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Soraia Isabel Domingues Marcos Falcão Licenciada em Química, Ramo Científico
Avaliação da actividade electroquímica em cogumelos
silvestres comestíveis
Departamento de Química Faculdade de Ciências da Universidade do Porto
Abril/2008
i
Á minha madrinha por todo o amor, carinho e apoio
pelo exemplo de coragem, força e alegria de viver Estarás sempre comigo…
ii
Agradecimentos
À minha orientadora, a Professora Ana Cristina Freire, por ter aceite orientar o
meu trabalho, pela dedicação na orientação deste trabalho, estando sempre disponível
para me ajudar.
Ao Doutor Miguel Vilas Boas, meu Co-orientador, que foi incansável na
orientação deste trabalho, sempre presente na resolução dos problemas. Um muito
obrigado pela sua dedicação na orientação e pela sua amizade.
À Doutora Isabel Ferreira por ter acolhido o meu trabalho no seu projecto de
investigação, por toda a amizade, simpatia e apoio demonstrado.
Aos meus colegas de Laboratório, pelos bons momentos passados tanto a trabalhar
como nas pausas para o cafezinho, que tornaram estes meses inesquecíveis. À Lillian,
pelos extractos de cogumelos, pelo apoio, conselhos e explicações acerca do mundo dos
cogumelos, pela sua boa disposição e amizade. À Daniela, por todo apoio e amizade,
sempre disponível a ajudar e a resolver qualquer problema, pelos bons momentos
passados nos almoços. Ao João, pelo sentido de humor e pela banda sonora do trabalho.
Aos restantes membros do Laboratório de Química e Bioquímica Aplicada da
Escola Superior Agrária de Bragança, pelo bom acolhimento, pelo apoio e pelos bons
conselhos ao longo destes meses.
Aos meus amigos fora do mundo da química, presentes em todos os momentos,
que ouviram os meus problemas, ansiedades, alegrias e me apoiaram, ao longo destes
dois anos.
Por fim, os últimos são os primeiros, aos meus pais, ao Miguel, aos meus avós e
ao meu tio pelo constante apoio, amor e carinho dado durante esta fase. Se cheguei aqui
a vós o devo.
iii
Resumo
Este trabalho teve como objectivo a avaliação da capacidade antioxidante e a
quantificação da composição electroactiva em doze espécies de cogumelos silvestres
comestíveis provenientes da região de Trás-os-Montes, através de técnicas
electroquímicas. As diferentes amostras de cogumelos, sofreram um processo de
extracção com metanol, analisando-se posteriormente o extracto por voltametria cíclica
e por voltametria de impulso diferencial.
Numa primeira fase do trabalho procedeu-se à optimização das condições
experimentais a utilizar nos estudos voltamétricos: solução MeOH/tampão acetato 0,1
mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), sistema de três eléctrodos constituído por um
eléctrodo de referência de Ag/AgCl saturado com KCl 3 mol dm-3, eléctrodo auxiliar de
platina e eléctrodo de trabalho de carbono vítreo; como electrólito de suporte
seleccionou-se uma solução de perclorato de sódio a 0,1 mol dm-3. Os voltamogramas
foram traçados num intervalo de potencial de 0 V a um máximo de 1,8 V.
A voltametria cíclica permitiu a avaliação do perfil redox dos extractos
metanólicos de cogumelos, enquanto que a voltametria de impulso diferencial permitiu
a quantificação das espécies electroactivas totais existentes nos diferentes extractos
metanólicos de cogumelos. Ambas as técnicas permitiram verificar a existência de uma
onda anódica irreversível a 0,9 V comum a todos os extractos. Atendendo aos valores
de Ep/2, verificou-se que o extracto com maior poder redutor foi o de Sarcodon
imbricatus seguido do Macrolepiota procera> Leucopaxillus giganteus> Agaricus
silvaticus = Coprinus comatus = Lactarius deliciosus.
No estudo de diferentes espécies do mesmo género, verificou-se que para os
Agaricus, os extractos de Agaricus silvaticus e Agaricus silvicola são os que apresentam
maior capacidade antioxidante, enquanto que o maior poder redutor foi apresentado pelo
Agaricus arvensis. Em relação aos Macrolepiota, o maior poder redutor é apresentado
pelo procera, enquanto que a maior capacidade antioxidante corresponde ao mastoideia.
Nos Lactarius, tanto o deliciosus como o piperatus, nas diferentes fases de maturação,
apresentam somente a onda comum a 0,9 V, embora o Lactarius deliciosus apresenta
uma maior densidade de corrente, logo maior capacidade antioxidante.
A avaliação da existência de outros processos de oxidação correspondentes a
flavonóides presentes nos extractos, realizado pH 7, demonstrou que no Sarcodon
iv
imbricatus, Macrolepiota procera e Leucopaxillus giganteus surgem ondas de oxidação
adicionais, a potenciais menos positivos, que foram atribuídos a existência de
flavonóides.
A quantificação de espécies electroactivas foi obtida em termos de equivalentes
de ácido gálico e ácido ascórbico. Verificou-se que os extractos Agaricus silvaticus,
Agaricus silvicola, Agaricus bisporus, Coprinus comatus são os que apresentam
maiores destas espécies, seguidos dos Macrolepiota mastoidea~Agaricus arvensis>
Agaricus romagnesii> Macrolepiota procera> Sarcodon imbricatus> Leucopaxillus
giganteus~Lactarius deliciosus> Lactarius piperatus.
Foi também optimizado um método de quantificação de tocoferóis por DPV; no
entanto, não foi possível detectar estas espécies antioxidantes nos extractos de
cogumelos utilizados.
v
Abstract
The aim of this work was the evaluation of the antioxidant capacity and the
quantification of the electroactive composition in twelve species of edible wild
mushrooms from the region of Trás-os-Montes, through electrochemical techniques.
The different samples of mushrooms were extracted with methanol, analyzing later the
extract by cyclic voltammetry and differential pulse voltammetry.
In the first stage the experimental conditions used in the voltammetric studies
were optimized: MeOH / acetate buffer 0.1 mol dm-3 (pH 4) / NaClO4 (70:28:2)
solutions, a three-electrode cell incorporating Ag/AgCl (3 mol dm-3 KCl) as the
reference electrode, a Pt foil as counter electrode and a platinum or glassy carbon disk
as working electrode; sodium perchlorate 0.1 mol dm-3 was used as supporting
electrolyte. The voltammograms were acquired between 0 V and 1.8 V.
The cyclic voltammetry allowed the evaluation of the redox profile of the
methanolic extracts of mushrooms, while the differential pulse voltammetry, allowed
the quantification of total electroactive species present in the different methanolic
extracts of mushrooms. Both techniques showed the existence of an irreversible anodic
wave at 0.9 V, similar to all extracts. Based on the values of Ep / 2, it was found that the
extract with higher reducing power was Sarcodon imbricatus followed by Macrolepiota
procera> Leucopaxillus giganteus> = Agaricus silvaticus = Coprinus comatus =
Lactarius deliciosus.
In the study of different species of the same gender, for Agaricus it was found that
the extracts of Agaricus silvaticus and Agaricus silvicola are those with higher
antioxidant capacity, while Agaricus arvensis present higher reducing power. For
Macrolepiota the higher reducing power is shown in procera, while highest antioxidant
capacity corresponds to mastoideia. In Lactarius, both deliciosus and piperatus, in
different stages of maturation, have only a common wave at 0.9 V, although the
Lactarius deliciosus presents a greater current density, therefore greater antioxidant
capacity.
The evaluation of oxidation processes due to flavonoids present in extracts, carried
at pH 7, revealed that in Sarcodon imbricatus, Macrolepiota procera and Leucopaxillus
giganteus, at less positive potentials, there are additional oxidation waves, which
confirm the presence of flavonoids.
vi
The quantification of electroactive species was obtained in terms of the equivalent
of gallic and ascorbic acids. It was found that the extracts of Agaricus silvaticus,
Agaricus silvicola, Agaricus bisporus, Coprinus comatus are those with higher content,
followed by Macrolepiota mastoidea ~ Agaricus arvensis> Agaricus romagnesii>
Macrolepiota procera> Sarcodon imbricatus> Leucopaxillus giganteus ~ Lactarius
deliciosus> Lactarius piperatus.
Finally, the presence of tocopherols in the extracts was evaluated using DPV,
however, under the experimental conditions it was not possible to detect these
antioxidants species in the analysed mushrooms extracts.
vii
Résumé
Ce travail a comme objectif l’évaluation de la capacité antioxydante et la
quantification de la composition électroactive sur douze espèces de champignons
champêtres comestibles qui proviennent de la région de Trás-os-Montes, à travers des
techniques électrochimiques. Les différents exemplaires de champignons ont subi un
processus d’extraction avec du méthanol, s’étant postérieurement analysé l’extrait par
voltamètre cyclique et para voltamètre d’impulsion différentiel.
Dans une première étape du travail, nous avons procédé à une optimisation des
conditions expérimentales a utiliser dans les études voltamétriques: solution
MeOH/tampon acétate 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), système de trois
électrodes constitués par un électrode de référence de Ag/AgCl saturé avec KCl 3 mol
dm-3, électrode auxiliaire de platine et électrode de travail de carbone vitré; comme
électrolyte de support nous avons sélectionné une solution de perchlorate de sodium a
0,1 mol dm-3. Les voltamogrames ont été tracé dans un intervalle de potentiel de 0 V à
un maximum de 1,8 V.
La voltamètrie cyclique a permis l’évaluation du profil du redox des extraits
méthanoïques des champignons, alors que la voltamètrie d’impulsion différentiel a
permis la quantification des espèces électroactives totales existantes dans les différents
extraits méthanoïques des champignons. Les deux techniques ont permis de vérifier
l’existence d’une onde anodique irréversible a 0,9 V commun a tout les extraits. Si nous
observons les valeurs de Ep/2, nous pouvons vérifier que l’extrait avec la plus grande
force réductrice a été le Sarcodon imbricatus suivi du Macrolepiota procera>
Leucopaxillus giganteus> Agaricus silvaticus = Coprinus comatus = Lactarius
deliciosus.
Dans l’étude de différentes espèces du même genre, nous avons vérifié que pour
les Agaricus, les extraits de Agaricus silvaticus et de Agaricus silvicola sont ceux qui
représentent la plus grande capacité antioxydante, alors que la plus grande force
réductrice a été présentée par le Agaricus arvensis. En ce qui concerne les
Macrolepiota, la plus grande force réductrice a été présentée par le procera, alors que la
plus grande capacité antioxydante correspond au mastoideia. Dans les Lactarius, aussi
bien le deliciosus que le piperatus, dans les différentes phases de maturation,
représentent seulement la vague commune a 0,9 V, malgré que le Lactarius deliciosus
viii
représente une plus grande densité de courrant, donc une plus grande capacité
antioxydante.
L’évaluation de la présence d’autres processus d’oxydation correspondants a des
flavonoïdes présents dans les extraits, réalisé pH 7, a démontré que dans le Sarcodon
imbricatus, Macrolepiota procera e Leucopaxillus giganteus ont surgi des vagues
d’oxydation additionnelle, à des potentiels moins positifs, qui ont été attribués à la
présence de flavonoïdes.
La quantification des espèces électroactives a été obtenue avec des équivalents
d’acide gallique et d’acide ascorbique. Nous avons vérifié que les extraits d’Agaricus
silvaticus, Agaricus silvicola, Agaricus bisporus, Coprinus comatus sont ceux qui
représentent les plus grandes valeurs de ces espèces, suivies des Macrolepiota
mastoidea~Agaricus arvensis> Agaricus romagnesii> Macrolepiota procera> Sarcodon
imbricatus> Leucopaxillus giganteus~Lactarius deliciosus> Lactarius piperatus.
Nous avons aussi optimisé une méthode de quantification de tocoferoïdes par
DPV; néanmoins, il nous a été impossible de détecter ces espèces antioxydantes dans
les extraits de champignons utilisés.
ix
Índice geral
Agradecimentos ii Resumo iii Abstract v Résumé vii Índice geral ix Índice de figuras xi Índice de tabelas xiv Lista de abreviaturas e símbolos xv Capítulo I – Introdução 1 1.1 – Cogumelos 2 1.1.1 – Valor nutricional e medicinal dos cogumelos 4 1.3 – Processos de stress oxidativo 6 1.3 – Compostos fenólicos 8 1.3.1 – Propriedades electroquímicas de compostos fenólicos 10 1.3.2 – Metodologias de avaliação da capacidade antioxidante 12 1.3.3 – Avaliação da capacidade antioxidante por técnicas electroquímicas 13 Capítulo II – Descrição das técnicas usadas 15 2.1 – Técnicas voltamétricas 16 2.1.1 – Voltametria cíclica 16 2.1.1.1 – Sistemas reversíveis 18 2.1.1.2 – Sistemas irreversíveis 19 2.1.2 – Voltametria de impulso diferencial 21 Capítulo III – Execução experimental 24 3.1 – Solventes e reagentes 25 3.2 – Instrumentação 26 3.2.1 – Instrumentação geral 26 3.2.2 – Electroquímica 26 3.3 – Procedimento 27 3.3.1 – Acondicionamento do eléctrodo 27 3.3.2 – Preparação dos extractos metanólicos 27 3.3.2.1 – Amostragem 27 3.3.2.2 – Extracção dos cogumelos 29 3.3.3 – Avaliação e quantificação da capacidade antioxidante 29 3.3.4 – Avaliação de tocoferóis em extractos de cogumelos 30 Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão 31 4.1 – Optimização das condições experimentais 32 4.1.1 – Eléctrodo de trabalho 32 4.1.2 – Solução tampão 33 4.1.3 – Condições electroquímicas 35 4.2 – Caracterização electroquímica por voltametria cíclica 37 4.2.1 – Comportamento electroquímico das substâncias padrão 38 4.2.2 – Extractos de cogumelos 39 4.2.2.1 – Agaricus 42 4.2.2.2 – Macrolepiotas 43 4.2.2.3 – Lactarius 44 4.2.3 – Estudo a pH 7 46 4.3 – Avaliação da capacidade antioxidante por voltametria de impulso diferencial 48 4.3.1 – Substâncias padrão 48 4.3.2 – Estudo do efeito da concentração da amostra 49 4.3.3 – Extractos de cogumelos 50 4.3.3.1 – Agaricus 52 4.3.3.2 – Macrolepiotas 53
x
4.3.3.3 – Lactarius 53 4.3.4 – Estudo a pH 7 56 4.4 – Quantificação dos antioxidantes totais presentes nos extractos de cogumelos 58 4.5 – Avaliação de tocoferóis em extractos de cogumelos 62 4.5.1 – Substâncias padrão 62 4.5.2 – Extractos de cogumelos 64 Capítulo 5 – Conclusões e perspectivas futuras 66 5.1 – Conclusões 67 5.2 – Perspectivas futuras 69 Bibliografia 70
xi
Índice de figuras Figura 1.1 Constituição do cogumelo.[3]
Figura 1.2 Estrutura de um Basidiomycota.[1] Figura 1.3 Esquema da formação de espécies reactivas de oxigénio.[32] Figura 1.4 Estruturas químicas para os ácidos fenólicos derivados do: (a) - ácido cinâmico e (b) -
ácido benzóico. Figura 1.5 Estrutura base para os flavonóides. Figura 1.6 Esquema reaccional da oxidação de compostos fenólicos, na presença de radicais livres,
com a formação do radical fenoxilo. Figura 2.1 Variação do potencial aplicado com o tempo, em voltametria cíclica. Figura 2.2 Voltamograma típico para um processo reversível O + ne – → R.[74] Figura 2.3 Voltamograma cíclico para um sistema irreversível.[75] Figura 2.4 Voltamogramas cíclicos de um sistema reversível (___) e quasi-reversível (- - -).[75] Figura 2.5 Voltametria de impulso diferencial: (a) - esquema de aplicação de potenciais; (b) - Perfil
de um voltamograma.[74,75] Figura 3.1 Montagem experimental. Figura 3.2 Cogumelos estudados neste trabalho: (a) Agaricus silvicola; (b) Agaricus silvaticus; (c)
Agaricus romagnesii; (d) Agaricus bisporus; (e) Agaricus arvensis; (f) Coprinus comatus; (g) Leucopaxillus giganteus; (h) Lactarius deliciosus; (i) Lactarius piperatus; (j) Macrolepiota procera; (k) Sarcodom imbricatus; (l) Macrolepiota mastoidea.
Figura 4.1 Voltamograma relativo ao ácido ascórbico 1mmol dm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com (i) eléctrodo de carbono vítreo e (ii) eléctrodo de platina. (a) Voltametria cíclica, com ν = 0,1 V s-1; (b) Voltametria de impulso diferencial, com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.
Figura 4.2 Voltamograma relativo a um extracto metanólico de Agaricus arvensis 10 mg cm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com (i) eléctrodo de carbono vítreo e (ii) eléctrodo de platina. (a) Voltametria cíclica, com ν = 0,1 V s-1; (b) Voltametria de impulso diferencial, com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.
Figura 4.3 Voltamograma relativo ao ácido ascórbico 1 mmol dm-3 em (i) tampão acetato 300 mmol dm-3 (pH 4) /HCl 0,02 mol dm-3 (10:2), (ii) MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), (iii) Tampão fosfato (pH 7) (65% 50 mmol dm-3 Na2 HPO4/ 35% 50 mmol dm-3). (a) Voltametria cíclica, com ν = 0,1 V s-1; (b) Voltametria de impulso diferencial, com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.
Figura 4.4 Voltamograma obtido por DPV de uma solução do extracto de Leucopaxillus giganteus 1 mg cm-3 em (i) tampão acetato 300 mmol dm-3 (pH 4) /HCl 0,02 mol dm-3 (10:2), (ii) MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) / NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V, (iii) Tampão fosfato (pH 7) (65% 50 mmol dm-3 Na2 HPO4/ 35% 50 mmol dm-3).
Figura 4.5 Voltamogramas cíclicos consecutivos, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,1 V s-1. (a) ácido ascórbico 1 mmol dm-3; (b) extracto de Agaricus arvensis a 10 mg cm-3.
Figura 4.6 Voltamograma cíclico do extracto metanólico de Leucopaxillus giganteus 1mg cm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), ν = 0,1 V s-1, (i) eléctrodo após acondicionamento/limpeza e (ii) eléctrodo sem acondicionamento/limpeza.
Figura 4.7 Voltamograma por DPV de uma solução de ácido ascórbico 1 mmol dm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com uma amplitude de impulso de (i) 0,05 V, (ii) 0,06 V e de (iii) 0,07 V.
Figura 4.8 Estrutura química do (a) ácido ascórbico, (b) ácido gálico e (c) rutina Figura 4.9 Voltamograma cíclico, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4
(70:28:2), com ν = 0,1 V s-1. (a) ácido ascórbico 0,5 mmol dm-3; (b) ácido gálico 0,5 mmol dm-3.
Figura 4.10 Voltamograma cíclico da rutina a 0,5 mmol dm-3, ν = 0,1V s-1, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), até (i) 0,6 V e (ii) 1,2 V.
Figura 4.11 Voltamograma cíclico dos diferentes extractos de cogumelos numa concentração de 5 mg cm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,1
xii
V s-1: (a) Agaricus silvaticus; (b) Macrolepiota procera; (c) Sarcodon imbricatus; (d) Coprinus comatus; (e) Leucopaxillus giganteus; (f) Lactarius deliciosus (fase III).
Figura 4.12 Voltamograma cíclico dos diferentes extractos de Agaricus numa concentração de 10 mg cm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), ν = 0,1 Vs-1: (i) A. silvicola; (ii) A. silvaticus; (iii) A. bisporus; (iv) A. romagnesii; (v) A. arvensis.
Figura 4.13 Voltamograma cíclico relativo aos extractos de (i) Macrolepiota mastoidea e (ii) Macrolepiota procera, com uma concentração de 10 mg cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2). ν = 0,1 V s-1.
Figura 4.14 Voltamograma cíclico para os extractos de (i) L. deliciosus, fase III e (ii) L. piperatus, fase III, com uma concentração de 10 mg/cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2). ν = 0,1 V s-1.
Figura 4.15 Voltamograma cíclico para os extractos Lactarius deliciosus em diferentes fases de maturação, (i) fase I, (ii) fase II e (iii) fase III, com uma concentração de 10 mg cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2). ν = 0,1 Vs-1.
Figura 4.16 Voltamograma cíclico, em MeOH /tampão acetato /NaClO4 (70:28:2), a (i) pH 7 e a (ii) pH 4, com ν = 0,1 V s-1. (a) ácido gálico, 1 mmol dm-3; (b) rutina, 0,5 mmol dm-3.
Figura 4.17 Voltamograma cíclico dos diferentes extractos de cogumelos numa concentração de 5 mg cm-3, em (i) tampão pH 7 e (ii) pH 4, com ν = 0,1 V s-1: (a) Agaricus silvaticus; (b) Macrolepiota procera; (c) Sarcodon imbricatus; (d) Coprinus comatus; (e) Leucopaxillus giganteus; (f) Lactarius deliciosus.
Figura 4.18 DPV dos padrões a 0,5 mmol dm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V. (a) ácido ascórbico; (b) ácido gálico; (c) rutina.
Figura 4.19 Representação gráfica da densidade de corrente em função da concentração de extracto de Agaricus silvaticus, para um Ep=0,9 V.A voltametria de impulso diferencial foi realizada com ν=0,03 vs-1 e uma amplitude de modulação de 006 V.
Figura 4.20 DPV dos diferentes extractos de cogumelos numa concentração de 5 mg cm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V: (a) Agaricus silvaticus; (b) Macrolepiota procera; (c) Sarcodon imbricatus; (d) Coprinus comatus; (e) Leucopaxillus giganteus; (f) Lactarius deliciosus.
Figura 4.21 DPV dos diferentes extractos de Agaricus numa concentração de 10 mg cm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V: (i) A. silvicola; (ii) A. silvaticus; (iii) A. bisporus; (iv) A. arvensis; (v) A. romagnesii.
Figura 4.22 DPV relativo aos extractos de (i) Macrolepiota mastoidea e (ii) Macrolepiota procera, com uma concentração de 10 mg cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.
Figura 4.23 DPV relativo aos extractos de (i) Lactarius deliciosus e (ii) Lactarius piperatus, na fase de maturação III, com uma concentração de 10 mg cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.
Figura 4.24 DPV relativo aos extractos Lactarius deliciosus em diferentes fases de maturação, (i) fase I, (ii) fase II e (iii) fase III, com uma concentração de 10 mg cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.
Figura 4.25 DPV relativo aos extractos Lactarius piperatus em diferentes fases de maturação, (i) fase I, (ii) fase II e (iii) fase III, com uma concentração de 10 mg cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.
Figura 4.26 DPV dos padrões a 0,5 mmol dm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 /NaClO4 (70:28:2), a (i) pH 7 e a (ii) pH 4. (a) ácido gálico; (b) rutina. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.
Figura 4.27 DPV dos diferentes extractos de cogumelos numa concentração de 5 mg cm-3, em tampão (i) pH 7 e (ii) pH 4: (a) Agaricus silvaticus; (b) Macrolepiota procera; (c) Sarcodon imbricatus; (d) Coprinus comatus; (e) Leucopaxillus giganteus; (f) Lactarius deliciosus. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.
Figura 4.28 DPV para o ácido gálico em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), a várias concentrações: (i) 0,20 mg cm-3; (ii) 0,15 mg cm-3; (iii) 0,1 mg cm-3 (iv) 0,05 mg cm-3; (v) 0,02 mg cm-3. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.
xiii
Figura 4.29 DPV do extracto S. imbricatus em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2) a várias concentrações: (i) 15 mg cm-3; (ii) 10 mg cm-3; (iii) 5 mg cm-3; (iv) 1 mg cm-3; (v) 0,5 mg cm-3. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.
Figura 4.30 Variação da densidade de corrente em função da concentração, de 0,002 a 0,2 mg cm-3 obtida por DPV para o (a) e ácido gálico (b). ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.
Figura 4.31 Variação da densidade de corrente em função da concentração de extractos, por voltametria de impulso diferencial. (a) A. silvicola, (b) A. bisporus, (c) A. silvaticus, (d) A. arvensis, (e) A. romagnesii, (f) C. comatus, (g) M. mastoidea, (h) M. procera, (i) S. imbricatus, (j) L. giganteus, (k) L. deliciosus, (l) L. piperatus. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.
Figura 4.32 Estruturas químicas dos diferentes tocoferóis. Figura 4.33 Voltamograma cíclico dos padrões numa solução contendo 0,2 cm-3 de H2SO4 0,1 mol
dm-3, 1,2 cm-3 de TBAP 0,06 mol dm-3, mantendo a proporção hexano /EtOH 40:60 (Vfinal = 10 cm-3), com concentração de 0,01 mg cm-3. ν = 0,1V s-1.
Figura 4.34 DPV para diferentes concentrações de padrões, solução contendo 0,2 cm-3 de H2SO4 0,1 mol dm-3, 1,2 cm-3 de TBAP 0,06 mol dm-3, mantendo a proporção hexano /EtOH 40:60 (Vfinal = 10 cm-3) . (i) 0,02 mg cm-3 (ii) 0,01 mg cm-3 (iii) 0,004 mg cm-3. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.
Figura 4.35 Variação da densidade de corrente em função da concentração de extractos para os padrões. (i) α-tocoferol; (ii) β- e γ-tocoferol; (iii) δ-tocoferol.
Figura 4.36 DPV dos diferentes extractos de Agaricus, com uma concentração de 10 mg cm-3, numa solução contendo 0,2 cm3 de H2SO4 0,1 mol dm-3, 1,2 cm3 de TBAP 0,06 mol dm-3, mantendo a proporção hexano /EtOH 40:60 (Vfinal = 10 cm3), s. (a) A. silvicola; (b) A. silvaticus; (c) A. romagnesii; (d) A. arvensis; (e) A. bisporus. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.
xiv
Índice de tabelas Tabela 4.1 Valores de Ep/2 para os diferentes extractos numa concentração de 5 mg cm-3. Tabela 4.2 Valores de Ep/2 para os diferentes extractos de Agaricus com uma concentração de 10 mg
cm-3. Tabela 4.3 Valores de Ep/2 para os Lactarius em diferentes fases de maturação, com uma
concentração de 10 mg cm-3. Tabela 4.4 Valores de Ep/2 para os diferentes extractos, a pH 7, com uma concentração de 5 mg cm-3. Tabela 4.5 Valores de Ep para os diferentes extractos com uma concentração de 5 mg cm-3. Tabela 4.6 Valores de Ep para os extractos de Lactarius nas diferentes fases de maturação, com uma
concentração de 10 mg cm-3. Tabela 4.7 Valores de Ep para os diferentes extractos, a pH 7, com uma concentração de 5 mg cm-3. Tabela 4.8 Resultados obtidos para os diferentes extractos por voltametria de impulso diferencial.
xv
Abreviaturas e símbolos
AA Ácido ascórbico AAPH Diidrocloreto de 2,2’-azobis (2-amino propano) ABTS Ácido 2’-azino-bis(3- etilbenzotiazoline-6-sulfónico AG Ácido gálico AMNV 2,2’-azobis(2,4-dimetilvaleronitrilo) DAD Detector diode-array DPPH 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo DPV Voltametria de impulso diferencial C.A. Capacidade antioxidante CV Voltametria cíclica ECD Detector electroquímico ESR Ressonância de spin electrónico EtOH Etanol GC-FID Cromatografia gasosa acoplada a um detector de ionização de chama HPLC Cromatografia líquida de alta pressão LC-MS Cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa MeOH Metanol MS-MS Espectrometria de massa acoplada a espectrometria de massa ORAC Capacidade de absorção do oxigénio radicalar PS Perclorato de sódio mono-hidratado RMN Ressonância magnética nuclear rpm Rotações por ,minuto TBAP Perclorato de tetrabutilamónio UV-Vis Ultravioleta-visível A Área do eléctrodo α Coeficiente de transferência C Concentração D Coeficiente de difusão ∆Ep Eº Potencial formal Ep/2 Potencial de onda a meia altura E1/2 Potencial de meia onda Ep Potencial de onda Epa Potencial de onda anódico Epc Potencial de onda catódico F Constante de Faraday kº Constante de velocidade padrão heterogénea ip Intensidade de corrente de pico ipa Intensidade de pico anódico ipc Intensidade de pico catódico j Densidade de corrente n número de electrões na número de electrões envolvidos no processo de transferência electrónica T Temperatura ν Velocidade de varrimento W1/2 Largura do pico a meia-altura
Capítulo I – Introdução
1
Capítulo I
Introdução
Capítulo I – Introdução
2
Neste capítulo apresenta-se a descrição das características dos cogumelos, no que
se refere aos aspectos constitucionais, nutricionais e as suas propriedades medicinais,
como o seu valor nutricional e medicinal, já que são uma fonte alimentar rica em
antioxidantes, moléculas bloqueadoras de radicais livres.
Os organismos estão expostos a vários tipos de ameaças, entre elas o stress
oxidativo, causador de um conjunto variado de patologias. Considerando os cogumelos
como uma fonte de compostos com propriedades farmacológicas com potencialidades
para a prevenção destas ameaças, efectua-se uma caracterização sucinta dos processos
de stress oxidativo, da importância dos compostos fenólicos na sua prevenção e
descrevem-se os métodos analíticos utilizados para a avaliação destes compostos em
matrizes alimentares.
1.1 – Cogumelos
Das 75 000 espécies classificadas como fungos, os cogumelos são os mais
conhecidos, constituindo um grupo de organismos bastante importante que durante
muito tempo foi considerado como plantas, mas que devido ás suas características tão
peculiares constituem agora um reino próprio – Reino Fungi.
Os fungos apresentam um conjunto de características próprias que permitem sua
diferenciação das plantas: não sintetizam clorofila, não possuem celulose na sua
parede celular, sendo esta constituída, na maioria das vezes, por quitina (polímero da
N-acetil-D-glicosamina) e também não armazenam amido como substância de reserva,
mas sim glicogénio.[1,2] São seres heterotróficos, obtendo o seu alimento por absorção.
Alguns, os saprófitas, produzem enzimas que hidrolisam a matéria orgânica morta que
os rodeia. Porém, podem também ser parasitas recebendo o alimento do corpo dos
hospedeiros, prejudicando-os, ou em simbiose com benefício para ambos.
Com excepção de algumas formas unicelulares, como as leveduras, os fungos
são constituídos por uma rede de filamentos ramificados chamados hifas, Figura 1.1.
Estas contêm citoplasma e núcleos, e podem apresentar diferentes formas. As hifas,
iniciam-se como formações tubulares a partir de esporos, ramificando-se
repetidamente. Constituem assim uma rede mais ou menos densa que forma o micélio.
O crescimento total do micélio pode exceder um quilómetro por dia e ficar organizado
num corpo muito elaborado, como acontece com os cogumelos.
Capítulo I – Introdução
3
Figura 1.1 – Constituição do cogumelo, retirado de [1].
A reprodução dos fungos é variada e por vezes complexa, envolvendo processos
sexuados e assexuados (por gemiparidade ou por formação de vários esporos). O tipo
de reprodução que apresentam é utilizado na sua classificação, considerando-se quatro
divisões: Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota e Deuteromycota.
Os cogumelos são frutificações de alguns fungos e pertencem à divisão
Basidiomycota. São em grande parte saprófitas existindo também alguns parasitas. A
constituição de um cogumelo encontra-se representada na Figura 1.1 e 1.2.
Figura 1.2 – Estrutura de um Basidiomycota, retirado de [3].
Capítulo I – Introdução
4
A parte visível do fungo é constituída por um conjunto compacto de hifas que
formam uma estrutura reprodutora complexa, denominada basidiocarpo. Nas lâminas
radiais existentes na face interior do chapéu, formam-se hifas especializadas chamadas
basídios que originam esporos sexuados designados basidiósporos, Figura 1.2. A parte
subterrânea do micélio não visível, é constituída por hifas septadas, monocarióticas e é
a partir dela que se forma a região aérea, na altura da reprodução. Uma vez maduros
estes esporos, caem ao solo e germinam produzindo hifas que darão origem aos
micélios primários. Estas hifas têm sexos diferentes (+, -). Quando se encontram duas
hifas compatíveis juntam-se célula a célula e dão lugar aos micélios secundários (com
células binucleadas). Estes micélios são os que irão produzir novos cogumelos.[1,2]
1.1.1 - Valor nutricional e medicinal dos cogumelos
Os cogumelos estão presentes em áreas tão diversas como a alimentação, a
medicina, na obtenção de alguns medicamentos (o Leucopaxillus giganteus é usado na
indústria farmacêutica para extracção do antibiótico clitocibina[4]), na luta biológica de
pragas (Cordyceps militaris contra a processionária do pinheiro[2]) e até no artesanato
e ornamentação.
Existem mais de 45 mil espécies descritas de cogumelos, com cerca de duas mil
conhecidas como comestíveis, mas apenas 25 são cultivadas e aceites como alimento,
e somente 10 têm-se tornado populares entre os países consumidores destes fungos.[1]
Na alimentação, apresentam um valor gastronómico elevado já que possuem um
sabor, aroma e textura inegualáveis. Desde os tempos antigos que os cogumelos são
consumidos por humanos, fazendo parte da sua dieta alimentar.[2,5-9]
São um alimento de alto valor nutritivo, com uma quantidade de proteínas quase
equivalente à carne, ovos, leite e acima de alguns vegetais e frutas (19-35% em seco,
incluindo todos os aminoácidos essenciais),[9,10,] apresentando um teor de 80 a 90 % de
água relativamente ao peso total.[2] Contêm vitaminas como a tiamina, riboflavina,
ácido ascórbico, vitamina D2, uma percentagem elevada de minerais (cálcio, iodo,
fósforo) e também valores apreciáveis de fibras.[5,7-9,11]
Alguns estudos recentes[12] indicam que os cogumelos silvestres do nordeste de
Portugal são uma fonte rica em carbohidratos, manitol e trealose. São um alimento
Capítulo I – Introdução
5
com baixo teor de gorduras, encontrando-se em maior quantidade os ácidos gordos
insaturados, como os ácidos oleico e linoleico. Este aspecto faz deste alimento um
excelente componente para uma dieta alimentar pobre em calorias, já que uma porção
de 100g de cogumelo contém aproximadamente 28 Kcal (118KJ).
Ao longo da história da humanidade, os primeiros efeitos da acção dos
cogumelos na saúde humana foram as intoxicações, como os casos do ergotismo na
idade média e alucinogénios em rituais religiosos. Só mais tarde, no séc. XIX e XX se
descobriu uma acção benéfica para o ser humano.[2,13]
Hoje em dia os cogumelos são um alimento terapêutico útil na prevenção de
várias doenças, servindo como fonte para o desenvolvimento de fármacos e
nutricêuticos (alimentos com propriedades farmacêuticas).[14] Na literatura está
descrito a actividade de cogumelos em várias terapêuticas anti-tumorais, anti-
microbianas, anti-víricas, anti-alérgicas, anti-inflamatórias, tratamentos hematológicos
e imunomoduladores, em tratamento de diabetes, hipertensão e
hipercolestrolemia.[2,15,16] Em alguns países, como a China, o Japão, os EUA e o
Canadá, os cogumelos são utilizados no tratamento de casos de cancro
gastrointestinais, dos pulmões e da mama.[17,18] A importância do cogumelo chinês
Shiitake (Lentinus edodes), é bem conhecida,[16,19] além de possuir compostos com
actividade anti-tumoral, é utilizado para preparar antibióticos e anti-víricos.
Estas propriedades a nível medicinal, estão associadas com a sua composição
química rica em 1,3-β-D-glucanas, ergosterol, lecitina, crestina, importantes na
resposta imunitária e hematológica no cancro, em quitina, um polissacárido existente
nas paredes celulares, o quitosano, derivado di-acetilado, responsáveis pela
diminuição do colesterol fisiológico.[13,20] São, também uma importante fonte de
compostos bioactivos com valor medicinal, apresentando uma grande variedade de
metabolitos secundários, tais como compostos fenólicos, policetídeos, terpenos e
esteróides, reconhecidos como excelentes antioxidantes, destacando-se os compostos
fenólicos, que se apresentam em maior quantidade.[21,22]
Entre estes compostos com propriedades antioxidantes foi identificado e
quantificado, em vários géneros de cogumelos comestíveis, a ergotionina (2-mercapto-
Nα-trimetil-L-histidina),[23] que é um bloqueador de radicais livres não enzimático,
com capacidade de proteger as células do stress oxidativo. A biosíntese deste
composto efectua-se exclusivamente nos fungos e micobactérias, sendo capturado
Capítulo I – Introdução
6
pelas plantas através das raízes e chegando às nossas células através da cadeia
alimentar.[24]
Estudos recentes[9,25,26,27] descrevem, por técnicas cromatográficas, a presença de
nove ácidos orgânicos, em maior quantidade, os ácidos cítrico, cetoglucárico, málico,
succínico, fumárico e os ácidos oxálico, ascórbico, quínico e ácido xiquímico, em
menores proporções. Adicionalmente, também foram identificados ácidos fenólicos
como os ácido cafeoilquinico, nas posições 3-, 4- e 5-, cafeíco, p-cumárico, p-
hidroxibenzóico, rutina e quercetina. Estes compostos além de influenciarem as
propriedades organolépticas, também apresentam uma importante actividade
biológica, como se verifica pelos resultados obtidos sobre a capacidade antioxidante
dos cogumelos, que mostraram a existência de uma correlação entre a actividade e o
conteúdo em polifenóis: maior actividade antioxidante indica maior quantidade de
fenóis totais. [4,14,15,17,21,22,28,29]
1.2. – Processos de stress oxidativo As células vivas estão continuamente expostas a uma grande variedade de
ameaças, como o stress oxidativo que é causado por um número de factores internos e
externos, como os processos fisiológicos de respiração mitocondrial ou a exposição a
poluentes e radiação ionizante. O stress oxidativo surge nos sistemas biológicos como
resultado de exposição significativa a oxidantes, da diminuição da capacidade
antioxidante do sistema ou de ambos. Está muitas vezes associado com a formação de
espécies reactivas de oxigénio, incluindo os radicais livres, implicados nas
patofisiologias das doenças.[30]
O oxigénio, é um componente vital para a sobrevivência da espécie humana,
estando presente na atmosfera, no estado fundamental e na forma de um biradical
tripleto, 3O2. Após a entrada no corpo humano, pode ser transformado através de um
processo de redução envolvendo 4 electrões, formando-se água, Figura 1.3. Desta
transformação resulta a formação de espécies reactivas de oxigénio, como o radical
superóxido (O2.-), o radical hidroxilo (OH.), o peróxido de hidrogénio (H2O2) e outras
espécies reactivas. Alguns componentes celulares, entre os quais, as proteínas, enzimas,
DNA e RNA, reagem prontamente com estas espécies reactivas de oxigénio.[31]
Capítulo I – Introdução
7
O2 O
HO2
H
HO2
H2O2
HO
H H
H2O3O2
e
hν
1O2
e
O22
e e
Figura 1.3 – Esquema da formação de espécies reactivas de oxigénio.[31]
A oxidação dos lípidos existentes nas membranas celulares é um processo muito
frequente no corpo humano. Esta reacção é iniciada rapidamente pelo excesso de
espécies reactivas de oxigénio, em particular os radicais hidroxilos, através de um
mecanismo radicalar em cadeia, formando-se compostos tóxicos como os peróxidos
lipídicos, o malonaldéido, monohidiroxperóxidos ou 4-hidroxinonenal.[32] Tanto as
espécies envolvidas como as formadas estão relacionadas em muitos causas de doenças,
incluindo o cancro e o envelhecimento.
A peroxidação lipídica, além de causar sérios danos no corpo humano, é a
principal causa da deterioração dos alimentos afectando a cor, aroma (formação de
moléculas nocivas à saúde, voláteis e não voláteis), textura e valor nutricional.[32]
A natureza equipou os organismos contra os danos provocados pelos radicais
livres com vários mecanismos de defesa que actuam de diferentes formas. Os
antioxidantes são moléculas naturais que previnem a formação descontrolada de radicais
livres e espécies reactivas de oxigénio ou que inibem a sua reacção com as estruturas
biológicas, interrompendo a reacção em cadeia e formando radicais com baixa
reactividade que são facilmente removidos do organismo.
Podem ser classificados em dois grandes grupos: as enzimas antioxidantes e os
antioxidantes de baixo peso molecular, aos quais pertencem uma grande variedade de
compostos.[33] As enzimas são em menor número e incluem a superóxido dismutase, a
catalase e a peroxidase. O grupo dos compostos com baixo peso molecular é vasto,[30,34]
actuando directamente como bloqueadores neutralizando as espécies reactivas de
oxigénio, ou indirectamente, como agentes quelantes de metais de transição.[30,35] Nos
tecidos humanos, estes compostos, têm origens diferentes, por exemplo, a glutationa, a
nicotinamida adenina dinucleótido (na forma reduzida) e a carnosina são sintetizadas
Capítulo I – Introdução
8
pelas células. O ácido úrico e a bilirubina são produtos do metabolismo celular,
enquanto que o ácido ascórbico, α-tocoferol, β-caroteno e outros carotenóides, como o
licopeno e compostos fenólicos, são obtidos da alimentação.[31,36,37] Todavia, em certas
situações, como a toma de alguns fármacos ou radiação UV, ocorre uma maior
formação de espécies reactivas de oxigénio, excedendo as capacidades normais de
defesa do organismo, o que provoca danos nos tecidos.
As plantas constituem a maior fonte de antioxidantes para o homem. A uma dieta
alimentar saudável, rica em fruta e vegetais está associada a uma menor incidência de
mortes por cancro, doenças do coração, aterosclerose, doenças degenerativas e
envelhecimento.[30,31]
1.3 – Compostos fenólicos Os compostos fenólicos são um grupo extenso e complexo de fitoquímicos e são
encontrados em grandes quantidades nos vegetais e plantas. Além das suas propriedades
antioxidantes, a sua presença contribui para a parte sensorial dos alimentos, como a cor,
o sabor e o aroma.[38]
De uma maneira geral, o termo “antioxidante” é usado para classificar moléculas
que estão presentes em baixas quantidades relativamente ao substrato que é oxidável,
que reagem rapidamente de maneira a suprimir ou a prevenir a sua oxidação.[39]
Recentemente, devido ás restrições colocadas ao uso de antioxidantes sintéticos
como o BHA (2- e 3-terc-butil-4-metoxifenol) e o BHT (2,6-di-terc-butil-4-metilfenol),
cresceu o interesse por antioxidantes de origem natural. Muitas indústrias cosméticas,
farmacêuticas e alimentares usam-nos na formulação dos seus produtos, porque além de
possuírem valor medicinal, previnem o envelhecimento e degradação dos produtos.[40-42]
Este conjunto de compostos tem na sua constituição básica um ou mais anéis
benzénicos hidroxilados e as suas propriedades redox estão relacionadas com as suas
características estruturais: o número e posições dos grupos hidroxilo e metoxilo no anel,
a extensão da conjugação estrutural, a presença de grupos dadores ou aceitadores de
densidade electrónica no anel aromático, que lhe conferem características antioxidantes.
Nas reacções em que estão envolvidos como antioxidantes actuam como dadores de
densidade electrónica em meios aquosos e dadores de protões em meios não polares,
Capítulo I – Introdução
9
como no caso da peroxidação lipídica, na qual se vão ligar aos radicais alquilperoxilo
(ROO•), formando um radical estabilizado pela ressonância do anel aromático.[32,43]
Os dois grupos principais que constituem os compostos fenólicos são os ácidos
fenólicos e os flavonóides. Os ácidos fenólicos dividem-se em derivados do ácido
benzóico (ex.: ácido gálico) e derivados do ácido cinâmico (ex.: ácido cafeico, ácido
clorogénico), Figura 1.4.[44,45] Os ácidos fenólicos encontram-se frequentemente
esterificados, muitas das vezes com o ácido quínico, por exemplo o ácido caféico vai
dar origem ao ácido clorogénico. Também se podem esterificar com outros
componentes como os ácidos xiquímico, málico, tartárico, entre outros. Além de
esterificados podem encontrar-se também na forma glicosídica.[32,46]
HO
R
CH CHCOOH HO
R
R
R
COOH
(a) (b) Figura 1.4 – Estruturas químicas para os ácidos fenólicos derivados do: (a) - ácido cinâmico e (b) - ácido benzóico.
A actividade antioxidante dos ácidos fenólicos e dos seus ésteres depende do
número de grupos hidroxilo existentes na molécula. A presença do grupo carboxilato,
um aceitador de densidade electrónica por efeito mesomérico, confere aos derivados
hidroxilados do ácido benzóico uma menor tendência para se comportarem como
dadores de protões, comparativamente aos derivados hidroxilados do ácido cinâmico.[36]
Os flavonóides englobam uma classe muito importante de compostos encontrados
com grande frequência na natureza, unicamente em vegetais, que além de possuírem
propriedades antioxidantes são considerados pigmentos. Todos os flavonóides possuem
uma estrutura base C6-C3-C6, em que dois dos anéis da molécula são anéis
aromáticos.[44,47] Estes compostos possuem como estrutura base a flavona, Figura 1.5,
ou uma forma hidrogenada dessa estrutura.
Capítulo I – Introdução
10
O
O
12
345
67
8
2'3'
4'
5'
A B
C
Figura 1.5 – Estrutura base para os flavonóides. Podem ser agrupados em vários grupos como: flavonas (ex.: luteolina), flavonóis
(ex.: quercetina), flavanonas (ex.: naringina) e isoflavonas. Os flavonóis são um grupo
abundante e ocorrem geralmente esterificados com glicosídeos e/ou glicurónidos.
Normalmente, o glicosídeo encontra-se na posição 3, podendo também surgir na
posição 7. A glicose é o glicosídeo mais comum, mas também ocorrem a rutinose,
galactose, arabinose ou a xilose. A rutina (quercetina-3-o -rutinose) é um dos
flavonóides mais bioactivos, também conhecida por vitamina P, e já descrito como um
factor activador para a vitamina C.[48]
1.3.1 - Propriedades electroquímicas de compostos fenólicos
Os compostos fenólicos são electroactivos, facilmente sujeitos a reacções de
transferência electrónica de oxidação e redução, podendo assim ser estudados por
métodos electroquímicos. Estes compostos têm em comum um ou mais grupos
hidroxilo ligados a um anel benzénico ou a uma estrutura cíclica.
A reacção inicial apresenta-se, muitas vezes, da seguinte forma:
R O + 2 H+ + 2e- (eq.1)
onde R é o antioxidante (redutor) e o O é o produto formado, que também pode ser
oxidante se o processo for reversível. Os grupos hidroxilo são oxidados pela
transferência de 2 electrões levando à formação, depois da libertação de 2H+, da
correspondente quinona. Está comprovado que, devido a efeitos de estabilização do
anel, quanto maior for o número de substituintes hidroxilo no anel aromático, menor
será o potencial de oxidação.[49]
Capítulo I – Introdução
11
De uma maneira geral, no passo inicial da oxidação dos compostos fenólicos há a
formação de um radical fenoxilo, mas também surge descrito na literatura o ião
fenoxónio como produto, Figura 1.6. Estes compostos intermédios podem participar em
reacções de acoplamento, perda de protões ou ataque nucleófilo.[34,50-52]
R O OR
R OH
R O
ROO
OR
Figura 1.6 – Esquema reaccional da oxidação de compostos fenólicos, na presença de radicais livres, com a formação do radical fenoxilo. No caso particular dos flavonóides, as reacções de oxidação dependem da sua
estrutura já que têm vários grupos fenoxilo livres, em particular o-fenoxilo. São estes
grupos hidroxilo presentes no anel C, Figura 1.5, que são os principais responsáveis
pelas propriedades antioxidantes, já que são os primeiros grupos a serem
oxidados.[43,48,53,54] A presença de diferentes substituintes nas estruturas vai alterar a sua
capacidade antioxidante, aumentando quando os substituintes são dadores de densidade
electrónica, já que estabilizam o anel aromático.[52]
O pH do meio reaccional é também um factor importante neste tipo de reacções,
pois o pH altera a fórmula de estrutura das espécies e por conseguinte terão valores de
potencias diferentes. Este factor permite diferenciar entre os ácidos fenólicos e
flavonóides. Estes últimos compostos vão apresentar reacções de oxidação susceptíveis
ao pH, tendo mais tendência a ocorrerem a pH neutro, isto é, são dadores de electrões
mais efectivos a este pH, enquanto que os ácidos fenólicos são mais activos a pH
ácidos.[43,53,55] Estudos efectuados por radioquímica revelam que a maioria dos
flavonóides ingeridos se encontram nos intestinos, antes de serem excretados na bílis,
onde a sua acção antioxidante será maior. Em contrapartida, os ácidos fenólicos são
Capítulo I – Introdução
12
mais electroactivos no estômago, estando de acordo com o pH em que são mais
electroactivos.[53,56]
1.3.2 - Metodologias de avaliação da capacidade antioxidante Na literatura, estão descritas várias metodologias para determinar a composição
fenólica e a capacidade antioxidante de compostos orgânicos. Estes métodos foram
desenvolvidos de acordo com as propriedades e os modos de acção apresentados pelos
compostos fenólicos.[33]
Genericamente, a avaliação da capacidade antioxidante de um composto ou de
uma amostra, independentemente da sua constituição, baseiam-se em estratégias de
inibição por competição, isto é, vão-se gerar/bloquear radicais, através de diversos
mecanismos, medindo-se a sua concentração em intervalo de tempo definidos.[33,57] A
maioria destes métodos avaliam a capacidade de bloquear radicais livres, alguns com
cor como os formados pelo DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazilo)[57,58], o ABTS•+ (ácido
2’-azino-bis(3- etilbenzotiazoline-6-sulfónico), o AAPH (diidrocloreto de 2,2’-azobis
(2-aminopropano)) e o AMNV (2,2’-azobis(2,4-dimetilvaleronitrilo)). Nestes casos é
possível a sua detecção e quantificação por UV-Vis. [33,57]
Outro método utilizado para descrever a capacidade bloqueadora e quelante de
radicais é através da avaliação da capacidade de absorção do oxigénio radicalar (ORAC)
com diferentes espécies reactivas (com um gerador de radicais peroxilo, hidroxilo,
superóxido ou um metal de transição), usando trolox como padrão.[23,39,59,60]
A actividade antioxidante pode também ser determinada directamente, avaliando o
poder redutor de uma amostra; estas metodologias baseiam-se na tendência que os
antioxidantes apresentam para reduzir o catião Fe3+ a Fe2+.[15,60]
A capacidade dos compostos fenólicos para promover ou inibir processos de
oxidação em lípidos levou ao desenvolvimento de uma série de metodologias,
enzimáticas e não enzimáticas, de inibição da peroxidação lipídica, usando o ácido
linolénico como sistema modelo.[52,61]
Para identificar e quantificar os vários compostos fenólicos, que apresentam
estruturas e polaridades muito semelhantes, utilizam-se técnicas espectrofotométricas de
UV-Vis, cromatográficos, HPLC (detectores de UV, fluorescência, DAD, ECD) ou GC-
FID, por espectroscopia de massa, por técnicas de ressonância magnética (RMN, ESR)
ou mesmo por técnicas hifenadas (LC-MS, MS-MS).[9,27,59,62-67]
Capítulo I – Introdução
13
Grande parte destas metodologias apresenta a desvantagem de usarem reagentes
específicos, dispendiosos e procedimentos elaborados, pelo que é recorrente a utilização
do método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteu para avaliar a quantidade de fenóis
totais. Este método é baseado na reacção dos compostos fenólicos com um reagente
colorimétrico, seguido de medição na região visível do espectro. A desvantagem deste
procedimento é que pode sobrestimar-se o conteúdo em fenóis totais, já que várias
substâncias como, o dióxido de enxofre, ácido ascórbico ou açucares redutores, podem
interferir na medição.[45]
1.3.3 - Avaliação da capacidade antioxidante por técnicas electroquímicas
A procura de metodologias alternativas para caracterizar e avaliar o perfil e
capacidade antioxidante de substâncias orgânicas, levou ao interesse pelas técnicas
electroquímicas, entre elas a voltametria cíclica, a voltametria de impulso diferencial e a
voltametria de onda quadrada.[33] Estas técnicas foram já aplicadas na caracterização de
uma variedade de antioxidantes incluindo ácidos fenólicos,[49,52,56] flavonóides,[45,55,67]
ácido ascórbico,[49,68] tocoferóis,[69] carotenóides[70] e antioxidantes sintéticos[71], tanto
em amostras biológicas como em extractos de plantas.[30,72]
A maioria dos compostos fenólicos é electroactiva, pelo que podem ser estudados
por métodos electroquímicos. Estes compostos, como foi referido anteriormente, vão
actuar como agentes redutores e, em solução, tendem a ser facilmente oxidados em
eléctrodos inertes. Foi já estabelecida uma importante relação entre comportamento
electroquímico e o poder antioxidante: um baixo potencial de oxidação está associado a
um elevado poder antioxidante.[39]
As técnicas voltamétricas oferecem vantagens em relação a outros métodos,
devido a rapidez e simplicidade da análise. O estudo electroquímico dos compostos
fenólicos oferece a possibilidade de investigar as suas características funcionais sem
usar reagentes específicos.[54]
Comparativamente com os métodos espectrofotométricos que são usados
habitualmente na avaliação dos diferentes compostos fenólicos, os electroquímicos
permitem uma maior selectividade.[30,39,45,72] Adicionalmente, as técnicas voltamétricas,
não requerem a caracterização intensiva de cada componente em relação a uma
determinada espécie reactiva de oxigénio para avaliarem a capacidade antioxidante.[30]
Capítulo I – Introdução
14
A maior desvantagem da determinação electroquímica é a possível desactivação
da superfície do eléctrodo, associada com a adsorção de substâncias orgânicas, o que
poderá limitar a reprodutibilidade do método.[37]
Sendo as técnicas voltamétricas rápidas e simples na avaliação da composição
fenólica e capacidade antioxidante, há uma janela de oportunidades para a sua utilização
de forma mais sistemática.
Desta maneira, estas técnicas apresentam-se como uma boa ferramenta tanto na
avaliação da capacidade antioxidante como na quantificação da composição
electroactiva de cogumelos silvestres comestíveis, encontrando-se alguns destes
resultados relativos aos extractos de Agaricus sp. já em publicação.[73]
Capítulo II – Descrição das técnicas usadas
15
Capítulo II
Descrição das técnicas usadas
Capítulo II – Descrição das técnicas usadas
16
Neste capítulo apresentam-se, sumariamente, os fundamentos teóricos subjacentes
às técnicas usadas na avaliação e quantificação da capacidade antioxidante em extractos
metanólicos de cogumelos. Utilizou-se a voltametria cíclica na caracterização do perfil
das espécies electroactivas e a voltametria de impulso diferencial para a quantificação
da capacidade antioxidante.
2.1 – Técnicas voltamétricas
As técnicas voltamétricas permitem a determinação de componentes
electroactivos, isto é, que podem ser oxidados ou reduzidos. A célula electroquímica, é
geralmente constituída pela solução, o eléctrodo de trabalho, onde ocorre a reacção, o
eléctrodo de referência, cujo potencial é fixo e constante e um eléctrodo auxiliar. O
eléctrodo de trabalho pode actuar como um dador (para a redução) ou receptor (para a
oxidação) de electrões transferidos para ou de espécies em solução, eq. 2,
O + ne- R (eq.2)
onde O é a espécie oxidada e R a reduzida.
O objectivo destas técnicas onde se controla o potencial ao longo do tempo é obter
uma resposta proporcional à concentração na solução. Esta reacção vai ocorrer numa
região de potencial que faz com que a transferência electrónica seja favorável
termodinâmica ou cinéticamente.[74]
2.1.1 – Voltametria cíclica
A voltametria cíclica é uma técnica muito utilizada para obter informação
qualitativa de uma reacção electroquímica, através do diagnóstico de mecanismos de
reacção electroquímicos, identificação de espécies electroactivas presentes em solução
ou análise semi-quantitativa da cinética das reacções. Quando se recorre ao estudo
electroanalítico de um novo sistema, é muitas das vezes a primeira técnica a ser
Capítulo II – Descrição das técnicas usadas
17
aplicada, dando uma rápida localização dos potenciais de oxidação-redução das espécies
electroactivas.
Esta técnica consiste na aplicação de um potencial ao eléctrodo de trabalho, que
varia com o tempo até a um determinado potencial limite, Efinal, e de seguida a direcção
de varrimento é invertida para o potencial inicial, Einicial, Figura 2.1, conduzindo a
reacções de oxidação/redução das espécies electroactivas (reacções faradaicas), à
adsorção de espécies de acordo com o potencial, e a uma corrente capacitiva associada à
carga da dupla camada.[74,75]
Figura 2.1 – Variação do potencial aplicado com o tempo, em voltametria cíclica.
Considere-se uma reacção de transferência electrónica de redução O + ne – → R,
Figura 2.2. A direcção de varrimento inicial, é portanto negativa. Quando o potencial
aplicado se aproxima do valor característico do potencial formal, Eº, onde a reacção de
eléctrodo começa, a corrente catódica começa a aumentar até atingir um máximo. A
criação de um gradiente de concentração e o consumo de espécies electroactivas, faz
com que a intensidade de corrente diminua, seguindo um perfil proporcional à raiz
quadrada do tempo, t1/2, semelhante ao que ocorre após a aplicação de um impulso de
potencial. Depois de ultrapassar esta região de potencial (~ 90/n mV após o pico), a
direcção do varrimento é invertida e as moléculas reduzidas são reoxidadas, resultando
uma onda anódica. A forma característica das ondas em voltametria cíclica é causada
pela formação de uma camada de difusão perto da superfície do eléctrodo.
Varrimento inverso
Varrimento directo Einicial
Efinal
Tempo
Ciclo 1
Pote
ncia
l
Capítulo II – Descrição das técnicas usadas
18
Figura 2.2 – Voltamograma típico para um processo reversível O + ne – → R.[74]
Com o aumento da velocidade de varrimento do potencial, o tempo para atingir o
equilíbrio na superfície do eléctrodo é menor, pelo que as reacções que aparecem como
reversíveis para velocidades de varrimento lentas podem ser quasi-reversíveis para
velocidades de varrimento elevadas. Este é um procedimento característico utilizado
para caracterizar a reversibilidade de sistemas electroquímicos.[74,75]
2.1.1.1 - Sistemas Reversíveis
Os voltamogramas cíclicos são caracterizados por vários parâmetros. Num sistema
reversível, a 25 ºC, a corrente é dada pela equação de Randles-Svecik:
( ) 2/12/12/351069,2 vACDnip ×= (eq.3)
onde n é o número de electrões, A é a área do eléctrodo (em cm2), C é a concentração
(mol cm-3), D é o coeficiente de difusão (cm2 s-1) e v é a velocidade de varrimento (V s-
1). De acordo com a equação, a corrente é directamente proporcional à concentração e
aumenta com a raíz quadrada da velocidade de varrimento. Para uma reacção reversível,
Capítulo II – Descrição das técnicas usadas
19
a razão entre as intensidades de corrente, ipc/ipa é um. Esta razão é afectada pelas
reacções químicas acopladas a processos de oxidação/redução.
O potencial da onda, Ep, está relacionado com o potencial formal destas reacções,
que para um sistema reversível é dado por:
2pcpao EE
E+
= (eq.4)
sendo a separação entre os potenciais catódico e anódico:
nEEE pcpap /059,0=−=∆ (eq.5)
Esta última equação é útil para a determinação do número de electrões transferidos e
aumenta com a irreversibilidade do sistema electroquímico. Um processo que apresente
uma transferência electrónica rápida, tem um ∆Ep de 59 mV, sendo a onda anódica e a
catódica independentes da velocidade de varrimento.[74,75]
2.1.1.2 - Sistemas irreversíveis e quasi-reversíveis
No caso de uma reacção irreversível do tipo O + ne – → R, o varrimento linear e a
voltametria cíclica conduzem ao mesmo perfil voltamétrico, pois não aparece nenhuma
onda anódica ao inverter a direcção de varrimento, Figura 2.3.
Figura 2.3 – Voltamograma cíclico para um sistema irreversível.[75]
Capítulo II – Descrição das técnicas usadas
20
Os sistemas totalmente irreversíveis são caracterizados pela seguinte equação:
⎥⎥⎦
⎤
⎢⎢⎣
⎡⎟⎠⎞
⎜⎝⎛+−−=
2/1
2/1 lnln78,0RTnFv
Dk
nFRTEE
oo
pα
α (eq.6)
onde α é o coeficiente de transferência, n é o número de electrões envolvidos no
processo de transferência electrónica, kº é a constante de velocidade padrão heterogénea
e F a constante de Faraday. O potencial da onda, Ep, e o potencial de meia-onda diferem
de 48/αn mV. O Ep ocorre a potenciais superiores a Eº. A intensidade de corrente é dada
por:
( ) ( ) 2/12/12/151099,2 vACDnni ap α×= (eq.7)
. sendo na o número de electrões envolvidos no processo. Os picos tornam-se mais
alargados conforme αn diminui.
Para sistemas quasi-irreversíveis (com 10-1> ko> 10-5 cm s-1), a corrente é
controlada pela transferência de carga e transporte de massa. A forma do voltamograma
varia em função de ko / √πaD (em que a = nFv/RT): conforme este parâmetro aumenta,
o processo aproxima-se de um sistema reversível, verificando-se o contrário, quando o
valor diminui, isto é, a irreversibilidade aumenta quando aumenta a velocidade de
varrimento. Nestes sistemas verifica-se uma diminuição da onda anódica relativamente
ao caso reversível e uma maior separação entre as ondas anódicas e catódicas, Figura
2.4.[74,75]
Figura 2.4 – Voltamogramas cíclicos de um sistema reversível (___) e quasi-reversível (- - -).[75]
Capítulo II – Descrição das técnicas usadas
21
2.1.2 – Voltametria de impulso diferencial
As técnicas voltamétrica por impulsos baseiam-se na medida da corrente ao longo
do tempo após a aplicação de um degrau de potencial. A corrente não é medida de
forma contínua, mas em intervalos de tempo predefinidos.
Estas técnicas foram desenvolvidas inicialmente para eléctrodos de gota de
mercúrio, já que sincronizando o crescimento da gota com os impulsos iria reduzir-se a
contribuição da corrente capacitiva, por amostragem da corrente no fim de vida da gota.
Após a aplicação do impulso de potencial, a corrente capacitiva extingue-se mais
rapidamente do que a faradaica. Este tipo de amostragem tem a vantagem de aumentar a
sensibilidade da técnica. Em eléctrodos sólidos, há uma vantagem adicional de
discriminação contra o bloqueamento da reacção de eléctrodo por adsorção.[75] Entre as
diferentes técnicas de voltametria de impulso, a principal diferença reside na forma dos
picos e modo como se faz a análise da corrente.
A voltametria de impulso diferencial, DPV, é uma técnica muito útil na medição
de concentrações vestigiais de espécies orgânicas e inorgânicas. Nesta técnica os
impulsos de potencial de amplitude fixa (10-100 mV), ∆E, são sobrepostos a uma
rampa de potencial que aumenta de forma linear com o tempo. A corrente é medida
imediatamente antes, 1, da aplicação e no final do impulso, 2, Figura 2.5 (a).
O instrumento regista a diferença de intensidade de corrente, ∆i, em cada impulso,
como função do potencial aplicado. Sendo a DPV uma técnica diferencial, a resposta é
semelhante à primeira derivada de um voltamograma diferencial, isto é um pico, Figura
2.5 (b).[74-76]
(a) (b)
Figura 2.5 – Voltametria de impulso diferencial: (a) – perfil de aplicação de potenciais; (b) – voltamograma diferencial de impulso.[74,75]
Capítulo II – Descrição das técnicas usadas
22
A intensidade de corrente é directamente proporcional à concentração da espécie
electroactiva:
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛+−
=σσ
π 112/1
mp t
CnFADi (eq.8)
em que o coeficiente σ = exp[(nF/RT)( ∆E/2)]. O termo (1-σ)/(1+σ) descreve o efeito de
∆E em ipmáx, aumentando quando ∆E aumenta, atingindo valor unitário quando ∆E é
muito grande.
O potencial do pico (Ep), usado para identificar espécies, é análogo com E1/2:
2/2/1 EEE p ∆±= (eq.9)
Quando o valor de ∆E é pequeno, o potencial do máximo de corrente é próximo de E1/2.
Conforme aumenta a irreversibilidade do sistema, Ep afasta-se de E1/2, ao mesmo tempo
que aumenta a largura do pico e a sua altura diminui, obtendo-se assim menor
sensibilidade e resolução.[90,101]
A forma do pico apresentada por esta técnica resulta numa melhoria na separação
entre duas espécies com potenciais próximos. Na maioria das vezes podem-se medir
picos separados entre si por 50 mV. Este tipo de resolução dos processos não só
depende do potencial, mas também da largura do pico. A largura do pico a meia-altura
está relacionada com o número de electrões envolvidos (eq.10).
nFRTW 52,3
2/1 = (eq.10)
Quando o valor de n = 1, o valor de W1/2 é igual a 30,1 mV (25ºC). Esta equação é
válida no limite quando ∆E tende para zero. A selecção da amplitude de impulso e da
velocidade de varrimento são dois parâmetros que requerem uma análise criteriosa, pois
amplitudes de impulso grandes originam picos mais alargados, devido ao aumento do
valor de W1/2, não sendo viável o uso de valores de ∆E superiores a 100 mV para não
ocorrer perda de resolução dos picos e consequentemente perda de selectividade.[74,77]
Capítulo II – Descrição das técnicas usadas
23
Para além das inúmeras vantagens apresentadas por esta técnica salientam-se, o
baixo limite de detecção, cerca de 10-8 mol dm-3 e a resposta na análise com eléctrodos
sólidos, especialmente envolvendo compostos orgânicos. Estes compostos adsorvem
fortemente à superfície do eléctrodo, logo, através de uma técnica diferencial pode-se
ultrapassar este problema, já que a técnica descrimina os efeitos que são mais ou menos
constantes antes e depois da aplicação do impulso.[74-76]
Devido a estas características, a DPV será utilizada na análise e quantificação da
capacidade antioxidante de extractos metanólicos de cogumelos silvestres comestíveis,
enquanto que através da CV será efectuado o estudo qualitativo do perfil electroquímico
destes extractos.
Capítulo III – Execução experimental
24
Capítulo III
Execução experimental
Capítulo III – Execução experimental
25
Neste capítulo estão descritos os solventes e reagentes utilizados na realização
deste trabalho, bem como a instrumentação usada e as condições experimentais
aplicadas. Descreve-se ainda os procedimentos seguidos na preparação dos extractos
metanólicos e análise da capacidade antioxidante.
3.1 – Solventes e reagentes
Na execução experimental, utilizou-se como solventes, o MeOH (Fluka, p.a),
MeOH (Fisher Scientific, qualidade HPLC), n-hexano (Lab-Scan, 95% qualidade
HPLC), etanol (Panreac, p.a.). Na preparação dos tampões usou-se o acetato de sódio
penta-hidratado (Panreac, p.a.), ácido acético glacial (Panreac, p.a.), ácido clorídrico
(Panreac, 37% p.a.), hidrogenofosfato de sódio e diidrogenofosfato de sódio (Panreac,
p.a.) e ácido sulfúrico (Fluka, 96% p.a.).
Na avaliação da capacidade antioxidante usaram-se os padrões de ácido ascórbico
(Panreac, p.a.), ácido gálico (Sigma) e rutina (Sigma). Na avaliação de tocoferóis
utilizou-se o (±)α-tocoferol (Fluka, ≥ 97%), (+)δ-tocoferol (Sigma, 90%) e o β- e γ-
tocoferol (Matreya, > 97% ).
Como electrólito de suporte usou-se, para a avaliação da capacidade antioxidante,
o perclorato de sódio mono-hidratado (PS) (Fluka, puriss p.a.) e o perclorato de
tetrabutilamónio (TBAP) (Acrós Organics, 99%) na avaliação de tocoferóis em
extractos de cogumelos. Ambos foram acondicionados a 30ºC antes de cada utilização.
A água utilizada nos trabalhos de electroquímica foi de tipo I, obtida através de
um sistema de purificação Mili-Q (TGI Pure Water Systems, USA).
Capítulo III – Execução experimental
26
3.2 – Instrumentação
3.2.1 – Instrumentação geral
A desidratação dos cogumelos foi efectuada num liofilizador modelo Ly-8-FM-
ULE, Snijders.
Para obter o resíduo seco dos extractos de cogumelos recorreu-se a um evaporador
rotativo Büchi RE 111, com condensador Heto CBN 8-30.
3.2.2 – Electroquímica
As medições voltamétricas foram efectuadas num potenciostato/galvanostato
Autolab® PGSTAT 302 controlado por um computador com software GPES (General
Purpose for Electrochemical Systems) da Autolab®.
Os estudos foram realizados numa célula electroquímica com uma configuração
para três eléctrodos, Figura 3.1, constituída por um eléctrodo de referência de Ag/AgCl
saturado com KCl 3 mol dm-3 (Methrom), um eléctrodo de trabalho de carbono vítreo
ou de platina, com uma área de φ = 0.314 cm2 (Bioanalytical Systems) e uma folha de
platina como contra-eléctrodo.
Figura 3.1 – Montagem experimental.
Capítulo III – Execução experimental
27
3.3 – Procedimento
3.3.1 – Acondicionamento do eléctrodo
Antes de cada utilização, o eléctrodo de trabalho foi polido numa suspensão
aquosa de alumina (0,3 µm, Beuhler) sob um disco de lixa fina Master-Tex (Beuhler) e
lavado com água desionizada. Seguidamente, aplicando um tratamento químico, o
eléctrodo foi sonicado numa solução de HCl 6 mol dm-3 (1 minuto) e depois em MeOH
(1 minuto). Este procedimento de limpeza foi efectuado, sempre, antes de cada medição.
3.3.2 - Preparação dos extractos metanólicos
3.3.2.1 – Amostragem
A recolha dos cogumelos e a sua identificação taxonómica foi efectuada por
pessoal qualificado da Escola Superior Agrária de Bragança, de acordo com os
procedimentos descritos na literatura[78-83], depositando-se os exemplares no Herbário da
Escola Superior Agrária de Bragança.
Para este trabalho foram estudadas 12 espécies diferentes de cogumelos, Figura
3.2, colhidas em Bragança (nordeste de Portugal) no Outono de 2006, exceptuando o
Lactarius piperatus (L.) Pers. que foi colhido na Primavera de 2006. As amostras de
Agaricus arvensis Schaeffer, Agaricus romagnesii Wasser, Sarcodon imbricatus (L.) P.
Karst, Lactarius deliciosus (L.) Gray, foram colhidas em zonas de pinhos (Pinus sp.). O
Agaricus bisporus (Lange) Imbach foi obtido, comercialmente, num supermercado
local. Os Agaricus silvaticus Schaeff., Agaricus silvicola (Vittadini) Peck, Macrolepiota
procera (Scop.) Singer, Macrolepiota mastoidea (Fr.) Singer, Lactarius piperatus (L.)
Pers. foram colhidos em zonas de carvalhos (Quercus pyrenaica). O Leucopaxillus
giganteus (Sowerby) Singer e Coprinus comatus (O. F. Müll.:Fr.) Pers. foram colhidos
em lameiros. Após a identificação, os cogumelos foram desidratados num liofilizador
antes de se proceder ao passo de extracção.
Capítulo III – Execução experimental
28
(a) (b)
(c) (d)
(e) (f)
(g) (h)
(i) (j)
(k) (l)
Figura 3.2 – Cogumelos estudados neste trabalho: (a) Agaricus silvicola; (b) Agaricus silvaticus; (c) Agaricus romagnesii; (d) Agaricus bisporus; (e) Agaricus arvensis; (f) Coprinus comatus; (g) Leucopaxillus giganteus; (h) Lactarius deliciosus; (i) Lactarius piperatus; (j) Macrolepiota procera; (k) Sarcodom imbricatus; (l) Macrolepiota mastoidea.
Capítulo III – Execução experimental
29
3.3.2.2 – Extracção dos cogumelos
Para a extracção, triturou-se cerca de 3 g de cogumelo desidratado. As amostras
foram mantidas em agitação com 100 cm3 de metanol a 25 ºC, a 150 rpm, durante 24h,
filtrando-se no final por gravidade. Após este processo, guardou-se o filtrado no
frigorífico, a 4ºC, e extraiu-se novamente o resíduo com100 cm3 de MeOH adicionais.
O procedimento de extracção foi repetido três vezes.
Os extractos metanólicos foram depois combinados e evaporados, até à secura, a
40ºC, num evaporador rotativo. O resíduo foi redissolvidos em metanol até à
concentração de 100 mg/cm-3, guardando-se no escuro, a uma temperatura de 4ºC para
os estudos posteriores.
3.3.3 – Avaliação e quantificação da capacidade antioxidante
Nestes ensaios electroquímicos os extractos metanólicos e os padrões foram
analisados em soluções de MeOH/tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4)/NaClO4
(70:28:2) e MeOH/tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 7)/NaClO4 (70:28:2), 300 mmol
dm-3 (pH 4)/HCl 0,02 mol dm-3 (10:2) e tampão fosfato (pH 7)/ 65% 50 mmol dm-3
Na2HPO4/ 35% 50 mmol dm-3 NaH2PO4. As soluções dos extractos metanólicos foram
preparadas com concentrações entre 0,5 e 15 mg cm-3, enquanto que para os padrões a
concentração foi compreendida entre 0,002 e 0,2 mg cm-3.
O estudo das soluções foi realizado imediatamente após a sua preparação e
colocação do eléctrodo de trabalho, para minimizar os efeitos de adsorção à superfície
do eléctrodo. O estado da superfície do eléctrodo foi monitorizado, previamente,
efectuando-se análises voltamétricas com uma solução electrólito de suporte. Para cada
solução efectuaram-se três repetições.
A avaliação do comportamento electroquímico foi realizada por voltametria
cíclica, entre os 0 V e um máximo de 1,8 V, com uma velocidade de varrimento de 0,1
V s-1.
Para a avaliação e quantificação do poder antioxidante por voltametria de
impulso diferencial, DPV, os voltamogramas foram traçados de 0 V a um máximo de
1,8 V, com uma velocidade de varrimento de 0,03 V s-1, amplitude de modulação de
0,06 V e um salto de potencial de 0,006 V.
Capítulo III – Execução experimental
30
Para cada extracto, a concentração foi representada em função da densidade de
corrente e comparada com os padrões.
3.3.4– Avaliação de tocoferóis em extractos de cogumelos
Os parâmetros experimentais da voltametria cíclica e da voltametria de impulso
diferencial foram idênticos aos aplicados na avaliação e quantificação dos antioxidantes
totais.
Para avaliar a presença de α, β, γ e δ-tocoferol, dissolveram-se os extractos numa
solução contendo 0,5 cm3 de H2SO4 0,1 mol dm-3 em etanol, 3 cm3 de electrólito de
suporte (perclorato de tetrabutilamónio) 0,06 mol dm-3 em etanol e completando o
volume (25 cm3) com hexano, obtendo-se uma proporção de hexano/etanol de 4:6. A
concentração dos extractos foi de 10 mg cm-3.
Para traçar a recta de calibração usaram-se os padrões mencionados,
efectuando-se o procedimento descrito, num intervalo de concentrações de 0,001 a
0,02 mg cm-3. As soluções foram guardadas no congelador em vial’s escuros.
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
31
Capítulo IV
Resultados obtidos e discussão
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
32
Neste capítulo descrevem-se os estudos de optimização das condições
experimentais, a análise dos padrões e traçado das respectivas rectas de calibração, a
avaliação e quantificação da capacidade antioxidante e a análise de tocoferóis para os
extractos metanólicos de cogumelos silvestres comestíveis.
4.1 – Optimização das condições experimentais
Com o objectivo de identificar as condições experimentais mais adequadas à
análise electroquímica dos extractos de cogumelos, optimizaram-se vários parâmetros,
utilizando-se o padrão de ácido ascórbico e um extracto de cogumelo.
Os parâmetros avaliados foram: o eléctrodo de trabalho a usar, o tipo de solução
tampão e as condições electroquímicas.
4.1.1 – Eléctrodo de trabalho
Para avaliar qual o tipo de eléctrodo mais adequado foram efectuados ensaios com
o eléctrodo de platina e o de carbono vítreo. Na Figura 4.1 e 4.2 apresentam-se os
voltamogramas para o padrão e para o extracto de cogumelo.
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
-30
-20
-10
0
10
20
30
(a)(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
0
10
20
30
40
50(b)
(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V
Figura 4.1 – Voltamograma relativo ao ácido ascórbico 1 mmol dm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com (i) eléctrodo de carbono vítreo e (ii) eléctrodo de platina. (a) Voltametria cíclica, com ν = 0,1 V s-1; (b) Voltametria de impulso diferencial, com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
33
Como se pode observar pela Figura 4.1, quer para a voltametria cíclica como para
a voltametria de impulso diferencial, para o ácido ascórbico, obtém-se uma onda
anódica mais definida e de maior intensidade com o eléctrodo de carbono vítreo. Para o
extracto de cogumelo, verifica-se também que o eléctrodo de carbono é o mais
recomendável, já que para o de platina se obtém uma resposta muito baixa. A possível
desvantagem de utilização do eléctrodo de carbono vítreo está relacionada com a maior
tendência de adsorção de substâncias orgânicas na sua superfície[75] comparativamente
com o eléctrodo de platina. Por esta razão irá utilizar-se este eléctrodo nos estudos
seguintes, aplicando-se um procedimento de limpeza (acondicionamento) entre cada
medição.
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80 (a)
(i)(ii)
j/µA
cm-2
E/V 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
5
10
15
20
25
(b)
(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V
Figura 4.2 – Voltamograma relativo a um extracto metanólico de Agaricus arvensis 10 mg cm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com (i) eléctrodo de carbono vítreo e (ii) eléctrodo de platina. (a) Voltametria cíclica, com ν = 0,1 V s-1; (b) Voltametria de impulso diferencial, com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.
4.1.2 – Solução tampão
Para avaliar o efeito da solução tampão, foram estudadas três soluções diferentes
utilizadas regularmente no estudo de compostos fenólicos:[58,65,70]
(i) - Tampão acetato 300 mmol dm-3 (pH 4) /HCl 0,02 mol dm-3 (10:2);
(ii) - MeOH/tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2);
(iii) - Tampão fosfato (pH 7) (65% 50 mmol dm-3 Na2 HPO4/35% 50 mmol dm-3
NaH2PO4).
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
34
Na Figura 4.3 apresentam-se os voltamogramas relativos ao ácido ascórbico em
cada um dos tampões anteriores.
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40 (a)
(iii)(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
0
10
20
30
40
50
(iii)
(ii)(i)
(b)
j/µA
cm-2
E/V
Figura 4.3 – Voltamograma relativo ao ácido ascórbico 1 mmol dm-3 em (i) tampão acetato 300 mmol dm-3 (pH 4) /HCl 0,02 mol dm-3 (10:2), (ii) MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), (iii) Tampão fosfato (pH 7) (65% 50 mmol dm-3 Na2 HPO4/ 35% 50 mmol dm-3). (a) Voltametria cíclica, com ν = 0,1 V s-1; (b) Voltametria de impulso diferencial, com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.
Todos os voltamogramas apresentam um processo de oxidação irreversível, no
intervalo de potencial analisado, verificando-se uma maior intensidade de onda para o
tampão acetato 300 mmol dm-3 (pH 4) /HCl 0,02 mol dm-3 (10:2). Em DPV, o
comportamento do ácido ascórbico nas diversas soluções tampão é variável,
verificando-se a existência de dois processos de oxidação nos tampões (i) e (iii),
enquanto para o tampão (ii) observa-se um onda de maior intensidade. Este fenómeno
poderá ser explicado pela coexistência do ácido ascórbico em duas formas ácido-base
em equilíbrio quando na presença da soluções (i) e (iii), o que dá origem a dois
processos de oxidação com potenciais distintos. Na Figura 4.4 apresentam-se os
resultados obtidos para um extracto de cogumelo nos diferentes tampões. Como se pode
observar, o voltamograma está mais definido para o tampão (ii). Com base nos
resultados obtidos decidiu utilizar-se a solução tampão MeOH /tampão acetato 0,1 mol
dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2).
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
35
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,20
2
4
6
8
10
12
14
16
18
(iii)
(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V
Figura 4.4 – Voltamograma obtido por DPV de uma solução do extracto de Leucopaxillus giganteus 1 mg cm-3 em (i) tampão acetato 300 mmol dm-3 (pH 4) /HCl 0,02 mol dm-3 (10:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V, (ii) MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) / NaClO4 (70:28:2), (iii) Tampão fosfato (pH 7) (65% 50 mmol dm-3 Na2 HPO4/ 35% 50 mmol dm-3).
4.1.3 – Condições electroquímicas
Para maximizar o sinal electroquímico avaliou-se o comportamento dos
voltamogramas cíclicos ao longo de vários ciclos de varrimentos consecutivos. Como se
observa na Figura 4.5, a intensidade da onda anódica vai diminuindo ao longo de cada
varrimento acabando quase por desaparecer nos últimos. Este resultado é consequência
da adsorção de compostos orgânicos que fazem parte das amostras, à superfície do
eléctrodo. Assim a análise incidirá no 1º varrimento de cada medição.
Na sequência do decréscimo acentuado na intensidade de corrente do
voltamograma, avaliou-se a necessidade de efectuar, previamente a cada análise, um
acondicionamento/limpeza da superfície do eléctrodo. A diminuição de intensidade
verificado na Figura 4.6, correspondente a dois ciclos de varrimentos independentes,
sem efectuar qualquer limpeza do eléctrodo, é comprovativa da alteração da superfície
por adsorção de compostos orgânicos, pelo que a reprodutibilidade do ensaio só é obtida
recorrendo a uma limpeza do eléctrodo de trabalho antes de cada ensaio. Estes
fenómenos de adsorção são mais significativos em voltametria cíclica devido à escala de
tempo associada a esta técnica. Assim a CV será utilizada apenas para uma análise
qualitativa do comportamento electroquímico dos compostos e dos extractos, enquanto
a informação quantitativa será recolhida pelas técnicas voltamétricas de impulso
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
36
diferencial. Nestas técnicas a intensidade de corrente é medida no início e no fim de
cada impulso, logo o efeito associado ao bloqueamento da superfície de eléctrodos pela
adsorção de compostos presentes na soluções vai ser reduzidos, já que estes efeitos são
mais ou menos constantes antes e depois da aplicação dos impulso.[75]
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8-10
0
10
20
30
40
50
60 (a)
5º4º3º2º
1º
j/µA
.cm
-2
E/V
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2-10
0
10
20
30
40
50(b)
5º4º3º2º
1º
j/µA
.cm
-2E/V
Figura 4.5 – Voltamogramas cíclicos consecutivos, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,1 Vs-1. (a) ácido ascórbico 1 mmol dm-3; (b) extracto de Agaricus arvensis a 10 mg cm-3.
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2-4
-2
0
2
4
6
8
10
(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V
Figura 4.6 – Voltamograma cíclico do extracto metanólico de Leucopaxillus giganteus 1mg cm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), ν = 0,1 V s-1, (i) eléctrodo após acondicionamento/limpeza e (ii) eléctrodo sem acondicionamento/limpeza.
Para optimizar as condições dos ensaios por DPV foram testados dois parâmetros
experimentais, a amplitude do impulso e o impulso de potencial. Na Figura 4.7
apresenta-se um exemplo da variação provocada pela aplicação de diferentes amplitudes
de impulso. Observando os voltamogramas pode verificar-se, que a amplitude de
impulso que gera uma maior densidade de corrente é de 0,06V. Assim, as condições
experimentais mais adequadas para a análise quantitativa dos ensaios por DPV são:
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
37
velocidade de varrimento de 0,03 Vs-1, amplitude de modulação de 0,06 V e um salto de
potencial de 0,006 V.
-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6
0
5
10
15
20
25
30
35
40
(iii)
(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V
Figura 4.7 – Voltamograma por DPV de uma solução de ácido ascórbico 1 mmol dm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com uma amplitude de impulso de (i) 0,05 V, (ii) 0,06 V e de (iii) 0,07 V.
4.2 – Caracterização electroquímica por voltametria cíclica
Na avaliação do comportamento electroquímico dos antioxidantes por voltametria
cíclica, através do voltamograma pode obter-se um número variado de informações
sobre a capacidade antioxidante, resultantes das características estruturais dos
componentes antioxidantes da amostra, neste caso particular dos antioxidantes de baixo
peso molecular. A corrente anódica formada é função do potencial de oxidação de um
componente ou de uma mistura de componentes numa amostra. A forma do
voltamograma indica a tendência do composto ou amostra para doar electrões à volta do
potencial da onda anódica. A capacidade antioxidante da amostra resulta assim da
combinação destes dois parâmetros, o potencial biológico de oxidação e a densidade de
corrente. O valor do potencial biológico, Ep/2, reflecte o poder redutor específico de um
determinado composto (ou compostos com potenciais semelhantes). A densidade de
corrente anódica, j, reflecte a concentração das espécies na amostra. A integração
resulta num valor equivalente à capacidade antioxidante total da amostra, sem que seja
necessário a determinação da actividade antioxidante de cada componente da
amostra.[30,33]
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
38
4.2.1 – Comportamento electroquímico das substâncias padrão
Como foi referido anteriormente, a estrutura peculiar dos compostos antioxidantes
permite que seja possível a sua determinação voltamétrica: estes compostos têm em
comum um ou mais grupos hidroxilo ligados a um anel benzénico ou a uma estrutura
cíclica.
Neste trabalho escolheram-se como substâncias padrão os ácidos ascórbico, gálico
(ácido fenólico), e a rutina (flavonóide), Figura 4.8, pois representam as estruturas dos
compostos antioxidantes mais utilizados na literatura, como referência das propriedades
antioxidantes de extractos de plantas.[55,67,68]
OHO
HO
H
OH
CH2OH
O HO
HO
HO
COOH
(a) (b)
(c)
Figura 4.8 – Estrutura química do (a) ácido ascórbico, (b) ácido gálico e (c) rutina.
Figura 4.9 – Voltamograma cíclico, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,1 Vs-1. (a) ácido ascórbico 0,5 mmol dm-3; (b) ácido gálico 0,5 mmol dm-3.
HO
OH
O
O
O rutinose
OH
OH
0,0 0,2 0,4 0,6
0
10
20
30
40
50(a)
E/V
j/µA
cm-2
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0-10
0
10
20
30
40
50 (b)
j/µA
cm-2
E/V
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
39
Os ácidos ascórbico e gálico apresentam ondas anódicas irreversíveis a
Ep/2=0,26 V e E(I)p/2=0,39 V, E(II)p/2=0,65 V respectivamente, Figura 4.9, como está
descrito na literatura.[49,56,68]
Em relação à rutina, este compostos apresenta duas ondas de oxidação,
irreversíveis a E(I)p/2= 0,38 V e E(II)p/2= 1,05 V e um onda de redução, de baixa
intensidade que poderá estar relacionada com a onda anódica a potencial menos
positivo, a Ep/2=0,133 V, Figura 4.10.[9,10]
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
-50-40-30-20-10
010203040506070
(ii)(i)
j/µA
cm-2
E/V
Figura 4.10 – Voltamograma cíclico da rutina a 0,5 mmol dm-3, ν = 0,1V s-1, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), até (i) 0,6 V e (ii) 1,2 V.
A irreversibilidade da 1ª onda é, no entanto, dependente dos limites de potencial
aplicado, pois quando se efectua o voltamograma até 0,6 V, verifica-se, quando o
varrimento vai até aos 1,2 V, surge um segundo processo de anódico irreversível, que
condiciona a reversibilidade do primeiro processo.
4.2.2 – Extractos de cogumelos
Os diferentes extractos metanólicos de cogumelos silvestres comestíveis foram
analisados por voltametria cíclica em tampão a pH 4. Começa-se por fazer uma
avaliação global do comportamento electroquímico, dos extractos que apresentam um
comportamento mais electroactivo, isto é, que apresentam ondas de oxidação mais
intensas. O estudo electroquímico dentro de cada variedade será discutido
posteriormente.
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
40
Os voltamogramas cíclicos dos extractos, Figura 4.11, apresentam todos ondas
anódicas irreversíveis, à semelhança das soluções padrão de ácido ascórbico e ácido
gálico.
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2-10
0
10
20
30
40
50
60 (a)
j/µA
cm-2
E/V0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
-10
0
10
20
30
40(b)
j/µA
cm-2
E/V
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40 (c)
j/µA
cm-2
E/V0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
-20
0
20
40
60
80(d)
j/µA
cm-2
E/V
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2-10
0
10
20
30
40(e)
j/µA
cm-2
E/V -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
-10
0
10
20
30
40
50
60 (f)
j/µA
cm-2
E/V
Figura 4.11 – Voltamograma cíclico dos diferentes extractos de cogumelos numa concentração de 5 mg cm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,1 V s-1: (a) Agaricus silvaticus; (b) Macrolepiota procera; (c) Sarcodon imbricatus; (d) Coprinus comatus; (e) Leucopaxillus giganteus; (f) Lactarius deliciosus (fase III). O potencial anódico de meia onda dos extractos é, aproximadamente, 0,9 V,
sendo mais positivos que as soluções padrão. Os valores dos potenciais, Ep/2,
correspondentes aos extractos apresentam-se na Tabela 4.1. Os extractos de Sarcodon
imbricatus, Macrolepiota procera surgem como excepções, já que apresentam um
segundo pico a potenciais menos positivos. O Lactarius deliciosus apresenta, para além
do processo anódico a 0,9 V uma inflexão a um potencial mais positivo, 1,1 V. O
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
41
extracto de Leucopaxillus giganteus, apresenta também uma segunda onda a 0,4 V, mas
apenas para concentrações superiores a 5 mg cm-3, o que corresponderá a substâncias
que se encontram em menores concentrações.
Tabela 4.1 – Valores de Ep/2 para os diferentes extractos numa concentração de 5 mg cm-3.
Extractos Ep/2 / V
Agaricus silvaticus 0,90
Macrolepiota procera 0,61; 0,91
Sarcodom imbricatus 0,40; 0,89
Coprinus comatus 0,91
Leucopaxillus giganteus 0,87
Lactarius deliciosus 0,91; 1,1
A comparação entre os voltamogramas dos extractos e das soluções padrão
analisados permite excluir, exceptuando para o Sarcodon imbricatus, a presença destas
substâncias nos extractos de cogumelos, pelo menos em quantidades detectáveis pelo
método. Por outro lado, a presença em todos os extractos de uma onda anódica a 0,9 V
indica que a composição em compostos electroactivos deverá ser aproximadamente
igual nos vários extractos.
Como já foi referido, o valor de Ep/2 reflecte o poder redutor específico de um
componente (ou de um conjunto de componentes com potenciais semelhantes) pelo que,
através da voltametria cíclica pode obter-se o poder redutor total da amostra.[30] Por
observação da Tabela 4.1 verifica-se que o extracto com menor potencial de oxidação é
o Sarcodon imbricatus, já que apresenta uma onda a aproximadamente 0,4 V, logo
possui maior poder redutor. Comparando os extractos relativamente ao seu poder
redutor, podem ordenar-se da seguinte maneira: Sarcodon imbricatus >Macrolepiota
procera >Leucopaxillus giganteus >Agaricus silvaticus = Coprinus comatus =
Lactarius deliciosus. No entanto, para comparar o potencial redutor entre as várias
espécies com a presença de um processo electroquímico a potenciais mais baixos (~ 0,4
V) pode ser muito mais significativo que as ligeiras diferenças de potencial observadas.
Considerando a existência de uma relação entre o comportamento electroquímico e o
poder antioxidante, onde baixo potencial de oxidação corresponde a um elevado poder
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
42
antioxidante,[39] pode concluir-se que o extracto de S. imbricatus é o que apresenta
maior poder antioxidante.
Seguidamente descreve-se o comportamento electroquímico para as diversas
espécies dos géneros Agaricus, Macrolepiota e Lactarius.
4.2.2.1 – Agaricus
Dentro do género Agaricus estudaram-se cinco espécies distintas, silvaticus,
silvicola, bisporus, arvensis, romagnesii. Observando os voltamogramas obtidos para
cada espécie, Figura 4.12, podemos constatar que têm o mesmo perfil voltamétrico, com
uma onda anódica irreversível próxima de 0,9 V. No A. bisporus observa-se,
adicionalmente, uma inflexão de baixa intensidade a 0,6 V, que deverá corresponder a
compostos electroactivos, que se encontram nesta espécie em menores quantidades.
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
(iii)
(v)(iv)
(iii)(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V
Figura 4.12 – Voltamograma cíclico dos diferentes extractos de Agaricus numa concentração de 10 mg cm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), ν = 0,1 V s-1: (i) A. silvicola; (ii) A. silvaticus; (iii) A. bisporus; (iv) A. romagnesii; (v) A. arvensis. Na tabela 4.2 apresentam-se os potenciais de oxidação correspondentes a todos
os extractos. Como se pode verificar, o potencial é semelhante, exceptuando para o A.
arvensis e o A. silvicola, que apresentam um valor ligeiramente inferior. No entanto,
essa pequena variação não deverá ser significativa para distinguir o poder redutor entre
as espécies.
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
43
Tabela 4.2 – Valores de Ep/2 para os diferentes extractos de Agaricus com uma concentração de 10 mg cm-3.
Extractos Ep/2 / V
A. silvicola 0,90
A. silvaticus 0,91
A. bisporus 0,91
A. romagnesii 0,91
A. arvensis 0,89
Relativamente à densidade de corrente da onda anódica a 0,9 V, verifica-se que o
sinal mais intenso ocorre, a uma concentração de 10 mg cm-3, no extracto metanólico de
A. silvicola. Uma vez que apresentam um potencial de oxidação semelhante, pode
estabelecer-se uma correlação entre a densidade de corrente e a concentração de
espécies antioxidantes se considerarmos que as espécies químicas presentes nos
extractos deste género deverão apresentar uma estrutura semelhante e
consequentemente processos electroquímicos semelhantes. Assim, os diferentes
extractos podem ordenar-se da seguinte forma: A. silvicola >A. silvaticus >A. bisporus >
A. arvensis >A. romagnesii
4.2.2.2 – Macrolepiotas
Para o género Macrolepiota caracterizaram-se as espécies mastoidea e procera.
Estes dois cogumelos têm também em comum uma onda anódica irreversível à volta de
0,9 V, Figura 4.13. O voltamograma cíclico do M. procera possui ainda outro processo
anódico irreversível a 0,59 V, equivalente à inflexão observada anteriormente para o A.
bisporus. Em relação à intensidade das ondas, a espécie mastoidea apresenta uma maior
densidade de corrente, para uma mesma concentração de extracto. Para estas duas
espécies, e considerando que o M. procera apresenta também um processo anódico a
um potencial menos positivo, o poder redutor será mais acentuado nesta espécie.
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
44
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2-10
0
10
20
30
40
50
60
70
(ii)
(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V
Figura 4.13 – Voltamograma cíclico relativo aos extractos de (i) Macrolepiota mastoidea e (ii) Macrolepiota procera, com uma concentração de 10 mg cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2). ν = 0,1 V s-1.
4.2.2.3 – Lactarius
Neste género, para além da avaliação de duas espécies diferentes de Lactarius
(deliciosus e piperatus), também se efectuou um estudo para o cogumelo em diferentes
fases de maturação: I (imaturo, chapéu fechado com um diâmetro < 4,5 cm); II (maduro,
com esporos imaturos, chapéu aberto com um diâmetro entre 4,5 e 7 cm); III (maduro,
com esporos maduros, chapéu aberto com um diâmetro > 7 cm). Esta última fase
corresponde à fase habitual de consumo do cogumelo.
Figura 4.14 – Voltamograma cíclico para os extractos de (i) L. deliciosus, fase III e (ii) L. piperatus, fase III, com uma concentração de 10 mg cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2). ν = 0,1 V s-1.
-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
45
Comprando os voltamogramas para os extractos de cogumelos de L. deliciosus e
L. piperatus na fase III, observam-se ondas anódicas irreversíveis, Figura 4.14, com
pouca intensidade, isto é, baixa densidade de corrente, logo fraca capacidade
antioxidante. O L. deliciosus apresenta duas ondas anódicas E(I)p/2=0,92 V, E(II)p/2=1,1
V, enquanto que o L. piperatus só apresenta um a Epa=0,92V, Tabela 4.3.
Tabela 4.3 – Valores de Ep/2 para os Lactarius em diferentes fases de maturação, com uma concentração de 10 mg cm-3.
Extractos Fases de
maturação Ep/2 / V
L. deliciosus I 0,93; 1,1
II 0,94; 1,2
III 0,92; 1,1
L. piperatus I -
II -
III 0,92
O L. deliciosus, no estudo das diferentes fases de maturação, apresenta um perfil
voltamétrico bastante idêntico, com pequenas oscilações nos potenciais, pouco
significativas, Tabela 4.3. Por observação do voltamograma, Figura 4.15, a fase I
apresenta menor densidade de corrente, o que limitará a sua capacidade antioxidante.
-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
(iii)
(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V
Figura 4.15 – Voltamograma cíclico para os extractos Lactarius deliciosus em diferentes fases de maturação, (i) fase I, (ii) fase II e (iii) fase III, com uma concentração de 10 mg cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2). ν = 0,1 V s-1.
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
46
Para o L. piperatus não se consegue identificar processos de oxidação para as
fases I e II, apresentando apenas uma onda anódica pouco intensa a 0,92 V na fase III de
maturação.
4.2.3 – Estudo a pH 7
Como foi mencionado no capítulo 1, o comportamento dos compostos fenólicos e
dos flavonóides é dependente do pH. Assim, para avaliar a presença destes compostos
nos extractos dos cogumelos, efectuou-se também o estudo utilizando um tampão a pH
7. Escolheram-se como soluções padrão, um flavonóide (rutina), e um ácido fenólico
(ácido gálico). Na Figura 4.16 apresentam-se os voltamogramas para estas soluções
padrão, a pH 7 e 4.
Para ambas as substâncias padrão, a pH 7, há uma descida do potencial das ondas
anódicas. No caso do ácido gálico, as duas ondas anódicas apresentam uma densidade
de corrente mais baixa para pH 7, sendo o potencial de E(I)p/2= 0,35 e E(II)p/2= 0,58 V.
A rutina apresenta comportamento semelhante, com a excepção do segunda onda de
oxidação que decresce de intensidade a pH 7, Figura 4.16. Os potenciais das ondas, para
a rutina são de E(I)p/2=0,24 e E(II)p/2=0,91 V.
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0-10
0
10
20
30
40
50(a)
(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80 (b)
(ii)(i)
j/µA
cm-2
E/V
Figura 4.16 – Voltamograma cíclico, em MeOH /tampão acetato 0,1mol dm-3 /NaClO4 (70:28:2), a (i) pH 7 e a (ii) pH 4, com ν = 0,1 V s-1. (a) ácido gálico, 1 mmol dm-3; (b) rutina, 0,5 mmol dm-3.
A análise comparativa dos voltamogramas dos extractos de cogumelos a pH 7 e a
pH 4, apresenta no geral, uma descida no potencial dos ondas, Figura 4.17. Para o
Agaricus silvaticus, a onda anódica apresenta uma maior área e intensidade a pH 7. Este
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
47
comportamento é semelhante para todas as espécies deste género. Também para o
Leucopaxillus giganteus, Coprinus comatus e para o Lactarius deliciosus existe um
aumento de intensidade da onda.
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2-10
0
10
20
30
40
50
60 (a)
(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40 (b)
(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2-10
0
10
20
30
40(c)
(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
-20
0
20
40
60
80
100
120 (d)
(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2-10
0
10
20
30
40(e)
(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
-10
0
10
20
30
40
50
60 (f)
(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V
Figura 4.17 – Voltamograma cíclico dos diferentes extractos de cogumelos numa concentração de 5 mg cm-3, em (i) tampão pH 7 e (ii) pH 4, com ν = 0,1 V s-1: (a) Agaricus silvaticus; (b) Macrolepiota procera; (c) Sarcodon imbricatus; (d) Coprinus comatus; (e) Leucopaxillus giganteus; (f) Lactarius deliciosus. Para o Sarcodon imbricatus, a pH 7, observa-se o aparecimento de um terceiro
processo de oxidação, Tabela 4.4, o qual poderá estar relacionado com compostos em
cuja oxidação é mais extensa a este pH, como os flavonóides. No Lactarius deliciosus, a
2ª onda a 1,1 V não é perceptível para estas condições experimentais, tendo esta onda,
muito provavelmente, origem em ácidos fenólicos.
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
48
Tabela 4.4 – Valores de Ep/2 para os diferentes extractos, a pH 7, com uma concentração de 5 mg cm-3.
4.3 – Avaliação da capacidade antioxidante por voltametria de impulso
diferencial
Após a caracterização por voltametria cíclica, efectuou-se o estudo, para as
substâncias padrão e para os diferentes extractos, por voltametria de impulso
diferencial. Nesta técnica os picos surgem mais definidos, ultrapassando assim o
problema de encontrar uma linha de base correcta. A maior definição dos processos
electroactivos, por DPV, resulta das características desta técnica voltamétrica que
permite minimizar o efeito da adsorção das espécies orgânicas à superfície do eléctrodo
através do uso de impulsos, embora o sinal de oxidação diminua, ligeiramente, entre
duas análises consecutivas.[48,75]
4.3.1 – Substâncias padrão
Em voltametria de impulso diferencial, o comportamento das três substâncias
padrão utilizadas é semelhante ao da voltametria cíclica, Figura 4.18.
Extractos Ep/2 / V
Agaricus silvaticus 0,82
Macrolepiota procera 0,50; 0,88
Sarcodon imbricatus 0,25; 0,56; 0,87
Coprinus comatus 0,87
Leucopaxillus
giganteus 0,87
L. deliciosus 0,85
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
49
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,60
5
10
15
20
25 (a)
j/µA
cm-2
E/V0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
5
10
15
20
25
30
35 (b)
j/µA
cm-2
E/V
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
20
40
60
80
100
120 (c)
j/µA
cm-2
E/V
Figura 4.18 – DPV dos padrões a 0,5 mmol dm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V. (a) ácido ascórbico; (b) ácido gálico; (c) rutina.
O ácido ascórbico apresenta uma onda de oxidação a 0,18 V, enquanto que o ácido
gálico e a rutina apresentam duas ondas de oxidação a E(I) = 0,34 V e E(II) = 0,61 V e
E(I)= 0,21 V E(II)= 0,86 V respectivamente.
4.3.2 – Estudo do efeito da concentração da amostra
Na secção 4.1.3 verificou-se que nas condições experimentais aplicadas ocorrem
importantes fenómenos de adsorção de espécies na superfície do eléctrodo, pelo que
decidiu-se, antes de avaliar de uma forma quantitativa a capacidade antioxidante dos
extractos, estudar o efeito da concentração da amostra na superfície do eléctrodo. Para
isso, efectuou-se a análise a várias concentrações de extracto de Agaricus silvaticus,
num intervalo de 0,1 a 15 mg cm-3. A partir dos resultados obtidos avaliou-se o
comportamento da densidade de corrente em função da concentração de extracto
metanólico, para o processo de oxidação comum a 0,9 V. Como pode observar-se,
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
50
Figura 4.19, a densidade de corrente aumenta com a concentração, verificou-se que no
intervalo entre 0,1 a 1 mg cm-3 o aumento é mais acentuado.
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16
0
2
4
6
8
10
12
14
j/µA
cm-2
c/mgcm-3
Figura 4.19 – Representação gráfica da densidade de corrente em função da concentração de extracto de Agaricus silvaticus, para um Ep=0,9 V. A voltametria de impulso diferencial foi realizada com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.
4.3.3 – Extractos de cogumelos
Tal como se pode observar no estudo por CV, todos os extractos apresentam um
pico de oxidação a aproximadamente 0,9 V. O extracto metanólico de Sarcodon
imbricatus apresenta um processo de oxidação a potenciais mais baixos, perto de 0,4 V,
enquanto que o de Leucopaxillus giganteus apresenta dois processos, a 0,4 V e a 0,6 V
aproximadamente. O Lactarius deliciosus é o único cogumelo que apresenta um pico de
oxidação a valores mais positivos superiores a 0,9 V.
Com base na análise dos voltamogramas, Figura 4.20, e dos potenciais de
oxidação, Tabela 4.5, podem identificar-se três zonas de potencial comuns a quase todos
os extractos: a 0,4 V, 0,6 V e a 0,9 V; alguns destes processos de oxidação apresentam
uma densidade de corrente muito baixa, surgindo como pequenas inflexões.
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
51
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
5
10
15
20
25 (a)j/µ
Acm
-2
E/V
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,20
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20 (b)
j/µA
cm-2
E/V
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,20
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20 (c)
j/µA
cm-2
E/V0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
5
10
15
20
25
30
35 (d)
j/µA
cm-2
E/V
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,20
5
10
15
20
25 (e)
j/µA
cm-2
E/V-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
0
5
10
15
20
25
30 (f)
j/µA
cm-2
E/V
Figura 4.20 – DPV dos diferentes extractos de cogumelos numa concentração de 5 mg cm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V: (a) Agaricus silvaticus; (b) Macrolepiota procera; (c) Sarcodon imbricatus; (d) Coprinus comatus; (e) Leucopaxillus giganteus; (f) Lactarius deliciosus.
Para a densidade de corrente de pico anódico comum, a 0,9 V, o extracto que
apresenta um valor mais elevado é o de Agaricus silvaticus, seguindo-se o Coprinus
comatus <Macrolepiota procera <Sarcodon imbricatus <Leucopaxillus giganteus
<Lactarius deliciosus. Logo o Agaricus silvaticus é o que possui maior quantidade de
compostos electroactivos.
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
52
Tabela 4.5 – Valores de Ep para os diferentes extractos com uma concentração de 5 mg cm-3.
Extractos Ep/V
Agaricus silvaticus 0,86
Macrolepiota procera 0,88
Sarcodon imbricatus 0,36; 0,86
Coprinus comatus 0,88
Leucopaxillus
giganteus 0,40; 0,58; 0,86
Lactarius deliciosus 0,88; 1,12
4.3.3.1 – Agaricus
Como pode observar-se na Figura 4.21, os extractos de Agaricus reflectem os
resultados observados em voltametria cíclica, apresentando um pico comum a 0,9V,
exceptuando o A. bisporus que tem também uma ligeira inflexão a 0,6 V.
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
5
10
15
20
25
30
(iii)
(v)(iv)(iii)(ii)(i)
j/µA
cm-2
E/V
Figura 4.21 – DPV dos diferentes extractos de Agaricus numa concentração de 10 mg cm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V: (i) A. silvicola; (ii) A. silvaticus; (iii) A. bisporus; (iv) A. arvensis; (v) A. romagnesii.
Considerando que uma maior intensidade de pico corresponde a uma maior
quantidade de compostos antioxidantes presentes no extracto, pode inferir-se que o
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
53
cogumelo com maior capacidade antioxidante é o A. silvicola seguido de A. silvaticus
<A. bisporus <A. arvensis <A. romagnesii.
4.3.3.2 – Macrolepiotas
As duas espécies de Macrolepiota apresentam nos voltamogramas, Figura 4.22,
um processo anódico a 0,88 e a 0,89 V para o mastoidea e procera, respectivamente,
sendo que este último apresenta outro processo de oxidação menos intenso a 0,53 V, tal
como se observava para a voltametria cíclica. O M. mastoidea apresenta uma maior
densidade de corrente em relação ao M. procera, o que corresponde a uma maior
quantidade de substâncias antioxidantes.
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
5
10
15
20
25
30
(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V
Figura 4.22 – DPV relativo aos extractos de (i) Macrolepiota mastoidea e (ii) Macrolepiota procera, com uma concentração de 10 mg cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V. 4.3.3.3 – Lactarius
Comparando o L. deliciosus com o L. piperatus, na fase III de maturação, Figura
4.23, para uma mesma concentração, o primeiro apresenta dois picos a 0,89 V e a 1,1 V,
enquanto que o segundo só apresenta um pico a 0,88 V, Tabela 4.6. Esta diferença pode
ser utilizada para distinguir estas duas espécies, dentro do mesmo género.
No geral, os picos de oxidação correspondentes ao extracto de L. deliciosus são
mais intensas em relação ao outro extracto, pelo que este cogumelo possui maior
concentração em compostos electroactivos que o L. piperatus, embora este possua um
potencial menos positivo.
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
54
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
5
10
15
20
25
30
35
(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V
Figura 4.23 – DPV relativo aos extractos de (i) Lactarius deliciosus e (ii) Lactarius piperatus, na fase de maturação III, com uma concentração de 10 mg cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V. Tabela 4.6 – Valores de Ep para os extractos de Lactarius nas diferentes fases de maturação, com uma concentração de 10 mg cm-3.
Extractos Fases de
maturação Ep/V
L. deliciosus I 0,88; 1,1
II 0,91; 1,2
III 0,89; 1,1
L. piperatus I 0,87
II 0,89
III 0,88
No estudo das fases de maturação do L. deliciosus por DPV, observam-se dois
picos de oxidação para as três fases, Figura 4.24, sendo que o 1º processo de oxidação é
mais intenso para a fase II, enquanto o segundo processo de oxidação é mais intenso na
fase III de maturação. Pode assim concluir-se que os compostos relacionados com o
segundo processo formam-se numa etapa final do crescimento do cogumelo.
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
55
-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
0
5
10
15
20
25
30
35 (iii)
(ii)(i)
j/µA
cm-2
E/V
Figura 4. 24 – DPV relativo aos extractos Lactarius deliciosus em diferentes fases de maturação, (i) fase I, (ii) fase II e (iii) fase III, com uma concentração de 10 mg cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.
Ao contrário do que se verificou por CV, no L. piperatus detectou-se um processo
de oxidação a aproximadamente 0,9 V para as três fases, Figura 4.25, o que demonstra a
maior sensibilidade desta técnica em relação à voltametria cíclica. O extracto na fase III
apresenta uma maior densidade de corrente, no entanto as diferenças podem não ser
significativas.
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2-10
0
10
20
30
(iii)(ii) (i)
j/µA
cm-2
E/V
Figura 4.25 – DPV relativo aos extractos Lactarius piperatus em diferentes fases de maturação, (i) fase I, (ii) fase II e (iii) fase III, com uma concentração de 10 mg cm-3 em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), com ν = 0,03 V s-1 e uma amplitude de modulação de 0,06 V.
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
56
4.3.4 – Estudo a pH 7
As substâncias padrão ácido gálico e rutina, a pH 7, apresentam o mesmo
comportamento descrito anteriormente, a pH 4. Os potenciais de oxidação tornam-se
menos positivos e os picos menos intensos. No caso da rutina, o segundo processo,
próximo de 1,1 V, é bastante menos intenso e definido quando se efectua a análise a pH
7. Estes resultados não estão de acordo com o descrito na literatura,[55] pois o flavonóide
apresenta um voltamograma mais intenso a pH 4, idêntico ao comportamento do ácido
fenólico.
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
15
30
45
60
75
90
105 (a)
(ii)
(i)
j/µAc
m-2
E/V0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
20
40
60
80
100
120 (b)(ii)
(i)j/µ
A.c
m-2
E/V
Figura 4.26 – DPV dos padrões a 0,5 mmol dm-3, em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 /NaClO4 (70:28:2), a (i) pH 7 e a (ii) pH 4. (a) ácido gálico; (b) rutina. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.
O extracto de Agaricus silvaticus, Coprinus comatus, Lactarius deliciosus
apresentam um perfil semelhante ao encontrado a pH 4, Figura 4.27, no entanto para o
Macrolepiota procera, surgem, para além do pico comum a 0,84 V, mais dois picos de
oxidação a 0,24 V, a 0,45 V. O mesmo se verifica para o Sarcodon imbricatus com três
picos de oxidação a 0,22 V, 0,53 V e a 0,85 V, Tabela 4.7.
Apesar de não se ter verificado um aumento de intensidade do pico a pH 7 para o
flavonóide estudado, a variabilidade observada nos processos de oxidação dos extractos
de cogumelos deverá estar relacionada com a presença de ácidos fenólicos e
flavonóides, como foi referido anteriormente.
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
57
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
5
10
15
20
25
30(a)
(ii)
(i)j/µ
Acm
-2
E/V0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
02468
10121416182022 (b)
(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,20
5
10
15
20(c)
(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
05
10152025303540455055 (d)
(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
5
10
15
20
25 (e)
(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
0
5
10
15
20
25
30 (f)
(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V
Figura 4.27 – DPV dos diferentes extractos de cogumelos numa concentração de 5 mg cm-3, em tampão (i) pH 7 e (ii) pH 4: (a) Agaricus silvaticus; (b) Macrolepiota procera; (c) Sarcodon imbricatus; (d) Coprinus comatus; (e) Leucopaxillus giganteus; (f) Lactarius deliciosus. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.
Tabela 4.7 – Valores de Ep para os diferentes extractos, a pH 7, com uma concentração de 5 mg cm-3.
Extractos Ep/V
Agaricus silvaticus 0,80
Macrolepiota procera 0,24; 0,45; 0,84
Sarcodon imbricatus 0,22; 0,53; 0,85
Coprinus comatus 0,85
Leucopaxillus
giganteus 0,43; 0,84
Lactarius deliciosus 0,83; 1,04
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
58
4.4 – Quantificação dos antioxidantes totais presentes nos extractos dos
cogumelos
A quantificação dos antioxidantes totais presentes nos extractos foi efectuada
através da voltametria de impulso diferencial, utilizando rectas de calibração de ácido
ascórbico e ácido gálico. Estas duas substâncias padrão foram escolhidas por serem
frequentemente descritas na literatura como termo de comparação, especialmente em
métodos espectroscópicos de análise de antioxidantes em amostras biológicas.[30,55,67,68]
Na Figura 4.28 está representado o voltamograma do ácido gálico a várias
concentrações. Pode constatar-se que com o aumento da concentração do composto, há
um aumento da densidade de corrente.
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
10
20
30
40
50
60
(v)
(iv)
(iii)
(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V
Figura 4.28 – DPV para o ácido gálico em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2), a várias concentrações: (i) 0,20 mg cm-3; (ii) 0,15 mg cm-3; (iii) 0,1 mg cm-3; (iv) 0,05 mg cm-3; (v) 0,02 mg cm-3. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V. Este comportamento também se verifica para o ácido ascórbico e para os
diferentes extractos, Figura 4.29, embora os declives das rectas da densidade de corrente
em função da concentração de extractos sejam diferentes, Figura 4.31.
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
59
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,20
10
20
(v)(iv)(iii)
(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V
Figura 4.29 – DPV do extracto S. imbricatus em MeOH /tampão acetato 0,1 mol dm-3 (pH 4) /NaClO4 (70:28:2) a várias concentrações: (i) 15 mg cm-3; (ii) 10 mg cm-3; (iii) 5 mg cm-3; (iv) 1 mg cm-3; (v) 0,5 mg cm-3. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V. Na voltametria de impulso diferencial, a densidade de corrente, além de variar
com a concentração, depende também da cinética de transferência electrónica e do
coeficiente de difusão das diferentes espécies electroactivas.[75] Por este facto, não se
podem comparar directamente os voltamogramas dos extractos com as substâncias
padrão, pois estes parâmetros são diferentes para espécies distintas. Adicionalmente, as
substâncias padrão não foram detectadas nos extractos metanólicos, pelo menos a uma
concentração mensurável. A relação entre a densidade de corrente e a concentração para
os extractos será distinta para o ácido ascórbico ou ácido gálico. Na Figura 4.30 pode
observar-se a representação gráfica da variação da densidade de corrente em função da
concentração. Os valores dos respectivos declives das restas encontram-se resumidos na
Tabela 4.8.
0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16
0
5
10
15
20
25
30 (a)
j/µA
cm-2
c/mgcm-3
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20
0
10
20
30
40
50
(b)
j/µA
cm-2
c/mgcm-3
Figura 4.30 – Variação da densidade de corrente em função da concentração, de 0,002 a 0,2 mg cm-3 obtida por DPV para o ácido ascórbico (a) e ácido gálico (b). ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
60
A diferença entre os declives dos padrões e os dos extractos reflecte, numa
primeira aproximação, a diferença entre os coeficientes de difusão das espécies
envolvidas e/ou parâmetros cinéticos dos respectivos processos electroquímicos.
A comparação dos declives para os diferentes extractos, Tabela 4.8, mostra que
existem diferenças, que não podem ser explicadas unicamente com base nos
coeficientes de difusão e parâmetros cinéticos. As diferentes espécies de cogumelos
silvestres comestíveis, vão ser semelhantes, apresentam um perfil voltamétrico muito
similar, indicando uma composição electroactiva semelhante (espécies pertencentes a
famílias de compostos fenólicos quimicamente semelhantes) e por conseguinte os
parâmetros cinéticos deverão não ser muito diferentes. Assim, a diferença poderá residir
na quantidade de massa electroactiva efectiva na composição dos extractos de
cogumelos. Pode assim concluir-se, através dos valores dos declives das rectas dos
extractos obtidos para o pico de oxidação em comum, Tabela 4.8, que a quantidade de
espécies electroactivas, é maior para os extractos de A. silvaticus, A. silvicola, A.
bisporus, sendo quase nula para o L. deliciosus.
0 2 4 6 8 10 12 14 160
2
4
6
8
10
12
14
(e)(b)
(a)
(d)
(c)
j / µ
Acm
-2
c/mgcm-3
0 2 4 6 8 10 12 14 160
1
2
3
4
5
6
7
(l)
(k)
(j)
(i)
(h)(g)
(f)
j/µA
cm-2
c/mgcm-3
Figura 4.31 – Variação da densidade de corrente em função da concentração de extractos, por voltametria de impulso diferencial. (a) A. silvicola, (b) A. bisporus, (c) A. silvaticus, (d) A. arvensis, (e) A. romagnesii, (f) C. comatus, (g) M. mastoidea, (h) M. procera, (i) S. imbricatus, (j) L. giganteus, (k) L. deliciosus, (l) L. piperatus. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
61
Tabela 4.8 – Resultados obtidos para os diferentes extractos por voltametria de impulso diferencial.
Extractos Declive
µAcm2mgcm-1
C. A. (AA)
mg/g
C. A. (AG)
mg/g
A. silvaticus 0,85 3,9 3,1
A. silvicola 0,85 2,9 2,2
A. bisporus 0,79 2,8 2,1
A. romagnesii 0,50 2,0 1,4
A. arvensis 0,55 2,2 1,7
M. procera 0,53 1,7 1,2
M. mastoidea 0,37 2,3 1,7
S. imbricatus 0,33 1,2 0,8
C. comatus 0,49 2,7 2,1
L. giganteus 0,21 1,0 0,6
L. deliciosus 0,04 1,0 0,6
L. piperatus 0,12 0,5 0,2
Ác. Ascórbico 204,75 1000 616
Ác. Gálico 245,84 1302 1000 C.A. (AA) – Capacidade antioxidante em termos de equivalentes de ácido ascórbico; C.A. (AG) – Capacidade antioxidante em termos de equivalentes de ácido gálico
Para expressar o poder antioxidante, calculou-se os equivalentes de cada espécie
em relação aos padrões, para uma determinada concentração. É de referir, que existem
desvios significativos à linearidade, para baixas e altas concentrações de extractos,
devido a fenómenos de adsorção e saturação na superfície do eléctrodo. Na Tabela 4.8
encontram-se os valores da capacidade antioxidantes (C. A.) em termos de equivalentes
de ácido ascórbico (AA) e ácido gálico (AG). A análise dos valores C.A. na Tabela 4.8
sugere que os extractos de A. silvaticus, A. silvicola, A. bisporus, Coprinus comatus,
tendo uma capacidade antioxidante maior, são os que apresentam um valor mais
elevado.
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
62
4.5 – Avaliação de tocoferóis em extractos de cogumelos
Individualmente os tocoferóis têm um papel importante no combate aos processos
de oxidação, pelo que se investigou a sua existência, nos extractos de cogumelos
silvestres comestíveis, através das técnicas voltamétricas utilizadas.
4.5.1 – Substâncias padrão
Os padrões analisados foram o α-, β-, γ- e δ-tocoferol, Figura 4.32.
O
HO
Tocol
12
345
6
78
α-tocoferol = 5, 7, 8-trimetiltocol
β-tocoferol = 5, 8-trimetiltocol
γ-tocoferol = 7, 8-trimetiltocol
δ-tocoferol = 8-metiltocol
Figura 4.32 – Estruturas químicas dos diferentes tocoferóis.
O voltamograma cíclico de uma solução contendo as quatro substâncias padrão,
Figura 4.33, revelou a existência de 3 ondas de oxidação irreversíveis. Para o β- e γ-
tocoferol ocorrem a um potencial idêntico, de acordo com o descrito na literatura.[69] A
primeira onda de oxidação surge a 0,60 V e corresponde ao α-tocoferol, a segunda a
0,70 V corresponde ao β- e γ-tocoferol e a terceira a 0,77 V é resultante do δ-tocoferol.
O α-tocoferol apresenta um potencial menos positivo, logo um maior poder redutor[30], o
que confirma o facto de ser um antioxidante mais activo.[69]
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
63
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
-4
-2
0
2
4
6
8
10
12
14δ
β + γ
α
j/µA
cm-2
E/V
Figura 4.33 – Voltamograma cíclico dos padrões numa solução contendo 0,2 cm3 de H2SO4 0,1 mol dm-3, 1,2 cm3 de TBAP 0,06 mol dm-3, mantendo a proporção hexano /EtOH 40:60 (Vfinal = 10 cm3), com concentração de 0,01 mg cm-3. ν = 0,1V s-1.
Na Figura 4.34 apresenta-se o voltamograma obtido por DPV. O perfil
voltamétrico é semelhante ao verificado na voltametria cíclica, mostrando três picos de
oxidação, em que a segunda é devida aos processos de oxidação do conjunto β- e γ-
tocoferol. A densidade de corrente dos processos anódicos varia linearmente com a
concentração das substâncias padrão, Figura 4.3.5, permitindo assim efectuar estudos
quantitativos.
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,02
4
6
8
10
12
14
16
18
(iii)
(ii)
(i)
j/µA
cm-2
E/V
Figura 4.34 – DPV para diferentes concentrações de padrões, solução contendo 0,2 cm3 de H2SO4 0,1 mol dm-3, 1,2 cm3 de TBAP 0,06 mol dm-3, mantendo a proporção hexano /EtOH 40:60 (Vfinal = 10 cm3) . (i) 0,02 mg cm-3 (ii) 0,01 mg cm-3 (iii) 0,004 mg cm-3. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
64
Como se pode ver na Figura 4.35, para os 4 padrões a linearidade apresenta uma
correlação bastante aceitável, >0,999, num intervalo de concentrações de 0,001 a
0,02 mg cm-3.
0 10 20 30 40 50
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
(iii)
(ii)
(i)
j/µA
cm-2
c/mgcm-3
Figura 4.35 – Variação da densidade de corrente em função da concentração de extractos para os padrões. (i) α-tocoferol; (ii) β- e γ-tocoferol; (iii) δ-tocoferol.
4.5.2 – Extractos de cogumelos O estudo da presença de tocoferóis nos extractos de cogumelos foi efectuado nas
cinco espécies do género Agaricus, Figura 4.36.
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,20
2
4
6
8
10
12
14
16
18 (a)
j/µA
cm-2
E/V 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
5
10
15
20(b)
j/µA
cm-2
E/V
Capítulo IV – Resultados obtidos e discussão
65
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,20
2
4
6
8
10
12
14
16 (c)
j/µA
cm-2
E/V 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18 (d)
j/µA
cm-2
E/V
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,20
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20 (e)
j/µA
cm-2
E/V
Figura 4.36 – DPV dos diferentes extractos de Agaricus, com uma concentração de 10 mg cm-3, numa solução contendo 0,2 cm3 de H2SO4 0,1 mol dm-3, 1,2 cm3 de TBAP 0,06 mol dm-3, mantendo a proporção hexano /EtOH 40:60 (Vfinal = 10 cm3), s. (a) A. silvicola; (b) A. silvaticus; (c) A. romagnesii; (d) A. arvensis; (e) A. bisporus. ν = 0,03 V s-1, amplitude de modulação de 0,06 V.
A análise de voltamogramas dos extractos mostra que apenas o α-tocoferol
poderia estar presente nos extractos que apresentam um processo de oxidação próximo
de 0,6 V. No entanto, através da adição de uma aliquota de solução padrão de α-
tocoferol ao extracto, verificou-se que não há coincidência do potencial dos picos, pelo
que se conclui que os extractos estudados não apresentam tocoferóis, pelo menos em
quantidades detectáveis.
Capítulo V – Conclusões e perspectivas futuras
66
Capítulo V
Conclusões e Perspectivas Futuras
Capítulo V – Conclusões e perspectivas futuras
67
Neste capítulo, resumem-se as conclusões deste trabalho e abordam-se
perspectivas de trabalho futuro.
5.1 – Conclusões
Através deste trabalho pretendeu-se explorar a voltametria cíclica e a voltametria
de impulso diferencial na caracterização das potencialidades antioxidantes de
cogumelos. Foi avaliada e quantificada a capacidade antioxidante de doze cogumelos
silvestres comestíveis provenientes da região de Trás-os-Montes, por voltametria cíclica
e voltametria de impulso diferencial.
Pelos estudos de voltametria cíclica, demonstrou-se que a electroactividade dos
extractos metanólicos de cogumelos é limitada, apresentando apenas ondas de
oxidações irreversíveis. No geral, os extractos evidenciam três regiões de actividade
electroquímica com processos anódicos irreversíveis, a 0,4 V, a 0,6 V e a 0,9V. A onda
a 0,9 V é a mais intensa e comum a todos, indicando uma composição em compostos
electroactivos semelhante. As ondas a 0,4 V e 0,6 V aparecem apenas em alguns
cogumelos e são indicativas de um poder redutor maior.
Através dos valores de Ep/2, o Sarcodon imbricatus é o que apresenta o menor
potencial de oxidação e assim maior poder redutor. Ordenando os extractos
relativamente ao seu poder redutor verifica-se que: Sarcodon imbricatus> Macrolepiota
procera> Leucopaxillus giganteus> Agaricus silvaticus = Coprinus comatus =
Lactarius deliciosus.
Os resultados para a voltametria de impulso diferencial corroboram os resultados
obtidos por voltametria cíclica, obtendo-se, no entanto, uma maior definição nos picos
de oxidação, já que esta técnica possui uma maior sensibilidade.
Dentro do género Agaricus, o maior poder redutor é encontrado no Agaricus
arvensis. No que diz respeito aos Macrolepiota, o procera é o que tem maior poder
redutor, enquanto que o mastoidea tem maior quantidade de substâncias electroactivas
(maior densidade de corrente). Para os Lactarius analisaram-se duas espécies em
diferentes fases de maturação. As duas espécies, deliciosus e piperatus, apresentam na
fase III, um perfil muito semelhante, com um pico comum irreversível, a 0,9 V,
apresentando o deliciosus um pico adicional a um potencial superior. Para o Lactarius
deliciosus, o perfil é idêntico nas três fases, sendo que a fase I apresenta menor
Capítulo V – Conclusões e perspectivas futuras
68
quantidade de espécies electroactivas. Para o piperatus, a intensidade dos processos
anódicos é praticamente indetectável nas fases iniciais de maturação, pelo que em CV
apenas se detecta electroactividade na fase final.
O estudo do efeito do pH [varia de pH de 4 para 7 (pH fisiológico)], feito na
tentativa de distinguir entre ácidos fenólicos e flavonóides, mostrou no geral, um efeito
da descida dos potenciais de oxidação. Para espécies como o Agaricus silvaticus,
Leucopaxillus giganteus, Coprinus comatus e Lactarius deliciosus houve um aumento
da densidade de corrente de pico. No caso do Sarcodon imbricatus, Macrolepiota
procera e Leucopaxillus giganteus houve o surgimento de novas ondas a potenciais
menos positivos, indicando a presença de flavonóides.
Em termos quantitativos, a análise foi obtida considerando o nº de equivalentes
de ácido gálico e ácido ascórbico, podendo afirmar-se que os extractos de A. silvaticus,
A. silvicola, A. bisporus, Coprinus comatus são os que apresentam um maior valor,
seguindo-se o Macrolepiota mastoidea ~ Agaricus arvensis> Agaricus romagnesii>
Macrolepiota procera> Sarcodon imbricatus> Leucopaxillus giganteus ~ Lactarius
deliciosus> Lactarius piperatus. Como se pode verificar ao longo deste estudo, o poder
redutor não coincide com a capacidade antioxidante, isto é, extractos que apresentam
um maior poder redutor, não apresentam uma maior capacidade antioxidante, como é o
caso do Sarcodon imbricatus. O poder redutor reflecte as características estruturais das
espécies químicas presentes nos extractos, enquanto que a capacidade antioxidante é o
resultado da quantidade de compostos electroactivos.
É de notar que não é possível comparar directamente os extractos com as
substâncias padrão, já que na DPV e CV, a densidade de corrente depende da
concentração, da cinética de transferência electrónica e coeficiente de difusão das
diferentes espécies electroactivas. Por esta razão, a diferença observada entre os
declives, resultantes da representação gráfica da variação da densidade de corrente em
função da concentração, para os diferentes extractos não pode ser explicada com base
nos coeficientes de difusão e parâmetros cinéticos. Apesar das espécies apresentarem
um perfil voltamétrico semelhante, que sugere uma composição química semelhante, e
parâmetros cinéticos aproximados, apresentam diferenças nos declives, que poderão
estar relacionadas com a quantidade de massa electroactiva efectiva na composição dos
extractos de cogumelos. Nesta perspectiva e tendo em conta o pico a 0,9 V que é
comum a todas as espécies, a quantidade de espécies electroactivas é maior para os
Capítulo V – Conclusões e perspectivas futuras
69
extractos de A. silvaticus, A. silvicola, A. bisporus, sendo quase nula para o L.
deliciosus.
Em relação à avaliação de tocoferóis nos extractos, não se conseguiram observar
processos de oxidação tanto em CV como em DPV, esta última técnica com um limite
de detecção de cerca de 10-8 mol dm-3,[75] querendo isto dizer que se existem, estes
compostos estão em quantidades não detectáveis pelo método.
5.2 - Perspectivas Futuras O futuro desenvolvimento deste trabalho, poderá passar pela optimização de
outras condições experimentais na tentativa de melhorar o perfil voltamétrico e
pesquisar outros processos de oxidação e diminuir os efeitos de matriz verificados. Para
isso vão-se estudar os efeitos da aplicação de outros métodos de extracção destes
compostos a partir dos cogumelos (como a extracção líquido-líquido) e melhorar a
análise através de um processo de pré concentração da amostra, utilizando colunas de
extracção em fase sólida, após o passo de extracção. Também para melhorar a análise e
após o passo de extracção, poderá avaliar-se o efeito da pré-concentração da amostra.
Considerando que a utilização das técnicas electroquímicas na caracterização e
quantificação dos compostos antioxidantes ainda está no início, será vantajoso efectuar
a comparação dos resultados electroquímicos com outras técnicas, como por exemplo,
espectrofotométricas e cromatográficas.
Para este trabalho em particular, os principais compostos antioxidantes dos
cogumelos serão identificados por LC-MS, comparando-se posteriormente a sua
actividade electroquímica com os compostos que dão origem aos processos de oxidação
observados.
Podem complementar-se os resultados obtidos recorrendo a outras técnicas
electroquímicas, como a voltametria de onda quadrada, ou com outras técnicas como
ESR ou RMN, para estudos de natureza estrutural.
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