados com auxilio de uma pinça anatômica previamente esterilizada sobre o ágar. Os

discos foram posicionados da seguinte forma: um disco central e sete ao redor em um total de

oito discos por placa (FIGURA 7). Foram testados 16 diferentes antimicrobianos: ácido

nalidíxico, amoxicilina + ácido clavulânico, ampicilina, amicacina, cefalexina, ceftriaxona,

ceftazidima, ciprofloxacina, cloranfenicol, doxiciclina, enrofloxacina, estreptomicina,

levofloxacina, tetraciclina, sulfonamidas e sulfametoxazol + trimetoprim. As placas foram

incubadas a 37ºC durante 24h e então era realizada a leitura dos halos com um halômetro. Os

valores obtidos eram anotados para posterior comparação com os valores preconizados pelo

Clinical and Laboratory Standarts Institute.

39

5.9 Análise estatística

Para a análise dos resultados obtidos quanto a sua significância estatística, foi

realizado o teste de MacNemar para a comparação entre a PCR e a microbiologia

convencional, e o teste exato de Fisher para a comparação entre as outras variáveis estudadas.

A concordância entre ambas as técnicas e os dois caldos utilizados foi determinada pela

análise de concordância kappa. O programa estatístico utilizado foi o XLSTAT 2012.

Figura 6: Prova da soroaglutinação

macroscópica para a confirmação dos isolados

de Salmonella spp. realizado com antigeno

polivalente somático anti-Salmonella.

Figura 7: Teste de susceptibilidade aos

antimicrobianos pelo método de difusão em disco

de Kirby-Bauer em agar Mueller-Hinton.

40

6 RESULTADOS

6.1. Determinação do limite de detecção da PCR

O teste de limite mínimo de detecção da PCR a partir do DNA genômico obtido da

linhagem (ATCC 13076) de referência foi de 1 UFC/mL. No entanto, a partir de linguiças

frescais contaminadas experimentalmente, o limite mínimo de detecção foi de 105 UFC/25g

(FIGURA 8). Com a realização da etapa de pré-enriquecimento e de enriquecimento seletivo,

o limite mínimo de detecção foi reduzido e a PCR foi capaz de detectar amostras com

contaminações iniciais de até 1 UFC/25 g (FIGURA 9).

6.2. Detecção de Salmonella nas amostras de linguiças frescais analisadas

80 amostras de linguiças frescais coletadas em Niterói e no Rio de Janeiro foram

analisadas por microbiologia tradicional e por PCR para a detecção de Salmonella sp

(FIGURA 10). Foi encontrada uma prevalência de 26% (21/80) de linguiças frescais

contaminadas (TABELA 2, TABELA 3 e TABELA 4). 8 das amostras contaminadas (10%)

foram coletadas em Niterói e 13 no Rio de Janeiro (16%), não havendo diferença significante

entre as duas cidades (p>0,05). Dentre as 21 amostras contaminadas, 5 foram detectadas

somente pela análise microbiológica (TABELA 3), 13 por PCR (TABELA 4) e 3 por ambas

as técnicas (κ = 0,164, p>0,05). Nas tabelas 5, 6 e 7, encontram-se discriminadas as amostras

detectadas como contaminadas ou livres de Salmonella spp. na PCR e na microbiologia

convencional. De acordo com o teste de MacNemar, o total de amostras contaminadas

detectadas por PCR (16) foi significativamente superior ao total de amostras (8) detectadas

pela microbiologia convencional (Q = 3,556, p<0,05).

A combinação da PCR com o cultivo no meio RV ou TTH foi igualmente eficiente,

com 13 amostras contaminadas detectadas no RV-PCR e 11 no TTH-PCR (p>0,05). O teste

kappa para os dois caldos foi 0,608. O plaqueamento em ágar Salmonella diferencial permitiu

mais eficiência na detecção do patógeno (p<0,05) com 8 amostras contaminadas detectadas

(10%), enquanto que o ágar Hektoen entérico detectou Salmonella spp. em 01 amostra

(1,2%). Em relação à combinação dos caldos de cultura utilizados em combinação com o agar

Salmonella diferencial, não houve diferença entre os caldos RV e TTH, com 6 (7,5%)

41

amostras positivas no primeiro e 4 (5%) no segundo (p>0,05). A única amostra contaminada

detectada pelo Hektoen entérico ocorreu quanto este foi associado com o caldo RV.

Figura 8: Avaliação da detecção de Salmonella spp. em linguiças artificialmente contaminadas. Os fragmentos

foram analisados por eletroforese em gel de agarose 2% (100 V, 200 mA por 80 min.) corado com GelRed.

Linha 1: Marcador de peso molecular de 100pb; Linha 2: controle positivo (DNA de Salmonella Enteritidis

ATCC 13076); Linha 3: controle negativo (PCR sem DNA molde); Linha 4: diluição contendo 105 UFC/mL;

Linha 5: diluição contendo 104 UFC/mL; Linha 6: diluição contendo 10

3 UFC/mL; Linha 7: diluição contendo

102 UFC/mL; Linha 8: diluição contendo 10 UFC/mL; Linha 9: diluição contendo 1 UFC/mL. Obs: a análise das

outras amostras foram incluídas no anexo.

Figura 9: Amplificação de fragmento de 598 pb do gene invA, exclusivo de Salmonella spp., em linguiças

contaminadas artificialmente e submetidas as etapas de pré-enriquecimento primário e enriquecimento seletivo.

Linha 1: marcador de peso molecular de 100pb; Linha 2: controle positivo; Linha 3: branco; Linhas 4: 105

UFC/mL; Linha 5: 104 UFC/mL; Linha 6: 10

3 UFC/mL; Linha 7: 10

2 UFC/mL; Linha 8: 10 UFC/mL; Linha 9: 1

UFC/mL.

42

Figura 10: Contaminação por Salmonella spp. em linguiças frescais coletadas em Niterói e no Rio de Janeiro. A

PCR em combinação com os caldos RV e TTH foi realizada com primers específicos para o gene InvA. Os

amplicons foram submetidos analisados por eletroforese em gel de agarose 2% (100 V, 200 mA por 80 min.)

corado com GelRed. Linha 1: Marcador de tamanho de fragmento de 100 pb; Linha 2: controle positivo (DNA

de Salmonella Enteritidis ATCC 13076) Linha 3: controle negativo (PCR sem DNA molde); Linha 4 e 5:

amostra 13, não contaminada; Linha 6 e 7: amostra 32, contaminada, detectada pela PCR em associação com o

caldo RV e TTH; Linha 8 e 9: amostra 45, contaminada detectada pelo PCR em associação ao caldo RV e não

detectada pela associação com o caldo TTH. A seta na direita indica o fragmento de 598 pb, específico de

Salmonella spp.

Tabela 2: Avaliação da contaminação por Salmonella spp. em linguiças frescais suína e de frango por

microbiologia convencional e por PCR associada ao enriquecimento seletivo em RV e TTH.

Composição

da linguiça

Amostras

(contaminadas/total)

Embalagem


Origem


Original Bandeja +

filme plástico

A

granel Niterói

Rio de

Janeiro

Frango 6/29 0/4 4/17 2/8 3/16 3/13

Pernil 5/24 3/7 1/12 1/5 2/10 3/14

Toscana 10/27 1/6 6/12 3/9 3/15 7/12

Total 21/80 4/17 11/41 6/22 8/41 13/39

Tabela 3: Avaliação da contaminação por Salmonella spp. em linguiças frescais suína e de frango por

microbiologia convencional.

Composição

da linguiça

Amostras


Embalagem


Origem


Original Bandeja +

filme plástico

A

granel Niterói

Rio de

Janeiro

Frango 3/29 0/4 1/17 2/8 2/16 1/13

Pernil 4/24 2/7 1/12 1/5 1/10 2/14

Toscana 1/27 0/6 1/12 0/9 0/15 1/12

Total 8/80 2/17 3/41 3/22 8/41 13/39

43

Tabela 4: Avaliação da contaminação por Salmonella spp. em linguiças frescais suína e de frango pela PCR.

Composição

da linguiça

Amostras


Embalagem


Origem


Original Bandeja +

filme plástico

A

granel Niterói

Rio de

Janeiro

Frango 5/29 0/4 3/17 2/8 3/16 6/13

Pernil 2/24 2/7 0/12 0/5 1/10 1/14

Toscana 9/27 1/6 5/12 3/9 3/15 6/12

Total 16/80 3/17 8/41 5/22 7/41 13/39

6.3. Influência da embalagem na contaminação de linguiças frescais por Salmonella spp.

nas amostras obtidas

Considerando o tipo de embalagem das linguiças nos estabelecimentos comerciais

(TABELA 2), 17/80 (21%) linguiças encontravam-se em sua embalagem original realizada na

indústria, enquanto 63/80 (79%) não apresentavam sua embalagem original, sendo que 41/63

(65%) produtos estavam disponíveis para a compra em bandeja e filme plástico próprio do

estabelecimento e 22/63 (35%) amostras estavam soltas (a granel) no balcão refrigerador. Das

amostras em embalagem original 4/17 (23%) foram positivas, enquanto das que não estavam

em sua embalagem original, 17/63 (27%) foram detectadas com o patógeno, sendo esta

diferença não significante (p>0,05). Entre os alimentos fora de sua embalagem original,

também não houve diferença quanto à presença de Salmonella spp. em linguiças mantidas em

bandejas, com 11/17 (65%) amostras positivas encontrando-se em bandejas com filmes

plásticos e 6/17 (35%) das amostras contaminadas a granel (p>0,05).

6.4. Ocorrência de amostras contaminadas de acordo com a composição da linguiça

Não houve diferença significante quanto a composição das amostras estudadas

(TABELA 2). Do total de 29 linguiças de frango, 6 (20%) estavam contaminadas com o

patógeno, enquanto 15 (29%) de 51 amostras de carne suína estavam contaminadas (p>0,05).

Realizando-se uma análise mais detalhada das linguiças suínas, 10/27 (37%) do tipo toscana e

5/24 (20,8%) de pernil foram confirmadas como contaminadas, caracterizando uma diferença

não significativa (p>0,05).

44

Tabela 5: Análise das amostras de número 1 a 30 contaminadas e não contaminadas com

Salmonella spp.

Amostra Composição Métodos

PCR - RV PCR - TT Cultura -

RV/Ra

Cultura -

TT/Ra

Cultura -

RV/H

Cultura -

TT/H

1 Frango Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

2 Toscana Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo



5 Toscana Positivo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo



8 Pernil Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo




12 Frango Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo



15 Toscana Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo


17 Frango Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo



20 Toscana Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo











PCR-RV: enriquecimento seletivo em caldo Rappaport-Vassiliadis seguido por PCR; PCR-TT: enriquecimento

seletivo em caldo Tetrationato Hajna seguido por PCR; Cultura RV-Ra; associação do caldo Rappaport-

Vassiliadis com o Agar Rambach; Cultura TT-Ra: associação do caldo tetrationato Hajna com o Agar Rambach;

Cultura RV-H: associação do caldo Rappaport-Vassiliadis com o Agar Hektoen Entérico; Cultura TT-H: :

associação do caldo tetrationato Hajna com o Agar Hektoen entérico

45


Salmonella spp.



RV/Ra

Cultura -

TT/Ra

Cultura -

RV/H

Cultura -

TT/H







37 Frango Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo

38 Pernil Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo







45 Toscana Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo


47 Toscana Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo


49 Pernil Positivo Positivo Positivo Positivo Negativo Negativo

50 Pernil Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo







57 Pernil Positivo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo









46


Salmonella spp.



RV/Ra

Cultura -

TT/Ra

Cultura -

RV/H

Cultura -

TT/H



63 Frango Positivo Positivo Positivo Negativo Negativo Negativo


65 Pernil Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo



68 Toscana Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo


















6.5. Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos dos isolados

Todos os oito isolados foram submetidos ao teste de susceptibilidade aos

antimicrobianos (TABELA 8). Nenhuma cepa apresentou multi-resistência, definida neste

estudo como a resistência a pelo menos um antimicrobiano pertencente a cada uma das três

diferentes classes. Dentre os microrganismos testados, quatro (cepas denominadas 20.1, 38.2,

50.2 e 65.1) apresentaram resistência a pelo menos um dos antimicrobianos da classe dos

beta-lactâmicos (ampicilina, amoxicilina + ácido clavulânico ou cefalexina) enquanto dois

isolados (cepas denominadas 50.2 e 65.1) apresentaram resistência intermediaria a

tetraciclina. A ampicilina, a amoxicilina + ácido clavulânico e a cefalexina foram os

antimicrobianos que apresentaram o maior numero de isolados resistentes, dois para cada um

deles (cepas denominadas 38.2 e 65.1).

47

Tabela 8: Isolados de Salmonella spp. e seus respectivos perfis de susceptibilidade frente a

16 antimicrobianos. Antimicrobiano / Cepa isolada 12.1 20.1 37.1 38.2 49.1 50.2 63.1 65.1 Total

Ácido nalidíxico S S S S S S S S 8S

Ampicilina S I S I S R S R 4S, 2I e 2R

Amoxicilina + ácido clavulânico S S S R S I S R 5S, 1I e 2R

Amicacina S S S S S S S S 8S

Cefalexina S R S R S I S S 5S, 1I e 2R

Ceftriaxona S S S S S S S S 8S

Ceftazidima S S S S S S S S 8S

Ciprofloxacina S S S S S S S S 8S

Cloranfenicol S S S S S S S S 8S

Doxiciclina S S S S S S S S 8S

Estreptomicina S S S S S S S S 8S

Enrofloxacina S S S S S S S S 8S

Levofloxacina S S S S S S S S 8S

Tetraciclina S S S S S I S I 6S e 2I

Sulfametoxazol + Trimetoprim S S S S S S S S 8S

Sulfonamidas S S S S S S S S 8S

S = Sensível, I = Resistência intermediária, R = Resistênte

48

7 DISCUSSÃO

A presença de Salmonella em alimentos constitui um risco para a saúde dos

consumidores. Desta forma, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) determina

em sua RDC nº 12 de janeiro de 2001 que produtos cárneos embutidos frescais devem estar

isentos de Salmonella, considerando como impróprias as amostras contaminadas por este

patógeno (BRASIL, 2001). O tipo de matriz analisada neste estudo possui ampla aceitação do

consumidor, representando 40% de todo o mercado de frios e embutidos do Brasil, com suas

vendas tendo aumentado em 60% durante o período entre 2000 e 2008 (NIELSEN, 2009).

Este produto é comumente utilizado nas refeições domésticas, em eventos festivos como

churrascos, ou como ingredientes de outros pratos, como a feijoada. É um produto que recebe

tratamento térmico antes de ser consumido. No entanto, MÜRMANN et al. (2007)

demonstraram que é necessária o aquecimento a 60°C durante 20 minutos para a inativação de

Salmonella spp. em linguiças frescais. Mesmo que estas matrizes sejam consumidas após

cocção, deve-se levar em consideração as mudanças nos hábitos de vida da população, que

impedem que as tarefas diárias sejam realizadas de forma correta, entra elas, o processamento

térmico dos alimentos. Além disso, deve-se observar o aumento dos serviços de alimentação,

que servem uma grande quantidade de pessoas diariamente, e que na tentativa de produzir

alimento suficiente para atender sua demanda, podem submeter os embutidos ao binômio

tempo/temperatura de forma inadequada ou insuficiente, permitindo a sobrevivência de

Salmonella spp. na matriz. Conforme Mürmann et al. (2009) destacam, o sub-processamento

térmico de linguiças frescais pode fazer com que estes produtos representem um perigo á

saúde do consumidor que de modo algum deve ser negligenciado.

Outro ponto importante é a recontaminação dos alimentos (MÜRMANN et al., 2007),

que pode ocorrer por deficiência de qualificação dos profissionais e no cumprimento das boas

práticas de fabricação. Segundo dados do Ministério da Saúde (BRASIL, 2011b), o principal

local de ocorrência de surtos de doenças veiculadas por alimentos no Brasil ocorre nas

residências domésticas. Conforme já discutido, tal fato pode ser explicado em parte pelo estilo

de vida moderno da população, mas também se deve levar em consideração a desinformação

das donas-de-casa a respeito dos diversos riscos de contaminação cruzada e recontaminação

que existem em sua cozinha. Uma vez dentro da cozinha doméstica, durante o pré-

processamento de linguiças frescais e outros alimentos, os utensílios utilizados podem agir

como veículos para a disseminação de diversos microrganismos, não apenas Salmonella spp.,

49

para outras matrizes alimentícias, ou mesmo como meio para a recontaminação da lingüiça

após esta ter sido submetida a tratamento térmico. Em um estudo na República da Irlanda,

GORMAN et al. (2002) detectaram contaminação cruzada entre Salmonella spp. isoladas de

carne de frango e diversos locais da cozinha doméstica, como a pia, o balcão e mesmo o pano

de prato. GOUGH e DODD (1998) estudaram a sobrevivência de Salmonella spp. em tábuas

de cortar carne, comumente utilizadas para a preparação de linguiças, e observaram que este

patógeno pode sobreviver até duas horas após a contaminação desta superfície. Este longo

período de sobrevivência nesta e em outras superfícies favorecem a contaminação de

alimentos que não sofrem tratamento térmico algum, como verduras, e a recontaminação de

alimentos que já passaram por cocção, como carnes em geral. Assim, faz-se necessária a

implantação de medidas de controle deste patógeno, no ambiente industrial e principalmente

na cozinha doméstica é desejável. As agências de vigilância sanitária devem agir de modo

enérgico e rigoroso, evitando que alimentos impróprios para o consumo humano sejam

comercializados.

Desta forma, de modo a auxiliar a detecção deste patógeno em linguiças frescais, o

objetivo deste estudo foi avaliar a PCR como potencial ferramenta a ser adotada para uso

rotineiro. Partindo-se do conhecimento que Salmonella é encontrada em pequenas

quantidades nos alimentos, dificilmente em contagens superiores a 102 UFC/25g (SPRICIGO

et al., 2008), inicialmente fez-se necessário conhecer o limite de detecção da técnica. Os

primeiros experimentos realizados com diluição seriada de um caldo de cultura inicialmente

contendo 108 UFC/mL mostraram que era possível detectar até 1 UFC/mL. Para determinar o

limite de detecção real diretamente da matriz alimentícia estudada foi realizado um

experimento onde foi realizada a contaminação artificial de lingüiça frescal tipo toscana,

mediante a inoculação de diluições seriadas, de modo que uma amostra de 25 g de alimento

utilizada junto aos 225 mL de APT contivessem ao final quantidades decrescentes de

UFC/mL. Desta forma, foi possível obter linguiças contaminadas artificialmente contendo

entre 107 e 1 UFC/25g. O resultado obtido mostrou que o limite de detecção era superior ao

obtido com a cultura, sendo que foi possível detectar apenas quantidades iguais ou superiores

a 105 UFC de Salmonella por 25g, limite superior aos objetivos deste estudo. Outros estudos

também demonstraram a dificuldade de se realizar a detecção direta de Salmonella spp. na

matriz alimentar (JIMENEZ et al., 2010; SANTOS et al., 2001).

A dificuldade em detectar os microrganismos alvo em matrizes cárnicas pode ser

explicada em parte pela composição destes produtos que de modo geral são ricas em proteínas

e lipídeos, além de mioglobina e hemoglobina, potentes inibidores da Taq Polimerase (AL-

50

SOUD e RÅDSTRÖM, 2001). BELEC et al. (1998) caracterizaram a mioglobina proveniente

da musculatura esquelética como inibidora da atividade da DNA polimerase oriunda de

Thermus aquaticus, enquanto KIM et al., (2000) em seus estudos para a detecção de

Clostridium perfringens em alimentos observaram efeito inibitório do colágeno presente na

carne sobre a PCR, onde mesmo quantidades de 105

UFC do microrganismo por grama não

foram detectadas. Desta forma, para reduzir o efeito destes inibidores sobre a PCR, visto que

estes são inerentes a matriz alimentícia estudada, podem ser usadas as etapas de pré-

enriquecimento e enriquecimento seletivo em caldos de cultura, previamente a extração do

DNA. Os caldos de enriquecimento são relativamente baratos, não requerem muita

manipulação e principalmente agem como diluentes de compostos inibidores da PCR além de

aumentarem o número de células microbianas presentes, incluindo o microrganismo alvo

(SANTOS et al., 2001).

Considerando as vantagens descritas acima, realizou-se o estudo de sua aplicação para

a detecção de Salmonella em linguiças. No início dos experimentos foi realizada a

contaminação artificial das matrizes alimentares com concentrações conhecidas de Salmonella

spp. Utilizando uma etapa de pré-enriquecimento em APT seguido de enriquecimento seletivo

em caldo RV e TTH, foi possível a detecção de até 1 UFC/25g nos alimentos contaminados

artificialmente. SANTOS et al. (2001) conseguiram realizar a detecção de Salmonella em

carcaças de frango contaminadas artificialmente em diluições tão baixas quanto 1 UFC/25g,

número de células próximo do limite alcançado no presente estudo. Resultado semelhante foi

obtido por GERMINI et al. (2009), que conseguiram após uma etapa de pré-enriquecimento,

detectar Salmonella spp. em quantidades inferiores a 10 UFC/25g em ovos. Utilizando

frangos naturalmente contaminados, RISSATO et al.(2011) demonstraram que a PCR, não

associada a enriquecimento, é ineficaz na detecção de Salmonella spp., não tendo conseguido

detectar amostras contaminadas, enquanto que após 24h e 48h de incubação em água

peptonada tamponada, detectaram 1 e 5 amostras contaminadas, respectivamente, de um total

de 30 amostras analisadas. Desta forma, é possível observar que a combinação da PCR com o

enriquecimento prévio é adequado, reduzindo o limite de detecção da técnica diminuindo o

número de falso-negativos. Após a análise em amostras contaminadas artificialmente, foi

realizada a avaliação da presença ou ausência de Salmonella spp. em amostras de linguiças

frescais adquiridas em supermercados.

No presente estudo, 21 das 80 (26%) amostras analisadas encontravam-se impróprias

para consumo de acordo com a legislação vigente, 8 (10%) em Niterói e 13 (16,2%) no Rio da

Janeiro. No estado do Rio de Janeiro, somente três estudos com esta matriz foram feitos.

51

Todos os estudos realizados mostraram que linguiças frescais comercializadas no país estão

contaminadas com Salmonella spp., embora a prevalência do patógeno varie de acordo com o

estudo. Todos os estudos já realizados no Brasil utilizaram somente a microbiologia

convencional para a avaliação das linguiças frescais. Lima et al. (2011) encontraram 53% de

amostras contaminadas com Salmonella spp. no município de Niterói, enquanto que Vistel et

al. (2000) relataram a contaminação de 10% das linguiças analisadas. Por outro lado, Chaves

e Franco (2000) relataram a ausência deste microrganismo nesta matriz em Niterói. De fato, a

detecção deste patógeno entre os estudos conduzidos no país é bastante variada. Salvatori et

al. (2003) e Mürmann et al. (2009) em Porto Alegre relataram ausência e 24,4% de

contaminação com o patógeno, respectivamente, enquanto que em São Paulo, Ristori (2010)

encontrou 20% de linguiças frescais contaminadas e Cortez et al. (2004) detectou o agente em

apenas 7,5% de suas amostras. Independente da grande variação de resultados observa-se uma

ampla disseminação deste patógeno neste tipo de produto no país, o que torna as linguiças

frescais potenciais veiculadoras, não importando a origem da carne e os estabelecimentos

comerciais.

Apesar de existir estudos no Brasil visando detectar este patógeno nesta matriz, estes

utilizam apenas a microbiologia convencional para a detecção, existindo uma carência de

informação quanto a aplicação de métodos moleculares para detecção de Salmonella spp. em

produtos embutidos frescais. No estado do Rio de Janeiro, nosso estudo foi o primeiro a

utilizar a PCR que é reconhecidamente superior a microbiologia convencional. Os resultados

obtidos demonstram que a PCR pode ser utilizada na avaliação da contaminação de embutidos

frescais por Salmonella spp. assim como já demonstrado para outros patógenos em diferentes

matrizes alimentares (ASENSI et al., 2009; RALL et al., 2009; SHABARINATH et al., 2007;

CASTAGNA, 2004). Devido a estes achados, cabe ressaltar que os outros estudos conduzidos

no país avaliando Salmonella spp. em embutidos frescais utilizaram somente a técnica

tradicional, sendo possível que tenha ocorrido subestimação da real contaminação. No

entanto, observando-se a detecção específica para Salmonella spp. por cada uma das duas

técnicas, 13 (61,9%) amostras positivas foram detectadas somente pela PCR, 5 (23%)

somente pela microbiologia e 3 (14,2%) por ambas as metodologias, com o coeficiente kappa

mostrando uma fraca concordância entre as técnicas (k = 0,164). Estes resultados suportam o

argumento de que a implementação da PCR para a análise de linguiças frescais pode ampliar

o espectro de detecção de Salmonella spp. em alimentos, reduzindo o número de falso-

negativos, conforme sugestão de Kumar et al. (2008). Bennet et al. (1998) apontam que a

detecção de um maior número de amostras contaminadas pela PCR ocorre, em parte, pela

52

ocorrência de colônias “atípicas” de Salmonella spp. nos meios de cultura, não sendo estas

selecionadas pelo analista para confirmação bioquímica. A não detecção de Salmonella spp.

em algumas amostras pela PCR pode ocorrer, em parte, pela presença de inibidores na matriz

alimentícia ou nos caldos de cultura utilizados para o enriquecimento das amostras (WILSON,

1997).

Importante frisar que a associação de caldos de pré e de enriquecimento seletivo antes

da PCR foi fundamental para aumentar a sensibilidade da técnica, conforme estudos

previamente realizados (BENNET et al, 1998; MARSIGLIA et al., 1997. Além de uma etapa

de pré-enriquecimento, foi realizada uma segunda etapa de enriquecimento seletivo, que além

de diluir possíveis inibidores da reação presentes naturalmente nos alimentos, aumentou o

número de células viáveis dos microrganismos alvo e reduziu a microbiota competitiva,

aumentando a sensibilidade da técnica (OLIVEIRA et al., 2003).

Dois caldos, o RV e o TTH, foram utilizados para o enriquecimento seletivo em

associação com a PCR. A concordância entre ambos os caldos de cultura foi boa (k = 0,608),

com ligeira superioridade em números absolutos do caldo TTH, apesar de estatisticamente

insignificante. Atualmente, ainda não existe um caldo de enriquecimento universal com alta

eficiência para a detecção de todos os serovares de Salmonella (LIMA et al., 2011) sendo este

o motivo da recomendação do uso de pelo menos dois diferentes caldos (BRASIL, 2003). Em

estudos realizados anteriormente avaliando a utilização dos caldos, cada um dos quais foi

apontado por um autor como tendo sido mais eficiente na detecção de Salmonella spp. quando

associado a PCR, onde ambos os caldos foram apontados, um por cada autor, como mais

eficiente em associação com a PCR na detecção de Salmonella spp. em alimentos (MYINT et

al., 2006; MARSIGLIA et al., 1997). No entanto, é importante ressaltar que a comparação

entre diferentes caldos de enriquecimento seletivo associados a PCR para a detecção de

Salmonella spp. em linguiças frescais ainda não havia sido estudada no Brasil.

Quanto à embalagem do produto, original a vácuo, substituída por uma própria do

estabelecimento, ou mesmo ausente, não houve diferença significativa de contaminação entre

as amostras. De fato, estes dados encontram suporte nos achados de Lima et al. (2011) que

mostraram que 11% das linguiças estavam contaminadas por Salmonella somente em sua

região externa, enquanto que 33% possuíam o patógeno em sua parte interna. Considerando

que nos mercados esse produto não é intensamente manipulado, somente para a troca de

embalagens ou sua retirada, questões relacionadas a higiene dos manipuladores se fazem

fundamentais para garantir a inocuidade destes alimentos. Talvez em amostras vendidas a

granel este argumento não fosse valido, visto que o produto fica exposto e é manipulado pelos

53

consumidores; no entanto, esse fator parece não influenciar na contaminação do alimento,

sendo possível que um estudo envolvendo a quantificação de Salmonella spp. em linguiças

contaminadas em sua superfície pudesse revelar se realmente existe maior contaminação em

produtos embalados a vácuo ou a granel. Spricigo et al. (2008) em seu estudo também

encontraram resultado semelhante, onde a obtenção de linguiças em embalagem fechadas ou a

granel não gerou resultados estatisticamente significantes entre si. Em vista dos resultados

deste estudo, pode-se supor que a manipulação dos produtos nos estabelecimentos comerciais

não possui influencia determinante para a presença deste patógeno em linguiças frescais,

sendo mais provável que a contaminação deste produto ocorra durante seu processamento

devido a utilização de carne contendo o patógeno para a elaboração dos produtos, práticas

inadequadas de higiene no estabelecimento e a utilização de ingredientes de baixa qualidade

microbiológica durante a elaboração desta matriz alimentícia (MATARAGAS et al., 2008;

MICHAELS et al., 2004). Castagna et al. (2004) demonstraram que em matadouros de suínos

em que os animais são portadores de Salmonella spp., a massa utilizada para a elaboração de

linguiças frescais também encontrava-se contaminada. Os mesmos autores observaram ainda

que foram detectadas mais amostras contaminadas entre os produtos finais do que entre os

animais, demonstrando que os diversos fatores já discutidos contribuem para a amplificação

da contaminação durante a elaboração do produto.

As aves e os suínos são reconhecidamente as duas principais espécies portadoras de

Salmonella spp. em seu trato gastrointestinal (MATARAGAS et al., 2008). Sem as devidas

medidas profiláticas, estes microrganismos podem contaminar o ambiente industrial e como

consequência a carne. Portanto, é esperado que seus produtos derivados sejam potenciais

veiculadores deste agente. Os resultados observados no presente estudo suportam esta

hipótese, visto que não houve diferença significativa entre ambos os produtos, com a

ocorrência de 20% das amostras constituídas de carne suína contaminada e 29% das linguiças

de frango. Ao avaliar a composição da linguiça suína, tipo toscana ou de pernil, não foi

observada influencia deste parâmetro na contaminação por Salmonella spp., em discordância

com os achados de Spricigo et al. (2008), que encontraram diferença. Segundo estes autores, a

posição dos cortes utilizados para a elaboração da lingüiça toscana encontra-se abaixo da

cavidade abdominal durante o abate, facilitando sua contaminação durante a evisceração, ao

contrário do pernil, que se encontra acima. No entanto, argumentam que estudos com

números maiores de amostras seriam necessários para confirmar essa diferença. Da mesma

forma, com o aumento do numero amostral talvez fosse possível encontrar diferença

significante entre estas duas composições.

54

Em relação às cepas de Salmonella spp. isoladas de linguiças frescais a partir da

microbiologia convencional (TABELA 8), foram estudados e determinados seus respectivos

perfis de susceptibilidade aos antimicrobianos. Nenhum isolado apresentou multirresistência,

caracterizada como a resistência a quatro ou mais antimicrobianos. Todos os isolados

apresentaram perfis de susceptibilidade distintos. Do total de microrganismos testados, 4

(50%) foram sensíveis a todos os antimicrobianos testados. 02 isolados apresentaram

resistência à ampicilina, amoxicilina + ácido clavulânico e cefalexina, enquanto outros 02

isolados apresentaram resistência intermediária à ampicilina e à tetraciclina e um

microrganismos frente à cefalexina e à amoxicilina+ácido clavulânico. Em estudo realizado

por Spricigo et al. (2008) em Santa Catarina, 20% dos microrganismos isolados apresentaram

multirresistência, sendo que destes, 41% e 45% eram resistentes a sulfonamida e a

tetraciclina, respectivamente. Outro estudo, apresentado por Kich et al. (2006) corrobora com

os achados anteriores, tendo sido encontrado resistência a tetraciclina (79%). De fato, é

esperado que os isolados apresentem altos níveis de resistência a este antimicrobiano, visto

que é um dos antibióticos mais utilizados na cadeia produtiva e que se encontra a mais tempo

disponível no mercado (Bahson & Fedorka-Clay, 1999). Os resultados do presente estudo

também estão de acordo com os achados observados nos estudos citados, visto que 2 isolados

apresentaram resistência intermediaria à tetraciclina. Possivelmente o baixo número amostral

(n=8) obtido dificulta o estabelecimento da prevalência de Salmonella spp. resistentes à

tetraciclina. O mesmo argumento é valido para as sulfonamidas, também amplamente

utilizadas na suinocultura, mas que neste estudo nenhum isolado foi resistente.

Dentre os grupos de antimicrobianos testados, as fluoroquinolonas, neste estudo

representado pelo ácido nalidíxico, enrofloxacina e ciprofloxacina, constituem o grupo de

quimioterápicos mais importantes para as intervenções médicas relacionadas a salmonelose

(SOUZA et al., 2010). No Brasil, estudos prévios tem relatado o isolamento de cepas de

Salmonella spp. resistentes às fluoroquinolonas. Spricigo et al. (2008) em estudos com

linguiças frescais mostraram que 17% dos isolados resistentes eram a ciprofloxacina,

enquanto Guerra et al. (2011) relataram ausência de resistência a esse grupo. Em carne de

frango, Ribeiro et al. (2007) detectaram 60% e 8% de cepas resistentes ao ácido nalidíxico,

sendo que Oliveira et al. (2005) encontraram apenas 3% dos isolados resistentes a

norfloxacina, com 100% dos microrganismos sensíveis à ciprofloxacina. Apesar dos baixos

níveis de resistência encontrados no Brasil, é prudente a realização de estudos adicionais e o

acompanhamento constante para a vigilância contínua da resistência as quinolonas, visto que

em outros países os níveis encontrados são elevados, conforme demonstrado pelos estudos de

55

Antunes et al. (2003) com carne de frango, que encontraram 50% de isolados resistentes ao

ácido nalidíxico e a enrofloxacina.

A ampicilina e amoxicilina+ácido clavulânico pertencem ao mesmo grupo de

antibióticos, os beta-lactâmicos. A resistência a este grupo de antimicrobianos por bactérias

entéricas vem ascendendo de forma assustadora nos últimos anos. Em um estudo de vigilância

nos Estados Unidos entre 2002 e 2006, Zhao et al., (2009) encontraram dentre 344 cepas de

Salmonella spp. isoladas de carne, 66% e 55,5% de microrganismos resistentes a ampicilina e

a amoxicilina+ácido clavulânico, respectivamente. Spricigo et al. (2008) estudando isolados

de linguiças suínas encontraram 5 microrganismos resistentes à ampicilina mas nenhum à

amoxicilina + ácido clavulânico. No entanto, Schmidt e Cardoso (2003) estudando dejetos

suínos encontraram 77,5% e 5% de resistência a ambos os antimicrobianos, respectivamente

enquanto Castagna et al. (2004) em isolados de embutidos frescais encontraram resistência

somente à ampicilina (20%). Apesar da divergência de resultados, é possível concluir sobre a

existência de Salmonella spp. resistentes no Brasil, sendo este fenômeno atribuído

principalmente a conjugação de plasmídeos contendo genes de resistência (Zhao et al., 2009).

Outro grupo de antimicrobianos especialmente importantes para o tratamento das

salmoneloses são as cefalosporinas de terceira geração, neste estudo representado pela

ceftriaxona e ceftazidima. Nenhum isolado apresentou resistência à ambos. Estas duas

moléculas são utilizadas para o tratamento de infecções por Salmonella spp. em crianças em

situações onde o uso de fluoroquinolonas é contra-indicado (Hohmann, 2001). Poucos são os

estudos no país com este grupo. No entanto, alguns dados disponíveis são assustadores, como

os encontrados nos estudos de Medeiros et al. (2011) que detectou 75% de Salmonella

Heidelberg resistentes à ceftriaxona. Mais estudos com maior número de isolados são

necessários para determinar melhor a situação dos níveis de resistência deste patógeno frente

as cefalosporinas de terceira geração.

56

8 CONCLUSÕES

- A detecção direta de Salmonella spp. em linguiças frescais não foi possível, dado o limite de

detecção da PCR superior a 105 UFC/25g, valor insuficiente para os propósitos deste estudo.

- A associação da PCR com as etapas de pré enriquecimento e enriquecimento seletivo

aumentaram a sensibilidade da técnica, permitindo a detecção de alimentos contaminados

com até 1 UFC/25g de Salmonella spp., tornando esta técnica uma opção confiável para a

detecção deste patógeno.

- Linguiças frescais de suíno e frango comercializadas em Niterói e no Rio de Janeiro estão

contaminadas com Salmonella spp., na proporção de 1 para cada 4 linguiças (21 de 80

amostras analisadas, prevalência de 27%), tornando esse alimento potencialmente perigoso

para a saúde do consumidor.

- A manutenção da embalagem original, o uso de uma modificada nos estabelecimentos ou

mesmo a ausência destas parece não ter aumentado a contaminação por Salmonella spp.

nestes produtos, visto que 23% (4 de 17) das amostras em suas embalagens originais e 26%

(17 de 41) das linguiças fora da embalagem original estavam contaminadas com o patógeno.

- Linguiças de carne suína ou de frango parecem ser igualmente contaminadas, considerando

que os resultados obtidos neste estudo, 20% e 29% de contaminação, respectivamente, não

foram estatisticamente significantes.

- Parece não existir diferença de presença de contaminação entre linguiças suínas de pernil ou

tipo toscanas, dado que 10 das 27 linguiças toscanas e 5 das 24 de pernil estavam

contaminadas por Salmonella spp., uma diferença estatisticamente não significante.

- Os isolados analisados neste estudo não apresentaram níveis de resistência significativa aos

antimicrobianos, em virtude de quatro isolados apresentarem resistência a algum dos

antimicrobianos testados. Desses, quatro microrganismos apresentaram resistência a

antimicrobianos da classe dos beta-lactâmicos (ampicilina, amoxicilina + ácido clavulânico e

cefalexina) e 2 microrganismos a tetraciclina,

57

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72

10 APÊNDICES

APÊNDICE A

OTIMIZAÇÃO DE CONDIÇÕES E PARÂMETROS DA REAÇÃO EM CADEIA DA

POLIMERASE PARA A IDENTIFICAÇÃO DE SALMONELLA SPP. EM LINGÜIÇA

FRESCAL TIPO TOSCANA SUÍNA

Claudius Couto Cabral, Carlos Adam Conte Junior, Joab Trajano Silva, Vânia Margaret Flosi

Paschoalin

Laboratório de Análises Avançadas em Biologia Molecular e Bioquímica, Instituto de

Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro.

O consumo de embutidos no Brasil vem apresentando grande expansão nos últimos

anos, com a assimilação de diversos produtos como a salsicha, a mortadela e a lingüiça no

hábito alimentar da população. Atualmente, existe grande interesse da indústria na produção

de produtos de alta qualidade, no que se refere a inocuidade do alimento, de forma que este

não cause malefícios a saúde humana. Neste contexto, encontra-se a bactéria Salmonella spp,

trata-se de um bastonete Gram negativo, encontrado no trato gastrointestinal de praticamente

todos os animais. O controle desta bactéria na cadeia produtiva de embutidos é de

fundamental importância, e a detecção rápida e eficaz dela se faz necessária para o sucesso

deste controle. O padrão ouro para a detecção laboratorial é o isolamento por métodos

tradicionais de microbiologia, no entanto estes são laboriosos e demorados. Técnicas

moleculares de alta sensibilidade e especificidade têm sido desenvolvidas a fim de aprimorar

a detecção. Neste trabalho, o objetivo foi desenvolver um protocolo de reação em cadeia da

polimerase (PCR) para a detecção de Salmonella spp. em lingüiça frescal tipo toscana. Uma

cepa de referência de Salmonella Enterica (ATCC 13076) foi crescida em caldo BHI durante

24h, com o crescimento obtido quantificado em espectrofotômetro por densidade óptica de

600 nm. Um crescimento na escala de 108 UFC/ml foi obtido, sendo este diluído de forma

seriada até a 101 UFC/ml. Seguiu-se a inoculação experimental em lingüiça frescal obtida do

comércio previamente confirmada como negativa para Salmonella spp. por métodos

tradicionais, de forma a obtenção de alimentos com 105 até 10

1 UFC/ml. Após

homogeneização em Stomacher 400 circulator, 1 mL foi retirado e utilizado para a extração

do DNA pelo kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen). As condições de amplificação e os

73

reagentes foram utilizados de acordo com Asensi e colaboradores (2009). O DNA amplificado

foi visualizado através de eletroforese em gel de agarose (SIGMA) a 2%, corados com gel red

(1:1000) e visualizados em fotodocumentador (Mini BisPro – BioAmerica). A amplificação

foi possível apenas da diluição contendo 105 UFC/ml, demonstrando a necessidade de

aperfeiçoamento das condições e do processo de extração, havendo a possibilidade da

utilização de pré-enriquecimento de forma a otimizar a metodologia de detecção deste

microrganismo nesta matriz alimentar.

74

ESTUDO DE CEPAS PROBIÓTICAS ISOLADAS DE KEFIR COM POTENCIAL DE

PRODUZIR ÁCIDO LINOLEICO CONJUGADO

Carla Paulo Vieira, Carlos Adam Conte-Junior, Analy Leite, Claudius

Cabral, Vânia Margaret Flosi Paschoalin, Joab Trajano Silva

Laboratório de Análises Avançadas em Biologia Molecular e Bioquímica, Instituto de

Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Ácido linoléico conjugado (CLA) é o nome dado a uma família de isômeros

geométricos e de posição do ácido linoléico. Estudos têm demonstrado os efeitos benéficos

que a ingestão deste ácido graxo possui sobre a saúde humana, entre eles a modulação do

sistema imune e atividades anti-carcinogênica e anti-obesidade. Estas observações têm

despertado o interesse no isolamento de cepas probióticas com potencial de sintetizar CLA

para uso na produção de alimentos probióticos enriquecidos em compostos funcionais.

Estudos preliminares realizados pelo nosso grupo demonstraram que o leite fermentado com

grãos de kefir de diferentes origens apresentou níveis aumentados de CLA, e que o perfil de

ácidos graxos e os níveis de CLA encontrados ao final da fermentação estavam relacionados

com as espécies de microrganismos presentes. O objetivo deste estudo foi estudar o potencial

de formação de CLA em cepas isoladas a partir de kefir, para serem utilizadas na fabricação

de produtos lácteos enriquecidos. Foram isoladas seis cepas de bactérias ácido-lácticas a partir

de grãos de kefir que apresentavam potencial probiótico. Para estudar a capacidade de

produção de CLA dos isolados, as cepas foram ativadas em caldo MRS à 37°C por 18h e

inoculadas em caldo MRS contendo 2% Tween 80 (w/v) suplementado com 0,1 g/L ou

0,7 g/L de óleo de girassol. Após incubação à 37ºC por 5h foram colhidas amostras de 1ml do

meio, que foram centrifugadas e os ácidos graxos presentes no sobrenadante foram extraídos

com hexano. A quantidade de CLA formada foi estimada espectrofotometricamente a 233 nm.

As cepas apresentaram maior produção de CLA quando incubadas em MRS suplementado

com 0,1g/L de óleo de girassol, mostrando em concentrações maiores de triacilgliceróis (0,7

g/L) a capacidade de produção de CLA é inibida. As cepas GYP12, MR1 e L12 apresentaram

as maiores taxas de conversão, com a produção final de CLA de 0,25 mg/ml, 0,25 mg/ml e

0,23 mg/ml, respectivamente. As menores taxas de conversão foram apresentadas pelas cepas

GYP7 e MRS47, com produção final de 0,10 mg/ml e 0,09 mg/ml respectivamente. As cepas

GYP12, MR1 e L12 serão usadas em desenhos experimentais com o objetivo de melhorar o

processo de produção de CLA.

75

APÊNDICE B

DETECTION OF ENTERIC BACTERIAL PATHOGENS, LISTERIA

MONOCYTOGENES AND OPPORTUNIST MYCOBACTERIAL SPECIES IN

MUSSEL (Perna perna) BY PCR AND RESTRICTION ENZYME ANALYSIS

Claudius C. Cabral1, Ana Carolina S. Carvalho

1, César A.L. de la Torre

2, Ana Letícia M.

Santos1, Cristiana B. Passinato

1, Carlos A. Conte-Junior

2, Rafael S. Duarte

3, Joab T. Silva

2,

Vânia Margaret F. Paschoalin2.

1 Laboratory of Advance Analysis in Biochemistry and Molecular Biology, Institute of

Chemistry, Department of Biochemistry, Federal University of Rio de Janeiro. 2 Laboratory of Physico-chemical Control of Products of Animal Origin, Veterinary College,

Department of Food Technology, Federal Fluminense University 3 Mycobacteria Laboratory, Center of Health Sciences, Department of Microbiology, Federal

University of Rio de Janeiro

The bivalve molluscs represent an important vehicle of infectious agents and marine

biotoxins. These animals have the ability to concentrate various pathogens and toxins during

their filter feeding process. The aim of this study was to investigate the occurrence of

pathogens such as Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella spp., and potentially

pathogenic mycobacterial species in mussel commercialized at a mussel farm in Niteroi-RJ,

Brazil by PCR and restriction enzyme analysis (PRA). A total of 28 samples in natura (25

grams ± 0,2g each) were analyzed. DNA was extracted from 1.0 mL aliquots of specific

enrichment culture to each specie investigated by DNeasy Blood and Tissue Kit (Quiagen).

The PCR assay was based on LamB and InvA genes of E.coli and Salmonella spp.,

respectively. A multiplex PCR based on iap and hly genes was performed to simultaneous

detection of L. monocytogenes and it´s virulence factor listeriolysin O. The identification of

mycobacterial species was performed by the PRA method. The results showed successful

amplification in six samples for E.coli (21.4%) and one for L.monocytogenes with virulence

factor (3.5%), with no amplification for Salmonella spp. One amplification was identified as

Mycobacterium peregrinum. Our finding suggest the potential risk of ingesting mussels to the

human heath due the presence of those pathogens. The termic treatment of this seafood before

consumption is therefore indicated as a good measure to prevent infection by those

microorganims.

76

DETECTION OF BIOGENIC AMINES IN MUSSEL (Perna perna) BY HPLC

César A. Lázaro1, Claudius C. Cabral

2, Ana Carolina S. Carvalho

2, Ana Letícia M. dos

Santos2, Joab T. Silva

2, Vânia M. F. Paschoalin

2, Eliane T. Mársico

1, Sérgio B. Mano

1, Carlos

A. Conte-Junior1

1Department of Food Technology, Veterinary College, Rua Vital Brasil Filho, 64, Santa Rosa,

24230-340, Niteroi- RJ, Brazil. 2Laboratory of Advanced Analysis in Biochemistry and Molecular Biology, Chemistry

Institute, Federal University of Rio de Janeiro, UFRJ, Av. Athos da Silveira Ramos, 149-

Bloco A, Cidade Universitária, Ilha do Fundão, 21949-900, Rio de Janeiro-RJ, Brazil.

Biogenic amines are low molecular weight substances, formed mainly by

decarboxylation of specific amino acids present in food through the action of bacterial

enzymes; due to this fact, they may be related to bacterial growth and used as an indicator of

microbial contamination. Amine determination in food is the great interest because

consumption of products with high concentration represents a public health risk on account of

their toxicological effects, and they can be used as an indirect bacteriological quality

indicator.The aim of this study was determinate the levels of biogenic amines in mussel

collected from a farm located in Niteroi- RJ, Brazil. A total of 28 samples in natura (25 ±

0.2g each) were extracted (perchloryc acid), derivatizated (benzoyl chloride) and injected in

HPLC system (Shimadzu LC/10AS) coupled to SPD/10AV UV-Vis detector (198 nm) and

column Teknokroma Tracer Extrasil ODS2 (15 x 0.46 cm id., 5 μm) in isocratic solvent of

acetonitrile:water (42:58). Presence of biogenic amines were identified by retention time and

quantified by area peak using standards. The results showed the presence of tyramine,

putrescine, cadaverine, spermidine and spermine in the samples. Tyramine was the most

abundant amine 3300.28 mg.Kg-1

; putrescine and cadaverine, with high values of 217.78 and

145.79 mg.Kg-1

, respectively; and finally spermidine and spermine with the lowest values,

54.25 and 72.44 mg.Kg-1

, respectively. Our finding suggest that the proposed HPLC method

is suitable to determine biogenic amines in mussels.

77

APÊNDICE C

PERFIL DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS DE ESCHERICHIA

COLI E SALMONELLA SPP. ISOLADAS DE LINGÜIÇAS FRESCAIS

COMERCIALIZADAS NA CIDADE DE NITERÓI – RJ

1Claudio Sabbatini Capella LOPES,

1Claudius Couto CABRAL,

1Raphael LEONARDO,

2Bruno Reis Carneiro da Costa LIMA,

3Robson Maia FRANCO,

3Carlos Adam CONTE-

JUNIOR, 4Joab Trajano SILVA,

4Vânia Margaret Flosi PASCHOALIN

1Aluno de mestrado em Ciência de Alimentos - UFRJ

2Aluno de doutorado em Higiene Veterinária e Processamento Tecnológico de P.O.A.

3Professor Adjunto – Universidade Federal Fluminense

4Professor Adjunto – Universidade Federal do Rio de Janeiro

Palavras-Chave: Resistência a antimicrobianos, linguiças frescais, E.coli, Salmonella spp.

Introdução

As linguiças constituem os derivados cárneos fabricados em maior quantidade no

Brasil, por serem altamente apreciados pela população e por apresentarem, nos dias atuais,

preços mais acessíveis quando comparado com a carne in natura (ABRAFRIGO, 2009). A

variedade frescal não recebe tratamento térmico durante sua elaboração, de modo que os

microrganismos presentes nas matérias-primas utilizadas se manterão no produto até a casa do

consumidor (BEZERRA et al., 2007; TERRA, 1998).

Estudos recentes têm demonstrado a importância da carne suína como importante

fonte de contaminação por Escherichia coli e Salmonella spp. (LIMA et al., , 2011; Spricigo

et al., 2008). Estes dois enteropatógenos são implicados como agentes de surtos de doenças

gastroentéricas por todo o mundo. Trabalhos voltados para o controle de qualidade

microbiológico destes produtos visam aprimorar a detecção destes enteropatógenos, pois a

detecção e a caracterização destes microrganismos indicam produtos elaborados na ausência

de boas práticas de fabricação, demonstrando a necessidade de implementação de estratégias

de controle apropriadas (DUQUE et al., 2002).

A determinação do perfil de susceptibilidade antimicrobiana em E.coli e Salmonella

spp. tem influência direta no aspecto clínico epidemiológico da medicina humana visto que,

em determinados casos, sob indicação médica, pode ser necessária uma intervenção

terapêutica com antibioticoterapia; a presença de mecanismos de resistência nestes patógenos

pode comprometer o sucesso do tratamento (EUA, 2005). Desta forma, o presente estudo

78

objetivou estudar o perfil de susceptibilidade a 16 antimicrobianos em E.coli e Salmonella

spp. isolados de linguiças frescais na cidade de Niterói – Rio de Janeiro.

Material e Métodos

Amostras congeladas oriundas de linguiças frescais previamente estudadas por Lima et

al.,(2011) foram utilizadas para o isolamento de E.coli e determinação do seu perfil de

susceptibilidade aos antimicrobianos. Adicionalmente, oito cepas de Salmonella spp.

previamente isoladas de linguiças frescais pelo nosso grupo foram incluídas no estudo.

As amostras mantidas congeladas foram descongeladas lentamente por imersão em

gelo por 20 minutos. Posteriormente, 100 µl da amostra foram adicionadas em 10 mL de

caldo Brain Heart Infusion (BHI). Após incubação por 24h a 37ºC, uma alçada de cada

cultura foi plaqueada em placas de Petri e 90 mm descartáveis contendo o agar eosina azul de

metileno (“eosine methylene blue” - EMB). Estes foram incubados por 24h a 37°C e as

colônias com características morfológicas sugestivas de E.coli foram transferidas para tubos

contendo BHI, com nova incubação a 37ºC durante 24h para posterior confirmação.

No total, 31 colônias foram submetidas a confirmação através da reação em cadeia da

polimerase (PCR), utilizando-se primers específicos para o gene lamB, caracteristico de E.

coli (Tabela 1). As condições e parâmetros da técnica foram utilizadas de acordo com Asensi

et al. (2009).

As cepas previamente isoladas de Salmonella spp. foram reativadas mediante repique

em 10 mL de caldo BHI seguido de incubação a 37ºC durante 24h. Decorrido este período, o

caldo foi utilizado para a realização do antibiograma. A metodologia empregada para analisar

o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos foi baseada no método de difusão em disco

em Agar Mueller-Hinton descrito por Bauer et al. (1966). Os antimicrobianos testados foram:

ácido nalidíxico, amoxicilina + ácido clavulânico, ampicilina, amicacina, cefalexina,

ceftriaxona, ceftazidima, ciprofloxacina, cloranfenicol, doxiciclina, enrofloxacina,

estreptomicina, levofloxacina, tetraciclina, sulfonamidas e sulfametoxazol + trimetoprim.

Resultados e discussão

Dentre as colônias sugestivas de E. coli, 27 foram confirmadas mediante amplificação

do gene lamB exclusivo deste patógeno (Figura 1). Segundo Asensi et al. (2009), este primer

é específico para a espécie E. coli, não gerando amplicons a partir de outros microrganismos.

79

O perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos das cepas isoladas deste patógeno pode ser

visualizado na tabela 1.

Gene

alvo Sequencia do primer

Amplicon

gerado Referência

lamB

(E.coli)

Foward:

5´CTGATCGAATGGCTGCCAGGCTCC3´

Reverse

5´CAACCAGACGATAGTTATCACGCA3´

346 bp Asensi et al., 2009

Tabela 2: Perfil de susceptibilidade antimicrobiana dos isolados de E.coli

Nº Amostras (%) Nº Amostras (%)

Antimicrobiano R I S Antimicrobiano R I S

Ácido Nalidíxico

10(36) 2 (7) 15(56)

Cloranfenicol

3(11) 2(7) 22(82)

Ampicilina 12(43) 0 15(57) Doxiciclina

4(15) 3(11) 20(74)

Amoxicilina +

ácido clavulânico 1(4) 2 (7) 24(89)

Estreptomicina

4(15) 3(11) 20(74)

Amicacina

1(4) 0 26(96)

Enrofloxacina

1(4) 2(7) 24(89)

Cefalexina

2(7) 0 25(93)

Levofloxacina

1(4) 0 26(96)

Ceftriaxona

0 3(11) 24(89)

Tetraciclina

10(37) 0 17(63)

Ceftazidima

3(11) 0 24(89)

Sulfametoxazol +

trimetoprim

13(48) 0 14(52)

Ciprofloxacina

1(4)

0

26(96)

Sulfonamidas

9(33) 0 18(67)

R – Resistente; I – Intermediário; S – Sensível

Figura 1: Gel de agarose 2% mostrando amplicons gerados a partir do gene lamB, específico para Escherichia coli. Linha 1: Controle negativo; Linha 2: DNA de E. coli DH5α (controle positivo); Linha 3 a 8: colônias suspeitas confirmadas como E.coli.

1 2 3 4 5 6 7 8

Tabela 1: Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a confirmação das colônias presuntivas de E.coli.

80

Todos os isolados apresentaram resistência a no mínimo um dos antimicrobianos

testados. Altos níveis de resistência foram detectados principalmente frente ao

sulfametoxazol + trimetoprim (48%), ampicilina (43%), tetraciclina (37%), ácido nalidíxico

(36%) e a sulfonamida (33%). Franco et al. (2010) encontraram 70% de resistência a

tetraciclina e 47% a sulfametoxazol + trimetoprim de isolados de carne e dejetos suínos.

A emergência de cepas de E.coli resistentes a antimicrobianos é uma preocupação

mundial não sendo restrita ao Brasil. Sáenz et al. (2001) encontrou na Espanha 53% de

isolados resistentes a tetraciclina e ao ácido nalidíxico e 34% de resistência frente a

sulfametoxazol + trimetoprim. Resultado semelhante foi relatado por Schroeder et al. (2003)

que encontrou em isolados de carne nos Estados unidos 53% de resistência a tetraciclina e

45% ao sulfametoxazol+trimetoprim. De fato, é esperado que ocorram altos níveis de

resistência frente a tetraciclina e as sulfas, visto que são dois dos antimicrobianos a mais

tempo disponíveis no mercado e amplamente utilizados na produção animal (Bahson &

Fedorka-Clay, 1999).

O perfil de sensibilidade aos antimicrobianos dos 8 isolados de Salmonella spp.

encontra-se na tabela 2. Em comparação a E. coli, observa-se menores níveis de resistência

aos antimicrobianos. Os resultados observados neste estudo são relativamente inesperados

quando comparados aos observados em outros. Nenhum isolado apresentou multirresistência,

caracterizada como a resistência a quatro ou mais antimicrobianos. Todos os isolados

apresentaram perfis de susceptibilidade distintos. Do total de microrganismos testados, 4

(50%) foram sensíveis a todos os antimicrobianos testados. Entre os resultados obtidos,

houve resistência de dois isolados a ampicilina, amoxicilina + ácido clavulânico e cefalexina,

resistência intermediária de dois microrganismos a ampicilina e a tetraciclina e de um

microrganismos frente a cefalexina e a amoxicilina+ácido clavulânico, respectivamente. Em

estudo conduzido por Spricigo et al. (2008) em Santa Catarina, observou-se 20% de isolados

com multirresistência, com 41% e 45% dos isolados sendo resistentes a sulfonamida e a

tetraciclina, respectivamente. No entanto, Castagna et al. (2000) encontrou somente baixos

níveis de resistência a ampicilina.

81

Conclusão

Os dados deste trabalho revelam a presença de enteropatógenos resistentes a

antimicrobianos em linguiças frescais, e alertam para a necessidade de monitoramento destes

patógenos e para a necessidade de adoção de medidas de controle do uso indiscriminado de

antimicrobianos em animais de produção. Futuros estudos com biologia molecular nestes

isolados deverão ser conduzidos com o intuito de aumentar a compreensão sobre mecanismos

de resistência envolvidos nos microrganismos presentes em linguiças frescais.

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Pork, 3, 1999, Washington, 240-241.

Tabela 3: Perfil de susceptibilidade antimicrobiana dos isolados de Salmonella spp.

Nº Amostras (%) Nº Amostras (%)

Antimicrobiano R I S Antimicrobia

no R I S

Ácido nalidíxico 0 0 8(100) Cloranfenicol 0 0 8(100)

Ampicilina 2 (25) 2 (25) 4(50) Doxiciclina 0 0 8(100)

Amoxicilina +

ácido clavulânico 1(12,5) 1(12,5) 6(75) Estreptomicina 0 0 8(100)

Amicacina 0 0 8(100) Enrofloxacina 0 0 8(100)

Cefalexina 2 (25) 1(12,5) 5(62,5) Levofloxacina 0 0 8(100)

Ceftriaxona 0 0 8(100) Tetraciclina 0 2(25) 6(75)

Ceftazidima 0 0 8(100) Sulfametoxazo

l + trimetoprim 0 0 8(100)

Ciprofloxacina 0 0 8(100) Sulfonamidas 0 0 8(100)

R – Resistente; I – Intermediário; S - Sensível


82

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http://sistemasweb.agricultura.gov.br/sislegis/action/detalhaAto.do?method=consultarLegislacaoFederal

http://www.cdc.gov/narms/faq_pages/5.htm

83

APÊNDICE D

Evaluating Salmonella sp. contamination of fresh pork and

chicken sausages marketed in two cities in Brazil

Cabral, C.C.*1

, Conte-Junior, C.A.2, Silva, J.T.

1, Paschoalin, V.M.F.

1

1Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Av. Athos da Silveira ramos-

Sala 545, 149 - Cidade Universitária, 21949-909, Rio de Janeiro (RJ), Brazil

2Faculdade de Veterinária, Universidade Federal Fluminense, Rua Vital Brasil Filho, 62,

24230-340, Niterói (RJ), Brazil

*Corresponding author:

E-mail: [email protected]

Tel: +5521 2624 0234

Fax: +55 21 2562 7266

ABSTRACT -Fresh sausages are the most popular stuffed meat product available in Brazil.

However, the use of contaminated raw material, unhygienic handling during processing, and

inadequate storage could be hazardous consumers’ health, since fresh-sausage processing

does not include heat treatment and the product may carry several human pathogens such as

Salmonella sp. To evaluate Salmonella sp. contamination of fresh sausages marketed in Rio

de Janeiro and Niterói, 80 fresh sausages were collected from 22 stores in both cities. A total

of 21 sausage samples (27%) proved to be contaminated by Salmonella sp. Sixteen (20%)

contaminated samples were detected by PCR testing combined with RV or TTH broth

culturing and plating on Hektoen and Salmonella differential agar, whereas conventional

microbiological screening detected only 8 (10%). The packing conditions of fresh sausages at

the retail market, original or replaced packing, or even unpacked, did not seem to significantly

affect Salmonella sp. contamination, since the samples in their original packing showed 23%

contamination whereas the contamination rate of sausages wrapped in plastic or unpacked

was 27%. Similarly, the meat composition did not seem to influence Salmonella sp.

contamination significantly, since 20% of the chicken and 29% of the pork sausages proved to

be contaminated. The contamination rate of Tuscan-type sausages was 37%, while

mailto:[email protected]

84

contamination was found in 21% of ham sausages, indicating that the cut of pork did not

affect the microbiological quality of the fresh sausages. The results shown here indicate that

PCR testing could be a valuable tool for assessing the microbiological quality during plant

processing of stuffed food.

Keywords: Salmonella sp., fresh pork and chicken sausages, PCR tests, product packing,

Brazil

1. INTRODUCTION

Among foodborne diseases, salmonellosis is a prominent cause of outbreaks

associated with different food matrices. In the United States, the estimated prevalence of

foodborne infections by non-typhoidal Salmonella is 1.4 million cases per year (Voestch et al.

2004). In Brazil, Salmonella sp. is most commonly involved in foodborne diseases, being

involved in 42.2% of the cases, and meat and its derivatives stand in second place among the

foods that are most commonly identified in outbreaks (Brasil, 2011).

The occurrence of salmonellosis worldwide has changed markedly in recent years,

with the rise of non-typhoidal salmonellae as agents of disease in humans, mainly due to food

contamination by these microorganisms (Olsen et al. 2001; Taunay et al. 1996). In Brazil, few

data on salmonellosis outbreaks are available, leading to a probable underestimation of the

true incidence of the disease in Brazil. Fernandes et al. (2006) reported 3554 cases of

salmonellosis in São Paulo state, and noted that young children and immunocompromised

patients were mostly affected. Taunay et al. (1996), in a 40-year retrospective study, reported

that 75% of the isolates were from stool, 16% from blood, and 4% from cerebrospinal fluid

cultures.

The main form of transmission of Salmonella sp. to humans and animals is through

ingestion of contaminated food and water, due to inadequate sanitary conditions during

production and processing, improper handling, or contamination of raw materials. In Brazil,

only eggs and foods that contain eggs have well-defined epidemiological importance (Brasil,

2011); however, the roles of other foods such as meat and vegetables are still uncertain,

although some of them have been reported as being involved in outbreaks of salmonellosis.

Fresh sausages are the most commonly consumed stuffed meat product in Brazil. The

acceptance of fresh sausages has increased by 60% from 2000 to 2008 and the rate of

consumption by the Brazilian population is around 1.7 kg/person/year (Nielsen, 2009). Fresh

85

sausages are made mainly from pork or chicken. Additives, condiments and spices are added

to preserve the product, and to enhance the flavor and appearance before the sausage material

is stuffed in natural casings. Those products are not heat-treated, and if the raw materials and

ingredients do not meet microbiological quality standards, contamination will continue and

may even increase during plant production until its final stage at the consumer’s house or at

food business establishments such as restaurants. Contamination of fresh sausages by

Salmonella sp. has already been reported in Brazil (Rall et al. 2009; Spricigo et al. 2008;

Salvatori et al. 2003), which makes this product a potential health hazard for Brazilian

consumers, since sausages are an inexpensive and widely accepted meat product

(ABRAFRIGO, 2009). In the State of Rio de Janeiro, few available studies (Lima et al. 2011;

Viestel et al. 2000; Chaves and Franco, 2000) have evaluated Salmonella sp. contamination of

sausages. In these studies, the conventional microbiological tests were performed, since this is

the standard methodology currently advised by the official food-safety regulations to evaluate

microbiological quality of food (Brasil, 2003).

The conventional methodology has two stages, pre-enrichment and selective-

enrichment culturing of microorganisms, followed by isolation in selective media, selection of

suspicious colonies, and biochemical identification, confirmed by a positive reaction in the

serum-agglutination test with polyvalent anti-Salmonella antigen. This methodology is time-

consuming and laborious, requiring an average of five days, in addition to the need for

different reagents and suitable glassware. These requirements make it difficult to analyze a

large number of samples, as is often necessary for routine surveillance or industrial internal

quality-control procedures. Another disadvantage that must be considered is the

misinterpretation of tests, which increases the number of false-negative results (Rall et al.

2009).

To increase the accuracy and specificity of the evaluation of Salmonella sp.

contamination in foods, the PCR test is considered by many investigators to be a fast and

reliable diagnostic method to evaluate food microbiological quality (Asensi et al. 2009;

Amagliani et al. 2007; Gebreyes et al. 2005; Bennet et al. 1998).

This study was designed to investigate Salmonella contamination in fresh pork and

chicken sausages marketed in the cities of Niterói and Rio de Janeiro, Brazil, and to evaluate

whether different sausage products (Tuscan-type, ham or chicken) or product packaging

conditions could affect the rate of Salmonella sp. contamination. A secondary objective was

to estimate the efficiency of the PCR test combined with conventional microbiological

screening, in detecting the pathogen in stuffed meat matrices.

86

2. MATERIALS AND METHODS

2.1. Sausage samples

A total of 80 samples of fresh sausages were collected (40 in Niterói and 40 in Rio de

Janeiro cities), from 22 different stores, from November 2011 to June 2012; 29 were chicken

sausages and 51 pork sausages (27 Tuscan-type and 24 ham). Upon purchase, the type of

product packaging, i.e., the original container used by the meat producer, new packaging in

the store, or unpacked in the refrigerated counter, indicating food manipulation in the store,

was recorded. Samples were kept at 4°C for a maximum of 2 h before analysis.

2.2. Microbiological analysis

From each sausage, 25 g was removed aseptically from different parts of the product,

transferred to a sterile homogenization bag (Interscience®

) along with 225 mL of buffered

peptone water (BPW), and homogenized with stomacher (Seward Stomacher 400 circulator®)

for 2 min at 230 rpm. The samples were incubated at 37°C for 24 h, and then aliquots of 1 mL

and 100 μL were transferred into 9 mL of tetrationate Hajna (TTH) and 9.9 mL Rappaport-

Vassiliadis (RV) broths, respectively, followed by 24 h incubation at 37ºC (TTH culturing) or

42ºC (RV culturing).

Aliquots of the cultures were seeded on Hektoen enteric agar and Salmonella

differential agar for 24 h. Three to 5 presumptive colonies were individually picked and

transferred to triple-sugar iron agar (TSI), and incubated at 37°C for 24 h. TSI colonies with

compatible biochemical profiles were selected and inoculated into tubes containing

phenylalanine agar and urea broth, and incubated at 37ºC for 24 h. Negative colonies were

transferred to tryptone soy agar (TSA) for 24 h, followed by the agglutination test, performed

using an anti-Salmonella polyvalent somatic serum (PROBAC®

, São Paulo, Brazil).

2.3. DNA Extraction

From each selective-enrichment culture, 1 mL aliquots were collected. The TTH

culture sample was previously centrifuged at 604 g for 5 min to remove the calcium carbonate

that is naturally present in this broth, in order to prevent subsequent clogging of the

membranes from the DNA extraction kit. Then, both broths were centrifuged at 14,000 g for

87

10 min. Pellets were washed twice in 0.9% NaCl and genomic DNA extraction was

performed using a DNeasy blood & tissue kit (Qiagen®

, Hilden, Germany). Total DNA was

quantified by fluorescence using the QuBit dsDNA HS Assay (Life Technologies®

, Carlsbad,

USA).

2.4. PCR

PCR targeting for the InvA gene was carried out using the set of primers (Invitrogen®

,

Carlsbad, USA) InvA1 (5 'GAT CCT TAT CGT CGC ACT GAA ACT G 3') and InvA2 (5

'GAC CAT CAA TGG C AC TCA GCA GG 3') (Kapley et al., 2000) at a concentration of

0.25 μM in a 50 μL volume. Then, 2.5 mM magnesium chloride, 200 mM dNTP, 2.5 U of

Platinum Taq (Invitrogen®

, Carlsbad, USA), 5 μL of 10x buffer and 100 ng of genomic DNA

were also added. A total of 40 amplification cycles were performed, preceded by a

denaturation step at 94°C for 30 s, followed by annealing at 60°C/30 s and extension at

72°C/2 min, with a final extension step at 72°C/7 min. Amplicons (598 bp) were observed

and documented (Mini BisPro - BioAmerica®

, California, USA) after electrophoresis on

agarose gel at 2% (100V, 200 mA for 80 min), and staining with GelRed (Biotium®

,

California, USA).

2.5. Statistical Analysis

The MacNemar test was used to compare the results obtained from the PCR assay and

conventional bacteriology, and the chi-square test was used for the comparison of other

variables. The agreement between the PCR assays and the culturing results in different broths

was estimated by the kappa agreement test. All analyses used the software XLSTAT 2012.

3. RESULTS

Eighty fresh sausage samples from two Brazilian cities were analyzed by conventional

microbiology and PCR assays for evaluating Salmonella sp. contamination. A prevalence of

26% (21 of 80) of contaminated fresh sausages was observed (Table 1). Eight of 80 (10%)

were collected from Niterói, and 13 of 80 (16%) from Rio de Janeiro, showing a non-

significant difference in contamination rates of sausages from the two cities (χ2 = 1.614,

p>0.05). Of the 21 contaminated samples, 5 were detected by microbiological culturing, 13 by

88

PCR assays (Fig. 1) and 3 by both methods (κ = 0.164, p>0.05). According to the MacNemar

test, the total of contaminated samples detected by PCR (16) was significantly higher than the

number of contaminated samples (8) that were detected by conventional microbiology (Q =

3.556, p<0.05). RV or TTH pre-enrichment broths were equally effective in combination with

PCR assays, since 13 contaminated samples were detected when culturing in RV and 11 in

TTH (χ2 = 0.049, p>0.05). The result for the kappa test comparing the two broths showed

good agreement between them (κ = 0.608).

Enrichment in RV or in TTH broths followed by plating on Salmonella differential

agar showed the best performance (χ2 = 6.248, p<0.05), detecting 8 contaminated samples

(10%), whereas plating on Hektoen agar detected a single positive sample when combined

with RV culturing (1.2%). No significant difference was observed if the pre-enrichment was

performed in RV or TTH broths before plating on Salmonella differential agar plating (χ2 =

0.136, p>0.05). Six of 80 (7.5%) contaminated samples were detected in RV, and 4 of 80

(5%) in TTH broths.

With respect to the meat composition and the packaging conditions of sausages in the

stores, 17 of 80 (21.2%) were in their original packaging, while 63 of 80 (78.8%) had been

removed from their original packaging. Of these, 41 of 63 (65%) sausages were in a plastic-

wrapped tray, and 22 of 63 (35%) sausages were unwrapped in the refrigerator counter. Four

of 17 (23%) sausages in their original packing were contaminated by Salmonella sp., while 17

of 63 (26%) from those that were out of their original packaging, showed contamination by

Salmonella sp. No significant difference was found between the samples (χ2 = 0.083, p>0.05)

protected by their original packing or by the plastic wrap. For the sausages out of their

original packaging, there was no difference regarding Salmonella sp. contamination in

sausages kept on trays wrapped in plastic compared with the unwrapped samples, since 11 of

41 (27%) samples in plastic wrap were contaminated whereas 6 of 22 (27%) of unwrapped

ones were contaminated by Salmonella sp. (χ2 = 0.9698, p>0.05).

There was no significant difference in rates of Salmonella sp. contamination regarding

the composition of sausages. Of the total of 29 chicken sausages, 6 (20%) were contaminated

by Salmonella sp., while 15 of 51 pork sausages (29%) were contaminated (χ2 = 0.160,

p>0.05). Among the pork sausages, 10 of 27 (37%) Tuscan-type sausages and 5 of 24 (21%)

ham sausages were contaminated, with a non-significant difference (χ2 = 1.954, p>0.05)

between them.

89

4. DISCUSSION

Salmonella food contamination poses a risk to the health of human beings. In Brazil,

the Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) established in its resolution (RDC)

No. 12 of January, 2001 that stuffed fresh meat products must be free of Salmonella to be

considered safe for human consumption (Brasil, 2001). Fresh sausages have wide consumer

acceptance, and can be considered one of the most versatile sources of animal protein. As

pointed out by Mürmann et al. (2007), it is recommended to heat fresh sausages to at least

60°C (172°F) for 20 min to eliminate Salmonella sp. In Brazil, fresh sausages are consumed

cooked, but one should take into account the lifestyle changes of the population in

metropolitan areas such as Rio de Janeiro and Niterói, where the daily routine may make it

difficult to perform adequate food preparation and thermal processing. Moreover, the number

of fast-food restaurants has increased. To meet the demand of serving a large number of

people each day, the adequate time and temperature for inactivating any Salmonella sp.

present in meat are not always used, allowing Salmonella sp. to survive in the food matrix.

Furthermore, recontamination of food is also possible (Michaelset al. 2004) because of the

scarcity of qualified professionals and lack of good manufacturing practices.

In this study, 26% of fresh sausages marketed in Rio de Janeiro and Niterói could not

be considered safe for human consumption, according to current legislation. Previous

evaluations of the microbiological quality of sausages are available, but have reported

divergent results. Lima et al. (2011) found that 48 of 91 samples (53%) from Niterói were

contaminated by Salmonella sp., while Vistel et al. (2000) reported that 3 of 30 samples

(10%) were contaminated by this pathogen. Chaves and Franco (2000) did not report

Salmonella sp. contamination in sausages from Niterói. The detection rates of this pathogen in

studies performed in this country are quite varied. Two studies (Mürmann et al. 2009;

Salvatori et al. 2003) carried out in the city of Porto Alegre reported that 82 of 332 (24%)

samples were contaminated by Salmonella sp.; and 93 samples did not contain the pathogen,

respectively. In São Paulo, Ristori (2010) found that 20 of 138 (14.5%) samples of fresh

sausages were contaminated, and Cortez et al. (2004) detected the pathogen in 8 of 106

(7.5%). Regardless of the wide variability of these results, fresh sausages seem to be potential

carriers of Salmonella sp.

In several studies, PCR assays performed better to detect Salmonella sp. and other

foodborne pathogens, compared to routine microbiological analysis that is usually used for

90

detection of Salmonella sp. in fresh stuffed products as well as in several food matrices (Rall

et al. 2009; Asensi et al. 2009; Shabarinath et al. 2007; Castagna 2004).

Previous studies in Brazil assessing Salmonella sp. contamination of fresh sausages

were performed by conventional microbiology, so it can be assumed that the rates of

contamination by this pathogen might be underestimated. PCR assays can broaden the

detection spectrum of Salmonella sp. in fresh sausages, by reducing the number of false

negatives. Indeed, the better performance of the PCR assay may be due, in part, to the

occurrence of "atypical" colonies of Salmonella sp. on plating, since these are not selected by

the analyst for further confirmation by biochemical tests (Bennetet al.1998). Failure of PCR

assays to detect food-borne pathogens has been intensively discussed, and attributed to the

presence of inhibitors in the food matrix or in the enrichment broths (Wilson, 1997).

However, PCR assays are consistently able to detect a higher proportion of contaminated

samples in comparison with conventional bacteriology.

The combination of broths for pre- and selective enrichment prior to the PCR assay

improved the pathogen detection rate, as described in several previous studies (Bennet et al.

1998; Marsiglia et al. 1997). Indeed, the PCR assay was ineffective in detecting Salmonella

sp. in fresh sausages if not preceded by the enrichment step. The extraction of high-quality

genomic DNA from foodborne pathogens in fresh sausage meat is difficult, and does not

allow a direct assay of naturally contaminated samples. Direct PCR detection could be

achieved only if the pathogen concentration is above 105

CFU/25 g (results not shown).

Additionally, the selective enrichment might dilute putative PCR inhibitors that are naturally

present in fresh sausages, increasing the number of viable pathogen cells, reducing the

competitive microbiota, and consequently increasing the sensitivity of the PCR (Oliveira et al.

2003).

RV and TTH selective enrichment in combination with PCR assay showed a similar

performance as reported previously (k = 0.608). The TTH broths were slightly superior,

although not significantly so, in terms of absolute numbers. Currently, there is no efficient

universal enrichment broth to detect every Salmonella serovar (Lima et al. 2011). The same

can be stated for the broths in combination with a PCR assay; in different studies, each of

them was considered to be the most effective broth when combined with PCR to detect

Salmonella sp. in food matrices (Myint et al. 2006; Marsiglia et al. 1997). Since there is no

universal broth, the use of at least two different selective broths is recommended in order to

increase the efficiency of detection of Salmonella sp. (Brasil, 2003).

91

The packing conditions of fresh sausages, whether original or repackaged at the retail

market, or even unwrapped, showed no significant effect on the rate of sausage

contamination. Indeed, these data concord with the findings of Lima et al. (2011) who found

that 11% of sausages were contaminated in their external portion, while 33% had the

pathogen contamination inside. Spricigo et al. (2008) also found similar results. In this study,

fresh sausage contamination was not significantly different in closed packaging or unwrapped

samples. It seems that the contamination of fresh sausages occurs during plant processing,

perhaps due to contaminated raw materials and/or inadequate hygiene practices (Mataragas et

al. 2008; Michaels et al. 2004).

Poultry and swine can be carriers of Salmonella sp. in their gastrointestinal tract

(Mataragas et al. 2008), and without appropriate prophylactic measures, these microorganisms

can readily contaminate the industrial environment and consequently the swine and poultry-

meat products. The results presented here support this hypothesis, since there was no

significant difference between them, with an occurrence of 20% and 29% contamination of

pork and chicken sausages, respectively. The composition of pork sausage, Tuscan-type or

ham sausages, showed no influence on Salmonella sp. contamination, in disagreement with

the findings of Spricigo et al. (2008). These authors suggested that the cuts used for

preparation of Tuscan-type sausage, which are located below the abdominal cavity during

slaughter, would facilitate contamination during evisceration, differently from ham, which is

located above it.

The results of this study concerning Salmonella sp. contamination of fresh sausages

marketed in the most populous cities in the state of Rio de Janeiro, Niterói (~500,000

inhabitants) and Rio de Janeiro (~6,500,000 inhabitants), indicate the need for reassessing and

improving raw material-quality control. PCR assays could be a valuable tool for

microbiological control of plant food processing by the manufacturers, or for surveillance by

the public-health monitoring agencies.

5. ACKNOWLEDGEMENTS

The authors thank the FAPERJ (Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa

do Estado do Rio de Janeiro) for financial support (E-26/110.816/2010).

92

6. CONFLICT OF INTEREST

The authors declare that they have no conflict of interest.

7. REFERENCES

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96

APÊNDICE E

Contaminação por Salmonella spp. em linguiças frescais coletadas em Niterói e no Rio de Janeiro. A PCR em

combinação com os caldos RV e TTH foi realizada com primers específicos para o gene InvA. M: marcador de

tamanho de fragmento de 100 pb; P: controle positivo (DNA de Salmonella Enteritidis ATCC 13076); B:

controle negativo (PCR sem DNA molde). A1 a A5: amostras de linguiças frescais coletadas em Niterói e no Rio

de Janeiro. A primeira raia de cada amostra corresponde a PCR após enriquecimento em caldo RV, e a segunda

raia corresponde a PCR após enriquecimento em caldo TTH. A seta na direita indica o fragmento de 598 pb,

específico de Salmonella spp.

M P B A1 A1 A2 A2 A3 A3 A4 A4 A5 A5

M P B A6 A6 A7 A7 A8 A8 A9 A9 A10 A10

M P B A11 A11 A12 A12 A13 A13 A14 A14 A15 A15

97

M P B A21 A21 A22 A22 A23 A23 A24 A24 A25 A25

M P B A26 A26 A27 A27 A28 A28 A29 A29 A30 A30 A31 A31

M P B A16 A16 A17 A17 A18 A18 A19 A19 A20 A20

98

*Nesta imagem originalmente haviam sido fotografados juntos dois géis correspondentes as amostras indicadas. Para facilitar a compreensão

da figura, a imagem foi editada.

M P B A36 A36 A37 A37 A38 A38 A39 A39 A40 A40 A41 A41 A42 A42 A43 A43 A44 A44 A45 A45 A46 A46

M B P A32 A32 A33 A33 A34 A34 A35 A35

M P B A47 A47 A48 A48 A49 A49

Gel 1 Gel 2

99

*Nesta figura, marcador de tamanho de fragmento utilizado foi de 1000 pb, e não de 100 pb, conforme todas as outras figuras.

M P B A50 A50 A51 A51 A52 A52 A53 A53 A54 A54 A55 A55 A56 A56

M B P A57 A57 A58 A58

M P B A59 A59 A60 A60

100

M P B A79 A79 A80 A80

M P A64 A64 A65 A65 A66 A66 A67 A67 A68 A68 A69 A69 B

M P B A70 A70 A71 A71 A72 A72 A73 A73 A74 A74 A75 A75 A76 A76 A77 A77

101

APÊNDICE F

Características de colônias típicas de Salmonella

spp. em ágar Hektoen entérico. As colônias

suspeitas apresentam cor azul esverdeada, com ou

sem centro negro.

Características de colônias típicas de Salmonella

spp. em Agar Rambach. As colônias suspeitas

apresentam cor rósea ou vermelha.

Colônias em Agar Hektoen entérico plaqueado a

partir de caldo de enriquecimento seletivo

oriundo de amostra processada. Apesar do

protocolo e cuidados adotados, observa-se ainda

abundante crescimento de microrganismos

indesejados. A seta em vermelho indica uma

colônia suspeita de Salmonella spp.

Colônias em Agar Rambach plaqueado a partir de

caldo de enriquecimento seletivo oriundo de

amostra processada. As setas em vermelho

indicam colônias suspeitas de Salmonella spp.

102

Tubo de agar TSI com perfil de reações

bioquímicas suspeitas de Salmonella spp. 1 –

Bizzel alcalino devido a ausência de fermentação

de lactose e sacarose; 2 – Formação de H2S

derivado do metabolismo microbiano; 3 – Fundo

ácido decorrente da fermentação da glicose.

Tubos contendo caldo uréia e agar fenilalanina

para as provas de triagem de colônias suspeitas

de Salmonella spp. 1 – Resultado positivo em

ágar fenilalanina devido a produção de

fenilalanina desaminase; 2 – Prova positiva para

a produção de urease; 3 e 4 – Tubos com

resultados negativos para produção de urease e

fenilalanina desaminase.

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AVALIAÇAO DA CONTAMINAÇÃO POR Salmonella spp. · PDF fileINSTITUTO DE QUÍMICA ... Parâmetros físico-químicos estabelecidos para linguiças pelo 20 . ... FIOCRUZ – Fundação